CN108587932A

CN108587932A - 一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶

Info

Publication number: CN108587932A
Application number: CN201711236766.XA
Authority: CN
Inventors: 郭世平; 张明; 陆健; 蔡国林; 解西柱; 潘贺鹏
Original assignee: JIANGSU NONGKEN MALT Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: JIANGSU NONGKEN MALT Co Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明公开了一种提高麦汁过滤性能的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶，属于生物工程技术领域。本发明对α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶的基因进行了修饰，去除了内含子，信号肽和终止密码子序列，其修饰后的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示，对应的氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。将修饰后的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列与表达载体pPIZαA连接，构建重组表达载体pPIZαA‑QAnabfA并在毕赤酵母X33中表达获得重组α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶。将重组α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶应用到麦汁的制造中提高麦汁的过滤速度。

Description

一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶

技术领域

本发明涉及一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，属于生物工程技术领域。

背景技术

阿拉伯木聚糖(arabinoxylans，AX)是半纤维素的主要成分，其基本结构是以β-(1→4) -D吡喃木糖残基为线形骨架，同时在C(O)-3，(O)-2或C(O)-2，3键联上α-L-阿拉伯呋喃糖残基为侧链取代基。AX的降解需要多种酶的协同作用，如内切β-木聚糖酶、外切β-木聚糖酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等。

在大麦麦芽中AX的含量为3.1％～4.0％，水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractable arabinoxylans,简称WEAX)的含量为0.49％～0.69％。AX在麦汁的制造过程中会产生很多问题，尤其是多聚阿拉伯木聚糖(polymeric arabinoxylans,简称PAX)，比如降低麦汁的过滤速度，增加麦汁的粘度等。但在AX的降解过程中，L-阿拉伯呋喃糖残基的存在阻碍了其它水解酶与AX的有效结合，进而降低了水解酶对AX的降解效率，影响麦汁的过滤性能。α-L- 阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶(α-L-Arabinofuranosidase,简称AnabfA)存在于糖基水解酶的第3、 43、51、54、62和127家族。它可特异性地从L-阿拉伯糖多糖或寡糖残基的非还原末端α-L-1,2-，α-L-1,3-和α-L-1,5-位点水解生成一个阿拉伯糖。AnabfA已经在一些细菌，真菌和植物中获得，但由于酶活较低，不具备工业化应用价值。

根据已发表的文献报道，产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的真菌主要为一些曲霉，如黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)等，除此之外还有一些白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)，腐质霉(Humicola insolens)，里氏木霉(Trichodermareesei)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum), 出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)等也产阿拉伯呋喃糖苷酶。来源于真菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH偏酸性，pH范围为4-5.5，最适反应温度为中高温，温度范围一般为 50℃左右，少数温度偏高可达到75℃。分子量范围在40kDa-110kDa。在细菌中，产阿拉伯呋喃糖苷酶的有类芽孢杆(Paenibacillus)，双歧杆菌(Bifidobacterium)，烟草芽孢杆菌 (Anoxybacilluskestanbolensis)，链霉菌属(Streptomyces)等，来源于细菌的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH一般比真菌来源阿拉伯呋喃糖苷酶偏碱性，pH范围为4.5-6之间，大多数为6左右，最适反应温度为50-65℃之间。还有一些来自于极端环境中的细菌，它们的最适反应温度，pH等差异就比较大。如来自嗜热菌Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应温度为80℃，来自于嗜热厌氧菌Thermoanaerobacter ethanolicus JW200的阿拉伯呋喃糖苷酶75℃的半衰期为1h，来自于枝顶孢菌Acremonium sp.WCQ-6A的阿拉伯呋喃糖苷酶最适反应温度为25℃，来源于嗜酸菌Rhodotorula flava的阿拉伯呋喃糖苷酶最适反应pH为2.0等。目前对植物中的阿拉伯呋喃糖苷酶的研究的主要对象为大麦麦芽中的阿拉伯呋喃糖苷酶，麦芽中的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应温度和pH分别为60和4.5左右。克隆表达的宿主菌一般为大肠杆菌和毕赤酵母，来源于原核生物的基因一般在大肠杆菌中表达，来源于真核生物的基因一般于毕赤酵母中进行异源表达。

目前，国内外对AnabfA的研究重视程度不够，尚未有商品化的酶问世，而且对AnabfA 的应用研究也比较少。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，以毕赤酵母为宿主，以pPICZαA为载体，表达SEQ ID NO.1所示的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为毕赤酵母X-33。

本发明的第二个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将SEQ ID NO,2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因插入到表达质粒pPICZαA的限制性内切酶EcoRI和NotI之间的位点上，获得重组表达载体pPICZαA-QAnabfA，再转化至毕赤酵母中进行表达。

在本发明的一种实施方式中，SEQ ID NO.2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因是在SEQ ID NO.3的基础上，去除编码信号肽、内含子和终止子序列的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列。

在本发明的一种实施方式中，用限制性内切酶Sac I线性化重组表达载体 pPICZαA-QAnabfA，再通过电转化的方法转入到毕赤酵母中。

本发明的第三个目的是提供一种制备重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的方法。包括以下步骤

(1)重组表达载体pPICZαA-QAnabfA整合到毕赤酵母的基因组上，得到重组菌株。

(2)培养重组菌株，诱导重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的表达,；

(3)回收并纯化重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶。

在本发明的一种实施方式中，将所述基因工程菌在BMGY中进行种子扩大培养，将扩培的种子液接种于BMMY中进行诱导发酵；发酵条件为：发酵于500mL的三角瓶中进行，装液量100mL，温度30℃，转速200r/min，诱导剂甲醇的添加量为每24h添加1％的甲醇，发酵时间为4d。

本发明的第四个目的是提供上述重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括用于大麦麦芽麦汁的制造中。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是在大麦麦芽糖化的初始阶段添加重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

在本发明的一种实施方式中，重组酶的添加量为20～50mU/g绝干麦芽。

在本发明的一种实施方式中，重组酶的添加量为31.2mU/g绝干麦芽。

在本发明的一种实施方式中，所述重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶与木聚糖酶协同作用于大麦麦芽汁中。

在本发明的一种实施方式中，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶和木聚糖酶不同时添加。

在本发明的一种实施方式中，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的添加量为0.067U/mL麦芽汁，木聚糖酶的添加量为333U/mL麦芽汁。

有益效果：应用本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶可以使麦汁的过滤速度提高12.8％，粘度降低2.4％，浊度提高2.3％。随着重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的添加，麦汁中AX的含量增加了1.1％，PAX的含量减少了2.9％。PAX的降解可以降低麦汁的粘度，使麦汁的过滤速度提高12.8％。

本发明将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶应用于大麦麦芽阿拉伯木聚糖的降解中，当重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶同时作用于木聚糖时协同能力为113％；当先加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶再加木聚糖酶作用于木聚糖时协同能力为122％，当先加木聚糖酶再加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用于木聚糖时协同能力124％。

附图说明

图1为重组表达质粒pPIZαA-QAnabfA的构建图谱；

图2为重组菌株发酵液SDS-PAGE分析，M：标准蛋白Marker；1～2：空载重组菌发酵液上清；3～4：重组菌发酵上清；

图3为重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶纯化后SDS-PAGE分析，M：标准蛋白Marker；1～2：未纯化的酶液；3：纯化的酶液

图4为重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶经糖基化酶处理后的SDS-PAGE分析，M：标准蛋白 Marker；1：糖基化酶处理后的酶2：未经糖基化酶处理的酶

图5为温度对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力及其稳定性的影响；

图6为pH对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力及其稳定性的影响；

图7为金属离子对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活的影响；

图8为糖化过程温度控制曲线图。

具体实施方式

1、菌株和质粒：Aspergillus niger CBS513.88，Pichia pastoris X-33，E.coliJM109均由本实验室保藏；质粒pMD18-T simple vector，pPICZαA均购自于TaKaRa公司。

2.主要酶、试剂和培养基：肽N-糖苷酶F，O-Glycosidase购自于New EnglandBiolabs(NEB) 公司，DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶，rTaq酶，高保真DNA聚合酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，均购自于TaKaRa公司；蛋白质Marker，博莱霉素(zeocin)购自于BBI生命科学有限公司；对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(4-Nitrophenylα-L-arabinofuranoside)购自于 Sigma公司；木聚糖酶(xylanase,简称xyn)

购自于白银赛诺生物科技有限公司；LB、YPD、BMMY、BMGY培养基均按照Invitrogen公司的毕赤酵母菌实验操作手册配制。

实施例1：黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的分析与克隆

利用液氮研磨的方法提取黑曲霉的基因组。从Genbank查询到的黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶的基因基因大小为1790bp，只有一个50bp内含子序列。其编码的蛋白质序列含有579个氨基酸，通过信号肽预测软件SignaIP，对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的氨基酸序列进行预测，结果表明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶N端含有18个氨基酸信号肽，该蛋白理论分子量为70kDa。利用NetNGlyc 1.0 Server和NetOGlyc 4.0 Server对酶的糖基化水平及其糖基化位点进行分析，结果显示，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶氨基酸条带上有9个N糖基化位点和5个O糖基化位点。

设计引物P1、P2、P3、P4，引物序列如表1所示。以黑曲霉的基因组为模版，利用重叠PCR技术去除AnabfA的信号肽、内含子和终止密码子序列获得目的基因片段QAnabfA。将QAnabfA与T载体pMD18-T连接得到重组质粒QAnabfA-T，并转化E.coli JM109进行保藏送到上海生工生物有限公司进行测序。基因测序结果显示序列长度为1683bp，信号肽、内含子和终止密码子序列完全去除，获得SEQ ID NO.2所示的基因序列。

表1 PCR反应引物

实施例2：重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的制备

将去除信号肽、内含子和终止密码子序列的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因片段(SEQID NO.2所示)与表达载体进行连接，得到重组表达质粒pPICZαA-QAnabfA，重组表达质粒pPIZαA-QAnabfA的构建图谱如图1所示。重组表达载体pPICZαA-QAnabfA通过Sac I酶切线性化后，利用电转化的方法转入毕赤酵母X-33，用含zeocin抗生素的平板对转化后的毕赤酵母进行初步筛选，得到阳性转化子。提取其基因组，利用PCR对阳性转化子进行二次筛选，得到重组菌株。

利用BMGY对重组菌株和空载重组菌株进行种子扩大培养，BMMY培养基对重组菌株和空载重组菌株进行发酵培养，发酵条件：500mL三角瓶中，装液量为100mL，温度30℃，转速200r/min，甲醇添加量为每24h添加终浓度为1％的甲醇，发酵时间4d。

取发酵四天后的培养液的上清，进行SDS-PAGE检测，结果(图2)表明，由于毕赤酵母中蛋白质的糖基修饰化作用，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶表观分子量在100kD左右。用酶PNGase F和O-Glycosidase切除重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的糖基化侧链，进行SDS-PAGE鉴定，结果(图3)表明，泳道2中103kDa和36kDa处的条带分别为酶O-Glycosidase和 PNGaseF的条带，因此70kDa处的条带为目的蛋白条带，符合理论值大小。

通过镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化，纯化后的蛋白分离液进行SDS-PAGE鉴定，结果(图4)表明，泳道3只有一条蛋白质条带，说明纯化效果良好。

实施例3重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活测定和酶学性质分析

酶活测定的反应体系为200μl，取25μl对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷溶液，50μl 0.1MpH5.5 醋酸钠缓冲液，25μl酶溶液于50℃的水浴锅中反应15min，用经沸水浴灭活10min的酶液作空白对照，反应结束后迅速加入100μl 1M Na₂CO₃终止反应，室温静置15min后，用酶标仪测410nm下的OD值，根据对硝基苯酚制作的标准曲线，计算出样品中对硝基苯酚的含量。酶活的定义：每分钟产生1μM的对硝基苯酚所需的酶量为一个酶单位。以Bradford测定发酵液蛋白质的浓度，从而测定酶的比活。

1.温度对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活力及其稳定性的影响

在pH5.5的条件下，用酶标仪测定酶在不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65℃)下的酶活，以测得的的最高酶活为100％，计算其它温度下的相对酶活，将酶在上述各温度下保温30min后，测定残余酶活。结果(图5)表明，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度为50℃，在温度30℃-55℃的水浴锅中温浴30min后，能保存有80％以上的酶活，在65℃以上的水浴锅中温浴30min，酶活完全丧失。

2.pH对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活力及其稳定性的影响

用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制不同pH(2.4、3、3.4、4、4.4、5、5.4、6、6.4、7、7.4、 8)的pNPAF溶液，在温度50℃的条件下测定不同pH条件下的相对酶活，把酶液在上述不同pH条件下处理30min后，测定其残余酶活。结果(图6)表明，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶最适pH为5.5，在pH3.5-5.5的缓冲液中温浴30min后，能保存80％以上的酶活。在pH 低于2.5或高于8.0的缓冲液中温浴30min后，酶活基本丧失。

3.金属离子对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影响

纯化后的酶液加入到终浓度为1mmol/L的金属离子(K⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Al³⁺)，以不加金属离子的酶液为对照，测定这些金属离子对酶的影响。结果(图7)表明，Cu²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活有抑制作用，相对酶活力只有对照的17％、8％、80％；Fe³⁺对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活有促进作用，相对酶活为对照的131％；Ni²⁺、K⁺、Al³⁺、Co²⁺、Mn²⁺和Mg²⁺对其酶活几乎没有影响。

4.重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的V_max值和K_m值的测定

将纯化的酶加入到含有不同底物浓度对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(0.1875-1.875mmol/L) 中，在pH5.5温度50℃下反应10min，计算初始反应速度。利用Lineweavere-Burk plot法计算获得V_max值和K_m值分别为0.78mM和2.57μmol/min/mg。

实施例4重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的应用

取50g经EBC粉碎机粉碎的单二大麦麦芽于糖化杯中，加入200ml去离子水和31.2mU/g 绝干麦芽重组AnabfA进行协定糖化(图8)。糖化结束后，在10～15min内使醪液冷却至室温，用去离子水使糖化杯中的内容物定重为450g，将糖化醪搅拌均匀，并用中速滤纸过滤，将最初收集的100mL滤液返回重滤，收集滤液，即为协定麦汁。测定麦汁的过滤速度，粘度，浊度，AX和PAX含量。过滤速度：从最初收集的100mL滤液返回重滤开始计时，30min 内过滤出多少体积的麦汁，即为过滤速度。麦汁的浊度采用EBC浊度计直接读数进行测定，EBC浊度计上的读数是按EBC富尔马进浊度单位显示的，样品可以由它直接测出EBC混浊度数。麦汁的粘度采用落球计粘度测定法，浊度和粘度的测定都是参考啤酒工业手册。PAX 为麦汁80％的乙醇沉淀物，用Douglas法测定AX和PAX的含量。以未添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作为对照，在相同条件下进行糖化。糖化结束后，结果表明(表2)，麦汁的过滤速度提高了12.8％，粘度降低了2.4％，浊度提高了2.3％。随着重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的添加，麦汁中AX的含量增加了1.1％，多聚阿拉伯木聚糖(PAX)的含量减少了2.9％，表明重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可以使水不溶性的阿拉伯木聚糖部分溶解，同时也促进了PAX的降解。PAX 的降解可以降低麦汁的粘度，提高麦汁的过滤速度。

表2重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对麦汁过滤性能的影响

比较不同添加方式下重组AnabfA与木聚糖酶对底物的作用效果：

反应底物：大麦阿拉伯木聚糖，从单二大麦麦芽中提取。反应在0.1M的醋酸盐缓冲液和50℃恒温水浴锅中进行，反应总体系为10mL，重组AnabfA0.067U/mL，木聚糖酶333 U/mL，阿拉伯木聚糖2mg/mL。对照组：以不加酶只加底物的反应体系为空白对照。

同时作用：重组AnabfA与木聚糖酶同时作用于底物，反应时间4h。

连续作用：先用一种酶(重组AnabfA或木聚糖酶)作用与底物，反应4h后，在沸水浴中灭活10min，再加入另一种酶(木聚糖酶或重组AnabfA)反应4h。

利用DNS法对同时作用和连续作用后产生的还原糖的量进行测定。以协同能力表征作用效果。协同能力：重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶同时或连续作用于底物产生还原糖的量与两种酶分别单独作用于底物产生的还原糖量之和的比值。

结果表明(表2)，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶同时作用于木聚糖时协同能力为113％；当先加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶再加木聚糖酶作用于木聚糖时协同能力为122％，当先加木聚糖酶再加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用于木聚糖时协同能力124％。这说明当以大麦麦芽木聚糖为底物时，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶具有良好的协同作用，并且这两种酶对木聚糖的降解是相互促进的。进一步证明在麦芽糖化的过程中，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可以与麦芽本身的木聚糖酶通过协同作用促进麦汁中PAX的降解。

表3重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶降解大麦麦芽木聚糖的协同作用

对照例1

按照实施例1～2的方式构建重组菌，区别在于，不对SEQ ID NO.3所示的基因序列去除信号肽、密码子和内含子序列，重组菌无法检测到α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 561

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Pro Thr Thr Asn His Thr Tyr Thr Asn Pro Ile Leu Pro Gly Trp

1 5 10 15

His Ser Asp Pro Thr Cys Ala His Val Pro Glu Gln Asn Thr Thr Phe

20 25 30

Cys Ala Thr Ser Thr Phe Ile Ala Tyr Pro Gly Leu Pro Ile Tyr Ala

35 40 45

Ser Lys Asp Leu Gln Asn Trp Lys Leu Ala Ser Asn Ala Phe Asn Arg

50 55 60

Pro Ser Gln Ile Pro Asp Leu Arg Asn Thr Thr Asp Gln Gln Gly Gly

65 70 75 80

Ile Tyr Ala Pro Thr Leu Arg Tyr His Asn Gly Thr Phe Tyr Leu Ile

85 90 95

Val Thr Tyr Leu Gly Ser Asp Ile Gln Gly Leu Leu Phe Thr Thr Thr

100 105 110

Asn Pro Tyr Asn Asn Ser Ala Trp Thr Asp Pro Leu Val Phe Ala Val

115 120 125

Thr Gly Ile Asp Pro Asp Ile Phe Trp Asp Asp Asp Gly Thr Val Tyr

130 135 140

Val Thr Ser Ala Asn Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn His Ile Gln Gln

145 150 155 160

Tyr Ser Leu Asp Leu Thr Thr Gly Ala Thr Gly Pro Val His Asn Leu

165 170 175

Trp Asn Gly Thr Gly Gly Ser Ser Pro Glu Gly Pro His Met Phe Arg

180 185 190

Lys Asp Gly Tyr Tyr Tyr Leu Met Ile Ala Glu Gly Gly Thr Glu Leu

195 200 205

Gly His Ser Glu Thr Ile Ala Arg Ser Arg Phe Arg Thr Gly Pro Trp

210 215 220

Glu Ala Tyr Ser Arg Asn Pro Leu Leu Thr Asn Arg Asn Thr Thr Gln

225 230 235 240

Tyr Phe Gln Thr Val Gly His Ala Asp Leu Phe Gln Asp Ser Met Gly

245 250 255

Asp Trp Trp Ala Val Ala Leu Ser Thr Arg Ser Gly Pro Ala Trp Lys

260 265 270

Asn Tyr Pro Met Gly Arg Glu Thr Val Leu Ala Pro Ala Arg Trp Glu

275 280 285

Val Gly Glu Trp Pro Val Val Gln Pro Val Arg Gly Val Met Ser Gly

290 295 300

His Leu Met Pro Glu Asp Arg Gly Ile Thr Val Gly Glu Gly Gly Trp

305 310 315 320

Ile Asp Gln Pro Asp Arg Val Asp Phe Val Pro Gly Ser Ala Ile Pro

325 330 335

Ala His Phe Val Tyr Trp Arg Tyr Pro Arg Thr Glu Asp Phe Gly Val

340 345 350

Ser Pro Glu Gly Tyr Pro Asn Thr Leu Arg Leu Thr Pro Ser Phe Tyr

355 360 365

Asn Leu Thr Gly Thr Pro Glu Phe Lys Pro Asp Asp Gly Leu Thr Leu

370 375 380

Val Met Arg Arg Gln Thr Asp Thr Leu Phe Thr Tyr Gly Val Asp Val

385 390 395 400

Ser Phe Asp Pro Glu Val Asp Asp Glu Glu Ala Gly Val Thr Val Phe

405 410 415

Leu Thr Gln Glu Gln His Ile Asp Leu Gly Ile Val Leu Leu Gln Asn

420 425 430

Asp Leu Ser Phe Arg Phe His Val Glu Gly Arg Gly Asn Tyr Asp Gly

435 440 445

Pro Leu Pro Gly Arg Thr Val Pro Val Pro Lys Glu Trp Gln Ala Gly

450 455 460

Pro Ile Arg Leu Glu Ile Gln Ala Val Asn Asp Thr Thr Tyr Ala Phe

465 470 475 480

Ala Ala Ala Pro Ser Arg Ser Pro Ser Gln Arg Lys Ile Ile Gly Tyr

485 490 495

Ala Asp Thr Arg Ile Val Ser Gly Gly Thr Gly Arg Phe Thr Gly Ser

500 505 510

Leu Val Gly Ala Tyr Ala Thr Lys Asn Gly Gly Ala Gly Phe Thr Pro

515 520 525

Ala Tyr Ile Ser Arg Trp Arg Tyr Gln Gly Gln Gly Gln Glu Ile Asp

530 535 540

Phe Gly Arg Ile Val Pro Ser Trp Thr Arg Ser Val Ala Ser Val Glu

545 550 555 560

Asp

<210> 2

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tatcccacaa caaatcacac ctacaccaac cccatccttc ccggctggca ctccgaccca 60

acatgcgcgc acgtcccgga gcaaaacacc accttctgcg ccacctccac cttcatcgcc 120

taccccggac tccccatcta cgccagtaaa gacctccaga actggaaatt ggccagcaat 180

gccttcaacc ggccatctca aattcccgat ctccgcaaca ccacggacca acaaggtggc 240

atctacgccc caactctgcg ctaccacaac ggcaccttct acctgatcgt cacctacctc 300

ggctcagaca tccaaggcct tctcttcacc accaccaacc cctacaacaa ctccgcctgg 360

accgaccccc tcgtcttcgc cgtcaccggc atcgacccag atatcttctg ggacgacgat 420

ggcaccgtct acgtcacatc cgcaaacagc ggctcctcca gcggcaacca catccaacag 480

tactccctcg acctcactac cggggctacc ggcccagtcc acaacctctg gaacggcacc 540

gggggttcca gccccgaggg gccacacatg ttccgcaaag acggatacta ctacctcatg 600

atcgccgagg gagggaccga actcggccat tcggagacta ttgcgcggtc taggttccgg 660

accgggccat gggaagctta ttcgcggaat ccgctgctga cgaatcgcaa tacaacgcag 720

tatttccaga cggttggaca tgcggatctg tttcaggata gcatggggga ttggtgggct 780

gtggcgctga gtacgcggtc tgggccggcg tggaagaact atcccatggg gagagagacg 840

gttcttgcgc cggcgagatg ggaggtgggc gagtggccag ttgtgcagcc ggttaggggg 900

gtgatgagcg ggcatttgat gccggaggat agggggatta cagttggtga gggaggctgg 960

attgaccagc ctgatagggt ggatttcgtt cccgggtcgg cgataccggc gcattttgtg 1020

tattggaggt atcccaggac ggaggatttt ggggtctcgc cggagggata tcctaatact 1080

ttgaggttga ctccgtcgtt ttataatctg acggggacac cggagttcaa gccagatgac 1140

gggttgacgc tggttatgcg tcgacagacg gatacgctgt tcacatatgg tgtggatgtc 1200

tcgtttgatc ccgaggtgga tgatgaggaa gcaggggtta cggtcttttt gacgcaggag 1260

cagcatattg acctgggaat tgtgttacta cagaatgacc tgtcattcag attccacgtt 1320

gaaggtcgcg gtaactacga cggtcctctt cctggacgaa ctgttcctgt tccaaaagag 1380

tggcaggcag gtcctatcag gcttgagatt caggctgtca acgacacaac ttatgctttt 1440

gcggctgcgc catcgagaag cccgagtcag aggaagatca ttgggtatgc agatacgagg 1500

attgtaagtg gtggcactgg tcgatttact ggctcgcttg ttggtgctta tgccacgaag 1560

aatggaggcg ctgggtttac gccggcttat attagtagat ggagatatca agggcaaggt 1620

caggaaattg attttggtcg tatagtaccg agctggacca ggtctgttgc atcggtggaa 1680

gac 1683

<210> 3

<211> 1790

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtggttct ccaccctcct catcaccact ctactatcaa ccactacatc ctcctatccc 60

acaacaaatc acacctacac caaccccatc cttcccggct ggcactccga cccaacatgc 120

gcgcacgtcc cggagcaaaa caccaccttc tgcgccacct ccaccttcat cgcctacccc 180

ggactcccca tctacgccag taaagacctc cagaactgga aattggccag caatgccttc 240

aaccggccat ctcaaattcc cgatctccgc aacaccacgg accaacaagg tggcatctac 300

gccccaactc tgcgctacca caacggcacc ttctacctga tcgtcaccta cctcggctca 360

gacatccaag gccttctctt caccaccacc aacccctaca acaactccgc ctggaccgac 420

cccctcgtct tcgccgtcac cggcatcgac ccagatatct tctgggacga cgatggcacc 480

gtctacgtca catccgcaaa cagcggctcc tccagcggca accacatcca acagtactcc 540

ctcgacctca ctaccggggc taccggccca gtccacaacc tctggaacgg caccgggggt 600

tccagccccg aggggccaca catgttccgc aaagacggat actactacct catgatcgcc 660

gagggaggga ccgaactcgg ccattcggag actattgcgc ggtctaggtt ccggaccggg 720

ccatgggaag cttattcgcg gaatccgctg ctgacgaatc gcaatacaac gcagtatttc 780

cagacggttg gacatgcgga tctgtttcag gatagcatgg gggattggtg ggctgtggcg 840

ctgagtacgc ggtctgggcc ggcgtggaag aactatccca tggggagaga gacggttctt 900

gcgccggcga gatgggaggt gggcgagtgg ccagttgtgc agccggttag gggggtgatg 960

agcgggcatt tgatgccgga ggataggggg attacagttg gtgagggagg ctggattgac 1020

cagcctgata gggtggattt cgttcccggg tcggcgatac cggcgcattt tgtgtattgg 1080

aggtatccca ggacggagga ttttggggtc tcgccggagg gatatcctaa tactttgagg 1140

ttgactccgt cgttttataa tctgacgggg acaccggagt tcaagccaga tgacgggttg 1200

acgctggtta tgcgtcgaca gacggatacg ctgttcacat atggtgtgga tgtctcgttt 1260

gatcccgagg tggatgatga ggaagcaggg gttacggtct ttttgacgca ggagcagcat 1320

attgacctgg gaattgtgtt actacagaat gacctgtcat tcagattcca cgttgaaggt 1380

cgcggtaact acgacggtcc tcttcctgga cgaactgttc ctgttccaaa agagtggcag 1440

gcaggtccta tcaggcttga gattcaggct gtcaacgaca caacttatgc ttttgcggct 1500

gcgccatcga gaagcccgag tcagaggaag atcattgggt atgcagatac gaggattgta 1560

agtggtggca ctggtcgatt tactggtaag ttggtccctt atattatcga tttgttgcag 1620

tgttgacatt tgtaggctcg cttgttggtg cttatgccac gaagaatgga ggcgctgggt 1680

ttacgccggc ttatattagt agatggagat atcaagggca aggtcaggaa attgattttg 1740

gtcgtatagt accgagctgg accaggtctg ttgcatcggt ggaagactag 1790

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcgaattct atcccacaac aaatcacacc 30

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agtaaatcga ccagtgccac cac 23

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtggtggcac tggtcgattt actggctcgc ttgttggtgc ttatgc 46

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atttgcggcc gcgtcttcca ccgatgc 27

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gactggttcc aattgagaag c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggatgtcaga atgccatttg c 21

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，以pPICZαA为载体，表达SEQ IDNO.1所示的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，宿主为毕赤酵母X-33。

3.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，将SEQ ID NO,2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因与pPICZαA连接，再转化至毕赤酵母中进行表达。

4.一种制备重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO,2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因与pPICZαA连接，再整合到毕赤酵母的基因组上，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的表达。

5.一种提高麦汁过滤性能的方法，其特征在于，向大麦麦芽汁中加入SEQ ID NO.1所示的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在大麦麦芽糖化的初始阶段添加所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，添加量为20～50mU/g绝干麦芽。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是由权利要求1所述的基因工程菌发酵获得的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还加入木聚糖酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征碍于，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶和木聚糖酶不同时添加。

10.如SEQ ID NO.1所示的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在啤酒酿造领域的应用。