KR20010071613A - 매우 다양한 라이브러리의 생산방법 - Google Patents

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KR20010071613A
KR20010071613A KR1020007014838A KR20007014838A KR20010071613A KR 20010071613 A KR20010071613 A KR 20010071613A KR 1020007014838 A KR1020007014838 A KR 1020007014838A KR 20007014838 A KR20007014838 A KR 20007014838A KR 20010071613 A KR20010071613 A KR 20010071613A
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마틴 씨. 라이트
브렌트 크라이더
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추후기재
필로스 인코포레이티드
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups

Abstract

(a)각각의 주형이 코딩 서열 및 작동가능한 방식으로 연결된 프로모터 서열을 포함하고 있는, 단일가닥 핵산 주형 집단(population)을 제공하는 단계;
(b)상기 단일가닥 핵산 주형 집단에 상기 핵산 주형보다 길이가 짧은, 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물을 혼성화시키는 단계;
(c)상기 단편이 상기 핵산 주형에 충분히 상보적인 두번째 핵산 가닥의 완성을 위한 프라이머로 작용하는 조건하에서, 상기 (b)단계의 혼성화 산물 각각을 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제와 접촉시키는 단계; 및
(d)상기 (c)단계의 산물을 RNA 중합효소와 접촉시켜 상기 두번째 핵산 가닥으로부터 전사된 RNA 라이브러리를 생산하는 단계
를 포함하는 핵산 라이브러리의 생산방법이 개시되어 있다.

Description

매우 다양한 라이브러리의 생산방법{Method for generating highly diverse libraries}
원하는 핵산 및 아미노산 서열을 분리할 수 있는 능력은, 특정한 종이 그 라이브러리로 대표되고 한 가지 또는 그 이상의 스크리닝 기술로 확인되기에 충분한 수 및 다양성을 가지는 재조합체 라이브러리의 사용가능성을 요한다. 그러한 라이브러리는 치료제, 연구 진단제 및 농경 제제를 포함하는 유용한 화합물뿐만 아니라 그들의 코딩 서열의 분리를 용이하게 해준다.
또한, 바람직한 라이브러리는 한 화합물의 다수의 가능한 변형체(variant)들을 포함하도록 특이적으로 고안될 수 있다. 이러한 타입의 라이브러리는 그 화합물의 향상된 버전, 예를 들면 최적화된 치료 효능을 가지고 있는 화합물 변형체를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
이러한 또는 기타 다른 적용을 위해서, 라이브러리의 다양성을 증가시키기 위한 일반적인 접근방법들이 매우 유용하며 단백질 고안 산업의 중요한 초점을 대표한다.
[발명의 요약]
일반적으로, 본 발명은
(a)각각의 주형이 코딩 서열 및 작동가능한 방식으로 연결된 프로모터 서열을 포함하고 있는, 단일가닥 핵산 주형 집단(population)을 제공하는 단계;
(b)상기 단일가닥 핵산 주형 집단에 상기 핵산 주형보다 길이가 짧은, 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물을 혼성화시키는 단계;
(c)상기 단편이 상기 핵산 주형에 충분히 상보적인 두번째 핵산 가닥의 완성을 위한 프라이머로 작용하는 조건하에서, 상기 (b)단계의 혼성화 산물 각각을 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제와 접촉시키는 단계; 및
(d)상기 (c)단계의 산물을 RNA 중합효소와 접촉시켜 상기 두번째 핵산 가닥으로부터 전사된 RNA 라이브러리를 생산하는 단계
를 포함하는 핵산 라이브러리의 생산방법을 특징으로 한다.
바람직한 구현에서, 상기 방법은 상기 라이브러리에 하나 또는 그 이상의 변이를 도입하는데 사용되고; 상기 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물은 이중가닥 핵산 분자를 절단함으로써 생성되며; 상기 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물은 랜덤 올리고뉴클레오티드 합성에 의하여 생성되고; 상기 단일가닥 핵산 주형은 그 핵산을 지니고 있는 M13 파아지를 사용하거나, 이중가닥 핵산 주형의 한가닥을 유전자 VI 엑소뉴클라아제 또는 람다 엑소뉴클라아제로 절단하거나, 비오틴화된 단일가닥 핵산을 스트렙트애비딘으로 포획하거나, 또는 RNA를 역전사함으로써 생성되며; 상기 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물은 적어도 약 100개의 상이한 종의 핵산 단편을 포함하고; (b)단계는 단일가닥 핵산 주형당 1~약 1000개의 단편을 사용하여 수행되며; (c)단계의 산물의 단일가닥이 핵산 주형으로 사용되며 (b)단계와 (c)단계가 반복되고; (b)단계와 (c)단계는 매회마다 (c)단계의 산물을 핵산 주형으로 사용하여 반복되며; 상기 방법은 상기 단일가닥 핵산 주형과 동질 이중가닥(homoduplex)을 형성하는 하나 또는 그 이상의 단일가닥 핵산 단편을 제공하고, 상기 동질 이중가닥-형성 단편의 존재하에 (b)단계를 수행하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 프로모터는 T7 프로모터이며; 상기 DNA 중합효소는 T4 DNA 중합효소이고; 상기 방법은 상기 접촉단계 (d) 이전에 (c)단계의 산물을 증폭하는 단계를 추가로 포함하며; 상기 방법은 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 단백질 라이브러리를 생산하는 (e)단계를 추가로 포함하고; 상기 방법은 상기 RNA 라이브러리의 실질적으로 모든 RNA 각각의 코딩 서열의 3' 말단부에 아미노산 수용체 분자를 결합시키는 (e)단계를 추가로 포함하며; 및 상기 방법은 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하는 (f)단계를 추가로 포함한다.
두 번째 측면에서, 본 발명은
(a)실질적으로 모든 주형 각각이 코딩 서열 및 작동가능한 방식으로 연결된 프로모터 서열을 포함하고 있는, 다양한 서열의 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단을 제공하는 단계;
(b)상기 첫번째 집단의 주형들에 상기 핵산 주형보다 길이가 짧고 실질적으로 동일한 서열을 가지는, 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 두번째 집단을 혼성화시키는 단계;
(c)상기 단편이 상기 핵산 주형에 충분히 상보적인 두번째 핵산 가닥의 완성을 위한 프라이머로 작용하는 조건하에서, 상기 (b)단계의 혼성화 산물을 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제와 접촉시키는 단계; 및
(d)상기 (c)단계의 산물을 RNA 중합효소와 접촉시켜, 상기 두번째 핵산 가닥으로부터 전사되었으며 상기 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단에 비해 감소된 서열 다양성을 가지고 있는 RNA 분자 집단을 생산하는 단계
를 포함하는 핵산 분자 집단내의 서열 다양성을 감소시키는 방법을 특징으로 한다.
바람직한 구현에서, 상기 방법은 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단으로부터 하나 또는 그 이상의 변이를 제거하는데 사용되고; (b)단계는 상기 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단을 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 둘 또는 그 이상의 상이한 집단에 혼성화시키는 것을 포함하며; 상기 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 두번째 집단은 이중가닥 핵산 분자를 절단하여 생성되고; 상기 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 두번째 집단은 랜덤 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 생성되며; 상기 단일가닥 핵산 주형은 그 핵산을 지니고 있는 M13 파아지를 사용하거나, 이중가닥 핵산 주형의 단일가닥을 유전자 VI 엑소뉴클라아제 또는 람다 엑소뉴클라아제로 절단하거나, 비오틴화된 단일가닥 핵산을 스트렙트애비딘으로 포획하거나, 또는 RNA를 역전사함으로써 생성되고; (b)단계는 단일가닥 핵산 주형당 1~약 1000개의 단일가닥 핵산 단편을 사용하여 수행되며; (c)단계의 산물의 단일가닥이 핵산 주형으로 사용되며 (b)단계와 (c)단계가 반복되고; (b)단계와 (c)단계는 매회마다 (c)단계의 산물을 핵산 주형으로 사용하여 반복되며; 상기 프로모터는 T7 프로모터이고; 상기 DNA 중합효소는 T4 DNA 중합효소이며; 상기 방법은 상기 접촉단계 (d) 이전에 (c)단계의 산물을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 방법은 상기 RNA 분자 집단을 해독하여 단백질 라이브러리를 생산하는 (e)단계를 추가로 포함하며; 상기 방법은 상기 RNA 분자 집단의 실질적으로 모든 RNA 각각의 코딩 서열의 3' 말단부에 아미노산 수용체 분자를 결합시키는 (e)단계를 추가로 포함하고; 및 상기 방법은 상기 RNA 분자 집단을 해독하여 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하는 (f)단계를 추가로 포함한다.
세번째 측면에서, 본 발명은
(a)각각의 주형이 코딩 서열을 포함하고 있는, 단일가닥 핵산 주형 집단을 제공하는 단계;
(b)상기 단일가닥 핵산 주형 집단과 충분히 상보적인, 다양한 서열의 단일가닥 핵산 분자 집단을 제공하는 단계;
(c)상기 단일가닥 핵산 주형 집단을 이중가닥을 형성하기에 충분한 조건하에서, 상기 다양한 서열의 단일가닥 핵산 분자 집단과 혼성화시키는 단계; 및
(d)상기 이중가닥을 하나 또는 그 이상의 절단/복원 효소와 그 효소가 상기 이중가닥내의 미스매치된 염기쌍을 수정할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계
를 포함하는 핵산 라이브러리의 생산방법을 특징으로 한다.
바람직한 구현에서, 상기 방법은 (d)단계 및 반복되는 (c)와 (d) 단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형들의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함하고; 및(c)와 (d)단계는 매회마다 (d)단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형 집단을 사용하여 반복된다.
네번째 측면에서, 본 발명은
(a)각각의 주형이 코딩 서열을 포함하고 있는, 단일가닥 핵산 주형 집단을 제공하는 단계;
(b)상기 단일가닥 핵산 주형 집단에 상기 핵산 주형보다 길이가 짧은, 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물을 혼성화시키는 단계;
(c)상기 단편이 상기 핵산 주형에 충분히 상보적인 두번째 핵산 가닥의 완성을 위한 프라이머로 작용하는 조건하에서, 상기 (b)단계의 혼성화 산물 각각을 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제와 접촉시키는 단계; 및
(d)상기 (c)단계의 산물을 하나 또는 그 이상의 절단/복원 효소와 그 효소가 상기 산물내의 미스매치된 염기쌍을 수정할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계
를 포함하는 핵산 라이브러리의 생산방법을 특징으로 한다.
바람직한 구현에서, 상기 방법은 (d)단계 및 반복되는 (b)~(d)단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형들의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함하고; 및 (b)~(d)단계는 매회마다 (d)단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형 집단을 사용하여 반복된다.
본 발명의 상기 세번째 및 네번째 측면의 바람직한 구현에서, 절단/복원 효소와의 접촉은 생체내에서(예를 들면, 박테리아 세포내에서) 이루어지고; 절단/복원 효소와의 접촉은 시험관내에서 이루어지며; 상기 단일가닥 핵산 주형은 그 핵산을 지니고 있는 M13 파아지를 사용하거나, 이중가닥 핵산 주형의 한가닥을 유전자 VI 엑소뉴클라아제 또는 람다 엑소뉴클라아제로 절단하거나, 비오틴화된 단일가닥 핵산을 스트렙트애비딘으로 포획하거나, 또는 RNA를 역전사함으로써 생성되고; (b)단계는 단일가닥 핵산 주형당 1~약 1000개의 다양한 서열을 지닌 단일가닥 핵산 분자, 또는 한 가닥 핵산 단편을 사용하여 수행되며; 상기 방법은 (d)단계의 산물을 증폭하는 (e)단계를 추가로 포함하고; 각각의 코딩 서열은 작동가능한 방식으로 프로모터 서열에 연결되어 있으며; 상기 방법은 (d)단계의 산물을 전사하여 RNA 라이브러리를 생산하는 (e)단계를 추가로 포함하고; 상기 방법은 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 단백질 라이브러리를 생산하는 (f)단계를 추가로 포함하며; 상기 방법은 상기 RNA 라이브러리의 실질적으로 모든 RNA 각각의 코딩 서열의 3' 말단부에 아미노산 수용체 분자를 결합시키는 (f)단계를 추가로 포함하고; 및 상기 방법은 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하는 (g)단계를 추가로 포함한다.
여기에서, "라이브러리"란 적어도 108, 바람직하게는 적어도 1010, 보다 바람직하게는 적어도 1012, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 1014개의, 핵산 및/또는 아미노산 성분을 가지고 있는 분자를 의미한다.
핵산 단편의 "혼합물"이란 적어도 100, 바람직하게는 적어도 500, 보다 바람직하게는 적어도 1000, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 1500개의 핵산 단편을 의미한다.
"프로모터 서열"이란 기능성 RNA 중합효소 결합 부위를 제공하며, proximal 코딩 서열의 전사를 허용하기에 충분한 모든 핵산 서열을 의미한다.
"충분히 상보적인"이란 한 핵산 가닥이 두번째 핵산 가닥과 매치된 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 그 두 핵산간에 하나 또는 그 이상의 이중가닥 영역을 생성할 수 있는 충분한 수의 뉴클레오티드를 가지고 있음을 의미한다. 한 핵산 분자내의 각 뉴클레오티드가 충분히 상보적인 반대 가닥내의 뉴클레오티드와 매치된 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 필요는 없으며, "충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물"에서 그 단편들의 상당 부분이 상기 "단일가닥 핵산 주형"과 미스매치를 형성하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 것임이 이해되어야 한다.
"가닥 치환 활성"이란 중합효소 또는 그의 결합된 헬리카아제(helicase)가 두 핵산 가닥간의 염기쌍을 파괴할 수 있는 능력을 의미한다.
"변이(mutation)"란 모든 뉴클레오티드 변화를 의미하며, 형태학적인 차이뿐만 아니라 침묵하는(silent) 변화를 초래하는 서열 변형을 포함한다.
"이중가닥(duplex)"이란 가닥간에 안정한 혼성화 컴플렉스를 유지하기에 충분한 서열 상보성이 존재하는, 두 개의 어닐링된(annealed) 핵산 가닥간에 형성된 구조를 의미한다. 이중가닥은 첫번째 가닥내의 모든 뉴클레오티드가 두번째 반대 가닥내의 모든 뉴클레오티드와 적절하게 염기쌍을 이루고 있는 "동질 이중가닥(homoduplex)", 또는 "이질 이중가닥(heteroduplex)"일 수 있다. "이질 이중가닥"이란 첫번째 가닥내의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 하나 또는 그 이상의 미스매치 때문에 두번째 반대되는 상보적인 가닥내의 하나 또는 그 이상의뉴클레오티드와 적절하게 염기쌍을 형성할 수 없는, 두개의 어닐링된 핵산 가닥간에 형성된 구조를 의미한다.
상이한 유형의 이질 이중가닥의 예에는 하나 또는 다수개의 뉴클레오티드 치환, 및 삽입 또는 결실 변이를 보이는 것들이 포함된다.
"랜덤 올리고뉴클레오티드"란 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 위치에 서열 다양성을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 의미한다. 랜덤 올리고뉴클레오티드는 전적으로 랜덤하거나 부분적으로 랜덤한 합성 방법을 사용하거나, 또는 특이적 방식(directed fashion)으로 올리고뉴클레오티드를 고의적으로 변형시켜 제조할 수 있다.
"아미노산 수용체 분자"란 리보솜 팹티드 트랜스퍼라아제 기능의 촉매 활성에 의해 성장하는 단백질 사슬의 C-말단부에 부가될 수 있는 모든 분자를 의미한다. 전형적으로, 그러한 분자는 (i)뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드-유사 부분(nucleotide-like moiety)(예를 들면, 아데노신 또는 아데노신의 구조유사물(N-6 아미노 위치에서의 디메틸화가 허용가능함)), (ii)아미노산 또는 아미노산-유사 부분(예를 들면, 20개의 D- 또는 L-아미노산, 또는 그들의 아미노산 구조유사물(예를 들면, 엘만 등(Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301, 1991)에 의해 기술된 O-메틸 티로신 또는 그의 구조유사물)), 및 (iii)상기 둘간의 결합(예를 들면, 3' 위치, 또는 덜 바람직하게는 2' 위치에서의 에스테르, 아미드 또는 케톤 결합)을 포함하는데, 바람직하게는 이러한 결합은 천연적인 리보뉴클레오티드 형태로부터 링의 주름(pucker)을 심각하게 혼란시키지 않는다. 아미노산 수용체는또한 친핵체(nucleophile)를 가질 수 있는데, 이는 제한없이, 아미노기, 히드록시기, 또는 황화수소기일 수 있다. 또한, 아미노산 수용체는 뉴클레오티드 유사체(mimetics), 아미노산 유사체, 또는 결합된 뉴클레오티드-아미노산 구조물(construct)의 유사체일 수 있다.
코딩 서열의 "3' 말단부에" 결합된 아미노산 수용체란 아미노산 수용체가 상기 코딩 서열의 마지막 코돈 뒤에 위치함을 의미한다. 이 용어는 제한없이, 정확하게 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 아미노산 수용체 뿐만 아니라, 사이에 끼인 코딩 또는 비코딩 서열(예를 들면, pause site에 해당하는 서열)에 의해 마지막 코돈으로부터 분리되어 있는 것도 포함한다. 이 용어는 또한 코딩 또는 비코딩 서열이 그 아미노산 수용체 분자의 뒤에 오는(즉, 3'인) 구조물도 포함한다. 아울러, 이 용어는 제한없이, 코딩 서열에 공유결합되어 있는(직접적으로 또는 사이에 끼인 핵산 서열을 통해 비간접적으로) 아미노산 수용체 분자 뿐만 아니라, 몇몇 비공유 수단에 의해, 예를 들면 코딩 서열의 3'말단에 또는 그 근처에 결합하며 그 자체가 아미노산 수용체 분자에 결합되어 있는 두번째 핵산 서열을 사용하는 혼성화를 통해 코딩 서열에 결합된 것도 포함한다.
"RNA-단백질" 융합이란 아미드 결합을 통해 단백질에 공유결합되어 있는 리보핵산을 포함하는 모든 분자를 의미한다. 이러한 공유결합은 리보솜에 의한 절단에 대해서 저항성을 가진다.
"단백질"이란 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합에 의해 연결된, 둘 또는 그 이상의 자연적으로 발생하거나 또는 개질된(modified) 아미노산을 의미한다. 여기서 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 서로 바꿔쓸 수 있다.
"다양한 서열의 단일가닥 주형 집단"이란 그 집단의 핵산종이 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 위치에서 상이한 서열을 가지고 있음을 의미한다.
"절단/복원 효소"란 미스매치된 염기쌍 또는 루프를 표준 염기쌍(즉, A:T 또는 G:C)으로 대체하기에 충분한 모든 효소 조합을 의미한다.
본 발명은 재조합체 라이브러리를 생산하고 변형시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 매우 다양한 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하기 위한 예시적인 단편 재조합 방법의 개략도이다. 이 방법에서, 상기 단편은 서열 다양성이 도입될 이중가닥 DNA 분자로부터 유래된다.
도 2는 두번째 예시적인 단편 재조합 방법의 초기 단계의 개략도이다. 이 방법에서, 상기 단편은 서열 다양성이 도입될 합성 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명은 유전적 변형이 도입되어온 DNA, RNA 및 단백질 라이브러리의 생산을 용이하게 하는, 다수의 신규하고 연관된, 핵산 서열의 랜덤 재조합 방법을 포함한다. 하기에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 바람직한 구현에서 이러한 기술은 시험관내에서 수행되며, 전형적인 단백질 라이브러리 또는 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하는데 사용되는데, 상기 라이브러리는 라이브러리 집단으로부터 원하는 단백질 또는 펩티드(또는 그들의 상응하는 코딩 서열)를 선별하기 위한 다양한 방법과 조합하여 사용된다. 이러한 일반적인 접근방법은 공정한 방식(unbiased fashion)으로 변이를 단백질 라이브러리내로 도입하기 위한 수단을제공하며, 또한 적합하지 않은 변이를 라이브러리 또는 선별된 풀에서 제거하거나, 또는 뒤이은 선별 라운드 동안 분자 집단으로부터 "백크로스(backcrossed)"시킬 수 있는 기술을 제공한다.
단편 재조합
본 발명의 바람직한 한 방법에 따르면, 변이체 단편을 생산하고 이들 단편을 변이되지 않은(전형적으로, 야생형) 서열과 랜덤 재조합시켜 라이브러리를 제조한다. 이러한 일반적인 방법의 일례를 도 1에 도시하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 우선 초기 이중가닥 DNA 서열(이하 "dsDNA(init)"라 함)내로 변이를 랜덤하게 도입한다. 이는 도 1에서 "dsDNA(mut)"로 표시된, 변이체 이중가닥 DNA 서열 집단을 생산한다. 이러한 변이는 PCR 변이유발방법(Taq 중합효소의 error-proofing 메카니즘에 의존하는), 부위-특이적 변이유발방법, 또는 주형-특이적 변이유발방법(예를 들면, Joyce and Inoue, Nucl. Acids Res. 17:171, 1989에 기술된) 등과 같은 기술에 의해 도입될 수 있다. 그런 다음, 이러한 변이-함유 집단내의 DNA를 다양한 표준 방법중 어느 하나를 사용하여 단편화한다. 예를 들면, 상기 DNA를 하나 또는 그 이상의 뉴클라아제(예를 들면, DNaseI, 구균 뉴클라아제, 제한효소, 또는 P1 뉴클라아제)를 사용하여 부분적으로 분해하거나, 또는 예를 들면 Fe·EDTA를 사용하여 화학적으로 단편화할 수 있다. 이와 달리, 중합반응(예를 들면, PCR 증폭) 동안의 제한된 뉴클레오티드 소모, 또는 간단한 물리적 전단(shearing)(예를 들면, 초음파 파쇄)에 의해 변이-함유 단편을 생산할 수도 있다. 바람직한 단편 크기는 25~1000 염기쌍이고, 가장 바람직하게는 50~150 염기쌍이다.
이어서, 상기 DNA 단편을 가열하여, 상기 초기 DNA와 서열이 동일하고 그 DNA의 비코딩(즉, 마이너스) 가닥인 전체 길이의 단일가닥 DNA 주형에 어닐링시킨다. 또한, 상기 혼성화 혼합물내에는 때때로 "종료자 단편(terminator fragment)"이라 불리우는 두번째 유형의 단편이 포함된다(참조: Joyce and Inoue, Nucl. Acids Res. 17:171, 1989). 이 종료자 단편은 상기 단일가닥 주형의 3' 말단에 상보적이며, 랜덤하게 어닐링된 변이-함유 단편의 갯수 또는 특성과 무관한 방식으로 상기 주형에 결합하는 중합 프라이머를 제공한다.
단일가닥 주형은 모든 표준 기술, 예를 들면 그 DNA 서열을 지니고 있는 M13 파아지를 사용하거나, dsDNA(init) 분자의 코딩가닥을 유전자 VI 엑소뉴클라아제(참조: Nikiforov et al., PCR Methods Appl. 3:285, 1994) 또는 람다 엑소뉴클라아제(참조: Higuchi and Ochman, Nucl. Acids Res. 17:5865, 1989)로 절단하거나, 고정화된 스트렙트애비딘(참조: Joyce and Inoue, Nucl. Acids Res. 17:171, 1989)으로 비오틴화된 DNA 가닥을 포획하거나, 또는 RNA를 역전사함으로써 생성될 수 있다. 주형-단편 혼성화를 수행하기 위해서, 주형 분자당 1개 이상 약 1000개 이하의 단편 분자를 사용하여 주형과 단편을 혼합한다. 주형에 대한 단편의 비율이 낮으면 주형과 흡사한 프로제니(progeny) 가닥이 생성되며, 반면 주형에 대한 단편의 비율이 높을 수록 상기 단편과 더 흡사한 프로제니가 생성된다. 혼성화 조건은 표준 방법에 따라 결정되며, 상기 주형과 단편간에 이질 이중가닥이 형성될 수 있도록 고안된다. 예시적인 혼성화 방법이 예를 들면, 스테머(Stemmer)의 미국특허 제 5,605,793호에 개시되어 있다.
일단 상기 주형에 어닐링되면, 상기 단편은 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제로 처리되어 함께 결합된다. 이러한 목적에 유용한 DNA 중합효소는 제한없이, T4 DNA 중합효소 및 재구성된 대장균 DNA pol II이다(참조: 예를 들면, Hughes et al., J. Biol. Chem. 266:4568, 1991). 모든 DNA 리가아제(예를 들면, T4 DNA 리가아제)가 사용될 수 있다. 이 단계에서, 상기 DNA 이중가닥은 우선 DNA 중합효소로 처리되고 DNA 리가아제로 처리되거나, 또는 두 효소로 동시에 처리될 수 있으며, 이 단계는 예를 들면 조이스와 이노우에의 문헌(Joyce and Inoue, Nucl. Acids Res. 17:711, 1989)에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다. 도 1에 도시한 바와 같이, 이 단계는 이중가닥 DNA 집단(이하, "dsDNA(lib)"라 함)을 생성하는데, 그 집단의 각 DNA는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 도입된 변이를 가지고 있는 단일가닥을 포함한다. 상기 변이가 초기에 도입되고, 어닐링된 단편의 갯수 및 특성이 랜덤하기 때문에, 그 집단내의 상이한 이중가닥은 상이한 변이 서열을 포함하게 된다.
이중가닥 DNA 라이브러리를 생산하기 위한 이러한 일반적인 접근방법에 대한 대안이 도 2에 도시되어 있다. 이러한 대안에 의해, 초기 이중가닥 DNA 분자의 코딩 가닥의 일부에 해당하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드 단편을 합성할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드 단편은 길이가 바람직하게는 5~2000 뉴클레오티드이고, 보다 바람직하게는 20~100 뉴클레오티드이며, 예를 들면 표준적인 핵산 합성 기술을 사용하여 생산된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 모든 표준 기술에 의해 전적으로 랜덤한 또는 세미-랜덤한 변이를 가지게 합성될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 올리고뉴클레오티드는 20 뉴클레오티드 세그먼트(segment)당 3개 까지의 도입된 미스매치를 포함하고 있으며, 틀에 맞는(in frame) 종료 코돈이 결여되어 있다. 또한, 어떤 경우에는 C-5 프로핀 우리딘(propyne uridine) 또는 C-5 프로핀 시티딘(propyne cytidine)과 같은 비-천연의 친화성-증강 염기쌍의 도입을 통해 상기 올리고뉴클레오티드의 혼성화 포텐셜을 증가시키는 것이 바람직하거나 또는 필요할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들면, 와그너 등의 문헌(Wagner et al., Science 260:1510, 1993)에 개시되어 있다.
이러한 변이-함유 올리고뉴클레오티드 단편은 이어서 상기에서와 같이 초기 DNA의 비코딩(즉, 마이너스) 가닥과 서열이 동일한 전체 길이의 가닥인 단일가닥 주형에 어닐링된다. 상기 단편은 또한 상술한 바와 같이 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제를 사용하여 함께 결합되어 이중가닥 DNA 라이브러리(dsDNA(lib))를 생성한다. 또한, 이 라이브러리는 이중가닥 분자 집단을 포함하며, 갯수, 위치 및 정체성면에서 상이한 변이를 가지고 있는 상이한 코딩 가닥들의 구색(array)을 포함하고 있다.
만약 원한다면, 상기 단편 또는 올리고뉴클레오티드 접근방법에 대해서, DNA 분자내로 다양한 수의 변이를 도입할 수 있도록 상기 단계를 반복할 수 있다. 특히, 상기 변이된 가닥이 초기 단일가닥 주형으로 작용하게 되며, 변이 단편 또는 올리고뉴클레오티드가 그러한 가닥에 어닐링되고 중합되며 리게이션된다.
백크로스(backcross) 방법
상기에서 포괄적으로 기술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 초기 DNA 서열내로 변이를 도입하는데 사용된다. 또한, 이러한 기술은 DNA 라이브러리로부터 바람직하지 않은 변이를 제거하거나 또는 빈도면에서 감소시키는데 사용될 수 있다. 이러한 접근방법에 따르면, dsDNA(mut)의 단편화에 이어, 야생형 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 변이되지 않거나 야생형인 DNA(wtDNA)의 특정 단편을 상기 dsDNA(mut) 단편 또는 올리고뉴클레오티드와 함께 상기 단일가닥 주형에 첨가할 수 있다. 상기 단편은 상술한 바와 같이, 가닥이 분리되고(필요하다면), 전체 길이의 단일가닥 주형에 어닐링되며, DNA 중합효소 및 DNA 리가아제를 사용하여 함께 결합된다. 변이되지 않은 올리고뉴클레오티드 또는 단편을 그에 상응하는 변이체 단편에 비하여 높은 농도로 사용함으로써 바람직하지 않은 변이가 최소화되거나 또는 제거된 라이브러리를 생산하는 것이 가능하다.
또한, 이러한 접근방법은 마찬가지로 바람직하지 않은 서열을 감소시키거나 제거하기 위하여 기존의 변이-함유 라이브러리와 함께 사용될 수 있다. 이러한 접근방법은 상기에서 포괄적으로 기술한 바와 같이, 변이 서열을 가지고 있는 초기 라이브러리, 및 야생형 서열의 단편 또는 올리고뉴클레오티드의 어닐링, 중합 및 리게이션을 포함한다.
RNA, 단백질, 및 RNA-단백질 라이브러리
본 발명의 바람직한 구현에서, 상술한 DNA 라이브러리는 RNA 중합효소, 예를 들면 T7 또는 SP6 중합효소 결합 부위를 추가로 포함한다. 그러한 결합 부위는 예를 들면, 밀리간 등의 문헌(Milligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:696, 1990)에 기술되어 있다. 이러한 부위는 코딩 서열의 상류에 그 서열의 전사를 허용하는 장소에 위치해 있다. 전형적으로 그러한 부위는 코딩 서열의 5~2000 염기쌍 상류에 위치해 있다.
RNA 중합효소 결합부위를 포함하고 있는 라이브러리는 상술한 바와 같이 변형될 수 있다. 중합 및 리게이션에 이어, 상기 dsDNA(lib)를 예를 들면 시험관내 전사 시스템을 사용하여 직접적으로 전사하여 RNA 라이브러리를 생산할 수 있다. 이와 달리, 상기 dsDNA(lib)를 예를 들면 시험관내 전사 및 해독 시스템을 사용하여 직접적으로 전사 및 해독하여 단백질 라이브러리를 생산할 수 있다. 예시적인 시험관내 전사 시스템 및 시험관내 해독 시스템은 T7 전사 시스템, 및 토끼의 망상적혈구, 맥아, 효모 및 대장균의 해독 시스템을 포함한다.
원한다면, 전사 이전에 가닥-특이적 증폭 단계를 포함시킴으로써 라이브러리내의 각 RNA 또는 단백질의 카피수를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 중합 및 리게이션 단계 동안 상기 변이 가닥내로 독특한 프라이머-결합 서열을 도입함으로써 PCR 증폭을 수행할 수 있다. 이러한 서열은 상기 DNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 미스매치 또는 서열 신장으로서 도입될 수 있으며, 상기 주형 가닥의 증폭없이 새로 합성된 가닥의 증폭을 허용한다. 이와 달리, 새로 합성된 가닥의 3' 말단에 상보적인 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링 및 신장의 다수의 사이클에 의해 선형 증폭이 달성될 수 있다. 뒤이은 PCR 및 전사 단계는 주형-유래 서열중 적은 부분만을 가지고 있는 변이 서열에 해당하는 RNA의 대부분을 생산한다.
바람직한 접근방법에서, 변이를 도입하거나 또는 원하지 않는 변이를 백크로스하기 위한 상기 방법들은 매우 다양한 RNA-단백질 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 그러한 라이브러리는 퓨로마이신(puromycin)과 같은 가수분해가 불가능한 아미노산 수용체 분자를 포함하는 링커를 라이브러리(예를 들면, 상술한 바와 같이 생산된)내의 RNA의 3' 말단부에 연결시킴으로써 제조될 수 있다. RNA-단백질 융합체를 생성하기 위한 예시적인 기술이 예를 들면, 스조스탁 등의 미국특허출원 제 09/007,005호(Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005) 및 로버츠 등의 문헌(Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297, 1997)에 개시되어 있다. 이들 RNA의 뒤이은 해독은 후에 시험관내 선별 실험에 사용될 수 있는 RNA-단백질 융합 분자의 라이브러리를 생성한다.
또한, 원한다면 RNA 또는 RNA-단백질 융합 분자는, 일단 선별되면 그에 상응하는 코딩 서열을 얻기 위한 표준 PCR 반응에 주형으로 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 시험관내 시스템에서, 단편 재조합, 분자수준의 백크로스, 단백질 및/또는 펩티드의 선별, 및 그들의 상응하는 코딩 서열의 선별을 수행하기 위한 수단을 제공한다.
절단/및 복원
단편 재조합 접근방법 외에도, 절단/복원 또한 라이브러리 서열을 변형시키는데 사용될 수 있다. 이러한 접근방법은 DNA, RNA, 및 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술은 상술한 방법들중 어느 하나에 의하여 생산된 dsDNA(lib)가 본래 약간의 미스매치된 염기쌍을 포함하고 있다는 사실에 의존한다. 라이브러리 서열내에 다양성을 생성하기 위하여, 이러한 미스매치가 절단/복원 효소에 의해 시험관내에서 복원된다. 이는 모든 절단 복원 시스템(예를들면, Jaiswal et al., Nucl. Acids Res. 26:2184, 1998, 또는 Fortini et al., Biochemistry 37:3575, 1998에 기술된 바와 같이)을 사용하여 수행될 수 있다.
이와 달리, 상기 절단/복원 단계는 dsDNA(lib)를 박테리아 또는 효모 균주내로 형질전환시키고, 생체내에서 그 박테리아 또는 효모의 복원 시스템을 이용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 이러한 단계는 상기 라이브러리를 모든 표준 생체내 절단/복원 시스템내로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 예시적인 시스템이 제한없이, 캠벨 등의 문헌(Campbell et al., Mutat. Res. 211:181, 1989), 비숍 및 콜로드너의 문헌(Bishop and Kolodner, Mol. Cell Biol. 6:3401, 1986), 피쉘 등의 문헌(Fishel et al., J. Mol. Biol. 188:147, 1986), 및 웨스트모어랜드 등의 문헌(Westmoreland et al., Genetics 145:29, 1997)에 개시되어 있다.
상기 복원 단계가 랜덤하기 때문에, 이러한 절단/복원 방법은 때때로 라이브러리 서열내로 변이의 도입을 초래하며, 때로는 코딩 가닥내로 야생형 서열 변형의 백크로스를 초래한다.
상기 접근방법에 대한 대안으로, 시험관내 또는 생체내 절단/복원 시스템 또한, dsDNA(mut)(예를 들면, 상술한 바와 같이 생산된) 및 dsDNA(init) 또는 wtDNA의 혼합물을 기질로 사용하여 다양한 라이브러리를 생산하는데 직접적으로 사용될 수 있다. 이러한 기술에서, 상기 혼합물은 가닥이 분리된 다음 재어닐링되며, 이어서 시험관내에서 절단/복원 효소와 함께 인큐베이션되거나, 또는 박테리아의 절단/복원 시스템을 이용할 수 있도록 박테리아내로 형질전환된다(예를 들면, 상술한 바와 같이). 이러한 방식으로, 변이가 서열내로 랜덤하게 도입될 수 있고, 야생형서열이 dsDNA(mut) 분자내로 백크로스될 수 있다.

Claims (35)

  1. (a)각각의 주형이 코딩 서열 및 작동가능한 방식으로 연결된 프로모터 서열을 포함하고 있는, 단일가닥 핵산 주형 집단(population)을 제공하는 단계;
    (b)상기 단일가닥 핵산 주형 집단에 상기 핵산 주형보다 길이가 짧은, 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물을 혼성화시키는 단계;
    (c)상기 단편이 상기 핵산 주형에 충분히 상보적인 두번째 핵산 가닥의 완성을 위한 프라이머로 작용하는 조건하에서, 상기 (b)단계의 혼성화 산물 각각을 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제와 접촉시키는 단계; 및
    (d)상기 (c)단계의 산물을 RNA 중합효소와 접촉시켜 상기 두번째 핵산 가닥으로부터 전사된 RNA 라이브러리를 생산하는 단계
    를 포함하는 핵산 라이브러리의 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 방법이 상기 라이브러리내로 하나 또는 그 이상의 변이를 도입하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. (a)실질적으로 모든 주형 각각이 코딩 서열 및 작동가능한 방식으로 연결된 프로모터 서열을 포함하고 있는, 다양한 서열의 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단을 제공하는 단계;
    (b)상기 첫번째 집단의 주형들에 상기 핵산 주형보다 길이가 짧고 실질적으로 동일한 서열을 가지는, 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 두번째 집단을 혼성화시키는 단계;
    (c)상기 단편이 상기 핵산 주형에 충분히 상보적인 두번째 핵산 가닥의 완성을 위한 프라이머로 작용하는 조건하에서, 상기 (b)단계의 혼성화 산물을 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제와 접촉시키는 단계; 및
    (d)상기 (c)단계의 산물을 RNA 중합효소와 접촉시켜, 상기 두번째 핵산 가닥으로부터 전사되었으며 상기 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단에 비해 감소된 서열 다양성을 가지고 있는 RNA 분자 집단을 생산하는 단계
    를 포함하는 핵산 분자 집단내의 서열 다양성을 감소시키는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 방법이 상기 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단으로부터 하나 또는 그 이상의 변이를 제거하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 (b)단계가 상기 단일가닥 핵산 주형의 첫번째 집단을 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 둘 또는 그 이상의 상이한 집단에 혼성화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물이 이중가닥 핵산 분자의 절단, 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드의 합성에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 단일가닥 핵산 주형이 그 핵산을 지니고 있는 M13 파아지를 사용하거나, 이중가닥 핵산 주형의 한가닥을 유전자 VI 엑소뉴클라아제 또는 람다 엑소뉴클라아제로 절단하거나, 비오틴화된 단일가닥 핵산을 스트렙트애비딘으로 포획하거나, 또는 RNA를 역전사함으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물이 적어도 약 100개의 상이한 종의 핵산 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 (b)단계가 단일가닥 핵산 주형당 1~약 1000개의 단편을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 (c)단계의 산물의 단일가닥이 핵산 주형으로 사용되며, (b) 및 (c)단계가 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 (b) 및 (c)단계가 매회마다 (c)단계의 산물을 핵산 주형으로 사용하여 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 방법이 상기 단일가닥 핵산 주형과 동질 이중가닥(homoduplex)을 형성하는 하나 또는 그 이상의 단일가닥 핵산 단편을 제공하고, 상기 동질 이중가닥-형성 단편의 존재하에 (b)단계를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 프로모터가 T7 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 DNA 중합효소가 T4 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 방법이 상기 접촉단계 (d) 이전에 (c)단계의 산물을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 방법이 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 단백질 라이브러리를 생산하는 (e)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 방법이 상기 RNA 라이브러리의 실질적으로 모든 RNA 각각의 코딩 서열의 3' 말단부에 아미노산 수용체 분자를 결합시키는 (e)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 방법이 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하는 (f)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. (a)각각의 주형이 코딩 서열을 포함하고 있는, 단일가닥 핵산 주형 집단을 제공하는 단계;
    (b)상기 단일가닥 핵산 주형 집단과 충분히 상보적인, 다양한 서열의 단일가닥 핵산 분자 집단을 제공하는 단계;
    (c)상기 단일가닥 핵산 주형 집단을 이중가닥을 형성하기에 충분한 조건하에서, 상기 다양한 서열의 단일가닥 핵산 분자 집단과 혼성화시키는 단계; 및
    (d)상기 이중가닥을 하나 또는 그 이상의 절단/복원 효소와 그 효소가 상기 이중가닥내의 미스매치된 염기쌍을 수정할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계
    를 포함하는 핵산 라이브러리의 생산방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 방법이 (d)단계 및 반복되는 (c)와 (d)단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형들의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 (c)와 (d)단계가 매회마다 (d)단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형 집단을 사용하여 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. (a)각각의 주형이 코딩 서열을 포함하고 있는, 단일가닥 핵산 주형 집단을 제공하는 단계;
    (b)상기 단일가닥 핵산 주형 집단에 상기 핵산 주형보다 길이가 짧은, 충분히 상보적인 단일가닥 핵산 단편의 혼합물을 혼성화시키는 단계;
    (c)상기 단편이 상기 핵산 주형에 충분히 상보적인 두번째 핵산 가닥의 완성을 위한 프라이머로 작용하는 조건하에서, 상기 (b)단계의 혼성화 산물 각각을 가닥 치환 활성이 결여된 DNA 중합효소 및 DNA 리가아제와 접촉시키는 단계; 및
    (d)상기 (c)단계의 산물을 하나 또는 그 이상의 절단/복원 효소와 그 효소가 상기 산물내의 미스매치된 염기쌍을 수정할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계
    를 포함하는 핵산 라이브러리의 생산방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 방법이 (d)단계 및 반복되는 (b)~(d)단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형들의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 (b)~(d)단계가 매회마다 (d)단계의 산물로부터 유래된 단일가닥 주형 집단을 사용하여 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19항 또는 제 22항에 있어서,
    상기 절단/복원 효소와의 접촉이 생체내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 절단/복원 효소와의 접촉이 박테리아 세포내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 19항 또는 제 22항에 있어서,
    상기 절단/복원 효소와의 접촉이 시험관내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 19항 또는 제 22항에 있어서,
    상기 단일가닥 핵산 주형이 그 핵산을 지니고 있는 M13 파아지를 사용하거나, 이중가닥 핵산 주형의 한가닥을 유전자 VI 엑소뉴클라아제 또는 람다 엑소뉴클라아제로 절단하거나, 비오틴화된 단일가닥 핵산을 스트렙트애비딘으로 포획하거나, 또는 RNA를 역전사함으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 19항 또는 제 22항에 있어서,
    상기 (b)단계가 단일가닥 핵산 주형당 1~약 1000개의 다양한 서열을 지닌 단일가닥 핵산 분자, 또는 한 가닥 핵산 단편을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 19항 또는 제 22항에 있어서,
    상기 방법이 (d)단계의 산물을 증폭하는 (e)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 19항 또는 제 22항에 있어서,
    상기 코딩 서열 각각이 작동가능한 방식으로 프로모터 서열에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 방법이 (d)단계의 산물을 전사하여 RNA 라이브러리를 생산하는 (e)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 방법이 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 단백질 라이브러리를 생산하는 (f)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서,
    상기 방법이 상기 RNA 라이브러리의 실질적으로 모든 RNA 각각의 코딩 서열의 3' 말단부에 아미노산 수용체 분자를 결합시키는 (f)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 방법이 상기 RNA 라이브러리를 해독하여 RNA-단백질 융합 라이브러리를 생산하는 (g)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020007014838A 1998-06-29 1999-06-29 매우 다양한 라이브러리의 생산방법 KR20010071613A (ko)

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