CN110734823B - 一株里氏木霉在大麦麦芽生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株里氏木霉在大麦麦芽生产中的应用，将里氏木霉CICC41495处理江苏大麦麦芽，处理后的麦芽其协定麦汁中高分子量阿拉伯木聚糖含量由876mg/L降低至235mg/L，降低了73.2％；粘度由1.59mPa·s降低至1.43mPa·s，下降了10.1％；过滤速度由3.5mL/min提高至6.2mL/min，提高了77％。本发明提供的方法，利用大麦发芽的环境条件，使里氏木霉在大麦表面生长的同时分泌阿拉伯木聚糖降解酶系，促进江苏大麦麦芽中高分子量阿拉伯木聚糖的降解，提高江苏大麦麦芽协定麦汁的过滤速度，常规理化指标达到了行业标准QB/T 1686‑2008中一级品的水平。

Description

一株里氏木霉在大麦麦芽生产中的应用

技术领域

本发明涉及一株里氏木霉在大麦麦芽生产中的应用，属于麦芽制造技术领域。

背景技术

啤酒糖化生产中，糖化醪液经过滤槽分离而得到透明澄清的麦汁，糖化醪液中麦汁的分离速度即过滤速度。大麦麦芽的过滤速度对啤酒生产效率和成品啤酒的品质均具有重要的影响，因而麦汁的过滤速度是酿酒师最为重视的指标之一，其决定了啤酒生产过程的效率。有研究发现是由于乳细胞壁中的阿拉伯木聚糖影响了过滤速度。由于高分子量的阿拉伯木聚糖水溶液具有较高的粘度，致使大麦麦芽的过滤速度慢，糖化的粘度高，不利于酶与底物的接触和降解，导致蛋白和淀粉等大分子物质不能充分降解，浸出物收得率较低，延长了啤酒单批次的生产时间，增加了生产成本。

阿拉伯木聚糖是大麦胚乳细胞壁中最主要的组成成分，当其在麦汁中的含量高时，其影响麦汁的粘度和过滤速度。添加外源微生物木聚糖酶是解决这一问题的有效方法。

阿拉伯木聚糖的完全降解需要一系列酶共同完成，该酶系主要包括：内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，β-1,4-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)及阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.6)，这些酶的作用位点见图1。A位点为β-1,4-木聚糖酶，其以内切方式作用于阿拉伯木聚糖主链中未被阿拉伯呋喃糖基团取代的β-1,4-木糖苷键，生成聚合度不同的低聚木糖和少量的木糖，是降解阿拉伯木聚糖的关键酶，也是目前被研究最多、最透彻的一种木聚糖酶；B位点为α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯木聚糖侧链上取代基团会在空间上阻碍木聚糖酶-底物诱导构象的形成，使木聚糖酶无法打开主链上的糖苷键，从而降低木聚糖酶的水解效率，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用于侧链的取代基团释放阿拉伯糖，有利于消除这一影响；C位点为阿魏酸酯酶，其作用于O-5位上与阿拉伯呋喃糖基团以酯键相连的阿魏酸，释放阿魏酸；D位点为β-木糖苷酶，作用于木聚糖酶的水解产物——低聚木糖，从非还原端进一步降解低聚木糖生成β-木糖，在将阿拉伯木聚糖彻底降解为木糖的过程中起重要作用。对于降解高分子量的阿拉伯聚糖，进而降低溶液的粘度和提高过滤速度来说，主链酶——β-1,4-木聚糖酶和侧链酶——α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶起关键性作用，β-木糖苷酶和阿魏酸酯酶在需要将阿拉伯木聚糖彻底降解为单糖的情况下(如生物柴油)，才发挥重要作用。

发明人分析发现，部分江苏大麦中阿拉伯木聚糖的含量较高，且在制麦过程中通过自身的阿拉伯木聚糖降解酶系无法彻底降解，造成生产的大麦麦芽过滤速度存在缺陷。当采用过滤速度存在缺陷的江苏大麦麦芽酿造啤酒时，酿酒师通常采用在糖化过程中外加微生物木聚糖酶的方法来解决。在糖化过程中添加微生物来源的木聚糖酶对于降解阿拉伯木聚糖、消除由阿拉伯木聚糖引起的过滤速度慢的问题是可行的。但通常商品酶制剂的价格较高，添加量较大，这在一定程度上增加了啤酒的生产成本。中国啤酒目前吨酒利润整体不高，对生产成本的控制非常严格，这限制了酶制剂在啤酒行业中的应用。如果能够提供一种在制麦的环境条件下，在大麦表面生产良好，且能够分泌较完整的阿拉伯木聚糖水解酶系的微生物，是解决江苏大麦由阿拉伯木聚糖含量过高引起的过滤问题的较经济的方法。因为只需要在浸麦水中接种这种微生物的种子液，微生物如果对生长的营养要求不高，能够在大麦表面生长的同时分泌较完整的阿拉伯木聚糖水解酶系，便能降解大麦中的阿拉伯木聚糖，这种方法的最大的益处是几乎不需要增加生产成本。

里氏木霉是一种丝状真菌，属于无性型的红褐肉座菌。里氏木霉具有能力很强的合成木聚糖酶的能力，在产酶条件下也不产生毒素和抗生素，对培养环境的营养要求不高，易于培养和控制，生长环境粗放，适应性较强。

发明内容

本发明提供了一种江苏产大麦麦芽的处理方法，该方法能够降解麦芽中的高分子量阿拉伯木聚糖，使得制备的麦汁粘度低、过滤速度快，显著提升了江苏产大麦麦芽的品质。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种大麦麦芽的处理方法，是用里氏木霉CICC41495处理大麦，所述里氏木霉购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，保藏编号为CICC41495。

本发明的一种实施方式中，所述处理是将大麦在含里氏木霉CICC41495的环境中浸泡。

本发明的一种实施方式中，所述处理方法包含如下浸麦工艺：第一步湿浸10～13小时、第二步干浸5～7小时、第三步湿浸14～18小时、第四步干浸10～13小时。

在本发明的一种实施方式中，所述湿浸是将大麦浸泡在浸麦水中，所述干浸是将浸麦水排去，保持大麦表面湿润即可。

本发明的一种实施方式中，将里氏木霉CICC41495的孢子接种至第三步湿浸时的浸麦水中。

本发明的一种实施方式中，所述接种里氏木霉CICC41495时的孢子终浓度为1.0×10⁷～2.0×10⁷个/mL。

本发明的一种实施方式中，将大麦在含里氏木霉CICC41495的环境中浸泡处理14～18h，浸泡过程控制温度25～30℃。

本发明提供了一种大麦麦芽的生产方法，所述方法包括如下步骤：

本发明的一种实施方式中，将上述用里氏木霉CICC41495处理后的大麦进行发芽、烘干、除根、包装。

本发明的一种实施方式中，发芽温度控制为26～30℃，每小时通入25～27℃的湿度超过95％的空气12～18min，发芽时间3～6天，制得绿麦芽。

本发明的一种实施方式中，将制得的绿麦芽转入烘干炉烘干，所述烘干是在如下条件下进行：①30℃恒温10小时，②45℃恒温5小时，③60℃恒温5小时，④70℃恒温4小时，⑤80℃恒温5小时。

本发明提供了一种经里氏木霉CICC41495处理后的大麦麦芽在饮品制备中的应用。

本发明的一种实施方式中，所述饮品包含熟啤酒、生啤酒、鲜啤酒、干啤酒、冰啤酒、低醇啤酒、无醇啤酒、小麦啤酒、浑浊啤酒、果蔬汁型啤酒、果蔬味型啤酒。

有益效果：本发明将里氏木霉CICC41495用于处理江苏大麦麦芽，处理后的麦芽其协定麦汁中高分子量阿拉伯木聚糖含量由876mg/L降低至235mg/L，降低了73.2％；粘度由1.59mPa·s降低至1.43mPa·s，下降了10.1％；过滤速度由3.5mL/min提高至6.2mL/min，提高了77％。本发明提供的方法，利用大麦发芽的环境条件，使里氏木霉在大麦表面生长的同时分泌阿拉伯木聚糖降解酶系，降解高分子量阿拉伯木聚糖，提高江苏大麦麦芽的过滤性能，简便可行，给麦芽生产企业带来一定的经济效益。

附图说明

图1为阿拉伯木聚糖降解酶系的酶切位点，A表示内切-β-1,4-木聚糖酶，B表示α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，C表示阿魏酸酯酶，D表示β-D-木糖苷酶。

图2为里氏木霉CICC41495分泌酶蛋白的SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

实施例1里氏木霉CICC41495孢子悬液的制备

(1)固体斜面试管的菌种培养：将里氏木霉CICC41495接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基，在30℃培养7天。

(2)茄子瓶的制备：从固体斜面试管，用接种针接种一环里氏木霉CICC41495的孢子至装有马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基中，在30℃培养7天。

(3)用0.9％的NaCl溶液收集茄子瓶中的里氏木霉CICC41495的孢子，得到孢子悬液。

实施例2里氏木霉CICC41495分泌的阿拉伯木聚糖降解酶系的SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE结合基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱对里氏木霉CICC41495所分泌的酶的组成进行了分析。

(1)SDS-PAGE分析：

采用SDS-PAGE(浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12.5％)分析发酵液中酶蛋白的种类。离心后的酶液与5×样品缓冲液按照4：l的比例混匀，上样量为20uL，SDS-PAGE(浓缩胶浓度5％，分离胶浓度为12.5％)首先电压60V直至溴酚蓝压成一条线，调至电压80V至溴酚蓝到达胶板底部。取下胶板，采用固定液固定30min，接着采用考马斯亮蓝G250染色液染色1小时，脱色至背景清晰。

(2)蛋白条带的挖取和酶解

用枪头切取凝胶中的目标蛋白条带，置于EP管中→加入200μL脱色液(100mmol/LNH₄HCO₃，溶于30％的乙腈中)脱色→于摇床上振荡至脱色完全→吸去脱色液→加入50μL无水乙腈冻干3～5min(冻干后的胶粒呈现白色)→各加入5～8μL经稀释后的胰蛋白酶溶液→于4℃冰箱放置30～60min使胶粒充分吸胀后→加入20～30μL的25mmol/L NH₄HCO₃溶液→37℃过夜反应16～20h→将管中酶解液转移至新的EP管中，冻干机中冻干后至剩余5μL→进行质谱分析。

(3)蛋白点的质谱鉴定

取0.7μL浓缩后的蛋白点酶解液→点在Anchorchip靶板上→风干→用0.7μL的0.1％的TFA脱盐→风干→点0.7μL 0.7mg/mL的基质(50％乙腈和2.5％三氟乙酸的α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液)→风干→采用Ultraflex基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱对Anchorchip靶板进行分析。采用软件Mascot在NCBInr中搜索质谱数据，确定蛋白条带的信息。

SDS-PAGE图谱如表1所示，蛋白条带的鉴定结果见图2。

表1里氏木霉CICC41495分泌的酶的组成的质谱鉴定结果

里氏木霉CICC41495分泌的酶蛋白中具有一个较全的阿拉伯木聚糖水解酶系，主要包括2种内切木聚糖酶和1种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，具体为内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅱ(条带10)(属于GHF11家族)；内切-1,4-β-木聚糖酶Ⅲ(条带7)(属于GHF10家族)；α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(条带8)(属于GHF62家族)。

实施例3高过滤速度江苏产大麦麦芽的制备

(1)浸麦：将筛选后的大麦加水进行浸渍。

浸麦工艺为：第一步为湿浸(将大麦浸泡在浸麦水中)12小时、第二步为干浸(将浸麦水排去，保持大麦表面湿润即可)6小时、第三步为湿浸16小时、第四步为干浸12小时；

第一次湿浸和干浸时的温度为16℃，第三步湿浸时，浸麦水中接种里氏木霉CICC41495的孢子，使接种后浸麦水中的孢子浓度为1.5×10⁷个/mL，将浸麦水温度升高到28℃，促进里氏木霉CICC41495在大麦表面的生长和酶系的分泌。

(2)发芽：将步骤(1)制得的浸渍大麦转入发芽箱，发芽箱温度控制为28℃，每小时通入26℃的湿度超过95％的湿空气15min，发芽时间3天，制得绿麦芽。

(3)烘干：将步骤(2)制得的发芽大麦转入烘干炉，烘干温度曲线为，30℃10小时-45℃5小时-60℃5小时-70℃4小时-80℃5小时，烘干时间29小时，制得水分低于5％的接种里氏木霉CICC41495的大麦麦芽。

(4)除根：利用除根机，去除烘干后的大麦的根，以防大麦麦芽吸水变潮以及给啤酒带来苦味。

(5)包装：以50kg为一袋，将成品大麦麦芽进行包装。

(6)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的测定以2mmol/L 4-硝基苯基-α-L-阿拉伯糖醛酸苷为底物，取0.5mL的底物溶液与适当稀释的酶液混合，在50℃下反应30min，加入0.5mol/L的碳酸钠1.0mL终止反应，于410nm处测定OD值，根据标准曲线计算α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶活力。一个酶活力单位(U)是指在测定条件下每分钟水解1μmol的4-硝基苯基-α-L-阿拉伯糖醛酸苷所需的酶量。

(7)内切木聚糖酶活力的测定以浓度1％燕麦木聚糖为底物。取2mL的底物溶液与2mL适当稀释的酶液混合，在37℃下反应30min，加入5.0mL DNS试剂终止反应，沸水浴加热5min，于540nm处测定OD值，根据标准曲线计算木聚糖酶活力。注：一个酶活力单位(U)是指在测定条件下每分钟释放1μmol的木糖所需要的酶量。

本实施例生产的高过滤速度江苏大麦麦芽的质量指标见表2。

表2接种与未接种里氏木霉的江苏大麦麦芽的指标

实施例4高过滤速度大麦麦芽在啤酒糖化工艺中的应用

(1)大麦麦芽糖化

①将实施例3中制备得到的麦芽50.0g细粉碎麦芽放入已知重量的糖化杯中；

②加入200mL 46℃的纯净水，置于自动糖化器上于45℃下保温30min；

③将醪液以1℃/min的速率升温至70℃，加入100mL 70℃的纯净水，于70℃下保温60min；

④将麦芽醪液冷却至25℃左右，加纯净水使醪液总重量达到450.0g；

⑤采用中速定性滤纸于32cm漏斗中过滤，收集滤液。

(2)阿拉伯木聚糖含量测定

1)制备标准曲线制

配制显色剂：0.5g间苯三酚用1mL无水乙醇助溶，再分别加入1mL浓盐酸、0.5mL17.5g/L的葡萄糖溶液和55mL冰醋酸，混匀，贮存于棕色瓶中。

配制20，40，60，80和100mg/L的系列木糖工作溶液。

分别取2mL各浓度的工作溶液，向各试管分别加入10mL显色剂，对照用2mL蒸馏水代替，混匀后，于沸水浴中准确反应25min，冷却至室温，测定552nm下的吸光度值，绘制标准曲线。

2)高分子量阿拉伯木聚糖含量的测定

注：本发明中高分子量阿拉伯木聚糖(high molecular weight arabinoxylan,HMW-AX)是指采用60％的乙醇从麦汁中沉淀出的阿拉伯木聚糖含量，这部分阿拉伯木聚糖分子量较高，溶液的粘度较高，对麦汁的过滤速度影响较大。

①取2mL麦汁加3mL无水乙醇进行沉淀过夜，10000×g离心15min，弃上清，沉淀用2mL蒸馏水复溶。

②取复溶后的溶液0.1mL，加入1.9mL蒸馏水，置于具塞刻度试管中，加入10mL间苯三酚显色剂，振荡均匀后于沸水浴中准确反应25min，冷却至室温，于552nm下测定OD值，根据标准曲线计算阿拉伯木聚糖的含量。

③过滤速度的测定：在32cm漏斗中，以中性滤纸为介质，收集麦汁，收集麦芽的总体积除以30得到，(单位为mL/min)来表示；

④粘度测定：采用HAAKE落球式粘度计进行测定。

⑤总酸的测定：按照中华人民共和国国家标准《GBT 4928-2008啤酒分析方法》中“10总酸”的测定方法进行。

⑥浊度的测定：按照中华人民共和国国家标准《GBT 4928-2008啤酒分析方法》中“6浊度”的测定方法进行。

⑦色度的测定：按照中华人民共和国轻工行业标准《QB/T 1686-2008啤酒麦芽》中“6.5.1色度(比色计法)”的测定方法进行。

测定结果见表2。

对比例1

(1)大麦麦芽的制备

具体实施方式见实施例3，区别在于，第二次湿浸时，接种来源于里氏木霉CICC40358的孢子。

(2)处理得到的大麦麦芽的质量检测

具体实施方式见实施例4，将(1)获得的实验组和对照组大麦分别进行大麦麦芽的糖化，并进行质量指标的测定。

表3不同种里氏木霉处理后的大麦麦芽的质量指标

对比例2

(1)大麦麦芽的制备

具体实施方式见实施例3，区别在于，第二次湿浸时，接种里氏木霉CICC41495的孢子后浸麦水中的孢子浓度为0.5×10⁷个/mL。

(2)处理得到的大麦麦芽的质量检测

具体实施方式见实施例4，将(1)获得的实验组和对照组大麦分别进行大麦麦芽的糖化，并进行质量指标的测定。

表4不同浓度里氏木霉处理后的大麦麦芽的指标

对比例3

(1)大麦麦芽的制备

具体实施方式见实施例3，区别在于，第二次湿浸时间为8小时。

(2)处理得到的大麦麦芽的质量检测

具体实施方式见实施例4，将(1)获得的实验组和对照组大麦分别进行大麦麦芽的糖化，并进行质量指标的测定。

表5不同里氏木霉处理时间后的大麦麦芽的质量指标

对比例4

(1)大麦麦芽的制备

具体实施方式见实施例3，区别在于，第二次湿浸温度为16℃。

(2)处理得到的大麦麦芽的质量检测

具体实施方式见实施例4，将(1)获得的实验组和对照组大麦分别进行大麦麦芽的糖化，并进行质量指标的测定。

表6不同里氏木霉处理温度的大麦麦芽的质量指标

对比例5

具体实施方式见实施例4，区别在于，用同种的未添加里氏木霉CICC41495的大麦麦芽进行糖化，同时添加来源于黑曲霉的木聚糖酶和拉伯呋喃糖苷酶的人工复配的酶制剂，糖化过程中，复配的酶制剂的添加量为木聚糖酶125U/g麦芽和阿拉伯呋喃糖苷酶74mU/g麦芽。

对糖化后的麦汁分别进行麦汁质量指标的测定。

表7不同处理的麦汁质量指标

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种大麦的处理方法，其特征在于，用里氏木霉CICC41495处理大麦，所述处理是将大麦在含里氏木霉CICC41495的环境中浸泡；所述处理方法包含如下浸麦工艺：第一步湿浸、第二步干浸、第三步湿浸、第四步干浸，将所述里氏木霉接种至第三步湿浸时的浸麦水中；第一步湿浸12小时、第二步干浸6小时、第三步湿浸16小时、第四步干浸12小时；所述里氏木霉的孢子终浓度为1.5×10⁷个/mL，浸泡过程控制温度28℃。

2.一种大麦麦芽的生产方法，其特征在于，将经权利要求1所述方法处理后得到的大麦进行发芽、烘干、除根、包装。

3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，发芽温度控制为26~30℃，每小时通入25~27℃的湿度超过95%的空气12~18 min，发芽时间3~6天，制得绿麦芽。

4.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述烘干是在如下条件下进行：① 30℃恒温10小时，② 45℃恒温5小时，③ 60℃恒温5小时，④ 70℃恒温4小时，⑤ 80℃恒温5小时。

5.权利要求2~4任一所述的方法制得的大麦麦芽。

6.权利要求5所述的大麦麦芽在饮品中的应用，其特征在于，所述饮品包含熟啤酒、生啤酒、鲜啤酒、干啤酒、冰啤酒、低醇啤酒、无醇啤酒、小麦啤酒、浑浊啤酒、果蔬汁型啤酒、果蔬味型啤酒。

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