BRPI9914278B1 - cepa recombinante de chrysosporium, e, método para produzir um polipeptídeo de interesse - Google Patents

Abstract

"cepa de chrysosporium mutante obtenível por métodos recombinantes ou de mutagênese in vitro, construção de ácido nucléico, cepa microbiana recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo de interesse, e para produzir uma cepa de chrysosporium mutante, e, xilanase de chrysosporium da família de xilanases f". descreve-se um novo sistema de transformação no campo dos hospedeiros fúngicos filamentosos para expressar e secretar polipeptídeos ou proteínas heterólogas. a invenção também abrange um processo para produzir grandes quantidades de polipeptídeo ou proteína de maneira econômica. o sistema compreende uma cepa fúngica transformada ou transfectada do gênero chrysosporium, mais particularmente de chrysosporium lucknowense e seus mutantes ou derivados. ela também abrange transformantes contendo seqüências codificantes de chrysosporium, bem como seqüência reguladoras-de-expressão de genes de chrysosporium.

Description

"CEPA RECOMBINANTE DE CHRYSOSPORIUM, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO DE INTERESSE".

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a um novo sistema de transformação no campo dos hospedeiros fungicos filamentosos para expressar e secretar polipeptídeos ou proteínas heterólogas. A invenção também abrange um processo para produzir grandes quantidades de polipeptídeo de maneira econômica. O sistema compreende uma cepa fungica transformada ou transfectada do gênero Chrysosporium, mais particularmente de Chrysosporium lucknowense e seus mutantes ou derivados. Ela também abrange transformantes contendo seqüências que codificam Chrysosporium. Descreve-se novas cepas mutantes de Chrysosporium, bem como novas enzimas derivadas do mesmo.

Fundamentos da invenção No estado da técnica descreveu-se uma quantidade de hospedeiros para a expressão de genes e processos de transformação. Bactérias são freqüentemente mencionadas, p. ex. Escherichia coli. No entanto, E. coli é um microorganismo incapaz de secreção de uma quantidade de proteínas ou polipeptídeos e, portanto, é indesejável como célula hospedeira para a produção de proteína ou polipeptídeo em um nível industrial. Uma desvantagem adicional do E. coli, e que também se aplica a bactérias em geral, é que os procariontes não podem proporcionar modificações adicionais requeridas para numerosos polipeptídeos e proteínas eucarióticas a serem produzidos numa forma ativa. A glicosilação de proteínas e a dobragem apropriada de proteínas são exemplos de processamento necessários para assegurar a produção de um polipeptídeo ou proteína ativa. Para assegurar um processamento desse tipo, pode-se utilizar, algumas vezes, células mamíferas; no entanto, a desvantagem desse tipo de células é que elas são freqüentemente difíceis de conservar e requerem meios onerosos. Portanto, tais sistemas de transformação não são práticos para a produção de proteínas ou polipeptídeos no nível industrial. Eles podem ser econômicos para compostos farmacêuticos de elevado valor que requerem quantidades relativamente baixas, porém certamente não para enzimas industriais.

Desenvolveu-se uma quantidade de sistemas de expressão fúngicos, p. ex. Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei. Vários outros já foram sugeridos, porém por diversas razões não tiveram aceitação ou uso disseminado. Em termos gerais, o hospedeiro ideal precisa preencher uma grande quantidade de critérios: O hospedeiro ideal precisa ser facilmente fermentado utilizando-se meio econômico. O hospedeiro ideal deveria utilizar o meio eficientemente. O hospedeiro ideal precisa produzir o polipeptídeo ou proteína com alto rendimento, i.e., precisa apresentar uma elevada proporção de proteína para biomassa. O hospedeiro ideal deveria ser capaz de uma eficiente secreção da proteína ou polipeptídeo. O hospedeiro ideal precisa permitir a facilidade de isolamento e purificação da proteína ou polipeptídeo desejado. O hospedeiro ideal precisa processar a proteína ou polipeptídeo desejado de tal forma que seja produzido numa forma ativa, não requerendo etapas adicionais de ativação ou modificação. O hospedeiro ideal deveria ser facilmente transformado. O hospedeiro ideal deveria permitir o uso de uma ampla faixa de elementos reguladores de expressão, desta forma assegurando a facilidade de aplicação e versatilidade. O hospedeiro ideal deveria permitir o uso de marcadores facilmente selecionáveis que são baratos de usar. O hospedeiro ideal deveria produzir transformantes estáveis. O hospedeiro ideal deveria permitir o cultivo em condições não prejudiciais à proteína ou polipeptídeo expresso, p. ex. baixa viscosidade, baixo cisalhamento.

Sistemas fúngicos que ainda não são utilizados de maneira disseminada encontram-se descritos, p. ex., na patente U.S. n° 5.578.463 de Berka et al., sugerindo Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochoibolus e Pyricularia, juntamente com Aspergillus e Trichoderma. No entanto, só se proporciona ilustrações de transformações e expressão para Aspergillus e Trichoderma e não se fornece detalhes para quaisquer dos outros hospedeiros sugeridos. WO 96/02563 e patentes U.S. nums. 5.602.004, 5.604.129 e 5.695.985 para Novo Nordisk descrevem as desvantagens de sistemas de Aspergillus e Trichoderma e sugere [que as] condições de cultivo para outros fungos podem ser mais adequadas para a produção de proteínas em grande escala. Os únicos exemplos proporcionados de quaisquer culturas transformadas são aquelas de cepas de Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris e Sporotrichum cellulophilum. Reporta-se que a cepa Sporotrichum lisa e produz pigmento verde em condições de fermentação, sendo que não se chega a resultados desse tipo com as outras cepas. Um mutante não-esporulante de Thielavia terrestris é descrito como sendo o organismo de escol em virtude de sua morfologia. No entanto, afirma-se também que a eficiência protoplasmatizante de Thielavia e Acremonium (com o que a cepa de Acremonium utilizada era o estado imperfeito da cepa de Thielavia utilizada) é baixa, e que a higromicina não foi útil como um marcador de seleção. Muitos outros são sugeridos como sendo potencialmente úteis em virtude de sua morfologia, porém não se descreve transformação dos mesmos. As cepas sugeridas são Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, Ctenomyce, Scytalidium e Talaromyces. Os hospedeiros transformados são mencionados como produzindo apenas baixos níveis da Humicola xylanase introduzida, sendo que Thielavia produz a menor quantidade; no entanto, a informação é ambígua e poderia efetivamente leva à inferência de que Thielavia seria a melhor concretização. A nomenclatura desta referência baseia-se nos nomes ATCC de Fungos Industriais de 1994. Assim, percebe-se que não foi atingido um alto grau de expressão heteróloga e, efetivamente, não foi possível derivar qualquer correlação positiva entre a morfologia postulada e o grau de expressão. Se fosse possível traçar qualquer correlação, mui provavelmente esta seria negativa. De acordo com a classificação fúngica da ATCC de 1996, Sporotrichum thermophilum ATCC 20493 é uma cepa de Myceliophthora thermophila. Correntemente, a cepa ainda é identificada como Myceliophthora thermophila. A impredizibilidade da arte é perceptível considerando-se estas revelações recentes.

Também, Allison et al. (Curr. Genetics 21: 225-229, 1992) descreveram a transformação de Humicola grisea var. thermoidea utilizando-se o processo de acetato de lítio e uma seqüência codificando enzima de Humicola, porém não se reporta a expressão de uma proteína heteróloga de tal cepa.

Em 1997, uma patente expedida para Hawaii Biotechnology Group referente a Neurospora transformada para a expressão de peptídeo mamífero, como a cromosina. A transformação de Neurospora crassa auxotrófica ocorreu com esferoplastos. Introduziu-se regiões reguladoras transcricionais endógenas e realizou-se a co-transformação. Nada se menciona acerca de outros hospedeiros e outros protocolos de transformação. Nada se depreende da revelação no que se refere ao grau de expressão. É duvidoso que o grau de expressão seja alto, visto que as imuno-técnicas (que são úteis para se detectar pequenas quantidades de proteína) são as únicas técnicas utilizadas para se ilustrar a presença da proteína. Não se descreve o efetivo isolamento da proteína. O WO 97/26330 da Novo Nordisk sugere um processo para se obter mutantes de células parentais fúngicas filamentosas apresentando uma propriedade aperfeiçoada para a produção de polipeptídeo heterólogo. O processo compreende inicialmente encontrar uma morfologia alterada, depois a verificação se o transformante produz mais polipeptídeo heterólogo do que o parental. O processo só ilustrado apenas no que se refere a cepas de Fusarium A3/5 e Aspergillus oryzae. Sugere-se que o processo seja aplicável para Aspergillus, Trichoderma, Thielavia, Fusarium, Neurospora, Acremonium, Tolyplocadium, Humicola Scytalidium, Myceliophthora ou Mucor. Como indicado acima, a impredizibilidade na arte e também a impredizibilidade do processo do pedido referido não proporcionam um ensinamento geralmente aplicável com uma razoável expectativa de sucesso. Descrição detalhada da invenção Descrevemos agora um sistema de expressão fúngica alternativa com a simplicidade de uso dos acima indicados Aspergilli e Trichoderma que preenchem as exigências acima. O novo sistema de acordo com a invenção proporciona as vantagens adicionais de que as taxas de transformação são mais elevadas do que aquelas para o freqüentemente utilizado sistema de Trichoderma reesei. Adicionalmente, as condições de cultura oferecem o bônus adicional de serem vantajosas para o polipeptídeo expresso. Nesta descrição e nas reivindicações anexas, onde se fizer referência a “polipeptídeos” ou “polipeptídeos de interesse” como os produtos do sistema de expressão da invenção, este termo também compreende proteínas, i.e. polipeptídeos com uma função particular e/ou uma estrutura secundária e/ou terciária. O pH do meio de cultura pode ser neutro ou alcalino, desta forma não mais sujeitando a proteína ou polipeptídeo produzido a um pH ácido que é agressivo e potencialmente inativador. Também é possível cultivar a um pH ácido, como pH 4, nos casos em que a proteína ou polipeptídeo é melhor adequado para um ambiente acídico. De uma forma adequada, a cultura pode ocorrer a um pH entre 4,0-10,0. No entanto, há uma preferência por um pH neutro a alcalino porque a cepa hospedeira apresenta melhor crescimento a um tal pH, p. ex. entre 6 e 9. O crescimento a uma temperatura alcalina, que pode ser de pH 8 acima e pode até mesmo ser tão alta quanto 10, também é uma boa alternativa em alguns casos. Também, a temperatura de cultivo dessas cepas de hospedeiros é vantajosa para a estabilidade de alguns tipos de polipeptídeo produzido. A temperatura de cultivo é, adequadamente, uma temperatura de 25-43°C. Uma temperatura na faixa de 40°C para baixo até 23°C ou 30°C também é aplicada de maneira vantajosa. Claramente, essas condições são de interesse particular para a produção de polipeptídeos mamíferos. A temperatura selecionada dependerá da economia de custos do cultivo e da sensibilidasde do polipeptídeo ou da cepa de cultivo. As condições serão determinadas pela pessoa versada na arte sem carga indevida numa base caso-a-caso, como é comum na arte.

Verificou-se também que a relação entre biomassa e viscosidade e a quantidade de proteína produzida é sumamente favorável para o hospedeiro de acordo com a invenção. Foram realizadas comparações com Trichoderma longibrachiatum (anteriormente também conhecido como Trichoderma reesei) e com Aspergillus niger. Trichoderma longibrachiatum deu 2,5-5 g/1 de biomassa, Aspergillus niger deu 5-10 g/1 de biomassa e o hospedeiro de acordo com a invenção deu 0,5-1 g/1 de biomassa sob suas respectivas condições otimizadas. Portanto, isto proporciona um aperfeiçoamento de 5-10 vezes sobre as cepas comercialmente utilizadas. Estas cepas comerciais são consideradas na arte como sendo, elas mesmas, grandes produtores de proteínas e são usadas com sucesso para a produção de proteína comercial. Elas têm sido cultivadas em suas condições ótimas, desenvolvidas e processadas de forma viável em fermentadores comerciais de grande escala. Utilizou-se as mesmas cepas para ilustrar um enorme aperfeiçoamento nos valores de viscosidade para culturas do hospedeiro de acordo com a invenção. Ao final do processo de fermentação, Trichoderma longibrachiatum deu um valor de 200-600 cP (Centipoise), Aspergillus niger deu um valor de 1500-2000 cP e o hospedeiro de acordo com a invenção deu um valor abaixo de 10 cP. Desta forma, isto proporciona um aperfeiçoamento dos valores de viscosidade de pelo menos 20-200 vezes acima das cepas comercialmente utilizadas. Um outro aspecto bastante surpreendente foi que os níveis de proteína determinados para as células de hospedeiro de acordo com a invenção foram muito mais elevados do que para as cepas comerciais de Aspergilli e Trichoderma reesei, mesmo com os níveis de biomassa e viscosidade surpreendentemente baixos mencionados acima. Em resumo, desta forma introduziu-se uma maneira fácil de utilizar o sistema de transformação aperfeiçoado versátil e o sistema de expressão em condições aperfeiçoadas de cultivo. As cepas de acordo com a invenção produzem níveis de proteína surpreendentemente mais elevados nestas condições aperfeiçoadas e, adicionalmente, fazem-no num tempo menor de fermentador. A presente invenção refere-se a cepas mutantes de Chrysosporium compreendendo uma seqüência de ácido nucléicos codificando uma proteína ou polipeptídeo heterólogo, sendo que a referida seqüência de ácidos nucléicos é ligada operacionalmente a uma região reguladora de expressão e, opcionalmente, uma seqüência codificante de sinal de secreção e/ou uma seqüência codificante de proteína-veículo. De preferência, uma cepa recombinante de acordo com a invenção secretará o polipeptídeo de interesse. Isto evitará a necessidade de romper a célula para isolar o polipeptídeo de interesse e também minimizará o risco de degradação do produto expresso por parte de outros componentes da célula hospedeira.

Chrysosporium pode ser definido com uma morfologia consistente com aquela descrita por Bamett e Hunter 1972, “Illustrated Genera of Imperfect Fungi”, 3a edição, Burgess Publishing Company. Outras fontes que proporcionam detalhes referentes à classificação de fungos do gênero Chrysosporium são conhecidas, p. ex. Sutton Classification (Van Oorschot, C.A.N. (1980) "A revision of Chrysosporium and allied genera" em Studies in Mycology n° 20 da CBS em Baam The Netherlands pl-36). CBS é um instituto depositário do Tratado de Budapest. De acordo com estes ensinamentos, o gênero Chrysosporium é incluído na família Moniliaceae que pertence à ordem Hyphomycetales. Os critérios que podem ser usados são os seguintes: 1. Sinais da ordem Hyphomycetales: Conídios são produzidos diretamente no micélio, em células esporogênicas separadas ou em conidióforos distintos. 2. Sinais da família Mondiaceae: Tanto conídios como conidióforos (se presentes) são hialinos e de cor brilhante; os conidióforos são individuais ou apresentam-se em aglomerados soltos. 3. Sinais do gênero Chrvsosporium Corda 1833: As colônias são usualmente estendidas, brancas, algumas vezes de cor creme, marrom claras ou amarelas, felpadas e/ou pulverulentas. As hifas são, na maioria das vezes, hialinas e de paredes lisas, com ramificação mais ou menos ortotópico. As hifas férteis apresentam pouca ou nenhuma diferenciação. Os conídios são terminais e laterais, taliformes, desenvolvidos sobre as hifas, sésseis ou em protrusões curtas ou ramos laterais, sub-hialinos ou amarelo-pálidos, de paredes finas ou grossas, subglobosos, claviformes, piriformes, obovóides, de uma só célula, raramente de 2 células, truncados. Os conídios intercalares estão presentes algumas vezes, são solitários, ocasionalmente encadeados, sub-hialinos ou amarelo-pálidos, mais largo do que as hifas suportantes, normalmente de uma só célula, truncados em ambas as pontas. Ocasionalmente estão presentes clamidósporos.

Outra fonte que proporciona informação sobre a nomenclatura fúngica é a ATCC (E.U.A). Seu sítio na internet é http://www.atcc.org. A CBS também tem um sítio na internet (http//www.cbs.knaw.nl) que proporciona informação relevante. VKM em Moscou também é uma fonte confiável de tal tipo de informação; o endereço para correio eletrônico da VKM é http://www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general. Outra fonte é http//NT.ars-grin.gov/-fungaldatabases. Todas estas instituições podem proporcionar ensinamentos sobre as características diferenciadoras de um crisósporo.

As cepas definidas como sendo de Myceliophthora thermophila não são consideradas para definir cepas de Chrysosporium de acordo com a definição da invenção. No passado tem havido considerável confusão sobre a nomenclatura de algumas cepas de Myceliophthora. De preferência, os Chrysosporium de acordo com a invenção são aqueles que são claramente distinguíveis como tais e não podem ser confundidos com Myceliophthora, Sporotrichum ou Phanerochaete chrysosporium.

As cepas a seguir são definidas como Chrysosporium, mas a definição de Chrysosporium não se limita a estas cepas: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. médium, C. médium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, C. zonatum. C. lucknowense forma uma das espécies de Chrysosporium que suscitaram interesse particular por ter proporcionado um produtor naturalmente grande de proteínas de celulase (WO 98/15633 e patente relacionada US 5.811.381). As características desta Chrysosporium lucknowense são: As colônias atingem 55 mm de diâmetro sobre ágar de glucose Sabouraud em 14 dias, [com aspecto] de cor creme, felpudo ou fofo; densas e com 3-5 mm de altura; margens definidas, regulares, e fimbriadas; reverso de cor amarelo claro a cor creme. As hifas são hialinas, apresentam paredes lisas e finas, pouca ramificação. As hifas aéreas são, na maioria das vezes, férteis e estreitamente septadas, largura de aproximadamente 1-3,5 mm.

As hifas submersas são inférteis, com cerca de 1-4,5 mm de largura, sendo que as hifas mais finas são freqüentemente contorcidas. Os conídios são terminais e laterais, predominantemente sésseis ou sobre protrusões curtas, freqüentemente cônicas, ou ramos laterais curtos. Os conídios são solitários, porém encontram-se em estreita proximidade uns com os outros, desenvolvem-se 1-4 conídios numa célula hifal, sub-hialina, com paredes bastantes finas e lisas, predominantemente subglobosos, também clavados obovóides, com uma só célula, 2,5 x 11 x 1,5-6 mm, com cicatrizes basais amplas (1-2 mm). Conídios intercalares estão ausentes. Clamidósporos estão ausentes. ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 e CBS 272.77 são exemplos de cepas de Chrysosporium lucknowense e outros exemplos são proporcionados no WO 98/15633 e na US 5.811.381.

Isolou-se uma cepa adicional desta espécie com uma capacidade de produção ainda maior para celulases. Esta cepa é denominada Cl por sua notação interna e foi depositada junto ao Depositário Internacional da Coleção toda-russa de microorganismos da Academia Russa de Ciências, rua Bakrushina 8, Moscou, Rússia 113184, em 29 de agosto de 1996, como um depósito de acordo com o Tratado de Budapeste e recebeu o número de registro VKM F-3500D. Denomina-se Chrysosporium lucknowense Garg 27Κ. As características da cepa Cl são as seguintes: As colônias crescem até cerca de 55-66 mm de diâmetro sobre ágar de dextrose-batata em cerca de 7 dias, tem cor branco-creme, são felpudas, têm altura de 2-3 mm no centro; as margens são definidas, regulares, fimbriadas, apresentam reverso de cor creme claro. As hifas são hialinas, apresentam paredes lisas e finas, pouca ramificação. As hifas aéreas são férteis, septadas, com largura de 2-3 mm. As hifas submersas são inférteis. Os conídios são terminais e laterais; sésseis ou sobre curtos ramos laterais; ausentes, solitários, mas em estreita proximidade uns com os outros, hialinos, com paredes finas e lisas, subglobosos, clavados ou obovóides, de uma só célula, 4-10 mm. Clamidósporos estão ausentes. Conídios intercalares estão ausentes. O processo de isolamento da cepa Cl é descrito no WO 98/15633 e na US 5.811.381. As cepas que apresentam uma tal morfologia são incluídas dentro da definição de Chrysosporium de acordo com a invenção. Também incluem-se na definição de Chrysosporium as cepas derivadas de predecessores de Chrysosporium aquelas que mutaram um pouco, seja naturalmente ou por mutagênese induzida. Em particular, a invenção abrange mutantes de Chrysosporium obtidos por mutagênese induzida, especialmente por meio de uma combinação de irradiação e mutagênese química.

Por exemplo, a cepa Cl foi mutagenizada sujeitando-se a mesma a luz ultravioleta par gerar a cepa UV13-6. Subseqüentemente, esta cepa foi ainda mais mutada com N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina para gerar a cepa NG7C-19. Esta última cepa, por sua vez, foi submetida a mutação com luz ultravioleta, resultando na cepa UV18-25. Durante este processo de mutação, as características morfológicas variaram um pouco na cultura em líquido ou sobre placas, bem como sob o microscópio. A cada mutagênese sucessiva, as culturas apresentaram menos do aspecto fofo ou felpudo sobre as placas que se descreve como sendo característico de Chrysosporium, até que as colônias atingissem um aspecto plano e fosco. Um pigmento marrom observado na cepa de tipo selvagem em alguns meios também foi menos prevalente em cepas mutantes. Na cultura líquida, o mutante UV18-25 apresentou-se distintamente menos viscoso do que a cepa de tipo selvagem Cl e os mutantes UV13-6 e NG7C-19. Embora todas as cepas mantivessem as características microscópicas brutas de Chrysosporium, os micélios tomaram-se mais estreitos com cada mutação sucessiva e, no caso de UV18-25, pôde-se observar a fragmentação distinta dos micélios. Esta fragmentação micelar é provavelmente a causa da menor viscosidade associada com culturas de UV18-25. A capacidade das cepas em esporularem diminui com cada etapa mutagênica. O exposto acima ilustra que, para que uma cepa pertença ao gênero Chrysosporium, há alguma tolerância com respeito à definição morfológica acima. A cada etapa de mutação a produção de celulase e de proteínas extracelulares também aumentou adicionalmente, enquanto que várias mutações resultaram numa diminuição da expressão de protease. Os critérios com que a taxonomia fúngica pode ser determinada estão disponíveis junto à CBS, VKMF e ATCC, por exemplo.

Em particular, verificou-se que a forma anamorfótica de Chrysosporium é adequada para a aplicação de produção de acordo com a invenção. O metabolismo do anamorfótico toma-o extremamente adequado para um alto grau de expressão. Um teleomorfótico também deveria ser adequado, visto que a preparação genética dos anamorfóticos e teleomorfóticos é idêntica. A diferença entre anamorfótico e teleomorfótico é que um é o estado assexual e o outro é o estado sexual. Os dois estados apresentam morfologia diferente em determinadas condições. E preferível utilizar cepas não-tóxicas de Chrysosporium das quais uma quantidade é conhecida na arte, porque com isto se reduz os riscos para o ambiente quando de uma produção em grande escala e simplificar os procedimentos de produção com a concomitante redução de custos.

Uma região reguladora de expressão consiste de uma seqüência de DNA reconhecida pelo cepa hospedeira de Chrysosporium para expressão. Ela compreende uma seqüência promotora ligada operacionalmente a uma seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo a ser expresso. O promotor é ligado de tal forma que o posicionamento frente ao códon de iniciação da seqüência a ser expressa permita expressão. A seqüência promotora pode ser constitutiva ou indutível. Considera-se qualquer seqüência reguladora de expressão ou combinação das mesmas capaz de permitir a expressão de um polipeptídeo de uma cepa de Chrysosporium. A seqüência reguladora de expressão é, adequadamente, uma região reguladora de expressão fúngica, p. ex. uma região reguladora de ascomiceto. Adequadamente, a região reguladora de expressão fúngica é uma região reguladora de qualquer um dos seguintes gêneros de fungos: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces ou formas sexuais alternativas dos mesmos, como Emericella, Hypocrea p. ex. o promotor de celobioidrolase de Trichoderma, promotor de glucomilase de Aspergillus, promotor de gliceraldeído fosfato desidrogenase de Aspergillus, promotor de álcool desidrogenase A e álcool desidrogenase R de Aspergillus, promotor de TAKA damilase de Aspergillus, promotores de controle de caminho cruzado e de fosfoglicerato de Neurospora, promotor de proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, promotor de lipase de Rhizomucor miehei e promotor de beta-galactosidase de Penicillium canescens. Uma seqüência reguladora de expressão do mesmo gênero que a cepa hospedeira é extremamente adequada, por ser mui provavelmente, adaptada especificamente ao hospedeiro específico. Assim, de preferência, a seqüência reguladora de expressão é uma da cepa de Chrysosporium. Nós verificamos que cepas particulares de Chrysosporium expressam proteínas em quantidades extremamente elevadas e as seqüências reguladoras de expressão natural são de interesse particular. Estas cepas são denominadas intemamente como cepa de Chrysosporium Cl, cepa UV13-6, cepa NG7C-19 e cepa UV18-25. Elas foram depositadas de acordo com o Tratado de Budapeste junto ao instituto depositário da “All Russian Collection” (VKM) em Moscou. A cepa de tipo selvagem Cl foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste com o número VKM F-3500 D, data de depósito de 29.08.1996, o mutante Cl UV13-6 foi depositado com o número VKM F-3632 D, e data de depósito de 02.09.1998, o mutante Cl NG7c-19 foi depositado com o número VKM F-3633 D e data de depósito de 02.09.1998 e o mutante Cl UV18-25 foi depositado com o número VKM F-3631 D e data de depósito de 02.09.1998.

De preferência, aplica-se uma região reguladora de expressão que permite a alta expressão no hospedeiro selecionado. Esta também pode ser uma região reguladora de alta expressão derivada de um hospedeiro heterólogo, como é bem conhecido na arte. Exemplos específicos de proteínas conhecidas por serem expressas em grandes quantidades e, portanto, proporcionando seqüências de regulação de expressão adequadas para a invenção são, sem limitar-se aos mesmos: hidrofobina, protease, amilase, xilanase, pectinase, esterase, beta-galactosidase, celulase (p. ex. endo-glucanase, celobioidrolase) e poligalacturonase. A alta produção tem sido assegurada tanto em condições de estado sólido como em condições de fermentação submersa. As análises para se determinar a presença ou a produção dessas proteínas são bem conhecidas na arte. Os catálogos da Sigma e Megazyme, por exemplo, proporcionam numerosos exemplos. A Megazyme localiza-se no Bray Business Park, Bray, County Wicklow na Irlanda. A Sigma Aldrich possui muitas afiliadas em todo o mundo, p. ex. USA P.O. Box 14508 St. Louis, Missouri. No caso da celulase referimos-nos a análises comercialmente obteníveis, como as análises CMCase, análises endoviscométricas, análises Avicelase, análises beta-glucanase, análises RBBCMCase, análises Cellazyme C. Alternativas são bem conhecidas por uma pessoa versada na arte e podem ser encontradas na literatura geral relativa ao assunto e esta informação é considerada aqui por referência. A título de exemplo referimos-nos a “Methods in Enzymology”, volume 1, 1955 até os volumes 297-299 de 1998. Adequadamente, a seqüência promotora de Chrysosporium é aplicada para assegurar seu bom reconhecimento por parte do hospedeiro. Nós verificamos que seqüências reguladoras de expressão heterólogas atuam tão eficientemente em Chrysosporium como seqüências nativas de Chrysosporium. Isto permite utilizar vetores e construções bem conhecidas na transformação de Chrysosporium, bem como oferece numerosas outras possibilidades para a construção de vetores, permitindo boas taxas de expressão neste novo hospedeiro de secreção e expressão. Por exemplo, é possível utilizar técnicas convencionais de transformação de Aspergillus, conforme descrito, por exemplo, por Christiansen et al em “Bio/Technol.” 6: 1419-1422 (1988). Outros documentos proporcionam detalhes de vetores de transformação de Aspergillus, p. ex. as patentes U.S. nums. 4.816.405, 5.198.345, 5.503.991, 5.364.770 e 5.578.463, EP-B-215.594 (também para Trichoderma) e seus conteúdos são incorporados aqui por referência. Como taxas extremamente altas de expressão para celulase foram determinadas para cepas de Chrysosporium, as regiões reguladoras de expressão dessas proteínas são particularmente preferidas. Referimos-nos, para exemplos específicos, às cepas de Chrysosporium depositadas previamente mencionadas.

Uma construção de ácidos nucléicos compreendendo uma região reguladora de expressão de ácido nucléico de Chrysosporium, de preferência de Chrysosporium lucknowense ou um derivado do mesmo, forma uma concretização separada da invenção, como o faz a cepa mutante de Chrysosporium compreendendo isso ligado operacionalmente a um polipeptídeo a ser expresso. Adequadamente, uma tal construção de ácidos nucléicos encontrar-se-á numa região reguladora de expressão de Chrysosporium associada com a expressão de xilanase ou celulase, de preferência a expressão de celobioidrolase, mais especificamente a expressão de uma celobioidrolase com 55 kDa. As seqüências promotoras de Chrysosporium de uma endoglucanase com 25 kDa (C1-EG5) e uma endoglucanase com 43 kDa (C1-EG6), em que os pesos moleculares são determinados de acordo com SDS PAGE (sendo que os pesos moleculares de acordo com os dados da seqüência de aminoácidos são 21,9 kDa e 39,5 kDa), são proporcionadas a título de exemplo. Assim, as seqüências promotoras de Chrysosporium de hidrofobina, protease, amilase, xilanase, esterase, pectinase, beta-galactosidase, celulase (p. ex. endoglucanase, celobioidrolase) e poligalacturonase são consideradas como incluídas no escopo da invenção. Quaisquer promotores ou regiões reguladoras de expressão de enzimas descritas na Tabela A ou B podem ser empregados de adequadamente. A seqüência de ácidos nucléicos de acordo com a invenção pode ser obtida convenientemente de uma cepa de Chrysosporium de acordo com a invenção, sendo que uma tal cepa é definida alhures na descrição. A maneira com que seqüências promotoras podem ser determinadas são numerosas e bem conhecidas na arte. Experimentos de deleção de nuclease da região a montante do códon ATG no início do gene relevante proporcionarão tal seqüência. Também, por exemplo, a análise de seqüências de consenso podem levar à descoberta do gene de interesse. Utilizando-se técnicas de hibridização e amplificação, alguém versado na arte pode facilmente chegar às seqüências promotoras correspondentes.

As seqüências promotoras de endoglucanases Cl foram identificadas desta maneira, através da clonagem dos genes correspondentes, e são dadas nas SEQ ID NOs: 2 (EG5) e 1 (EG6), respectivamente. Outros promotores preferidos de acordo com a invenção são o promotor de celobioidrolase com 55 kDa (CBH1) e os promotores de xilanase com 30 kDa (XylF), porque as enzimas são expressas em alto nível por seus próprios promotores. As seqüências promotoras correspondentes podem ser identificadas de uma maneira objetiva através da clonagem, conforme descrito abaixo para os promotores de endoglucanase, utilizando-se a informação de seqüência parcial dada na SEQ ID No. 4 (para CBH1) e SEQ ID No. 5 (para XylF), respectivamente. Os promotores das enzimas degradadoras-de-carboidrato de Chrysosporium, especialmente os promotores de Cl, podem ser usados vantajosamente para expressar polipeptídeos desejados em um organismo hospedeiro, especialmente um organismo fungico ou outro organismo hospedeiro microbiano. Seqüências promotoras apresentando pelo menos 60 %, de preferência pelo menos 70 %, sendo o mais preferível, pelo menos 80 % de identidade de seqüências de nucleotídeos com a seqüência dada nas SEQ ID NOs 1 e 2, ou com as seqüências encontradas para outros genes de Chrysosporium, fazem parte da presente invenção.

Para concretizações particulares da cepa recombinante e a seqüência de ácidos nucléicos de acordo com a invenção também nos referimos aos exemplos. Para as cepas recombinantes, referimos-nos também ao estado da técnica em que se descreve seqüências promotoras de alta expressão, em particular aquelas que proporcionam alta expressão em fungos, p. ex., como são descritas para Aspergillus e Trichoderma. O estado da técnica proporciona uma quantidade de regiões reguladoras de expressão para uso em Aspergillus p. ex. a patente U.S. n° 5.252.726 da Novo e US 5.705.358 da Unilever. O teor desse estado da técnica é incorporado aqui por referência. O gene de hidrofobina é um gene fungico que é altamente expresso. Sugere-se, portanto, que a seqüência promotora de um gene de hidrofobina, de preferência de Chrysosporium, pode ser adequadamente aplicado como seqüência reguladora de expressão em uma concretização adequada da invenção. As seqüências de genes de Trichoderma reesei e Trichoderma harzianum para hidrofobina foram descritas, por exemplo, no estado da técnica, e também como seqüência gênica para Aspergillus fumigatus e Aspergillus nidulans e a informação de seqüência relevante é incorporada aqui por referência (Munoz et al., Curr. Genet. 1997, 32(3): 225-230; Nakari-Setala T. et al., Eur. J. Biochem. 1996 15: 235 (1-2):248-255, M. Parta et al., Infect. Immun. 1994 62 (10): 4389-4395 e Stringer M.A. et al., Mol. Microbiol. 1995 16(1): 33-44). Utilizando esta informação de seqüência uma pessoa versada na arte pode obter as seqüências reguladoras de expressão de genes de hidrofobina de Chrysosporium sem indevida experimentação, seguindo técnicas convencionais como já sugerido acima. Uma cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a invenção pode compreender uma região reguladora de hidrofobina ligada operacionalmente à seqüência que codifica o polipeptídeo de interesse.

Uma seqüência reguladora de expressão também pode compreender, adicionalmente, um acentuador ou silenciador. Estes também são bem conhecidos no estado da técnica e localizam-se usualmente a alguma distância do promotor. As seqüências reguladoras de expressão também podem compreender promotores com sítios de ligação de ativador e sítios de ligação de repressor. Em alguns casos, esses sítios também podem ser modificados para eliminar este tipo de regulação. Promotores fángicos filamentosos em que sítios creA estão presentes já foram descritos. Esses sítios creA podem ser mutados para assegurar que a repressão de glucose normalmente resultante da presença dos sítios não-mutados seja eliminada. O pedido WO 94/13820 de Gist-Brocades ilustra este princípio. O uso de um tal promotor permite a produção do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácidos nucléicos regulada pelo promotor na presença de glucose. O mesmo princípio também se depreende do WO 97/09438. Estes promotores podem ser usados com ou sem seus sítios creA. Os mutantes em que os sítios creA foram mutados podem ser usados como seqüências reguladoras de expressão em uma cepa recombinante de acordo com a invenção e a seqüência de ácidos nucléicos que ela regula pode ser então expressa na presença de glucose. Tais promotores de Chrysosporium asseguram a des-repressao de maneira análoga àquela ilustrada no WO 97/09438. A identidade dos sítios creA é conhecida do estado da técnica. Altemativamente, é possível aplicar um promotor com sítios de ligação CreA que não foram mutados numa cepa hospedeira com uma mutação em outro lugar no sistema de repressão, p. ex. no próprio gene creA, de modo que a cepa pode, não obstante a presença de sítios de ligação creA, produzir a proteína ou polipeptídeo na presença de glucose.

Seqüências terminadoras também são seqüências reguladoras de expressão e estas são ligadas operacionalmente na ponta 3 ’ da seqüência a ser expressa. Qualquer terminador fúngico é provavelmente funcional na cepa hospedeira de Chrysosporium de acordo com a invenção. Exemplos compreendem terminador de A nidulans trpC (1), terminador de A niger alfa-glucosidase (2), terminador de A niger glucoamilase (3), terminador de Mucor miehei carboxil protease (US 5.578.463) e o terminador de Trichoderma reesei celobioidrolase. Naturalmente, as seqüências de terminador de Chrysosporium funcionarão em Chrysosporium e são adequadas, p. ex., o terminador EG6.

Uma cepa recombinante de Chrysosporium adequada de acordo com a invenção possui a seqüência de ácidos nucléicos a ser expressa ligada operacionalmente a uma seqüência codificando a seqüência de aminoácidos definida como seqüência-sinal. Uma seqüência-sinal é uma seqüência de aminoácidos que, quando ligada operacionalmente à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo expresso, permite sua secreção do fungo hospedeiro. Uma tal seqüência-sinal pode ser uma que é associada normalmente com o polipeptídeo heterólogo, ou pode ser uma que é nativa ao hospedeiro. Também pode ser exógena tanto para o hospedeiro como para o polipeptídeo. A seqüência de ácidos nucléicos que codifica a seqüência-sinal precisa ser posicionada na matriz para permitir a tradução da seqüência-sinal e o polipeptídeo heterólogo. Considera-se qualquer seqüência-sinal capaz de permitir a secreção de um polipeptídeo de uma cepa de Chrysosporium. Uma tal seqüência-sinal é, adequadamente, uma seqüência-sinal fúngica, de preferência uma seqüência-sinal de ascomiceto.

Exemplos adequados de seqüências-sinal podem derivar-se de leveduras em geral ou de qualquer dos gêneros específicos de fungos a seguir: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces ou suas formas sexuais alternativas, como Emericella, Elypocrea. As seqüências-sinal que são particularmente úteis são freqüentemente associadas nativamente com as seguintes proteínas: uma celobioidrolase, uma endoglucanase, uma beta-galactosidase, uma xilanase, uma pectinase, uma esterase, uma hidrofobina, uma protease ou uma amilase. Exemplos incluem amilase ou glucomilase de Aspergillus ou Humicola (4), TAKA amilase de Aspergillus oryzae, alfa-amilase de Aspergillus niger, carboxil peptidase de Mucor (US 5.578.463), uma lipase ou proteinase de Rhizomucor miehei, celobioidrolase de Trichoderma (5), beta-galactosidase de Penicillium canescens e fator de conjugação alfa de Saccharomyces.

Altemativamente, a seqüência-sinal pode ser de um gene de amilase ou sutilisina de uma cepa de Bacillus. Uma seqüência-sinal do mesmo gênero que a cepa hospedeira é extremamente adequada visto que é mui provavelmente adaptada especificamente ao hospedeiro específico, assim, de preferência, a seqüência-sinal é uma seqüência-sinal de Chrysosporium. Verificamos cepas particulares de Chrysosporium para excretar proteínas em quantidades extremamente grandes e, naturalmente, as seqüências-sinal destas cepas são de interesse particular. Estas cepas são denominadas intemamente como cepa de Chrysosporium Cl, cepa UV13-6, cepa NG7C-19 e cepa UV18-25. Elas foram depositadas de acordo com o Tratado de Budapeste como descrito alhures nesta descrição. As seqüências-sinal de fungos filamentosos, leveduras e bactérias são úteis. As seqüências-sinal de origem não-fúngica também são consideradas úteis, particularmente as bacterianas, de plantas, e mamíferas.

Uma cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com qualquer das concretizações da invenção pode compreender também um marcador selecionável. Um marcador selecionável desse tipo permitirá a fácil seleção de células transformadas ou transfectadas. Um marcador selecionável freqüentemente codifica um produto gênico proporcionando um tipo específico de resistência exógeno à cepa não-transformada. Isto pode ser resistência a metais pesados, a antibióticos e biocidas em geral. A prototrofia também é um marcador selecionável útil da variedade não-antibiótica. Marcadores não-antibióticos selecionáveis podem ser preferidos no caso em que a proteína ou polipeptídeo de interesse é utilizado em alimentos ou farmacêuticos visando uma aprovação regulatória mais rápida ou menos complicada de um produto desse tipo. Mui freqüentemente, a indicação GRAS é utilizada para marcadores desse tipo. Uma quantidade desse tipo de marcadores está disponível para a pessoa versada na arte. A FDA, p. ex., proporciona uma listas dos mesmos. Os mais comumente utilizados são os marcadores selecionáveis selecionados do grupo que confere resistência a uma droga ou que removem um defeito nutricional, p. ex. o grupo que compreende amdS (acetamidase), hph (higromicina fosfotransferase), pyrG (orotidine-5'-fosfato decarboxilase), trpC (antranilato sintase), argB (omitina carbamoiltransferase), sC (sulfato adeniltransferase), bar (fosfinotricina acetil-transferase), resistência a glufosinato, niaD (nitrato redutase), um gene de resistência à bleomicina, mais especificamente Sh ble, resistência à sulfoniluréia, p. ex. mutação de acetolactato sintase ilvl. A seleção também pode ser realizada em virtude da cotransformação em que o marcador de seleção encontra-se sobre um vetor separado ou em que o marcador de seleção se encontra sobre o mesmo fragmento de ácido nucléico que a seqüência codificando polipeptídeo para o polipeptídeo de interesse.

Como usado aqui, o termo polipeptídeo heterólogo é uma proteína ou polipeptídeo não normalmente expresso pela cepa hospedeira de Chrysosporium usada para a expressão de acordo com a invenção. O polipeptídeo pode ser de origem vegetal ou animal (vertebrado ou invertebrado), p. ex. de origem mamária, de peixes, insetos, ou de microorganismos, com a condição de que isto não ocorra na cepa hospedeira. Um mamífero pode incluir um humano. Um microorganismo compreende vírus, bactérias, arqueobactérias e fungos, i.e. fungos filamentosos e leveduras. O Manual Bergey's de Determinologia Bacteriana proporciona listas adequadas de bactérias e arqueobactérias. Para fins farmacêuticos há uma freqüente preferência por proteínas humanas, de modo que um hospedeiro recombinante de acordo com a invenção, formando uma concretização preferida, será um hospedeiro em que o polipeptídeo é de origem humana. Para fins como a produção de alimentos, adequadamente, o polipeptídeo heterólogo será de origem animal, vegetal ou de algas. A origem fúngica é a mais preferida.

Uma concretização preferida da invenção compreenderá uma seqüência de ácidos nucléicos heteróloga com utilização adaptada de códon. Uma seqüência desse tipo codifica a seqüência nativa de aminoácidos do hospedeiro de que se deriva, porém tem uma seqüência de ácidos nucléicos diferente, i.e. uma seqüência de ácidos nucléicos em que determinados códons foram substituídos por outros códons codificando o mesmo aminoácido, porém que são mais facilmente utilizados pela cepa de hospedeiro que está sendo usada para a expressão. Isto pode levar a uma melhor expressão da seqüência de ácidos nucléicos heteróloga. Isto é prática comum para uma pessoa versada na arte. Esta utilização de códon adaptada pode ser realizada com base na utilização conhecida de códon fúngico relativamente à utilização de códon não-fúngico. Pode ser adaptada ainda mais especificamente à utilização de códon do próprio Chrysosporium. As semelhanças são tais que a utilização de códon, como observada em Trichoderma, Humicola e Aspergillus deveria permitir a troca de seqüências desses organismos sem a adaptação de utilização de códon. Os detalhes estão disponíveis para a pessoa versada no que se refere à utilização de códon destes fungos e são incorporados aqui por referência. A invenção não se restringe às cepas recombinantes de Chrysosporium indicadas acima, mas também cobre uma cepa recombinante de Chrysosporium compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos codificando uma proteína homóloga para uma cepa de Chrysosporium, sendo que a referida seqüência de ácidos nucléicos é ligada operacionalmente a uma região reguladora de expressão e a referida cepa recombinante expressa mais da referida proteína do que a correspondente cepa não-recombinante sob as mesmas condições. No caso do polipeptídeo homólogo de interesse, o mesmo é, de preferência, uma enzima neutra ou alcalina, como a hidrolase, uma protease ou uma enzima degradadora de carboidrato, como já descrito alhures. O polipeptídeo também pode ser acídico. De preferência, a cepa recombinante expressará o polipeptídeo em maiores quantidades que a cepa não-recombinante. Todos os comentários indicados relativamente ao polipeptídeo heterólogo também são válidos (mutatis mutandis) para a celulase de polipeptídeo homóloga.

Assim, a invenção também abrange cepas de Chrysosporium geneticamente manipuladas em que a seqüência que é introduzida pode ser de origem de Chrysosporium. No entanto, uma cepa desse tipo pode ser distinguida de cepas naturalmente ocorrentes em virtude de, por exemplo, seqüências heterólogas presentes na seqüência de ácidos nucléicos usada para transformar ou transfectar o Chrysosporium, em virtude do fato de que múltiplas cópias da seqüência codificando o polipeptídeo de interesse estão presentes, ou devido ao fato de que estes são expressos numa quantidade excedente àquela da cepa não-manipulada em condições idênticas, ou devido ao fato de que a expressão ocorre em condições normalmente não-expressantes. Este último pode ser o caso se um promotor indutível regular a seqüência de interesse contrária à situação não-recombinante ou se outro fator induzir a expressão do que é o caso na cepa não-manipulada. A invenção conforme definida nas concretizações precedentes não se destina a abranger cepas de Chrysosporium naturalmente ocorrentes. A invenção refere-se a cepas derivadas por meio de manipulação, seja com tecnologias genéticas clássicas ou com metodologias de manipulação genética.

Todas as cepas recombinantes da invenção podem compreender uma seqüência de ácidos nucléicos codificando uma proteína heteróloga selecionada dentre enzimas degradadoras de carboidrato (celulases, xilanases, mananases, manosidases, pectinases, amilases, p. ex. glucoamilases, α-amilases, alfa- e beta-galactosidases, a- e β-glucosidases, β-glucanases, quitinases, quitanases), proteases (endoproteases, amino-proteases, amino- e carbóxi-peptidases), outras hidrolases (lipases, esterases, fitases), oxidoreductases (catalases, glucose-oxidases) e transferases (transglicosilases, transglutaminases, isomerases e invertases). * pesos moleculares (por MALDI) Nota: * todos os outros pesos moleculares por SDS PAGE * enzimas foram tomadas em teores iguais de proteína * xyl = xilanase * endo = endoglucanase * gal = galactosidase * gluc = glucosidase * CBN = celobioidrolase * PGU = poligalacturonase Os produtos mais interessantes a serem produzidos de acordo com a invenção são celulases, xilanases, pectinases, lipases e proteases, em que celulases e xilanases clivam ligações beta-1,4, 4 celulases compreendem endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases. Estas proteínas são extremamente úteis em diversos processos industriais conhecidos na arte. Especificamente para as celulases referimos-nos, p. ex., ao WO 98/15633 em que se descreve celobioidrolases e endoglucanases de utilização. O conteúdo do referido pedido é incorporado aqui por referência. Nós também nos referimos às Tabelas A e B proporcionando detalhes adicionais de proteínas de Chrysosporium interessantes.

Verificou-se, de acordo com a invenção, que se pode preparar mutantes de Chrysosporium que apresentam reduzida expressão de protease, tomando-os até mesmo mais adequados para a produção de produtos proteináceos, especialmente se o produto proteináceo for sensível à atividade de protease. Assim, a invenção também envolve uma cepa mutante de Chrysosporium que produz menos protease do que a cepa não-mutante de Chrysosporium, por exemplo menos que a cepa de C. lucknowense Cl (VKM F-3500D). Em particular, a atividade de protease dessas cepas é menos do que a metade da quantidade, mais preferivelmente, menos que 30 % da quantidade produzida pela cepa Cl. A menor atividade de protease pode ser medida com processos conhecidos, como medindo-se os halos formados sobre placas com leite desnatado ou a degradação de BS A.

Uma concretização da invenção de interesse particular é um Chrysosporium recombinante de acordo com a invenção em que a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo de interesse codifica um polipeptídeo que é inativado ou instável a um pH ácido, i.e. pH abaixo de 6, até mesmo abaixo de pH 5,5, mais adequadamente até mesmo abaixo de pH 5 e até tão baixo ou mais baixo que pH 4. Esta é uma concretização particularmente interessante porque os sistemas de expressão fúngica geralmente descritos não são cultivados em condições que são neutras até alcalinas, mas são cultivados a um pH ácido. Assim, o sistema de acordo com a invenção proporciona um sistema de expressão fungica para proteínas ou polipeptídeos que são capazes de ser inativados ou que são instáveis a um pH ácido.

De maneira bastante específica, uma cepa recombinante como definida em qualquer das reivindicações de acordo com a invenção, em que a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo de interesse codifica uma proteína ou polipeptídeo apresentando atividade ótima e/ou estabilidade a um pH acima de 5, de preferência a um pH neutro ou alcalino (i.e., acima de 7) e/ou a um pH mais elevado que 6, é considerada uma concretização preferida da invenção. Mais de 50 %, mais de 70 % e, até mesmo mais de 90 % de atividades ótimas a tais valores de pH são antecipadas como sendo concretizações particularmente úteis. Um polipeptídeo expresso nas condições de cultivo não precisam, necessariamente, ser ativos nas condições de cultivo, efetivamente pode ser vantajoso que seja cultivado em condições sob as quais é inativo porque sua forma ativa poderia ser prejudicial para o hospedeiro. Tal é o caso para as proteases, por exemplo. No entanto, o que se requer para que a proteína ou polipeptídeo seja estável nas condições de cultivo. A estabilidade pode ser a estabilidade térmica. Também pode ser estabilidade contra composições específicas ou químicas, como estão presentes, por exemplo, em composições ou processos de produção ou de aplicação do polipeptídeo ou proteína de interesse. LAS em composições detergentes compreendendo celulases ou lipases, etc. é um exemplo de um químico freqüentemente prejudicial para proteínas. Os períodos de tempo de utilização nas aplicações podem variar de uma exposição curta até longa de modo que a estabilidade pode refletir-se durante um período de tempo variável por aplicação. A pessoa versada será capaz de determinar as condições corretas numa base caso-a-caso. Pode-se utilizar uma quantidade de análises comercialmente disponíveis para determinar as atividades ótimas dos diversos produtos enzimáticos. Os catálogos das [firmas] Sigma e Megazyme, por exemplo, apresentam os mesmos. Exemplos específicos de testes são indicados alhures na descrição. Os fabricantes proporcionam orientação para a aplicação.

Verificamos, com surpresa, que uma cepa de Chrysosporium que pode ser utilizada de maneira conveniente para transformar ou transfectar com a seqüência de interesse a ser expressa é uma cepa que apresenta biomassa relativamente baixa. Nós verificamos que cepas de Chrysosporium apresentando uma biomassa duas a cinco vezes menor do que a de Trichoderma reesei, quando cultivada a uma viscosidade de 200-600 cP ao final da fermentação e apresentando uma biomassa de 10 a 20 vezes menor do que a de Aspergillus niger quando cultivado a uma viscosidade de 1500-2000 cP em condições correspondentes, i.e. suas respectivas condições ótimas de cultivo, podem proporcionar um alto nível de expressão. Este nível de expressão excede em muito aquele das duas cepas comerciais de referência a uma biomassa muito menor e a uma viscosidade muito menor. Isto significa que o rendimento de expressão dessas cepas de Chrysosporium será consideravelmente maior do o que de Aspergillus niger e Trichoderma reesei. Uma cepa de Chrysosporium transformada ou transfectada desse tipo forma uma concretização adequada da invenção. Encontramos uma biomassa de 0,5-1,0 g/1 para a cepa de Chrysosporium C 1(18-25) em oposição a 2,5-5,0 g/1 para Trichoderma reesei e 5-10 g/1 de Aspergillus niger sob as condições descritas acima. Nos Exemplos nós oferecemos detalhes deste processo.

Em uma concretização conveniente, uma cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a invenção produz proteína ou polipeptídeo numa quantidade pelo menos equivalente à produção em moles por litro de celulase com a cepa UV13-6 ou C-19, e, o mais preferível, pelo menos equivalente a ou maior que aquela da cepa UV18-25 sob condições correspondentes ou idênticas, i.e. suas respectivas condições ótimas de cultivo.

Inesperadamente, nós também verificamos que as taxas de expressão e de secreção são exageradamente elevadas quando se utiliza uma cepa de Chrysosporium apresentando a morfologia miceliana da cepa UV18-25, i.e. micélios curtos fragmentados. Assim, uma cepa recombinante de acordo com a invenção apresentará, de preferência, uma morfologia desse tipo. Contudo, a invenção também abrange cepas não-recombinantes ou cepas manipuladas de outra forma de Chrysosporium e que apresentam esta característica inédita e inventiva. Também está coberta pela invenção uma cepa recombinante de Chrysosporium em qualquer das concretizações descritas de acordo com a invenção apresentando adicionalmente uma reduzida esporulação em comparação com Cl, de preferência abaixo daquela da cepa UV13-6, de preferência abaixo daquela da NG7C-19, de preferência abaixo daquela da UV18-25 em condições equivalentes de fermentador. Também está coberta pela invenção uma cepa recombinante de Chrysosporium em qualquer das concretizações descritas de acordo com a invenção, apresentando adicionalmente pelo menos a quantidade de proporção de produção de proteína para biomassa em comparação com C1, de preferência em comparação com aquela de qualquer das cepas UV13-6, NG7C-19 e UV18-25 em condições equivalentes de fermentador. Contudo, a invenção também abrande cepas não-recombinantes ou cepas manipuladas de outra forma de Chrysosporium apresentando esta característica inédita e inventiva tal qual ou em combinação com qualquer das outras concretizações.

Outra concretização atraente da invenção também abrange uma cepa recombinante de Chrysosporium apresentando uma viscosidade abaixo daquela da cepa NG7C-19, de preferência abaixo daquela da UV18-25 em condições correspondentes ou idênticas de fermentador. Contudo, a invenção também abrange cepas não-recombinantes ou cepas manipuladas de outra forma de Chrysosporium apresentando esta característica inédita e inventiva tal qual ou em combinação com qualquer das outras concretizações. Nós determinamos que a viscosidade de uma cultura de UV18-25 está abaixo de 10 cP, em oposição àquela de Trichoderma reesei sendo da ordem de 200-600 cP, sendo que aquela de Aspergillus niger é da ordem de 1500-2000 cP sob suas respectivas condições ótimas de cultura ao final da fermentação. O processo utilizado para uma tal determinação é proporcionado nos Exemplo. A viscosidade pode ser determinada, em muitos casos, por monitoração visual. A fluidez da substância pode variar tão amplamente que pode ser quase sólida, em forma de molho ou líquido. A viscosidade também pode ser facilmente determinada por meio de viscosimetria rotacional de Brookfield, uso de tubos de viscosidade cinemática, viscosímetro de esfera descendente, ou viscosímetro de tipo taça. Os rendimentos de uma tal cultura de baixa viscosidade são maiores do que de culturas comerciais conhecidas com maior viscosidade por unidade de tempo e por célula. O processamento de tais culturas de baixa viscosidade de acordo com a invenção é vantajoso, em particular quando as culturas são ampliadas. As cepas em pauta, de Chrysosporium com a baixa viscosidade, desempenham muito bem em culturas com dimensões de até 150.000 litros. Assim, qualquer ampliação de escala de cultura até 150.000 litros proporciona uma concretização útil da invenção. Qualquer outro tamanho convencional de fermentação deveria ser bem realizado com as cepas de acordo com a invenção. O arrazoamento por trás disto é que podem surgir problemas numa produção em grande escala, com a formação de agregados que apresentam micélios que são densos demais e/ou que são distribuídos de forma não-homogênea. Como um resultado, o meio não pode ser utilizado efetivamente durante a cultura, levando assim a um processo de produção ineficiente, em particular em fermentações de grande escala, i.e. acima de 150.000 litros. A aeração e a misturação tomam-se problemáticos, levando à carência de oxigênio e nutrientes e, assim, a uma reduzida concentração de biomassa produtiva, e a um reduzido rendimento de polipeptídeo durante a cultura, e/ou pode resultar em tempos de fermentação mais prolongados. Adicionalmente, a alta viscosidade e alto cisalhamento não são desejáveis em processos de fermentação comerciais e, em processos comerciais correntes, constituem os fatores limitadores de produção. Todos estes aspectos negativos podem ser superados com o hospedeiro de Chrysosporium de acordo com a invenção, que apresenta características muito melhores do que Trichoderma reesei, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae que são utilizados comercialmente neste aspecto, i.e. apresenta níveis de produção de proteína e propriedades de viscosidade e valores de biomassa muito melhores.

Uma cepa de Chrysosporium selecionada dentre Cl, UV13-6, NG7C-19 e UV18-25 ilustra vários aspectos da invenção de maneira muito conveniente. No entanto, a invenção também abrange cepas recombinantes ou manipuladas de outra forma de Chrysosporium derivadas das quatro cepas depositadas que também apresentam qualquer das características inéditas e inventivas tal qual ou em combinação. Os dados de depósito para estas cepas foram apresentados alhures na descrição. A invenção também abrange cepas recombinantes ou cepas manipuladas de outra forma de Chrysosporium derivadas das quatro cepas depositadas que também apresentam quaisquer das características inéditas e inventivas tal qual ou em combinação. Uma cepa de Chrysosporium de acordo com a invenção também compreende uma cepa que apresenta, em condições correspondentes de cultura, uma biomassa pelo menos duas vezes tão baixa quanto aquela de Trichoderma reesei, adequadamente até mesmo até 5 vezes menor do que aquela de Trichoderma reesei, especificamente de uma de Trichoderma reesei apresentando uma viscosidade de 200-600 cP conforme descrito nas condições dos exemplos. Uma cepa de Chrysosporium de acordo com a invenção também compreende uma cepa que produz o polipeptídeo em, pelo menos, uma quantidade em moles por litro de celulase através da cepa Cl, UV13-6, NG7C-19 ou UV18-25 sob as condições correspondentes ou idênticas.

As cepas de Chrysosporium de acordo com a invenção também são preferidas se apresentarem condições ótimas de crescimento a pH neutro ou alcalino e a temperaturas de 25-43°C. Pode existir uma preferência por pH neutro ou até mesmo alcalino. Essas condições de produção são vantajosas para uma quantidade de polipeptídeos e proteínas, em particular aquelas passíveis de ataque por pH ácido ou aquelas que são inativas ou instáveis a temperaturas baixas. Contudo, também constitui uma concretização da invenção incluir cepas de Chrysosporium que podem ser cultivadas sob pH ácido pois isto pode ser útil para determinadas proteínas e polipeptídeos. Um pH ácido adequado situa-se em 7,0. Um pH ácido menor que 6,5 é considerado como proporcionando uma boa concretização da invenção. Um pH em tomo de 5,0-7,0 também é uma concretização adequada. Um pH neutro pode ser de 7,0 ou de aproximadamente 7, p. ex. 6,5-7,5. Como indicado alhures o pH de interesse ótimo depende de uma quantidade de fatores que será aparente para a pessoa versada na arte. Um pH maior que 7,5 é alcalino, podendo-se utilizar, adequadamente, um [pH] entre 7,5-9,0.

Quando se compara dados de cepas de acordo com a invenção com outras cepas, talvez apresentando outras condições ótimas (p. ex. Aspergillus e Trichoderma) para medições de viscosidade, determinação de biomassa ou produção de proteína, as comparações deveríam ser realizadas utilizando-se as condições ótimas relevantes para a cepa relevante. Isto será óbvio para a pessoa versada na arte.

Uma cepa de Chrysosporium de acordo com qualquer das concretizações indicadas acima da invenção, a referida cepa apresentando, adicionalmente, a produção de uma ou mais enzimas fúngicas selecionadas dentre as enzimas degradadoras de carboidrato, proteases, outras hidrolases, oxidoredutase, e transferases indicadas acima, é considerada uma concretização particularmente útil da invenção. Os produtos mais interessantes são, especificamente, celulases, xilanases, pectinases, lipases e proteases. No entanto, também é útil como uma concretização da invenção, uma cepa de Chrysosporium que apresenta produção de uma ou mais enzimas que apresentam estabilidade e/ou atividade ótima neutra ou alcalina, de preferência estabilidade e/ou atividade ótima alcalina, sendo que a referida enzima é selecionada dentre enzimas degradadoras de carboidrato, hidrolases e proteases, de preferência hidrolases e enzimas degradadoras de carboidrato. No caso de Chrysosporium não-recombinante, essas enzimas são, convenientemente, diferentes da celulase, conforme descrito no WO 98/15633. Enzimas de interesse particular compreendem xilanases, proteases, esterases, alfa-galactosidases, beta-galactosidases, beta-glucanases e pectinases. As enzimas não se limitam àquelas indicadas previamente. Os comentários referentes à estabilidade e atividade, alhures na descrição, também são válidos aqui. A invenção também abrange um processo para produzir um polipeptídeo de interesse, sendo que o referido processo compreende cultivar uma cepa de Chrysosporium em qualquer das concretizações de acordo com a invenção sob condições que permitam a expressão e, de preferência, a secreção do polipeptídeo, e recuperar o polipeptídeo de interesse subseqüentemente produzido.

Onde se menciona proteína ou polipeptídeo, variantes e mutantes, p. ex., mutantes de substituição, inserção ou deleção de proteínas naturalmente ocorrentes devem ser incluídos que apresentam a atividade de não-mutante. O mesmo é válido no que se refere a seqüências de ácidos nucléicos correspondentes. Processos, como de relocação de genes, manipulação de proteínas e mutagênese direcionada para sítio de evolução dirigida e mutagênese randômica são processos através dos quais se pode obter esses peptídeos, variantes ou mutantes. As patentes U.S. nums. 5.223.409, US 5.780.279 e US 5.770.356 proporcionam ensinamento sobre evolução dirigida. Com a utilização deste processo ocorre em cada tipo de célula uma biblioteca de seqüências de genes mutadas randomicamente, criadas por exemplo, por relocação de genes via PCR propensa a erro. Cada gene possui uma região de secreção e uma região imobilizadora fixada ao mesmo de modo que a proteína resultante é secretada e permanece fixada na superfície do hospedeiro. Subseqüentemente, criam-se condições que necessitam da atividade biológica do polipeptídeo particular. Isto ocorre durante um número de ciclos, levando, ultimamente, a um gene final com as características desejadas. Em outras palavras, um processo de evolução direcionado e acelerado. A patente U.S. n° 5.763.192 também descreve um processo para se obter DNA, RNA, peptídeos, polipeptídeos ou proteína por meio de seqüências geradas estocasticamente por acoplamento de polinucleotídeo sintético, sua introdução num hospedeiro, seguido de seleção da célula hospedeira com a característica predeterminada correspondente. É possível utilizar técnicas convencionais de clonagem e de isolamento de proteína ou polipeptídeo para se chegar à informação de seqüência requerida. Partes de seqüências conhecidas podem ser usadas como sondas para isolar outros homólogos em outros gêneros e cepas. A seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma atividade de enzima particular pode ser usada para selecionar uma biblioteca de Chrysosporium, por exemplo. Uma pessoa versada na arte verificará quais condições de hibridização são apropriadas. Processos convencionais para hibridização de ácidos nucléicos, construção de bibliotecas e técnicas de clonagem são descritos em Sambrook et al. (editores) (1989) em "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York, e Ausubel et al. (editores) "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) John Wiley and Sons, New York. A informação relevante também pode ser derivada de manuais e patentes posteriores, bem como de vários kits comercialmente obteníveis no campo.

Em uma concretização alternativa, o referido processo compreende a cultura de uma cepa de acordo com a invenção em condições que permitem a expressão e, de preferência, a secreção da proteína ou polipeptídeo ou seu precursor e a recuperação do polipeptídeo produzido subseqüentemente e, opcionalmente, submetendo-se o precursor a etapas adicionais de isolamento e purificação para se obter o polipeptídeo de interesse. Um processo desse tipo pode compreender, adequadamente, uma etapa de clivagem do precursor no polipeptídeo ou precursor de interesse. A etapa de clivagem pode consistir de clivagem com uma protease semelhante a Kex-2, qualquer Kex-1 ou protease pareada com aminoácido básico, por exemplo, quando o sítio de clivagem de protease liga um portador de proteína bem secretada e o polipeptídeo de interesse. Uma pessoa versada na arte pode facilmente encontrar seqüências de protease semelhante a Kex-2 como detalhes de seqüência de consenso porque estes estão disponíveis, e já se descreveu uma quantidade de alternativas, p. ex. a furina.

Adequadamente, em um processo para a produção do polipeptídeo de acordo com quaisquer concretizações da invenção, o cultivo ocorre a um pH maior que 5, de preferência 5-10, mais preferivelmente 6-9. Adequadamente, em um processo deste tipo o cultivo ocorre a uma temperatura entre 25-43°C, de preferência 30-40°C. A cepa de Chrysosporium utilizada no processo de acordo com a invenção é, bastante adequadamente, uma cepa de Chrysosporium recombinante de acordo com quaisquer concretizações descritas. Num caso destes, o processo de acordo com a invenção ainda pode ser precedido pela etapa de produção de uma cepa de Chrysosporium recombinante de acordo com a invenção. A seleção das condições apropriadas dependerá da natureza do polipeptídeo a ser expresso, e essa seleção encontra-se bem dentro do âmbito da atividade normal de uma pessoa versada na arte. O processo de produção de uma cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a invenção também faz parte da presente invenção. O processo compreende introduzir estavelmente uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo heterólogo ou homólogo numa cepa de Chrysosporium, sendo que a referida seqüência de ácidos nucléicos é ligada operacionalmente a uma região reguladora de expressão, sendo que a referida introdução ocorre de uma maneira conhecida per se para a transformação de fungos filamentosos. Como indicado acima, numerosas referências encontram-se disponíveis e apenas uma pequena seleção foi citada. A informação proporcionada é suficiente para permitir que uma pessoa versada realize o processo sem trabalho desnecessário. O processo compreende a introdução de uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo quaisquer dos elementos de ácidos nucléicos descritos nas diversas concretizações do Chrysosporium recombinante de acordo com a invenção, tal qual ou em combinação. A título de exemplo, a introdução pode ocorrer utilizando-se o processo de transformação de protoplasta. O processo é descrito nos exemplos. Processos alternativos de transformação de protoplasta ou esferoplasta são conhecidos e podem ser usados como foram descritos no estado da técnica para outros fungos filamentosos. Detalhes desses processos podem ser encontrados em muitas das referências indicadas e são, portanto, incorporados por referência. Um processo de acordo com a invenção compreende adequadamente a utilização de uma cepa não-recombinante de Chrysosporium de acordo com a invenção como material inicial para a introdução da seqüência desejada que codifica o polipeptídeo de interesse. A presente invenção também abrange um processo para produzir enzima de Chrysosporium, sendo que o referido processo compreende cultivar uma cepa de Chrysosporium de acordo com quaisquer concretizações da invenção como descrito acima em ou sobre um meio de cultivo a um pH mais elevado que 5, de preferência de 5-10, mais preferivelmente de 6-9, adequadamente de 6-7,5, 7,5-9 como exemplos de faixa de pH neutras e alcalinas. A presente invenção também abrange um tal processo utilizando um meio de cultivo a uma temperatura entre 25-43°C, de preferência de 30-40°C. A combinação de pH preferido e temperatura constitui uma concretização especialmente preferida do processo de produção de enzima de Chrysosporium de acordo com a invenção.

De uma maneira mais geral, a invenção ainda abrange um processo de produção de enzimas que apresentam atividade e/ou estabilidade ótima neutra ou alcalina, de preferência, atividade e/ou estabilidade ótima alcalina. As faixas preferidas relativamente a pH e atividade ótima, bem como as análises com que se determina as mesmas foram proporcionadas alhures na descrição. A enzima deveria ser selecionada de enzimas degradadoras de carboidrato, proteases, outras hidrolases, oxidorreductases, e transferases, como descrito acima, sendo que o referido processo compreende cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com a correspondente seqüência de ácidos nucléicos codificando enzima. Adequadamente, uma enzima desse tipo consistirá de uma enzima de Chrysosporium. Um processo adequado desse tipo compreende a produção, especificamente, de celulase, xilanase, pectinase, lipase e protease, sendo que a celulase e xilanase clivam ligações B-1,4 e a celulase compreende endoglucanase, celobioidrolase e β-glucosidase. O processo de acordo com a invenção pode compreender cultivar qualquer hospedeiro de Chrysosporium de acordo com a invenção compreendendo ácido nucléico que codifica tais enzimas previamente mencionadas. Adequadamente, a produção de hospedeiros de Chrysosporium não-recombinantes de acordo com a invenção é dirigida para a produção de enzimas degradadoras de carboidrato, hidrolases e proteases. Num caso destes a enzima é, adequadamente, diferente de uma celulase. Exemplos adequados de produtos a serem produzidos são dados nas Tabelas A e B. Os processos de isolamento são análogos àqueles descritos no WO 98/15633 e são incorporados aqui por referência.

As enzimas produzidas por cepas de Chrysosporium de acordo com a invenção também são abrangidas pela invenção. As enzimas de origem de Chrysosporium como as que podem ser isoladas de cepas não-recombinantes de Chrysosporium de acordo com a invenção também são abrangidas. Elas apresentam as características de estabilidade e atividade previamente indicadas. Adequadamente, elas são estáveis na presença de LAS. Em particular, proteases com pi de 4-9,5, proteases com um MW de 25-95 kD, xilanases com pi entre 4,0 e 9,5, xilanases com MW entre 25 e 65 kD, endoglucanases com um pi entre 3,5 e 6,5, endoglucanases com MW de 25-55 kDa, β-glucosidases, α,β-galactosidases com um pi de 4-4,5, β-glucosidases, α,β-galactosidases com um MW de 45-50 kDa, celobioidrolases com pi de 4-5, celobioidrolases com MW 45-60 kDa, p. ex. um MW de 55 kD e pi de 4,4, poligalacturonases, com um pi de 4,0-5,0 poligalacturonase de 60-70 kDa, p. ex. 65 kDa, esterases com um pi de 4-5, e esterases com um MW de 95-105 kDa com as características de estabilidade e atividade indicadas acima são reivindicadas.

Os pesos moleculares (MW: molecular weights) são aquelas determinadas por SDS-PAGE. A enzima não-recombinante, i.e. não ocorrente nativamente é diferente de celulase como descrito no WO 98/15633. Uma enzima como descrita no WO 98/15633 é excluída. As enzimas de acordo com a invenção são representadas pelas enzimas da Tabela B. As enzimas com combinações dos valores de pi e pesos moleculares indicados acima também são abrangidas. A invenção também se refere à (super)produção de produtos não-protéicos pelas cepas mutantes (recombinantes) da invenção. Tais produtos não-protéicos incluem metabólitos primários, como ácidos orgânicos, aminoácidos, e secundários, como antibióticos, p. ex. penicilinas e cefalosporinas. Estes produtos são o resultado de combinações de caminhos bioquímicos envolvendo vários genes fungicos de interesse. Os metabólitos primários e secundários e procedimentos para a produção destes metabólitos em organismos fungicos são bem conhecidos na arte. Exemplos da produção de metabólitos primários foram descritos por Mattey M., “The Production of Organic Acids”, Current Reviews in Biotechnology, 12, 87-132(1992). Exemplos da produção de metabólitos secundários foram descritos por Penalva et al. “The Optimization of Penicillin Biosynthesis in Fungi”, Trends in Biotechnology 16, 483-489 (1998).

EXEMPLOS

EXEMPLOS DE DETERMINAÇÃO DE BIOMASSA E VISCOSIDADE

As faixas de dados de parâmetros de operação a seguir foram determinadas para fermentações fungicas utilizando-se três diferentes organismos fungicos. Os três organismos fúngicos comparados são: Trichoderma longibrachiatum (anteriormente T. reesei), Aspergillus niger e Chrysosporium lucknowense (EÍV18-25).

Viscosidade: A viscosidade é determinada com um viscosímetro Brookfield LVF utilizando-se o adaptador para amostra pequena e fuso número 31.

Ligar a bomba circuladora de água 5 minutos antes do uso do viscosímetro para equilibrar a camisa de água. A temperatura do banho de água deveria ser de 30°C.

Obter uma amostra fresca de brodo de fermentação e colocar 10 ml do brodo no fuso de amostra pequena. Selecionar a velocidade do fuso dando uma leitura na faixa de 10-80. Esperar durante quatro (4) minutos e efetuar a leitura da escala do viscosímetro. Multiplicar a leitura pelo fator dado abaixo para se obter a viscosidade em centipoise (cP).

Velocidade do fuso Fator de multiplicação 6 50 12 25 30 10 35 60 As faixas de viscosidade a seguir foram determinadas para fermentações utilizando o organismo fúngico especificado e empregando o procedimento acima: Viscosidade em cP T. longibrachiatum 200-600 A niger 1.500-2.000 C. lucknowense (UV18-25) LT 10 Biomassa: A biomassa é determinada através do seguinte procedimento: Pesar previamente 5,5 cm de filtro de papel (Whatman 54) em um disco de pesagem de alumínio.

Filtrar 5,0 ml de brodo integral através de 5,5 cm de papel num funil de Buchner, lavar a torta de filtração com 10 ml de água desionizada, colocar a torta de filtração e filtrar numa panela de pesagem e secar de um dia para o outro a 60°C. Terminar a secagem a 100°C para 1 hora, depois colocar num dissecador para resfriar.

Medir o peso do material secado. A biomassa total (g/1) é igual à diferença entre os pesos inicial e final multiplicada por 200.

As faixas de biomassa a seguir foram determinadas para fermentações utilizando o organismo fúngico especificado empregando o procedimento acima: Biomassa em g/1 T. longibrachiatum 2,5-5 A niger 5-10 C. lucknowense (UV 18-25) 0,5-1 Proteína: Os níveis de proteína foram determinados utilizando-se o Procedimento de Análise BioRad da firma Sigma Company. Os níveis de proteína foram os mais altos para o Chrysosporium.

Os dados apresentados acima representam valores determinados 48 horas no processo de fermentação até o final da fermentação; todos os valores de Aspergilli e Trichoderma são para organismos fúngicos comercialmente relevantes e refletem dados comerciais efetivos.

Uma cepa fúngica, como C. lucknowense (UV18-25), tem a vantagem de que a baixa viscosidade permite o uso de menor aporte de potência e/ou cisalhamento [do que] na fermentação para atender à demanda de oxigênio, para aqueles casos em que o esforço de cisalhamento sobre o produto pode ser prejudicial para a produtividade devido ao dano físico da molécula de produto. A menor produção de biomassa com alta produção de proteína indica um organismo mais eficiente na conversão de meio de fermentação a produto. Assim, o Chrysosporium proporciona melhores dados de biomassa e viscosidade ao mesmo tempo que fornece pelo menos tanta proteína, e, efetivamente, bastante mais proteína, do que os dois sistemas usados comercialmente que, obviamente, são melhores, do que para cepas de Aspergillus ou Trichoderma tipicamente depositadas em coleções públicas gerais. A alta produção de proteína com baixa concentração de biomassa produzida por C. lucknowense (UV18-25) poderia permitir o desenvolvimento de condições de fermentação com múltiplos maiores de incremento de biomassa, caso o aumento de biomassa resulte em maior produtividade, para o produto desejado antes de se atingir condições de fermentação limitantes. Os presentes altos níveis de biomassa e de viscosidade produzidos pelos organismos T. longibrachiatum e A niger restringem o aumento de biomassa à medida que os presentes níveis de biomassa e viscosidade se encontram próximos de condições limitantes de fermentação prática.

Exemplos de transformação comparando Chrysosporium, Trichoderma e Tolypocladium geodes As duas cepas não-transformadas de Chrysosporium Cie uma cepa de referência de Trichoderma reesei foram testadas em dois meios (Gs pH 6,8 e agar Pridham, PA, pH 6,8). Para se testar o nível de resistência a antibióticos os esporos foram coletados de placas PDA com 7 dias de cultivo. Placas seletivas foram incubadas a 32°C e avaliadas após 2, 4 e 5 dias. Resultou que as cepas C-l NG7C-19 e UV18-25 apresentam claramente um baixo nível de resistência basal tanto relativamente à fleomicina como à higromicina. Este nível é comparável àquele para uma cepa de T. reesei de referência comumente utilizada em laboratório. Assim, há uma clara indicação de que estes dois marcadores fungicos selecionáveis podem ser bem usados em cepas de Chrysosporium. Não se deveria esperar problemas com outros marcadores fungicos selecionáveis. A seleção de cepas de Chrysosporium transformadas com Sh-ble (resistência à fleomicina) foi realizada com sucesso a 50 pg/ml. Este também foi o nível de seleção usado para T. reesei, mostrando assim que a seleção diferencial pode ser facilmente obtida em Chrysosporium. Os mesmos comentários são válidos para cepas transformadas com resistência à higromicina num nível de 150 pg/ml. A técnica de transformação de protoplasta foi utilizada em Chrysosporium baseada na tecnologia de transferência fúngica mais geralmente aplicada. Todos os esporos de uma placa PDA de 90 mm foram recuperados em 8 ml de IC1 e transferidas para um frasco de agitação de 50 ml com meio IC1 para incubação durante 15 horas a 35°C e 200 rpm. Depois disto, a cultura foi centrifugada, o pellet foi lavado em MnP, novamente dissolvida em 10 ml de MnP e 10 mg/ml de Caylase C3 e incubada durante 30 minutos a 35°C com agitação (150 rpm). A solução foi filtrada e o filtrado foi submetido a centrifugação durante 10 minutos a 3500 rpm. O pellet foi lavado com 10 ml de MnPCa2+. Isto foi centrifugado durante 10 minutos a 25°C. Em seguida, adicionou-se 50 microlitros de MPC frio. A mistura foi mantida sobre gelo durante 30 minutos após o que adicionou-se 2,5 ml de PMC. Após 15 minutos à temperatura ambiente 500 microlitros dos protoplastas tratados foram misturados com 3 ml de MnR Soft e imediatamente plaqueados numa placa MnR contendo fleomicina ou higromicina como agente de seleção. Após incubação durante cinco dias a 30°C analisou-se transformantes (clones tomam-se visíveis após 48 horas). A eficiência de transformação foi determinada utilizando-se 10 microgramas de plasmídeo de referência pAN8-l19. Os resultados são apresentados na Tabela D a seguir.

Os resultados mostram que a viabilidade dos transformardes de Chrysosporium é superior àquele de Trichoderma. A transformabilidade das cepas é comparável e, assim, o número de transformantes obtidos em um experimento é 4 vezes maior para Chrysosporium do que para T. reesei. Assim, o sistema de transformação de Chrysosporium não só se equipara ao sistema de T. reesei comumente utilizado, mas até mesmo o supera. Este aperfeiçoamento pode provar ser especialmente útil para vetores que apresentam menor eficiência de transformação do que pAN8-l. Exemplos desse tipo de vetores de transformação menos eficientes são vetores de transporte de proteínas para a produção de proteínas não-füngicas que geralmente proporcionam 10 vezes menos transformantes.

Diversos outros vetores de transformação e expressão foram construídos com seqüências codificantes homólogas de proteína de Chrysosporium e também com seqüências heterólogas codificando proteína para uso em experimentos de transformação com Chrysosporium. Os mapas de vetores são proporcionados nas figuras 6-11. A proteína homóloga a ser expressa foi selecionada do grupo de celulases produzidas por Chrysosporium e consistia de endoglucanase 6 que pertence à família 6 (MW de 43 kDa) e a proteína heteróloga era a endoglucanase 3 que pertence à família 12 (MW de 25 kDa) de Penicillium. pF6g compreende fragmento de promotor de endoglucanase 6 de Chrysosporium ligado a seqüência-sinal de endoglucanase 6 em matriz com a matriz de leitura aberta de endoglucanase 6 seguido da seqüência terminadora de endoglucanase 6. A seleção de transformantes é realizada empregando-se cotransformação com um vetor selecionável. pUT1150 compreende promotor de celobioidrolase de Trichoderma reesei ligado à seqüência-sinal de endoglucanase 6 em matriz com a matriz de leitura aberta de endoglucanase 6, seguido de seqüência terminadora de celobioidrolase de T. reesei. Adicionalmente, este vetor porta uma segunda cassete de expressão com um marcador selecionável, i.e., o gene de resistência à íleomicina (gene Sh-ble). pUT1152 compreende promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase A de Aspergillus nidulans ligado à seqüência-sinal de endoglucanase 6 em matriz com a matriz de leitura aberta de endoglucanase 6, seguido de seqüência terminadora de antranilato sintase (trpC) de A nidulans. Adicionalmente, este vetor porta uma segunda cassete de expressão com um marcador selecionável, i.e. o gene de resistência à fleomicina (gene Sh-ble). pUT1155 compreende promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase A de A nidulans ligado à seqüência-sinal de celobioidrolase de Trichoderma reesei em matriz com a proteína-veículo Sh-ble que, por sua vez, é ligada na matriz à matriz de leitura aberta de endoglucanase 6, seguido da seqüência terminadora trpC de A nidulans. Este vetor utiliza a tecnologia da proteína-veículo fusionada à proteína de interesse que é conhecida por melhorar muito a secreção da proteína de interesse. pUTllóO compreende promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase A de Aspergillus nidulans ligado à seqüência-sinal de celobioidrolase de Trichoderma reesei em matriz com a proteína-veículo Sh-ble que, por sua vez, é ligada na matriz à matriz de leitura aberta de endoglucanase 3 de Penicillium seguido da seqüência terminadora trpC de A nidulans. pUT1162 compreende promotor de celobioidrolase de Trichoderma reesei ligado à seqüência-sinal de endoglucanase 3 em matriz com a matriz de leitura aberta de endoglucanase 3 de Penicillium, seguido da seqüência terminadora de celobioidrolase de T. reesei. Adicionalmente, este vetor porta uma segunda cassete de expressão com um marcador selecionável, i.e. o gene de resistência à fleomicina (gene Sh-ble). A Tabela E apresenta os resultados de transformação de ambos, Chrysosporium UV18-25 e Tolypocladium geodes. O protocolo de transformação utilizado é descrito na seção de transformação heteróloga. Exemplos de expressão heteróloga e homóloga de transformantes de ......Ά...........JL................W.............«hí ‘.......................

Chrysosporium Cepas Cl (NG7C-19 e/ou UV18-25) foram testadas quanto à sua capacidade de secretar diversas proteínas heterólogas: uma proteína bacteriana (proteína resistente à fleomicina Streptoalloteichus hindustanus, Sh ble), uma proteína fúngica (xilanase II de Trichoderma reesei, XYN2) e uma proteína humana (a lisozima humana, HLZ).

Os detalhes dos processos são os seguintes: [1] secreção Cl de proteína de resistência à fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus (Sh ble).

As cepas Cl NG7C-19 e UV 18-25 foram transformadas pelo plasmídeo PUT7201. Este vetor apresenta a seguinte cassete de expressão fúngica: promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase A (gpdA) de Aspergillus nidulans 2 uma seqüência-sinal de celobioidrolase I sintética de Trichoderma reesei (cbhl) 1,3 gene de resistência à fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh ble 4 terminador de triptofano-sintase (trpC) de Aspergillus nidulans 5 O vetor também porta o gene de beta-lactamase (bla) e origem de replicação de E. coli de plasmídeo pUC18 6. O mapa detalhado de plasmídeo é oferecido na figura 2.

Protoplastas C1 foram transformados de acordo com Durand et al. 7 adaptados a Cl (a composição dos meios e soluções é dada alhures): Todos os esporos de uma placa PDA de 90 mm de cepa Cl não-transformada foram recuperados em 8 ml de IC1 e transferidos para um frasco de agitação com 50 ml de meio IC1 para uma incubação de 15 horas a 35°C e 150 rpm. Em seguida, a cultura foi centrifugada, o pellet foi lavado em MnP, dissolvida em 10 ml de MnP +10 mg/ml de Caylase C3, e incubada durante 30 min. a 35°C com agitação (150 rpm). A solução foi filtrada e o filtrado foi centrifugado durante 10 min. a 3500 rpm. O pellet foi lavado com 10 ml de MnPCa2+. Isto foi centrifugado durante 10 min. a 3500 rpm e o pellet foi recolhido em 1 ml de MnPCa2+. Adicionou-se 10 pg de DNA de pUT720 a 200 μΐ de solução de protoplasta e incubou-se durante 10 min. à temperatura ambiente (~20°C). Em seguida, adicionou-se 50 μΐ de MPC frio. A mistura foi mantida sobre gelo durante 30 min., após o que se adicionou 2,5 ml de PMC. Após 15 min à temperatura ambiente, 500 μΐ dos protoplastas tratados foram misturados a 3 ml of MnR Soft e imediatamente plaqueados numa placa MnR contendo fleomicina (50 pg/ml a pH 6,5) como agente de seleção. Após 5 dias de incubação a 30°C, os transformantes foram analisados (os clones começam a ser visíveis após 48 horas). A produção de Sh ble de transformantes Cl (clones resistentes à fleomicina) foi analisada como a seguir: Os transformantes primários foram espetados sobre placas de GS+fleomicina (5 pg/ml) e desenvolvidos durante 5 dias a 32°C para verificação da resistência. Cada clone resistente validado foi subclonado sobre placas GS. Utilizou-se dois subclones por transformante para inocular placas PDA de modo a se obter esporos para a iniciação de cultura líquida. As culturas líquidas em IC1 foram desenvolvidas durante 5 dias a 27°C (agitando a 200 rpm). Em seguida, as culturas foram centrifugadas (5000 g, 10 min.) e recolheu-se 500 μΐ de sobrenadante. A partir destas amostras, as proteínas foram precipitadas com TCA e ressuspensas em Tamponador de Amostra Western até 4 mg/ml de proteínas totais (Processo de Lowry 8). 10 μΐ (cerca de 40 pg das proteínas totais) foram carregados sobre um gel de 12 % de acrilamida/SDS e processados (sistema BioRad Mini Trans-Blot). O manchamento Western foi conduzido de acordo com as instruções da BioRad (Schleicher & Schull, membrana de 0,2 μιη) utilizando antissoro anti-Sh ble de coelho (Cayla, referência de catálogo #ANTI-0010) como anticorpo primário.

Os resultados são apresentados na Figura 1 e na Tabela F: Estes dados mostram que: 1) Os sinais de transcrição/tradução heterólogos de pUT720 são funcionais em Chrysosporium. 2) A seqüêneia-sinal heteróloga de pUT720 é funcional em Chrysosporium. 3) O Chrysosporium pode ser usado como um hospedeiro para a secreção de uma proteína bacteriana heteróloga. Γ21 Secreção de Cl da lisozima humana (HLZ).

Cepas Cl de NG7C-19 e UV18-25 foram transformadas pelo plasmídeo pUT970G 9. Este vetor apresenta a seguinte cassete de expressão fúngica: promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase A (gpdA) de Aspergillus nidulans 2 uma seqüência-sinal de celobioidrolase I sintética de Trichoderma reesei (cbhl) 1,3 gene de resistência à fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh ble 4 usado como proteína-veículo 10 domínio hinge [dobradiça] de glucoamidase (glaA2) de Aspergillus niger clonado do plasmídeo pAN56-2 11,12 um peptídeo ligante (LGERK) apresentando um sítio de clivagem de protease semelhante a KEX2 1 um gene de lisozima humana sintética (hlz)10 terminador de triptofano-sintase (trpC) de Aspergillus nidulans 5 O vetor também porta o gene de beta-lactamase (bla) e origem de replicação de E. coli de plasmídeo pUC 186. O mapa detalhado do plasmídeo é oferecido na figura 3.

Protoplastas Cl foram transformados com o plasmídeo pUT970G seguindo-se o mesmo procedimento já descrito no Exemplo 1. A proteína de fusão (Sh ble :: GAM hinge:: HLZ) é funcional com respeito ao gene de resistência à fleomicina, permitindo assim a fácil seleção dos transformantes Cl. Além disso, o nível de resistência à fleomicina correlaciona-se grosseiramente com o nível de expressão de hlz. A produção com HLZ de transformantes Cl (clones resistentes à fleomicina) foi analisada com análise de atividade de lisozima como a seguir: Transformantes primários foram espetados sobre placas de GS+fleomicina (5 pg/ml) (verificação de resistência) e também sobre placas LYSO (detecção de atividade de HLZ por meio de visualização de zona de clareamento 110). As placas foram desenvolvidas durante 5 dias a 32°C. Cada clone liofilizado foi subclonado sobre placas LYSO. Utilizou-se dois subclones por transformante para inocular placas PDA com o fim de se obter esporos para a iniciação de cultura líquida. As culturas líquidas em IC1 foram desenvolvidas 5 dias a 27°C (agitação a 180 rpm). Em seguida, as culturas foram centrifugadas (5000 g, 10 min.). Mediu-se a atividade de lisozima destas amostras de acordo com Mõrsky et al.13 Estes dados mostram que: 1) Os pontos 1 & 2 do Exemplo estão confirmados. 2) Sh ble é funcional em Chrysosporium como marcador de resistência. 3) Sh ble é funcional em Chrysosporium como proteína- veículo. 4) O sítio de clivagem de protease semelhante a KEX2 é funcional em Chrysosporium (de outra forma a E1LZ não seria ativa). 5) O Chrysosporium pode ser usado como hospedeiro para a secreção de proteína mamífera heteróloga.

[3] Secreção de Cl de xilanase II (XYN2) de Trichoderma reesei.

Cepa UV18-25 de Cl foi transformada pelos plasmídeos pUT1064 e pUT1065. pUT1064 apresenta as seguintes cassetes de expressão fúngica: A primeira cassete permite a seleção de transformardes resistentes à fleomicina: promotor do gene de controle de caminho cruzado (cpc-1) [Cross-Pathway Control] deNeurospora crassa 14 gene Sh ble de resistência à fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus 4 terminador de triptofano-sintase de Aspergillus nidulans (trpC)5 A segunda cassete é a cassete de produção de xilanase: promotor cbhl de cepa TR2 de T. reesei 15 gene xyn2 de cepa TR2 de T. reesei (incluindo sua seqüência-sinal) 16 terminador cbhl de cepa TR2 de T. reesei 15 O vetor também porta uma origem de replicação de E. coli do plasmídeo pUC19 6. O mapa detalhado de plasmídeo é oferecido na figura 4. pUT1065 apresenta a seguinte cassete de expressão fúngica: promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpdA) de A nidulans 2 seqüência-sinal de celobioidrolase I (cbhl) de T. reesei sintética 1,3 gene Sh ble 4 de resistência à fleomicina de S. hindustans utilizado como uma proteína-veículo 10 um peptídeo de ligação (SGERK) apresentando uma sítio de clivagem de protease semelhante a KEX2 1 gene xyn2 da cepa TR2 de T. reesei (sem seqüência-sinal) 16 terminador de triptofano-sintase (trpC) de A nidulans 5 O vetor também porta o gene de beta-lactamase (bla) e uma origem de replicação de E. coli do plasmídeo pUC186. O mapa detalhado de plasmídeo é oferecido na figura 5.

Protoplastas Cl foram transformados com o plasmídeo pUT1064 ou pUT1065 seguindo-se o mesmo procedimento já descrito no exemplo 1. A proteína de fusão no plasmídeo pUT1065 (Sh ble :: XYN2) é funcional com respeito à resistência à fleomicina, permitindo, desta forma, a fácil seleção dos transformantes Cl. Além disso, o nível de resistência à fleomicina correlaciona-se grosseiramente com o nível de expressão de xyn2. No pUT1064, xyn2 foi clonado com sua própria seqüência-sinal. A produção pela xilanase de transformantes Cl (clones resistentes à fleomicina) foi analisada através de atividade de xilanase como a seguir: Transformantes primários foram espetados sobre placas de GS+fleomicina (5 pg/ml) (verificação de resistência) e também sobre placas XYLAN (detecção de atividade de xilanase através de visualização de zona de clareamento 17). As placas foram desenvolvidas durante 5 dias a 32°C. Cada clone visualizado foi subclonado sobre placas XYLAN. Utilizou-se dois subclones por transformante para inocular placas PDA com o fim de se obter esporos para a miciaçao de cultura liquida. A.s culturas liquidas em 1C1 ~t~ 5g/l Kftalato foram desenvolvidas durante 5 dias a 27°C (agitação a 180 rpm). Em seguida, as culturas foram centrifugadas (5000 g, 10 min.). Mediu-se a atividade de xilanase destas amostras com a Técnica DNS de acordo com Miller et a 1.18 Estes dados mostram que: 1) Pontos de 1 a 4 da amostra 2 são confirmados. 2) Pode-se utilizar Cl como hospedeiro para a secreção de uma proteína fungica heteróloga.

[4] Nós também ilustramos dados da expressão de UV18-25 transformado em que a tabela I mostra os resultados para os plasmídeos com os quais a transformação foi realizada. A Tabela mostra bons níveis de expressão para endoglucanase e celobioidrolase utilizando-se seqüências-sinal e seqüências reguladoras de expressão heterólogas, mas também com seqüências-sinal e seqüências reguladoras de expressão homólogas. Os detalhes dos vários plasmídeos podem ser derivados de alhures na descrição e das figuras. A produção ocorre a um pH alcalino a uma temperatura de 35°C.

Condições de cultivo (frasco de agitação): 88 h, 35°C, 230 rpm * todos os valores acima encontram-se em % relativo com a cepa parental UV18-25 Apêndice aos Exemplos: Meios Meios de transformação: Base de Mandeis: meio MnP: KH2PO4 2,0 g/1 base de Mandeis com (NH4)2S04 Mg/l peptona 1 g/1 MgS04.7H20 0,3g/l MES 2g/l CaCE 0,3 g/1 sucrose 100 g/1 oligoelementos 1,0 ml/1 ajustar pH em 5 MnR MnP CA2': MnP+sucrose 130 g/1 meio MnP + extrato de levedura 2,5 g/1 CaCb 2H2O 50 mM glucose 2,5 g/1 ajustar pH em 6,5 agar 15 g/1 MnR Soft: MnR com apenas 7,5 g/1 de agar MPC: CaCb 50 mM pH 5,8 MOPS 10 mM PEG 40 % Para seleção e cultivo GS: glucose 10 g/1 biosojase 5 g/1 [Merieux] agar 15 g/1 pH deveria ser 6,8 PDA: agar de dextrose de batata 39 g/1 [Difco] pH deveria ser 5,5 MPG: base de Mandeis com K.Ftalato 5 g/1 glucose 30 g/1 extrato de levedura 5 g/1 O meio de regeneração (MnR: regeneration media) suplementado com 50 pg/ml de fleomicina ou 100-150 pg/ml de higromicina é utilizado para selecionar transformantes. Utiliza-se meio GS, suplementado com 5 pg/ml de fleomicina para confirmar resistência a antibiótico. PDA é um meio completo para desenvolvimento rápido e boa esporulação. Os meios líquidos são inoculados com 1/20 de suspensão de esporos (todos os esporos de uma placa PDA de 90 mm em 5 ml de Tween a 0,1 %). Essas culturas são desenvolvidas a 27°C em frascos de agitação (200 rpm).

Isolamento e caracterização de proteínas Cl O processo para se obter diversas proteínas é descrito como uma quantidade de características das proteínas. As tabelas A, B e J proporcionam detalhes de esquema de purificação e atividades. O isolamento ocorre do filtrado de cultura de Chrysosporium utilizando-se cromatografia de troca de íons DEAF-Toyopearl analogamente ao processo descrito no WO 98/15633, incorporado aqui por referência. A fração não-ligada (F 60-31 CF) obtida desta cromatografia foi purificada com o uso de cromatografia de troca de íons Macro Prep Q após equilibração em pH 7,6. A fração não-ligada (NBNB) foi combinada e as proteínas ligadas foram eluídas em gradiente de NaCl 0-1 Μ. A fração de NBNB proporcionou bandas de proteínas importantes com 19, 30, 35 e 46 kD e uma menos importante com 51 kD. Em gradiente de NaCl 0-1 M picos de proteína foram eludidos de diversas frações. 39-41 incluíram proteínas com 28, 36 e 60 kD, 44-48 incluíram, 28, 45 e 66 kD como bandas de proteínas importantes com proteínas com 33, 36, 55, 60 e 67 kD, a fração 49-51 deu proteínas com 30, 36, 56 e 68 kD e a fração 52-59 incluiu proteínas importantes com 33 e 55 kD e proteínas menos importantes com 28 e 36 kD. A fração combinada de NBNB foi ainda mais purificada por meio de cromatografia hidrofóbica sobre Phenyl Superose. A fração de NBNB foi equilibrada com tamponador de fosfato-Na 0,03M, pH 7,0, contendo (NFL^SCfi 1,2 M e aplicada numa coluna. As proteínas adsorvidas foram eluídas em gradiente de (NH4)2S04 1,2-0,6 M. Assim, obteve-se xilanase homogênea com MW 30 e 51 kD e pi 9,1 e 8,7, respectivamente, como o foi uma protease de 30 kD com pi 8,9.

As xilanases não apresentaram atividade de celobioidrolase MUF e são, portanto, xilanases autênticas. A xilanase alcalina de 30 kD (pi 9,1) apresentou alta atividade dentro de uma faixa de pH muito ampla, de 5-8, mantendo 65 % de atividade máxima a pH 9-10; é um membro da família de xilanases F; suas seqüências parciais de nucleotídeos e aminoácidos são representadas na SEQ ID No. 5. A seqüência parcial de aminoácidos representada corresponde a aproximadamente os aminoácidos 50-170 da ponta N da proteína madura. As xilanases de acordo com a invenção apresentam pelo menos 60 %, de preferência pelo menos 70 %, sendo o mais preferível pelo menos 80 % de identidade de seqüência relativamente à seqüência parcial de aminoácidos da SEQ ID No. 5. O promotor de xilanase correspondente, que é uma concretização preferida da invenção, pode ser identificado utilizando-se a seqüência parcial de nucleotídeo de SEQ ID No. 5. A xilanase de 51 kD (pi 8,7) apresentou atividade máxima a pH 6 e conservou pelo menos 70 % de sua atividade a pH 7,5 e conservou pelo menos 50 % de sua atividade a pH 8,0. Ela não foi muito estável com apenas 15 % de atividade a pH 5,5 e 4 % a pH 7,5. A constante de Michaelis relativamente a xilano de bétula foi de 4,2 g/1 para xilanase de 30 kD e 3,4 g/1 para xilanase de 51 kD. O ótimo de temperatura foi elevado e igual a 70°C para ambas as xilanases. A atividade de protease com 30 kD medida relativamente a proteínas da fração NBNB pareceu ser igual a 0,4 x 10-3 unidades/ml a 50°C e pH 7, 90 kD. A fração apresentou uma atividade, relativamente à caseína tingida, de 0,4 unidades arbitrárias/mg (pFÍ 7). A adição de uréia como agente caotrópico resultou num aumento de 2-3 vezes da atividade de protease. O efeito da protease sobre a atividade de xilanase foi significativa. Permaneceram apenas 30 % de atividade de xilanase a pH 10,3 e 50°C após 30 minutos de incubação. A pH 8, permaneceram 95 % da atividade de xilanase. A adição de LAS resultou num aumento dramático da atividade de xilanase a pH 8 e 10,3 com apenas 50 % de atividade de xilanase após 10 minutos de incubação com ou sem inibidor de protease PMSF. A protease de 30 kD foi alcalina com pH ótimo a pH 10-11. A atividade é inibida com fluoreto de fenilmetlisulfonila (PMSF) e não com o ácido iodoacético, pepstaina A e EDTA que a caracteriza como uma protease tipo serina. A protease não é ativa relativamente a proteínas Cl a pH neutro e 50°C sem agentes caotrópicos. O aumento de pH e a adição de agentes caotrópicos, como LAS, SDS e uréia aumentaram significativamente a proteólise. A fração 39-41 foi purificada por meio de cromatografia hidrofóbica sobre plenol superose. As frações foram equilibradas com tamponador de fosfato Na 0,03M, pH 7,2, contendo (NFL^SCfi 1,5 M e aplicadas numa coluna. As proteínas adsorvidas foram eluídas em gradiente de (NH4)2S04 1,5-0 M. Desta forma, obteve-se xilanase homogênea com MW de 60 kD e pi 4,7. Esta xilanase apresentou atividades relativamente a xilano, MUF-celobiosídeo, MUF-xilosídeo e MUF-lactosídeo. Esta xilanase pertence provavelmente à família 10 (família F). Esta xilanase foi estável a pH de 5 a 8 durante 24 horas e conservou mais de 80 % de atividade a 50°C. Ela conservou 70 % de atividade a pH 5-7 a 60°C. Manteve 80 % de atividade durante 5 horas e 35 % durante 24 horas a 50°C e pH 9. A pH 10, conservou-se 60 % de atividade a 50°C e 0,5 hora de incubação. Após 5 horas de incubação a pH 8 e a 60°C, verificou-se que 45 % de atividade diminuem até 0, após 24 horas. Apresentou um pFÍ ótimo dentro da faixa de pH de 6-7 e conservou 70 % de atividade a pH 9 e 50 % de atividade a pH 9,5. A constante de Michaelis relativamente ao xilano de bétula foi de 0,5 g/1. A temperatura ótima foi alta e igual a 80°C. A fração 44-48 foi então purificada por cromato-enfoque sobre Mono P. Utilizou-se um gradiente de pH de 7,63-5,96 para a eluição das proteínas. Como um resultado, isolou-se endoglucanase com 45 kD, com um pi de 6. A endo com 45 kD apresentou uma atividade a pH 5 relativamente a CMC e a um pH 5-7 relativamente a RBB-CMC. A endo com 45 kD conservou 70 % desta atividade máxima relativamente a CMC a ρΗ 6,5 e 70 % de sua atividade máxima relativamente a RBB-CMC foi conservada a pH 7,0; 50 % de sua atividade máxima relativamente a CMC foi conservada a pH 7 e 50 % de sua atividade máxima relativamente a RBB-CMC foi conservada a pH 8. A constante de Michaelis relativamente a CMC foi de 4,8 g/1. A temperatura ótima foi alta e igual a 80°C. Outras proteínas 28, 33, 36, 55, 60 e 66 kD foram eluídas misturadas entre si. A fração 52-58 foi purificada por cromato-enfoque sobre Mono P também com um gradiente de pH de 7,6-4,5. Obteve-se endoglucanase individual com 55 kD com pi 4,9. A endo com 55 kD foi neutra. Apresentou um pH amplo ótimo de 4,5-6 e 70 % de atividade foram consertados a pH 7,0 tanto para CMC como para RBB-CMC e 50 % de atividade foram conservados a pH 8 tanto para CMC como para RBB-CMC. A constante de Michaelis relativamente a CMC foi de 1 g/1. A temperatura ótima foi alta e igual a 80°C. Uma quantidade de frações também conservou proteínas com MW de28,33e36 kD.

Proteínas com 45, 48 e 100 kD foram isoladas de fração ligada de DEAE Toyopearl de F 60-8 UF cone. de cultura de Chrysosporium das frações 50-53 utilizando cromatografia Macro Prep Q. A fração 50-53 foi equilibrada com tamponador de HC1 imidazol 0,03 M, pH 5,75 e foi aplicada numa coluna e as proteínas adsorvidas foram eluídas em gradiente de NaCl 0,1-0,25 M durante 4 h. Como um resultado, isolou-se proteínas com 45 kD (pi 4,2), 48 kD (pi 4,4) e 100 kD (pi 4,5) em estados homogêneos (figura 17). A 45 kD é supostamente uma alfa beta-galactosidase em virtude de sua atividade relativamente a p-nitrofenil alfa-galactosídeo e p-nitrofenil beta-galactosídeo. O pH ótimo foi de 4,5, 70 % da atividade foram mantidos a pH 5,7 e 50 % de sua atividade foram retidos a pH 6,8. A temperatura ótima foi de 60°C (figura 18). A proteína de 48 kD era uma celobioidrolase com alta atividade relativamente a p-nitrofenil beta-glucosídeo e também atividades relativamente a celobiosídeo de MUF, lactosídeo de MUF e butirato de p-nitrofenila. A proteína de 48 kD apresentou um pH ótimo de 5 relativamente a CMC e 5-6 relativamente a RBB-CMC (figura 19). A proteína de 100 kD com pi 4,5 apresentou atividade apenas relativamente ao butirato de p-nitrofenila. É provavelmente uma esterase, porém não é uma feruloil esterase porque não possuía atividade contra metil éster de ácido ferúlico. Apresentou uma pH neutro/alcalino ótimo (pH 8-9) e uma temperatura ótima de 55-60°C (figuras 20, 21). A protease de 90 kD com pi 4,2 foi isolada da fração ligada e a atividade medida relativamente a proteínas da fração NBNB pareceu ser igual a 12 x 10-3 unidades/ml a 50°C e pH 7, 90 kD. A fração apresentou atividade, relativamente a caseína tingida, de 0,01 unidades arbitrárias/mg (pH 7). A adição de uréia como agente caotrópico resultou num aumento de 2-3 vezes de atividade de protease como o fez a adição de LAS tanto a pFÍ 7 como a 9 (50°C). A protease de 90 kD foi neutra com um pH ótimo em pH 8. A atividade é inibida com fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e não por ácido iodoacético, pepstatina A e EDTA que a caracteriza como uma protease tipo serina.

Isolou-se também da fração ligada endoglucanase de 43 kD com pi 4,2 (fração 33-37) e endoglucanase de 25 kD com pi 4,1 (fração 39-43), celobioidrolase de 55 kD com pi 4,9 (fração 39-43) e poligalactouronase de 65 kD com pi 4,4 (fração 39-43). As endoglucanases não apresentaram atividade relativamente a avicel ou celobioidrolase de MUF e apresentou alta atividade relativamente a MC, RBB-CMC, CMC41, beta-glucano e endoglucanase. A endoglucanase com 25 kD não produz glucose de CMC e o endo com 43 kD o fez. Não se formou glucose a partir de avicel. O pH ótimo para a proteína com 43 kD foi de 4,5 com 70 % de atividade máxima mantida a pH 7,2 e 50 % a pH 8. A endo com 43 kD manteve 70 % de atividade a pH 5 e 6 durante 25 horas de incubação. Manteve apenas 10 % a pH 7 durante este período de incubação. A endo com 25 kD apresentou um pH ótimo de atividade a pH 5 relativamente a CMC e amplo pH ótimo de atividade relativamente a RBB-CMC com 70 % da atividade máxima sendo mantida a pH 9 e com 50 % da atividade máxima ocorrendo a pH 10. Manteve-se 100 % de atividade a pH 5 e 6, e 80 % a pH 7,8, 8,6 e 9,6 durante 120 horas de incubação. A endo com 25 kD tinha uma temperatura ótima de atividade a 70°C. A endo com 43 kD apresentou uma temperatura ótima de atividade a 60°C. As constantes de Michaelis relativamente a CMC foram de 62 e 12,7 g/1 para endoglucanase com 25 e 43 kD, respectivamente. A poli-galactouronase é uma pectinase. Uma constante de Michaelis relativamente a PGA foi de 3,8 g/1. O pH ótimo de atividade de PGU encontra-se dentro da faixa de pH de 5-7 e a temperatura ótima encontra-se dentro de 50-65°C.

Genes codificando proteínas de C. lucknowense foram obtidos utilizando-se PCR e caracterizados por meio de análise de seqüência. Os genes plenos correspondentes foram obtidos por meio de seleção de bibliotecas de genes (parcial) utilizando-se os fragmentos isolados de PCR. O gene pleno da endoglucanase com 43 kD (EG6, família 6) da cepa Cl foi clonado, sequenciado e analisado (incluindo a região promotora com 2,5 kb e região terminadora com 0,5 kb). Suas seqüências de nucleotídeos e aminoácidos são representadas na SEQ ID No. 1. O peso molecular predito da proteína madura é de 39,427 Da e pi predito é de 4,53, valores que correspondem bem aos valores medidos. Análise de alinhamento de proteínas com outras glicosil hidrolases da família 6,2 mostra que C1-EG6 não inclui um domínio de ligação de celulose (CBD). Análise de homologia utilizando o programa SwissProt SAMBA (algoritmo Smith & Waterman, Gap penalty 12/2, alinhamento 10, matriz Blosum62) mostra que C1-EG6 apresenta uam identidade de 51,6 % com EG-B de Fusarium oxysporum (mais de 376 aminoácidos), 51,0 % de identidade com CBH3 de Agaricus bisporus (mais de 353 aminoácidos), e 50,7 % de identidade com CBH2 de Trichoderma reesei (mais de 367 aminoácido). A seqüência-sinal putativa abrange de Met 1 a Arg 28. O promotor contém vários sítios potenciais de ligação de CreA, de modo que é muito provável que este promotor estaria sujeito a repressão de glucose numa cepa fúngica com regulação operacional de CreA.

Semelhantemente, o gene pleno da endoglucanase com 25 kD (EG5, família 45) da cepa Cl foi clonado, sequenciado e analisado (incluindo a região promotora com 3,3 kb e a região terminadora com 0,7 kb). As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos são apresentadas na SEQ ID No. 2. O peso molecular predito da proteína madura é de 21.858 Da e o pi predito é de 4,66, valores que correspondem bem aos valores medidos. Esta é a menor endoglucanase fúngica conhecida até hoje. Análise de alinhamento com outras glicosil hidrolases da família 45 mostra que C1-EG5 não inclui um domínio de ligação de celulose (CBD: cellulosebinding domain), nem um domínio coesina/doquerina. Análise de homologia utilizando o programa NCBI-BLASTP2 (Gap penalty 11/1, alinhamento 10, matriz Blosum62) mostra que a proteína homóloga mais próxima a C1-EG5 é EG-K de Fusarium oxysporum com 63 % de identidade. A seqüência-sinal putativa abrange de Met 1 até Ala 18. O promotor contém muitos sítios potenciais de ligação de CreA, de modo que é muito provável que este promotor estaria sujeito a repressão de glucose em uma cepa fúngica com regulação operacional de CreA.

Além disso, uma endoglucanase adicional foi verificada por meio de PCR baseada em análise de homologia de celulases de família 12. A seqüência parcial de nucleotídeos e aminoácidos desta endoglucanase adicional (EG3, família 12) é dada na SEQ ID No: 3. A proteína com 55 kD era uma celobioidrolase (referida aqui como CBH1) com atividade contra celobiosídeo MUF, lactosídeo MUF, FP e avicel, também contra p-nitrofenil β-glucosídeo, celobiose e n-nitrofenil lactosídeo. Sua atividade relativamente ao celobioidrolase de MUF é inibida pela celobiose. A constante de inibição foi determinada em 0,4 mM. A constante de Michaelis relativamente ao celobiosídeo de MUF foi de 0,14 mM, relativamente ao lactosídeo de MUF foi de 4 mM e, relativamente a CMC foi de 3,6 g/1. O pH ótimo é bastante largo, de 4,5 a 7,50 % de atividade máxima relativamente a CMC e 80 % de atividade relativamente a RBB-CMC é mantida a pH 8. Mantém-se 70-80 % de atividade dentro de pH 5-8 durante 25 horas de incubação. A temperatura ótima é de 60-70°C. CBH1 é provavelmente um membro da celobioidrolase família 7; suas seqüências parciais de nucleotídeos e aminoácidos são representadas na SEQ ID No: 4. A seqüência parcial de aminoácidos representada corresponde aos aminoácidos, aproximadamente, 300-450 da ponta N da proteína madura. Uma celobioidrolase de acordo com a invenção apresenta pelo menos 60 %, de preferência pelo menos 70 %, sendo o mais preferível pelo menos 80 % de identidade da seqüência da seqüência parcial de aminoácidos da SEQ ID No: 4. O promotor de CBH correspondente, que é uma concretização preferida da invenção, pode ser identificado utilizando-se a seqüência parcial de nucleotídeos da SEQ ID No: 4. Observou-se um efeito sinérgico entre endo com 25 kD e CBH com 55 kD durante a hidrólise com avicel. O coeficiente de sinergismo foi máximo na proporção de endo com 25 kD para CHB com 55 kD de 80:20. O Ksyn foi de 1,3 em seu máximo.

As Tabelas A, B e J ilustram os detalhes do exposto acima. O nível de expressão de cinco principais genes de Chrysosporium foi estudado com análise Northern. Diversas cepas de C. lucknowense foram desenvolvidos em meio rico contendo pharmedia com celulose e lactose (meio 1) ou meio rico contendo pharmedia e glucose (meio 2) a 33°C. Após 48 h, o micélio foi colhido e o RNA isolado. O RNA foi hibridizado com 5 sondas diferentes: EG5, EG6, EG3, XylF e CBH. Após exposição, os manchamentos Northern foram removidos e novamente hibridizados com uma sonda de L3 ribossômico como um controle para a quantidade de mRNA no manchamento. A maior parte das cepas apresentou resposta muito elevada para CBH e resposta elevada para XylF no meio 1; no meio 2, metade da cepa apresentou resposta elevada para todos os genes, e a outra metade apresentou resposta baixa. A ordem de intensidade de expressão foi deduzida destes dados como sendo de CBH > XylF > EG5 > EG3 > EG6.

As Tabelas A, B e J ilustram os detalhes do indicado acima. Descrição das figuras A Figura 1 é um manchamento Western como descrito nos Exemplos A Figura 2 é um mapa de pUT720 A Figura 3 é um mapa de pUT970G A Figura 4 é um mapa de pUT1064 A Figura 5 é um mapa de pUT1065 A Figura 6 é um mapa de pF6g A Figura 7 é um mapa de pUTl 150 A Figura 8 é um mapa de pUTl 152 A Figura 9 é um mapa de pUTl 155 A Figura 10 é um mapa de pUTl 160 A Figura 11 é um mapa de pUTl 162 Figura 12: Cromatografia de troca de íons sobre Macro Prep Q de fração NB após DEAE-Toyopearl da amostra F-60-31 CF.

Figura 13: Dependência de pH de atividade de enzimas de frações NB de amostra F-60-31 CF.

Figura 14: Estabilidade de enzimas da fração NB de amostra F-60-31 apH 5,5 e 7,5 (60°C).

Figura 15: Estabilidade de pH a 60°C e 50°C de 60 kD Xyl (pi 4,7) de fração NB de amostra F-60-31.

Figura 16: Dependências de temperatura de enzimas de fração NB de amostra F-30-61.

Figura 17: Cromatografia de troca de íons sobre Macro Prep Q de frações ligadas 50-53 após DEAE-Toyopearl da amostra F-60-31 CF.

Figura 18: Dependências de pH e temperatura de atividade de α-galactosidase de F-60-43, UF -cone.

Figura 19: Dependências de pH de atividade de 48 kD CBH (pi 4,4) de frações ligadas de F-60-8 UF-conc.

Figura 20:Dependências de temperatura de atividade para p-nitrofenil butirato de F-60-8 UF-conc.

Figura 21: Dependências de pH de atividade para p-nitrofenil butirato de F-60-8 UF-conc.

Figura 22: Cursos de pH de atividades de proteases com 30 kD (pi 8,9) e 90 kD (pi 4,2) relativamente a proteínas Cl (50°C, 30 min. de incubação).

Figura 23: Efeito da protease “alcalina” com 30 kD (pi 8,9) sobre a atividade de xilanase da fração NBNB (Macro Prep Q) de F 60-31 CF a 50°.

Figura 24: Efeito da protease “neutra” com 90 kD (pi 4,2) sobre a atividade de CMCase das proteínas na fração ligada #44-45 (DEAE-Toyopearl) da amostra de F 60-8 UV-conc a 50°C.

Figura 25: Hidrólise completa de ácido poligalacturônico com poligalacturonase com 65 kD (pi 4,4): 50°C, pH 4,5; concentração de PGA = 5 g/1, concentração de proteína = 0,1 g/1.

Figura 26: Dependências de pH e temperatura da atividade de poligalacturonase de F-60-43 UF-conc.

Figura 27: Inibição da atividade relativamente a MUF-celobiosídeo com celobiose para CBH com 55 kD (pi 4,4): pH 4,5, 40°C.

Figura 28: Efeito sinérgico entre Endo com 25 kD (pi 4,1) e CBH com 55 kD (pi 4,4) relativamente a avicel (40°C, pH 5, 25 min.).

Figura 29: Hidrólise completa de CMC (a) e avicel (b) pelas enzimas isoladas de frações ligadas de amostra de F-60-8 UF-conc. (50°C, pH 5): concentração de CMC e avicel - 5 g/1, concentração de Endo com 25 kD = 0,01 g/1, concentração de Endo com 43 kD = 0,02 g/1; Endo com 1-25 kD (pi 4,1), Endo com 2-43 kD (pi 4,2).

Figura 30: Hidrólise completa de CMC (1) e avicel (2) com CBH com 55 kD (pi 4,4) sem (a) e com (b) glucono-b-lactona (50°C, pH 4,5): concentração de CMC e avicel = 5 g/1, concentração de proteína = 0,1 g/1, concentração de glucono-ô-lactona = 5 g/1.

Figura 31: Dependência do pH é de atividades de CMCase e RBB-CMCase das enzimas isoladas de amostra de F-60-8 UF-conc.: Endo 1-25 kD (pi 4,1), Endo 2-43 kD (pi 4,2).

Figura 32: Dependência do pH de atividades de CMCase e RBB-CMCase de CBH com 55 kD (pi 4,4).

Figura 33: Dependências da temperatura da atividade de CMCase (pH 4,5) das enzimas isoladas de frações ligadas de amostra de F-60-8 UF-conc.: CBH com 1-55 kD (pi 4,4), Endo com 2-25 kD (pi 4,1), Endo com 3-43 kD (pi 4,2).

Figura 34: Estabilidade de pH (50°C) das enzimas isoladas de frações ligadas de amostra de F-60-8 UF-conc.: CBH com 1-55 kD (pi 4,4), Endo com 2-25 kD (pi 4,1), Endo com 3-43 kD (pi 4,2).

Figura 35: Adsorção das enzimas isoladas de frações ligadas de amostra de F-60-8 UF-conc.

Referências (cujos teores são incorporados) 1. Calmeis T.P., Martin F., Durand H., e Tiraby G. (1991) “Proteolytic events in the processing of secreted proteins in fungi”, J. Biotechnol. 17(1): p. 51-66. 2. Punt P.J., Dingemanse M.A., Jacobs-Meijsing B.J., Pouwels P.H., e van den Hondel C.A. (1988) “Isolation and characterization of the glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase gene of Aspergillus nidulans”, Gene 69(1): p. 49-57. 3. Shoemaker S., Schweickart V., Ladner M., Gelfand D., Kwok S., Myambo K., e Innis M. (1983) “Molecular cloning of exo-cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27”, Bio/Technology Oct. :691-696. 4. Drocourt D., Calmeis T., Reynes J.P., Baron M., e Tiraby G. (1990) “Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to fleomicina resistance”, Nucleic Acids Res. 18(13): p. 4009. 5. Mullaney E.J., Hamer J.E., Roberti K.A., Yelton M.M., e Timberlake W.E. (1985) “Primary stracture of the trpC gene from Aspergillus nidulans”, Mol. Gen. Genet. 199(1 ): p. 37-45. 6. Yanisch-Perron C., Vieira J., e Messing J. (1987) “Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors”, Gene 33:103-119. 7. Durand H., Baron M., Calmeis T., e Tiraby G. (1988) “Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains”, em Biochemistry and genetics of cellulose degradation, J.P. Aubert, editor, Academic Press. p. 135-151. 8. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., e Randall R.J. (1951) “Protein measurements with the folin phenol reagent”, J. Biol. Chem. 193, 265-275. 9. Parriche M., Bousson J.C., Baron M., e Tiraby G. “Development of heterologous protein secretion systems in filamentous fungi”, em 3a Conferência Européia sobre Genética Fúngica, 1996. Münster, Alemanha. 10. Baron M., Tiraby G., Calmeis T., Parriche M., e Durand H. (1992) “Efficient secretion of human lysozyme fused to the Sh ble fleomicina resistance protein by the fungus Tolypocladium geodes ”, J. Biotechnol. 24(3): p. 253-266. 11. Jeenes D.J., Marczinke B., MacKenzie D.A., e Archer D.B. (1993) “A trancated glucoamylase gene fusion for heterologous protein secretion from Aspergillus niger”, FEMS Microbiol. Lett. 107(2-3): p. 267-271. 12. Stone P.J., Makoff A.J., Parish J.H., e Radford A. (1993) “Cloning and seguence-analysis of the glucoamylase gene of neurospora-crassa”, Current Genetics 24(3): p. 205-211. 13. Mõrsky P. (1983) “Turbidimetric determination of lysozyme with Micrococcus lysodeikticus cells: Reexamination of reaction conditions”, Analytical Biochem. 128:77-85. 14. Paluh J.L., Orbach M.J., Legerton T.L., e Yanofsky C. (1988) “The cross pathway control gene of Neurospora crassa, cpc-1, encodes a protein similar to GCN4 of yeast and the DNA-binding domain of the oncogene v-jun-encoded protein”, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 85(11): p. 3728-32. 15. Nakari T., Onnela M.L., Ilmen M., Nevalainen K., e Penttilã M. (1994) “Fungai promoters active in the presence of glucose”, Patente #WO 94/04673, Alko. 16. Torronen A., Mach R.L., Messner R., Gonzalez R., Kalkkinen N., Harkki A., e Kubicek C.P. (1992) “The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of both enzymes and genes”, Biotechnology (N Y) 10(11): p. 1461-5. 17. Farkas V. (1985) “Novel media for detection of microbial producers of cellulase and xylanase”, FEMS Microbiol. Letters 28:137-140. 18. Miller G.L. (1959) “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Anal. Chem. 31:426-428. 19. Punt P.J., Mattem I.E., van den Hondel C.A.M.J.J. (1988) “A vector for Aspergillus transformation conferring íleomicina resistance”, Fungai Genetics Newsletter 35, 25-30.

REIVINDICAÇÕES

Claims (20)

1. Cepa recombinante de Chrysosporium, caracterizada pelo fato de ser obtida por métodos de transformação a partir de um mutante derivado de Chrysosporium lucknowense, compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo de interesse, a dita sequência de ácidos nucléicos sendo ligada operacionalmente a uma sequência reguladora de expressão e, opcionalmente, uma sequência-sinal de secreção, a dita cepa recombinante expressando o dito polipeptídeo de interesse em um nível mais elevado do que a cepa mutante correspondente sob as mesmas condições, em que dita mutante derivada de Chrysosporium lucknowense é UV13-6 (VKM F-3632 D), NG7C-19 (VKM F-3633 D), ou UV18-25 (VKM F-3631 D.

2. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita cepa mutante é UV13-6 (VKM F-3632 D).

3. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita cepa mutante é NG7C-19 (VKM F-3633 D).

4. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita cepa mutante é UV18-25 (VKM F-3631 D).

5. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito polipeptídeo de interesse é um polipeptídeo heterólogo de origem de planta, animal (incluindo humano), algácea, bacteriana, arquebacteriana, viral ou fúngica.

6. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dito polipeptídeo de interesse é selecionado dentre enzimas degradadoras de carboidratos, proteases, lipases, esterases, outras hidrolases, oxidorredutases e transferases.

7. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito polipeptídeo de interesse é selecionado dentre enzimas fúngicas permitindo a (super)produção de metabólitos primários, incluindo ácidos orgânicos, e metabólitos secundários, incluindo antibióticos.

8. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência-sinal homóloga ou heteróloga.

9. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência-sinal fúngica.

10. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a sequência-sinal fúngica é uma sequência-sinal de uma celulase, β-galactosidase, xilanase, pectinase, esterase, protease, amilase, poligalacturonase ou hidrofobina.

11. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um marcador de seleção, tal como um marcador que confere resistência a uma droga ou que alivia um defeito nutricional.

12. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência regulatória de expressão homóloga ou heteróloga, de preferência uma sequência regulatória de expressão fúngica.

13. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a sequência regulatória de expressão compreende um promotor indutível ou constitutivo.

14. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a sequência regulatória de expressão compreende um promotor fúngico de celobioidrolase, glucoamilase, gliceraldeído fosfato desidrogenase, álcool desidrogenase A, álcool desidrogenase R, fosfoglicerato, proteinase aspártica, lipase, beta-galactosidase, hidrofobina, protease, amilase, xilanase, pectinase, esterase, endo-glucanase ou poligalacturonase.

15. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a sequência regulatória de expressão é derivada de uma cepa de Chrysosporium.

16. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita sequência regulatória de expressão compreende uma sequência promotora associada com expressão de celulase ou expressão de xilanase ou expressão de gliceraldeído fosfato desidrogenase.

17. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que dita sequência regulatória de expressão compreende uma sequência promotora de celobioidrolase (CBH1).

18. Método para produzir um polipeptídeo de interesse, caracterizado pelo fato de compreender cultivar uma cepa recombinante de Chrysosporium como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 em condições que permitam a expressão e, de preferência, a secreção da proteína ou polipeptídeo e a recuperação do polipeptídeo de interesse produzido subsequentemente.

19. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito polipeptídeo de interesse é uma xilanase de Chrysosporium da família da xilanase F, compreendendo um sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:5.

20. Cepa recombinante de Chrysosporium de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de interesse é selecionado de celulase, β-galactosidase, xilanase, pectinase, esterase, protease, amilase, poligalacturonase ou hidrofobina.