RU2014148769A

RU2014148769A - Композиции и способы, включающие последовательности, характеризующиеся мегануклеазной активностью

Info

Publication number: RU2014148769A
Application number: RU2014148769A
Authority: RU
Inventors: Эрика БЕРМУДЕС; Эндрю Марк Сиган; Джеймс ИНГЛИШ; Саверио Карл Фалко; Хойжун Гао; Лу Лю; Чжань-бинь Лю; Азалеа ОНГ; Сергей Свиташев; Джошуа К. Янг
Original assignee: Е.И. Дюпон Де Немур Энд Компани; Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк.
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2013-05-01
Publication date: 2016-06-27
Also published as: CA2872096A1; CN104411823A; US20170022488A1; WO2013166113A1; US20140223606A1; US20190040372A1; BR112014027468A2; US10150956B2; US9499827B2; US20180142223A1; US9909110B2; US20150184173A1

Abstract

1. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с мегануклеазной активностью, при этом указанный полипептид содержит:a) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:1, выбранному из группы, состоящей из положений 2, 12, 16, 22, 23, 31, 36, 43, 50, 56, 58, 59, 62, 71, 72, 73, 80, 81, 82, 86, 91, 95, 98, 103, 113, 114, 116, 117, 118, 121, 124, 128, 129, 131, 147, 151, 153, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 200, 203, 204, 209, 222, 232, 236, 237, 246, 254, 258, 267, 278, 281, 282, 289, 308, 311, 312, 316, 318, 319, 334, 339, 340, 342, 345, 346, 348 и их комбинаций; илиb) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44 любые аминокислотные модификации (a).2. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:1.3. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включаетa) аспарагиновую кислоту (D) в положении, соответствующем аминокислотному положению 2 в SEQ ID NO:1;b) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 12 в SEQ ID NO:1;c) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 16 в SEQ ID NO:1;d) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотномуположению 22 в SEQ ID NO:1;e) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 23 в SEQ ID NO:1;f) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 31 в SEQ ID NO:1;g) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 в SEQ ID NO:1;h) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 43 в SEQ ID NO:1;i) аргинин (R) или лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 50 в SEQ ID NO:1;j) лейцин (L) в положении, с

Claims

1. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с мегануклеазной активностью, при этом указанный полипептид содержит:

a) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:1, выбранному из группы, состоящей из положений 2, 12, 16, 22, 23, 31, 36, 43, 50, 56, 58, 59, 62, 71, 72, 73, 80, 81, 82, 86, 91, 95, 98, 103, 113, 114, 116, 117, 118, 121, 124, 128, 129, 131, 147, 151, 153, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 200, 203, 204, 209, 222, 232, 236, 237, 246, 254, 258, 267, 278, 281, 282, 289, 308, 311, 312, 316, 318, 319, 334, 339, 340, 342, 345, 346, 348 и их комбинаций; или

b) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44 любые аминокислотные модификации (a).

2. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:1.

3. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает

a) аспарагиновую кислоту (D) в положении, соответствующем аминокислотному положению 2 в SEQ ID NO:1;

b) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 12 в SEQ ID NO:1;

c) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 16 в SEQ ID NO:1;

d) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотному

положению 22 в SEQ ID NO:1;

e) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 23 в SEQ ID NO:1;

f) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 31 в SEQ ID NO:1;

g) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 в SEQ ID NO:1;

h) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 43 в SEQ ID NO:1;

i) аргинин (R) или лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 50 в SEQ ID NO:1;

j) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 56 в SEQ ID NO:1;

k) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 58 в SEQ ID NO:1;

l) гистидин (H) или аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 59 в SEQ ID NO:1;

m) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 62 в SEQ ID NO:1;

n) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 71 в SEQ ID NO:1;

o) треонин (T) в положении, соответствующем аминокислотному положению 72 в SEQ ID NO:1;

p) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 73 в SEQ ID NO:1;

q) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 80 в SEQ ID NO:1;

r) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 81 в SEQ ID NO:1;

s) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 82 в SEQ ID NO:1;

t) аспарагиновую кислоту (D) в положении, соответствующем аминокислотному положению 86 в SEQ ID NO:1;

u) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 91 в SEQ ID NO:1;

v) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 95 в SEQ ID NO:1;

w) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 98 в SEQ ID NO:1;

x) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 103 в SEQ ID NO:1;

y) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 113 в SEQ ID NO:1;

z) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 114 в SEQ ID NO:1;

aa) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 116 в SEQ ID NO:1;

bb) глицин (G) в положении, соответствующем аминокислотному положению 117 в SEQ ID NO:1;

cc) треонин (T) в положении, соответствующем аминокислотному положению 118 в SEQ ID NO:1;

dd) глицин (G) в положении, соответствующем аминокислотному положению 121 в SEQ ID NO:1;

ee) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 124 в SEQ ID NO:1;

ff) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотному положению 128 в SEQ ID NO:1;

gg) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 129 в SEQ ID NO:1;

hh) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 131 в SEQ ID NO:1;

ii) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 147 в SEQ ID NO:1;

jj) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 151 в SEQ ID NO:1;

kk) лейцин (L) или метионин (M) в положении, соответствующем аминокислотному положению 153 в SEQ ID NO:1;

ll) триптофан (W) в положении, соответствующем аминокислотному положению 159 в SEQ ID NO:1;

mm) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 160 в SEQ ID NO:1;

nn) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 161 в SEQ ID NO:1;

oo) тирозин (Y) в положении, соответствующем аминокислотному положению 162 в SEQ ID NO:1;

pp) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 163 в SEQ ID NO:1;

qq) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 164 в SEQ ID NO:1;

rr) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 165 в SEQ ID NO:1;

ss) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 166 в SEQ ID NO:1;

tt) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 167 в SEQ ID NO:1;

uu) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 168 в SEQ ID NO:1;

vv) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 169 в SEQ ID NO:1;

ww) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 170 в SEQ ID NO:1;

xx) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 171 в SEQ ID NO:1;

yy) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 172 в SEQ ID NO:1;

zz) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 173 в SEQ ID NO:1;

aaa) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 174 в SEQ ID NO:1;

bbb) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 175 в SEQ ID NO:1;

ccc) глутамин (Q) в положении, соответствующем аминокислотному положению 176 в SEQ ID NO:1;

ddd) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 177 в SEQ ID NO:1;

eee) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 178 в SEQ ID NO:1;

fff) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 179 в SEQ ID NO:1;

ggg) глутамин (Q) в положении, соответствующем аминокислотному положению 180 в SEQ ID NO:1;

hhh) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 182 в SEQ ID NO:1;

iii) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 183 в SEQ ID NO:1;

jjj) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 184 в SEQ ID NO:1;

kkk) треонин (T) или гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 185 в SEQ ID NO:1;

lll) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 186 в SEQ ID NO:1;

mmm) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 187 в SEQ ID NO:1;

nnn) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 188 в SEQ ID NO:1;

ooo) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 189 в SEQ ID NO:1;

ppp) глутамин (Q) в положении, соответствующем аминокислотному положению 190 в SEQ ID NO:1;

qqq) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 191 в SEQ ID NO:1;

rrr) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 194 в SEQ ID NO:1;

sss) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 195 в SEQ ID NO:1;

ttt) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 196 в SEQ ID NO:1;

uuu) фенилаланин (F) в положении, соответствующем аминокислотному положению 197 в SEQ ID NO:1;

vvv) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 200 в SEQ ID NO:1;

www) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 203 в SEQ ID NO:1;

xxx) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 204 в SEQ ID NO:1;

yyy) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотному положению 209 в SEQ ID NO:1;

zzz) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 222 в SEQ ID NO:1;

aaaa) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 232 в SEQ ID NO:1;

bbbb) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 236 в SEQ ID NO:1;

cccc) лейцин (L) или аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 237 в SEQ ID NO:1;

dddd) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 246 в SEQ ID NO:1;

eeee) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 254 в SEQ ID NO:1;

ffff) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 258 в SEQ ID NO:1;

gggg) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 267 в SEQ ID NO:1;

hhhh) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 278 в SEQ ID NO:1;

iiii) тирозин (Y) в положении, соответствующем аминокислотному положению 281 в SEQ ID NO:1;

jjjj) фенилаланин (F) в положении, соответствующем аминокислотному положению 282 в SEQ ID NO:1;

kkkk) треонин (T) в положении, соответствующем аминокислотному положению 289 в SEQ ID NO:1;

llll) глицин (G) в положении, соответствующем аминокислотному положению 308 в SEQ ID NO:1;

mmmm) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 311 в SEQ ID NO:1;

nnnn) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 312 в SEQ ID NO:1;

oooo) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 316 в SEQ ID NO:1;

pppp) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 318 в SEQ ID NO:1

qqqq) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 334 в SEQ ID NO:1;

rrrr) фенилаланин (F) в положении, соответствующем аминокислотному положению 339 в SEQ ID NO:1;

ssss) глицин (G) или лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 340 в SEQ ID NO:1;

tttt) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 342 в SEQ ID NO:1;

uuuu) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 345 в SEQ ID NO:1;

vvvv) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 346 в SEQ ID NO:1;

wwww) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 348 в SEQ ID NO:1; или

xxxx) любую комбинацию из a)-wwww).

4. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, где указанный полипептид дополнительно содержит:

d) серин (S) или аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 19 в SEQ ID NO:1;

e) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотному положению 22 в SEQ ID NO:1;

f) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 23 в SEQ ID NO:1;

g) метионин (M) в положении, соответствующем аминокислотному положению 24 в SEQ ID NO:1;

h) аргинин (R) или аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 28 в SEQ ID NO:1;

i) аргинин (R), аланин (A), глутамин (Q), цистеин (C), глицин (G), серин (S), треонин (T), лейцин (L), глутаминовую кислоту (E) или пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 30 в SEQ ID NO:1;

j) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 31 в SEQ ID NO:1;

k) аргинин (R), аланин (A), лизин (K), глутамин (Q), глицин (G) или лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 32 в SEQ ID NO:1;

l) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 36 в SEQ ID NO:1;

m) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 43 в SEQ ID NO:1;

n) аргинин (R) или лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 50 в SEQ ID NO:1;

o) изолейцин (I) или лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 54 в SEQ ID NO:1;

p) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 56 в SEQ ID NO:1;

q) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 57 в SEQ ID NO:1;

r) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 58 в SEQ ID NO:1;

s) гистидин (H) или аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 59 в SEQ ID NO:1;

t) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 62 в SEQ ID NO:1;

u) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 71 в SEQ ID NO:1;

v) треонин (T) в положении, соответствующем аминокислотному положению 72 в SEQ ID NO:1;

w) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 73 в SEQ ID NO:1;

x) глицин (G) в положении, соответствующем аминокислотному положению 79 в SEQ ID NO:1;

y) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 80 в SEQ ID NO:1;

z) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 81 в SEQ ID NO:1;

aa) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 82 в SEQ ID NO:1;

bb) аспарагиновую кислоту (D) в положении, соответствующем аминокислотному положению 86 в SEQ ID NO:1;

cc) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 87 в SEQ ID NO:1;

dd) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 91 в SEQ ID NO:1;

ee) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 95 в SEQ ID NO:1;

ff) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 98 в SEQ ID NO:1;

gg) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 103 в SEQ ID NO:1;

hh) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 105 в SEQ ID NO:1;

ii) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 111 в SEQ ID NO:1;

jj) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 113 в SEQ ID NO:1;

kk) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 114 в SEQ ID NO:1;

ll) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 116 в SEQ ID NO:1;

mm) глицин (G) в положении, соответствующем аминокислотному положению 117 в SEQ ID NO:1;

nn) треонин (T) в положении, соответствующем аминокислотному положению 118 в SEQ ID NO:1;

oo) глицин (G) в положении, соответствующем аминокислотному положению 121 в SEQ ID NO:1;

pp) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 124 в SEQ ID NO:1;

qq) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотному положению 128 в SEQ ID NO:1;

rr) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 129 в SEQ ID NO:1;

ss) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 131 в SEQ ID NO:1;

tt) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 132 в SEQ ID NO:1;

uu) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 147 в SEQ ID NO:1;

vv) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 151 в SEQ ID NO:1;

ww) лейцин (L) или метионин (M) в положении, соответствующем аминокислотному положению 153 в SEQ ID NO:1;

xx) триптофан (W) в положении, соответствующем аминокислотному положению 159 в SEQ ID NO:1;

yy) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 160 в SEQ ID NO:1;

zz) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 161 в SEQ ID NO:1;

aaa) тирозин (Y) в положении, соответствующем аминокислотному положению 162 в SEQ ID NO:1;

bbb) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 163 в SEQ ID NO:1;

ccc) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 164 в SEQ ID NO:1;

ddd) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 165 в SEQ ID NO:1;

eee) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 166 в SEQ ID NO:1;

fff) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 167 в SEQ ID NO:1;

ggg) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 168 в SEQ ID NO:1;

hhh) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 169 в SEQ ID NO:1;

iii) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 170 в SEQ ID NO:1;

jjj) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 171 в SEQ ID NO:1;

kkk) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 172 в SEQ ID NO:1;

lll) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 173 в SEQ ID NO:1;

mmm) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 174 в SEQ ID NO:1;

nnn) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 175 в SEQ ID NO:1;

ooo) глутамин (Q) в положении, соответствующем аминокислотному положению 176 в SEQ ID NO:1;

ppp) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 177 в SEQ ID NO:1;

qqq) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 178 в SEQ ID NO:1;

rrr) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 179 в SEQ ID NO:1;

sss) глутамин (Q) в положении, соответствующем аминокислотному положению 180 в SEQ ID NO:1;

ttt) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 182 в SEQ ID NO:1;

uuu) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 183 в SEQ ID NO:1;

vvv) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 184 в SEQ ID NO:1;

www) треонин (T) или гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 185 в SEQ ID NO:1;

xxx) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 186 в SEQ ID NO:1;

yyy) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 187 в SEQ ID NO:1;

zzz) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 188 в SEQ ID NO:1;

aaaa) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 189 в SEQ ID NO:1;

bbbb) глутамин (Q) в положении, соответствующем аминокислотному положению 190 в SEQ ID NO:1;

cccc) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 191 в SEQ ID NO:1;

dddd) делецию аминокислоты в положении, соответствующем аминокислотному положению 192 в SEQ ID NO:1;

eeee) пролин (P) в положении, соответствующем аминокислотному положению 194 в SEQ ID NO:1;

ffff) лизин (K) в положении, соответствующем аминокислотному положению 195 в SEQ ID NO:1;

gggg) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 196 в SEQ ID NO:1;

hhhh) фенилаланин (F) в положении, соответствующем аминокислотному положению 197 в SEQ ID NO:1;

iiii) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 200 в SEQ ID NO:1;

jjjj) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 203 в SEQ ID NO:1;

kkkk) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 204 в SEQ ID NO:1;

llll) аланин (A) или серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 206 в SEQ ID NO:1;

mmmm) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотному положению 209 в SEQ ID NO:1;

nnnn) лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 222 в SEQ ID NO:1;

oooo) метионин (M) в положении, соответствующем аминокислотному положению 211 в SEQ ID NO:1;

pppp) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 232 в SEQ ID NO:1;

qqqq) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 236 в SEQ ID NO:1;

rrrr) лейцин (L) или аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 237 в SEQ ID NO:1;

ssss) изолейцин (I) или лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 241 в SEQ ID NO:1;

tttt) глутаминовую кислоту (E) в положении, соответствующем аминокислотному положению 244 в SEQ ID NO:1;

uuuu) гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 246 в SEQ ID NO:1;

vvvv) аспарагиновую кислоту (D) или гистидин (H) в положении, соответствующем аминокислотному положению 253 в SEQ ID NO:1;

wwww) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 254 в SEQ ID NO:1;

xxxx) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 258 в SEQ ID NO:1;

yyyy) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 267 в SEQ ID NO:1;

zzzz) изолейцин (I) в положении, соответствующем аминокислотному положению 278 в SEQ ID NO:1;

aaaaa) тирозин (Y) в положении, соответствующем аминокислотному положению 281 в SEQ ID NO:1;

bbbbb) фенилаланин (F) в положении, соответствующем аминокислотному положению 282 в SEQ ID NO:1;

ccccc) треонин (T) в положении, соответствующем аминокислотному положению 289 в SEQ ID NO:1;

ddddd) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 292 в SEQ ID NO:1;

eeeee) глицин (G) в положении, соответствующем аминокислотному положению 308 в SEQ ID NO:1;

fffff) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 311 в SEQ ID NO:1;

ggggg) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 312 в SEQ ID NO:1;

hhhhh) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 316 в SEQ ID NO:1;

iiiii) аргинин (R) в положении, соответствующем аминокислотному положению 318 в SEQ ID NO:1

jjjjj) валин (V) в положении, соответствующем аминокислотному положению 319 в SEQ ID NO:1;

kkkkk) аланин (A) в положении, соответствующем аминокислотному положению 334 в SEQ ID NO:1;

lllll) фенилаланин (F) в положении, соответствующем аминокислотному положению 339 в SEQ ID NO:1;

mmmmm) глицин (G) или лейцин (L) в положении, соответствующем аминокислотному положению 340 в SEQ ID NO:1;

nnnnn) серин (S) в положении, соответствующем аминокислотному положению 342 в SEQ ID NO:1;

ooooo) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 345 в SEQ ID NO:1;

ppppp) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 346 в SEQ ID NO:1; или

qqqqq) аспарагин (N) в положении, соответствующем аминокислотному положению 348 в SEQ ID NO:1; или

rrrrr) любую комбинацию из a)-qqqqq).

5. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 251, 252, 253, 272, 273, 274, 275, 272, 273, 274, 275, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 430, 431, 432 и 433.

6. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, где полипептид способен распознавать и расщеплять последовательность распознавания мегануклеазой, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:423 или SEQ ID NO:424.

7. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, где указанный полипептид характеризуется повышенной мегануклеазной активностью по сравнению с контрольной мегануклеазой, не имеющей указанной аминокислотной модификации.

8. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 7, где указанная контрольная мегануклеаза выбрана из группы SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:429 или SEQ ID NO:435.

9. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 7, где повышенная мегануклеазная активность подтверждается по:

a) более высокому количественному показателю в анализе дрожжей по сравнению с контрольной мегануклеазой, не имеющей указанной аминокислотной модификации; или

b) более высокой частоте мутаций в целевом сайте по сравнению с контрольной мегануклеазой, не имеющей указанной аминокислотной модификации; или

c) большей степени разрезания in vitro по сравнению с контрольной мегануклеазой, не имеющей указанной аминокислотной модификации; или

d) любой комбинации (a), (b) и (c).

10. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, дополнительно содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую N-концевой транзитный пептид, кодируемый в ядре.

11. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, дополнительно содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую C-концевую гистидиновую метку.

12. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 7, где повышенная мегануклеазная активность определяется при 16ºC, 24ºC, 28ºC, 30ºC или 37ºC.

13. Рекомбинантный ДНК-конструкт, содержащий выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1.

14. Рекомбинантный ДНК-конструкт по п. 13, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.

15. Рекомбинантный ДНК-конструкт по п. 14, где указанный промотор является гетерологичным по отношению к указанному полинуклеотиду или указанный промотор является гомологичным по отношению к указанному полинуклеотиду.

16. Клетка, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид по п. 1 или рекомбинантный ДНК-конструкт по п. 13, отличающаяся тем, что указанный полинуклеотид является гетерологичным по отношению к клетке.

17. Клетка по п. 16, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой дрожжевую клетку.

18. Клетка по п. 16, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой растительную клетку.

19. Клетка по п. 16, отличающаяся тем, что указанный полинуклеотид или указанный рекомбинантный ДНК-конструкт стабильно включен в геном указанной растительной клетки.

20. Клетка по п. 16, отличающаяся тем, что указанный полинуклеотид или указанный рекомбинантный ДНК-конструкт стабильно включен в геном хлоропластов указанной растительной клетки.

21. Клетка по п. 18, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка получена из однодольного растения.

22. Клетка по п. 21, отличающаяся тем, что указанное однодольное растение представляет собой маис, пшеницу, рис, ячмень, сахарный тростник, сорго или рожь.

23. Клетка по п. 18, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка получена из двудольного растения.

24. Клетка по п. 23, отличающаяся тем, что двудольное растение представляет собой сою, Brassica, подсолнечник, хлопчатник или люцерну.

25. Растение, содержащее растительную клетку по п. 18.

26. Эксплантат растения, содержащий растительную клетку по п. 18.

27. Растение, эксплантат или растительная клетка по п. 26, где указанные растение, эксплантат или растительная клетка проявляет повышенную мегануклеазную активность по сравнению с растением, эксплантатом или растительной клеткой из того же вида, линии или сорта, которые не содержат по меньшей мере один полинуклеотид по п. 1.

28. Трансгенное семя, продуцируемое растением по п. 25.

29. Выделенный полипептид, характеризующийся мегануклеазной активностью, при этом указанный полипептид содержит:

30. Выделенный полипептид по п. 29, где указанный полипептид обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательности по отношению к SEQ ID NO:1.

31. Выделенный полипептид по п. 29, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает:

d) цистеин (C) в положении, соответствующем аминокислотному положению 22 в SEQ ID NO:1;

xxxx) любую комбинацию из a)-wwww).

32. Выделенный полипептид по п. 29, где указанный полипептид дополнительно содержит:

rrrrr) любую комбинацию из a)-qqqqq).

33. Выделенный полипептид по п. 29, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 251, 252, 253, 272, 273, 274, 275, 272, 273, 274, 275, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 430, 431, 432 и 433.

34. Выделенный полипептид по п. 29, где полипептид способен распознавать и расщеплять сайты распознавания мегануклеазой, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:423 или SEQ ID NO:424.

35. Выделенный полипептид по п. 29, где указанный полипептид характеризуется повышенной мегануклеазной активностью по сравнению с контрольной мегануклеазой, не имеющей указанной аминокислотной модификации.

36. Выделенный полипептид по п. 29, где указанная контрольная мегануклеаза выбрана из группы SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:429 или SEQ ID NO:435.

37. Выделенный полипептид по п. 29, где повышенная мегануклеазная активность подтверждается по:

d) любой комбинации (a), (b) и (c).

38. Композиция, содержащая по меньшей мере один или несколько полипептидов по п. 29.

39. Способ получения мегануклеазы, характеризующейся повышенной активностью в диапазоне температур, при этом способ включает:

a) получение варианта мегануклеазы путем модификации по меньшей мере одной аминокислоты в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:1, выбранному из группы, состоящей из положений 2, 12, 16, 22, 23, 31, 36, 43, 50, 56, 58, 59, 62, 71, 72, 73, 80, 81, 82, 86, 91, 95, 98, 103, 113, 114, 116, 117, 118, 121, 124, 128, 129, 131, 147, 151, 153, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 200, 203, 204, 209, 222, 232, 236, 237, 246, 254, 258, 267, 278, 281, 282, 289, 308, 311, 312, 316, 318, 319, 334, 339, 340, 342, 345, 346, 348 и их комбинаций; и

b) отбор указанного варианта мегануклеазы, полученного на этапе a), и скрининг указанного варианта мегануклеазы в отношении способности к расщеплению целевой последовательности ДНК в диапазоне температур от 16ºC до 37ºC, включающем данные значения.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанный диапазон температур включает:

a) 16ºC;

b) 18ºC;

c) 20ºC;

d) 24ºC;

e) 28ºC;

f) 30ºC;

g) 37ºC или

h) любую комбинацию a), b), c), d), e), f), h), g) и g).

41. Способ получения мегануклеазы, характеризующейся повышенной мегануклеазной активностью по сравнению с контрольной мегануклеазой, при этом способ включает:

b) отбор варианта мегануклеазы, полученного на этапе a), и скрининг указанного варианта в отношении повышенной мегануклеазной активности по сравнению с контрольной мегануклеазой.

42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что повышенная мегануклеазная активность подтверждается по:

d) любой комбинации (a), (b) и (c).

43. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 1, где указанный полипептид с мегануклеазной активностью содержит линкерный полипептид, где указанный линкерный полипептид содержит:

a) SEQ ID NO:420;

b) SEQ ID NO:421;

c) SEQ ID NO:422 или

d) аминокислотную последовательность, состоящую из любых возможных аминокислот в положениях, соответствующих положениям 156-193 SEQ ID NO:1.

44. Композиция, содержащая по меньшей мере один или несколько полинуклеотидов по п. 1.

45. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:1, выбранному из группы, состоящей из положений 16, 22, 50, 56, 59, 71, 81, 103, 121, 153, 185, 209, 222, 246, 258, 281, 308, 316, 345, 346 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:2.

46. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 45, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:1.

47. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 45, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает любую из аминокислотных модификаций, показанных на фигурах 5A-5C.

48. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 45, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38.

49. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:86, выбранному из группы, состоящей из положений 2, 12, 16, 22, 23, 36, 43, 50, 56, 58, 59, 72, 73, 81, 86, 91, 95, 103, 113, 114, 120, 121, 124, 128, 129, 131, 151, 153, 200, 204, 209, 232, 236, 237, 246, 254, 258, 267, 281, 308, 311, 312, 316, 319, 334, 339, 340, 342 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:85.

50. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 49, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:86.

51. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 49, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает любую из аминокислотных модификаций, показанных на фигурах 9A-9D.

52. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 49, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 251, 252 и 253.

53. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:270, выбранному из группы, состоящей из положений 16, 22, 50, 71, 185, 246, 258, 316 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:269.

54. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 53, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:272, 273, 274 и 275.

55. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:282, выбранному из группы, состоящей из положений 12, 16, 22, 31, 50, 56, 59, 62, 81, 98, 103, 105, 116, 118, 121, 153, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 258, 281, 308, 312, 316, 319 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:281.

56. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 55, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:282.

57. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 55, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает любую из аминокислотных модификаций, показанных на фигурах 10A-10C.

58. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 55, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297 и 298.

59. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:329, выбранному из группы, состоящей из положений 12, 32, 50, 56, 80, 105, 124, 129, 131, 153, 185, 311, 316, 318, 340 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:328.

60. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 59, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:329.

61. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 59, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает любую из аминокислотных модификаций, показанных на фигуре 11.

62. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 59, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 и 341.

63. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:356, выбранному из группы, состоящей из положений 12, 24, 36, 50, 56, 62, 73, 80, 124, 129, 147, 182, 203, 237, 252, 311, 316, 318, 340, 348 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:355.

64. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 63, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:356.

65. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 63, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает любую из аминокислотных модификаций, показанных на фигуре 12.

66. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 63, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370 и 371.

67. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:389, выбранному из группы, состоящей из положений 12, 50, 56, 124, 129, 131, 153, 211, 237, 311, 316 и положения 318 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:388.

68. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 67, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности к SEQ ID NO:389.

69. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 67, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная модификация включает любую из аминокислотных модификаций, показанных на фигуре 13.

70. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 67, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402 и 403.

72. Дрожжи, растение, растительная клетка, эксплантат или семя, содержащие мегануклеазу, созданную с помощью способа по пп. 36-42.

73. Способ внесения двухцепочечного разрыва в геном дрожжевой или растительной клетки, при этом указанный способ включает:

a) приведение по меньшей мере одной растительной или дрожжевой клетки, содержащей в своем геноме сайт распознавания мегануклеазами, в контакт с вариантом полипептида c мегануклеазной активностью, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 251, 252, 253, 272, 273, 274, 275, 272, 273, 274, 275, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402 и 403, где вариант мегануклеазы способен индуцировать двухцепочечный разрыв в указанном сайте распознавания; и

b) отбор дрожжевой или растительной клетки из a) и скрининг указанной дрожжевой или растительной клетки в отношении любой модификации указанной последовательности распознавания.

74. Способ интеграции полинуклеотида, представляющего интерес, в сайт распознавания в геноме растительной или дрожжевой клетки, при этом способ включает:

a) приведение по меньшей мере одной растительной или дрожжевой клетки, содержащей в своем геноме сайт распознавания мегануклеазой, в контакт с:

(i) вариантом полипептида с мегануклеазной активностью, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 251, 252, 253, 272, 273, 274, 275, 272, 273, 274, 275, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402 и 403,

где вариант мегануклеазы способен к индукции двухцепочечного разрыва в указанном сайте распознавания; и

(ii) фрагментом ДНК, содержащим полинуклеотид, представляющий интерес;

b) отбор по меньшей мере одной растительной или дрожжевой клетки, включающий интеграцию кассеты с полинуклеотидом, представляющим интерес, в сайт распознавания.

75. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в аминокислотном положении, соответствующем положению в SEQ ID NO:429, выбранному из группы, состоящей из положений 16, 22, 50, 71, 185, 246, 258, 316 и их комбинаций, и где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:423.

76. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид по п. 75, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с мегануклеазной активностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:430, 431 и 432.

77. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид с мегануклеазной активностью с SEQ ID NO:436, где полипептид способен распознавать и расщеплять целевой сайт для мегануклеазы, содержащий SEQ ID NO:424.