CN110713998B - 一种阿拉伯木聚糖降解酶系的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿拉伯木聚糖降解酶系的制备方法及其应用，属于啤酒生产技术领域。该酶系通过将里氏木霉加入以玉米芯和麸皮为碳源的发酵培养基中发酵得到。该降解酶系蛋白中包含3种内切木聚糖酶和α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶。将该降解酶系蛋白添加到大麦麦芽的糖化过程中，当添加量为0.36mg/g时，麦汁中的高分子量阿拉伯木聚糖被100％降解，麦汁的粘度下降了12.9％，过滤速度提高了112％，过滤得到的麦汁体积提高了55.8％。

Description

一种阿拉伯木聚糖降解酶系的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种阿拉伯木聚糖降解酶系的制备方法及其应用，属于啤酒生产技术领域。
背景技术
啤酒糖化生产中，糖化醪液经过滤槽分离而得到透明澄清的麦汁，糖化醪液中麦汁的分离速度即过滤速度。大麦麦芽的过滤速度对啤酒生产效率和成品啤酒的品质均具有重要的影响，因而麦汁的过滤速度是酿酒师最为重视的指标之一，其决定了啤酒生产过程的效率。有研究发现是由于乳细胞壁中的阿拉伯木聚糖影响了过滤速度。由于高分子量的阿拉伯木聚糖水溶液具有较高的粘度，致使大麦麦芽的过滤速度慢，糖化的粘度高，不利于酶与底物的接触和降解，导致蛋白和淀粉等大分子物质不能充分降解，浸出物收得率较低，延长了啤酒单批次的生产时间，增加了生产成本。
阿拉伯木聚糖是大麦胚乳细胞壁中最主要的组成成分，当其在麦汁中的含量高时，其影响麦汁的粘度和过滤速度。添加外源微生物木聚糖酶是解决这一问题的有效方法。
阿拉伯木聚糖的完全降解需要一系列酶共同完成，该酶系主要包括：内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，β-1,4-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)及阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.6)，这些酶的作用位点见图1。A位点为β-1,4-木聚糖酶，其以内切方式作用于阿拉伯木聚糖主链中未被阿拉伯呋喃糖基团取代的β-1,4-木糖苷键，生成聚合度不同的低聚木糖和少量的木糖，是降解阿拉伯木聚糖的关键酶，也是目前被研究最多、最透彻的一种木聚糖酶；B位点为α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯木聚糖侧链上取代基团会在空间上阻碍木聚糖酶-底物诱导构象的形成，使木聚糖酶无法打开主链上的糖苷键，从而降低木聚糖酶的水解效率，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用于侧链的取代基团释放阿拉伯糖，有利于消除这一影响；C位点为阿魏酸酯酶，其作用于O-5位上与阿拉伯呋喃糖基团以酯键相连的阿魏酸，释放阿魏酸；D位点为β-木糖苷酶，作用于木聚糖酶的水解产物——低聚木糖，从非还原端进一步降解低聚木糖生成β-木糖，在将阿拉伯木聚糖彻底降解为木糖的过程中起重要作用。对于降解高分子量的阿拉伯聚糖，进而降低溶液的粘度和提高过滤速度来说，主链酶——β-1,4-木聚糖酶和侧链酶——α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶起关键性作用，β-木糖苷酶和阿魏酸酯酶在需要将阿拉伯木聚糖彻底降解为单糖的情况下(如生物柴油)，才发挥重要作用。
目前的文献或者生产实践中均为通过在啤酒生产过程中添加各种木聚糖酶单酶或者人工复配的多种微生物来源的酶制剂来降解阿拉伯木聚糖，过程复杂、成本较高。如果一种微生物能够分泌完整的阿拉伯木聚糖降解酶系，且能够有效降解大麦麦芽中的高分子量阿拉伯木聚糖，对于简化啤酒酿造过程、降低成本、提高生产效率及啤酒品质具有非常重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种阿拉伯木聚糖降解酶系制备方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种阿拉伯木聚糖降解酶系的制备方法，所述方法是以里氏木霉CICC41495为发酵菌株，所述里氏木霉购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，保藏编号为CICC41495。
在本发明的一种实施方式中，所述阿拉伯木聚糖降解酶系是所述里氏木霉CICC41495在以玉米芯和麸皮为碳源的培养基中发酵获得，所述玉米芯和麸皮的比例为1～5:1。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：(1)将里氏木霉CICC41495接种于种子培养基，在25～35℃培养36～48h；(2)将种子液接入含有麸皮和玉米芯的培养基在25～35℃培养150～200h。
在本发明的一种实施方式中，所述阿拉伯木聚糖降解酶系包含3种内切木聚糖酶，1种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和一种β-木糖苷酶，所述的3种内切木聚糖酶分别为内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅰ，内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅱ，内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅲ，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶属于糖苷水解酶第62家族。
在本发明的一种实施方式中，将里氏木霉CICC41495发酵获得的发酵液直接进行冷冻干燥制成粉剂。
本发明提供一种所述阿拉伯木聚糖降解酶系在啤酒生产中的应用。
在本发明的一种实施方式中，将制备得到的阿拉伯木聚糖降解酶系添加至啤酒糖化过程的大麦麦芽醪液中。
本发明提供一种阿拉伯木聚糖降解酶系在饮品制备中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述饮品包含熟啤酒、生啤酒、鲜啤酒、干啤酒、冰啤酒、低醇啤酒、无醇啤酒、小麦啤酒、浑浊啤酒、果蔬汁型啤酒、果蔬味型啤酒。
有益效果：
本发明采用里氏木霉CICC41495为菌种，以玉米芯和麸皮为碳源进行摇瓶发酵获得的阿拉伯木聚糖降解酶系，酶种齐全，成本低廉，将其添加到啤酒生产糖化阶段的大麦麦芽醪液中，能够将高分子量阿拉伯木聚糖100％降解，麦汁的粘度由1.55mPa·s降低至1.35mPa·s，下降了12.9％；过滤速度由4.8mL/min提高到10.2mL/min，提高了112％；过滤得到的麦汁体积由215mL提高到335mL，提高了55.8％，对于麦芽和啤酒的生产都具有重要的意义。
附图说明
图1为阿拉伯木聚糖降解酶系的酶切位点，A表示β-1,4-木聚糖酶，B表示α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，C表示阿魏酸酯酶，D表示β-木糖苷酶。
图2为采用几种不同碳源获得的里氏木霉CICC41495发酵液中的蛋白条带的分析，泳道1为麸皮，泳道2为玉米芯，泳道3为麸皮+玉米芯，泳道4为葡萄糖，泳道5为微晶纤维素，泳道6为玉米粉。
图3为里氏木霉CICC41495分泌的酶蛋白的双向电泳图谱，1-8分别表示从降解酶系中的内切-1,4-β-木聚糖酶I、内切-1,4-β-木聚糖酶II、1,4-β-木聚糖酶Ⅲ、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等蛋白。
图4为添加阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白对麦汁高分子量阿拉伯木聚糖含量的影响。
图5为添加阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白对粘度的影响。
图6为添加阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白对过滤速度的影响。
图7为添加阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白对麦汁产量的影响。
具体实施方式
(1)内切木聚糖酶活力测定
①以10mg/mL的燕麦木聚糖为底物，取0.5mL的底物溶液与0.5mL适当稀释的酶液混合；
②将①中混合液在37℃下反应30min，加入DNS试剂1.25mL终止反应；
③于540nm处测定OD值，根据标准曲线计算内切木聚糖酶活力。
注：一个酶活力单位(U)是指在测定条件下每分钟水解燕麦木聚糖产生1μmol的木糖所需的酶量。
(2)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的测定
①以浓度为2mmol/L的4-硝基苯基-α-L-阿拉伯糖醛酸苷为底物，取0.5mL的底物溶液与适当稀释的酶液混合；
②将①中混合液在50℃下反应30min，加入1.0mL、0.5mol/L的碳酸钠终止反应；
③于410nm处测定OD值，根据标准曲线计算α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶活力。
注：一个酶活力单位(U)是指在测定条件下每分钟水解1μmol的4-硝基苯基-α-L-阿拉伯糖醛酸苷所需的酶量。
(3)β-木糖苷酶活力测定
①以浓度为20mmol/L的对硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷为底物，取0.5mL的底物溶液与适当稀释的酶液混合；
②将①中混合液在50℃下反应5min，加入600μL、1mol/L的碳酸铵溶液终止反应；
③于405nm处测定吸光度值的增加量，根据标准曲线计算β-木糖苷酶活力。
注：一个酶活力单位(U)被定义为每分钟产生1微摩尔4-硝基酚所需的酶量。
实施例1降解酶系蛋白的摇瓶发酵
种子培养基：硫酸铵1.4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，酵母粉1.0g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钴2.0mg/L，硫酸亚铁5.0mg/L，硫酸锌1.4mg/L，硫酸锰1.6mg/L，pH为自然。(121℃灭菌20min)
产酶培养基：硫酸铵1.4g/L，玉米芯30g/L，麸皮10g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，酵母粉1.0g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钴2.0mg/L，硫酸亚铁5.0mg/L，硫酸锌1.4mg/L，硫酸锰1.6mg/L，pH为自然。(121℃灭菌20min)
(1)里氏木霉CICC41495保存在马铃薯-葡萄糖-琼脂斜面(PDA)上，使用时用0.9％的NaCl溶液收集孢子用于接种；
(2)将25mL种子培养基装入250mL三角瓶，接入浓度为108个/mL的(1)中所述里氏木霉孢子悬液1mL，培养温度为30℃，摇床转速为200r/min，培养36～48h，获得种子液；
(3)将25mL产酶培养基装入250mL三角瓶，接入2.5mL、步骤(2)中获得的种子液，培养温度为30℃，摇床转速为200r/min，培养168h；
(4)发酵液经10000×g离心15min，后冷冻干燥，获得里氏木霉CICC41495分泌的降解酶系蛋白粉剂并于4℃保存备用。
实施例2不同碳源对里氏木霉CICC41495分泌的酶蛋白中与阿拉伯木聚糖降解有关的水解酶的活力分析
分别采用不同的碳源(麸皮，玉米芯，麸皮+玉米芯，葡萄糖，微晶纤维素，玉米粉)，对获得的里氏木霉CICC41495的发酵液中的内切酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶活力进行活力测定，3种酶的测定结果见表1。各种碳源获得的发酵液的SDS-PAGE图谱见图2，泳道1为麸皮，泳道2为玉米芯，泳道3为麸皮+玉米芯，泳道4为葡萄糖，泳道5为微晶纤维素，泳道6为玉米粉。
表1里氏木霉CICC41495发酵液中阿拉伯木聚糖降解相关的水解酶活力
Figure BDA0002296986870000051
注：比活力单位，以每毫克蛋白质的活性单位表示。
从表1的数据可以看出，同时以玉米芯和麸皮为碳源和诱导剂的里氏木霉CICC41495全培养上清液中，与阿拉伯木聚糖水解相关的酶系齐全，阿拉伯木聚糖降解酶系的三种主要水解酶的活性最高，蛋白的浓度也最高，均高于单独使用麸皮和玉米芯的发酵液，包括内切木聚糖酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-D-木糖苷酶的活力均能检测到。
从图2的结果可以看出，采用其他碳源的发酵液中酶的种类均没有采用玉米芯时的种类丰富，且表1的数据表明采用麸皮(10g/L)+玉米芯(30g/L)为共同碳源时，发酵液中的蛋白质浓度和各水解酶的酶活均是最高的。
实施例3里氏木霉CICC41495分泌的酶蛋白的双向电泳分析
实施例2中测得的内切木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活是多种同工酶的总酶活。采用双向电泳结合基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱对实施例2中采用玉米芯和麸皮为碳源时制备的发酵液中阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白的组成进行了分析。
(1)样品前处理
水化液：含4％CHAPS，8mol/L尿素，1％DTT，0.002％溴酚蓝和0.5％pH4～7IPG缓冲溶液。
①取10mL离心后的发酵液上清液，加入40mL的-20℃的20％(w/v)TCA/丙酮溶液；
②-20℃冰箱过夜，4℃、10000×g离心15min；
③弃上清，沉淀用-20℃的90％丙酮洗涤两次；
④用水化液溶解沉淀，4℃、8000×g离心20min离心，测定上清蛋白浓度，-20℃保存备用。
(2)第一向-等电聚焦
①取125μL水化液(含有100μg酶蛋白)，上样(IPG干胶条长度7cm，pH 3-10)；
②转移至Ettan IPGphor 3的聚焦槽中，进行等电聚焦。
聚焦程序：50V×12h→250V×0.5h→500V×0.5h→3h内电压从500V梯度升到4000V，在4000V下运行10KVH。
(3)胶条平衡
平衡液缓冲溶液Ⅰ：甘油30％，尿素6mol/L，溴酚蓝0.002％，2％SDS和10mg/mL DTT溶解于pH 6.8、50mmol/L Tris-HCl溶液中；平衡液缓冲溶液Ⅱ：IAA 25mg/mL，SDS 2％，溴酚蓝0.002％，尿素6mol/L和甘油30％，溶解于pH 6.8、50mmol/L Tris-HCl的缓冲溶液中。
用双蒸水洗涤等电聚焦结束后的胶条，先后将IPG胶条放入5mL平衡液缓冲溶液Ⅰ和Ⅱ中，在摇床上振荡平衡15min。
(4)第二向-SDS-PAGE及凝胶染色
①将平衡好的胶条转移至SDS-PAGE胶顶端；
②用低熔点琼脂糖(0.5％)密封；
③接通电源进行第二向SDS-PAGE(分离胶12.5％，浓缩胶5％)；
④上样(24μL蛋白样品中加入6μL上样缓冲液，100℃下加热5min)，采用60V电压直至溴酚蓝指示带达到堆积胶底部成一条直线，80V电压直到溴酚蓝指示带到达分离胶底部，经固定液(甲醇：乙酸：水比例为5：1：4)固定30min；
⑤0.25％的考马斯亮蓝R-250溶液染色1h；
⑥用脱色液(甲醇：乙酸：水比例为1：1：8)脱至背景清晰。
(5)蛋白点的挖取和酶解
①用枪头切取凝胶中的目标蛋白点，置于EP管中；
②加入200μL脱色液(100mmol/L NH4HCO3，溶于30％的乙腈中)，于摇床上振荡至脱色完全，吸去脱色液；
③加入50μL无水乙腈冻干3～5min(冻干后的胶粒呈现白色)；
④各加入5～8μL经稀释后的胰蛋白酶溶液，于4℃冰箱放置30～60min使胶粒充分吸胀；
⑤加入20～30μL的25mmol/L NH4HCO3溶液，37℃过夜反应16～20h；
⑥将管中酶解液转移至新的EP管中，冻干机中冻干后至剩余5μL，进行质谱分析。
(6)蛋白点的质谱鉴定
①取0.7μL浓缩后的蛋白点酶解液点在Anchorchip靶板上；
②待其风干，用0.7μL的0.1％的TFA脱盐；
③待其风干，点0.7μL 0.7mg/mL的基质(50％乙腈和2.5％三氟乙酸的α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液)；
④待其风干，采用Ultraflex基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱对Anchorchip靶板进行分析。
采用软件Mascot(http://www.matrixscience.com)在NCBInr中搜索质谱数据，确定蛋白点的信息。双向电泳图谱如图2所示，蛋白点的鉴定结果见表2。
表2图谱中各蛋白点的质谱鉴定结果
Figure BDA0002296986870000071
表2的结果表明，以玉米芯和麸皮为碳源的里氏木霉CICC41495中的阿拉伯木聚糖水解酶系主要包括3种内切木聚糖酶：内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅰ(编号为2的点)(属于GHF11家族)，内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅱ(编号为5,7,8的点)(属于GHF11家族)，内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅲ(编号为1,4的点)(属于GHF10家族)，和1种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(属于GHF62家族)，其中，内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅰ包括：编号为2的点；内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅱ包括：编号为5,7,8的点；内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅲ包括：编号为1,4的点；α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶包括：编号为2,3的点，它们组成了一个阿拉伯木聚糖降解酶体系。
实施例4酶蛋白在大麦麦芽糖化工艺中的应用
(1)糖化工艺为：
①将50.0g细粉碎麦芽放入已知重量的糖化杯中；
②加入200mL 46℃的纯净水，置于自动糖化器上于45℃下保温30min；
③将醪液以1℃/min的速率升温至70℃，加入100mL 70℃的纯净水，于70℃下保温60min；
④将麦芽醪液冷却至25℃左右，加纯净水使醪液总重量达到450.0g；
⑤采用中速定性滤纸于32cm漏斗中过滤，收集滤液。
在糖化开始时(进行步骤①时)的糖化醪液中，分别一次性加入不同量的实施例1发酵获得的降解酶系蛋白粉剂，糖化结束后，测定麦汁中的高分子量阿拉伯木聚糖含量、粘度和过滤速度等指标，来反映阿拉伯木聚糖降解酶系对糖化过滤指标的改善效果，对照为未加酶蛋白的糖化麦汁。
(2)高分子量阿拉伯木聚糖含量的测定
①标准曲线的制备
配制显色剂：0.5g间苯三酚用1mL无水乙醇助溶，再分别加入1mL浓盐酸、0.5mL17.5g/L的葡萄糖溶液和55mL冰醋酸，混匀，贮存于棕色瓶中。
配制20，40，60，80和100mg/L的系列木糖工作溶液。
分别取2mL各浓度的工作溶液，向各试管分别加入10mL显色剂，对照用2mL蒸馏水代替，混匀后，于沸水浴中准确反应25min，冷却至室温，测定552nm下的吸光度值，绘制标准曲线。
②高分子量阿拉伯木聚糖含量的测定
注：本发明中高分子量阿拉伯木聚糖(high molecular weight arabinoxylan,HMW-AX)是指采用60％的乙醇(终浓度)从麦汁中沉淀出的以聚合态的形式存在的阿拉伯木聚糖含量，这部分阿拉伯木聚糖分子量较高，溶液的粘度较高，对麦汁的过滤速度影响较大。
取2mL麦汁加3mL无水乙醇进行沉淀过夜，10000×g离心15min，弃上清，沉淀用2mL蒸馏水复溶。
取复溶后的溶液0.1mL，加入1.9mL蒸馏水，置于具塞刻度试管中，加入10mL间苯三酚显色剂，振荡均匀后于沸水浴中准确反应25min，冷却至室温，于552nm下测定OD值，根据标准曲线计算阿拉伯木聚糖的含量。
(3)过滤速度的测定：在32cm漏斗中，以中性滤纸为介质，单位时间内收集的麦汁体积来表示(单位为mL/30min)。
(4)粘度测定：采用HAAKE落球式粘度计进行测定。
外加里氏木霉CICC41495分泌的阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白对麦芽中阿拉伯木聚糖的降解、麦汁过滤速度和粘度的影响，结果分别见图4、5、6和7。
图4中随着酶系蛋白添加量的增加，高分子量阿拉伯木木聚糖逐渐被降解，在添加量0.36mg/g时，阿拉伯木木聚糖可以被彻底降解。
图5中随着酶系蛋白添加量的增加，麦汁的粘度逐渐下降，当添加量为0.36mg/g时，麦汁粘度由1.55mPa·s降低至1.35mPa·s，粘度下降了12.9％。
图6中随着酶系蛋白添加量的增加，麦汁的过滤速度逐渐提高，0.1mg/g麦芽时，过滤速度达7.6mL/min；当添加量为0.36mg/g时，麦汁过滤速度由4.8mL/min提高到10.2mL/min，速度提高了112％。
图7中随着酶系蛋白添加量的增加，麦汁产量不断提高，当添加量为0.36mg/g时，麦汁产量由215mL提高到335mL，产量提高了55.8％。
对比例1
具体实施方式同实施例1，将产木聚糖培养基中的玉米芯和麸皮更换为等量的微晶纤维素。
结果显示，以微晶纤维素为碳源的里氏木霉CICC41495发酵液中有纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，内切-β-1,4-木聚糖酶II，酶活力分别为内切-1,4-β-木聚糖酶95U/mg蛋白，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶42U/mg蛋白，发酵液中蛋白质浓度为0.502mg/L，虽然发酵液中蛋白质的浓度很高，但从图2SDS-PAGE图谱中可以看出，绝大部分蛋白集中在分子量44.3-66.4kDa附近，这部分蛋白主要是是纤维二糖水解酶I和II。当酶蛋白添加量为0.36mg/g麦芽时，高分子量阿拉伯木聚糖的降解率为43％，麦汁的粘度由1.55mPa·s降低至1.47mPa·s，下降了5.2％；过滤速度由4.8mL/min提高到6.1mL/min，提高了27.1％；过滤得到的麦汁体积由215mL提高到253mL，提高了17.7％。
对比例2
具体实施方式同实施例1，将产木聚糖培养基中的玉米芯和麸皮换成质量比为2:1(麸皮(13.3g/L)+玉米芯(26.7g/L))。
结果显示，采用质量比为2:1的玉米芯和麸皮的发酵液中，发酵液中蛋白质浓度为0.215mg/L，蛋白质浓度偏低，酶的种类有内切-1,4-β-木聚糖酶I、内切-1,4-β-木聚糖酶II、1,4-β-木聚糖酶Ⅲ和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，酶活力分别为内切-1,4-β-木聚糖酶179U/mg蛋白，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶110U/mg蛋白。当酶蛋白添加量为0.36mg/g麦芽时，也能够将高分子量阿拉伯木聚糖100％降解，麦汁的粘度由1.55mPa·s降低至1.36mPa·s，下降了12.3％；过滤速度由4.8mL/min提高到10.0mL/min，提高了112％；过滤得到的麦汁体积由215mL提高到330mL，提高了53.5％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种制备阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白的方法，其特征在于，以里氏木霉CICC41495为发酵菌株，在以玉米芯和麸皮为碳源的培养基中发酵获得，玉米芯和麸皮的比例为（1~3）:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：（1）将里氏木霉CICC41495接种于种子培养基，在25~35℃培养36~48 h；（2）将种子液接入含有麸皮和玉米芯的培养基在25~35℃培养150~200 h。
3.根据权利要求1~2所述方法，其特征在于，所述阿拉伯木聚糖降解酶系蛋白包含3种内切木聚糖酶，1种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和一种β-木糖苷酶，所述的3种内切木聚糖酶分别为内切-1, 4-β-木聚糖酶Ⅰ，内切-1, 4-β-木聚糖酶Ⅱ，内切-1, 4-β-木聚糖酶Ⅲ，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶属于糖苷水解酶第62家族。
4.根据权利要求1~3任一所述的方法，其特征在于，将发酵获得的发酵液直接进行冷冻干燥制成粉剂。
5.权利要求1~4任一所述的方法在啤酒生产中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，按照权利要求1~4任一所述方法制备阿拉伯木聚糖降解酶系，再添加至啤酒糖化过程的大麦麦芽醪液中。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891770B (zh) * 2022-06-27 2024-01-19 盐城工学院 一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1325072A1 (ru) * 1985-10-29 1987-07-23 Латвийский Государственный Университет Им.П.Стучки Штамм микромицета ТRIсноDеRма наRZIаNUм ВКПМ F-319-продуцент кормового белка
CN101659949A (zh) * 2009-09-23 2010-03-03 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种液体纤维素酶的制备方法
CN101705217A (zh) * 2009-10-29 2010-05-12 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法
CN103842515A (zh) * 2011-03-17 2014-06-04 丹尼斯科美国公司 降低糖化过程的粘度的方法
CN105420217A (zh) * 2015-12-17 2016-03-23 山东龙力生物科技股份有限公司 一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用
WO2016160955A1 (en) * 2015-03-31 2016-10-06 Xyleco, Inc. Processing of biomass materials
CN108587932A (zh) * 2017-11-30 2018-09-28 江苏省农垦麦芽有限公司 一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶
CN109486867A (zh) * 2018-10-30 2019-03-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 复合纤维素酶系及其在淀粉燃料乙醇生产中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017047961A1 (ko) * 2015-09-16 2017-03-23 전동언 분생포자 형성균 배양용 배지의 제조방법
CN108949860B (zh) * 2018-08-13 2021-08-27 安吉艾格赛思生物科技有限公司 一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法
CN110760399A (zh) * 2019-11-29 2020-02-07 江南大学 一种阿拉伯呋喃糖苷酶在啤酒生产中的应用
CN110714037A (zh) * 2019-11-29 2020-01-21 江南大学 一种木聚糖酶的制备方法及其在啤酒生产中的应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1325072A1 (ru) * 1985-10-29 1987-07-23 Латвийский Государственный Университет Им.П.Стучки Штамм микромицета ТRIсноDеRма наRZIаNUм ВКПМ F-319-продуцент кормового белка
CN101659949A (zh) * 2009-09-23 2010-03-03 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种液体纤维素酶的制备方法
CN101705217A (zh) * 2009-10-29 2010-05-12 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法
CN103842515A (zh) * 2011-03-17 2014-06-04 丹尼斯科美国公司 降低糖化过程的粘度的方法
WO2016160955A1 (en) * 2015-03-31 2016-10-06 Xyleco, Inc. Processing of biomass materials
CN105420217A (zh) * 2015-12-17 2016-03-23 山东龙力生物科技股份有限公司 一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用
CN108587932A (zh) * 2017-11-30 2018-09-28 江苏省农垦麦芽有限公司 一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶
CN109486867A (zh) * 2018-10-30 2019-03-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 复合纤维素酶系及其在淀粉燃料乙醇生产中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Secretome analysis of Trichoderma reesei CICC41495 for degradation of arabinoxylan in malted barley";Junyong Sun等;《Journal of the Institute of Brewing》;20180724;第124卷(第4期);摘要，第353页左栏第4段，第354页左栏最后1段-右栏第2段，表2，第355页右栏第3段 *
"绿色木霉复合木聚糖酶的固态发酵条件优化";苏移山等;《食品与药品》;20070310;第9卷(第3期);摘要，第6页第3.1小节，表1 *

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