KR100501838B1 - 새로운 대사 경로를 만들고 이를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 분자를 만들고 이를 스크린하는 신규한 약물 개발 시스템에 관계한다. 시스템은 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리에서 다양한 종으로 부터 유전물질을 혼합하고 클로닝하는 방법을 제공하여 새로운 대사경로와 화합물을 만든다. 시스템은 또한 이와같은 새로운 경로와 화합물을 만들 수 있는 라이브러리를 포함하는 숙주 유기체를 존재-스크리닝 하고 확인하는 방법에 관련된다. 숙주 유기체는 특정질병에 대한 약물 스크리닝에 유용하고 관심이 가는 화합물의 생산에도 유용하다. 본 발명의 방법은 공지의 또는 가망 원료인 유기체 게놈을 보조하는데에도 유용하다.

Description

새로운 대사 경로를 만들고 이를 스크리닝하는 방법{METHODS FOR GENERATING AND SCREENING NOVERL METABOLIC PATHWAYS}
1. 기술분야
본 발명은 약물 개발에 대한 새로운 방식에 관계한다. 구체적으로 본 발명은 약물의 우수한 재료 또는 전망있는 재료가 되는 유기체의 게놈을 유지하고; 새로운 대사 경로를 만들 수 있는 유기체중 하나 이상의 종에서 유전물질을 무작위로 복합시키고; 새로운 생화학 경로의 생성과 새로운 종류의 화합물을 생산하기 위한 유전공학적으로 조작된 세포를 사전-스크리닝 또는 스크리닝하는 시스템에 관계한다. 새로운 또는 재구성된 대사경로는 화합물의 대량 생산에 유용하다.
2. 종래 기술
2.1. 선두 약물의 원료
약물 개발에 기본적인 시도는 원하는 활성을 가지는 선두약물을 확인하고 추가 약물 개발을 진행하는데 요구되는 기준에 맞는 모범적인 화합물을 최적화시키는 것이다. 약물 개발을 위한 통상적인 방법중에 하는 생검에서 질병(표적 질병)의 원인이 되는데 복합된 거대분자를 제시하는 것과 연관이 있는데 잠재적인 가능성이 있는 추천약물은 치료활성에 대해 테스트받는다. 이와 같은 거대분자에는 수용체, 효소 또는 전사 인자 등이 있다.
또 다른 방법으로는 질병의 원인이 되는 물질의 대표적인 전체 세포 또는 유기체를 제시하는 것이다. 이와 같은 물질에는 세균 및 종양 세포주 등을 포함한다.
전통적으로, 잠재적인 가능성이 있는 추천 약물로는 두 가지 원료가 있는데 하나는 천연 생성물과 합성 화합물이 된다. 예시적인 화합물의 확인은 가능한 광범위한 구조형태를 포함한 무작위로 수집된 것을 스크리닝하여 이루어진다. 합성된 복합 화합적 라이브러리의 최근 개발로 인하여 스크리닝에 이용할 수 있는 다양한 종류의 화합물의 추가 증가되고 있다. 그러나, 임의 합성된 화학 라이브러리에서 다양성은 사람의 상상과 합성기술등으로 제한을 받고 있다.
지구상의 세균, 곰팡이, 무척추동물 및 식물과 같은 원료로부터 천연 생성물의 무작위 스크리닝으로 인하여 많은 중요한 약물이 개발되어 왔다(Franco et al. 1991, Critical Rev Biotechnol 11:193-276; Goodfellow et al. 1989, in "Microbial Products: New Approaches", Cambridge University Press, pp. 343- 383; Berdy 1974, Adv Appl Microbiol 18:309-406; Suffness et al. 1988 in Biomedical Importance of Marine Organisms, D.G. Fautin, California Academy of Sciences, Pages 151-157). 이들 천연 생성물중 10,000개 이상이 생물학적으로 활성이 있고, 이들중 적어도 100개는 현재 항생제, 농화학 분야와 항암제로 이용되고 있다. 약물 개발에 있어 이와 같은 접근방식의 성공여부는 얼마나 많은 화합물이 스크리닝 프로그램에 참여하였는가에 있다. 일반적으로 제약회사는 수십만종의 천연 및 합성 화합물을 포함하는 화합물 컬렉션을 스크리닝 한다. 그러나, 기존 개발된 화합물에 대한 신규 화합물의 비율은 시간이 지남에 따라 감소한다. 예를들면 항-암제에 대한 스크리닝에서 예를 들면 항-암제에 대한 스크리닝에서 생물학적으로 활성이 있는 대부분 미생물 종이 이미 특징화된 화합물을 생산한다. 부분적인 이유는 신규한 천연 생성물 샘플을 지속적이고 적절하게 발견하고, 재상산하고, 공급하는데 어려움이 있기 때문이다. 생물학적 다양성은 대개 분자의 다양성으로 인한 것이기 때문에 무작위 스크리닝에 대해 현재 선택된 유기체에서 생물학적 다양성이 불충분하고 이는 신규한 화합물을 분리해낼 가능성이 감소되는 원인이 된다.
다양한 천연 원료로부터 신규한 생활성이 지속적으로 발견된다(Cragg et al., 1994. (in "Enthnobotany and the search for new drugs" Wiley, Chichester. p178-196). 신규한 예시적인 약물로 완전히 조직적으로 계발되는 것은 얼마 없다. 예를 들면 단지 5,000개 식물종이 의료용으로 이용가능성에 대해 조사된 것으로 밝혀졌다. 이는 열대지방에서 생장하는 250,000-3,000,000 종의 일부에 지나지 않는다(Abelson 1990, Science 247:513). 또한, 평가된 수만종의 해양 미생물중 단지 소수만이 특성에 대해 밝혀졌다. 또한, 예시적인 화합물로 아직 이용되지 않은 수많은 생체 다양성이 있다.
천연 생성물의 원료로 토양 미생물, 곰팡이, 무척추동물 및 식물이 전통적으로 이용되어 왔다. 그러나 약물 개발과 대량생산을 위해 개발되어온 악티노마이세츠(Actinomycetes)와 같은 몇몇 연구가 활발히 이루어진 것을 제외하고는 재생성과 생산성에 여전히 문제가 있다. 예를 들면, 항-종양제인 탁솔(taxol)은 태평양 주목 나무 수피의 성분으로 임상적인 용도로 이를 공급함으로써 지역적인 생태계의 손상에 대해 우려를 낳고 있다. 탁솔에는 11개 키랄 중심이 있고 2048개의 예상 가능한 디아스테레오머형을 포함하여 대규모로 이를 합성하는 것은 바람직하지 못하다(Phillipson, 1994, Trans Royal Soc Trop Med Hyg 88 Supp 1:17-19).
해양 무척추동물은 신규한 화합물의 가망 원료이나 약물 스크리닝과 대규모 공급 기술에 있어 여전히 약점이 있다. 예를 들면, 해양 무척추동물은 수집에 어렵고 천연 생성물에는 많은 계절적인 가변성이 있기 때문이다.
해양 무척추동물은 신규한 화합물의 가망 원료이나 약물 스크리닝과 대규모 공급 기술에 있어 여전히 약점이 있다. 예를들면, 해양 무척추동물은 수집에 어렵고 천연 생성물에는 많은 계절적인 가변성이 있기 때문이다. 그리고 대부분이 특정 영양 요구성을 가진다. 오염 안된 해수 등이 발효에 일반적인 필수조건이다. 해양 미생물중 적어도 99%가 실험실 배지에서는 생존할 수 없는 것으로 알려져 있다. 또한, 현재 이용할 수 있는 상업적인 배양장비는 염 상태에서 또는 고압에서 사용하기에는 적절하지 못하다.
또한, 특정 화합물은 특정 유기체가 서로 상호작용하고 환경과 맞을 때에만 고유 특성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
병인성 물질은 식물 유전자 발현을 변경시켜 피토알렉신과 같은 화합물의 합성을 자극하여 식물이 병인성 물질의 공격으로부터 저항할 수 있게 한다. 예를 들면, 야생 타바코 식물 니코티아나 실베스트리스(Nicotaiana sylvestris)는 만두카 섹타 유충으로부터 공격을 받을 때 알칼로이드의 합성을 증가시킨다. 이와 유사하게 곰팡이는 피토알렉신에 반응성이 있어 이의 누적을 방지하거나 해독시킨다. 이와 같은 대사작용은 막대한 량의 스크린에서 빠질 수도 있고 숙주 식물과 함께 있는 곰팡이에 대해 평가하지 않을 수도 있다. 유기체에서 자연적으로 환경의 영향에서 극적인 경우는 독침이 있는 개구리에서 볼 수 있다. 견본의 신이 있는 등을 가로질러 침끝을 문지르면 나트륨 채널 동근 알칼로이드, 바트라취톡신 치사량이 나오고, 바트라취톡신은 2세대 자연적으로 양육된 개구리에서는 감지되지 않는다(Daly, 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. 92:9-13). 통상적인 약물 스크리닝 기술만이 적용되는 경우에 이와 같은 잠재적으로 가치가 있는 분자들은 절대로 발견되지 않는다.
또한, 무작위적인 스크리닝을 통하여 발견된 선두 화합물은 거의 약물이 될 수 없는데 그 이유는 능력, 선택성, 생체적응성 또는 안정성등이 부적절하기 때문이다. 고유 활성을 개선시키기 위한 구조적으로 변형시키기 위해서는 다량의 선두 화합물이 필요하다. 그러나, 식물과 같은 천연 원료로부터 선두 화합물의 합성 및 개발에 대한 현행 방법은 상대적으로 효과가 적다. 수집, 약물을 생산하는 유기체의 생장, 복제금지, 균주 개발, 배지 개선 및 대량생산과 같은 다양한 약물 개발단계와 연관된 상당한 장애물이 있다. 이와 같은 문제점으로 인하여 신규 화합물의 임상적인 테스트를 지연시키고 선두 약물의 새로운 원료를 이용하는 경쟁성에 영향을 가진다.
현재, 천연 생성물의 전술한 해양, 식물 및 동물 원료 등이 이용되지 않고 있다. 선두 화합물을 생산하고 스크리닝하는 현재 이용할 수 있는 방법은 개발된 원료하에서 적절히 효과적으로 이용할 수는 없다. 일부 토양 미생물과 곰팡이와는 달리 이와같은 약물을 생산하는 유기체는 산업적인 발효기술에 바로 적응할 수 없다. 동시에 새로운 고-효율 및 다량 스크리닝 기술에 의해 약물로써의 새로운 원료 개발에 대한 요구가 강해지고 있다. 따라서, 약물 개발을 목적으로 하는 화합물의 원료가 이용되지 않고 있기 때문에 이들의 화학적인 다양성 및 유전적 자료를 이용하는 방법이 요구된다.
2.2. 발현 라이브러리
최근에 약물 개발 프로그램은 메카니즘 기초한 개발 스크리닝으로 전환되었다. 일단 표적 분자가 확인되며(예로써 질병을 조절하는데 연관된 호르몬 수용체) 검사방법은 분자 수준에서 표적과 상호 작용하는 치료요법적 물질의 확인 및 합성하는 것에 초점을 둔다.
표적분자를 확인하고, 조사하고 생산하는데 유전자 발현 라이브러리가 이용된다. 발현 클로닝은 단백질의 물리적 성질을 몰과도 단일 단백질을 인코드하는 표적 유전자를 얻을 수 있는 통상적인 방법이다.
사람 포유류 조직에서 준비된 유전자 발현 라이브러리를 스크린하여 확인된 많은 단백질은 잠재적인 질병 표적 예로써 수용체(Simonsen et al. 1994, Trends Pharmacol Sci 15:437-441; Nakayama et al. 1992, Curr Opin Biotechnol 3:497- 505; Aruffo, 1991, Curr Opin Biotechnol, 2:735-741) 와 시그날-유도 단백질(Margolis et al., US 5,434,064)이다. (Seed et al., 1987, Proc Natl Acad Sci 84:3365-3369; Yamasaki et al., 1988, Science 241:825-828; and Lin et al., 1992, Cell 68:775-785(type III TGF-β receptor). 예를 들면 포유류 세포에서 기능적인 발현 클로닝에 의해 확인된 단백질 등이 있다.
일단, 질병 표적이 확인이 확인되면, 단백질 표면 또는 단백질 표적을 발현할 수 있는 조작된 숙주 세포는 선두 화합물에 대해 스크린하기 위한 생물학적 검사에 이용된다(Luyten et al. 1993, Trends Biotechnol 11:247-54). 따라서, 약물 개발 과정 내에서 가능성이 있는 단백질 질병 표적의 확인 및 생산에 대해 유전자 발현 라이브러리의 이용이 상당히 제한을 받게 된다. 약물이 단백질 또는 항생제와 같은 작은 펩티드의 경우에 원하는 생물학적 활성을 가지는 분자를 만들고 스크린 하기 위해서는 발현 라이브러리를 준비해야 한다(Huse et al. 1991, Ciab Foundation Symp 159:91-102).
그러나, 약물 개발과 연관된 유전자 발현 라이브러리의 다른 이용도도 있다. 미생물의 유전자 라이브러리는 의학적인 활성이 있는 대사물질 및 특정 화합물질을 생산하는 생합성 경로에 관계되는 유전자를 확인하기 위한 목적으로 준비한다. 이와 같은 경로에는 약물 표적으로 이용되는 단일 단백질보다 더 큰 복합성을 가지는 다중 단백질(특히, 효소)을 요구한다. 예를 들면 박테리아성 폴리케티드 합성효소(PKSs)의 유전자 인코딩 경로는 유기체의 유전자 라이브러리 스크리닝에 의해 확인되었다(Malpartida et al. 1984, Nature 309-46; Donadio et al. 1991, Science 252:675-679). PKSs 는 치료요법적 화합물의 중요한 종류인 폴리펩티드의 생합성을 촉매하고, 생산된 폴리펩티드의 구조적 다양성을 조절한다. 스트렙토마이세스에서 숙주-벡터 시스템이 개발되어 직접 돌연변이가 가능하고 클론된 PKS 유전자의 발현도 가능하다(McDaniel et al. 1993, Science 262:1546-1550; Kao et al. 1994, Science 265:509-512). 이와 같은 특정 숙주-벡터 시스템은 폴리펩이트를 생산하는 보다 효과적인 방법은 개발하고, 신규한 폴리펩티드를 개발하는데 이용된다(Khosla et al. WO 95/08548).
또다른 예로는 대장균 숙주의 발효에 의해 염료 염색제, 인디고를 생산하는 것이다. 다중 효소 생합성 경로를 인코드하는 유전자를 포함하는 두 개 오페론은 외부 대장균 숙주에 의해 인디고 생산을 개선하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다(Ensley et al. 1983, Science 222:167-169; Murdock et al. 1993, Bio/Techno -logy 11:381-386). 전반적으로 대사경로를 인코드하는 유전자의 이형 발현의 통상적인 연구는 이미 밝혀진 대사 경로에 관련된 것으로 알려진 단백질을 인코드하는 특정 유전자의 직접 클로닝, 서열 분석, 고의적 돌연변이 및 재배열과 관계한다.
약물 표적의 확인 및 질병 기작을 이해하는데 있어 상당한 진보에 있어 선두 화합물의 신속한 확인 및 임상적인 테스트를 위해 이를 이용하는 새로운 전력과 방법의 필요성이 증가되고 있다.
3. 발명의 요약
본 발명은 약물 개발을 목적으로 하는 분자 다양성을 유발하고 이를 스크리닝하는 약물 개발 시스템을 제공한다. 본 발명의 방법은 선두 약물의 원료로 알려진 또는 가망이 있는 유기체의 유전 물질과 유전자 발현 라이브러리를 획득하고 보존하는 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 미생물, 식물 및 동물을 포함하는 특히 자연상태에서 실질적인 양으로 회수할 수 없거나 실험실에서 배양할 수 없는 제공 미생물종으로부터 복합적인 천연 경로 유전자 발현 라이브러리를 만든다. 수집된 제공 미생물은 이들의 알려진 생물학적 성질을 기초로 하여 선별하거나 자연에서 수집된 미확인된 유기체종 또는 확인된 유기체 혼합물이 될 수도 있다. 제공 미생물의 게놈의 무작위 단편을 클론하는데 일부는 전체 생화학 경로 또는 이의 일부를 포함하는 것일 수도 있으며, 클론된 것은 숙주 유기체에서 발현시킨다.
본 발명에 따르면, 옮겨진 DNA 의 유전자 생성물 서브세트는 숙주 유기체에서 기능을 할 수 있다. 제공 유기체의 천연 발생경로는 숙주 유기체내에서 재구성될 수도 있다. 비상동 숙주의 상이한 생리학적 조절 환경에서 제공 유전자의 발현을 밝힐 수 있다. 제공 유기체의 대사 경로는 숙주 유기체에 있는 대사 경로와 상호 작용하여 신규 화합물 또는 숙주 유기체에 의해 보통 생산되지 않은 화합물을 만든다.
또한, 임의 시간대에 제공 유기체의 한정된 서브세트만 숙주 유기체에서 발현되기 때문에 숙주 유기체의 이미 밝혀진 생물학적/세포 배경에 기초하여 대사 경로와 화합물을 더욱 용이하게 감지할 수 있게 한다. 필수적으로는, 이와 같은 제공 유기체의 유전적 원료는 상이한 약물 개발 프로그램에서 복제될 수 있고 반복적으로 이용될 수 있는 유전자 발현 라이브러리에 포함되어 유지된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 복합적인 키메라 경로 발현 라이브러리 구성과 연관되는데 이때 제공 유기체의 하나이상의 종으로부터 유도된 유전물질은 무작위로 복합시키고, 숙주 시스템에서 클론시키고 발현시킨다. 이와 같은 라이브러리는 다중 경로와 유기체로부터 무작위로 복합된 유전자를 발생시키고 이는 자연 상태에서는 존재하지 않은 대사 경로의 유전자를 만들게 된다. "별도의 유전자 세트"란 복합적인 유전자 발현 라이브러리에서 하나이상의 경로 또는 유기체로부터 유전자 결합에 의해 수득된 두 개 이상의 유전자 집합을 말한다. 다수의 유전자 생성물이 숙주 시스템에서 기능을 가질 수 있는데 이때 새로운 종류의 화합물을 만드는 신규한 키메라 대사경로를 만들기위해 상호 작용한다. 따라서, 약물 스크리닝을 위해 이용될 수 있는 분자 구조의 다양성은 복합적인 키메라 유전자 발현 라이브러리에서 현존 경로와 유기체의 유전자 물질을 혼합하여 증가될 수도 있다.
유전자 발현 라이브러리를 스크리닝하는 표준 방법이 이용될 수도 있고 라이브러리는 바람직한 경로와 대사 생성물을 발현하는 클론을 확인하도록 맞추어진 보고된 양생법과 결합시켜 수정될 수도 있다. 특정 구체예에서, 숙주 유기체는 발현 라이브러리에서 감지될 수도 있는 바람직한 종류의 대사물질에 반응하는 화학 반응성 프로모터와 작동식으로 연합된 리포터 단백질을 인코드하는 유전자를 포함하도록 조작할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 숙주 유기체는 찾은 경로에서 생산된 화합물에 의해 리포터 분자로 직접 또는 간접적으로 전환될 수 있는 리포터 분자의 선구물질인 생리학적 프로브에 노출시킬 수도 있다. 리포터 발현의 활성화 또는 리포터 선구 물질의 전환은 바람직한 클론의 확인 및 분리를 가능하도록 시그날은 생성한다.
본 발명은 또 다른 구체예에서 라이브러리에 있는 숙주 유기체는 항-감염성에 대한 병인성 물질 또는 항종양 물질에 대한 암세포와 같은 바람직한 화합물에 대한 표적 자체 또는 검사를 포함하는 리포터 섭생 또는 또다른 지시 세포형과 함께 반-고형 매트릭스에 끼워 넣을 수 있다. 복합적인 유전자 발현 라이브러리가 있는 바람직한 유기체를 확인하고 분리하기 위해서 마크로드로플렛 소팅, 형광 활성화된 세포 소팅 또는 자성 활성화된 세포소팅과 같은 상당량의 스크리닝 공정이 이용될 수 있다.
양성 클론을 신규화합물의 생산에 대해 추가 분석할 수 있다. 신규 화합물의 생산을 유도하는 대사경로의 유전학적 및 생화학은 분리된 클로내로 도입되는 유전자 물질을 특징화시킴으로써 윤곽이 잡힐 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 유기체, 지시 세포 및 리포터 섭생으로 구성된 조성물, 다른 독성 화합물의 생산을 위해 수정된 숙주 유기체, 특정 형태의 리포터 시스템을 포함하는 복합적인 유전자 발현 라이브러리, 특이적인 복합 유전자 발현 라이브러리, 숙주유기체를 만드는데 유용한 재조합 DNA 벡터에 관계한다.
3.1. 정의
여기에서 사용된 용어는 다음과 같은 의미를 가진다.
"복합적 천연 경로 발현 라이브러리"는 다수 종의 제공 유기체로부터 유도된 유전물질에서 만들 발현 구조 라이브러리로써, 유전물질에 있는 유전자는 적절한 숙주 유기체에 있는 유전자 발현은 유도할 수 있는 조절 부위와 작동 시에 연합된다. 복합 발현 라이브러리는 제공 유기체의 기능적인 유전자 생성물을 만들 수 있는 숙주 유기체를 이용한다. 각 숙주 유기체에서 유전자 물질은 제공 유기체들 중 하나로부터 나온 자연 발생적인 생화학 경로 또는 이의 일부를 인코드한다.
"복합 키메라 경로 발현 라이브러리"는 하나이상의 제공 유기체로부터 유도된 무작위로 결합된 유전물질에서 준비된 발현 구조체 라이브러리로 이때 유전물질에 있는 운전자는 적절한 숙주 유기체에 있는 유전자 발현을 유도할 수 있는 조절부분과 작동 시에 연합된다. 사용된 숙주 유기체는 제공 유기체의 기능적인 유전자 생성물을 생산할 수 있다.
"편향된 복합 유전자 발현 라이브러리"는 특정 성질에 대해 미리 선택된 하나이상의 제공 유기체로부터 구한 유전물질에서 만들어진 발현 구조체 라이브러리이다. 미리 선택된 유전물질은 복합 자연 경로 또는 키메라 라이브러리를 만드는데 이용될 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "라이브러리"는 발현구조 또는 발현구조를 포함하는 숙주 유기체를 말한다.
"생화학 경로", "천연 경로" 및 "대사경로"는 유기체에 의해 실행되는 관련된 생화학 반응을 모두 포함한다. 이와 같은 경로에는 생합성 또는 생분해 경로 또는 에너지 생산 또는 전환경로를 포함하나 이에 한정시키지 않는다.
"화합물"은 생화학 경로의 생성물 또는 부산물로써 다수의 유전자 생성물의 상호작용 산물이다.
"활성"은 소요의 화합물이 생산되게 되는 일련의 생화학 반응을 실행하기 위한 숙주 유기체의 능력이다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, 다음의 약어는 아래와 같이 사용된다;
eq(등가량); M(몰라량); μM(마이크로몰과); nmol(나노몰); kg(킬로그램); gm(그램); mg(밀리그램); ㎍(마이크로그램); ng(나노그램); L(리터); mL(밀리리터); ㎕(마이크로리터); vol(용적); s(초); ℃(섭씨).
또한, 다음과 같은 약어가 이용되었다. cfu: 콜로니 형성 단위; LB: 라우리 배지; ddH2O: 이중 증류된, 역삼투 정제된 물; sea H2O: 여과된 태평양 해수; SSW: 합성된 해수; FACS: 형광-활성화된 세포 소팅; GFP: 아에쿠오리아 빅토리아 그린 형광 단백질; kbp: 킬로베이스염기쌍; g: 중력; rpm: 분당 회전수; CIAP: 송아지 내지 알칼리 포스포타제; EDTA: 에틸렌디아민 테트라아세트산 ; TE: 10mM 트리스/1.5mM EDTA pH 7.4 ; PEG: 폴리에틸렌 글리콜; E.col: 대장균; CHO: 차이니즈 헴스터 난; S. 크레비시아: 사카로마이세스 크레비시아; A. 니듈란; 아스퍼질러스 니듈란; S. 폼비: 쉬조사카로마이세스 폼비; S. 리비단스: 스트렙토마이세스 리비단스; S. 아우레우스: 스타필로코커스 아우레우스; S. 코엘리콜라: 스트렙토마이세스 코엘리콜라; B. 서브틸리스: 바실러스 서브틸리스; BAC: 박테리아 인공 염색체; YAC: 이스트 인공 염색체; PCR: 중합효소 사슬 반응; CaMV: 양배추 모자이크 바이러스; AcNPV: 오토그라파 칼리포르니카 뉴클리아 폴리하이드로시스 바이러스: EBV: 입스타인-바 바이러스; SDS: 소듐 도데실 설페이트; CsCl: 염화 세슘
본 발명은 자연상태에 유전 원료의 다양성을 얻고 이를 보존하고 수득한 유전적 원료를 다양한 화학적 구조로 해독하고 확장시키는 방법과 조성물을 제공하는 약물 개발 시스템에 관계한다. 본 발명은 또한 바람직한 활성과 화합물을 스크리닝한다.
좀더 구체적으로는, 본 발명은 복합 유전자 발현 라이브러리를 만들고 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이들 라이브러리는 다양한 종의 유전자 생성물의 무작위 분류로 구성되는데 일부 경우에 발현 숙주에서 서로 상호작용을 할 수 있고, 일부 경우에는 새로운 생화학 경로 또는 새로운 종류의 화합물을 생산하게 된다. 또한, 본 발명의 라이브러리는 분자 다양성을 쉽게 이용할 수 없는 경우에 효과적인 접근 방식이 된다.
새로운 생화학적 경로는 물질의 구조적 변형, 물질에 화학기의 추가 또는 물질의 분해 등을 포함하는 공정이 될 수 있으나 이에 한정시키지 않는다.
새로운 종류의 화합물은 대사물질, 부차적인 대사물질, 효소 또는 유기체의 구조성분을 포함하나 이에 국한하지 않는다. 관심이 있는 화합물은 항생제, 항바이러스제, 항종양제, 제약학적 또는 면역조절 성질이 있는 하나이상의 치료요법적 성질을 가지는 것이 될 수도 있고 안료와 같은 상업적으로 가치가 있는 화학물질이 될 수 있으나 이에 한정시키지는 않는다. 화합물은 리포터 또는 특정 수용체에 항진제 또는 길항제로 작용할 수 있다.
본 발명에서 이용된 "복합 유전자 발현 라이브러리"는 발현 구조체 라이브러리를 포함하는 숙주 유기체와 복합 천연 경로 발현 라이브러리, 복합 키메라 경로 발현 라이브러리를 포함한다.
"복합 천연 경로 발현 라이브러리"는 하나이상의 제공자 유기체로 부터 유도한 유전물질에서 만든 발현구조 라이브러리로써 이때 유전물질에 있는 유전자는 적절한 숙주 유기체에서 유전자 발현을 끌어낼 수 있는 조절부분과 작동시에 연합된다. 복합 발현 라이브러리는 제공 유기체의 기능적인 유전자 생성물을 생산할 수 있는 숙주 유기체를 이용한다. 각 숙주 유기체에 있는 유전물질은 제공 유기체중 하나로 부터 자연 발생 생화학 경로 또는 이의 일부를 인코드한다.
"복합 키메라 경로 발현 라이브러리"는 다수의 제공 유기체에서 유도된 무작위 접합된 유전물질에서 준비된 발현 구조 라이브러리이고 유전물질에 있는 유전자는 적절한 숙주 유기체에 있는 유전자 발현을 이끄는 조절부위와 사용할 수 있도록 연합된다. 이용된 숙주 유기체는 제공 유기체의 기능을 가진 유전자 생성물을 생산할 수 있다. 숙주 유기체에 발현시에 제공 유기체의 유전자 생성물은 새로운 키메라 생화학 경로를 만들도록 상호 작용할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 하나이상의 제공 유기체에서 구한 유전물질을 제공하고 유전물질을 조작하고 하나이상의 제공 유기체의 유전자가 숙주 유기체로 전달되고 발현될 수 있도록 하기 위해 클로닝 또는 발현 벡터를 경유하여 숙주 유기체내로 상기 유전물질을 유도한다. 제공 유전물질을 포함하는 이와같은 숙주 유기체는 라이브러리를 형성하기 위해 합체한다.
제공된 유전물일 일반적으로 무작위로 모아진 유전자로 구성되고 이의 발현은 하나이상의 기능성 조절 유전자에 의해 구동되고 조절된다. 발현 구조 또는 벡터는 이와 같은 조절부분을 제공한다. 제공 유기체의 유전자는 숙주 유기체에서 전사되고, 해독되고, 진행되어 기능성 단백질을 생산하고 다시 소요의 대사물질을 생산한다.
본 발명에 따르면, 완전한 자연 발생 생화학 경로 또는 이의 일부로 구성된 유전자 발현 라이브러리는 소요의 화합물을 만들거나 또는 이의 활성을 제공하기 위한 제공 다중-효소 시스템에 대한 조사를 실시할 수 있다. 특정 생화학 경로에 연관된 유전자를 통상적으로 분리하여 단일 발현 구조 또는 클론으로 특징화될 수 있다. 이와 같은 일반적인 배열은 도 1 에 나타내었다.
일단 바람직한 활성 또는 화합물이 확인되면 이와 같은 통상적인 특징은 균주 개발과 공정 개발과 같은 하류 약물 개발을 실행할 수 있다. 양성 클론은 추가 연구 또는 사용을 위해 표준 조건하에서 배양한다. 생화학 경로 유전자는 서열화, 돌연변이, 발현 또는 추가 스크리닝에 바로 이용될 수 있다. 클론된 생화학 경로는 전사 및 유전적 조작을 통해 소요의 화합물의 대량 생산을 가능하게 한다.
또한 제공 유기체에서 감지되지 않은 생화학 경로는 숙주 유기체에서 이들의 기능적 재구성에 의해 용이하게 개발될 수 있다. 숙주 유기체의 생화학적 특징이 잘 공지되어 있기 때문에 제공 유전물질의 발현 결과로써 많은 변이체를 인지할 수 있다. 신규한 화합물은 환경조건하에 대조군 숙주 유기체에 의해 생산될 수 있는 화합물에 대해 제공 유전물질을 포함하는 숙주 유기체 추출물과 비교함으로써 감지할 수 있다. 비록 바람직한 활성 또는 화합물이 소량 감지 될 수도 있다. 뒤에서 상술하겠지만 본 발명은 바람직한 활성 또는 화합물을 생산할 수 있는 클론을 감지하고 분리하는 방법을 제공한다.
적절하게는 구체예에서 본 발명은 천연 또는 실험실에서 배양될 수 없는 제공 유기체에 적용할 수 있다. 이와 같은 유기체에서 숙주 유기체로 유전자 물질을 전달함으로서 유기 대사 경로를 재생할 수 있고 바람직한 성질에 대해 물질을 효과적으로 테스트 할 수 있다. 따라서 이들 유기체의 유전적 다양성을 얻고 보존할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리는 하나 또는 그이상의 제공 유기체로부터 나온 유전물질은 숙주 유기체에 도입되기 전에 무작위로 결합된다. 따라서, 라이브러리에 있는 각 숙주 유기체는 개별적으로 다양한 제공 경로 또는 유기체로부터 유도된 독특한 유전자 또는 이의 복합체를 포함한다. 도 2 에서는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리의 발현 구조체에서 유전자와 조절 부분의 배열을 나타낸다. 대부분의 경우에, 라이브러리에서 이와 같은 유전자 복합은 자연 상태에서는 일어나지 않는다. 발현 시에, 다양한 제공 경로 또는 유기체의 기능적인 유전자 생성물은 개별 숙주 유기체에서 서로 상호 작용하여 생화학적 복합 반응을 일으키고 이는 새로운 키메라 대사 경로 또는 새로운 화합물을 생산하게 된다. 집합적으로, 라이브러리에서 제공 유기체의 유전 원료는 개별 제공 유기체에서는 발견되지 않는 다양한 화학적 화합물로 해독된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 제공 유기체 종은 이들의 생물학적 특징 또는 숙주 유기체에 상보적인 바람직한 그러나 아직 밝혀지지 않은 생화학 반응을 실행하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 같은 바람직한 특징에는 특정 영양소를 이용하는 능력, 극한 상황에서 생존하는 능력, 화학구조를 유도하는 능력 및 특정 형태의 화학적 결합 형성을 촉매하거나 파괴하는 능력을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 제공 유기체의 유전자가 숙주 유기체에서 발현될 때, 제공 유전자의 생성물은 숙주 대사 경로를 구성하는 숙주 유전자 생성물은 변형시키거나 대체시켜 새로운 하이브리드 경로를 만든다. 제공자의 숙주에서 유도된 성분으로 구성된 하이브리드 경로에 의해 새로운 활성 또는 화합물이 생성될 수 있다. 제공 유전자 생성물에 의해 변형되는 표적이 되는 대사 경로는 숙주 유기체에 고유의 것일 수 있다. 또는, 표적 대사 경로에는 유전자 발현 라이브러리의 작제 전에 또는 동시에 모든 숙주 유기체에서 유전공학적으로 조작된 또는 내상인 비동성 유전자 생성물을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 유전자 발현 라이브러리를 만들고 스크리닝하는데 이때 제공 유기체의 대사 경로를 인코드하는 DNA 단편은 표적 대사 경로를 포함하는 숙주 유기체에서 클론되고 발현된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 숙주 유기체는 배양배지로 소요의 화합물을 방출하는 강화된 활성 약물 유출 시스템을 가지는데 따라서 숙주 유기체에서 화합물의 독성이 감소된다. 중성 수지와 같은 흡수성 물질은 숙주 유기체의 배양과정에서 이용될 수 있고 따라서 숙주 유기체에 의해 생산되고 분비되는 대사물질을 분리하여 대사물질의 회수를 실시할 수 있다.
복합 유전자 발현 라이브러리의 스크리닝을 좀더 효과적으로 하기 위해서, 본 발명은 관심이 있는 활성 또는 화합물을 보유하는 라이브러리내에 이들 숙주 유기체를 감지하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 한 구체예에서, 숙주 유기체는 리포터 분자의 신규 합성을 활성화시킴으로써 소요의 화합물 또는 활성의 존재와 같은 도입된 변화의 존재에 대해 반응을 나타내는 리포터 시스템을 포함한다. 또다른 구체예에서, 숙주 유기체에는 리포터 분자 또는 생리학적 프로브의 전구물질을 포함하는데 이는 바람직한 화합물 또는 활성에 의해 리포터로 전환된다. 양성 클론에서 리포터 분자는 발현 라이브러리에서 양성 클론을 감지하고 다른 비-생산성 클론으로부터 이를 분리할 수 있도록 하는 시그날을 생성한다.
많은 점에서, 약물 개발 시스템은 약물 개발의 다양한 단계에서 최종 임상실험까지 상당한 편의와 시간적인 장점을 제공한다. 본 발명의 라이브러리는 상당량의 스크리닝을 위한 이미 확립된 다중-웰 픗트 프린트 포맷과 로봇 공학등과 양립할 수 있다. 본 발명의 숙주 유기체는 유전적 조직 및 공정 개발에 사용되는 통상적인 유기체이다. 본 발명은 이와 같은 숙주 유기체 또는 생산 숙주가 이들의 생물학적 특징 및 유지 요구성에 대해 잘 특징화되어 있기 때문에 상당한 장점을 가진다. 제공 유기체에서 다른 전술한 발현 시스템으로 유전 물질을 옮김으로써, 제공 유기체에 대한 배양조건을 어렵게 할 필요성이 줄어든다. 따라서 본 발명의 시스템에서 발견되는 임의 선두 화합물에 대한 생물학적 활성, 약리학적 그리고 독성 성질이 연구되고 좀더 효과적으로 최적화되었다.
분자 생물학에서의 표준 기술에 의해 양성 클론에서 새로운 대사 경로를 설명할 수 있다. 선두 화합물은 표준 또는 경험적으로 결정된 배양 조건하에서 약물을 생산하는 숙주 유기체 클론을 배양하여 합성될 수 있는데 추가 분석 및 개발을 위해 충분한 양의 선두 화합물을 분리할 수 있다. 이와 같은 표준 산업적인 숙주 유기체의 일부를 정립한 Good Manufacturing Practice(GMP)와 같은 고순도 제조 프로토콜이 있다. 천연 생성물 원료를 스크리닝하는 통상적인 방법과는 달리, 각 잠재성이 있는 약물을 생산하는 유기체의 특정 요구에 대한 스크리닝과 생산기술을 채택하는데는 필요한 노력이 적게든다.
본 발명은 제공 유기체 또는 세포형태의 특정 세트의 유전 물질로부터 본 발명의 방법에 따라 만들어진 특이적인 복합 유전자 발현 라이브러리를 제공한다. 특별히 혼합된 샘플에서 유기체 또는 세포형태의 모두가 복합 유전자 발현 라이브러리를 준비할 수 있도록 개별적으로 확인하거나 또는 특징화시킬 필요는 없다.
본 발명의 임의 복합 유전자 발현 라이브러리는 증폭되거나, 복제되거나 또는 저장될 수 있다. 증폭은 숙주 유기체의 다수 클론을 생산할 수 있도록 제공 DNA를 포함하는 초기 숙주 유기체를 배양하는 것을 말한다. 복제는 라이브러리에서 개별 클론을 선택하여 생장시키는 것을 말한다. 본 발명의 복합 유전자 발현 라이브러리는 숙주 유기체에 적절한 본 기술분야에 공지의 기술을 이용하여 저장하거나 회수할 수 있다. 따라서, 본 발명의 라이브러리는 제공 유기체의 유전자 원료를 수득하고 보존하는 효과적인 수단이고 이는 약물 개발 프로그램에 반복적으로 접근할 수 있다.
5.1. 복합 유전자 발현 라이브러리의 준비.
5.1.1. 제공 유기체
본 발명의 복합 유전자 발현 라이브러리를 준비할 목적으로 임의의 유기체를 제공 유기체로 이용할 수 있다. 제공 유기체는 개인 또는 공공 실험실 배양물 또는 ATCC, International Mycological Institute 와 같은 배양물 기타기관 또는 배양할 수 있는 배양할 수 없는 환경 샘플로부터 구할 수 있다.
제공 유기체는 토양 미생물, 곰팡이 및 식물과 같은 약물을 유도하는 전통적인 원료가 된다. 제공 유기체는 약물을 만들고 생산하는데 유용한 유전자전이, 유전공학적으로 조작된 또는 유전공학적으로 선택된 균주일 수 있다.
제공 유기체는 환경 샘플에서 직접적으로 수득할 수 있는 라이브러리를 만드는데 이용될 수 있는 유전 물질과 같은 현재 미생물 기술로 배양할 수 있거나 배양할 수 없을 수도 있다. 자연상태에서 발견되는 미생물의 소수(≤1%)만이 실험실에서 배양될 수 있기 때문에, 본 발명의 주요장점은 제공 유기체가 여기에서 이용될할 수 있는 수준으로 배양될 수 없는 것이다(Torsvik et al. 1990. Appl Env Micro, 56:782-787).
본 발명은 제공자로써 미생물의 이용에 제한을 두지 않는다. 식물은 동물과 미생물 모두에서 상당한 활성을 가지는 광범위한 화합물 예를들면 피토알렉신(Abelson 1990, Science 247:513)을 생산한다. 탁솔, 캄토테신 및 아르테미시닌과 같은 생물학적으로 활성이 있는 화합물은 항-종양 및 항-멜라리아제와 같은 임상적인 개발을 진행중인 식물에서 유도된 천연생성물이 된다. 바람직한 제공 유기체는 임의 식물 특히, 잠재적인 가능성이 있는 치료요법적 성질 등이 바람직하다(Cramer et al. 1985, EMBO J. 4:285-289; Cramer et al. 1985, Science 227:1240-1243; Dron et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6738-6742).
항균성 또는 제약학적 성질이 있는 천연 생성물이 있는 또다른 원료로는 척추동물과 무척추동물이다. 이들 화합물의 일부는 경쟁물질, 병원균 및, 포식자에 대한 화학적인 방어작용을 한다. 이와 같은 화합물은 먹이를 죽이는데 이용되거나 도는 의사소통의 형태로 이용될 수 있다(Caporale 1995, Proc Natl Acad Sci 92:75-82). 상당히 많은 경우에, 부차적인 대사물질은 공생관계가 될 수 있는 연합 미생물에 의해 생산되는 것으로 간주된다(Faulkner et al. 1993. Gazzetta Chimica Italiana, 123:301-307; Bewley et al. 1995, in "An Overview of Symbiosis in Marine Natural Products Chemistry Symposium" in honor of Professor Antonio Gonzalez, La Laguna University, Canary Islands, September 16, 1995, p26(abstract).
자연계에서 다른 유기체의 생화학적 경도를 조정할 수 있는 것으로 알려진 유기체는 특별히 관심이 있는 원료 예를 들면, 싸이카스와 같은 특정 식물은 특정 식물은 특정 곤충의 발생을 파괴하는 에키디손 유사물질을 생산할 수 있다. 이와같은 유기체는 경쟁자, 공생물질, 포식자 및 먹이 또는 숙주와 기생충으로 존재하는 동일한 생태 지역에서 살 수 있다. 따라서, 자연계에서 화학적으로 다른 것과 상호 작용할 수 있는 유기체로부터 유도된 유전물질을 이용하는 장점이 있을 수 있다.
천연 생성물로 또 다른 풍부한 원료로는 해양 미생물이다. 예를 들면, 해양 미생물은 신규한 분자구조를 생산하는데 이들 중 상당부분이 생체 활성이 있는 것으로 예를 들면 강력한 항-염증성질을 가지는 살린아미드(Tapiolas et al. 1991, J Amer Chem Soc, 113:4682-83)와 토양 박테리아에서 볼 수 없었던 분자 구조를 가지는 강력한 항암제인 옥타락틴 A를 생산한다. 해양 미생물로부터 유도된 특정 화합물은 상당히 활성이 있는 화합물을 결합된 할로겐의 화학적 활성 때문에 제공하는 해수의 소금물에 포함되는데 예를 들면, 혼합된 폴리케티드와 메발론산 생합성 경로의 산물인 마리논은(Pathirana et al. 1992, Tetrahedron Lett 33:7663-7666) 그람 양성 세균에 대한 선택적인 항생제 활성을 가진다. 상이한 염도, 온도 및 압력조건을 가지면서 극지방에서 적도지방까지 살아가는 방대한 종류의 해양 생물종이 있다.
이와 같은 서식지의 독특한 특징이 이들 유기체의 유전학과 생화학에 반영되고 많은 유용한 약물을 유도하는데 제공된다(Fenical et al. 1992, in "Marine Miroorganisms; a new biological resource", Adv in Marine Biotechol, Vol. I, Plenum Press, New York).
천연 또는 인공 환경에서 생물학적 샘플을 얻을 수 있고 여기에는 진핵 유기체 및 원핵 생물 또는 바이러스를 포함할 수 있는데 이들 중 일부는 특정화되지 않은 것도 있다. 샘플은 무작위로 수집할 수도 있고 또는 산업적인 용출액이 있는 환경적으로 오염이 된 지역에서 수집할 수도 있다. 제공 유기체의 원료는 흙, 담수 또는 해수 여과물질, 온천 또는 열 분출구 주변의 침착물 또는 강 침전물등이 이용될 수 있다. 샘플은 물밑에 사는, 원양에 사는 그리고 간조 해양원으로부터 수집할 수 있다. 샘플은 열대, 아열대, 온대 및 다른 지역에서 수집할 수도 있다. 제공 유기체는 호열성, 호할로겐성, 호산성, 호압성 또는 메탄 발생성일 수도 있다.
열대 우림 지역에서 볼 수 있는 식물과 미생물과 같은 전멸 가능성에 직면한 유기체를 이용하는 것이 적절하다. 이와 같은 서식지가 파괴되고 있는 한, 유용한 약물을 생산할 수 있는 종을 상실할 수도 있다.
조류, 지의 곰팡이, 식물 및 동물을 포함하는 잠재적인 의약용 성질이 있는 유기체는 통상적인 또는 특유의 의료용 과정에서 이들의 용도에 기초하여 수집할 수 있다.
많은 부분에 있어서, 전통적인 약물 개발 또는 개발 기술에 일반적으로 이용할 수 없는 제공 유기체로부터 유도된 유전 물질로 라이브러리를 만드는 것이 바람직하다. 이와 같은 제공 유기체는 다음과 같은 특징을 하나이상 가질 수 있다: i) 유기체는 실험실에서 증식되지 않거나 배양될 수 없고; ii) 유기체는 추가 실험을 위한 충분한 양을 천연상태에서 회수될 수 없고; 그리고/또는 iii) 알려지지 않은 또는 상업적으로 이용할 수 없는 바람직한 화합물을 생산하기 위한 특별 조건을 요구하는 유기체. 나중에 기술된 특징은 또한 기존 배양물 수집에 있는 유기체를 설명할 수도 있는데 부적절한 배양 조건 때문에 통상적인 스크리닝 과정에서 선두 약물이 감지되지 않을 수 있다.
발현 라이브러리를 만들기 위한 목적으로, 제공 유기체는 독성학적으로 정의하거나 또는 생화학적으로 특징화할 필요가 없다. 환경 샘플로부터 대표적인 종 또는 배양 가능한 종의 동정 또는 유전학전 풋트프린팅을 실시하는데 이때 샘플의 복합성에 따라 달라질 수 있고, 제공 종의 탈-복제(dereplication) 요구와 같은 약물 개발 프로그램의 필요에 따라 달라질 수 있다.
제공 유기체는 이들의 핵산을 추출하기 전에 실험실에 농축시키거나 또는 배양될 수 있다. cDNA를 준비하기 위해 제공 유기체에서 소요의 활성을 인코드하는 유전자 생성물의 전사를 유도하거나 강화하는데 특정 생장 조건 또는 배양물에 특정 화학물의 존재를 요구할 수 있다. 표준 생장조건은 만일 게놈 DNA 가 필요할 경우 유기체를 배양하는데 이용될 수 있다.
환경 샘플에 있는 모든 제공 유기체는 동일 속도로 증식되기 때문에 실험실 조건하에서 일부 제공 유기체가 과다 성장하여 서서히-생장하는 유기체의 손실 또는 희석될 수 있다. 따라서, 실험실에서 선-배양 없이 환경 샘플에 있는 제공 유기체에서 직접 핵산을 준비하는 것이 바람직하다. 해양 해면동물과 같은 무척추동물의 부차 대사물질에 접근하고자 할 때 특히 유용한데 대사물질은 연합된 공생 및 배양할 수 없는 미생물에 의해 생산되는 것으로 종종 간주된다. 환경 샘플에서 제공 유기체로부터 다량의 핵산을 만드는 방법은 5.1.2에 제공하고 있다.
본 발명에서 고려하고 있는 제공 유기체에는 바이러스; 박테리아; 이스트와 원충류와 같은 단핵 진핵 생물; 조류; 곰팡이; 식물; 종피식물; 이끼벌레; 곤충; 극피동물; 벌레; 연체동물; 물고기; 양서류; 파충류; 새; 포유류를 포함하나 이에 한정하지 않는다. 표 1 과 2 에서는 제공 유기체의 예를 들었다.
전형적인 세균 및 곰팡이 주게 조직의 목록(버디 1974, Adv Appl Microbiol, 18: 309-406; 굳펠로우 등. 1989, 캠브리지 대학 신문 343-383 "미생물 생성물: 새로운 접근"에서,)
군 종류
세균아크티노마이세탈레스 유우박테리알레스 슈우도모나달레스 마이코플라즈마탈레스믹소박테리알레스 스트렙토마이세스,마이크로모노스포라, 노르카디아, 악티노마듀라, 악티노플라네스,스트렙토스포랑기움, 마이크로비스포라, 키타사토스포리아 아조박테리움, 리조비움, 아크로모박테리움, 엔테로박테리움, 브루셀라, 마이크로코쿠스, 락토바실루스, 바실루스, 클로스트리디움, 브레비박테리움 슈우도모나스, 에어로박터, 비브리오, 할로박테리움 마이코플라즈마 시토파가, 믹소코쿠스
곰팡이믹소탈로피테스피코마이세테스아스코마이세테스바시디오마이세테스펀가이 임퍼펙티 이스트 피사룸, 풀리고 무코르, 피토프토라, 리조푸스 아스퍼질러스, 페니실리니움 코프리누스, 파네로캐테 악크레모니움(세팔로스포리움), 트로코더마, 헬름인토스포리움, 퓨사리움, 알터나리아, 미로데시움 사카로마이세스
전형적 주게 조직의 고 형태
군 전형적 종류, 화합물, 특성
식물 알개 리켄스 고차식물 다이제니아 심플렉스(카이닉 액시드, 안티헬르민틱) 라미나리아 안쿠스타타(라미닌, 하이포텐시브)유스니아파시아타(벌핀닉액시드,안티마이크로바이알; 유스닉 액시드, 안티튜모르)카타란투스(빈카 알칼로이드), 다기탈리스(카디악 글리코사이드),포도필륨(포도필로톡신),택수스(택솔), 세팔로택수스(호모하링토닌),캠프토데카(캠프토데신),아르테미시아(아르테미시닌),콜레우스(포르스콜린),데스모디움(K 채널 아고니스트)
원생 동물디노프라겔라테스 티코디스쿠스 브레비스(브레비톡신, 카디오바스큘라)
곤충 돌로메데스("피싱 스파이더"베놈스),에필라크나(멕시칸 빈 비틀 알칼로이드)
이끼벌레 부굴라 네리티나(브리오스타틴스, 안티 캔서)
연체 동물 코누스 톡신스
해면 동물 마이크로키오나 프로리퍼라(엑티오닌, 안티마이크로바이알),크립토테티야 크리타(D-아라비노 퓨라노사이즈)
산호충 수도테로고니아 스피시즈(수도테라신스,안티인플레머토리),에리트로포디움(에리트롤라이즈, 안티인플레머토리)
벌레아넬리다 스피눈쿨리다튜니케이츠 룸브리코너라이스 헤테로파 (네라이스톡신,인섹티사이달)보넬리아 비리디스(보넬린, 뉴로액티브)트라이다이뎀눔 솔리듐(다이뎀닌, 안티-튜모와안티-바이랄),엑타이나시디아 터비나타(엑타이나시딘스, 안티-튜모),
어류 엡타트레투스 스타우티(엡타트레틴, 카디오액티브), 트라키누스 드라코(프로테이나시우스 톡신스, 혈압, 호흡, 심장 속도를 감소시킨다.)
양서류 덴드로바티드 프로그스(바트라코톡식스, 퓨밀리오톡신스,히스트리오니코톡신스, 그외 기타 폴리아민스)
파충류 스네이크 베놈 톡신스
조류 히스트리오니코톡신스, 모디파이드 카로테노이즈, 레티노이즈와 스테로이즈 (굳윈 1984, "카로테노이즈의 생화학"2권, 챕맨 앤 홀, 뉴욕, pp. 160-168.)
포유류 오린토리노후스 아나티누스(덕빌드플라티푸스베놈),모디파이드 캔테노이즈, 레티노이즈와 스테로이즈(굳윈 1984, 상기 참조, pp. 173-185; 데블린 1982, "생화학의 교과서", 윌리, 뉴욕, p. 750)
5.1.2. 제공 유기체로 부터 다량의 핵산 분리.
사용되는 유기체 형태와 샘플 원료에 따라 다양한 방법을 이용하여 제공 유기체로부터 핵산을 분리해낼 수 있다. 제공 유기체의 유전정보를 충분히 나타내는 유전자 발현 라이브러리를 작제하기 위해 절단, 단일가닥 틈 또는 부분적인 변성이 없고, 분자량이 큰(특히 게놈 DNA 클로닝에서) 상당량의 핵산을 얻는 것이 중요하다. 다량의 핵산을 준비하기 위해서, 본 발명의 방법은 샘플에서 제공 유기체의 부드럽고, 신속하고, 완전한 용해와 유기체로부터 핵산분해 효소 및 다른 분해성질이 있는 단백질의 완전한 불활성화를 제공한다. 실험실에서 추가 분리 단계를 실행할 때까지 샘플에서 핵산을 안정화시키기 위해 초기 추출과정을 실행할 수 있다.
임의 핵산 분리 과정은 제공 유기체의 효과적인 분해를 요구한다. 액체 질소에서 동결, 유리 또는 다른 파괴성 물질 존재 하에 연마, 단순한 기계적 전단 또는 효소적 분해 등을 포함하는 다수의 표준 기술이 이용될 수 있다.
토양과 같은 혼합된 물질 또는 셀룰로오즈 또는 키틴(예를 들면 필라멘트성 곰팡이와 식물)과 같은 거친 물질을 다량 포함하고 있는 샘플에서 냉동-건조를 이용하면 샘플을 부서지기 쉬운 상태로 만들어 이들을 파괴하기에 더 좋게 만든다. 이와같은 동결 건조된 물질에는 장기간 동안 효소와 큰 분자량의 물질(핵산)을 보유하고 있다(Gurney 1984, in Methods in Molecular Biology, Vol. 2, p35-42, John M. Walker ed.). 샘플은 액체 질소에서 섬광 동결될 수도 있다. 토양과 같은 느슨한 상태의 샘플은 미세한 가우지 또는 나일론 메쉬에서 동결을 시킨다. 24-72시간 동안 진공상태에서 냉동된 샘플에서 동결 건조법을 실시한다. 냉동-건조된 샘플은 -70℃에서 진공상태로 건조 보관된다. 미생물 집단의 농축과 같은 환경 샘플을 준비하는데 추가 단계가 요구될 수 있다(Jacobson et al. 1982, Appl Env Microbiol, 58:2458-2462; Zhou et al. 1996, Appl Env Microbiol, 62:316-322; Somerville et al. 1989, Appl Env Microbiol, 55:548-554).
본 발명의 한가지 주요 방법은 Chirgwin et al. (1979, Biochem 24:5294), Sadler et al. (1992, Curr Gebet, 21:409-416) and Foster (1991, Ph. D. thesis, University of California, Santa Barbara)로부터 변형된 것이다. 이 방법은 단백질을 변성시키고 핵산 분해효소를 불활성화시키기 위해 강력한 키오트로픽 제제인 구아니디움 이소티오시아네이트를 이용하고, 염화 세슘 농도차 원심분리에 의해 핵산 물질의 정제를 할 수 있다. 여기에서 제공되는 방법은 DNA 와 RNA 모두를 추출하는 Chirgwin 방법과는 다르다. 본 발명의 방법에는 또한 고속 원심분리 단계 및 비스벤즈아미드 염료의 추가 첨가를 포함한다. 사용된 제공 유기체에 따라 추가 단계에는 선택적으로 폴리사카라이드를 제거하기 위해 염화 섹사데실피리디니움 또는 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)로 처리, 페놀릭의 제거를 위해 폴리비닐피롤리돈의 처리 및 전분과 다른 탄수화물의 제거를 위해 셀룰로오즈 크로마토그래피로 처리하는 것을 포함하나 이에 한정하지 않는다(Murray & Thompson, 1980, Nuc Acid Res 8:4321-25).
제공 유기체에서 분리된 RNA 는 역전사 효소를 이용하여 상보적인 DNA(cDNA)로 전이될 수 있다.
손상된 핵산은 클론이 어렵게 되어 제공 유기체의 DNA 상실과 라이브러리에서 클론수가 적게된다. 숙주 유기체가 재조합에 허용적이고 효과적인 내생 DNA 복구 기작이 부족한 경우에는 이와 같은 문제가 악화될 수 있다. 본 발명은 또한 상보 DNA 의 2차 가닥 합성동안에 이용되는 통상의 효소반응을 이용하여 시험관에서 클로닝하기 전에 손상된 DNA 를 복구하도록 제공한다(Sambrook et al. 1989, in "Molecular Clonin" 2nd Edition, section 8). 예를 들면 DNA 틈이나 절단은 DNA 중합효소와 클리노우 단편과 대장균 DNA 연결효소에 의해 복구될 수 있다. 이와 같은 효소 반응은 본 기술에 숙지의 지식을 가진 자에게 공지된 것이다.
환경 샘플로부터 추출된 DNA로부터 복합 발현 라이브러리를 만들 때 이용할 수 있는 DNA 의 양이 제한되고 연결 전략의 선택에서 고려되어야 한다. 추출 또는 농축(<100㎍)후에 양이 적을 경우, DNA 는 고효율 클로닝 시스템, 5.1.3에서 상술하는 것과 같은 SuperCos에 연결될 수 있다. 클론에서 삽입체는 증폭되고 제한 효소 절단에 의해 벡터로부터 방출된다. 진핵 및 원핵 제공 유기체를 포함할 수도 있는 환경 DNA 샘플의 특징 때문에 다중 숙주 유기체를 이용하는 것이 바람직하다. 고유 환경 DNA 샘플을 충분한 양으로 이용할 수 있는 경우에, 또는 DNA 증폭된 경우에 DNA 는 발현 숙주세포의 소요 패널에 적절한 각 벡터 패널에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 두 개이상의 발현 숙주 사이에 셔틀할 수 있는 능력을 가진다.
5.1.3. 숙주 유기체와 벡터.
여기에서 사용된 "숙주 유기체"는 박테리아와 같은 단세포 유기체와 식물 및 동물과 같은 다세포 유기체 등을 포함한다. 생체에서 배양되거나 유전공학적으로 조작될 수 있는 것을 포함한 임의 세포 형태가 이용될 수 있다. 본 기술에 공지인 임의 숙주-벡터 시스템이 본 발명에서 이용될 수도 있다. 하나이상의 숙주 유기체에서 복제될 수 있고 유지될 수 있는 셔틀 벡터를 이용하는 것이 바람직하다.
숙주 유기체 또는 숙주 세포는 개인 실험실 기탁주, ATCC 와 같은 공공 배양기관 또는 상업적인 공급 회사에서 구할 수도 있다. 이와 같은 유기체 또는 세포는 특정 용도를 위해 본 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 변형될 수 있다.
본 발명에 따르면, 숙주 유기체 또는 숙주세포는 비동성 유전자의 발현에 이용될 수 있고, 생화학적, 생리학적 또는 유전학적으로 상당히 특징화되었다. 이와같은 숙주 유기체는 전통적인 유전적 균주 개량법, 육종 방법, 발효 공정 또는 재조합 DNA 기술과 함께 이용될 수 있다. 대규모 생산 공정을 위해 개발된 숙주 유기체를 이용하는 것이 바람직하고, 생장조건 및 2차 대사물질 생산에 대한 조건은 공지의 것이다.
숙주 유기체는 표준 온도 조건, 배양시간, 광학적 밀도, 발현 숙주의 영양학적 그리고 생리학적 요구조건에 상응하는 배지조성 하에서 배양될 수 있다. 그러나, 라이브러리의 생산과 유지조건은 라이브러리의 발현과 스크리닝 하는 것과는 다를 수 있다. 변형된 배양 조건과 배지는 제공 유기체의 일부 영양학적 그리고 생리학적 특징을 본뜨고 관심이 있는 대사물질의 생산을 실행하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 관심이 있는 화합물의 화학적 전구물질은 이와 같은 전구물질의 수정을 위해 영양배지에 제공될 수 있다. 본 기술에 공지된 임의 기술을 이용하여 적절한 조건을 정립할 수 있다.
숙주 유기체에는 동종 재조합을 실시하고 외부 DNA 를 제한하는 능력이 결손되는 것이 바람직하다. 숙주 유기체는 제공 유기체의 것과 유사한 코돈 이용을 한다. 진핵 제공 유기체를 이용하는 경우에, 숙주 유기체는 인트론 제거와 같은 제공 메신져 RNA 를 적절히 처리할 수 있는 능력을 가지는 것이 바람직하다.
적절한 원핵 숙주 유기체에는 대장균, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토마이세스 리비단스, 스트렙토마이세스 코엘리콜라 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 사카로마이세스 세르비시에(빵의 효모), 쉬이조사카로마이세스 폼비(분열 효모)피키아 파스토리스, 한셀울과 폴리몰파(메틸요구성 효모)와 같은 효모가 이용될 수 있다. 뉴로스포라 크라사와 아스퍼질러스 니듈란과 같은 필라멘트성 아스코마이세츠가 이용될 수 있다. 니코티아나와 아라비도프시스에서 유도하나 것과 같은 식물세포가 적절하다. 적절한 포유류 세포에는 사람, 원숭이, 차이니스 헴스터 난(CHO) 세포, NIh/3T3, COS, 293, VERO 등과 같은 설치류에서 유도된 것을 포함하나 이에 국하시키지 않는다(Kriegler M. in "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual", New York, Freeman & Co. 1990).
특정 방식으로 발현된 유전자 생성물을 변형시키고 진행시킬 수 있는 숙주 유기체를 이용할 수 있다. 생화학 경로중 단백질 기능에 있어서 이와 같은 병형(예로 글리코실화)과 단백질 생성물의 처리(절단등) 등은 중요하다. 여러 가지 숙주 세포는 단백질의 해독후 처리와 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 가진다. 발현된 외부 단백질이 정확한 수정 및 처리를 할 수 있는 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 이용될 수 있다. 이를 목적으로, 유전자 생성물의 1차 전사체의 적절하고 정확한 처리, 글리코실화 포스포릴화를 위한 세포기작을 가지는 진핵 숙주 세포가 적절하다.
예를 들면, 진핵 곰팡이는 동일한 핵심 분자 생물학의 상당부분을 공유하고, 가장 보편적인 곰팡이 종간에 유전자 교환이 가능하다는 것을 알 수 있다(Gurr et al. 1987, in Gene Structrue in Eukaryotic Microbes, Kinghorn ed., p.93; Bennet & Lasure 1992, Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, NY). 진핵 숙주 유기체의 적합한 예로는 분열효모, 쉬조사카로마이세스 폼비(Schizosaccaromyces pombe)이다. 우선, S. 폼비(Schizosaccaromyces pombe)의 분자 생물학이 매우 잘 알려져 있고 많은 주요 배양과 정제공정 및 조작이 일상적인 과정에 따라 실시될 수 있다. 둘째로 단핵세포이기 때문에 실험실 세팅에서 배양, 저장 및 조작이 용이하다. 셋째로는 혼합형 진핵 DNAs 의 발현에 이용할 수 있다는 것이 특히 중요한데 다른종의 곰팡이, 식물 및 포유류의 유전자의 적절한 절단 및 발현이 가능하다. 이핵 RNA(인트롤을 포함하는 RNA)의 절단과 처리에 대한 연구에서 S. 폼비는 절단에 필요한 작은 핵산 RNA(snRNS) 성분의 구조와 패턴이 다른 곰팡이와 고차 후생동물과 고유하는 것을 알 수 있었다. 마지막으로, 많은 비-S. 폼비 프로모터, 포유류와 식물 바이러스에서 유도한 일부는 상당수준의 유전자 발현을 조정할 수 있다(Forsburg, 1993, Nuc Acids Res, 21:2955) 이와 같은 특징은 NIH3T3(섬유아세포), GT1-7(신형) 또는 다른 세포형태와 같은 포유류 세포 발현 숙주에 곰팡이 DNA/cDNA 라이브러리의 셔틀을 허용한다.
클로닝 벡터 또는 발현벡터는 발현을 위해 숙주 유기체내로 제공 DNA 를 도입하는데 이용된다. 발현 구조체는 하나이상의 조절부분과 작동식으로 연합된 제공 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 조정 부분은 제공 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 조정부분은 제공 DNA 또는 벡터에 의해 공급받을 수 있다. 플라스미드; 코스미드; 파지스미드; 효모 인공 염색체(YACs) 및 박테리아 인공 염색체(BACs: Shizuya et al. 1992, Pro Natl cad Sci 89: 8794-8797) 또는 변형된 바이러스와 같은 인공 크로모좀을 포함하나 이에 한정하지 않으나, 벡터는 반드시 숙주 유기체에 적응성이 있어야 한다. 이용 가능한 벡터의 예로는 λgt11, pWE15, SuperCos1(Stratagene), pDblet(Burn et al 1995, Gene, 164:173-177). pbLUESCRIPT (Stratagene), CDM8, pJ88, pYAC3, pYAC4(Appendix 5 of Current Protocols in Molecular Biology, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, which is incorporated herein by reference)를 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
숙주와 제공 유기체의 조절 부분과 전사인자가 적응성이 있을 때 제공 전사부분은 숙주 유기체에서 전사를 효과적으로 하기 위해 RNA 중합효소와 같은 숙주 인자에 결합할 수 있다. 제공 유기체와 숙주 유기체간에 적응성이 없는 경우 숙주 유기체에 적응성이 있는 조절부분이 제공 DNA 단편에 부착되어 전달된 유전자의 발현을 이루게 한다.
고유 해독 개시 코돈, 리보좀 결합 부분 및 인접서열을 포함하는 전체 오페론이 적절한 클로닝 또는 발현 벡터에 삽입되는 경우에 추가 콘트롤 시그날이 필요하지 않다. 그러나, 유전자의 코딩 서열의 일부만이 삽입된 경우에 해독 개시 코돈(주로 ATG)과 인접서열을 포함하는 외생 컨트롤 시그날을 제공해야만 한다. 이와같은 외생 조절 부분과 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 오리진일 수 있다. 구성 및 유도성 제어부분은 제공 DNA 의 발현에 이용될 수 있다. 발현 라이브러리의 생성물이 독성인 경우에 유도성 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다. 발현 효과는 적절한 전사 강화 요소를 포함시켜 강화될 수 있다(Bittner et al. 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
"작동식으로-연합된"은 전사 및 해독을 허용하는 방식으로 발현될 조절부분과 DNA 서열이 결합되고 위치하도록 연합된 것을 의미한다. 유전자 발현에 필요한 조절부분의 정확한 특성은 유기체마다 다르다. 일반적으로, 프로모터는 작동식으로 연합된 핵산서열의 전사를 촉진시키고 RNA 중합효소에 결합할 수 있어야 한다. 이와같은 조절부분에는 TATA 박스, 캠 서열, CAAT 서열등과 같은 전사와 해독개시와 연관된 5'-비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 코딩 서열의 3'에 비-코딩 부분이 보유되거나 종료부분과 폴리아데닐화 부위와 같은 전사 종류 조절서열을 복제될 수 있다. 핵산 분자의 두 개 서열은 이들이 동일한 RNA 전사체에서 전사되도록 하거나 한 서열에서 RNA 전사를 개시하여 제 2 서열로 연장되도록 하는 방식으로 서로 연합된 경우에 "작동식으로-연합"되어 있다고 할 수 있다. 따라서 폴리시트론 전사체가 만들어 질 수 있다. 프로모터에서 시작되는 전사가 작동식으로 연합된 서열의 RNA 전사체를 만드는 경우에 프로모터와 임의 다른 핵산사열과 같은 두 개 이상의 서열이 작동식으로 연합되어 있다. 작동식으로 연합되기 위해서는 두 개의 서열이 바로 인접할 필요는 없다.
또한, 발현 벡터에는 제공 DNA 를 포함하는 숙주 유기체를 우선 분리하고, 확인하고 추척하기 위한 선택성 또는 스크린할 수 있는 표적 유전자를 포함할 수 있다. 발현 벡터에는 발현 구조체에서 DNA 삽입체의 절단 및 재배열을 가능하도록 독특한 또는 편의에 맞쳐 위치한 제한효소 부위를 제공할 수 있다.
발현 벡터에는 하나이상의 숙주 유기체에서 벡터의 유지와 복제를 허용하는 서열을 포함하거나 또는 숙주 크로모좀내에 벡터를 끼워넣을 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 서열에는 복제원점, 자발적인 복제서열(ARS), 센트로머 DNA 와 텔로머 DNA 를 포함하나 이에 국한하지 않는다. 그 결과, 하나이상의 발현 구조체가 숙주 유기체에서 만들어지고 유지될 수 있다. 발현 구조체는 숙주 유기체에서 숙주 게놈에 끼어들어가거나 에피좀에 남아있을 수 있다.
일반적으로, 박테리아와 포유류 세포, 박테리아와 효모, 박테리아와 식물세포 또는 그람 양성과 그람 음성 박테리아와 같은 적어도 2개의 숙주 유기체에서 복제되거나 유지되는 셔틀 벡터를 이용할 수 있다. 셔틀 벡터는 Inc P. Inc Q 플라스미드에서 유도된 것과 같은 광범위한 숙주 범위의 복제 원점 또는 적어도 2개이상의 복제원점을 포함할 수 있다. 셔틀 벡터에는 접합 전달에 의해 적응성이 있는 다양한 숙주 유기체로 라이브러리를 이동시키는데 이용될 수 있는 자연발생 플라스미드로부터 유도된 서열을 포함할 수 있다(Hayman et al. 1993, Plasmid 30: 251-257). 라이브러리를 만드는데 셔틀 벡터를 이용함으로써 제공 유기체의 DNA 서열은 복제되어 하나의 숙주 유기체에서 다른 유기체로 전달된다.
예를들면, 적절한 예시적인 발현 벡터-숙주 유기체 복합은 코스미드, SuperCos1 과 대장균 균주 XL1-Blue MR 이고 이들 모두 Stratagene(La Jolla, CA)에서 상업적으로 이용할 수 있다. 벡터는 30-42kbp 크기의 DNA 삽입체를 BamHI 클로닝부위를 통하여 받아들이고, 포유류 세포에서 발현을 위해 이용되는 SV40 프로모터와 네오마이신 저항 표식(neoR)을 가진다. 벡터에는 원핵 세포에서 선택용으로 암피실린 저항 유전자를 포함할 수 있다. 대장균 숙주 유기체는 특정 제한효소 시스템(hsdR, mcrA, mcrCB and mr)이 결손되어 있고, 엔도뉴클라아제-결손(endA1)이고, 재조합 결손(recA)이다. 숙주 유기체는 사이토신 또는 아데닐 메틸화를 하는 삽입된 DNA 를 절단하지 못하기 때문에 종종 메틸-dNTP 유사체를 이용하여 합성된 진핵 DNA 와 cDNA에 있는 경우도 있다.
이와 같은 시스템의 장점은 제한효소-recA-대장균 숙주 라이브러리를 만들기 위해 시험관내 패키지 시스템에 상당히 효과적인 람다를 이용하는 것을 포함한다. 원료가 되는 게놈 DNA 의 질이 네이키드 DNA 형질변환에 요구되는 것보다 질이 낮기 때문에 패키지된 게놈 DNA 삽입체는 분해에 대해 보호될 수도 있다. 대장균 숙주 세포내에 있게되면 손상된 삽입체는 숙주의 세포 DNA 복구 기작에 의해 복구된다. 시스템은 소량의 시작 복구 기작에 의해 복구된다. 시스템은 소량의 시작 게놈 DNA(5-10㎍)을 요구하고, 패키지 시스템이 특정 크기범위의 삽입체만을 받아들이기 때문에 크기 선별이 필요없다. 대장균에서 초기 라이브러리는 증폭되어 또 다른 숙주 유기체에 도입할 목적으로 효과적인 형질전환 방법에 이용될 수 있다.
SuperCos1 벡터는 SV40 복제 원점과 neoR 유전자를 스트렙토마이세스 복제원점(플라스미드 pIJ1 이 또는 pIJP22)과 티오스트렙톤 저항 유전자로 대체함으로써 스트렙토마이세스 숙주에서 클로링할 수 있도록 변형된다. KpnI 와 HindIII로 절단하여 pIJ101 원점과 티오스트렙톤 저항 유전자를 포함하는 pIJ699(Hopwood et al. 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation)에서 4.0kb 단편을 분리하여 이와같은 셔틀 벡터, Streptocos(도6A)를 만들 수 있다. 이와 같은 단편은 KpnI 부위에서 블런트되고 SmaI-HindIII 제한효소 부위에서 SuperCos 내로 클론된다(Bierman 1992, Denis 1992 for related examples) 또한, 서열원소는 접한 절단에 의해 셔틀 코스미드 이동을 위해 도입된다(Bierman 1992, Denis 1992 for related examples). 스트렙토마이세스-특이적인 프로모터를 포함하는 상이한 스트렙토코커스 부분은 벡터내에 BamHI 클로닝 부위내로 유입될 수 있다. PCR을 이용하면 스트렙토마이세스 프로모터 단편은 SuperCos1 의 NotI/EcoRI 부위에 직접 클론될 수 있도록 만든다. 다양한 공지의 스트렙토마이세스 프로모터는 ermE, Pptr(1995, Mol Microbiol, 17:989), hrdB (Buttner, M. J. 1989, Mol Microbiol, Vol. 3, pp. 1653-1659)을 포함하는 것을 이용한다. 이와같은 방식은 광역의 숙주-벡터 시스템에 유용하다. 따라서, SuperCos1 은 숙주 복제 원점, 선택성 표식인자, 필요에 따라 동종 프로모터를 도입시켜 변형할 수도 있다.
숙주로 식물세포를 이용하는 복합 유전자 발현 라이브러리에 있어서, 제공 코딩 서열의 발현은 다수의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 적절한 균주는 Principles of Gene Manipulation 1985, R.W. OLD and S.B. Primrose 3rd ed. Blackwell Scientific Pub에 상술되어 있는데 CaMV 의 35S RNA 와 19S RNA 프로모터와 같은 바이러스 프로모터(Brisson et al. 1984, Nature 310-511-514) 또는 TMV의 피복 단백질 프로모터(Takamatsu et al 1984, EMBO J. 6:307-311)가 이용될 수 있고; 또는 RuBISCO(Coruzzi et al. 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al. 1984, Science 224:838-843)의 소단위와 같은 식물 프로모터 또는 콤 hsp17. 5-E 또는 hsp17.3-B(Gurley et al. 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565)와 같은 열 쇼크 프로모터가 이용될 수 있다.
숙주 세포로써 식물세포와 프로토플라스트 모두 다 이용될 수 있다. 숙주 식물에는 옥수수, 밀, 쌀, 콩, 토마토, 담배, 당근, 땅콩, 감자, 고구마, 해바라기, 얌(yam), 아라비도프시스, 평지씨, 페튜니아 등을 포함하나 이에 국한하지 않는다. 식물 원형질이 적절한데 그 이유는 세포벽이 없고, 세포 배양물에 증식할 수 있는 능력이 있고 식물로 재생할 수 있기 때문이다.
또한 재조합 구조는 식물에서 발현할 수 있는 선택성 또는 스크린가능한 표식 유전자를 포함하는데 여기에는 항생제 저항성을 제공하는 유전자(예로써 카나마이신 또는 하이그로마이신에 저항성) 또는 제초제 저항성(예로 설포닐 우레아, 포스피노트리친 또는 글리포세이트)를 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 스크린가능한 표식에는 β-글루코루노니다제를 인코드하는 유전자(Jefferson, 1987, Plant Molec Biol. Rep 5:387-405) 루시퍼라제(Ow et al. 1986, Science 234:856-859)를 인코드하는 유전자를 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
식물세포에 제공 유기체 DNA 를 도입시키기 위해서는 식물을 형질전환시키기 위한 아그로박테리움 튜메페시엔(Agrobacterium tumefaciens) 시스템이 이용될 수 있다. T-DNA 기초한 형질변환 벡터의 적절한 고안과 구조는 본 기술분야에 숙지의 지식을 가진 자에게 공지의 점이다. 이와 같은 형질변환은 적절하게는 이중 아그로박테리움 T-DNA 벡터(Bevan, 1984, Nuc. Acid Res. 12:8711-8721)그러나 외떡잎 식물 및 식물 세포에 DNA 를 전달하거나 형질 변환시키는데에는 이용될 수 있다(Hernalsteen et al. 1984, EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et a. 1984, Nature 311:763-764; Grimsley et al. 1987, Nature 325:1677-1679; Boulton et al. 1989, Plant Mol. Biol. 12:31-40; Gould et al. 1991, Plant Physiol. 95:426-434).
또 다른 구체예에서, 식물 세포내로 재조합 핵산 구조체를 도입하는 다양한 방법이 이용될 수도 있다. 이와 같은 방법은 표적이 외떡잎 식물 세포일 경우에 특히 유용하다. 또 다른 유전자 전이 및 형질전환 방법에는 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 통한 원형질 형질전환 또는 네이키드 DNA 의 일렉트로포레이션에 의한 취득(Paszkowski et al., 1984, EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. 1985, Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; Shimamoto, 1989, Nature 338:274-276) 및 식물조직의 일렉트로포레이션(D'Halluin et al., 1992, Plant Cell 4:1495-1505)을 포함하나 이에 한정시키지 않는다. 식물 세포 형질변환의 또 다른 방법은 마이크로인젝션, 실리콘 카바이드에 의한 DNA 취득(Kaeppler et al., 1990, plant Cell Reporter 9:415-418) 및 마이크로인젝션 충격(Klein et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; Gordon-Kamm et al., 1990, Plant Cell 2:603-618)을 포함한다.
식물분자 생물학의 일반 개론은 Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 431-463; and Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9을 참고한다.
곤충 시스템에서, 스포도프테라 프르기페르다 세포에서 제공 유전자를 발현시키기 위한 벡터로는 오토그라파 칼리프로니카 뉴클리어 폴리하이드로시스 바이러스(AcNPV), 베큘로바이러스가 이용된다. 제공 DNA 서열은 바이러스의 비-필수 부위(예를들면 폴리헤드린 유전자)에 클론되고 AcNPV 프로모터의 제어하에(예로써 폴리헤드린 프로모터)위치하게 된다. 그다음 이와같은 재조합 바이러스는 숙주세포를 감염시키는데 이용되는데 이때 삽입된 유전자가 발현된다(Smith et al. 1983, J Virol 46:584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051).
효모에서 구성 또는 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 벡터가 사카로마이세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae)(빵효모), 쉬조사카로마이세스 폼비(Schizosaccaromyces pombe)(균열효모), 피치아 파스토리스와 한센뉼라 폴리몰파(Hansenula polymorpha)(메틸요구성 효모)에 이용된다. 참고(Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Pubish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al. 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds, Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch, 3; and Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, NyY., Vol. 152, pp. 673-684; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds, Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and III.
포유류 숙주 세포에서는 다양한 포유류 발현 벡터를 상업적으로 구할 수 있다. 또한, 다수의 바이러스계 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터를 이용되는 경우에, 제공 DNA 서열은 나중 프로모터/3연속 리더 서열과 같은 아데노바이러스 전사/해독 제어 복합체에 연결될 수 있다. 이와같은 키메라 유전자는 생체내 또는 시험과 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈내에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 부위(E1 또는 E3)에 삽입하면 감염된 숙주에서 비동성 새성물을 발현할 수 있고 살아있을 수 있는 재조합 바이러스가 된다(Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 81:3655-3659). 복제인자를 처리할 수 있는 입스타인-바 바이러스(EBV) 원점(Orip)과 EBNA-1 이 셔틀 에피좀성 클로닝 벡터, EBO-pCD(Spickofsky et al. 1990. DNA Prot Eng Tech 2:14-18)를 만드는데 이용될 수 있다. 레트로바이러스에 기초한 바이러스 벡터가 또한 이용될 수 있다(Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).
포유류 세포에는 다수의 선택 시스템이 이용되는데 허피스 심플렉스 바이러스 티미닌 카이나제(wigler, et al. 1977, Cell 11:223), 하이포산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)과 아데닌 포스포리보실 전이효소(Lowy, et al. 1980, Cell 22:817) 유전자가 각각 tk-, Hgprt-,aprt- 세포에 이용될 수 있으나 이에 국한시키지 않는다. 또한, 메토트렉세이트에 저항성을 부여하는 디하이드로플레이트 환원효소(dhfr)(Wigler, et al. 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al. 1981, Proc, Latl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코페놀산에 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, 1981); 아미노글리코시드 G-418에 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포전이효소(neo); 그리고 하이그로마이신에 저항성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제(lyg)(Santerre, et al. 1984, Gene 30:147) 등의 선택에 기초한 항-대사물질 저항성이 이용될 수도 있다.
또한 본 발명은 복합 유전자 발현 라이브러리 실행을 개선하는 특이적으로 개선된 숙주 유기체를 제공한다. 라이브러리가 2차 대사물질을 만드는 목적으로 이용되는 경우에 화합물의 독성이 라이브러리에 있는 생산성 숙주 유기체의 하향 표현을 유도한다. 본 발명의 한 구체예에서, 숙주 유기체를 변형시켜 관심이 있는 화합물의 생산에 의해 숙주 유기체의 생장과 생존이 역으로 영향을 받지 않게 한다. 내성의 증가로 생산단계와 스크리닝 단계에서 가능성 있는 약물을 생산하는 숙주 유기체의 손실을 감소시킬 수 있다.
숙주 유기체의 적절한 변형의 예로는 숙주 유기체에 효과적인 약물 방출 시스템의 도입 또는 과다 생산하는 것이다. 박테리아, 효모 및 포유류 세포를 포함하는 대부분 유기체에 약물 저항성에 있어 막-연합된 에너지에 의한 유출이 중요한 역할을 한다(Nikaido 1994, Science 264:382-388; Balzi et al. 1994, Biochim Biophys Acta 1187:152-162; Gottesman et al. 1993. Ann Rev Biochem 62:385) 유출 시스템의 강화된 보체를 가지는 변형된 숙주 유기체는 광범위한 강력한 독성 화합물을 활발하게 분비하여 숙주 유기체내에 이의 축적을 감소시킨다. 화합물을 생산하는 대사과정의 최종 생성물에 의한 방해와 같은 네가티브 피이드백 메카니즘을 피할 수 있다. 또한, 소요의 화합물이 숙주 유기체내에 축적되지 않기 때문에 좀더 효과적으로 화합물을 분리해낼 수 있다.
박테리아에서, 폴리케티드 항생제(arcAE genes of E. coli, Ma et al. 1993, J Bacteriol 175:6299-6313)로부터 플로로퀴놀린과 에티듐 브로마이드(bmr of Bacillus subtilis and nor A of Staphylococcus aureus, Neyfakh et al. 1993, Antimicrob Agents Chemother 37:128-129), 독소루비딘(drr of Streptomyces peucetius) 및 4차 아민(gacE of Klebsiella aerogenes and mviC of E. coli)까지 광범위한 서로 구조적으로 무관한 분자를 펌프할 수 있는 다수의 방출 시스템에 대해 연구하고 있다. 표 3 에는 이와 같은 방출 시스템의 예를 나열하고 있다. 원핵 숙주 유기체에서 이와 같은 방출 시스템이 이용될 수 있다.
효모에서, 다기능 약물 저항성을 제공하는 많은 유전자가 방출 시스템을 인코드하고 있고 이는 본 발명에 유용하다. 예를 들면, bfr1+ 유전자는 쉬조사카로마이세스 폼비(Schizosaccaromyces pombe)에 브레펠딘 A 저항성을 제공하고 칸디다 알비칸(Candida albicans)의 CDR1 유전자는 사이클로헥사미드와 클로람페니콜에 대한 저항성을 제공한다(Prasad et al. 1995, Curr Genet 27:320-329).
포유류 세포에서, ATP-결합 펌프 단백질 종류에 속하는 다중 약물 저항성 단백질이 이용될 수 있다(Juranka et al. 1989, FASEB J, 3:2583-2592; Paulusma et al. 1996, Science 271:1126-1128; Zaman et al. 1994, Proc. Natl Acad Sci, 91: 8822-8826; Breuninger et al. 1995, Cancer Res 55:5342-5347, Koepsell EP 0699753). 사람 mdr1 다중 약물 저항성 유전자는 사카로마이세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서 기능적으로 발현될 수 있다(Kuchler et al. 1992, Proc Natl Acad Sci 89:2302- 2306). 진핵 세포에서는 다른 방출 시스템이 이용될 수 있다.
활성 약물 유출 시스템에 의해 분비되는 화합물의 목록
화학물 류별 특정 이름 유출시스템
양이온 염료 로다민-6G 에티디움 브로마이드아크리플라빈 bmr acrAE
염기성 항생제 퓨로마이신독소루비딘 bmrdrr, mdr
친수성 항생제 노보비오신마크로리드 acrAE
혐기성 항생제 베타락탐
유기 양이온 테트라페닐포스포니움 bmr
전하를 갖지않음 탁솔클로람페니콜 mdrbmr
약산 날리딕산미트로마이신 emrmdr
양쪽이온 플로로퀴놀린 mdr
계면활성제 SDS acrAE
하나이상의 방출 시스템이 숙주 유기체에 도입되거나, 유도되거나 과다 생산될 수 있다. 유출 시스템의 성분을 인코드하는 유전자는 전술한 기술과 발현 벡터를 이용하여 숙주 유기체에 도입되고 발현될 수 있다. 예를 들면, 방출 시스템 유전자의 발현을 위한 유도성 프로모터를 이용하는 것이 유리할 수도 있다.
5.1.4. 복합 천연 경로 발현 라이브러리.
본 발명은 복합 유전자 발현 라이브러리의 작제와 이용에 관계하는데 이때 숙주 유기체에는 제공 유기체의 다수종에서 유도된 천연 생화학 경로 또는 이의 일부를 인코드하는 유전 물질을 포함하는데 이는 제공 유기체의 기능적 유전자 생성물을 생산할 수 있다. 제공 유기체의 생화학 경로 또는 이의 일부는 라이브러리의 각 숙주 유기체에서 기능적으로 재구성될 수 있다. 이와 같은 생화학 경로의 새로운 활성과 화합물은 여기에서 제공하는 방법 또는 통상적인 약물 개발 기술에 의해 스크린이 더욱 용이하다.
cDNA 라이브러리, 게놈 DNA 라이브러리와 혼합형 cDNA/게놈 DNA 라이브러리를 포함하는 이와 같은 라이브러리를 만들기 위한 시발 유전물질로 DNA 또는 RNA가 이용될 수 있다. 5.1.1에서 상술된 유기체와 같은 다수의 제공 유기체에서 유도된 DNA 단편은 숙주 유기체에 도입되는데 이와 같이 수집된 숙주유기체 각각에는 제공 유기체중 하나에서 유도된 DNA 단편을 포함할 수 있다.
숙주유기체와 제공유기체가 특정 유전적 특징을 공유하는 것이 적절한데 예를 들면 DNA에서 유사한 GC 함량, 공통적인 RNA 절단 메카니즘, 또는 적정 생장온도와 같은 생리학적인 특징등이 공유되는 것이 바람직하다. 따라서 제공 유기체와 계통학적으로 상당히 밀접한 관계에 있는 숙주유기체를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 다른 원핵 세포의 오페론을 클로닝하고 발현시키는데 있어서 원핵 숙주 유기체를 이용하는 것이 바람직하다.
전통적인 약물 개발 또는 약물 개발 기술에 적응하지 못하는 제공 유기체가 바람직하다. 예를 들면, 대부분 해양 박테리아가 잘 알려지지 않았고 통상적인 토양 미생물 과정에 잘 맞지 않는다. 본 발명은 생산과 정제 공정의 개발을 간단히 할 수 있다.
전달되는 제공 DNA 단편은 완전한 생화학 경로 또는 이의 일부 기능성 단백질은 인코드하는 코딩부분과 프로모터와 터미네이터와 같은 고유적으로 연합된 조절 부분으로 구성될 수 있다. 전체 생화학 경로를 인코드하는 가능성이 큰 거대 원핵 게놈 DNA 단편을 이용하면 적절한 결과를 얻을 수 있다. 전달된 DNA 단편의 고유 기능 및 조직이 숙주 유기체내에서 유지되는 경우 제공 유기체의 유전자는 조화롭게 발현될 수 있다. 숙주 유기체에 전달된 유전자의 전사를 보장하기 위해서는 DNA 단편에 외생 조절 부분을 결합시켜 고유 프로모터로부터 개시된 전사를 대체하거나 보강하게 한다.
관심을 끄는 것은, 해양 박테리아에서 유도된 대부분 유전자가 대장균에 있는 기능 단백질을 발현시키기 위한 고유 프로모터를 이용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 외생 조절부분을 이용할 필요없이도 해양 미생물이 발현될 수 있다. 표 4 에는 대장균에서 고유 프로모터를 이용할 수 있는 해양 박테리아를 나열한 것이다.
대장균의 고유 프로모터를 이용하는 해양 박테리아 유전자의 목록
유전자 종 및 속 참고문헌
카파-카라기나제(cgkA) 알테로모나스 카라기노보라,그람(-) 호기성 Barbeyron et al., 1994, Gene 139:105-109
Na+/H+안티포터(NhaA) 비브리오 알기노리키쿠스 Nakamura et al., 1994, Biochim Biophys Acta 1190:465-468
포스포디에스테라제(CpdP) 비브리오 피쉐리, 공생 Dunlap et al., 1993, J.Bact.175(15):4615-4624
키티나제 알테로모나스 sp., 균주 0-7 Tsujibo et al., 1993, J.Bact. 175(1):176-181
트리부틸 틴 클로라이드 저항성 알테로모나스 sp., M-1,그람(-) 구균 Fukagawa et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Comm. 194(2):733-740
dagA-상보성 알테로모나스 할로플랑키스,그람(-) MacLeod et al., 1992, Mol. Micro. 6(18): 2673-2681
비브리오신(nprV) 비브이오로레타이쿠스,그람(-) David et al., 1992, Gene 112:107-122
테트라사이클린저항성 비브리오 살모니시다, 호기성 Sorum et al., 1992, Chemo. 36(3):611-615
멜라닌 합성(melA) 쉬완넬라 콜웰리니아,그람(-) 페리파이트 Fuqua et al., 1991, Gene 109:131-136
DNA 수정 클러스터 하이포모나스 야나쉬니아,친열성 Danaher et a., 1990, Gene 89:129-133
적절한 구체예에서, 본 발명의 방법은 게놈내에 오페론이라고 하는 서로 떨어져 있는 기능적으로 관련된 유전자 덩어리내에 박테리아와 같은 원핵 세포의 유전자를 조직화시키는 방식으로 장점을 제공한다. 이와 같은 유전자 덩어리에서, 생화학 경로의 성분을 인코드하는 유전자는 통상의 조절 서열에 함께 연결될 수 있다. 필라멘트성 곰팡이(악티노마이세스-Actinomycetes)에서 기능적으로 연관이 있는 유전자는 서로 붙어 있는 것으로 알려져 있다. 많은 박테리아와 악티노마이세스(Actinomycetes) 그리고 일부 진핵 곰팡이에서 유전자가 집단을 이루고, 생합성 경로는 분리되어 특징화될 수 있다. 예를 들면, 에르위니아 허브콜라(Erwinia herbicola)에서 처음부터 카로테노이드 지아산틴과 베타-크립토산틴을 생산하는데 이용되는 12개 단백질이 활성화되어 대장균(E.coli)에서 동시에 생산되었다(Perry et al. 1986, J. Bacteriol, 168:607-612; Hundle et al. 1991, Photochem and Photobiol 54:1:89-93). 루이신과 이소루이신 생합성과 같은 원핵 생물 아미노산 생합성 경로와 글루코즈 전달 시스템 또한 별도의 유전자 덩어리에 포함될 수 있다. 따라서, 원핵생물이 제공 유기체로 이용되는 경우에, 생합성 경로와 기능적으로 연관된 유전자를 한 클론에서 분리해낼 수 있다.
상대적으로 코딩안된 부분이 적은 조밀한 게놈을 가지는 제공 유기체가 바람직하다. 많은 경우에 있어서, 상대적으로 적은 게놈을 가지는 박테리아로 예를 들면 대장균의 경우에 4400kbp, 아라키박테리아의 경우에 2500-3500kbp가 된다. 제공 유기체 게놈의 모든 서열을 포함하는 가능성이 99% 되기 위해서는 라이브러리에서 요구되는 독립된 클론의 수는 다음의 수식에 의해 계산될 수 있다 (Clarke et al. 1976, Cell 9:91-99):
수학식 1
이때, N 은 라이브러리에서 필요한 재조합클론수
P 는 서열의 가능성
f 는 하나의 재조합 클론에 있는 게놈의 부분 비율.
예를 들면, 대장균은 약 DNA가 4400kbp이고 코스미드 벡터는 40kbp의 DNA를 패키지할 수 있다. 이와 같은 계산에 따르면, 대장균의 전체 게놈은 코스미드 라이브러리에서 504개 클론으로도 완전히 제공할 수 있다는 것이다. 일반적인 DNA 라이브러리가 500,000개 독립적인 재조합 클론을 포함하기 때문에 하나의 라이브러리는 대장균과 유사한 크기의 게놈을 가지는 최고 1,000개 다른 박테리아 종을 효과적으로 나타낼 수 있다. 따라서, 상당한 화학적 다양성이 발생되고 1000종 이상의 박테리아의 다양한 유전물질로 구성된 유전자 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써 효과적으로 평가할 수 있다.
표준 문헌 예를 들면 Maniatis et al. 1989, Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York에서 상술된 과정에 따라 복합 유전자 발현 라이브러리를 작제하는데 이용되는 일상적인 분자생물학 반응을 실시할 수 있다.
도 3 에는 복합 천연 경로 유전자 발현 라이브러리에 대한 클로닝 전략에 대해 나타낸다. 제공 유기체에서 임의 세포는 유전자 발현 라이브러리의 작제를 위한 핵산 원료로 작용한다. 자연 발생 플라스미드와 같은 염색체외 유전 요소 DNA와 염색체 DNA를 포함하는 게놈 DNA가 이용될 수 있다. 또는 제공 유기체의 RNA를 이용할 수 있다. RNA, 적절하게는 mRNA를 본 기술 분야에 공지인 임의 기술을 이용하여 추출하고, 정제하고 이를 cDNA로 전환시킨다. cDNA의 제 1 가닥 합성을 시작하는 데에는 올리고(dT) 프라이머 또는 무작위 서열 프라이머를 이용할 수 있다. DNA 삽입체는 PCR에 의해 선택적으로 증폭될 수 있다.
5.1.2에 제공된 과정 또는 다른 공지의 과정에 따라 게놈 DNA와 RNA를 추출하고 정제할 수 있다. 필라멘트성 곰팡이와 박테리아의 경우에 이와 같은 과정은 a) 액체 배지에서 배양된 어린 균사에서 준비한 원형질의 신속한 SDS/고염에서 용균시키고 바로 평형을 갖춘 페놀로 추출하고; b) 구아니디움 이소티오시아네이트에서 원형질을 신속히 용균하고 이어서 CsCl 농도차에서 한외원심분리시키고; 또는 c) 아가로즈 플러그와 펄스된 겔 전기영동에서 준비된 원형질로부터 큰 분자량의 DNA를 분리해내는 것을 포함하는 몇 가지 기술로 구성될 수 있다. 박테리아의 경우에, 효소/계면활성제, 비-특이적 프로테아제와의 배양에 의한 용균과 페놀-클로람페니콜/이소아밀 알코올에 의한 추출과정이 이용될 수 있다.
최적의 결과를 얻기 위해서는 완전한 오페론 또는 이의 일부를 포함하는 더 큰 가능성을 위해 큰 무작위 원핵 생물 게놈 DNA 단편이 바람직하다. 게놈 DNA는 다양한 제한효소를 이용하여 특정부분에서 절단시킬 수도 있다. 무작위의 큰 DNA 단편(20kbp 이상)은 빈번히-절단시키는 제한효소로 게놈 DNA를 부분절단시켜 만들 수 있다. 요구되는 게놈 DNA의 양은 이용되는 게놈의 복합성에 따라 달라진다. 또는 DNA는 미세구멍을 가진 바늘을 통과시키거나 초음파 파쇄에 의해 물리적으로 전단시킬 수 있다.
비어있는 발현 벡터내에 삽입하기 전에 이와 같은 DNA 삽입체는 아가로즈 겔, 전기 영동, 동적 밀도차 원심분리 및 컬럼 크로마토그래피에 의해 크기에 따라 분리시킬 수 있다. 선형 10-40% 당 농도차가 바람직하다. 상보적인 접착 말단 단부를 가지는 발현 벡터내에 DNA 단편을 연결시킴으로써 삽입이 이루어진다. 연결반응이 이용되는 벡터 DNA와 DNA 삽입체의 양은 이들의 상대적인 크기에 따라 달라지는데, 이는 본 기술분야에 공지의 기술을 이용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 그러나, 발현벡터에 DNA를 절단하는데 이용되는 상보적인 제한효소 부위가 없는 경우에는 DNA 분자의 단부는 무딘 단부를 만들기 위해 효소적으로 변형시킬 수 있다. 또는 DNA 단부에 링커 또는 어뎁터와 같은 뉴클레오티드 서열을 연결시킴으로써 원하는 부위를 만들 수 있고; 이와 같이 연결된 링커 또는 어뎁터는 제한효소 엔도뉴클레아제 인지 서열을 인코드하는 특이적으로 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 또 다른 방법에 따르면, 절단된 발현 벡터와 DNA 삽입체는 동일 다량체 꼬리에 의해 변형될 수도 있다.
DNA 삽입체에 벡터 DNA를 연결시킨 후에 발현 구조체는 숙주 유기체에 도입될 수 있다. 형질도입, 형질 감염, 감염, 접합, 원형질 융합, 리포좀-중개된 전이, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션 및 미소돌출 공격등과 같은 다양한 방법이 있으나 이에 국한시키지는 않는다. 특정 구체예에서, 대장균 숙주에 박테리오파지 또는 코스미드 DNA의 도입은 시험관내에서 박테리오파아지 입자에 DNA를 패키지하여 이들 입자들이 대장균 세포를 감염시키도록 하는 것이다. 박테리아 접합과 같은 미생물 간에 DNA 전달하는 다른 자연 발생적인 메카니즘이 또한 이용될 수 있다.
발현 구조를 포함하는 숙주세포를 모아서 라이브러리를 만든 후에, 본 분야에 공지의 기술을 이용하여 증폭시키거나 복제시킬 수 있다. 증폭의 목적은 여러번 사용할 수 있는 라이브러리를 제공하는 것이다. 라이브러리를 도말하여 박테리아가 생장하도록 한 후 저장을 목적으로 박테리아 또는 파지를 수득하는 것으로 증폭을 실시할 수 있다.
또는 일정한 배열로 라이브러리를 저장할 수 있다. 다량의 라이브러리는 저밀도로 플레이트하여 하나의, 별개 플락 또는 콜로니를 형성하도록 하고 96-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트와 같은 코드가 된 다중 웰 마스터 플레이트의 웰에 콜로니 또는 개별 플락을 옮긴다. 개별 콜로니는 적절한 조건하에서 웰에서 생장시킨다. 코드된 마스터 플레이트는 각 클론을 별도로 하나이상의 작업 플레이트로 복제하는데 보관 원으로 사용될 수 있다. 따라서, 라이브러리에 있는 각 클론은 개별적으로 조작하고 검사된다. 코드된 보관 플레이트는 추가 이용을 위해 밀봉 보관할 수 있다. 클론의 복제와 이동은 다중-핀 복제기 또는 유체를 취급하기 위한 다중-채널 장치로 실시할 수 있다. 적절하게는 실험실 로보트에 의해 대부분의 이동과 조작이 실시된다(Bentley et al. 1992, Genomics 12:534-541).
본 발명의 라이브러리는 냉동기(-20℃ 내지 -100℃)에서 또는 액체 질소(-176℃ 내지 -196℃)에서 동결건조 또는 동결 보관된다.
라이브러리에서 제공 DNA를 포함하는 숙주 유기체는 이용되는 숙주-벡터 시스템에 따라 다양한 방법에 의해 확인되고 선택될 수 있다. 한가지 방법으로 이와 같은 숙주 유기체는 티미딘 카이나제 활성, 카나마이신, 암피실린, 블레오마이신 또는 티오스트렙톤과 같은 항생제에 저항성, 멜라닌과 같은 안료의 생산 및 메토트렉세이트에 대한 저항성 등과 같은 표적 유전자 기능의 유무에 따라 확인되고 선택될 수 있다. 또는 대사적 테스트, 조직 배양물에 촛점 형성 또는 베큘로바이러스에서 폐색체형성 등에 의한 숙주 유기체의 표현형 또는 대사과정의 변화 등을 이용할 수 있다. 제공 DNA의 존재에 대해 일단 선택되면, 추가 특징화를 위해 클론에서 효소검사 또는 대사 테스트를 실시한다.
제공 DNA 또는 이의 일부를 포함하는 클론 라이브러리에서 제공 DNA 삽입체를 특징화하기 위해, 대표적인 클론으로 DNA의 간단한 준비와 제한효소 분석을 실시한다. 결과는 라이브러리로 예상되는 삽입 DNA의 크기와 범위를 비교할 수 있는 제공 DNA 크기와 제한효소 패턴에 대한 특징을 제공한다.
5.1.5. 복합 키메라 경로 발현 라이브러리.
본 발명은 복합 키메라 경로 발현 라이브러리의 작제와 이용에 관계하는데 이때, 숙주 유기체에는 하나이상의 제공 유기체에서 유도된 무작위로 연결된 유전물질을 포함하는데 이는 제공유기체의 기능적 유전자 생성물을 생산할 수 있다. 라이브러리에 있는 숙주 유기체의 실제 수는 하나이상의 제공 유기체에서 유도한 무작위의 독특한 유전자 복합체를 포함할 수 있다. 고유의 조절 부분 또는 외부에서 공급된 조절부분에 의해 전이된 유전자의 공동발현이 영향을 받을 수 있다. 여러 가지 제공 유기체에서 유도된 다수의 유전자 생성물은 신규한 키메라 대사 경로와 신규한 화합물을 만들기 위해 숙주 유기체에서 상호 작용한다. 이와 같은 키메라 경로에서 신규 활성과 화합물은 통상적인 약물 개발 기술 또는 여기에서 제공하는 방법에 의해 좀더 용이하게 스크리닝될 수 있다.
복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리에서 어떻게 새로운 경로 또는 화합물이 발생되는지에 대한 이론에 제한을 두지는 않지만 다수의 제공 유기체에서 유도된 기능적으로 비동성 유전자의 공동발현에 의해 유전자 생성물은 생체내에서 서로간에 그리고 숙주 유기체의 성분과 상호작용을 할 수 있게 된다. 이와 같은 상호작용을 통하여, 새로운 생화학적 반응이 일어나고, 이들중 일부는 키메라 생화학 경로를 만들기 위해 구체적으로 작용할 수 있다. 비동성 유전자 생성물은 제공 유기체에는 없는 기질, 공인자 및 시그날 발생 분자와 만날 수 있다. 이와 같은 기질, 공인자 및 시그날을 발생시키는 분자는 숙주 유기체, 동일한 숙주 유기체 또는 배지에서 공동발현되는 다른 비동성 유전자 생성물에 의해 공급될 수 있다.
또한, 일부 비동성 유저자 생성물은 숙주 유기체에서 생합성동안에 구조적으로 변형되거나, 여러 가지로 국소화되거나 격실화될 수 있다. 일부 비동성 유전자 생성물은 고유 제공 유기체와는 상이한 숙주 세포 환경에 노출될 수 있다.
일부 비동성 유전자 생성물은 숙주유기체에서 작용하여 숙주 세포 환경을 변화시킬 수도 있다. 비동성 유전자 생성물의 기능에 영향을 주거나 영향을 받을 수 있는 숙주 세포 환경의 요소에는 염, 미량원소, 영양소, 산소, 대사물질의 농도, 에너지원, 산화환원 상태와 pH 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 일부 비동성 유전자 생성물은 숙주 유전자 생성물과 상호 작용하여 숙주 대사 경로를 변형시키게 된다.
비동성 유전자의 복합에 따라 자연계에는 존재하지 않는 신규한 키메라 생화학 경로와 신규한 종류의 화합물이 숙주 유기체 라이브러리에서 형성된다. 복합 키메라 경로 발현 라이브러리에서, 제공 유기체의 유전적 원료를 배로하여 확장시켜 개별 유기체에서 발견할 수 없는 다양한 화학적 구조를 제공한다. 준비된 라이브러리는 통상적인 방법 또는 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하여 스크린할 수 있다. 따라서, 약물 스크리닝에 신규한 경로와 화합물이 좀더 근접할 수 있게 하였다.
5.1.1에서 상술된 제공 유기체중 임의의 것이 복합 키메라 경로 발현 라이브러리를 만드는데 이용될 수 있다. 제공 유기체는 공지의 생물학적 성질에 기초하여 선택하거나 또는 공지의/또는 확인 안된 유기체 혼합물일 수 있다.
본 발명의 복합적인 키메라 경로 발현 라이브러리는 5.1.3에서 상술한 원리에 따라 합체될 수 있다. 제공 유기체로부터 DNA 단편이 무작위 결합을 시키기 위해서 라이브러리 어셈블리 과정은 다음의 단계를 포함하도록 변형될 수 있는데; 좀더 작은 DNA 단편의 발생, 유전자 카세트를 만들기 위해 프로모터와 터미네이터와 같은 조절 서열과의 연결 및 유전자 카세트에 결합.
삽입 DNA는 게놈 DNA의 단편 또는 mRNA에서 유도된 상보적인 DNA(cDNA)일 수 있다. 여러 종의 제공 유기체 DNA 또는 RNA는 공동 정제되거나 별도 분리되어 특정 비율로 복합시킬 수 있다. 클로닝 또는 발현 벡터 내로 삽입하기전에 임의 단계에서 삽입 DNA의 무작위 혼합을 실시한다.
5-메틸-dCTP와 같은 메틸화된 뉴클레오티드는 cDNA 합성에 이용되어 효소적 절단에 대해 보호를 하게 되고 프로모터와 터미네이터 단편에 연관된 센스 방향에 cDNA 삽입체를 직접 클로닝하게 한다.
2-7kbp의 게놈 DNA의 무작위 단편은 Sau3AI와 같은 상대적으로 절단부위가 많은 제한효소로 부분적인 절단에 의해 만들어진다. 부분적인 절단은 샘플을 아가로즈 겔 전기영동을 실시하여 모니터하고 확인한다.
구성 또는 유도성 프로모터와 터미네이터와 같은 외부 조절부위는 전달된 유전자의 발현을 유도하기 위해 제공된다. 숙주와 제공 유기체의 시스템이 적응성이 없는 경우에 이와 같은 조절 서열을 제공하는 것이 필수적이다. 특정 발현 숙주에 특이적이고 이들의 단부에 특정 제한효소 부위를 가지는 다양한 프로모터와 터미네이트 단편을 만들 경우 PCR을 이용한다. DNA 삽입체에 조절 부분을 결합시키는 임의 방법이 이용될 수 있다. 클리나우 단편으로의 처리와 부분적으로 채우는 반응과 같은 부분적인 뉴클레오티드는 적응성이 있는 단부를 가지는 프로모터와 터미네이터 단부에 특이적으로 연결되는 삽입체 DNA 단부를 만드는데 이용된다.
본 발명은 독특한 제한효소 부위의 양측에 서로 반대 위치로된 두 개 프로모터를 포함하는 유전자 카세트를 이용하는 것과 연관된 방법을 제공한다. 이와 같은 제한효소 부위에 삽입된 임의 DNA는 양측에 있는 두 개 프로모터에 의해 양가닥에서 전사될 수 있다.
본 발명은 또한 DNA 삽입체의 한 측에 있는 프로모터와 터미네이터를 포함하는 유전자 카세트를 이용하는 것과 연관된 또 다른 방법을 제공한다. cDNA의 직접 클로닝에 대한 과정을 따르는 경우 cDNA 삽입체의 5'단부와 3'단부는 프로모터 단편의 3'단부와 터미네이터 단편의 5'단부와 함께 독특하게 일치하는 제한효소 부위를 가진다.
양단에 양립하는 제한 효소부위를 가지는 게놈 DNA 단편 또는 cDNA는 프로모터에 연결시키고, 일부 경우에는 터미네이트 단편에 연결시켜 평균크기가 1-10kbp인 유전자 카세트를 만든다.
펩티드 합성에서 이용되는 것과 유사한 방식에 의해 다중 전사 단위로 구성된 단위(concatemer)를 어셈블리할 수 있다. 유전자 카세트 서브세트는 자석비드와 같은 고형상의 한 단부에 결합될 수 있다. 다른 자유 단부는 "탈-보호"를 위한 몇가지 연속적인 과정을 거치게 되고 나머지 전사 단위에 연속적인 연결과정을 거치게 된다. 고형상의 각 추가 과정후에 연결 안된 DNA 단편으로부터 단위를 분리시킨다. 결합이 완료되면, 인트론 뉴클리아제와 같은 제한효소로 배양하여 단위를 방출시키는데 인트론 뉴클리아제는 고형상에 인접한 독특한 매우 희귀한 부위를 절단하여 결합된 DNA가 절단되는 가능성을 줄인다. 결합된 DNA는 클로닝 벡터에 삽입되어 적절한 숙주 유기체로 도입되는 발현 구조체를 만든다. 또는 숙주 유기체내로 도입하기 전에 증폭을 위해 대장균 recA-균주내로 형질 도입시킨다.
프로모터와 터미네이터 합성, 유전자 카세트의 준비, DNA 삽입체의 어셈블리 및 삽입체와 벡터의 연결에 대해서는 5.4와 5.5에 상세히 설명한다.
일단 복합 키메라 경로 발현 라이브러리가 합체되면, 5.1.3에서 상술한 것과 동일한 방식으로 저장하고, 증폭하고, 복제하고, 선-선별하고 스크리닝할 수 있다.
5.1.6. 편향된 복합 발현 라이브러리.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 편향된 복합 천연 또는 키메라 경로 발현 라이브러리는 하나이상의 제공유기체에서 모운 미리 선택된 DNA 단편에서 만들 수 있다. 제공 유기체의 전체 수집된 게놈 DNA 또는 cDNA만을 이용하는 대신에, 이와 같은 방식은 소요의 화합물을 생산할 수 있는 클론 빈도를 증가시켜 스크린이 필요한 클론의 수를 줄이게 한다. 미리 선택된 DNA 단편은 부분적인 또는 완전한 생합성 경로를 인코드하는 유전자를 포함하는데 소요의 화합물을 만드는 것에 관련 있는 공지의 유전자로부터 준비된 다수의 프로브와 초기 DNA 라이브러리를 하이브리드시켜 미리 선택할 수 있다. 초기 DNA 라이브러리, 적절하게는 코스미드 라이브러리이고 반드시 발현라이브러리일 필요는 없는 라이브러리에는 하나이상의 제공 유기체의 DNA를 포함한다. 선-스크리닝을 위해서, 초기 라이브러리가 발현 라이브러리일 경우에 양성 클론에서 DNA는 대장균(E. coli) 또는 스트렙토마이세스 리비단(Streptomyces lividans)과 같은 숙주내에 이동되어 발현된다. 하나이상의 초기 라이브러리를 선-스크린하여 모든 양성클론에서 DNA를 모우고 편향된 복합 유전자 발현 라이브러리를 만드는 이용한다.
초기 라이브러리는 다양한 숙주 유기체에서 선-스크리닝할 수 있도록 증폭시킨다. 예를 들면, 스트렙토마이세스 리비단에서 유전자 발현 라이브러리가 일단 만들어지면, 옥시테트라사이클린을 생산하는 S. 리모시스(S. rimosis) 또는 악티노마이신 D를 생산하는 S. 파르루스(S. parlus)와 같은 발현과 스크리닝을 위한 특정 숙주 유기체에 도입시킨다. 자연 발생 플라스미드에서 유전자 전달을 위한 적절한 서열을 발현 벡터가 가지고 있는 경우에 이와 같은 서열은 접합 전달을 통한 다양한 적합성이 있는 숙주에 라이브러리를 이동시키는데 이용된다.
선-스크리닝에 이용되는 프로브는 폴리케티드 생합성 위치와 같은 임의 클론된 생합성 경로로부터 유도될 수 있는데 그 이유는 최상으로 특징화된 생합성 위치가 있고 공지의 유전자 집합, 예를 들면, actI(악티노로딘 생합성-Malpartida et al. 1987 Nature 325:818-820); whiE(포자 안료 생합성 - Blanco et al. 1993 Gene 130:107-16)와 eryAl(Donadio et al. 1991 Science 252, 675-679) 사이에 상당한 서열 보존이 되어 있기 때문이다. 다른 항생제 또는 부차적인 대사물질 생합성 위치에도 유사한 원리를 적용시킬 수 있다. 예를 들면, 바실러스와 같은 GC가 낮은 그램 양성 박테리아에서(Stachelhaus et al. 1995 Science 269:69-72) 그리고 티오스트렙톤, 버지니아마이신, 발리노마이신과 악토노마이신을 생산하는 악티노마이세츠 종과 같은 GC가 높은 그램 양성 박테리아에서 클론된 펩티드의 합성으로 이들 두 개 집단 박테리아에서 새로운 생합성 위치를 확인하는데 프로브로 이용되는 충분한 양의 유사한 서열을 보유하게 된다. 펩티드 합성효소, 아미노글리코시드 합성효소와 같은 다른 클론된 생합성 경로는 초기 라이브러리의 선-스크리닝을 위해 프로브를 제공할 수 있다.
또는, 부차적인 대사과정에 연관된 단백질을 인코드하는 DNA로부터 구한 프로브에 의해 초기 DNA 라이브러리를 스크리닝 할 수 있다. 이와 같은 프로브는 총 DNA로 부터 1차 대사과정 생합성 경로와 관련된 코딩된 DNA에서 코딩안된 DNA를 제하여 만들 수 있다. 따라서 남아있는 DNA는 2차적인 대사과정에 연관된 단백질을 인코드하는 코딩부분에 대해 편향되어 있다. 5.3.5에서는 공제 과정에 대해 상술한다.
5.2. 복합 발현 라이브러리의 스크리닝
본 발명의 약물 개발 시스템은 복합 발현 라이브러리를 스크리닝하는 신규한 방법을 포함한다. 항체 결합과 리간드 결합과 같은 발현 라이브러리를 스크리닝 하는 표준 방법이 본 발명의 발현 라이브러리에 이용되나 라이브러리는 바람직한 경로와 대사 생성물을 발현하는 숙주 유기체를 확인하도록 만들어진 리포터 섭생을 채택할 수도 있다.
여기에서 청구하는 방법은 라이브러리에서 생산성있는 클론의 효과적이고 방대한 작업의 감지 및 분리를 하는데 허용되는 최소한의 작업을 이용하여 상당규모의 샘플을 처리할 수 있게 한다. 라이브러리를 화합물의 생산 또는 관련 DNA의 존재에 대해, 그리고 광범위한 활성에 대해 존재-스크리닝할 수 있다. 라이브러리는 또한 생체내와 시험관 검사에서 표적으로 직접 처리할 수 있다. 확인된 또는 분리된 세포집단은 바로 배양하여 수적으로 팽창시키고, 신규한 화합물 생산에 대해 추가 분석하게 된다. 신규한 활성 또는 화합물의 생산을 유도하는 대사 경로를 인코드하는 유전자는 분리된 클론내로 유입되는 유전자 물질을 특징화함으로써 설명될 수 있다. 유전자, 경로, 클론에 대한 정보로 약물의 최적화와 생산을 상당부분 실행할 수 있다.
여기에서 이용된 것과 같이, "라이브러리 클론" 또는 "라이브러리 세포"는 제공 대사 경로 또는 이의 성분을 인코드할 수 있는 적어도 하나의 DNA 단편을 포함하는 복합 유전자 발현 라이브러리에 있는 숙주 세포 또는 유기체를 의미한다. "양성클론" 또는 "양성세포"란 리포터에 의해 시그날을 발생시키는 라이브러리 클론 또는 세포를 의미한다. "생산성 세포" 또는 "생산성 클론"은 라이브러리에 있는 "비-생산성 세포"와는 구별되는 소요의 활성 또는 화합물을 생산할 수 있는 라이브러리내에 있는 세포 또는 유기체를 말한다.
"선-스크린"이란 소요의 화합물 또는 유전자 및 활성의 존재를 나타내는 일반적인 생물학적 또는 생화학적 검사를 말한다. "스크린"이란 특정 질병 또는 임상적인 질환에 관계하는 생화학적 검사를 말하며, 표적을 이용한다. "표적"이란 테스트 시에 화합물이 스크린에서 노출되는 일반적으로 전체 세포 또는 효소와 같은 거대분자를 말한다. 존재-스크린과 스크린을 일반적으로 사용하여 리포트 섭생의 존재 하에 라이브러리 세포 집단에서 실행하는 자장 세포 소트 시스템(MACS)의 이용 또는 형광-활성화된 세포 소트(FACS)에 의한 형광 감지, 시각적 감지 또느 발색 지시물질의 상분석 등을 실시한다.
본 발명의 방법은 소요의 세포를 감지하고 분리하는 목적으로 생산성 세포와 연합된 감지가능한 시그날을 발생에 대한 상호 배타적인 접근 방식이 아닌 또다른 방식을 제공한다. 리포터는 감지가능한 시그날을 직간접으로 발생시킬 수 있는 분자이다. 예로써 리포터는 빛을 발생시키는 분자 또는 섭생의 다른 성분에 의해 특이적으로 인지되는 세포 표면 분자가 된다. 리포터 섭생은 리포터에 의해 시그날을 발생할 수 있는 리포터와 조성물로 구성된다. 리포터 섭생은 살아있는 지시계 세포 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 리포터 섭생 성분은 라이브러리의 숙주 유기체에 결합되거나 스크리닝을 위해 별도의 유닛을 만들기 위해 침투성 반-고형 배지에 있는 라이브러리 각각 또는 집합체에 공동 포함될 수 있다.
다음의 문헌에 상술된 소요의 화합물의 감지를 위해서, Diaion HP20 또는 Amberlite XAD-8 수지와 같은 중성 수지 등의 흡수성 있는 물질을 라이브러리 세포에 첨가시킬 수 있다(Lam et al. 1995, J Industrial Microbiol 15:453-456). 대부분 3차 대사물질이 소수성 분자이기 때문에 이와 같은 대사물질의 방출 또는 분비는 세포 외부에 침전으로 유도시킨다. 배양물에서 수지에 포함시키는 경우에 용출이나 스크리닝을 위해 배양물로부터 제거되는 수지에서 분리를 실시해야 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 숙주 유기체에는 화학 반응성 구조체를 포함하도록 만드는데, 이는 발현 라이브러리에서 스크린될 바람직한 화합물 또는 대사물질에 반응성이 있는 화학반응성 프로모터가 연합된 리포터 분자를 인코드하는 유전자로 구성된다. 바람직한 활성 또는 화합물의 존재 하에서 양성 클론에 있는 화학 반응성 프로모터는 작동식으로-연합된 리포터 유전자의 전사를 개시시키기 위해 유도될 수 있다. 양성 세포는 리포터 유전자의 발현에 의해 발생되는 감지가능한 시그날에 의해 확인될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 생리학적인 프로브를 이용하여 바람직한 활성 또는 화합물이 존재함으로써 각 세포에서 생리학적 변화에 반응하여 시그날을 발생시킨다. 이와 같은 프로브는 생화학 경로에서 활성 또는 화합물에 의해 직간접적으로 리포터 분자로 전환되는 리포터 분자 선구물질이 될 수 있다. 생산성 세포와 접촉 시에 생리학적 프로브 또는 리포터 전구물질은 생산성 세포를 확인 또는 분리를 시키는 감지가능한 시그날을 발생시킨다. 라이브러리 세포에 프로브 또는 전구물질을 직접 첨가하여 접촉이 이루어진다. 또는 스크리닝 동안 라이브러리 세포에 프로브 또는 전구물질의 포획 또는 확산에 의해 접촉이 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 바람직한 활성 또는 화합물의 생산을 알리는데 지시계 세포를 이용하고 따라서 라이브러리에서 생산성 세포의 확인 또는 분리가 가능하다. 전체 살아있는 또는 고정된 지시계 세포 또는 이의 세포 일부는 라이브러리 세포의 개별 또는 전체와 혼합되거나 함께 포획될 수 있다. 지시계 세포는 바람직한 활성 또는 화합물의 존재에 대해 반응하는 이들의 생물학적 성질에 대해 선택된다. 지시계 세포는 바람직한 화합물의 표적 세포일 수도 있다. 또는 지시계 세포는 감지가능한 시그날을 발생시키기 위해 리포터와 접합하여 이용될 수 있다.
각 라이브러리에 대한 존재-스크린 및 스크린은 가능하면 숙주 유기체와 제공 유기체의 완전한 특징화후에 선택된다. 숙주 유기체가 양성인 검사에서는 부적합하고 제공 유기체가 양성인 검사는 라이브러리 존재-스크린 또는 스크린에 이용가능한 것으로 간주한다. 기질은 적절하게는 바람직한 생합성 능력과 연관된 효소의 표적으로 특정 클론에서 DNA에 대한 전사와 해독 활성의 존재를 암시하는 무관한 표적(예로 아밀라제, β-갈락토시다제)이 될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구체에에서, 항생제 저항성은 소요의 2차 대사물질의 생산 또는 생산가능성을 나타내는 지시계로 이용될 수 있다. 라이브러리 클론이 항생제 판넬에 노출될 때 항생제에 대한 저항성은 자가-독성에 대한 보호로써 2차 대사물질 생합성 경로에 인접하여 있는 유출 펌프와 같은 자가-방어 기작의 존재를 암시하는 것이다. 이와 같은 클론은 감지시점에서 2차 대사물질 생산을 나타내지는 않으나 추가 조절 또는 검사될 수 있는 인접한 생합성 경로를 포함하는 가능성이 높다.
본 발명은 또한 배양접시에서 박테리아를 생장시키는 전통적인 방법에 대체하는 한정된 공간에서 세포를 생장시키는 효과적인 방법으로 포획방법을 제공한다. 플레이트 포맷에서 세포를 생장시키는 것은 노동 및 물질 집약적으로 포획된 세포는 액체 배양물에서 용이하게 생장할 수 있는데 분열하는 세포가 함께 유지되는 장점이 있어 소요의 2차 대사물질의 감지를 실시할 수 있다. 포획 방법의 또 다른 장점은 존재-스크리닝 또는 스크리닝을 별도 유닛에서 실행할 수 있도록 라이브러리 세포에 리포터 섭생 또는 다른 지시계 세포를 함께 포획시킬 수 있다는 것이다. 세포의 포획은 아가로즈, 알지네이트 또는 카라기난 등과 같은 물질을 이용하여 열적 또는 이온성 동결에 의해 용이하게 실시할 수 있다.
FACS는 입자의 형광발생 성질에 기초하여 입자(1-130㎛ 크기)를 분리시킬 수 있는 공지의 방법이다(Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). FACS는 개별 입자에서 형광부분을 레이져로 여기시키는 기초작업으로 실시한다. 양성 형광으로 입자에 작은 전기적 전하를 부가하게 된다. 이와 같은 변화로 인하여 혼합물로부터 양성입자와 음성입자의 전자기적 분리가 가능하다. 분리된 입자는 96-웰 또는 384 웰 플레이트의 각 개별 웰에 직접 보관할 수 있다.
MACS는 자성 미소구(0.5-100㎛ 직경)에 결합할 수 있는 능력에 기초한 입자를 분리시키는 공지의 방법이다(Dynal 1995). 세포-표면 항원 또는 헵탄을 특이적으로 인지하는 항체의 공유결합에 의한 첨가 등을 포함하여 자성 미소구에서 다양한 변화를 실시할 수 있다. 또는 포획된 세포에 자성을 띄게 하기 위해, 페리틴과 같은 자성 발생 리포터 단백질을 생성하는 숙주 세포내에 리포터 섭생을 결합시킬 수 있다. 이와 같은 경우에, 양성 시그날을 발생시키는 포획된 세포는 자성 미소구로 작용할 수 있다. 선택된 미소구는 자장에 노출시켜 물리적으로 조작한다. 예를 들면, 선택된 미소구는 반응용기의 외측에 자석을 공급하여 분리시킬 수 있다.
5.2.1. 리포터 구조체.
본 발명에 따르면, 라이브러리에 있는 숙주 유기체는 리포터 유전자와 작동식으로 연합된 화학 반응성 리포터로 구성된 화학 반응성 리포터 구조체를 포함하도록 만들 수 있다. 숙주 유기체 또는 구조체에는 화학 반응성 프로모터의 전사 조절 또는 시그날 생산과 연관된 부수적인 단백질을 인코드하는 다른 유전자를 가질 수도 있다.
화학 반응성 프로모터는 특정 활성 또는 특정 화합물의 존재하에서만 작동식으로 연합된 리포터 유전자의 전사를 개시하거나 조절하고 RNA 중합효소에 결합할 수 있는 임의 이중-나선 DNA 서열이 된다. 바람직하게는 화학반응성 프로모터는 유도 활성 또는 화합물 없이 숙주 유기체에 구성적 배경이 되는 전사활성이 없거나 무시할 정도의 수준을 가진다. 전사 활성을 감소시키거나 중지시켜 활성 또는 화합물의 존재에 대해 음성적으로 반응하는 화학반응성 프로모터를 이용할 수 있다.
본 발명에 유용한 프로모터에는 대사과정 프로모터, 생분해 경로 프로모터, 사이토크롬 및 쇼크 단백질과 같은 스트레스 반응에 대한 프로모터(Orser et al. 1995, In vitro Toxicol 8:71-85)등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 예를 들면 슈도모나스 TOL 플라스미드 메타-절단 경로의 Pm 프로모터와 벤조에이트와 할로 또는 알킬로방향족 화합물에 의해 유도될 수 있고 조절되는 이의 양성 조절자 Xyls 단백질 등이 이용될 수 있다(Ramos et al. 1988, FEBS Letters 226:241-246; de Lorenzo et al. 1993, Gene 130:41-46; Ramos et al. 1986, Proc Natl Acad Sci 83:8467-8471; Mermod et al. 1986, J. Bateriol 167:447-454). 화학반응성 프로모터의 예로는 포스포네이트 이용(Metcalf et al. 1993, J Bacteriol 175:3430-3442)과 연관된 프로모터; cis-cis 뮤코네이트에 감응성이 있는 프로모터(Cohen et al. 1993, J Bacteriol, 175:7856-7862; Cohen et al. 1993, J. Bacteriol, 175:1484-1492), 스타필로코커스 아우레우스에서 아르젠과 카드뮴 오페론에서의 프로모터(Corbisier et al, 1993, FEMS Letters 110:231-238); sfiA(Quillardet et al. 1982, Proc Natl Acad Sci 79:5971-5975) 및 zwf(Orser et al., 1995, supra)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
리포터 유전자는 감지가능한 시그날을 직간접적으로 생성시키는 리포터 분자를 인코드한다. 여기에는 발색 또는 자성발생 리포터와 생체발광, 화학적 발광 또는 형광발생등과 같은 빛을 발산시키는 리포터를 이용하는 것을 포함하나 여기에는 빅토리아 아에퀘리아(Chalfie et al. 1994, Science 263:802-805)의 그린 형광 단백질(GFP); 형광이 강화된 변형되 GFP(Heim et al. 1995, Nature 373:663-4); 비브리오 하르베이(Vibrio harveyi)의 루시페라제(Karp, 1989, Biochim Biophys Acta 1007:84-90; Stewart et al. 1992, J Gen Microbiol, 138:1289-1300)와 개똥벌레인 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)의 루시퍼라제(De Wet et al. 1987, Mol Cell Biol 7:725-737)를 포함할 수도 있으나 이에 국한시키지 않는다. 임의 형광 발생 또는 발색 효소가 이용될 수도 있는데 베타-갈락토시다제(LacZ, Nolan et al. 1988, Proc Natl Acad Sci USA 85:2603-2607)와 알칼린 포스포타제를 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 임의 세포 표면 항원이 이용될 수도 있는데 대장균 플라겔리에의 표면에서 플라겔린(fliC 유전자)과 융합 단백질로써 발현되는 대장균 티오레독신(trxA 유전자)과 같은 대장균(E. coli) 티오레독신-플라겔린 융합 단백질이 될 수 있다(Lu et al. 1995, Bio/ Technology 13:366-372).
여기에서 제공하는 예시적인 화학 반응성 리포터 구조체는 특정 벤조에이트에 반응하여 리포터 GFP의 전사와 해독이 되는(도 6) 슈도모나스(Pseudomonas)의 XylS 유전자와 Pm 프로모터(Ramos et al. 1988, FEBS Letter 226:241-2476)를 포함하는 pERD-20-GFP이다.
상이한 프로모터 서열은 PCR에 의해 발생되어 GFP의 코딩 부분 또는 플라겔린-티오레독신 리포터에 부착된다. 소요의 프로모터를 포함하는 게놈 DNA와 플라스미드 DNA는 표준 DNA 정제 방법을 이용하여 관련 종으로부터 정제하고 TE에 재현탁시킨다. 서브클로닝을 위해 제한효소부위를 추가로 가지는 프로모터 부분의 5'와 3' 경계에 상응하는 프라이머를 합성한다. 선택된 주형과 프라이머에 적합한 것으로 결정된 조건하에서 Thermocycler에서 증폭 반응을 실시한다. 반응 생성물은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리시켜, TA 클로닝 키트를 이용하여 서브클론시킨다(Invitrogen, La Jolla). 증폭된 프로모터 서열은 GFT 또는 플라겔린-티오레독신 cDNA의 5'에 일반적인 클로닝 벡터안에 다시 클론된다.
5.2.2. 생리적인 프로브와 리포터 전구물질.
여기에서 사용하는 생리학적인 프로브는 접촉시에 또는 삽입시에 라이브러리 세포 또는 지시계 세포의 생리학적 또는 대사변수에서 변화에 반응하여 시그날을 발생시키는 형광 또는 발색제가 된다.
프로브는 형광발생제에 연결된 효소기질일 수도 있다. 예를 들면, 형광발생 알킬 에테르를 세포와 함께 배양시킨다. 세포가 폴리아로마틱 탄화수소를 생산하는 경우 탄화수소는 마이크로좀성 디알킬라아제를 유도하여 형광발생 알킬 에테르를 절단하게 되어 형광 생성물이 만들어진다.
형광 프로브는 다음의 생리학적 대사적 변수에 변화를 감지하는 것에 대해서 선택된다(Shechter, et al. (1982, FEBS Letters 139:121-124)) (Bronstein et al. (Anal Biochem 219:169-81)).
대사활성 원인 (특정예) 균주/기질 (화학물 종류)
막전위의 감소 스트레스, 손상(이소프로판올) BacLight 균주(반-침투성 핵산균주)
세포 내 pH 생리적 변화 BCECF-AM(친지성 아세토옥시메틸에스테르 페놀성 플로오르)
사이토크롬-중개된산화의 증가 폴리아로마틱 탄화수소(나프탈렌)에 의한 마이크로좀성 디알킬라제 유도 7-에톡시-헵타데실-쿠마린(형광발생 알킬 에테르)
5.2.3. 라이브러리의 존재-스크리닝과 스크리닝
본 발명의 복합 유전자 발현 라이브러리는 다양한 방법에 의해 존재-스크린되거나 스크리닝 될 수 있는데 예로써 시각적 감시, 자동화된 상분석, 분자 베콘 DNA 프로브(Tyagi et al. 1996, Nature Biotechnol, 14:303-308)에 하이브리드화, 형광 활성화된 세포 소트(FACS)와 자성 세포 소팅(MACS)를 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 스트리닝은 증폭안된 또는 증폭된 라이브러리의 대량 배양물에서 실시한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 존재-스크리닝 또는 스크리닝하는 동안에 비활성 안정한 다공성 반-고형 매트릭스에 라이브러리 세포 개별 또는 단체로 방울씩 포획된다. 반-고형 매트릭스는 기체, 액체, 거대분자등이 침투할 수 있고 포획된 세포가 성장 분할할 수 있다. 적절한 매트릭스에는 아가로즈, 알지네이트 및 카라기난을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 포획된 라이브러리 세포는 작은 방울로 배양하고 테스트하는데 추가 조작을 위해 작은 방울에서 세포를 회수할 수 있도록 살아있게 한다. 매트릭스는 선택적으로 선택성 포식을 포함하는 라이브러리 세포에 대해 선택성을 가지도록 항생제와 같은 기질에 노출시킬 수 있다. 다음의 실시예는 설명을 위한 것이므로 본 발명을 이에 한정하고자 함은 아니다.
포획하는 연속적인 존재-스크리닝 또는 스크리닝동안에 이용되는 감지방법에 따라 큰 방울(0.5-2.5㎜) 또는 작은 방울(10-250㎛)로 만들어 실시한다. 방울의 크기와 조성은 방울을 만드는 동안에 조절할 수 있다. 적절하게는 각 큰 방울 또는 작은 방울에는 1 내지 5개 라이브러리 세포를 포함할 수 있다.
예를 들면, 다음과 같이 알지네이트 나트륨을 이용하여 큰 방울을 만들 수 있다: 오버헤드 믹서를 이용하여 2000rpm에서 1% 농도를 100㎖ 멸균수에 알지네이트 나트륨을 용해시킨다. 1-5개 세포를 각 방울에 포획시키기 위해서 대장균(E.coli) 또는 쉬조사카로마이세스 폼비(Schizosaccaromyces pombe)와 사카로마이세스(saccaromyces) 종과 같은 효모: 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종의 포자: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis): 아스파라질러스(Aspergillus)와 뉴로스포라(Neurospora) 종과 같은 곰팡이 등의 라이브러리 세포를 알지네이트 나트륨 용액에 첨가한다. 혼합물은 기체를 제거하기 위해 적어도 30분간 방치하고; 별개의 방울을 만들 수 있는 임의 장치를 통하여 압출시킨다. 이와 같은 장치중에 하나는 25 가우지 바늘이다. 135mM 염화칼슘 용액을 부드럽게 교반시키는 비이커내에 알지네이트 나트륨 용액을 한 방울씩 첨가하여 방울을 만든다. 방울은 10분간 고형으로 만들고 염화칼슘 용액을 빼내고 적절한 배양 배지로 대체된 멸균 플라스크로 옮긴다. 포획된 라이브러리 세포는 표준조건하에서 생장시킨다.
작은 방울을 만들 수 있는 임의 방법 또는 장치를 이용하여 작은 방울을 만들 수 있는데 두 개 유체 환형 분무기, 정전기적 방울 발생기, 진동성 오리피스 시스템 및 에멀션화 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 반-고형 방울을 만드는 또다른 방법은 본 분야에 공지되어 있다(Weaver, U.S. patent 4,399,219).
다음의 실시예는 에멀션화 기술을 작은 방울을 만드는 과정에 대해 상술한다(Monshipouri et al. 1995, J. Microencapsulation, 12:255-262). 오버헤드 믹스를 이용하여 2000rpm에서 0.6g 폴리포스페이트 나트륨과 2% 알지네이트 나트륨을 100㎖ 멸균수에 용해시키고 알지네이트 용액은 60분간 가스를 빼낸다. 오일상은 카놀라 또는 올리브유 300㎖을 적어도 30분간 1.0g 정제된 콩 렉치틴과 혼합하여 준비한다. 50% 글리세롤 10㎖에 1.9g 황화 칼슘을 포함하는 슬러리는 적어도 15분간 초음파분쇄에 의해 준비한다. 방울당 1-5개 세포를 만드는 라이브러리 세포와 슬러리는 오일상에 도입하기 전에 바로 알지네이트 용액에 혼합시킨다. 에멀션화 과정은 알지네이트 혼합물을 오일상에 천천히 이동시키고 580rpm에서 10분간 혼합하여 개시된다. 500㎖ 멸균수를 첨가하고 혼합을 5분간 지속한다. 작은 방울은 원심분리에 의해 오일에서 제거한다. 작은 방울은 씻어내고 적절한 배양 배지로 재현탁시키고 필요한 경우 표준조건하에서 즉시 배양한다. 방울의 크기는 상 현미경에 의해 검사한다. FACS 또는 MACS에 의한 소트 목적은 방울이 소트에 필요한 범위 크기를 벗어나는 경우에 요구하는 크기를 제한하는 필터 막을 이용하여 방울크기를 선택할 수 있다.
본 발명에 따르면, 약물 스크린의 리포터 섭생 또는 표적의 성분은 라이브러리 세포와 같이 포획될 수 있다. 생검, 효소 또는 리포터 분자를 포함하는 전체 지시계 세포 또는 세포 부분은 전술한 것과 같이 큰 방울 또는 작은 방울을 만들기 전에 배지에서 현탁된 라이브러리 세포와 혼합할 수 있다. 라이브러리 세포에 의해 생산된 소요의 화합물은 공동 포획된 지시계 세포 또는 리포터에 닿기 위해 방울내에 축적되고 확산되어 시그날을 발생시킨다. 공동 포획된 지시계 세포는 바람직한 화합물 예를 들면 항-감염에 대한 병인물질 또는 항암제용 표적세포등과 같은 살아있는 표적이 될 수 있다. 지시계 세포에서 대사과정에 임의 변화 예를 들면, 죽음, 성장 장애는 시그날로 이루어져 공지의 방법을 이용하여 방울내에서 감지된다. 이와 같은 방법에는 핵심 착색, 방울의 공학 측정 등과 같은 생리학적인 프로브를 이용하는 것을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
방울이 캡슐화된 라이브러리 세포에 의해 생산된 리포터 섭생, 대사물질 및 화합물의 성분에 노출되면, 리포터 성분은 반-고형 배지를 통하여 확산되어 시그날을 발생시킨다. 예를 들면, 적절한 소팅 포맷에 가게되는 방울 배치에 생리학적 프로브가 첨가된다. 라이브러리 세포가 방울내에서 분열하는 경우에, 고유 양성 세포의 자손은 마이크로콜로니와 함께 유지되고 따라서 강력한 시그날이 발생된다. 반-고형배지는 리포터에 의해 발생되는 시그날과 광학적으로 필적할 수 있는 것이 바람직한데 예를 들면 시그날을 효과적으로 감지하기 위해서는 파장범위에 광투과성을 가지는 것이다.
육안으로 또는 방울을 스크리닝 포인트를 통해 통과시키는 임의 장치를 이용하여 발색 리포터를 이용함으로써 큰 방울을 분류하는데 양성을 분리해낼 수 있다. 작은 방울은 FACS 또는 MACS를 이용하여 분리할 수 있다. FACS 기술은 일정수준의 작업자 또는 적절한 기계(Becton-Dickinson FACStar Plus)를 이용하여 실시한다. 입자 현탁 밀도는(세포 또는 방울) 1 × 106 입자/㎖로 조정한다. 모든 경우에서 양성세포는 웰당 1개 클론으로 다중-웰 플레이트에 직접 분리한다. MACS는 작업자의 지시에 따라 MPC-M 자성 튜브를 이용하여 실시한다(Dynal, 5 Delaware Drive, Lake Success, New York 11042).
존재-스크린 또는 스크린에서 양성으로 밝혀진 포획된 세포는 적절한 한천 또는 액체에 넣어 방울을 배양시킴으로써 회수할 수 있다. 일정 배양기간 후에 양성 세포는 방울 밖으로 생장한다. 조작과 방울의 보관에 편의성을 위해, 연속 배양은 다중-웰 플레이트에서 실시한다.
더 작은 집단으로 줄인 존재-스크린된 양성은 글리세롤 존재 하에서 냉동 및 저장되거나 다중-웰 플레이트에서 생장될 수 있다. 다양한 형태의 검사 플레이트에서 (예를 들면 차등 배지, 선택성 배지, 항균 또는 조작된 검사 배지) 멀티핀 복제기를 이용하여 클론된 집단을 이동시키는데 이용된다. 특이적 검사는 이와 같은 미소절정 플레이트에서 실시하고 표준 플레이트 판독기에 의해 판독하거나 현행 고효율 스크리닝 기술에 이용되는 다른 포맷에서 실시된다.
더욱 토론에서 명백히 하기 위해 다음의 소단락은 진핵, 원핵 제공유기체 및 숙주와 연관된 본 발명의 여러 구체예를 상세히 설명한다. 다음의 구체예는 예를 든 것으로 본 발명의 이에 국한하는 것은 아니다.
5.3. 제공 유기체에서 고품질의 핵산을 준비하는 과정
DNA 라이브러리를 만드는데 있어서 제공 유기체의 유전자 정보를 대표하는 시발물질로써 고품질의 DNA 또는 RNA를 이용하는 것이 중요하다. 제공 유기체 또는 환경 샘플에서 고품질의 핵산을 추출하고, 선택하고, 준비하는 방법을 본 단란에서 제공한다. 2차 대사과정에 관련된 DNA를 모우기 위한 목적으로 DNA 라이브러리를 존재-스크리닝하는데 이용되는 빼낸 DNA 프로브를 만드는 방법을 상술한다.
5.3.1. 구아니디움 이소티오시아네이트 핵산 분리.
냉동건조된 또는 동결안된 물질은 기계적인 연마기 또는 미세 연마 유리 또는 부석이 있는 절구에서 손으로 분쇄할 수 있다. 연마 후에 바로 연마된 냉동 건조된 물질은 물질 1-2g 당 10㎖ 용해 완충액으로 혼합시킨다. 용해 완충액은 5M 구아니딘 이소티오시아네이트, 50mM Hepes pH 7.6, 10mM EDTA, 5% β 멀캅토에탄올(또는 250mM DTT)이다. 혼합 후에 그리고 5분간 50℃에서 배양 후에 용액은 4% 사르코실에 넣고 혼합하고 50℃에서 5분간 배양한 후 8000g에서 원심분리시킨다. 상층액이 흐려지면, 27,000g에서 90분 원심분리단계를 이용하여 바람직하지 않은 탄수화물은 가라앉힌다. 또는, 바람직하지 않은 오염물질의 용해질을 맑게 하는 데에는 15,000 회전을 이용한다. 원심 분리 후에, 상층액은 1.42M CsCl(0.15g CsCl/㎖)로 만들고 원심분리 튜브내에 미리 만들어진 5.7M CsCl/TE(10mM 트리스-HCl/1mM EDTA) 용액에 얹는다. 20℃에서 18시간동안 160,000g에서 한외-원심분리를 실시한다. 한외원심분리후에, 1.42M/5.7M CsCl에서 맑고 젤리형의 층이 DNA이고 전체 세포 DNA는 튜브의 바닥에 맑은 펠렛으로 존재한다.
한외-원심분리 단계에서의 DNA는 TE완충액에 대해서 투석시키고, 0.1M NaCl를 제공하여 2.5배 용적의 에탄올로 침전시키고, 건조시켜 적정양의 TE로 다시 용해시킨다. DNA 층이 흰색인 경우에 남아있는 탄수화물을 제거하기 위해 CsCl/비스벤지디이미드 층에서 8시간동안 다시 원심분리시킨다. 염료는 85% 이소프로판올로 2-5회 세척하여 제거하고 DNA는 전술한 것과 같이 투석하고 테스트시킨다.
RNA는 재현탁 완충액(5M 구아니딘 이소티오시아네이트, 50mM Hepes, pH 7.6 10mM EDTA)에서 용해시켜 1.33 구아니딘 이소티오시아네이트 50mM Hepes pH 7.6, 10mM EDTA 용액으로 희석시킨다. 총 RNA를 원하는 경우 희석된 RNA 샘플은 2배 에탄올 또는 1배 이소프로판올을 첨가하여 침전시킨다. 침전된 RNA는 70% 에탄올로 헹구어내고, 건조시키고, 물 또는 포름아미드로 재현탁시켜 사용할 때까지 -70℃에서 저장시킨다.
5.3.2. 폴리(A)를 포함하는 RNA의 분리
진핵 mRNA 분자의 대부분에는 3' 단부에 최대 250 염기 길이의 폴리(아데닐)산 트랙을 포함하기 때문에 올리고-dT 셀룰로오즈 매트릭스를 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한다. 상업적으로 이용할 수 있는 올리고-dT 매트릭스를 사용할 수 있는데, 간단한 중력 컬럼, 반-자성 입자, 스핀과 푸쉬 컬럼을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 분리된 mRNA는 물 또는 포름아미드에 용해된 상태로 저장되거나 -70℃에서 건조될 수 있다.
5.3.3. tRNA로부터 비-리보좀성 서열의 수집.
비-리보좀성 서열을 모우는 것이 배양이 어렵거나 불가능한 제공 유기체로부터 유용한 RNA 집단을 얻기 위한 필수 단계일 수 있다. 다른 RNA 종에서 주요 리보좀성 RNA을 정제해내는데 있어 중성 슈크로스 농도차에서 RNA를 분리하는 것이 유용하다(R. McGookin 1984, In Methods in Molecular Biology Vol. 2 Nucleic Acids. Humana Press, pp. 109-112). 원심 분리후에, 다량의 리보좀성 RNA를 포함하는 샘플은 버리고 나머지 부분은 투석시켜 침전시킨다.
시발물질로서 소량의 RNA를 증폭시키기 위해 무작위-꼬리를 달고 있는 올리고-dT 프라이머와 PCR의 유무에 관계없이 무작위 프라이머를 이용하는 다른 방법을 이용한다.
5.3.4. 클리노우 단편을 이용하는 필-인 반응(fill-in reaction).
절단후에 절두형 DNA 분자를 만드는데 이용되는 기술은 5' 접착성 단부에 뉴클레오티드를 첨가시키기 위해, 대장균 DNA 중합효소의 클리나우 단편 또는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 부족한 다른 DNA 중합효소를 이용하는 것이다. 완전한 뉴클레오티드 세트 없이 이용될 때 이와 같은 활성은 서로에 대해서는 적응성이 있으나 그들 자체내에서는 적응성이 없는 연결 단부를 만드는데 이용된다.
고역가 유전자 라이브러리와 구조체를 만드는데 이와 같은 기술이 이용된다(Hung et al. 1984, Nuc Acids Res 12:1863-1874; Zaborovsky et al. 1986, Gene 42:119; Foster, 1991, Ph. D. thesis, University of California, Santa Barbara; Loftus et al. 1992, Biotechniques 12:172-175).
클리나우 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 50㎎/㎖ BSA, 1mM dNTP), 효소(10u/50㎕ 반응)를 이용하여 37℃에서 3-4시간 동안 배양하여 필-인 반응을 실시한다. 반응 후에 DNA를 친화력 크로마토그래피, 에탄올 침전 및 스핀-컬럼 원심분리 등을 포함하는 다양한 방법에 의해 정제될 수 있다.
5.3.5. 존재-스크리닝을 위한 빼낸 DNA 프로브의 준비 과정
RNA는 분별과정이 필요 없는 복잡한 라이프 사이클을 가지는 어린, 중기 로그상태 배양된 유기체에서 분리해낸다. 이와 같은 RNA 집합체는 분화안된 생장과 1차 대사에 관계된 유전자에 상보적이다. RNA는 시험관에서 바이오티닐화되고 동종 또는 상당히 연관된 비동성 종에서 게놈 DNA의 무작위 전단된, 유전자 크기의 단편에 하이브리드 된다. 이와 같은 혼합물의 페놀 추출로 인하여 사이면에서 주요 대사 RNA에 상보적인 게놈 서열이 제거된다. 이와 같은 공정을 1회 반복된다. 생성되 단일 가닥 DNA 단편은 1차 대사 유전자의 (+) 가닥과 2차 대사 관련된 유전자를 포함하는 다른 유전자의 (+)와 (-) 가닥으로 구성된다. DNA 혼합물을 변성시키고, 관련된 서열만이 하이브리드되어 이중 나선 DNA를 형성할 수 있도록 하는 매우 엄격한 조건하에서 5-10 1/2 Cots동안 다시 하이브리드된다. 남아있는 단일 가닥 DNA는 하이드록시아파타이트에 결합시키거나 또는 mung 콩 뉴클리아제로 절단시켜 제거한다. 1차 대사과정과 연관된 유전자가 아닌 분리된 이중-나선 DNA는 무작위 프라이밍을 이용하여 라벨시키고 라이브러리의 존재-스크리닝에 대한 프로브로 이용될 수 있다.
5.3.6. 토양 또는 다른 혼합형 환경 샘플에서 핵산의 정제
토양 샘플은 액화 질소에서 섬광 냉동시키고 처리할 때까지 -70℃에 보관한다. 또는 토양 샘플은 -20℃에서 냉동 보관한다. 샘플은 사용하기 직전에 얼음에서 해동시키거나 또는 처리 전에 냉동-건조시킨다.
물질의 물리적인 상태와 원료에 따라서 약간 수정이 된 과정에 의해 전체 핵산을 추출한다. 건조 또는 반건조된 샘플은 냉동시키고 직접 처리하거나; 매우 젖은 상태 샘플은 섬광 냉동시키고 냉동-건조시키고; 오일 샘플은 처리하기 전에 인산 완충염으로 희석시킨다. 다음의 과정중 적절한 것을 선택한다. Ogram et al. 1987, J. Microbiol. Meth. 7:57-66; Steffan et al. 1988, Appl. Environ. Microbilogy, 54:137-161; Werner et al. 1992, J. of Bact 174(15):5072-5078; Zhou et al. 1996, Appl. Environmental Microbiol. 62(2):316-322.
간략하면, 5g 샘플은 뜨거운 구아니디움 이소티오시아네이트 용해 완충액(5.3.1 참조)에 한 방울씩 첨가하여 직접적으로 용해시키고, 염화 세슘 정제를 한다. 또는 샘플은 50㎖ 원심분리 튜브에서 13.5㎖ DNA 추출 완충액(100mM 트리스-HCl, pH 8.0, 100mM EDTA, 100mM 인산 나트륨, 1.5mM NaCl, 1% CTAB(헥사데실메틸암모니움브로마이드))와 100㎕ 20㎎/㎖ 프로테네이즈 K와 함께 혼합시켜 37℃에서 30분간 225rpm에서 수평 교반시킨다. 교반 후에 20% SDS 1.5㎖을 첨가하고 2시간동안 65℃에서 샘플을 배양하고 매 15-20분간 아래 위를 뒤짚는 교반을 실시한다. 상층액은 20℃에서 10분간 6000xg에서 원심분리에 의해 수득한다. 펠렛은 추출 완충액 4.5㎖, 20% SDS 0.5㎖을 첨가하고, 1분간 볼텍스하고 65℃에서 10분 배양후 다시 원심 분리시켜 3x를 추출시킨다. 3배 추출물에서 수득한 상층액은 클로로포름-이소아밀 알코올(48:1)을 이용하여 2회 추출한다. 핵산은 0.6 용적의 이소프로판올을 첨가하고 1시간 배양하고, 실온에서 16,000g 20분간 원심분리에 의해 침전시킨다. 가공안된 핵산 펠렛은 10mM 트리스-HCl pH 8.0, 2mM EDTA에서 재현탁시킨다. 필요한 경우에 DEAE 크로마토그래피에 의해 DNA를 추가 정제한다. 4M 아세테이트 리튬 또는 페놀산 추출에 의해 RNA를 선택적으로 침전시킴으로써 펠렛에서 tRNA를 수득할 수 있다(Ausubel et al. 1990, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York; Hoben et al. 1988, Appl., Environ, Microbiology, 54:703-71).
5.3.7. DNA 복구.
잘린 또는 분해된 DNA는 T4 DNA 중합효소로 임의 단편 단부에 블런트 단부를 만들어서 복구할 수 있다(New England Biolabs). DNA는 블런팅 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.8, 10mM MgCl2, 40㎛ dNTPs, 5u/10㎍ T4 DNA 중합효소)에서 37℃ 1-2 시간동안 처리한다. DNA는 3M 아세테이트 나트륨 1/10 부피와 100% 에탄올 2.5 부피를 첨가하여 에탄올 침전시킨다.
원심분리와 물에 재현탁시킨 후에, DNA 샘플은 16℃에서 1-2시간동안 대장균 리가제 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.8, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 26㎛ NAD+ 25㎛ BSA, 10u 대장균)으로 처리한다. 처리 후에 DNA 샘플은 20mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.3M 아세테이트 나트륨 용액으로 5배 희석하고 페놀 및 클로로포름으로 각 1회 추출한다. 수용상에 2.5배 용적 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킨다. 샘플은 70% 에탄올로 2회 세척하고 멸균수 또는 10mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM EDTA에서 재현탁시키고 사용할때까지 -70℃에서 보관한다.
5.4. 원핵 세포 발현 라이브러리용 과정
이 단락에서는 원핵 숙주와 제공 유기체를 이용하여 천연 경로 발현 라이브러리와 키메라 경로 발현 라이브러리를 만드는 과정을 제공한다. 5.3.1 - 5.3.4 에서 상술된 기술에 의해 수득된 정제된 고품질 DNA는 다음의 과정에 이용될 수 있다.
5.4.1. 박테리아 종, 균주 및 배양 조건
특별히 우수한 발현 숙주 유기체는 제한-, 엔도뉴클레아제 결손, 재조합 결손이다. 대장균(E. coli)에서 적절한 균주는 XLl-MR (유전자형은 McrA-, McrCb-, McrF-, Mrr-, hsdr-, endal-, recA-)이다. 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 적절한 균주는 S. 리비단(S. lividans) TK 64이다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 경우에는 적절한 균주는 B. 서브틸리스(B. subtilis) PB168 trpC2; B. 서브틸리스(B. subtilis) pB5002 sacA, degUhy; B. 서브틸리스(B. subtilis) PB168delta trpC2, pksdelta 75.8; B. 서브틸리스(B. subtilis) ATCC 39320 and 39374이다.
제공유기체도 박테리아 종이다. 일부는 현행 검사에서 감지될 수 있는 독특한 화합물을 생산하는 능력에 대해 선택된다. 또는 관심이 가는 환경 샘플에서 이들의 존재에 대해 선택될 수 있다. 일부예에서, 해양 박테리아는 Harbor Branch Oceanographic Institute and Scripps Institute of Oceanography 에서 구할 수 있다. 이들은 200마이클 근해를 벗어난 원해 바다에서 구할 수 있다. 샘플이 분류학적으로 다양하다는 것을 확인하기 위한 필수 수준에서 대사 테스트와 그람 테스트 및 콜로니 형태에 대해 테스트한다.
라이브러리 원액이 준비되면 37℃ 에서 대장균을 생장시켜 30℃에서 발현시킨다. 해양 악티노마이세스(Actinomyces)와 스트렙토마이세스(Streptomyces)종은 30℃ 에서 생장시킨다.
5.4.2. 제공 게놈 DNA 의 준비.
각 박테리아종에서 10㎖ 배양물을 생장시킨다. 박테리아는 원심분리에 의해 펠렛화시키고 10mM 트리스, 5㎜EDTA(TE)에서 재현탁시킨다. DNA는 5.1.2에서 상술한 것과 같이 정제되거나 또는 박테리아 펠렛은 SDS/프로테네이즈 K에 용해시키고 페놀; 클로로포름에 의해 추출하고 이소프로판올로 침전시킨다. 생성된 정제 DNA 는 TE에서 밤새 재현탁시킨다.
각 정제된 DNA 한방울씩을 아가로즈 겔 전기영동시켜 DNA 농도를 결정하고 일체성을 확인한다.
천연 경로 발현 라이브러리를 위해 무작위 거대 DNA 단편을 만들기 위해서 각 종에서 20㎍ DNA 를 Sau3A와 같은 빈번히-절단하는 효소를 이용하여 1α 효소 완충액과 ㎍DNA 당 0.01-0.5 u 효소로 37℃에서 1시간 동안 배양시켜 부분적으로 사용된 효소의 양은 원하는 크기 범위를 만들기 위해 실험적으로 결정한다. 절단된 DNA 를 모우고 페놀; 클로로포름 추출시키고, 에탄올 침전시킨다. 혼합물 100㎍은 게놈 DNA 의 고유 단편을 요구하는 각 라이브러리에 이용된다. 이와 같은 혼합물은 슈크로즈 농도차를 통하여 크기별로 선택적으로 분류할 수 있다. 크기 분리에 의해 키메라 경로 발현 라이브러리에 대해 더 작은 DNA 단편이 동시에 선택될 수 있다.
절단 및 크기분류는 샘플을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다.
5.4.3. 원핵 세포 프로모터 단편의 생성.
한 실시예에서, 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 유일한 BamH1 부위의 양측 중 한측에 베타-갈락토시다제 프로모터(lac)가 두 개 포함한 단편을 만드는데 각 복사체에는 중앙에 있는 BamH1 위치쪽으로 직접 전사를 위한 lac 이 위치해 있다(도 4A). 합성된 올리고뉴클레오티드는 합성기에 의해 포스포릴화 될 수 있다. 각 올리고뉴클레오티드 400㎎은 5분간 가열하고 25℃에서 30분 이상 서서히 냉각시키고 T4 DNA 리가제와 함께 실온에서 30분간 연결시켜 서냉 복원된다. 연결 혼합물은 아가로즈 겔 전기영동을 시키고 2-7 kbp 단편은 절단하여 Gene Clean 에 의해 정제시킨다. 결합된 쌍을 이룬, 적정 방향을 잡고 있는 카세트는 1×리가제/PEG 완충액에서 T4 DNA 리가제와 함께 15℃ 16시간 배양함으로써 pBSK 플라스미드 벡터의 Smal 부위내로 삽입된다. 연결 혼합물은 XL1-MR 세포내로 도입시킨다. 각 클론은 제한효소 분석에 의해 분석하고 방향과 정확성을 확인하기 위해 선택적으로 서열화한다.
pBSK-(lac/lac)n 클론(n은 2 내지 10의 정수)을 0.3ℓ양에 배양시키고 플라스미드는 플라스미드 준비 키트(Qiagen)을 이용하여 정제한다. 선택 정제된 pBSK- (lac-lac)n 40㎍을 1×완충액에서 Smal 으로 완전히 절단한다. 절단된 DNA는 아가로즈 겔 전기영동시키고 lac/lac 프로모터 다이머는 잘라내어 Gene G/ean으로 정제한다. 1×완충액에서 BamH1으로 완전히 절단한다(도 4B 와 4C). 절단된 프로모터 단량체는 페놀: 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전시키고, 1×C1AP 완충액에서 CIAP로 처리하여 탈 포스포릴화시킨다. 탈 포스포릴화된, 절단된 프로모터는 전술한 것과 같이 추출하여 침전시킨 다음 20㎎/㎖ 농도에서 TE에 재현탁시키고 -20℃에 저장한다.
또 다른 실시예에서, 준비된 프로모터 단편은 프로모터 서열은 포함하기 않은 유사하게 준비된-링커와 혼합하고 제공 게놈 DNA 와 연결시키는데 이용된다. 이로써 안티-센스 전사가 바람직한 경우에 하나의 프로모터만 있는 카세트를 만들 수 있다.
5.4.4. 복합 키메라 경로 발현 라이브러리를 위한 유전자 카세트 준비.
한 실시예에서, 게놈 DNA 의 BamHI-BamHI 단편(평균크기 3.5kbp)을 데포스포릴화된 프로모터 단편과 혼합하고 그다음 연결시킨다. 게놈 DNA 에 대한 프로모터 몰비율은 20:1 이다. 생성된 유닛(lac/게놈 DNA 단편/lac)은 4kbp 평균 크기를 가진다. 이용될 수 있는 다른 원핵 프로모터는 다른 대장균 프로모터(Harley et al., 1987, Nuc Acid REs 15:2343-2361)와 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 발현 숙주에 이용하기 위해 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로모터(Strohl 1992, Nuc Acid Res V20:961-974)를 포함할 수 있다. 미결정된 또는 상당한 재조합 능력을 가지는 숙주에서 여러 가지 카세트를 포함하는 임의 클론에 여러 가지 상이한 프로모터를 포함하도록 상이한 일련의 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다.
5.4.5. 고형 서포트 준비.
Pierce(Cat No 53113)으로 부터 Ultralink 고정된 스트렙타아비딘 비드를 구입하였다. Pierce(Cat No 53112)에서 3M Emphaze 바이오서포트 배지 AB1 " 블랭크 비드"를 구입하였다. 다른 구입체에서의 유사 고형 서포트가 이 목적을 위해 대체될 수 있다.
Life Technologies (Gibco-BRL) 로 부터 올리고뉴클레오티드를 구입하였다. 올리고뉴클레오티드 "비드-연결된-3"는 5'-인산-GCCGAC CAT TTA AAT CGG TTA AT 3' 이다. "비드-연결된-3"는 5'-인산-TAA CCG ATT TAA ATG GTC GGC 3'" 이다. 서냉복원하였을 때 이들 올리고뉴클레오티드에는 SwaI 제한효소 엔도뉴클레아제 부위(아래 밑줄친 부분)를 포함한다. 서냉복원된 비드-연결된 올리고뉴클레오티드는 3'단부에 AT 달려있는 있다. 이와 같이 부착된 것은 올리고뉴클레오티드 비드-연결된-5 에서 굴게 표시하였다.
바이오틴-GCC GAC CAT TTA AAT CGG TTA AT
CGG CTG GTA AAT TTA GCC AAT
각 비드-연결된 올리고뉴클레오티드 동량은 에펜도르프 튜브에서 함께 혼합한다. 5M NaCl 을 최종 농도 300mM 로 튜브에 혼합한다. 대조군으로써 서냉복원 안된 올리고뉴클레이티드를 이용하여 아가로즈 겔 전기영동에 의해 서냉복원을 확인하다.
블랭크 비드를 만들기 위해, 100㎎ 건조 비드는 1㎖ 인산 완충된 염(PBS)에서 재현탁시킨다. 최종 농도 1㎎/㎖로 소혈청 일부민(BSA)에 첨가한다. 실온에서 4시간동안 비드를 회전시킨다. 비드는 원심분리에 의해 펠렛화시키고 1M 트리스 -HCl pH8.0 으로 실온에서 2시간동안 3×세척하여 반응안된 아자락톤 부위를 차단시킨다. 비드는 간단한 원심분리에 의해 펠렛화시키고 PBS 로 완전히 세척한다. 블랭크 비드는 사용할때까지 4℃에서 PBS 에 저장한다. 스트렙타아비딘 비드에 비드-연결된 올리고뉴클레오티드에 결합시키기 위해 10㎍의 미리 서냉복원된 올리고뉴클레오티드는 1×결합 완충액(PBS,500mM NaCl)에서 20㎖ Ultralink 고정된 스트렙타아비딘 비드와 함께 혼합시킨다. 비드는 비드를 현탁상태로 유지시키기 위해 역위상태로 실온에서 3시간 동안 배양시킨다. 비드는 펠렛화시키고 1㎖ 결합 완충액으로 3×세척한다. 그다음 비드는 1×연결 완충액(50mM 트리스-HCl pH7.8, 10mM디티오트레티올, 1mM ATP, 25㎍/㎖ BSA)으로 세척하고 평행을 이루게 한다. 비드는 사용할때까지 4℃에 보관한다.
5.4.6. 복합 키메라 경로 발현 라이브러리의 어셈블리
자성 비드에 유전자 카세트의 부착; 유전자 카세트는 T4 폴리뉴클레오티드 카이네이즈를 이용하여 1×카이네이즈 완충액에서 포스포릴화시킨다. 포스포릴화된 단편은 에탄올 침전시키고 TE 에서 재현탁시킨다. 이의 1/10을 두 개의 짧은 포스포릴화안된 합성 링커의 혼합물에 연결시킨다. 나머지 9/10은 추후 공정에 이용된다. 각 링커는 두 개의 드물게 절단하는 효소 즉 Not1 또는 Srf1 중 하나를 가진다. 또한, 링커를 포함하는 Not1은 올리고뉴클레오티드 합성시기에 바이오티닐화 시킨다. Not1과 Srf1 링커는 100:100:1 의 비율로 포스포릴화된 전사 뉴닛과 혼합시키고 15℃에서 16시간동안 1×리가제/PEG 완충액에서 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결시킨다. 혼합물은 아비딘-공액된 MPG 자석 비드에 결합시키고 제조업자가 권하는 과정에 따라 연결 혼합물에서 비드-결합된 전사단위를 제거한다.
연결된 DNA 혼합물에서 약 1/2은 한 단부에는 바이오티닐화된 Notl 링커가 위치하고 다른 단부에는 Srf1 링커를 가진다. Notl 단부는 아비딘-바이오틴 연결에 의해 비드에 결합될 수 있다. 양단에 Not1 링커가 있는 단편은 추가 첨가 단계에 관여하지 않는다. 양단에 Srf1 링커가 있는 단편은 자석 분리단계에 유지되지 못한다.
비드 결합된 DNA 에 첨가를 위해 DNA 집합의 준비; 포스포릴화된 전사 단위의 나머지 9/10 전술한 것과 같이 연결시키나 Srf1 링커에만 연결시키고 Srf1 으로 완전히 절단한 다음 디포스포릴화반응 정제와 에탄올 침전 과정을 거친다.
비드-결합된 DNA 의 탈-보호; 비드에 결합된 전사유닛은 1×Srf1 완충액에서 Srf1 효소로 완전히 절단한다. 반응은 열에 의해 비활성화시키고 비드는 자장 분리에 의해 빼낸다.
결합: 포스포릴 제거 반응한 Srf1-Srf1 절단된 전사유닛을 포함하는 연결 혼합물에 1×연결 완충액하에서 비드를 첨가한다. 연결반응은 T4 DNA 리가제의 첨가에 의해 개시되고 25℃에서 60분간 진행하고 리가제를 열에 의한 비활성시키고 자석 분리에 의해 비드를 빼낸다. 연결은 포스포릴화된 비드-결합된 DNA 와 포스포릴화안된 전사유닛 사이에서 주로 일어난다. 비드에서 전사유닛은 T4 폴리뉴클레오티드 카이나제에 의해 포스포릴화시키고, 열에 의해 불활성화시키고, 자석을 이용하여 분리시키고 추가 T4 DNA 리가제의 첨가제 의해 연결 혼합물로 복귀시킨다.
이와 같은 과정은 10번 반복하고 Not1 으로 절단시켜 비드로부터 폴리머를 잘라낸다. 절단된 DNA 는 에탄올 침전시키고, TE 에서 재현탁시키고 아가로즈 겔에서 관찰하여 크기와 품질을 확인하고, 발현 숙주에 따라 SuperCos1 또는 다른 벡터안으로 삽입한다. 5.4.5 에서 상술하는 것과 같이 관련 발현 숙주에서 원핵 세포 라이브러리를 만드는데 단위(콜카타머)가 이용된다.
5.4.7 복합 천연 경로 발현 라이브러리의 어셈블리
대장균 라이브러리에 대한 발현 벡터는 30-42kbp 크기의 삽입체를 유지할 수 있는 코스미드 SuperCos1 이 바람직하다. SuperCos1으로 DNA 단편의 삽입과 Gigapack 추출물을 이용한 패키지는 제조업자의 지시에 따라 실행한다(Stratagene).
간략하면, XL1-MR 숙주 세포는 DNA 라이브러리를 포함하는 SuperCos1 파아지로 감염시킨다. 다음과 같이 실시한다: XL1-MR 세포는 1% 말토즈, 10㎜MgSO4 가 포함된 5㎖ LB 배지에서 37℃ 300rpm 으로 밤새 생장시킨다. 밤새 배양된 배양물은 1:10으로 희석시키고 LB/10mM MgSO4 에서 37℃ 300rpm 에서 3시간 배양시킨다. 배양물은 800×g 에서 원심분리에 의해 펠렛화시키고 5mL LB에서 재현탁시킨다. 현탁액 600㎖는 실온에서 30분간 파아지 입자에 패캐지된 500cfu 라이브러리로 배양시키고 이어서 8배 LB를 이용하여 37℃, 300rpm 에서 60분간 배양시킨다.
발현 라이브러리의 증폭을 위해, 감염된 숙주 세포는 50㎖LB, 50㎍/㎖ 암피실린이든 150㎜ 배양접시에 도말한다. 플레이트는 실온에서 47시간동안 미리 건조시킨다. 스프레딩후에, 플레이트는 37℃에서 밤새 배양시킨다. 플레이트를 긁어내어 콜로니는 플레이트당 15% 글리세롤 85% LB를 포함하는 3㎖에 재현탁시킨다. 이와같은 박테리아 현탁액은 추가 사용을 위해 -70℃에 보관한다.
개별 콜로니를 스크리닝하기 위해 라이브러리를 준비하기 위해서 감염된 숙주 세포는 50㎖ LB, 50㎎/㎖ 암피실린이 포함된 150㎜ 배양접시에 도말한다. 플레이트는 미리 실온에서 48시간동안 건조시킨다. 도말 후에, 플레이트는 37℃ 에서 밤새 배양시킨다. 생성된 콜로니는 멸균된 집게를 이용하여 집어내고 다중-웰 플레이트중 한 개 웰로 이동시킨다. 384-웰 플레이트의 각 웰에는 75㎖ LB, 50㎍/㎖ 암피실린, 7% 글리세롤을 포함한다. 외측 줄(총 80개 웰)은 접종시키지 않고, 연속적인 배양과 냉동시키는 과정동안에 증발 장벽을 제공하기 위해 배지로 채워둔다. 이와 같이 접종된 마스터 플레이트는 교반 없이 37℃에서 16시간 동안 둔다. 밤새 배양된 마스터 384-웰 플레이트는 원료 플레이트로 이용하여 하나이상의 작업 384-웰 플레이트 또는 Ommi-Tray로 복제시킨다. 마스터 384-웰 플레이트는 개별적으로 밀봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 복제는 384-핀 복제기를 이용하여 실시한다. 사용하기 전후에 384-핀 복제기는 20초간 표백제에 담구고 이어서 30초간 물에 담구고 그다음 5초간 에탄올에 담구고 불꽃에 그을린다. 라이브러리 어셈블리 방법은 벡터와 발현 숙주 선택에 따라 달라진다.
5.4.8. 발현 라이브러리의 존재-스크리닝
존재 스크린에는 세 가지 과정 즉 세포내, 차등, 선택과정이 있다.
간략하면, 첫째 범주인 세포내 존재-스크리닝은 화학-반응성이 있는 리포터 구조를 포함하도록 조작된 숙주내에 라이브러리를 도입시키는 것이다. 리포터는 GFP(그린 형광 단백질) 또는 β-갈락토시다제이고 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 또는 큰방울 분류에 의해 선택이 이루어진다.
두 번째 범주인 차등 존재-스크리닝은 형광 또는 발색 생리학적 추적자와 함께 숙주에서 라이브러리를 배양하고 이어서 FACS 또는 큰 방울 분류를 실시하는 것이다.
세 번째 범주인 선택성 존재-스크리닝은 항생제와 같은 선택성 물질로 숙주에서 라이브러리를 배양하고 이어서 살아있는 또는 다중 세포를 확인하기 위한 FACS 또는 큰방울 분류를 실시하는 것이다.
모든 방법에서 세포분류는 개별 배양물을 검사하기 전에 증폭된 라이브러리의 대량 배양물에서 실시한다.
라이브러리는 FACS 또는 큰방울 분류에 의해 존재-스크린된다. DNA 라이브러리를 포함하는 숙주 세포 집합체는 저밀도 또는 고밀도 미세 환경을 촉진하는 두가지 포맷중 하나에서 배양한다.
제 1 포맷에서, 증폭된 라이브러리의 세포는 개별 세포로 검사한다. 대장균 라이브러리 몇 방울을 20배 배지에서 300rpm, 30℃, 4시간동안 생장시키고, 펠렛화시키고, 1배 멸균 이중증류수에 재현탁시키고 형광 프로브(필요에 따라)로 배양시키고 FACS 를 실행시키기 위해 얼음위에 둔다.
제 2 포맷에서, 증폭된 라이브러리 몇 방울은 5.2.3 에서 상술한 것과 같이 기질 또는 선택성 물질 존재 하에 포획하고 배양한 다음 FACS 또는 큰 방울 분류를 실행한다.
형광 추적자 또는 기질과 함께 검사될 배양물에 대해, 배양물은 ddH2O 로 재현탁시키고, 착색시키고 제조업자의 과정에 따라 FACS 를 실시하는데 일반적으로는 다음과 같다: 배양은 15분간, 실온, 암상태에서 실시하고, 1.5㎖ 마이크로퓨즈 튜브에서 5분간 펠렛화시키고 1배 냉각 ddH2O 에서 재현탁시킨다.
분류 후에, 발현 라이브러리에서 선택된 1∼1000개 클론 또는 큰 방울 집합체는 0.5L 영양배지에서 배양시킨다. 배양된 박테리아와 배지는 0.5L 에틸아세테이트를 이용하여 추출함으로써 화학분석을 위해 처리시킨다. 회전 증발에 의해 배양물 ℓ당 약 20㎎-1g 추출물의 가공안된 유기 추출물을 얻는다. 동족 클론된 DNA 는 정제하고 숙주 세포로 다시 형질도입시켜 코스미드에 관련 서열의 국소화를 확인한다. 라이브러리 클론으로부터 발현에 의해 발생된 화학 샘플은 일련의 칼럼(양이온, 음이온, 역상)을 이용하여 HPLC 에 의해 검사하고, NMR 을 이용하여 정략적으로 화학 분석한다.
5.4.9. 평판 복제에 의해 해양 그람(-)/대장균 라이브러리의 대사 테스트
DNA 라이브러리를 준비하기 전에 각 야생형 해양종을 테스트하여 다중성을 방지하고 완료된 라이브러리에서 실시되는 대사 테스트의 배열을 결정하도록 한다.
개별 클론은 스크리닝하기 위한 라이브러리를 준비하기 위해 대장균 XLI-MR 와 같은 감염된 숙주 세포는 50㎖LB, 50㎎/㎖ 암피실린이 있는 150㎜ 배양접시에서 도말한다. 플레이트는 실온에서 48시간 동안 미리 건조시킨다. 도말 후에, 플레이트는 실온에서 48시간 동안 미리 건조시킨다. 도말 후에, 플레이트는 37℃에서 12시간 배양시킨다. 생성된 콜로니는 멸균 집게를 이용하여 선택하고 384-웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 옮긴다. 각 웰에는 75㎖ LB, 50㎍/㎖ 암피실린, 7% 글리세롤을 포함한다.
외측 줄(총 80개 웰)은 접종시키지 않고, 연속적인 배양과 냉동시키는 과정동안에 증발 장벽을 제공하기 위해 배지로 채워둔다. 이와 같이 접종된 마스터 플레이트는 교반없이 37℃에서 16시간 동안 둔다. 밤새 배양된 마스터 384-웰 플레이트는 원료 플레이트로 이용하여 하나이상의 작업 384-웰 플레이트 또는 Ommi- Tray로 복제시킨다. 마스터 384-웰 플레이트는 개별적으로 밀봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 복제는 384-핀 복제기를 이용하여 실시한다. 사용하기 전후에 384-핀 복제기는 20초간 표백제에 담구고 이어서 30초간 물에 담구고 그 다음 5초간 에탄올에 담구고 불꽃에 그을린다.
일련의 차등/선택성 배지(예를 들면 사이드로되어 감지 배지 또는 항균배지)위에 DNA 라이브러리를 복제시키기 위해 원료 플레이트로 작용 다중-웰 플레이트 또는 Ommi-Trays 를 이용한다. 결과를 종합하여 DNA 라이브러리를 만드는데 이용되는 야생형 해양 박테리아의 프로파일과 비교한다.
5.4.10 큰방울 포획에 의한 해양 그람(-)/대장균의 대사적 테스트
알지네이트 나트륨을 취하여 2000rpm 에서 오버헤드 믹서를 이용하여 1% 농도에서 멸균수 100㎖에서 용해시킴으로써 클론을 포획시킬 수 있다. 라이브러리 현탁액을 첨가시켜 방울당 적어도 1∼5개 클론을 첨가한다. 혼합물은 기체를 빼내기 위해 적어도 30분간 방치한다. 그 다음 혼합물은 개별 방울을 만들 수 있는 임의 장치를 통과 시킨다. 이중 하나는 25 가우지 바늘이 있는 주사기이다. 이를 135mM 염화셀슘이 든 천천히 교반시키는 비이커내에 적하시킨다. 방음은 10분간 경화시켜 멸균 플라스크로 옮기고 염화 셀슘은 제거하고 LB/Amp 비지와 기질(예로써 X-글루코시다민)로 대체한다. 방울을 포함하고 있는 플라스크는 30℃에서 밤새 교반시키고 다음날 아침에 양성 클론에 대해 검사하는데 이는 청석 콜로니가 있으면 양성을 나타낸다.
방울은 큰 투명한 트레이에 단층으로 위치시켜 눈으로 검사한다. 양성 클론을 제거하여 LB/Amp 와 50mM 시트레이트 나트륨 pH7.4를 포함하는 96-웰 마스터 플레이트에 위치시켜 방울을 용해시켜 37℃ 밤새 생장시킨다. 이와 같은 밤새 배양된 마스터 96-웰 플레이트는 하나이상의 작업 다중 웰 플레이트 또는 Ommi Tray 에 복제하도록 원료 플레이트로 사용한다. 마스터 96웰 플레이트는 개별적으로 봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 양성 클론은 생성물의 특정 테스트를 위해 또는 존재-스크린 또는 스크리닝을 위해 보내질 수 있다. 다중-핀 복제기를 이용하여 복제를 실시함으로써 추가 스크리닝을 실시할 수 있다. 사용하기 전후에, 다중-핀 복제기는 20초간 표백제에, 그다음 30초간 물에, 그리고 5초간 에탄올에 담구고 불꽃에 그을린다.
5.4.11. 작은 방울 포획화에 의해 해양 그람(-)/대장균 라이브러리의 대사적 테스트
다음의 방법에 따라 작은 방울을 만들 수 있다. 오버헤드 믹서를 이용하여 2000rpm에서 0.6g 폴리스페이트 나트륨과 2% 알지네이트 나트륨을 100㎖ 멸균수에 용해시킨다. 그 다음 혼합물에서 60분간 기체를 빼낸다. 그 다음 1.9g 황산 칼슘은 적어도 15분간 100㎖ 50% 글리세롤에서 초음파 분쇄시킨다. 방울당 1∼5개 세포를 만드는 라이브러리 현탁액과 슬러리를 알지네이트 용액과 혼합하고 바로 오일상(올리브유)으로 도입시킨다. 이때 오일상은 적어도 30분간 1.0g 정제된 콩 레치틴을 첨가하여 미리 혼합시켜 둔 것이다. 에멀젼화는 오일상에 알지네이트 혼합물을 서서히 옮기고 580rpm 에서 10분간 혼합시켜 개시한다. 그 다음 500㎖ 멸균수를 첨가하고 혼합은 5분간 지속한다. 그 다음 원심분리에 의해 오일에서 작은 방울을 빼내고 세척하고 LB/Amp로 재현탁시킨다. FACS를 이용한 분류 목적으로 요구되는 크기를 제한시키는 필터막을 이용하여 방울을 크기별로 선택할 수 있다. 클론은 형광 기질을 포함하는 LB/Amp 배지에서 2시간 동안 진탕 배양시켜 생장시킨다.
배양 후에, 원심분리하고, 세척하고 ㎖당 1×106 방울 밀도를 가지도록 멸균수에 재현탁시켜 FACS 를 이용한 분류작업을 위해 샘플을 준비한다. 방울 크기는 상 현미경을 이용하여 검사한다. FACS 는 숙련된 작업자에 의해 Becton-Dickinson FACStar Plus 에서 실시하고 양성은 LB/Amp 를 포함하는 다중-웰 플레이트로 직접 분류하고, 웰당 한 개의 양성 클론을 분리해낸다. 이들 플레이트는 콜로니가 비드밖으로 생장할때까지(1-2일). 37℃에서 배양시킨다. 이와 같은 12시간 배양된 플레이트는 하나이상의 작업 다중-웰 플레이트 또는 Ommi-Tray로 복제시키기 위한 원료 플레이트로 이용한다. 그 다음 마스터 다중-웰 플레이트는 각각 봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 그 다음 양성 클론은 생성물의 특정 테스트를 위해 또는 존재-스크린 또는 스크리닝을 위해 보내질 수 있다. 다중-핀 복제기를 이용하여 복제를 실시함으로써 추가 스크리닝을 실시할 수 있다. 사용하기 전후에, 다중-핀 복제기는 20초간 표백제에, 그 다음 30초간 물에, 그리고 5초간 에탄올에 담구고 불꽃에 그을린다.
5.4.12. 평판 복제에 의해 악티노마이세츠(Actinomycetes)/스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 라이브러리의 대사적 테스트.
DNA 라이브러리를 준비하기 전에 분류학적으로 다중성을 방지하고 완료된 라이브러리에서 실시되는 대사적 테스트의 배열을 결정하도록 각 배양가능한 야생형 악티노마이세스(actinomycete) 종을 테스트한다. 개별 클론은 스크리닝하기 위한 라이브러리를 준비하기 위해 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividians) TK66 을 F10A 가 있는 150㎜ 배양접시에서 도말한다. 플레이트는 실온에서 48시간동안 미리 건조시킨다. 도말 후에, 플레이트는 30℃에서 12시간 배양시킨다. 티오스트렙톤 위에 깔아서 선택을 개시한다. 생성된 콜로니는 멸균 집게를 이용하여 선택하고 96 웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 옮긴다. 각 웰에는 F10A 배지를 포함한다. 밤새 배양된 마스터 96-웰 플레이트는 원료 플레이트로 이용하여 하나이상의 작업 96-웰 플레이트 또는 Ommi-Tray 로 복제시킨다. 마스터 96 웰 플레이트는 개별적으로 밀봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 복제는 다중 핀 복제기를 이용하여 실시한다. 사용하기 전후에 다중-핀 복제기는 20초간 표백제에 담구고 이어서 30초간 물에 담구고 그 다음 5초간 에탄올에 담구고 불꽃에 그을린다.
일련의 차등/선택성 배지(예를 들면 사이드로 도어 감지 배지 또는 항균 배지)위에 DNA 라이브러리를 복제시키기 위해 원료 플레이트로 작용-웰 플레이트 또는 Ommi-Trays 를 이용한다. 결과를 종합하여 DNA 라이브러리를 만드는데 이용되는 야생형 해양 박테리의 프로파일과 비교한다.
5.4.13. 큰방울 포획에 의한 아티노마이세스/스트렙토마이세스 리비단스( Actinomycetes/Streptomyces lividans ) 라이브러리의 대사적 테스트
클론은 5.4.10에서 대장균 라이브러리의 경우와 마찬가지 방법으로 캡슐화시킨다. 방음은 10분간 경화시켜 멸균 플라스크로 옮기고 염화 셀슘은 제거하고 F10A 배지와 기질(예로써 X-gal)로 대체한다. 방울을 포함하고 있는 플라스크는 30℃에서 밤새 교반시키고 다음날 아침에 양성 클론에 대해 검사하는데 이는 청색 콜로니가 있으면 양성을 나타낸다.
방울은 큰 투명한 트레이에 단층으로 위치시켜 눈으로 검사한다. 양성 클론을 제거하여 F10A 와 50mM 시트레이트 나트륨 pH7.4 를 포함하는 96-웰 마스터 플레이트에 위치시켜 방울을 용해시켜 30℃ 2일간 생장시킨다. 이와 같은 밤새 배양된 마스터 96-웰 플레이트는 하나이상의 작업 다중 웰 플레이트 또는 Ommi Tray 에 복제하도록 원료 플레이트로 사용한다. 마스터 96웰 플레이트는 개별적으로 봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 양성 클론은 생성물의 특정 테스트를 위해 또는 존재-스크린 또는 스트리닝을 위해 보내질 수 있다.
5.4.14. 지시계 세포와 함께 공동 포획하에 의한 클론의 존재-스크리닝.
라이브러리 클론 집합체는 적절히 희석한 것을 플레이팅하고 클로니 형성된 수를 헤아려 역가를 측정한다. 적절한 라이브러리 세포는 1% 알지네이트에서 혼합하여 큰 방울하나에 1개 세포가 되게 한다. 또한 적절한 지시계 세포를 포함하여 방울당 50개 표적 세포를 포함하도록 한다. 큰 방울은 5.4.10에서 상술하는 것과 같이 만들고 라이브러리와 지시계 세포에 적절한 조건하에서 배양시킨다.
일반적으로 S. 리비단스(S. lividans) 라이브러리 큰 방울은 R5 또는 F10A로 30℃ 배양시키고 대장균 큰방울은 LB 또는 B3 로 30-37℃에서 배양시킨다. 배지와 온도는 지시계 세포의 생리학적 요구에 부응하게 조정한다. 지시계 세포에서 라이브러리 세포의 효과를 나타내기 위해 다음과 같은 리포터 섭생을 이용한다: 세포 죽음을 감지하기 위해, 중성 레드 또는 콩고 레드를 포함시키고; 세포의 생존능을 감지하기 위해 지시계 세포와 연관된 기질(예로 E. 페칼리스의 경우 X-글루코피라노시드)을 포함시키고; 프로모터 활성하여 반응하여 B-갈락토시다제 리포터 활성을 감지하기 위해 배양배지에 80㎎/㎖ X-gal 을 포함시킨다. 5.4.10 에서 상술한 것과 같이 양성 큰 방울을 분리시킨 후에 지시계 세포는 라이브러리 세포에 대해서는 선택성이 있으나 지시계 세포에 대해서는 선택성이 없는 항생제를 첨가하여 제거한다. 그 다음 라이브러리는 보관하거나 필요에 따라 추가 검사한다.
5.5. 진핵세포 발현 라이브러리를 위한 과정
이 단락은 진핵 세포 제공 유기체의 유전자 발현 라이브러리를 만드는데 일반적으로 이용되는 과정에 대해 상술한다. 도 5A-5F 에서는 진핵 세포에서 복합 키메라 경로 유전자의 준비와 연관된 단계에 대해 상술한다.
유전자 발현을 목적으로 유전학적으로 조정하기 위해서는 안정성 있고, 비-필라멘트성이고 충분히 특징화된 것이 우수한 발현 진핵 세포 숙주 유기체이다. 효모와 곰팡이의 경우에는 30℃에서 생장할 수 있는 S. 폼비가 적절하다(C. Guth rie and G.R. Funk, Guide to Yeast Genetics and Mpolecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press). A. 탈리아나(A.thaliana)와 N. 타바코 (N. tabacum) 세포가 적절한 숙주이다(C.P. Lichtenstein & J. Draper, Genetic Engineering of Plants, DNA Cloning Vol. II. pp. 67-119).
5.5.1. 밀도차 원심분리에 의한 부수체 게놈 DNA의 제거
진핵 생물 게놈에는 주요 리보좀성 코딩부분 또는 표면적인 기능이 없는 서열로 구성된 다양의 반복 DNA 를 가진다. 따라서, 진핵 생물 제공 유기체에서 게놈 DNA 를 준비하기 위해 라이브러리로부터 이와 같은 코딩 부위가 아닌 DNA 서열을 배제하는 것이 바람직하다. DNA 결합 염료, Hoechst 33258(Cooney & Matthews, 1984) 하에서 표준 CsCl 게놈 DNA 정제 방법을 이용하여 클로닝하기 전에 다양한 게놈 DNA 를 분리한다.
5.5.2. 진핵 생물 프로모터와 터미네이터 단편의 생성.
공지의 프로모터와 터미네이트 서열과는 별도로 서열-특이적인 프라이머를 이용한 PCR 에 의해 프로모터와 터미네이터 유전자 단편이 생성될 수 있다. 이용된 수주 유기체에 의해 선택된 프로모터와 터미네이터 서열이 결정된다. 예를들면, S. 폼비가 발현 숙주로 이용되는 경우에 nmt 1 또는 ura 4와 같은 고유 프로모터와 CMV, SV40 와 같은 바이러스에서 유도된 비-고유 프로모터(Forsburg, 1993 Nuc Acid Res. 8:4321-4325) 또는 사람의 크로닌 고나도트로핀 또는 소마토스타틴(R. Toyama, H. Okayama 1990, FEBS Letters 268(1) pp.217-221)에서 유도할 수 있다. 유도성 테트라사이클린 시스템에서 볼 수 있는 것과 유사한 유전공학적으로 조작된 프로모터를 이용할 수 있다(Faryar et al. 1992, Curr Genet 21:345-349).
PCR 반응은 Pfu 중합효소(Stratagene) 또는 Vent 중합효소(New England Biolabs)와 같은 상당히 충실성이 큰 DNA 중합효소와 표준 PCR 반응조건을 이용하여 상업적으로 이용할 수 있는 PCR 기계에서 실시한다. 모든 프라이머 세트가 동일 반응 조건을 이용하지 않기 때문에 본 분야에 공지의 기술을 이용하여 정확한 조건은 실험적으로 결정할 수 있다. PCR 올리고 뉴클레오티드 프라이머는 시판되는 것을 이용하거나 본 분야에 공지된 방법에 의해 합성할 수 있다.
PCR 에 의해 만들어진 프로모터와 터미네이트 단편은 5'단부에 제한효소 부위로 구성된다. 본 발명의 원리를 설명하기 위해 여기에서는 Bgl II, Xho I 과 BamHI을 이용한다. 프로모터 또는 터미네이터 유전자 서열 내에 제한 효소부위가 없는 경우에 한하여 임의의 제한효소를 이용할 수 있다.
cDNA 또는 게놈 DNA 삽입체에 필적하는 클로닝 부위를 만들기 위해, 프로모터 유전자 단편을 Bgl II 와 XhoI 으로 절단하여 5'단부에 Bgl II 부위와 3'단부에 XhoI 부위를 가지는 프로모터 유전자 단편을 만든다. 터미네이터는 XhoI 으로만 절단하여 5'단부에 XhoI 부위만 가지도록 한다. 5' 와 3' 방향은 프로모터 또는 터미네이트 유전자 단편에 대체 전사의 예상방향에 기초한다. (도 5B 참조).
대장균 DNA 중합효소 I(클리노우단편) 큰 소단위와 데옥시뉴클레오시드 서브세트(dCTP 와 dTTP)를 이용하여 부분적인 필-인 반응으로 XhoI 단부에 의해 자가 연결을 할 수 없는 프로모터와 터미네이트를 만든다. 프로모터 단편의 Bgl II단부는 염기-상보성이 없기 때문에 영향을 받지 않고 터미네이트의 BamHI 단부는 클리노우 단편을 이용하기 위해 5'단부에 노출시키지 않는다.
송아지 내장 알칼리 포스포타제와 같은 포스포타제로 처리하여 BglII 자가 연결을 막고 프로모터와 터미네이트 단편 모두에 연결을 하기 위한 유사 단부를 제공한다. cDNA 단편은 제 1 가닥을 합성하는 동안에 5'-메틸 dCTP의 결합에 의해 NotI으로 절단하는 것으로부터 보호를 받는다(Short J. M. 1988, Nuc Acids Res 16:7583-7600).
본 발명의 또 다른 구체예에서, DNA 삽입체가 mRNA 에서 유도된 경우에, 방향성을 가지는 클로닝을 이용하여 클로닝 효과를 개선시킨다. cDNA 삽입체는 프로모터와 터미네이트에 대해 센스 방향으로 한 방향으로 연결될 수 있다. 프로모터와 터미네이트 단편 모두에서 여러 가지 연결 불가한 단부를 만들면 가능하다. 본 발명을 설명하기 위해 BglII, XhoI, XmaI 과 BamHI을 이용한다. 필적하는 단부를 만들고 메틸화에 의해 보호될 수 있는 임의 효소쌍을 이용할 수도 있다.
터미네이트 단편의 5' 단부에서는 XhoI 부위대신에 XmaI 부위를 이용하고, 프로모터 단편을 만드는 방법은 그대로이다. XmaI 은 클리노우 단편과 dCTP를 이용하여 채우는 작업에 의해 NotI 과 필적하기 때문에 이용하였다. 이로 인해 2개 염기 dCTP-dCTP 5'꼬리를 가지는 터미네이트 단편이 생성되고 이는 적절히 준비된 NotI 절단된 cDNA 유전자 단편과 필적한다.(도 5A)
5.5.3. DNA 삽입체의 준비
진핵 라이브러리를 위한 코딩 유전자 단편은 두 개 주요 DNA 원료에서 유도하였는데 즉 게놈 DNA(gDNA) 또는 mRNA 로 부터 효소적으로 유도된 상보 DNA(cDNA)이다. gDNA 또는 cDNA 를 준비하는 과정은 상당히 유사하나 동일하지는 않다.
상보 DNA 는 문헌 또는 제조업자의 매뉴얼에 따라 이용할 수 있는 표준 과정을 이용하여 mRNA 또는 tRNA 에서 만든다. tRNA의 분리는 5.3.1 에 상술한 구아니디움-이소티오시아네이트 방법에 의해 게놈 DNA 에서 동시에 실시할 수 있다. 그리고 mRNA 는 올리고-dT 셀롤로오즈에서 연속적인 친화성 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다.
제 1 가닥 cDNA 합성은 5'단부에서 NotI 부위와 같은 클로닝 부위를 가지는 올리고-dT DNA 프라이머를 이용한다 5'단부부근에 있는 내부 Not I 부위를 포함하는 무작위 올리고 뉴클레오티드 서열을 이용하여 무작위로 개시된 제 1 가닥 합성을 할 수 있다. 이와같은 또다른 프라이머를 이용하여 큰 mRNA 에 대한 3'편향을 피할 수 있다. 5-메틸-dCTP와 같은 메틸화된 데옥시뉴클레오티드를 Pfu 와 같은 중합효소와 함께 이용하여 제한효소 절단으로 부터 보호될 수 있다(Short et al., supra; G.L. Costa, 1994, Strategies 7:8). 초기 프라이머에 있는 메틸레이트안된 부위만 절단에 이용될 수 있고 따라서 cDNA에 특정 3'단부를 가진다. 메틸화된 cDNA는 메틸화에 의해 만들어지나 모든 이용가능한 부위가 메틸화되고 따라서 효소절단에 대해 저항성이 있기 때문에 클로닝의 방향성을 상실할 수도 있다.
5'포스페이트를 가지는 변형된 BamHI 어뎁터와 같은 서열-특이적 어뎁터의 연결에 의해 특정 5'단부를 가지는 cDNA를 만들 수 있다. 이의 짝 올리고뉴클레오티드로 서냉복원되는 경우에 어뎁터에는 단지 2개 염기 dGTP-dATP 5'꼬리와 끝이 무딘 인산 단부를 가진다. 이와 같은 변형된 어뎁터는 표준과정과 같이 Pfu 또는 T4 DNA 중함효소로 처리된 cDNA에 연결된다. 변형된 BamHI 어뎁터에 연결하고, NotI 으로 cDNA를 절단한 후에, 어뎁터가 붙은 cDNA는 클리노우 단편과 dGTP로 처리하여 적절하게 준비된 프로모터와 터미네이트 단편에 연결시키기 위해 특정, 방향성을 가진 cDNA 유전자 삽입체를 만든다. 단편의 방향성은 cDNA의 5' 단부가 프로모터의 3'단부를 향하고 있으며 cDNA 의 3'단부는 터미네이트의 5'단부를 향하고 있다. (도 5C 참조).
Sau3AI 와 같은 빈번히 절단하는 제한효소를 이용하여 전체 게놈 DNA 를 부분적으로 절단하면 게놈 DNA 단편을 만들 수 있다. 이와 같은 효소가 널리 이용되며, 부분 절단후에 슈크로즈 농도차에 의한 크기를 분류가 가장 일반적인 기술이다. 초기 효소 농도를 다양하게 하여 세 가지 다른 절단에 의해 수집된 단편들을 이용하여 게놈 내에 효소 감응성에 대한 차이를 얻을 수 있다.
크기별 분류와 정제 다음에, 단편은 BamHI 메틸화 효소로 처리하여 임의 내부 BamHI 부위를 보호하고, 클리노우 단편과 dATP & dGTP로 처리한다. 이로써 유전자 단편에 BamHI 부위가 메틸화되고 dATP-dGTP 꼬리를 가지게 된다. (도 5D). 이와같은 단편은 자가-연결을 할 수 없고 적절히 준비된 프로모터와 터미네이트 유전자 단편을 연결시키는 능력만을 가진다.
5.5.4. 프로모터와 터미네이터에 삽입 DNA 의 연결
적절히 준비된 cDNA, 프로모터, 터미네이트 단편을 16℃에서 밤새 연결시킨다. 연결반응에는 프로모터(P); cDNA; 터미네이터(T)의 비율이 10:1:10 이 된다. 적정 비율은 본 분야에 공지의 기술을 이용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 방향성을 가지는 클로닝은 하나의 연결 생성물만을 가지는데 프로모터-센스 삽입체-터미네이터 유전자를 카세트를 제공한다.
준비된 게놈 DNA, 프로모터, 터미네이트 유전자 단편을 다양한 비율로 16℃에서 연결반응을 실시한다. 연결성분은 자가-연결될 수 없기 때문에 적정 비율은 실험적으로 결정한다. 형성된 연결 생성물의 1/2을 직접 이용할 수 있고, 형성된 생성물의 1/4은 연결과정에 참가할 수 없으며, 생성물의 1/4은 생장하는 사슬이 종료되기 전에 한 번만 연결될 수 있다.
다음과 같이 복합된다. CP=프로모터, frag=5'→3' 게놈 DNA 단편, T=터미네이터 graf=3'→5' 게놈 DNA 단편)
1. P-frag-T 5. P-garf-T
2. T-frag-P 6. T-garf-P
3. P-frag-P 7. P-garf-P
4. T-Frag-T 8. T-garf-T
삽입체의 방향이 무작위이기 때문에 복합 1,6 & 2,5 는 바람직한 생성물이고 이들 생성물의 50%는 임의의 제공된 유전자에서 정확한 방향을 가진다(1과 6).
터미네이터/터미네이터 유전자 카세트가 형성될 경우 노출된 5'단부가 부족하고, 3'단부에 무딘, 절단안된 BamHI 단부 때문에 임의 클로닝 단계에 관여할 수 없다.
프로모터/프로모터 구조는 BglII 단부가 5'포스페이트가 부족하기 때문에(제 1 과정)다른 노출된 BamHI 단부에만 연결되어 클론될 수 있다. 노출된 BglII에 연속적으로 연결되는 것은 5'포스페이트가 부족하기 때문에 들어오는 유전자 카세트가 드물다 노출된 BamHI 단부는 잔류하는 형성되는 사슬에만 가능하고 들어오는 새로운 유전자 카세트에는 불가능하다. 따라서, 이와같은 프로모터/프로모터 유전자 카세트는 또다른 사슬에 있는 인접한 BamHI과 고리를 형성하여 사슬을 종료한다. 이와 같은 프로모터/프로모터 단편이 연결효능에 상당한 문제가 되는 경우에 새로운 유전자 카세트를 첨가하기 전에 고정된 생장하는 사슬의 중간 카이나제 처리를 하면 BglII/BglII 연결 생성물에 의해 프로모터/프로모터 단편이 길어니는 사슬을 연장시킬 수 있게 된다. 이와같은 카이나제 처리는 고형상에 BglII/BglII와 BglII/BamHI 연결을 촉진시켜 관련된 생장하는 사슬을 고리화시킨다.
5.5.5. 단위를 만들기 위해 유전자 카세트의 연속적인 연결
프로모터/터미네이터 복합에 의해 인접한 게놈 DNA 또는 cDNA 삽입체로 구성된 유전자 카세트의 연결은 원핵세포 DNA 에서 미리 정해진 유사방법을 이용하여 실행한다. 여기에서 주요 차이점은 연속적인 클로닝을 위해 노출된 3'제한효소를 만들기 위해 엔도뉴클레아제 BamHI을 이용한다는 것이다. BamHI 메탈라이제 또는 5-메틸-dCTP를 이용하면 삽입체 DNA 내에 BamHI 부위가 보호된다는 것을 알 수 있다(도 5E).
5-10 회 사슬 연결후에, 단위에서 성장하는 사슬은 보호를 해제하고 클리노우 단편과 dATP와 dGTP로 처리하여 발현 벡터에 연결시키기 위해 준비한다. 성장하는 사슬에서 서로 연결될 수 없는 단부를 만들게 되고 임의 고리화와 단위 사슬의 손실을 막을 수 있다.
벡터 DNA 는 5:1 몰 비율로 콘카타머 사슬에 연결될 수 있다. 비율을 다르게 할 수도 있다. 8-12 시간 동안 16℃에서 또는 4시간 동안 22℃에서 실시한다.
연결후에, 비드는 씻어내고, 인트론 뉴클레아제 제한 효소 완충액에 재현탁시킨다. 제조업자의 지시에 따라 전술한 것과 같이 절단시킬 수 있다. 임의 인트론 뉴클레아제를 이용할 수 있다. 팔린드롬 3'단부를 만드는에 효소 CeuI이 적합하고 이와같은 단부는 자가-연결을 방지한다. (도 5F).
5.5.6. 콘카타머 구조를 포함하는 벡터의 고리화와 형질변환.
고형 상에서 방출된 콘카타머-벡터 분자는 1×리가제 완충액으로 CeuI 절단 혼합물을 100배 희석시킴으로써 분자내 연결을 할 수 있다. T4 리가제를 첨가하고 반응은 22℃에서 4∼6시간 또는 16℃에서 12시간 실시한다. (도 5f). 생성된 구조는 마이크로필터 또는 동결-건조에 의해 농축시켜 표준방법에 의해 S. 폼비(S. pombe) 균주 또는 대장균(E. coli) 또는 S. 리비단(S. lividans) 내로 도입시킬 수 있다. 일렉트로포레이션 및 변형된 칼슘-인사 형질전환 방법을 이용하여 실시할 수 있으나 이에 한정시키지 않는다.
5.5.7.효모에서 발현을 시키기 위해 벡터의 준비와 준비된 벡터의 연결.
이 단락에서는 숙주 유기체로써 효모를 이용하여 복합 유전자 발현 라이브러리를 준비하기 위해 일반적으로 이용할 수 있는 과정을 설명한다.
S. 폼비(S. pombe)에서 라이브러리를 만들기 위해 하나의 가능성 있는 벡터(유일한 벡터는 아님)는 대장균/S. 폼비 셔틀 벡터 pDblet(Brun et al. 1995, Gene, 164:173-177)이다. 이와 같은 벡터는 상당수의 복사체를 발현시키고, 대장균과 S. 폼비(S. pombe)에서 매우 안정하기 때문에 다수의 클로닝 부위와 f1 파지 원점을 가지는 등의 장점이 있다.
본 발명에 있어서, pDblet의 다중 클로닝 부위(MCS)는 공지된 서열의 BstX1 부위에 맞도록 변형될 수 있고(도 6B), 그 이유는 고형상에서 콘카타머를 방출하는데 이용되는 인트론 뉴클라제 효소가 특정 서열의 3'뉴클레오티드 말단(3'GATT...)를 만들기 때문이다. 서열 CCACCTAACTGG 를 가지는 조작된 BstX1 부위는 절단후에 적절한 CTAA-3' 꼬리부분을 만든다.
pDblet 를 수정하기 위해서는 정확한 서열을 가지지 않는 기존 BstX1 부위를 제거하기 위해 우선 SacI & NotI으로 절단한다. 스핀-크로마토그래피 또는 다른 수단에 의해 일단 정제된 pDblet 플라스미드를 미리 합성된 올리고뉴클레이티드와 혼합시키는데 이때 올리고뉴클레오티드에는 BstX1 부위에 대한 정확한 서열에 추가하여 새로운 NcoI 부위와 SacI- NotI- 필적하는 단부를 가진다. (도 6C 참조). 연결과 형질 변환 후에, 미니-클론은 NcoI으로 절단하여 정확성에 대해 점검한다. 정확한 클론은 BstXI와 NcoI 부위 존재 하에 확인한다. 이와 같이 수정된 pDblet 를 BstXI과 XhoI으로 처리하면 5'XhoI 부위와 3'CTAA BstX1 꼬리를 가지는 벡터를 만들 수 있다. (도 5E). 이와 같이 절단된 벡터는 클리노우 단편과 dCTP 와 dTTP로 처리하여 자기끼리 연결할 수 없도록 한다. 콘카타머 사슬을 수용하는데 이와 같은 벡터를 이용한다.
5.5.8. 식물 발현 라이브러리.
이 단락에서는 제공/또는 숙주 유기체로써 식물 세포를 이용하여 복합 유전자 발현 라이브러리를 만드는데 적용되는 일반적인 과정에 대해 상술한다.
식물로부터 제공 DNA를 만들기 위해, 다음과 같은 일반적인 과정이 이용된다; (1) 냉각 에테르에서 식물 조직을 선-처리하여 세포 분열을 강화시키고; (2) 모래, 유리비드 또는 알루미늄 옥시드로 연마하여 조직을 기계적으로 균질화시키고; (3) 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 메쉬를 통하여 여과시키고; 그리고 (4) 5.1.2 에서 상술된 과정에 의해 DNA를 추출하다. 생성된 정제된 DNA는 5.5.3에서 상술하는 것과 같이 변형된다. 5.5.3 에서 상술한 것과 같이 PCR 에 의해 CaMV B5S 또는 노팔린 합성효소 프로모터와 노팔린 합성효소 종료 단편이 만들어진다. 프로모터와 터미네이터 단편은 DNA 단편에 부착시켜 5.5.5 와 5.5.6 에서 상술하고 있는 것과 같이 식물 DNA 에 연결시킨다.
적절한 식물 DNA 벡터는 Bin19 또는 이의 변이체로써 T-DNA border를 이용하고 아그로박테리움 투메페이션스(Agrobacterium tumefaciens)에 있는 공생 Ti 플라스미드에서 Vir 부분의 트란스 작용 기능을 이용하여 식물 숙주 세포의 핵 게놈내에 제공 유전물질을 전달하게 된다(Bevan 1984, supra). 시판되는 pBI121 또는 pBI221와 같은 다중 클로닝 부위를 가지는 변형된 Bin19 벡터를 이용할 수 있다(Clontech, Palo Alto). 카나마이신 저항성 또는 β-글루코루노니다제 활성이 형질변환을 모니터하고 존재스크린에 대해 표식으로 이용될 수 있다.
Potrykus et al. 1988 in "Methods for Plant Molecular Biology" Weissbach and Weissbach ed. Academic Press, page 376-378에서 상술된 과정에 따라 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 식물의 잎에서 식물 원형질을 준비한다. 발현 구조는 Power et al. 1988 in "Methods for Plant Molecular Biology" Weissbach and Weissbach ed. Academic Press, page 388-391에서 상술하고 있는 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 형질도입에 의해 원형질체 세포내로 도입된다. 형질 변환된 원형 질체는 카나마이신과 같은 항생제 저항성에 대해 선택되고, 5,4,10 에서 상술하는 존재-스크린을 위해 캡슐화시킨다.
실시예
6. 실시예: 복합 유전자 발현 라이브러리의 작제와 스크리닝.
다음의 소단락에서는 제공 유기체로써 토양 미생물 또는 해양 미생물 혼합물을 이용하여 복합 유전자 발현 라이브러리의 준비와 존재-스크리닝에 대해 상술한다. 라이브러리는 스트렙토마이세스 리비딘(Streptomyces lividans), 대장균(E. coli) 및 S. 폼비(S. pombe)를 숙주 유기체로 이용한다. 결과에서는 라이브러리 세포의 일부가 제공 유기체의 대사 활성을 나타내는 것으로 이는 잠재적인 관심이 있는 제공 대사 경로가 숙주 유기체에서 기능을 하고 있다는 것을 의미한다. 또한, 하나의 라이브러리 클론에는 대사경로에서 공지 효소에 동질인 서열을 공유하는 해양 박테리아 단백질을 포함하고 있는 것으로 나타났다.
6.1. 재료와 방법.
본 발명에 유용한 시약을 일반적으로 시중에 구할 수 있다. 예를들면, Gene Clean, Genome kit (Bio101, Vista, CA); 제한효소, PCR 시약, 완충액(Promega, Madison, WI; New England Biolabs; Stratagene, La Jolla, CA); TA 클로닝 키트 (Invitrogen, La Jolla, CA); 박테리아 배지(Difco, Inc.); 미라팁(Hawaiian Marine Imports, Inc.); pBSK 플라스미드, XL1-MR 세포, SuperCos 1 코르미드, Gigapack 패키지 추출물(Stratagene, La Jolla, CA); Qiagen QIAprep 플라스미드 정제키트(Qiagen, Inc., Chatworth, CA); 아비딘-공액된 자성 다공성 유리(MPG) 비드(CPG, Inc., New Jersey); 배양접시 96- and 384 웰 플레이트, Omni-Trays(Nunc), 96-and 384-핀 복제기(V&P Scientific, San Diego, CA); 암피실린(IBI, Inc., CA); 그린 형광 단백질과 GFP cDNA(Clontech, Inc.); 올리고뉴클레오티드(Genset, La Jolla, CA); 박테리아종 DNA 서열(American Type Culture Collection, Rockville, MD); 7-에톡시 헵타데실-쿠마린, BCECF-AM(Molecular Probes, Oregon); 3-메틸 벤조에이트, 3-클로로톨루엔, m-톨루에이트, 테트라사이클린 클로람페니콜, 아세토아미노펜, 아르젠, 안토모니, 시스-시스 뮤코네이트, 다른 화학물질(Sigma)와 다이나비드, MPC-M(Dynal, Inc., Lake Success, NY).
6.1.1. 배지준비.
배지와 용액에 일반적으로 이용되는 정제수(ddH2O)는 연화, 역삼투와 이온 제거에 의해 정제된다. 태평양 해수(해수 H2O)는 Scripps Institute of Oceanography (La Jolla, CA)에서 구하였고 사용 전에 여과한다. 합성해수(SSW)는 염(45.2㎜ Naf, 48.8㎜ SrCl2, 0.324mM H3BO3, 0.563mM KBr, 6.25mM KC1, 4.99mM CaCl2, 7mM Na2SO4, 16.4mM MgCl2, 268mM NaCl, 45.8mM Na 2SiO3, 1.10mM EDTA, 1.58mM NaHCO3)와 해양 잔류 원소(0.1% Mira Tip)을 ddH2O에 첨가하여 만들 수 있다.
LB배지는 1% 트랩톤, 0.5% 이스트추출물, 1% NaCl 을 이용하여 준비한다. W2-B1 은 75% 해수 H2O 또는 SSW 와 0.25% 펩톤, 0.15% 이스트 추출물, 0.6% (vol/vol)글리세롤을 이용하여 만든다.
F10A 는 2.5% 가용성 감자전분, 0.2% 포도당, 0.5% 이스트 추출물, 0.5%펩톤, 0.5% Distiller solubles(Nutrition Products Co., Louisville, KY), 0.3% 탄산칼슘으로 만들고 pH는 7로 조정한다.
6.2. 플레이트 복제와 큰 방울 포획을 이용한 악티노마이세스/스트렙토마이세스 리비단 복합 천연 경로 발현 라이브러리의 존재-스크리닝.
#501∼534 로 확인된 34개 악티노마이세스(actinomycetes) 종을 제공 유기체로 이용하였다. 유기체는 F10A 배지에 별도로 배양시키고 게놈 DNA 는 5.3.1 에서 상술한 것과 같이 추출하고 정제한다.
한 종에 약 100㎍ 게놈 DNA 를 수득하여 5.4.2 에서 상술한 것과 같은 Sau 3A에 의해 부분적인 제한 효소 절단을 위해 혼합한다. 게놈 DNA 의 단편은 슈크로즈 농도차 원심분리에 의해 크기별 분류를 시키고 20-40kb 단편을 포함하는 부분은 모아서 클리노우-단편으로 부분적으로 필-인 반응시켜 아래에서 유사하게 준비된 벡터와 필적할 수 있게 한다(Korch 1987, Nuc Acids Res 15:3199-3220; Loftus et al. 1992 Biotechniques 12:172-175) 합체된 단편 0.5-3.0㎍은 다중 베치에서 BamHI 또는 XhoI 으로 준비된 0.5-3.0㎍ pIJ922 와 pIJ903 벡터에 연결시킨다. 연결된 발현 구조체는 라이소자임에 의해 세포벽을 제거한 반응성이 있는 것으로 만들어진 숙주 유기체, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 균주 TK64에 형질 도입시킨다(Hopwood 1985, supra). 약 11,000 클론이 발생되어 증폭시키고 20% 글리세롤에서 균사로 보관하고 -70℃에서 50% 글리세롤내에서 포자 현탁액으로 보관한다.
개별 클론을 스크린용 라이브러리를 준비하기 위해서 형질전환된 TK64 숙주 세포를 F10A 한천이 깔린 150㎜ 배양접시에 도말한다. 도말후에, 플레이트는 30℃에서 21시간 배양시킨다. 플레이트에 티오스트렙톤 5㎍/㎖, 1㎖/플레이트도 농도로 깔아서 선별을 실시한다. 48-72시간 뒤에 콜로니는 멸균 집게로 집어내어 96-웰 플레이트의 각 웰당 하나씩 넣는다. 각 웰에는 F10A 배지를 포함하고 있다. 이와 같이 접종된 마스터 플레이트는 30℃에서 1∼4일간 둔다. 12시간 배양된 마스터 96-웰 플레이트를 원료 플레이트로 이용하여 하나이상의 작업 96-웰 플레이트 또는 Omni-Trays 에서 복제시킨다. 마스터 96-웰 플레이트는 각각 봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 복제는 사용 전에 불꽃에 의해 살균된 96-핀 복제기를 이용하여 실시한다.
작업 96-웰 플레이트는 원료 플레이트로 사용하여 차등 또는 선택성 배지와 지시계 플레이트에서 라이브러리를 복제한다. 선택 항생제에는 에리트로마이신, 노보바이오신 및 네오마이신을 포함한다. 차등 배지에는 기질-X-글루코피라노시드와 X-글루콘산을 포함하는 F10A 와 R5 를 포함한다. 지시계 플레이트에는 F10A 에서 생장된 라이브러리 클론을 포함하고 여기에 엔테로코커스 페아칼리스(E. faecais), 바실러스 서브틸리스(B. subtitis) 또는 SOS 크로모테스트(X-gla)로된 지시계 물질을 덮는다. 결과를 종합하여 스트렙토마이세스(Streptomyces) 숙주 TK64의 프로파일과 비교한다.
라이브러리의 클론은 큰 방울 캡슐화에 의해 존재-스크린시킨다. 각 스크린을 위해, 라이브러리의 50,000 개 증폭된 클론을 5.4.13에서 상술하는 것과 같이 캡슐화시킨다.
6.3. 큰 방울 포획화에 의해 악티노마이세스/대장균 복합 키메라 경로 발현 라이브러리의 존재-스크리닝
6.2에서 상술한 것과 같이 34개 악티노마이세스(actinomycetes)로부터 수득된 게놈 DNA 를 S. 리비단스(S. lividans) 숙주에서 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리의 준비에 이용한다. 2-7 kb 의 Sau 3A-절단된 게놈 DNA 의 단편을 포함하는 부분을 합친다.
게놈 DNA 단편 몇 방울을 별도의 여러 가지 프로모터에 연결시켜 5.5.3에서 상술하느 유전자 카세트를 만든다. 콘카타머는 각 과정마다 상이한 유전자 카세트를 이용하여 8회 연결과정과 보호제거에 의해 형성되고 생성된 각 콘카타머는 게놈 DNA 단편에 부착된 8개 상이한 프로모터로 구성된 8개 유전자 카세트를 가진다.
10㎍ 콘카타머를 고리화시켜 BamHI 부위에서 0.5㎍ SuperCos 1 벡터에 연결시킴으로써 발현 구조체를 만들고 이는 제조업자의 지시에 따라 대장균 숙주 세포 XL1-MR의 감염을 위해 시험관에서 패키지 한다(Stratagene). 약 1,000,000 클론을 수득하여 증폭시키고, 합체하여 증폭시킨 라이브러리를 형성한다. 라이브러리는 -70℃에서 저장한다. 증폭된 세포는 5,4,10에서와 같이 포획시키고 5.4.14 에서와 같이 존재-스크리닝한다.
6.4. 큰 방울 포획에 의해 곰팡이/쉬조사카로마이세스 폼비( Schizosaccharomyces pombe ) 복합 키메라 경로 발현 라이브러리의 존재-스크린
ATCC로부터 다음과 같은 곰팡이 제공 유기체를 이용하여 두 개의 복합 키메라 경로 발현 라이브러리를 준비한다; 트리코더마 레세이, 퓨사리움 복시스포룸, 페니실리움 로퀘포르티, 리조푸스 올리고스포루스, 뉴로스포라 크라사, 피코마이세스 블랭키셀라아누스, 아스퍼질러스 퓨미가투스, 아스퍼질러스 플라부스, 에메리셀과 헤테로탈리카, 카이토미움 그라실리, 페니실리움 노타툼, 페니실리움 크리소게놈.
각 종은 500㎖ 감자 덱스트로즈 한천(PDA:Difco) 또는 말토 엑스트렉트 한천(MEA:Difco) 에서 48-72 시간 동안 평균 rpm 하에서 별도 배양시켰다. ㎖당 1×104 ∼1×106 포자를 1ℓ 배양 플라스크에서 500㎖ 감자 추출물 또는 맥아즙에 넣고 22℃, 225 rpm, 48-72 시간 동안 생장시켰다.
배양물은 진공 하에서 Mirachloth(Calbiochem)를 통하여 여과시켜 수득한다. 수득된 균사체는 2ℓddH2O로 세척하고 10분간 공기-건조시키고, 냉동 건조시킨다. 곰팡이 게놈 DNA와 mRNA를 추출하고 5.3.1 과 5.3.2 에서 상술한 것과 같이 균사에서 정제한다. 수득된 균사는 냉동-건조시키고 -70℃에서 저장한다.
5.4.2 에서 상술하는 것과 같이 곰팡이 게놈 DNA 단편을 준비한다. 곰팡이 mRNA 는 표준 방법에 따라 cDNA로 전환 시킨다(Sambrook et al. 1989, Watson CJ & Jackson JF (1985) DNA clonign: A practical approach 79-88, IRL Press). 각 종에서 동량의 DNA 단편을 합체하여 게놈 DNA 합체와 cDNA 합체를 만든다.
약 5-10㎍ DNA 를 포함하는 이들 각 합체물을 독립적으로 사용하여 복합 키메라 경로 발현 라이브러리를 어셈블리한다. 다음의 S.폼비(S. pombe)-필적하는 프로모터와 터미네이터는 5.5.2 에서와 같이 만든다; CMV 즉각형 초기, SV40 초기, RSV, HSV 티미딘 카이나제, CaMV, nmtI, adh1, uva 4 프로모터, 프로모터와 터미네이터 단편은 5.5.4 에서 상술하는 것과 같이 cDNA 와 게놈 DNA 합체와 복합시킨다. 평균 길이가 5kb 인 각 유전자 카세트는 5.5.5 에서 상술한 것과 같이 접합시킨다. 각 8개 유전자 카세트를 포함하는 최종 콘카타머는 고리화시켜 5.5.7 에서 상술하는 것과 같이 벡터 변형된 pDblet로 삽입한다(Brun et al. 1995, Gene, Vol. 164 pp. 173-177). 발현 구조체는 Gielz and Woody(FD Gietz $ RA Woody, Molecular gentics of yeast: a practical approach, chapter 8, pp 121-134의 리튬 아세테이트 방법에 따라 S.폼비(S. pombe) 세포내로 형질도입된다. ura 4 표식의 존재에 대해 선택 시에 110,000개 S. 폼비(S. pombe) 클론을 수득하여 증폭시킨다. 클론을 합체하여 존재-스크리닝을 위해 증폭된 라이브러리를 만든다. 다음과 같은 존재-스크린을 실시한다. 효소 기질 테스트, 항-균 활성, 항생제 저항성.
6.5. 평판 복제에 의해 해양 그람(-)/대장균 라이브러리의 존재-스크리닝
바하마 섬 부근에서 취한 해수에서 수득한 해양 박테리아는 Harbor Branch Oceanographic Institute 가 제공하였다. DNA 라이브러리를 준비하기 전에 각 야생형 그람-음성 착색된 해양 박테리아를 테스트하여 다양성을 결정하고 완전한 라이브러리에서 실시되는 존재-스크린의 배열을 결정하는데 도움을 얻는다.
다음의 검사는 해양 그람-음성/대장균 라이브러리의 부모종에서 실시한다.
검사 37종 중에서 양성종
크로마졸올 S (CAS) 27
스트렙토코커스 피오진스 0
엔테로코커스 페아칼리스 3
프로테우스 미라발리스 1
사르시나 아우란티아카 10
스타필로코커스 아우레우스 6
전분 절단 17
이들 검사 중에서, 대장균(E. coli)에서 복합 유전자 발현 라이브러리 세포에서 다음과 같은 것에 대해 선별하였다.; CAS; S. 아우레우스(S. aureus); S. 아우란티아카(S. aurantiaca); 전분절단.
간략하면, 각 40개 모체종은 5㎖ B3 배지에 접종하여 Falcon 2059 튜브에서 30℃, 300rpm 에서 12시간 배양시켰다. 12시간 배양물을 펠렛화시켜 표준과정에 의해 전체 게놈 DNA 를 추출시켰다. 게놈 DNA 는 아가로즈 겔에서 관찰하여 정량화시키고 갈 40종에서 5㎍ DNA 는 총 200㎍으로 합체시켰다. 5.1.4 에서 상술한 것과 같이 대장균에서 복합 천연 경로 발현 라이브러리를 어셈블리하였다. 이 DNA 는 부분적으로 절단하여 SuperCos 1 에 연결시키고, SuperCos 1 제조업자의 지시에 따라 대장균내로 도입시키기 위해 λ파아지에 패키지 하였다(Stratagene). 이로써 5×106 클론이 형성되고 이는 표준 과정에 의해 7×108/㎖ cfu 로 증폭시켰다. 증폭된 원액은 추가 이용을 위해 -70℃에서 15% 글리세롤에서 저장한다.
개별 클론을 스크린하기 위한 라이브러리를 준비하기 위해 증폭된 라이브러리 세포는 50㎖/LB, 100㎎/㎖ 암피실린과 50㎎/㎖ 카나마이신이 포함된 150㎜ 배양접시에 도말한다. 플레이트는 암(暗)상태에서 실온, 24시간 동안 미리 건조시킨다. 7×108/㎖ cfu 원액은 LB를 이용하여 500cfu/㎖로 희석시킨다. 1㎖을 각 150㎜ 플레이트에 도말한다. 도말 후에, 플레이트는 37℃에서 12시간 배양시킨다. 생성된 콜로니는 멸균집게를 이용하여 집어내고 384-웰 플레이트에서 각 웰당 하나씩 이동시킨다. 6400 콜로니를 선택하였다. 각 웰에는 75㎖ LB, 50㎎/㎖ 암피실린, 7% 글리세롤을 포함한다.
외측 줄(총 80개 웰)은 접종시키지 않고, 연속적인 배양과 냉동시키는 과정동안에 증발 장벽을 제공하기 위해 배지로 채워둔다. 이와 같이 접종된 마스터 플레이트는 교반없이 37℃에서 16시간 동안 둔다. 밤새 배양된 마스터 384-웰 플레이트는 원료 플레이트로 이용하여 하나이상의 작업 384-웰 플레이트 또는 Omni-Tray로 복제시킨다. 마스터 384-웰 플레이트는 개별적으로 밀봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 복제는 384-핀 복제기를 이용하여 실시한다. 사용하기 전후에 384-핀 복제기는 20초간 표백제에 담구고 이에서 30초간 물에 담구어 그 다음 5초간 에탄올에 담구고 불꽃에 그을린다.
일련의 차등/선택성 배지(예를 들면 사이드로도어 감지 배지 또는 항균 배지)위에 DNA 라이브러리를 복제시키기 위해 원료 플레이트로 작용 다중-웰 플레이트 또는 Omni-Trays를 이용한다. 결과를 종합하여 DNA 라이브러리를 만드는데 이용되는 야생형 해양 박테리아의 프로파일과 비교한다.
전분 분해능력에 대해 양성인 6개 클론을 분리하였다. 이들 클론은 S. 아우레우스(S. aureus) 또는 S. 아우란티아카(S. aurantiaca)의 성장을 방해하는 능력에 대해 테스트하고 한 개 클론이 S. 아우란티아카(S. aurantiaca)의 성장을 방해하는 것으로 밝혀졌다. 이 클론은 DNA 서열 분석을 포함한 추가 분석을 받게 되고 폴리케티드 합성 경로에서 이들과 유사한 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 도 10에서는 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor)의 악티노로딘 디하이드라제 유전자와 함께 CXC-AMN 20 에서 유도한 DNA 서열의 예상 아미노산 서열을 나타낸다.
이들 클론의 활성성분은 유기용매를 이용한 추출과 항-균 검사에 의한 정제등으로 추가 분석하였다.
동종 부모 종을 결정하기 위해 이와같은 클론에 포함된 DNA 서열을 다중 복합 PCR 로 검사한다. PCR 프라이머는 클론 서열에 기초하여 선택되고 합성된다. PCR 에서 양성 대조군으로는 상당히 보존된 리보좀성 RNA 프라이머 서열을 이용한다. 양성 대조군은 약 2kb 단편을 가진다. 클론 또는 이의 동종 부모종에서 발생된 암플리콘은 600bp 이하이다. 우선 부모 종의 게놈 DNA 의 4개 합체를 이용하여 표준 방법에 의해 다중 PCR 반응을 실행한다. 합체 1∼3에서의 게놈 DNA 는 증폭시에 암플리콘을 생산한다(도 11). 다중 복합 PCR 반응은 개별 부모종의 게놈 DNA 로 반복한다. 도 12에서는 합체 1 에서 #6종, 합체 2 에서 #18종, 합체 3에서 #31 종에서 구한 게놈 DNA 가 PCR 반응에서 양성인 것으로 나타났다. 이는 확인된 DNA 서열은 이들 해양 박테리아 3종에서 유도된 것이라는 것을 알 수 있다.
따라서, 이와 같은 결과로부터, 소요의 대사경로를 인코드하는 해양 박테리아에서 유도한 유전물질을 가지는 클론을 복합 유전자 발현 라이브러리가 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 또한 라이브러리에 있는 이와같은 클론은 확인되고 존재-스크리닝에 의해 분리하였다.
6.6. 큰방울 포획에 의한 해양 그람(-)/대장균 라이브러리의 존재-스크리닝
알지네이트 Protanol 나트륨을 취하여 2000rpm 에서 오버헤드 믹서를 이용하여 1% 농도에서 멸균수 100㎖에서 용해시킴으로써 30,000개 클론을 포획시킬 수 있다. 30,000 세포를 포함하는 라이브러리 현탁액 1㎖을 첨가시켜 방울당 적어도 1∼5개 클론을 첨가한다. 혼합물은 기체를 빼내기 위해 적어도 30분간 방치한다. 그다음 혼합물은 25가우지 바늘을 통과시킨다. 이를 135mM 염화셀슘이 든 천천히 교반시키는 비이커내에 적하시킨다. 방울은 10분간 경화시켜 멸균 플라스크로 옮기고 염화 셀슘은 제거하고 LB/Amp 배지와 기질(예로써 X-글루시다민)로 대체한다. 다른 기질에는 X-아세테이트, X-글루코피라노시드, X-gal dl 있고 폴리키티드 경로와 연관된 특징기질도 있다. 방울을 포함하고 있는 플라스크는 30℃에서 밤새 교반시키고 다음날 아침에 양성 클론에 대해 검사하는데 이는 청색 콜로니가 있으면 양성을 나타낸다. 클론은 5.4.14 에서와 같이 지시계 세포와 함께 공동 포획시킨다. 지시계 세포에는 S. 아우레우스(S. aureus), S. 아우란티아카(S. aurantiaca)를 포함한다.
방울은 큰 투명한 트레이에 단층으로 위치시켜 눈으로 검사한다. 하나의 X-글루코사미니드 양성을 회수하여 15% 글리세롤에 재현탁시키고, -70℃에 저장한다. 다른 양성 클로니를 제거하여 LB/Amp 와 50mM 스트레이트 나트륨 pH7.4 를 포함하는 96-웰 마스터 플레이트에 위치시켜 방울을 용해시켜 37℃밤새 생장시킨다. 이와같은 밤새 배양된 마스터 96-웰 플렐이트는 하나이상의 작업다중 웰 플레이트 또는 Omni Tray에 복제하도록 원료 플레이트로 사용한다. 마스터 96 웰 플레이트는 개별적으로 봉하여 -80℃에서 냉동시킨다. 양성 클론은 생성물의 특정 테스트를 위해 또는 존재-스크린 또는 스크리닝을 위해 보내질 수 있다. 다중-핀 복제기를 이용하여 복제를 실시함으로써 추가 스크린을 실시할 수 있다.
본 발명의 구체예를 설명하였는데 이는 설명을 위한 것으로 본 발명의 영역내에서 다양한 다른 구체예, 변형 등이 가능하다는 것을 본 기술에 숙지의 지식을 가진 자는 인지할 것이다. 따라서 본 발명은 여기에서 상술하는 구체예에 제한하는 것이 아니라 특허청구범위에 제한한다.
많은 점에서, 약물 개발 시스템은 약물 개발의 다양한 단계에서 최종 임상실험까지 상당한 편의와 시간적인 장점을 제공한다. 본 발명의 라이브러리는 상당량의 스크리닝을 위한 이미 확립된 다중-웰 픗트 프린트 포맷과 로봇 공학등과 양립할 수 있다. 본 발명의 숙주 유기체는 유전적 조직 및 공정 개발에 사용되는 통상적인 유기체이다. 본 발명은 이와 같은 숙주 유기체 또는 생산 숙주가 이들의 생물학적 특징 및 유지 요구성에 대해 잘 특징화되어 있기 때문에 상당한 장점을 가진다. 제공 유기체에서 다른 전술한 발현 시스템으로 유전 물질을 옮김으로써, 제공 유기체에 대한 배양조건을 어렵게 할 필요성이 줄어든다. 따라서 본 발명의 시스템에서 발견되는 임의 선두 화합물에 대한 생물학적 활성, 약리학적 그리고 독성 성질이 연구되고 좀더 효과적으로 최적화되었다.
분자 생물학에서의 표준 기술에 의해 양성 클론에서 새로운 대사 경로를 설명할 수 있다. 선두 화합물은 표준 또는 경험적으로 결정된 배양 조건하에서 약물을 생산하는 숙주 유기체 클론을 배양하여 합성될 수 있는데 추가 분석 및 개발을 위해 충분한 양의 선두 화합물을 분리할 수 있다. 이와 같은 표준 산업적인 숙주 유기체의 일부를 정립한 Good Manufacturing Practice(GMP)와 같은 고순도 제조 프로토콜이 있다. 천연 생성물 원료를 스크리닝하는 통상적인 방법과는 달리, 각 잠재성이 있는 약물을 생산하는 유기체의 특정 요구에 대한 스크리닝과 생산기술을 채택하는데는 필요한 노력이 적게든다.
본 발명은 제공 유기체 또는 세포형태의 특정 세트의 유전 물질로부터 본 발명의 방법에 따라 만들어진 특이적인 복합 유전자 발현 라이브러리를 제공한다. 특별히 혼합된 샘플에서 유기체 또는 세포형태의 모두가 복합 유전자 발현 라이브러리를 준비할 수 있도록 개별적으로 확인하거나 또는 특징화시킬 필요는 없다.
본 발명의 임의 복합 유전자 발현 라이브러리는 증폭되거나, 복제되거나 또는 저장될 수 있다. 증폭은 숙주 유기체의 다수 클론을 생산할 수 있도록 제공 DNA를 포함하는 초기 숙주 유기체를 배양하는 것을 말한다. 복제는 라이브러리에서 개별 클론을 선택하여 생장시키는 것을 말한다. 본 발명의 복합 유전자 발현 라이브러리는 숙주 유기체에 적절한 본 기술분야에 공지의 기술을 이용하여 저장하거나 회수할 수 있다. 따라서, 본 발명의 라이브러리는 제공 유기체의 유전자 원료를 수득하고 보존하는 효과적인 수단이고 이는 약물 개발 프로그램에 반복적으로 접근할 수 있다.
도 1 은 복합 천연경로 발현 라이브러리의 발현 구조이다. 발현 구조체에는 대사 경로를 인코드하는 유전자와 천연적으로 연합된 조절부분으로 구성된 벡터 DNA 와 제공 DNA 단편을 포함한다.
도 2 는 복합 키메라 경로 발현 라이브러리의 발현 구조체이다. 발현 구조체에는 벡터 DNA 와 5개 결합된 유전자 카세트를 포함하는데 각 카세트는 제공 DNA 와 조절부분으로 구성된다.
도 3 은 복합 천연경로 발현 라이브러리의 클로닝 전략이다. 클론 가능한 DNA(B)는 제공 유기체(A)에서 추출하여 제한 효소를 이용하여 절단하고 자연 발생 생화학 경로 또는 이의 일부를 인코드하는 게놈 DNA(C)를 만든다. 이용가능한 단부(E)를 가지는 벡터를 만들기 위해 DNA 벡터(D)는 제한효소로 절단하고 게놈 DNA 단편과 연결시켜 발현 구조체(F)를 만든다.
도 4A-4C 는 유전자 카세트 어셈블리이다. 도 4A 는 SmaI 부위의 일부분에 상응하는 접착성 BamHI 부위와 끝이 잘린 말단(blunt end)을 포함하는 서냉 복원된, 포스포릴화된 lac 프로모터 단편을 나타낸다. 도 4B 는 lac 프로모터에 의해 각 측면에 있는 BamHI 부위를 포함하는 프로모터 이량체를 나타낸다. 도 4C는 결합된 프로모터 단편이다.
도 5A-5F 는 복합 키메라 경로 발현 라이브러리에 대한 클로닝 전략이다. 도 5A 는 cDNA 와 게놈 DNA 삽입체의 직접적인 클로닝을 위한 프로모터와 터미네이터를 준비하고 단계를 보여주고 있다. 도 5B 는 게놈 DNA 삽입체에 연결하기 위한 프로모터와 터미네이터 단편을 준비하는 단계를 보여주고 있다. 도 5C 는 직접적인 클로닝, 유전자 카세트의 어셈블리 및 고형 서포트에 결합을 위한 cDNA 삽입체를 준비하는 단계를 보여주고 있다. 도 5D 는 클로닝, 유전자 카세트 어셈블리 및 고형 서포트에 결합시키기 위한 게놈 DNA 삽입체를 준비하는 단계에 대해 설명하고 있다. 도 5E 와 5F 는 연속적인 연결 및 유전자 카세트의 탈보호 등을 나타내어, 단위구조(concatemer)를 만들고, S. pombe/대장균 셔틀 벡터(pDblet)에 단위구조의 결합, 고형 서포트로 부터 발현 구조체의 방출 및 발현 구조체의 고리화를 이루게 된다.
도 6A-6B 는 복합 유전자 발현 라이브러리를 만드는데 유용한 벡터에 대해 나타낸다. 도 6A 는 스트렙토코커스의 유전자 지도이고 코스미드 벡터 스트렙토코커스에는 다중 클로닝 부위에 T3 와 T7 프로모터에 인접한 유일한 BamHI 부위를 가지고, 복제원점, pIJ699의 티오스트렙톤 저항 유전자, ColE1 원점(ori), 암피실린 유전자(Amp)와 두 개 Cos 부위를 포함한다. 도 6B 는 변형된 pDblet 의 유전자 지도를 나타낸다. 플라스미드 pDblet 는 다중 클로닝 부위(MCS)에서 변형이 있었고, ColE1 복제된 원점, 암피실린 유전자(ApR), 자가 복제 서열(ARS) 두 개, ura4 표식과 β-갈락토시다제 유전자(LacZ)를 포함한다. A:Art II; B: BamHI; N:NdeI, 도 6C 에서는 개조된 BstX1 서열과 NcoI 부위를 포함하는 올리고머를 나타내는데 이는 SacI/NotI 절단된 pDblet 에 연결되어 변형된 pDblet를 만든다.
도 7 은 그린 형광 단백질(GFP)를 인코드하는 리포터 유전자, 화학 반응성 프로모터(Pm)와 이와 연관된 조절물질(Xyls)로 구성된 화학 반응성 구조체 pERD-20 -GFP를 나타낸다.
도 8 은 침투가능한 매트릭스로 구성된 마크로드로플렛을 나타내는데 이는 복합 유전자 발현 라이브러리에서의 클론과 리포터 섭생을 포함하는 지시세포를 에워싸고 있다.
도 9A 와 9B 는 해양 세균 유전자로 구성된 발현 구조체의 존재와는 상관없이 대장균 세포에서 FACS 소팅을 예를 들고 있는데 pERD-20-GFP 화학 반응성 구조를 포함하는 대장균, 균주 XL1-MR(이는 XL1-GFP 라고 칭함)을 해양 세균 유전자의 코스미드 라이브러리로 감염시킨다. 해양 세균 유전자의 유무에 상관없이 XL1-GFP 세포는 30℃에서 12시간동안 배양시키고 FACS 소팅을 2회 실시한다. 도 9A 는 해양 박테리아 유전자가 있는 XL1-GFP이고 도 9B 는 대조군 XL1-GFP 세포이다.
도 10 은 스트렙토마이세스 코엘리콜라의 악티노로딘 디하이드라제의 아미노서열과 CXC-AMN 20에서 유도된 예상된 부분 아미노산 서열의 배열이다. 평범한 상자는 서열 인식성을 나타내고 빗금친 상자는 보존된 서열 유사상을 나타낸다.
도 11 은 해양 미생물의 게놈 DNA 에서 클론 CXC-AMN 20 서열의 PCR 감지를 나타낸다. 도면에서는 해양 미생물 게놈 DNA 에서 유도한 PCR 엠플리콘을 포함하는 착색된 아가로즈 겔을 나타낸다. M: 분자량 표식, (b.p). 암플리콘과 리보좀 RNA 에 대한 -: 네가티브 대조군 +: 양성 대조군; 라인에는 총 37종 해양 미생물에서 얻은 게놈 DNA에서 유도한 암플리콘을 포함한다. 1.2.3.4 는 해양 미생물의 게놈 DNA 를 모은 것이다.
도 12A-C 는 해양 미생물종의 게놈 DNA 에서 클론 CXC-AMN 20 서열의 PCR 감지를 나타낸 것이다. 도면은 해양 미생물 각 종의 게놈 DNA 에서 유도된 PCR 엠플리콘을 포함하는 착색된 아가로즈 겔을 나타낸다. M: 분자량 표식, (b.p). 앰플리콘과 리보좀 RNA 에 대한 -: 음성 대조군과 +: 양성 대조군. 라인에는 1.2.3에 있는 종 #1-10, #12-20과 #21-35의 해양 미생물 게놈 DNA 에서 유도한 엠플리콘을 포함한다.

Claims (37)

  1. 발현 구조체 집합물로 구성되고 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리에 있어서, 각 발현 구조체는 다양한 제공 유기체(donor organism) 종에서 유래되고 무작위로 결합된 cDNA 또는 게놈 DNA을 포함하고, 이때 이들 결합된 cDNA 또는 게놈 DNA는 적절한 숙주 유기체에서 상기 결합된 cDNA 또는 게놈 DNA에 의해 인코드된 유전자의 발현을 유도하는 조절 부분과 작동가능하게 연합된 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  2. 청구항 2은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서, 발현 구조체는 플라스미드 벡터, 파아지, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터 또는 인공 염색체로 구성된 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  3. 제 2 항에 있어서, 벡터는 상이한 여러 숙주 세포 종류 또는 균주에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터인 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  4. 청구항 4은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA는 박테리아, 곰팡이, 조류, 지의류, 식물, 원충류, 후생동물, 강장동물, 곤충, 연체동물, 해면, 벌레, 양서류, 파충류, 피낭류, 새 또는 포유류에서 유래된 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  5. 청구항 5은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서, 제공 유기체는 토양 미생물이나 해양 미생물의 혼합물, 또는 토양 미생물과 해양 미생물의 혼합물로 구성된 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  6. 제 1 항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA는 환경 샘플에서 유래된 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  7. 청구항 7은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 5 항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA는 제공 유기체의 오페론으로 구성된 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  8. 청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 7 항에 있어서, 오페론은 목적하는 대사 경로를 인코드하는 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  9. 제 1 항에 있어서, 각 발현 구조체는 숙주 세포에 포함되는 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  10. 청구항 10은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 9 항에 있어서, 숙주 세포는 활성 약물 방출 시스템의 도입, 유도 또는 과다 생산에 의해 변화되는 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  11. 제 9 항에 있어서, 숙주 세포는 공지의 대사 경로의 도입, 유도 또는 과다 생산에 의해 변화되는 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  12. 청구항 12은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 9 항에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 곰팡이, 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  13. 청구항 13은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 12 항에 있어서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor), 사카로마이세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 아서퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopis thalinana), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), COS 세포, 293 세포, VERO 세포, NIH/3T3 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  14. 제 9 항에 있어서, 숙주 세포는 라이브러리에서 목적하는 대사 경로 또는 화합물을 발현하는 클론을 확인할 수 있도록 맞춤된 리포터 프로모터 구조체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  15. 청구항 15은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 14 항에 있어서, 리포터 프로모터 구조체는 숙주 세포에 의해 발현되는 목적하는 대사 경로 또는 화합물에 의해 유도되거나 조절되는 조절 부분과 작동가능하게 연합된 리포터 유전자를 인코드하는 DNA로 구성된 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  16. 청구항 16은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 9 항에 있어서, 숙주 세포는 라이브러리에서 목적하는 대사 경로 또는 화합물을 발현하는 클론을 확인할 수 있도록 맞춤된 리포터 프로모터 구조체를 포함하는 매트릭스에 존재하는 것을 특징으로 하는 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리.
  17. 복합 키메라 경로 유전자 발현 라이브러리를 만드는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    다수의 제공 유기체에서 유래된 cDNA 또는 게놈 DNA를 무작위로 결합시키고;
    상기 결합된 cDNA 또는 게놈 DNA를 DNA 벡터에 연결하여 발현 구조체 라이브러리를 만들고,
    이때 cDNA 또는 게놈 DNA에 포함된 유전자는 적절한 숙주 세포에서 유전자의 발현을 유도하는 고유 또는 외부 조절 부분과 작동가능하게 연합된다.
  18. 청구항 18은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 17 항에 있어서, DNA 벡터는 플라스미드 벡터, 파아지, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터 또는 인공염색체로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 19은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 18 항에 있어서, 벡터는 상이한 여러 숙주 세포 종류 또는 균주에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 20은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 17 항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA는 박테리아, 곰팡이, 조류, 지의류, 식물, 원충류, 후생동물, 강장동물, 곤충, 연체동물, 해면, 벌레, 양서류, 파충류, 피낭류, 새 또는 포유류에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 21은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 17 항에 있어서, 제공 유기체는 토양 미생물이나 해양 미생물의 혼합물, 또는 토양 미생물과 해양 미생물의 혼합물로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 17 항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA는 환경 샘플에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 23은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 21 항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA는 제공 유기체의 오페론으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 24은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 23 항에 있어서, 오페론은 목적하는 대사 경로를 인코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 17 항에 있어서, 숙주 세포에 발현 구조체 라이브러리를 도입하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 26은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 25 항에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 곰팡이, 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 27은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26 항에 있어서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor), 사카로마이세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 아서퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopis thalinana), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), COS 세포, 293 세포, VERO 세포, NIH/3T3 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 28은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 25 항에 있어서, 숙주 세포는 라이브러리에서 목적하는 대사 경로 또는 화합물을 발현하는 클론을 확인할 수 있도록 맞춤된 리포터 프로모터 구조체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 29은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 28 항에 있어서, 리포터 프로모터 구조체는 숙주 세포에 의해 발현되는 목적하는 대사 경로 또는 화합물에 의해 유도되거나 조절되는 조절 부분과 작동가능하게 연합된 리포터 유전자를 인코드하는 DNA로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 숙주 세포는 활성 약물 방출 시스템의 도입, 유도 또는 과다 생산에 의해 변화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 31은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 25 항에 있어서, 숙주 세포는 공지의 대사 경로의 도입, 유도 또는 과다 생산에 의해 변화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 유전자 발현 라이브러리에서 목적하는 화합물을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    가) 청구항 9항의 유전자 발현 라이브러리를 배양하고;
    나) 목적하는 화합물을 생산하는 클론에 대한 유전자 발현 라이브러리를 스크린한다.
  33. 목적하는 화합물에 대한 유전자 발현 라이브러리를 스크린하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    가) 청구항 14항의 유전자 발현 라이브러리를 배양하고;
    나) 리포터 프로모터 구조체에 의해 발생되는 시그널을 감지하고, 따라서 목적하는 화합물을 생산하는 클론을 확인한다.
  34. 청구항 34은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    목적하는 화합물에 대한 유전자 발현 라이브러리를 스크린하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    가) 청구항 16항의 유전자 발현 라이브러리를 배양하고;
    나) 리포터 프로모터 구조체에 의해 발생되는 시그널을 감지하고, 따라서 목적하는 화합물을 생산하는 클론을 확인한다.
  35. 목적하는 화합물을 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    가) 청구항 32항에서 확인된 클론을 배양하고;
    나) 확인된 클론 배양물로부터 목적하는 화합물을 회수한다.
  36. 목적하는 화합물을 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    가) 청구항 33항에서 확인된 클론을 배양하고;
    나) 확인된 클론 배양물로부터 목적하는 화합물을 회수한다.
  37. 청구항 37은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    목적하는 화합물을 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    가) 청구항 34항에서 확인된 클론을 배양하고;
    나) 확인된 클론 배양물로부터 목적하는 화합물을 회수한다.
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