CN101139556A

CN101139556A - 重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体和菌株

Info

Publication number: CN101139556A
Application number: CNA2007100450817A
Authority: CN
Inventors: 周祥山; 张元兴; 陈琳; 范卫民; 陆建
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2007-08-21
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2027-08-21
Also published as: CN101139556B

Abstract

本发明提供了一种重组α－葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法，通过PCR方法获得编码油脂酵母α－葡聚糖酶的基因序列，将其构建入带有His Tag标签的毕赤酵母分泌表达载体，并转化毕赤酵母获得高表达菌株，通过优化的高密度发酵和纯化工艺，获得了高纯度的带有His Tag的α－葡聚糖酶融合蛋白，其具有高度的α－葡聚糖酶活。该方法工艺简便、高分泌表达α－葡聚糖酶融合蛋白，获得的α－葡聚糖酶融合蛋白纯度高、活性好、生产成本低。

Description

重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体和菌株

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及α-葡聚糖酶的生产方法，特别是指一种重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法，及相关表达载体和菌株。

背景技术

根据国际生物化学与分子生物学命名委员会，葡聚糖酶分为5类：葡聚糖酶(EC3.2.1.11)，葡聚糖-1，6-α-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.70)，葡聚糖-1，6-α-D-异麦芽糖酶(EC 3.2.1.94)，葡聚糖-1，6-α-D-异麦芽三糖酶(EC 3.2.1.95)和支链-葡聚糖外切1，-α--糖苷酶(EC 3.2.1.115)。

很多真菌，如曲霉、薄毛壳酶、镰刀酶、油脂酵母、拟青霉、和青霉类等都可以产生葡聚糖酶。它们产生的这些酶均为内葡聚糖酶，特异地作用于葡聚糖内α-(1→6)-键，作用后主要生成异麦芽糖或异麦芽三糖。已有报道，许多细菌链球菌、假单胞菌、大环杆菌等也可以产生胞外葡聚糖内切酶。如球形节杆菌产生异麦芽糖葡聚糖酶，这是一种可以从葡聚糖和寡糖的非还原末端连续的释放出异麦芽糖的外葡聚糖酶。该酶不仅能够识别α-(1→6)-糖苷键，还能识别α-(1→2)-、α-(1→3)-和α-(1→4)-糖苷键。同时，一些Bacteroides oralis IG、Arthrobacter globiforms I-42、Pseudomonassp.、Streptococcus mitis也能产生外切葡聚糖酶。

由于蔗糖是形成葡聚糖的天然底物，所以在含糖食品的生产中，葡聚糖污染是一个很大的问题。因为葡聚糖会阻塞过滤装置而防碍糖特别是甘蔗的结晶。当原液中葡聚糖含量低至如75mg/L时，过滤效率仍能降低50％左右。目前，工业上已成功用细丽毛壳霉和青霉菌生产的葡聚糖酶来解决糖加工过程中的葡聚糖污染问题，含量为10ppm/50L的葡聚糖酶就能使过滤效率恢复到90％的正常水平。

此外，葡聚糖酶在牙齿保健方面也具有重要的应用价值，它能有效地阻止牙菌斑的形成，从而达到防治包括蛀牙、牙龈炎和牙周炎等多种口腔疾病的功效。M.Marotta的研究表明，商业用酶Dextranase 50L在浓度为3.75×10^-2-1.5×10^-1U/L范围内能有效的抑制口腔中葡聚糖的合成同时抑制蔗糖的黏附，对消除早期形成的由蔗糖沉积引起的生物膜起到了良好的预防效果。

我国对葡聚糖酶的需求潜力很大，但目前产量较低，且酶种数量较少。迄今为止，达到生产规模的酶制剂只有α-淀粉酶、糖化酶和碱性蛋白酶，所以需要加大投入和研究开发。这些研究的成功将促进葡聚糖酶在酒精、发酵、饲料、制糖等产业的广泛应用，因而具有广阔的开发应用前景。

目前，国际上商业用葡聚糖酶大多来源于青霉菌(Penicillium minioluteum)和Chaetomiunm sp.，而油脂酵母是一种产子囊酵母，也可以产生葡聚糖酶。关于油脂酵母产葡聚糖酶的研究从1989年Koenig D分离了分子量为74KDa，71KDa，68KDa，65KDa的葡聚糖酶开始，有了一系列的研究。在此基础上，David W通过添加诱导物1-O-，Methyl-glucopyranoside在发酵12h后达到最大的酶活。1993年Day，Donal F，KimD利用Lipomyces starkeyi ATCC 74054和Leuconostoc mesenteroides在工业化生产上的联合培养获得一定分子量的葡聚糖酶并申报了专利。寥威、周河治等从土壤中分离出的一株产葡聚糖酶酶活31U/ml的野生菌株SB12，经UV、⁶⁰Co、LiCl诱变筛选后得到了产葡聚糖酶高产菌株SB126，经优化发酵转速、pH值、温度、接种量和发酵时间等发酵条件后，检测酶活达到70U/ml，较野生菌株提高了近两倍。青霉菌葡聚糖酶在毕赤酵母中重组表达，产量达到了3.2g/L。

目前，关于葡聚糖酶的分离纯化方法主要还是采用盐和PEG沉淀、萃取法和色谱法等。Dipak K，Sadhan K等用磷酸钙凝胶色谱从Penicillium lilacinum中分离出了分子量大小为26KDa的葡聚糖酶。C.V.A.Wynter，M.Chang等从厌氧细菌Rt364中分离了具热稳定性的葡聚糖酶，通过硫酸胺沉淀，离子交换，疏水层析和分子排阻色谱分离纯化了分子量大小为140KDa的葡聚糖酶。Elvira Khalikova，Petri Susi等对Bacillus sp.分泌的葡聚糖酶粗酶液用硫酸胺和PEG沉淀，酶活提高了733倍，经过阴离子交换柱和亲和吸附，总酶产率为19％。

目前关于α-葡聚糖酶的研究大多集中于从自然界筛选生产葡聚糖酶的菌株，已知开放阅读框的α-葡聚糖酶真菌类共有7种，主要是青霉菌和曲霉菌，细菌共有13种，主要是链球菌和产气杆菌。对α-葡聚糖酶的纯化步骤都比较复杂，大多3～5步。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法以及涉及的表达载体、菌株，该方法工艺简便、高分泌表达α-葡聚糖酶融合蛋白，获得的α-葡聚糖酶融合蛋白纯度高、活性好、生产成本低。

在本发明的第一方面，提供了一种高效生产α-葡聚糖酶融合蛋白的方法，其点是，包括以下步骤：

a.在适合的表达条件下，培养一酵母工程细胞，所述酵母工程细胞整合有内含编码所述α-葡聚糖酶融合蛋白的核苷酸序列的酵母分泌表达载体，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，从而分泌表达出所述α-葡聚糖酶融合蛋白；

b.分离纯化出表达的所述α-葡聚糖酶融合蛋白。

所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述酵母分泌表达载体是pPIC9k中整合了所述核苷酸序列的pdex-9k-His。

所述步骤a的所述表达条件为：分为培养阶段和诱导阶段，溶氧维持在30％，温度保持在25～28℃，培养阶段培养至发酵罐中甘油基本耗尽时，流加50％甘油，持续6小时，进入诱导阶段，流加100％甲醇诱导，甲醇终浓度在1‰～2‰，诱导pH为6.0。

所述步骤b包括步骤：

(1)发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液；

(2)通过简单的SP-sephrose阳离子交换和Ni亲和层析，即可获得纯度在95％以上的纯品。

所述SP-sephrose阳离子交换的缓冲液的pH值为4.0，所述Ni亲和层析的缓冲液的pH值为6.5。

在本发明的第二方面，提供了一种酵母分泌表达载体，其特点是，所述酵母分泌表达载体含有编码α-葡聚糖酶融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

所述核苷酸序列的编码区包含与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有95％以上相同性的序列和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列有95％以上相同性的序列。

所述的核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述酵母分泌表达载体是pPIC9k中整合了所述核苷酸序列的pdex-9k-His。

在本发明的第三方面，提供了一种酵母工程细胞，其特点是，所述酵母工程细胞整合有上述的酵母分泌表达载体。

所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞。一般常用GS115菌株。

本发明的有益效果如下：

1.本发明通过构建重组毕赤酵母分泌表达载体，并转化毕赤酵母，从而高效分泌表达α-葡聚糖酶融合蛋白，表达量高。

2.由于是分泌表达，而且在α-葡聚糖酶的C末端融合了His Tag标签，经SP-sephrose阳离子交换和Ni亲和层析两步纯化即可获得高纯度的α-葡聚糖酶融合蛋白，纯化效率高，简化了纯化工艺，减少了纯化的成本。

3.同时，利用毕赤酵母表达α-葡聚糖酶融合蛋白，使其糖基化位点能得到正确的修饰，比大肠杆菌表达具有更好的优势。

4.本发明为α-葡聚糖酶融合蛋白的工业化发酵生产奠定了基础。

附图说明

图1为本发明的重组毕赤酵母分泌表达载体的一具体实施例的示意图。

图2为图1的重组毕赤酵母分泌表达载体转化毕赤酵母后获得的重组毕赤酵母Mut⁺/Mut^-表型验证图。

图3为本发明的高表达重组毕赤酵母菌株的发酵结果。

图4表示阳离子交换层析纯化α-葡聚糖酶融合蛋白的结果。

图5表示Ni柱亲和层析纯化α-葡聚糖酶融合蛋白的结果。

图6a为发酵上清液、阳离子交换层析纯化产物和Ni柱亲和层析纯化产物的SDS-PAGE蛋白电泳结果。

图6b为发酵上清液、阳离子交换层析纯化产物和Ni柱亲和层析纯化产物的蛋白印迹鉴定结果。

图7a表示温度对本发明获得的α-葡聚糖酶融合蛋白的酶活的影响。

图7b表示pH值对本发明获得的α-葡聚糖酶融合蛋白的酶活的影响。

图7c表示金属离子和SDS对本发明获得的α-葡聚糖酶融合蛋白的酶活的影响。

具体实施方式

本发明首先构建了α-葡聚糖酶融合蛋白表达载体pdex-9k-His，通过电击法转化毕赤酵母GS115，获得重组菌株。摇瓶发酵筛选一株α-葡聚糖酶融合蛋白的高表达重组菌株，5L发酵上清液中其α-葡聚糖酶融合蛋白的表达量可达到83900U/L。通过SP-sephrose阳离子交换柱和Ni亲和层析两步纯化，得到电泳纯α-葡聚糖酶融合蛋白，其最终纯化效率达37.13％。对重组酶进行初步酶学性质分析表明，最适反应pH约为4.5，最适反应温度约为30℃。本发明的α-葡聚糖酶融合蛋白易于在毕赤酵母中表达，表达量高，成本低，易于纯化，并具有良好的活性。

本发明首先通过PCR方法将6x His Tag编码序列插入pPIC9k(Invitrogen，该表达载体pPIC9k带有一段Saccharomyces cerevisiae的分泌信号肽，使得蛋白质能分泌到胞外)，构建了带有6x His Tag编码序列的甲醇毕赤酵母表达载体pPIC9k-His，并设计一对带有酶切位点的特异引物，从油脂酵母Lipomyces starkeyi 12659^TM基因组中通过PCR的方法克隆了编码α-葡聚糖酶基因序列，将获得的基因片段产物经过双酶切，与经同样酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9k-His连接，将该基因序列插入到pPIC9k-His中，构建了α-葡聚糖酶融合蛋白表达载体pdex-9k-His(当然也可以直接以PCR方法引入HisTag构建α-葡聚糖酶融合蛋白基因序列再将其插入pPIC9k中)，His Tag有利于用Ni亲和层析的方法来纯化。采用电击法将用Sac I线性化的表达载体转入毕赤酵母GS115(Invitrogen)中，获得重组菌株。

将转化后生长在MGY板上的重组子，然后涂于不同浓度的G418板，从高浓度G418板上随机挑选重组子进行用PCR的方法来验证菌株Mut+/Mut-表型。将Mut+重组子进行摇瓶发酵，每24小时，用DNS法测酶活。在诱导72小时后，筛选出一株在48小时有最高酶活的菌株pdex-9k-His7。这样，通过平板筛选和摇瓶筛选得到了一株高效表达α-葡聚糖酶融合蛋白的重组毕赤酵母pdex-9k-His 7。

在5L发酵罐上进行了pdex-9k-His 7的α-葡聚糖酶融合蛋白表达。分为培养阶段和诱导阶段，常规条件培养发酵47小时后，流加甲醇诱导α-葡聚糖酶融合蛋白表达，保持甲醇终浓度为1‰～2‰，此后每4小时用DNS法检测酶活。当持续出现两个酶活降低点时，结束发酵。

发酵上清经过简单离心或过滤，再经阳离子交换和Ni亲和层析纯化。在蛋白质专家数据库中提交该蛋白，得到该蛋白质的等电点为5.71，所以将阳离子柱缓冲液pH值调节至4.0。通过线性梯度洗脱摸索洗脱条件，最终得到含0.5mol/L的NaCl洗脱后，洗脱组分包含全部的α-葡聚糖酶活性。Ni亲和层析的A相含有20mmol/L的咪唑，减少了上样液中杂质的非特异性结合。考虑到咪唑竞争性结合到Ni柱上的pH值范围，选择了对酶活性没有严重抑制的pH值6.5。该步纯化特异性非常强，唯一的洗脱组分含有全部的α-葡聚糖酶活性。本发明通过两步纯化，得到了电泳纯的α-葡聚糖酶融合蛋白，并经过了His-蛋白印迹鉴定。

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。

实施例1构建重组毕赤酵母表达载体pdex-9k-His

(1)pPIC9k-His表达载体构建

根据毕赤酵母表达载体pPIC9k(Invitrogen)的多克隆酶切位点和His4处酶切位点，合成一对引物，其序列如下：上游引物(带有6个His-tag基因序列(SEQ ID NO：3))，5’-ATCGCGGCCGCG

TAATAGAATTAATTCG-3’(单下划线部分为Not I酶切序列，波浪线部分为His-tag基因序列)；下游引物，5’-CGGGTCGACAATGTTCGTCAAAATG-3’(单下划线部分为Sal I酶切序列)；以pPIC9k(Invitrogen)质粒为模板，通过如下PCR反应扩增得到一个1979bp的DNA片段：以总体积50μl进行PCR反应，94℃变性5min，按94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，最后再72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳回收所得的PCR反应片段，经限制性内切酶Not I和Sal I双酶切，用快速连接试剂盒(Takara公司)连接，克隆入经Not I和Sal I双酶切的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9k的Not I和Sal I位点处，获得带有His-tag序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k-His。转化大肠杆菌TOP10。经菌落PCR挑选出阳性转化子，并对阳性转化子进行序列测定，结果表明成功将His-tag克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9k中。

(2)pdex-9k-His表达载体构建

根据油脂酵母的α-葡聚糖酶(简写为dex)基因序列(SEQ ID NO：1)及其编码的蛋白序列(SEQ ID NO：2)和毕赤酵母表达载体pPIC9k-His的多克隆酶切位点，合成一对引物，其序列如下：上游引物，5’-GCGCGAATTCATGACATTAATCTACGTG-3’(下划线部分为EcoR I酶切序列)；下游引物，5’-ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTGACCC-3’(单下划线部分为Not I酶切序列)；采用Tiangen公司酵母基因组提取试剂盒提取油脂酵母12659^TM(保藏号为ATCCLipomyces starkeyi No.12659^TM)基因组。以油脂酵母12659^TM基因组为模板，通过如下PCR反应扩增得到一个1845bp的DNA片段：以总体积50μl进行PCR反应，94℃变性5min，按94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，最后再72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳回收所得的PCR反应片段，经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，用快速连接试剂盒(Takara公司)连接，克隆入经EcoR I和Not I双酶切的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9k-His的EcoR I和Not I位点处，获得带有His-tag序列的重组毕赤酵母表达载体pdex-9k-His(如图1所示)，转化大肠杆菌TOP10。经菌落PCR挑选出阳性转化子，并对阳性转化子进行序列测定，结果表明序列正确(SEQ ID NO：5)，将编码如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

实施例2高表达重组毕赤酵母菌株的获得

(1)重组毕赤酵母表达载体pdex-9k-His的转化和阳性克隆的筛选

重组毕赤酵母表达载体pdex-9k-His经Sac I完全酶切线性化后，电击法转化毕赤酵母GS115菌株(Invitrogen)，转化在不含组氨酸的基本培养基MGY平板上筛选出发生同源重组的His⁺克隆。

利用含有不同浓度的G418的YPD平板，可以估测出整合基因组的外源基因的拷贝数，其操作方法如下：用10ml的无菌水把在MGY(YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，甘油1.5％，琼脂糖1.5％)平板上的转化子洗脱并悬浮，轻微振荡后，稀释适当倍数，以105的细胞浓度分别在含G418浓度为1.0、2.0、3.0、4.0mg/ml的YPD平板上涂布，随机挑选了能在含有3.0、4.0mg/ml G418的YPD平板上生长的转化子单菌落，用PCR方法进行Mut⁺/Mut^-表型鉴定。以6个转化子的基因组为模板(用Tiangen公司酵母基因组提取试剂盒抽提酵母基因组)，用5’-AOX1引物(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)和3’-AOX 1引物(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)，以总体积15μl进行PCR反应，94℃变性5min，按94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，最后再72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。根据葡聚糖酶融合蛋白基因和AOX基因序列大小，Mut⁺转化子显示出两条大小分别为2.2kb和2.4kb的条带(如图2所示)。

(2)摇瓶诱导筛选高表达α-葡聚糖酶融合蛋白菌株

将上述6个转化菌株在20ml MGY培养基(YNB 1.34％，甘油1％，生物素4×10^- ⁵％)中，30℃过夜培养，直到菌液浓度OD600达到2～6。将菌液于50ml离心管中4000g，4℃离心5min。用合适的MM培养基(YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，甲醇0.5％)洗涤一次，4000g，4℃离心5min，去上清。用适量的MM培养基将细胞浓度定OD600为1，然后在30℃下培养。每24小时添加甲醇至终浓度0.5％。每24小时用DNS法测一次酶活，将48小时表达α-葡聚糖酶最高的重组菌株pdex-9k-His 7进行5L发酵罐发酵。

实施例3重组α-葡聚糖酶融合蛋白的高密度发酵诱导表达

在5L发酵罐中加入3L发酵基础培养基，121℃灭菌30min，调节温度至28℃，用氨水调节pH至6.0，加入PTM 4.5ml/L，以10％的接种量接入种子，发酵过程中溶氧维持在30％。

参见图3，发酵分为两个阶段：第一阶段为培养阶段，为菌体生长期，即从接入种子后，培养约37小时，此时菌体已将发酵罐中甘油基本耗尽，具体表现为pH下降，溶氧突然上升。此时流加50％甘油(含有PTM，4.5ml/L)，补料速度为18ml·L^-1·h^-1，持续6小时，至菌体湿重达到232g/L，即进入第二阶段。第二阶段为诱导期。此阶段流加100％甲醇(含有PTM，4.5ml/L)诱导α-葡聚糖酶融合蛋白表达，流速从1ml·L^-1·h^-1逐步提高，用甲醇电极监测，维持甲醇终浓度在1‰～2‰，此后每4小时用DNS法检测酶活，当持续出现两个酶活降低点时，结束发酵。在发酵100小时后，酶活达到最高点，为83900U/L，菌体湿重达到543g/L。整个发酵时间持续107小时，发酵结束时酶活为76600U/L。

实施例4重组α-葡聚糖酶融合蛋白的纯化

将发酵液于4℃8000g离心20min，取上清经0.45μm纤维素膜过滤，稀释发酵上清酶活为10.36U/mg，离子强度为1.5×10³s/cm。利用SP-sephrose Fast Flow离子交换层析柱进行纯化，其中A相缓冲液：20mmol/L柠檬酸，20mmol/L NaH₂PO₄，pH 4.0，B相缓冲液：20mmol/L柠檬酸，20mmol/L NaH₂PO₄，NaCl 1mol/L，pH 4.0。洗脱条件：先用A相平衡阳离子交换柱，直至UV280检测线和电导线回到基线，然后以4ml/min流速，适当A相和B相缓冲液比例洗脱(结果见图4)。洗脱样品经酶活测定后(酶活为181.96U/mg)，过Ni亲和层析柱，其中C相缓冲液：50mmol/L NaH₂PO₄，500mmol/LNaCl，10％甘油，20mmol/L咪唑，pH 6.5，D相缓冲液：50mmol/L NaH₂PO₄，500mmol/LNaCl，10％甘油，1mol/L咪唑，pH 6.5。以2ml/min流速，分别用30％和50％D相梯度洗脱(结果见图5)，得到电泳纯α-葡聚糖酶融合蛋白，其最终纯化效率达37.13％。洗脱样品进行进一步酶活测定，测得酶活188.34U/mg。

实施例5SDS-PAGE和Western Blotting检测葡聚糖酶融合蛋白

将原发酵液，阳离子交换柱纯化后样品，Ni柱纯化后具有葡聚糖酶活性的蛋白样品进行蛋白电泳，采用8％SDS-PAGE胶，用考马斯亮蓝R-250染色，结果见图6a。Western Blotting在100V下湿转PVDF膜3小时，4℃封闭过夜，小鼠His单克隆抗体(天为时代公司)孵育2小时，鼠抗辣根过氧化物酶抗体孵育1小时，用TMB显色。WesternBlotting结果(见图6b)表明经SP阳离子交换纯化后，产物基本为葡聚糖酶融合蛋白，而Ni柱纯化后为特异性的葡聚糖酶融合蛋白条带。

实施例6重组葡聚糖酶融合蛋白的最适反应温度、pH及金属离子影响的测定

维持pH4.5，在不同温度(10℃～60℃)，用DNS法测定酶活性。测得重组葡聚糖酶融合蛋白的最适反应温度为30℃(见图7a)。

配制不同pH值的20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3.5～4.5)，20mmol/L柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(pH 5.0～7.5)，20mmol/L磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH8.0～8.5)，0.5个pH单位为梯度。测定最适反应pH值时，用不同pH值的缓冲液分别稀释纯化过的酶与底物葡聚糖T-2000，在维持温度为37℃下，测定酶活。结果表明重组葡聚糖酶融合蛋白的最适反应pH值为pH 4.5(见图7b)。

配制pH为4.5，浓度为1mmol/L的金属离子(AlCl₃，CaCl₂，CoCl₂，CuSO₄，FeCl₃，KCl，MgCl₂，NaCl，NiSO₄，MnCl₂，ZnCl₂)和1mmol/L的SDS溶液，与一定酶在37℃下保温3小时，然后测定剩余酶活性。测得Al³⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，SDS能完全抑制葡聚糖酶活性，而Mg²⁺和Ca²⁺均能增加酶活，分别为1.45和1.38倍(见图7c)。

综上所述，本发明的重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法工艺简便、高分泌表达α-葡聚糖酶融合蛋白、获得的α-葡聚糖酶融合蛋白纯度高、活性好、生产成本低。

需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

序列表

<110>华东理工大学

<120>重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体和菌株

<160>6

<210>1

<211>1824

<212>DNA

<213>油脂酵母(Lipomyces starkeyi)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1824)

<223>α-葡聚糖酶基因

<400>1

atgacattaa tctacgtgcc ttcaatattt acaatggtcc cctcaatcac acggattgta 60

ctggttaaca ttctgttggc gacgttggtt ttgggagctg cagtccttcc acgagacaac 120

agaactgttt gcgggagtca actctgcaca tggtggcacg actccggcga gataaacacc 180

ggtactcctg tacaggcagg aaacgttcga caatcccgaa agtactctgt ccatgtgagc 240

ctggcagacc gtaaccaatt ctacgactct ttcgtatatg aatcgatacc taggaacggc 300

aatggcagaa tttattctcc caccgaccca cctaacagca atacattgaa tagtagcatt 360

gacgacggta tatcaatcga accatctctc ggcatcaaca tggcttggtc ccagttcgaa 420

tatagacgag atgtcgacat taagattact acaatcgatg gctcaatatt ggatggccct 480

ttggacattg ttattcggcc gacttctgtt aagtactcag tcaaaagatg tgtgggtggt 540

atcattatta gagtccctta tgatcccaat ggtcgaaaat tctctgttga gttaaagagt 600

gacctttaca gttacctctc cgacggttcg caatatgtga cctctggagg gagcgtggtt 660

ggtgtggagc caaaaaatgc cctggtgatc tttgccagcc ctttcttgcc acgggatatg 720

gttcctcata tgacaccaca cgacacccag acaatgaagc cgggcccaat caataatggg 780

gactggggtt caaagcctat actctacttc ccgcctggcg tatactggat gaacgaggat 840

acctctggta accccgggaa gctcggctca aatcatatgc ggctggatcc caatacctac 900

tgggtccatc tagccccagg agcctatgtg aaaggagcca ttgagtattt cacgaagcaa 960

aatttctatg caacgggtca tggcgttctc tcaggtgaga actatgttta tcaggccaat 1020

gcagctgata actactatgc cgtcaagagt gatggcacaa gcttgagaat gtggtggcac 1080

aacaaccttg gaggcggtca aacatggttt tgcatggggc ccaccattaa tgcaccgccg 1140

tttaatacga tggacttcaa cggaaactct aatatttcca gccggattag tgactataag 1200

caggttggcg cttatttttt ccaaacagac ggaccggaga tctacgagga cagtgttgtc 1260

catgacgtct tctggcatgt taatgatgat gccatcaaga catattattc cggagcttca 1320

atttcacgag caaccatctg gaggtgtcac aatgacccga tcatacagat gggctggacg 1380

tcacgaaatc tcaccggaat cagcattgat aacctgcacg tcatccacac gagatatttc 1440

aaatctgaaa cagtggttcc ttcagcaatc attggagcgt ctccattcta cgcaagtgga 1500

atgactgttg atcccagcga gtccatcagc atgaccatct ctaacgtggt gtgtgagggt 1560

ctatgcccct cactgttccg tatcactccg cttcagagct acaacaacct tgttgtcaag 1620

aacgtggcct ttcccgatgg actgcagaca aatccaatcg gaataggaga gagcattata 1680

ccagcagctt ccggctgtac aatggacttg gaaatcacaa actggaccgt caaaggacaa 1740

aaagtcacca tgcaaaactt tcagtccggg tcacttggcc agttcgatat cgatggttca 1800

tactggggtc aatggtccat aaac 1824

<210>2

<211>608

<212>PRT

<213>油脂酵母(Lipomyces starkeyi)

<400>2

Met Thr Leu Ile Tyr Val Pro Ser Ile Phe Thr Met Val Pro Ser Ile

1 5 10 15

Thr Arg Ile Val Leu Val Asn Ile Leu Leu Ala Thr Leu Val Leu Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Pro Arg Asp Asn Arg Thr Val Cys Gly Ser Gln Leu

35 40 45

Cys Thr Trp Trp His Asp Ser Gly Glu Ile Asn Thr Gly Thr Pro Val

50 55 60

Gln Ala Gly Asn Val Arg Gln Ser Arg Lys Tyr Ser Val His Val Ser

65 70 75 80

Leu Ala Asp Arg Asn Gln Phe Tyr Asp Ser Phe Val Tyr Glu Ser Ile

85 90 95

Pro Arg Asn Gly Asn Gly Arg Ile Tyr Ser Pro Thr Asp Pro Pro Asn

100 105 110

Ser Asn Thr Leu Asn Ser Ser Ile Asp Asp Gly Ile Ser Ile Glu Pro

115 120 125

Ser Leu Gly Ile Asn Met Ala Trp Ser Gln Phe Glu Tyr Arg Arg Asp

130 135 140

Val Asp Ile Lys Ile Thr Thr Ile Asp Gly Ser Ile Leu Asp Gly Pro

145 150 155 160

Leu Asp Ile Val Ile Arg Pro Thr Ser Val Lys Tyr Ser Val Lys Arg

165 170 175

Cys Val Gly Gly Ile Ile Ile Arg Val Pro Tyr Asp Pro Asn Gly Arg

180 185 190

Lys Phe Ser Val Glu Leu Lys Ser Asp Leu Tyr Ser Tyr Leu Ser Asp

195 200 205

Gly Ser Gln Tyr Val Thr Ser Gly Gly Ser Val Val Gly Val Glu Pro

210 215 220

Lys Asn Ala Leu Val Ile Phe Ala Ser Pro Phe Leu Pro Arg Asp Met

225 230 235 240

Val Pro His Met Thr Pro His Asp Thr Gln Thr Met Lys Pro Gly Pro

245 250 255

Ile Asn Asn Gly Asp Trp Gly Ser Lys Pro Ile Leu Tyr Phe Pro Pro

260 265 270

Gly Val Tyr Trp Met Asn Glu Asp Thr Ser Gly Asn Pro Gly Lys Leu

275 280 285

Gly Ser Asn His Met Arg Leu Asp Pro Asn Thr Tyr Trp Val His Leu

290 295 300

Ala Pro Gly Ala Tyr Val Lys Gly Ala Ile Glu Tyr Phe Thr Lys Gln

305 310 315 320

Asn Phe Tyr Ala Thr Gly His Gly Val Leu Ser Gly Glu Asn Tyr Val

325 330 335

Tyr Gln Ala Asn Ala Ala Asp Asn Tyr Tyr Ala Val Lys Ser Asp Gly

340 345 350

Thr Ser Leu Arg Met Trp Trp His Asn Asn Leu Gly Gly Gly Gln Thr

355 360 365

Trp Phe Cys Met Gly Pro Thr Ile Asn Ala Pro Pro Phe Asn Thr Met

370 375 380

Asp Phe Asn Gly Asn Ser Asn Ile Ser Ser Arg Ile Ser Asp Tyr Lys

385 390 395 400

Gln Val Gly Ala Tyr Phe Phe Gln Thr Asp Gly Pro Glu Ile Tyr Glu

405 410 415

Asp Ser Val Val His Asp Val Phe Trp His Val Asn Asp Asp Ala Ile

420 425 430

Lys Thr Tyr Tyr Ser Gly Ala Ser Ile Ser Arg Ala Thr Ile Trp Arg

435 440 445

Cys His Asn Asp Pro Ile Ile Gln Met Gly Trp Thr Ser Arg Asn Leu

450 455 460

Thr Gly Ile Ser Ile Asp Asn Leu His Val Ile His Thr Arg Tyr Phe

465 470 475 480

Lys Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile Gly Ala Ser Pro Phe

485 490 495

Tyr Ala Ser Gly Met Thr Val Asp Pro Ser Glu Ser Ile Ser Met Thr

500 505 510

Ile Ser Asn Val Val Cys Glu Gly Leu Cys Pro Ser Leu Phe Arg Ile

515 520 525

Thr Pro Leu Gln Ser Tyr Asn Asn Leu Val Val Lys Asn Val Ala Phe

530 535 540

Pro Asp Gly Leu Gln Thr Asn Pro Ile Gly Ile Gly Glu Ser Ile Ile

545 550 555 560

Pro Ala Ala Ser Gly Cys Thr Met Asp Leu Glu Ile Thr Asn Trp Thr

565 570 575

Val Lys Gly Gln Lys Val Thr Met Gln Asn Phe Gln Ser Gly Ser Leu

580 585 590

Gly Gln Phe Asp Ile Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Trp Ser Ile Asn

595 600 605

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>His Tag

<400>3

catcatcatc atcatcat 18

<210>4

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

His His His His His His

1 5

<210>5

<211>1851

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1851)

<223>α-葡聚糖酶融合蛋白编码序列

<400>5

atgacattaa tctacgtgcc ttcaatattt acaatggtcc cctcaatcac acggattgta 60

ctggttaaca ttctgttggc gacgttggtt ttgggagctg cagtccttcc acgagacaac 120

agaactgttt gcgggagtca actctgcaca tggtggcacg actccggcga gataaacacc 180

ggtactcctg tacaggcagg aaacgttcga caatcccgaa agtactctgt ccatgtgagc 240

ctggcagacc gtaaccaatt ctacgactct ttcgtatatg aatcgatacc taggaacggc 300

aatggcagaa tttattctcc caccgaccca cctaacagca atacattgaa tagtagcatt 360

gacgacggta tatcaatcga accatctctc ggcatcaaca tggcttggtc ccagttcgaa 420

tatagacgag atgtcgacat taagattact acaatcgatg gctcaatatt ggatggccct 480

ttggacattg ttattcggcc gacttctgtt aagtactcag tcaaaagatg tgtgggtggt 540

atcattatta gagtccctta tgatcccaat ggtcgaaaat tctctgttga gttaaagagt 600

gacctttaca gttacctctc cgacggttcg caatatgtga cctctggagg gagcgtggtt 660

ggtgtggagc caaaaaatgc cctggtgatc tttgccagcc ctttcttgcc acgggatatg 720

gttcctcata tgacaccaca cgacacccag acaatgaagc cgggcccaat caataatggg 780

gactggggtt caaagcctat actctacttc ccgcctggcg tatactggat gaacgaggat 840

acctctggta accccgggaa gctcggctca aatcatatgc ggctggatcc caatacctac 900

tgggtccatc tagccccagg agcctatgtg aaaggagcca ttgagtattt cacgaagcaa 960

aatttctatg caacgggtca tggcgttctc tcaggtgaga actatgttta tcaggccaat 1020

gcagctgata actactatgc cgtcaagagt gatggcacaa gcttgagaat gtggtggcac 1080

aacaaccttg gaggcggtca aacatggttt tgcatggggc ccaccattaa tgcaccgccg 1140

tttaatacga tggacttcaa cggaaactct aatatttcca gccggattag tgactataag 1200

caggttggcg cttatttttt ccaaacagac ggaccggaga tctacgagga cagtgttgtc 1260

catgacgtct tctggcatgt taatgatgat gccatcaaga catattattc cggagcttca 1320

atttcacgag caaccatctg gaggtgtcac aatgacccga tcatacagat gggctggacg 1380

tcacgaaatc tcaccggaat cagcattgat aacctgcacg tcatccacac gagatatttc 1440

aaatctgaaa cagtggttcc ttcagcaatc attggagcgt ctccattcta cgcaagtgga 1500

atgactgttg atcccagcga gtccatcagc atgaccatct ctaacgtggt gtgtgagggt 1560

ctatgcccct cactgttccg tatcactccg cttcagagct acaacaacct tgttgtcaag 1620

aacgtggcct ttcccgatgg actgcagaca aatccaatcg gaataggaga gagcattata 1680

ccagcagctt ccggctgtac aatggacttg gaaatcacaa actggaccgt caaaggacaa 1740

aaagtcacca tgcaaaactt tcagtccggg tcacttggcc agttcgatat cgatggttca 1800

tactggggtc aatggtccat aaacgcggcc gcgcatcatc atcatcatca t 1851

<210>6

<211>617

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Met Thr Leu Ile Tyr Val Pro Ser Ile Phe Thr Met Val Pro Ser Ile

1 5 10 15

Thr Arg Ile Val Leu Val Asn Ile Leu Leu Ala Thr Leu Val Leu Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Pro Arg Asp Asn Arg Thr Val Cys Gly Ser Gln Leu

35 40 45

Cys Thr Trp Trp His Asp Ser Gly Glu Ile Asn Thr Gly Thr Pro Val

50 55 60

Gln Ala Gly Asn Val Arg Gln Ser Arg Lys Tyr Ser Val His Val Ser

65 70 75 80

Leu Ala Asp Arg Asn Gln Phe Tyr Asp Ser Phe Val Tyr Glu Ser Ile

85 90 95

Pro Arg Asn Gly Asn Gly Arg Ile Tyr Ser Pro Thr Asp Pro Pro Asn

100 105 110

Ser Asn Thr Leu Asn Ser Ser Ile Asp Asp Gly Ile Ser Ile Glu Pro

115 120 125

Ser Leu Gly Ile Asn Met Ala Trp Ser Gln Phe Glu Tyr Arg Arg Asp

130 135 140

Val Asp Ile Lys Ile Thr Thr Ile Asp Gly Ser Ile Leu Asp Gly Pro

145 150 155 160

Leu Asp Ile Val Ile Arg Pro Thr Ser Val Lys Tyr Ser Val Lys Arg

165 170 175

Cys Val Gly Gly Ile Ile Ile Arg Val Pro Tyr Asp Pro Asn Gly Arg

180 185 190

Lys Phe Ser Val Glu Leu Lys Ser Asp Leu Tyr Ser Tyr Leu Ser Asp

195 200 205

Gly Ser Gln Tyr Val Thr Ser Gly Gly Ser Val Val Gly Val Glu Pro

210 215 220

Lys Asn Ala Leu Val Ile Phe Ala Ser Pro Phe Leu Pro Arg Asp Met

225 230 235 240

Val Pro His Met Thr Pro His Asp Thr Gln Thr Met Lys Pro Gly Pro

245 250 255

Ile Asn Asn Gly Asp Trp Gly Ser Lys Pro Ile Leu Tyr Phe Pro Pro

260 265 270

Gly Val Tyr Trp Met Asn Glu Asp Thr Ser Gly Asn Pro Gly Lys Leu

275 280 285

Gly Ser Asn His Met Arg Leu Asp Pro Asn Thr Tyr Trp Val His Leu

290 295 300

Ala Pro Gly Ala Tyr Val Lys Gly Ala Ile Glu Tyr Phe Thr Lys Gln

305 310 315 320

Asn Phe Tyr Ala Thr Gly His Gly Val Leu Ser Gly Glu Asn Tyr Val

325 330 335

Tyr Gln Ala Asn Ala Ala Asp Asn Tyr Tyr Ala Val Lys Ser Asp Gly

340 345 350

Thr Ser Leu Arg Met Trp Trp His Asn Asn Leu Gly Gly Gly Gln Thr

355 360 365

Trp Phe Cys Met Gly Pro Thr Ile Asn Ala Pro Pro Phe Asn Thr Met

370 375 380

Asp Phe Asn Gly Asn Ser Asn Ile Ser Ser Arg Ile Ser Asp Tyr Lys

385 390 395 400

Gln Val Gly Ala Tyr Phe Phe Gln Thr Asp Gly Pro Glu Ile Tyr Glu

405 410 415

Asp Ser Val Val His Asp Val Phe Trp His Val Asn Asp Asp Ala Ile

420 425 430

Lys Thr Tyr Tyr Ser Gly Ala Ser Ile Ser Arg Ala Thr Ile Trp Arg

435 440 445

Cys His Asn Asp Pro Ile Ile Gln Met Gly Trp Thr Ser Arg Asn Leu

450 455 460

Thr Gly Ile Ser Ile Asp Asn Leu His Val Ile His Thr Arg Tyr Phe

465 470 475 480

Lys Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile Gly Ala Ser Pro Phe

485 490 495

Tyr Ala Ser Gly Met Thr Val Asp Pro Ser Glu Ser Ile Ser Met Thr

500 505 510

Ile Ser Asn Val Val Cys Glu Gly Leu Cys Pro Ser Leu Phe Arg Ile

515 520 525

Thr Pro Leu Gln Ser Tyr Asn Asn Leu Val Val Lys Asn Val Ala Phe

530 535 540

Pro Asp Gly Leu Gln Thr Asn Pro Ile Gly Ile Gly Glu Ser Ile Ile

545 550 555 560

Pro Ala Ala Ser Gly Cys Thr Met Asp Leu Glu Ile Thr Asn Trp Thr

565 570 575

Val Lys Gly Gln Lys Val Thr Met Gln Asn Phe Gln Ser Gly Ser Leu

580 585 590

Gly Gln Phe Asp Ile Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Trp Ser Ile Asn

595 600 605

Ala Ala Ala His His His His His His

610 615

Claims

1.一种高效生产α-葡聚糖酶融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

b.分离纯化出表达的所述α-葡聚糖酶融合蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述酵母分泌表达载体是pPIC9k中整合了所述核苷酸序列的pdex-9k-His。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a的所述表达条件为：分为培养阶段和诱导阶段，溶氧维持在30％，温度保持在25～28℃，培养阶段培养至发酵罐中甘油基本耗尽时，流加50％甘油，持续6小时，进入诱导阶段，流加100％甲醇诱导，甲醇终浓度在1‰～2‰，诱导pH为6.0。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b包括步骤：

(1)发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述SP-sephrose阳离子交换的缓冲液的pH值为4.0，所述Ni亲和层析的缓冲液的pH值为6.5。

6.一种酵母分泌表达载体，其特征在于，所述酵母分泌表达载体含有编码α-葡聚糖酶融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQ ID NO：2和SEQID NO：4所示的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的酵母分泌表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列的编码区包含与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有95％以上相同性的序列和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列有95％以上相同性的序列。

8.如权利要求7所述的酵母分泌表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQ IDNO：5所示核苷酸序列，所述酵母分泌表达载体是pPIC9k中整合了所述核苷酸序列的pdex-9k-His。

9.一种酵母工程细胞，其特征在于，所述酵母工程细胞整合有权利要求6所述的酵母分泌表达载体。

10.如权利要求9所述的酵母工程细胞，其特征在于，所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞。