JP5001346B2 - ディファレンシャルに発現する同義遺伝子のコンカテマー - Google Patents
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Description
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
(ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも第一カセットは第二カセットと異なる)
のヌクレオチド配列のカセットを含んで成るヌクレオチドのコンカテマーに関する。
を有する。この方法では、同一でないオーバーハングを有するカセットが、1つの酵素で切り出されうる。このことは、分子内再ライゲーションを防ぎ、そして同一のカセットが互いにライゲーションするのを防ぎ、分子内組換えの危険性を低下させる。
[RS1-RS2-SP-PR-X-TR-SP-RS2'-RS1']
(ここで、Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRはプロモーターを表し、
TRはターミネーターを表す)を有するカセットを含んで成る一次ベクターから出発して、i) RS2及びRS2'に特異的な少なくとも1つの制限酵素の力を借りて一次ベクターを切断し、一般式[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1](ここで、rs1及びrs2はともに機能的制限部位RS2又はRS2'を表す)を有するカセットを獲得し、
ii) rs1とrs2との間の相互作用を介して、切り出されたカセットを構築すること、
を含んで成る。
n≧2であり、そして少なくとも2つの発現可能なヌクレオチド配列が異なる発現状態に由来する)のオリゴヌクレオチドを含んで成る、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも1つのコンカテマーを含んで成る、宿主細胞に関する。
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
(ここで、
rs1とrs2は共に機能的制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも2つのカセットのrs1-rs2が同一の制限酵素によって認識される)のオリゴヌクレオチドを含んで成る、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくともコンカテマーを含んで成る細胞に関する。
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
(ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、
TRはターミネーターを表す)のヌクレオチド配列のカセットを含んで成る一次ベクターに関する。
3' rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1-rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs15'
3' rs2-SP-TR-X-PR-SP-rs1-rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs15'
3' rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1-rs2-SP-TR-X-PR-SP-rs1 5'
(rs1-rs2は共に制限部位を表す)
を有することがある。
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
(ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、そして
TRはターミネーターを表す)のヌクレオチド配列を含んで成る一次ベクター内のクローニング部位内に発現可能なヌクレオチド配列を挿入すること、を含んで成る一次ベクターの調製方法に関する。
[RS1-RS2-SP-PR-X-TR-SP-RS2'-RS1']
(ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRはプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、
−ここでの発現可能なヌクレオチド配列は、1つの発現状態から単離され、そして
−少なくとも2つのカセットが異なる)のヌクレオチド配列のカセットをそれぞれが含んで成る少なくとも2つの一次ベクターを含んで成るヌクレオチドライブラリーに関する。
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
(ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、そして
TRはターミネーターを表す)のヌクレオチド配列を含んで成るカセットを含んで成る一次ベクター混合物のクローニング部位内にクローニングし、そして一次ベクターを宿主細胞内に伝達してライブラリーを獲得すること、
を含んで成る方法、に関する。
オリゴヌクレオチド
約2〜10000個の核酸を有する核酸の任意なフラグメント
本発明の目的のために、略語RSn(n=1,2,3等)は、制限部位を含んで成るヌクレオチド配列を表すために使用される。制限部位は、認識配列及び開裂部位によって定義される。開裂部位は、認識配列の内側又は外側に位置していてもよい。略語「rs1」-「rs2」は、開裂後の制限部位の2つの末端を表すために使用される。配列「rs1-rs2」は、一緒に完全な制限部位を表す。
RS1-RS2-SP-PR-X-TR-SP-RS2-RS1のような式は、個々の配列が指定された順序で続くことを意味すると解されるべきである。このことは、例えばRS2の認識配列の一部がスペーサー配列と重複することを排除しないが、RS1及びRS1'を除く全ての要素が機能的であり、且つ開裂及び再構築の後に機能的なままであることを厳密に必要とする。更に、当該式は、追加の配列が列記した要素間に挿入される可能性を排除しない。例えば、イントロンが、本発明の後文に記載のように挿入されることがあり、そして、更なるスペーサー配列がRS1とRS2の間、及びTRとRS2の間に挿入されることがある。重要なのは、当該配列が機能的なままであることである。
発現状態は、任意なある時間の、任意な個々の生物の任意な特定の組織における状態である。遺伝子発現の変化をもたらす条件の任意な変化は、別の発現状態をもたらす。異なる発現状態が、異なる種の異なる個体において見られるが、それらは同一の種又は個体の異なる器官においても、そして同一の種又は個体の異なる組織型においても見ることができる。異なる発現状態は、任意なある種又は個体の同一の器官又は組織において、当限定しないが年齢の変化、疾患、感染、乾燥、湿気、塩分、生体異物に対する曝露、生理学的エフェクター、温度、気圧、pH、光、気体の環境、化学物質、例えば毒素を含んで成る、異なる環境条件に該組織又は器官を曝露することによって得ることもできる。
本明細書で使用する場合、人工染色体(AC)は、内因性の染色体と一緒に安定的に複製し、そして分離することができる1個のDNAである。真核生物の場合、人工染色体はまた、機能的なセントロメア、機能的なテロメア、及び少なくとも1つの自己複製配列を含んで成る、十分な長さのヌクレオチドとしても記載されることがある。それは、その中に挿入される異種遺伝子を収納し、そして発現する能力を有する。それは、活動的な哺乳類のセントロメアを含む場合、哺乳類人工染色体(MAC)と言及される。植物人工染色体及び昆虫人工染色体(BUGAC)は、それぞれ植物及び昆虫のセントロメアを含む染色体を言及する。ヒト人工染色体(HAC)は、ヒトセントロメアを含む染色体を言及し、AVACは、鳥類人工染色体を言及する。酵母人工染色体(YAC)は、酵母において機能的な染色体、例えば酵母セントロメアを含む染色体を言及する。
後文において、本発明は、進化可能な人工染色体を含む、形質転換した宿主細胞を得る段階が、エントリーベクターから開始して実施されうる順序で説明される。
本発明に従う、ベクター、コンカテマー、及び細胞に挿入されうる発現可能なヌクレオチド配列は、任意な型のヌクレオチド、例えばRNA、DNAを包含する。そのようなヌクレオチド配列は、例えば、天然で発現可能なcDNAから得ることもできる。しかし、特定の遺伝子をコードするゲノムDNAの配列を使用することもできる。好ましくは、発現可能なヌクレオチド配列は、完全長の遺伝子、例えば実質的に完全長のcDNAと対応しているが、もとの完全長のmRNAよりも短いペプチドをコードするヌクレオチド配列も使用されうる。より短いペプチドは、天然タンパク質のものと類似の触媒活性をなおも保持することがある。
本発明の重要な観点は、高度に順序づけられた配列のヌクレオチドのカセットであって、5’→3’方向に、一般式
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
(ここで、RS1及びRS1'は制限部位を表し、RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、CSはクローニング部位を表し、そしてTRはターミネーターを表す)を有するカセットに関する。
両方の制限部位を開裂する制限酵素で一次ベクターを処理することによって、当該発現コンストラクト及び当該一次ベクターは、2つのコンパチブルでない末端を有するものとなる。これは、空のベクターが発現コンストラクトのコンカテマー化に関与しないので、コンカテマー化を容易にする。
基本的に、制限酵素が知られている任意の制限部位が使用されうる。これらは、分子生物学の分野で一般的に知られ、そして使用される制限酵素、例えばSambrook, Fritsch, Maniatis,"A laboratory Manual", 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.に記載されているものを含む。
RS2配列とPR配列との間に位置するスペーサー配列は、好ましくは、転写されないスペーサー配列である。スペーサー配列の目的は、同一細胞内に存在する、異なるコンカテマー間の、又は同一のコンカテマー内に存在するカセット間の組み換えを最小限にすることであるが、それはまた、当該カセット内のヌクレオチド配列を更に「宿主」様にするための役割を果たすこともある。スペーサー配列の更なる目的は、カセットが頭と頭、又は尾と尾で会合する場合に起こりうる、隣接するパリンドローム配列間でのヘアピン形成の発生を低下させることである。スペーサー配列は、例えばPCRプライマー部位としての、又は、カセットのアフィニティー精製を可能にする核酸若しくはPNA若しくはLNAプローブに対するハイブリダイゼーションのための標的としての役割を果たしうる、短い保存ヌクレオチド配列を導入するために便利なこともある。
プロモーターは、RNAポリメラーゼが結合し、そして転写を開始するDNA配列である。プロモーターは、鎖が転写されるのを指示することによって転写物の方向性を決定する。
続いて、本発明で一緒に使用されうる既知の酵母プロモーターの例を示す。当該例は限定するものではなく、そして、本発明に従い有用なプロモーターをどのように選択し又は設計するかを当業者に示す役割を果たすためのものである。
(1)転写の開始部位の位置及び基底レベルを決定する、TATAボックス及び転写開始部位を含んで成る、いわゆる最小プロモーター領域。サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、最小プロモーター領域の長さは比較的変化可能なものである。事実、TATAボックスの正確な配置は、開始部位の−40〜−120ヌクレオチド上流にあってもよい(Chen and Struhl, 1985, EMBO J., 4,3273-3280)。
(2)構成的に(培養条件に関係なく、細胞周期に沿った比較的一定の転写レベル)又は制御可能に(アクチベーターの存在下での転写及び/又はリプレッサーの存在下での抑制の活性化)有効な転写レベルを保証するのを可能にする、TATAボックスの上流(最大数百ヌクレオチドすぐ上流)の配列。これらの配列は、アクチベーター、インヒビター、エンハンサー、インデューサー、リプレッサーなどの複数の型のものでもよく、そして細胞性の因子又は培養条件の変化に応答することがある。
更に好ましくは、本発明は、合成プロモーターの使用を採用する。合成プロモーターは、ある遺伝子の最小プロモーター領域と別の遺伝子の上流制御配列とを組み合わせることによって構築される。プロモーターの制御の増大は、上流制御配列の特定配列を修飾することによって、例えば、置換又は欠失を介して、あるいは特定の制御配列の多数のコピーの挿入を介して得ることができる。合成プロモーターを用いる1つの利点は、それらが、宿主細胞の天然のプロモーターに干渉しすぎることなく制御されうることである。
(P. R. (2)-P. R. (1))-
(P. R. (1)は、コード配列に隣接し、且つ転写開始部位、RNAポリメラーゼ結合部位を有し、且つTATAボックス、CAAT配列、及び転写制御シグナル、例えばキャッピング配列を必要に応じて含む、プロモーター領域であり;
P. R. (2)は、RNAポリメラーゼ結合領域の転写の有効性の増強と関連した、P. R. (1)の5’末端に連結したプロモーター領域である)を有するプロモーターを記載している。
一次ベクターのカセット内のクローニング部位は、任意のヌクレオチド配列がその中にクローニングされうるように設計されるべきである。
−組み換え及びloxP部位を使用する、Clontech社のCreator(商標)Cre-loxP系
−ラムダ付着部位(att-λ)、例えばLife Technologies社のGateway(商標)系の使用、
が含まれる。これらの系はともにディレクショナルである。
ターミネーター配列の役割は、コード配列の長さに転写を制限することである。最適なターミネーター配列は、それ故に、宿主細胞でこの作用を実施することができるものである。
任意に、ベクター内のカセットは、発現可能なヌクレオチド配列に対して5’又は3’側に位置することがある、イントロンを含んで成ることがある。イントロンのデザイン及びレイアウト当業界で周知である。イントロンのデザインの選択は、発現可能なヌクレオチド配列が最終的に発現するべく対象の宿主細胞に大きく依存する。発現カセット内にイントロンを持つ効果は、イントロン配列と一般的に関連しているものである。
用語「エントリーベクター」とは、本発明に従うカセットを用いて、cDNA又は他の発現可能なヌクレオチド配列を貯蔵し、又は増幅するためのベクターを意味する。一次ベクターは、好ましくは、E.コリ又は任意な他の適当な標準的宿主において増殖することができる。それは、好ましくは増幅可能で且つ、標準的な均一化手順及びエンリッチメント(enrichment)手順に適合可能であるべきである。
細胞においてヌクレオチド配列のライブラリーを構築し、そして維持するための方法並びにそれに適したベクター及び宿主細胞は当業界で周知である。当該ライブラリーに主に必要なことは、その中で本発明に従う多数の一次ベクター(コンストラクト)を保存し、そして増幅することが可能であるべきということであり、当該ベクター(コンストラクト)は、少なくとも1つの発現状態に由来する発現可能なヌクレオチド配列を含んで成り、そして少なくとも2つのベクター(コンストラクト)が異なる。
コンカテマーは、一連の連結した単位である。本文において、コンカテマーは、多数の直列に連結したヌクレオチドカセットを表すために使用され、ここでは、少なくとも2つの直列に連結したヌクレオチド単位が、基本構造
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]
(ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表す)
を有するカセットを含んで成る。
ストレプトマイセス、ミクロモノスポラ(Micromonospora)、ノルカディア(Norcadia,)、アクチノマデュラ(Actinomadura)、アクチノプラネス(Actinoplanes)、ストレプトスポランギウム(Streptosporangium)、ミクロビスポラ(Microbispora)、キタサトスポリアム(Kitasatosporiam)、アゾバクテリウム(Azobacterium)、リゾビウム(Rhizobium)、アクロモバクテリウム(Achromobacterium)、エンテロバクテリウム(Enterobacterium)、ブルセラ(Brucella)、ミクロコッカス(Micrococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、バチルス(Bacillus)(B. t.毒素)、クロストリジウム(Clostridium)(毒素)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、シュードモナス(Pseudomonas)、アエロバクター(Aerobacter)、ビブリオ(Vibrio)、ハロバクテリウム(Halobacterium)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、サイトファーガ(Cytophaga)、ミクソコッカス(Myxococcus)
アマニタ・ムスカリア(Amanita muscaria)(ベニテングダケ(fly agaric)、イボテン酸、ムシモール(muscimol))、シロシベ(Psilocybe)(シロシビン(psilocybin))、フィサリウム(Physarium)、フリゴ(Fuligo)、ムコール(Mucor)、フィトフトラ(Phytophtora)、リゾプス(Rhizopus)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)(ペニシリン)、コプリヌス(Coprinus)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、アクレモニウム(Acremonium)(セファロスポリン)、トロコデルマ(Trochoderma)、ヘルミンソスポリウム(Helminthosporium)、フサリウム(Fusarium)、アルテルナリア(Alternaria)、ミロセシウム(Myrothecium)、サッカロマイセス(Saccharomyces)
マクリ(Digenea simplex)(カイニン酸(kainic acid)、駆虫薬)、ミツイシコンブ(Laminaria anqustata)(ラミニン、降圧剤),
ウスネア・ファスシアタ(Usnea fasciata)(バルピン酸(vulpinicacid)、抗菌剤、ウスニン酸、抗ガン剤)
ヨモギ(Artemisia)(アルテミニシン(artemisinin))、コリウス(Coleus)(フォルスコリン),、ハギ(Desmodium)(カリウムチャネルアゴニスト)、カタランサス(Catharanthus)(ビンカアルカロイド)、ジギタリス(Digitalis)(強心配糖体)、ポドフィルム(Podophyllum)(ポドフィロトキシン(podophyllotoxin))、イチイ(Taxus)(タキソール)、イヌガヤ(Cephalotaxus)(ホモハリントニン(homoharringtonine))、カンプトテカ(Camptotheca)(カンプトテシン(Camptothecin))、チャ(Camellia sinensis)(ティー(tea))、カンナビス・インディカ(Cannabis indica)、カンナビス・サチバ(Cannabis sativa)(大麻)、コカノキ(Erythroxylum coca)(コカ)、烏羽玉(Lophophora williamsii )
(ペヨーテ(Peyote))、ニクズク(Myristica fragrans)(ナツメグ)、ニコチアナ(Nicotiana)、ケシ(Papaver somniferum)(オピウム・ポピー(Opium Poppy))、クサヨシ(Phalaris arundinacea)(リードカナリーグラス(Reed canary grass))
タイコジスカス・ブレビス(Ptychodiscus brevis); 渦鞭毛藻(Dinoflagellates)(ブレビトキシン、心血管性)
ミクロシオニア・プロライフェラ(Microciona prolifera)(エクチオニン(ectyonin)、抗菌剤) クリプトテチラ・クリタ(Cryptotethya cryta)(D-アラビノフラノシド)
カツオノエボシ並びに他のクラゲ及びメデュソイド毒(medusoid toxin)
シュードテルゴニア種(Pseudoterogonia specie)(シュードテラシン(Pseudoteracin)、抗炎症剤)、 エリスロポディウム(Erythropodium)(エリスロリド(erythrolide)、抗炎症剤)
線虫分泌化合物(Nematode secretory compound)
イモガイ毒、ウミウシ毒、頭足類神経伝達物質(cephalapod neurotransmitter)、イカスミ(squid ink)
ランブリコネレシス・ヘテロパ(Lumbriconereis heteropa)(ネライストキシン(nereistoxin、殺虫剤)
ハシリグモ属(「フィッシング・スパイダー」毒)
キセノバラヌス(Xenobalanus) (皮膚用接着剤)
エピラチュナ(Epilachna)(メキシカンビーンビートル(mexican bean beetle)のアルカロイド)
ボネリア・ビリジス(Bonellia viridis)(ボネリン(bonellin)、神経刺激性)
フサコケムシ(Bugula neritina)(ブリオスタチン、抗ガン剤)
ウミユリ化学(Crinoid chemistry)
トリジデナム・ソリダム(Trididemnum solidum)(ジデニン(didemnin) 、抗腫瘍剤及び抗ウイルス剤; エクテイナシジア(Ecteinascidia turbinata) エクテイナシジン(ecteinascidins)、抗腫瘍剤)
メクラウナギ(Eptatretus stoutii)(エプタトレチン(eptatretin)、心作用性)、トゲミシマ(Trachinus draco)(タンパク性毒素、血圧降下、呼吸及び心拍数低下). ヤドクガエル(Dendrobatid frog) (バトラコトキシン、プミリオトキシン(pumiliotoxin)、ヒストリオニコトキシン(histrionicotoxin)及び他のポリアミン)、ヘビ毒;カモノハシ(Orinthorhynohus anatinus)(カモノハシ毒), 修飾型カロテノイド;レチノイド及びステロイド;鳥類:ヒストリオニコトキシン(histrionicotoxin)、修飾型カロテノイド;レチノイド及びステロイド
コンカテマー化されるカセットは通常、制限酵素による消化、又はPCRのいずれかによってベクターから切り出される。切り出しの後、カセットは、サイズ分画、例えばゲルろ過を介して、又はカセット内の既知の配列のタギングを介して分離されうる。単離されたカセットは、続いて、粘着末端間の相互作用を介して、又は平滑末端のライゲーションを介して一緒に連結されうる。
(ここで、Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRはプロモーターを表し、
TRはターミネーターを表す)から出発して、
i) RS2及びRS2'に特異的な少なくとも1つの制限酵素の力を借りて一次ベクターを切断し、一般式[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1](ここで、rs1及びrs2はともに機能的制限部位RS2又はRS2'を表す)を有するカセットを獲得し、
ii) rs1とrs2との間の相互作用を介して切り出されたカセットを構築すること、
を含んで成る。
i)発現状態からmRNAを単離し、
ii)当該mRNA配列に相当する実質的に完全長のcDNAを獲得し、
iii)一次ベクター内の、5’→3’方向の一般式[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1'](ここで、CSはクローニング部位を表す)のカセットのクローニング部位内に実質的に完全長のcDNAを挿入する段階、
を含んでもよい。
・アンピシリン:細菌の細胞壁合成の末端反応を阻害する。耐性遺伝子(bla)は、当該抗生物質のベータラクタム環を開裂してそれを解毒するベータラクタマーゼをコードする。
・ヒグロマイシン:リボソームの転移を混乱させ、そして翻訳ミスを促進することによってタンパク質合成を阻害するアミノサイクリトール。耐性遺伝子(hph)はヒグロマイシンBのリン酸化を解毒する。
本発明の1つの観点において、多数のカセットを含んで成るコンカテマーは、コンカテマーを維持することができ、且つ発現可能なヌクレオチド配列を協調して発現することができる宿主細胞内に導入される。コンカテマー内に含まれるカセットは宿主細胞から単離され、そして、好ましくはカセット間にコンカテマー制限部位を有するそれらの均一構造に起因して、再構築される。
実施例1〜3において、Asc1部位は、粘着末端がpEVEベクターのカセットのAsc1部位(=本特許の一般式のRS2)に適合するように、C4 (Sigma, Burke DT et al. 1987, Science vol 236, p 806)のEcoR1部位内に導入された。
pYAC4-Ascアームの調製
1.150 mlのLB (sigma)にpYAC4-Ascを含むE. コリ DH5aαの単一コロニーを播種する。
2. OD600〜1まで増殖させ、細胞を採集し、そしてプラスミドを調製する。
3. 100μgのpYAC4-AscをBamH1及びAsc1で消化する。
4. フラグメントを脱リン酸化し、そしてホスファターゼを熱不活性化する(20分、80℃)。
5. フラグメントを精製する(例えばQiaquick Gel Extractionキット)。
6. フラグメントの量を推定するために1%アガロースゲルに流す。
1. 100μgのプラスミド調製物を以下の各ライブラリー
a) pMA-CAR
b) pCA-CAR
c) ファフィア(phaffia) cDNAライブラリー
d) キャロット(carrot) DNAライブラリーから採取する。
2. Srf1で消化する(10ユニット/調製物, 37℃で一晩)。
3. 脱リン酸化する(10ユニット/調製物, 37℃, 2時間)。
4. 80℃で20分間熱不活性化する。
5. 濃縮し、そして緩衝液を交換する(沈殿又は限外ろ過)。
6. Asc1で消化する(10 ユニット/調製物, 37℃, 一晩)。
7. 調製物の体積を100μlに調整する。
異なる型のEVACが、ライゲーション反応に投入する異なるライブラリーの比率を変化させることによって生成された。
2. 33.5μL未満に濃縮する。
3. 2.5 ユニットのT4 DNA-リガーゼ+ 4μL 10x リガーゼ緩衝液を添加する。40μLに調整する。
4. 16℃で3時間ライゲーションする。
5. 2μLの500 mM EDTAを添加することによって反応を停止させる。
6. 反応液の体積を125μLにし、25μLのローディングミックスを添加し、60℃で5分間過熱する。
7. 1 % LMPアガロースゲルの10個の穴に均一に分配する。
8. パルスフィールドゲルに流す(CHEF III, 1 % LMPアガロース, 1/2xTBE (BioRad), 角度 120度, 温度12℃, 電圧5.6V/cm, 5〜25秒に及ぶスイッチタイム, ランタイム30時間)。
9. 分子量マーカー+品質チェック用の1つのサンプルレーンを含むゲルの一部を染色する。
10. 97〜194 kb (画分1);194〜291 kb (画分 2); 291〜365 kb (画分 3)に相当する残りの9個のサンプルレーンをゲルから切り出す。
11. 高濃度のNaClアガラーゼ緩衝液(1 u のアガラーゼ/100μgゲル)中で40℃で3時間、ゲルをアガラーゼ処理する。
12. 20μL未満に濃縮する。
13. アルカリ/カチオン形質転換を用いて、調製物で適当な酵母を形質転換する。
14. 選択的最小培地上でプレーティングする。
15. 30℃で4〜5日間とインキュベートする。
16. コロニーをピッキングする。
17. コロニーを解析する。
直接的な形質転換を含むEVAC(進化可能な人工染色体)の調製
pYAC4-Ascアームの調製
1. 150 mlのLB (sigma)にpYAC4-Ascを含むE. コリ DH5aαの単一コロニーを播種する。
2. OD600〜1まで増殖させ、細胞を採集し、そしてプラスミドを調製する。
3. 100μgのpYAC4-AscをBamH1及びAsc1で消化する。
4. フラグメントを脱リン酸化し、そしてホスファターゼを熱不活性化する(20分、80℃)。
5. フラグメントを精製する(例えばQiaquick Gel Extractionキット)。
6. フラグメントの量を推定するために1%アガロースゲルに流す。
1. 100μgのプラスミド調製物を以下の各ライブラリー
a) pMA-CAR
b) pCA-CAR
c) ファフィア(phaffia) cDNAライブラリー
d) キャロット(carrot) DNAライブラリーから採取する。
2. Srf1で消化する(10ユニット/調製物, 37℃で一晩)。
3. 脱リン酸化する(10ユニット/調製物, 37℃, 2時間)。
4. 80℃で20分間熱不活性化する。
5. 濃縮し、そして緩衝液を交換する(沈殿又は限外ろ過)。
6. Asc1で消化する(10 ユニット/調製物, 37℃, 一晩)。
7. 調製物の体積を100μlに調整する。
異なる型のEVACが、ライゲーション反応に投入する異なるライブラリーの比率を変化させることによって生成された。
2. 1 ユニットのT4 DNA-リガーゼ+ 4μL 10x リガーゼ緩衝液を添加する。40μLに調整する。
3. 16℃で2時間ライゲーションする。
4. 2μLの500 mM EDTAを添加することによって反応を停止させ、60℃で20分熱不活性化する。
5. 反応液の体積を蒸留水で500μLにし、30μLに濃縮する。
6. 10 UのAsc1, 4 uLの10X Asc1緩衝液を添加し、40μLにする。
7. 37℃で1時間インキュベートする(あるいは15分、30分)。
8. 60℃で20分熱不活性化する。
9. 2μgのAC4-Ascアーム, 1 UのT4 DNA リガーゼ, 10 uLの10Xリガーゼ緩衝液を添加し、100μLにする。
10. 16℃でインキュベートする。
11. 水を添加して500μLにする。
12. 20μLに濃縮する。
13. アルカリ/カチオン形質転換を用いて、調製物で適当な酵母を形質転換する。
14. 選択的最小培地上でプレーティングする。
15. 30℃で4〜5日間とインキュベートする。
16. コロニーをピッキングする。
17. コロニーを解析する。
EVAC(進化可能な人工染色体)の調製(小規模な調製)
発現カセットの調製
1. 5 mlのLB-培地(Sigma) に10倍表示のライブラリーに相当するライブラリーの播種材料を播種する。一晩増殖させる。
2. 1.5mlの培養液からプラスミドをミニプレップする(例えばQiaprep スピンミニプレップキット)。
3. Srf 1でプラスミドを消化する。
4. フラグメントを脱リン酸化し、そしてホスファターゼを熱不活性化する(20分、80℃)。
5. Asc1で消化する。
6. フラグメントの量を推定するために、1%アガロース中に1/10の反応液を流す。
1. 150 mlのLB (sigma)にpYAC4-Ascを含むE. コリ DH5aαの単一コロニーを播種する。
2. OD600〜1まで増殖させ、細胞を採集し、そしてプラスミドを調製する。
3. 100μgのpYAC4-AscをBamH1及びAsc1で消化する。
4. フラグメントを脱リン酸化し、そしてホスファターゼを熱不活性化する(20分、80℃)。
5. フラグメントを精製する(例えばQiaquick Gel Extractionキット)。
6. フラグメントの量を推定するために1%アガロースゲルに流す。
1. カセット/アーム比が1000/1未満となるように、発現カセットフラグメントをYAC-アームと混合する。
2. 必要に応じて、フラグメント濃度が75 ng/μL反応液となるように、混合物を濃縮する(例えば、Microcon YM30を用いる)。
3. 1ユニットのT4 DNA-リガーゼを添加し、16℃で1〜3時間ライゲーションする。1μLの500 mM EDTAを添加することによって反応を停止させる。
4. パルスフィールドゲルに流す(CHEF III, 1 % LMPアガロース, 1/2xTBE, 角度 120度, 温度12℃, 電圧5.6V/cm, 5〜25秒に及ぶスイッチタイム, ランタイム30時間)。2個のレーンに試料を添加する。
5. 分子量マーカーを含むゲルの一部を染色する。
6. 分子量100〜200kbに相当するサンプルレーンをゲルから切り出す。
7. 高濃度のNaClアガラーゼ緩衝液(1 u のアガラーゼ/100mgゲル)中でゲルをアガラーゼ処理する。
8. 20μL未満に濃縮する。
9. アルカリ/カチオン形質転換を用いて、調製物で適当な酵母を形質転換する。
10. 選択的最小培地上でプレーティングする。
11. 30℃で4〜5日間とインキュベートする。
12. コロニーをピッキングする。
1. Daucus carota, キャロットルートライブラリー
・完全長
・オリゴdT プライミングした、ディレクショナルcDNA ライブラリー
・3個のEvolva EVE 4,5及び8ベクター(図4,5,6)のプールを用いて作成したcDNAライブラリー
・独立したクローンの数:41.6 x 106個
・平均サイズ: 0.9-2.9 kb
・存在している異なる遺伝子数5000-10000個
・完全長
・Oligo dTプライミングした、ディレクショナルcDNAライブラリー
・3個のEvolva EVE 4,5及び8ベクター(図4,5,6)のプールを用いて作成したcDNAライブラリー
・独立したクローンの数:48.0 x 106個
・平均サイズ: 1.0-3.8 kb
・存在している異なる遺伝子数5000-10000個
・完全長且つ均一
・ディレクショナル cDNAクローニング
・3個のEvolva EVE 4,5及び8ベクター(図4,5,6)のプールを用いて作成したcDNAライブラリー
・異なる遺伝子の数:48個
・使用した種及び遺伝子
・リンドウ種(Gentiana sp), ggps, psy, pds, zds, Icy-b, Icy-e, bhy, zep
・ロドバクター・カプスラツス(Rhodobacter capsulatus), idi, crtC, crtF
・エルウィニア・ウレドボラ(Erwinia uredovora), crtE, crtB, crti, crtY, crtZ
・ノストク・アナバエアナ(Nostoc anabaena), zds
・シネコッカス(Synechococcus)PCC7942, pds
・エルウィニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola), crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ
・スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus), crtM, crtN
・ザントフィロマイセス・デンドロロウス(Xanthophyllomyces dendrorhous), crtl, crtYb
・カプシカム・アンヌウム(Capsicum annuum), ccs, crtL
・ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum), crtL, bchy
・プロクロコッカス種(Prochlorococcus sp.), Icy-b, Icy-e
・サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae), idi
・コリネバクテリウム種(Corynebacterium sp.), crtl, crtYe, crtYf, crtEb
・リコペリシコン・エスキュレンタム(Lycopersicon esculentum), psy-1
・ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa), al1
実施例5a:形質転換
1. 単一のコロニーを100 mlのYPDブロス内に播種し、そして通気しながら30℃で2 x 106〜2 x 107個の細胞/mlに増殖させる。
2. 細胞をペレットにするために、400 x gで5分間遠心し;上清を捨てる。
3. 合計9 ml TE(pH 7.5)中で再懸濁する。細胞をペレットにするために遠心し、そして上清を捨てる。
4. 5 mlの0.1 M 酢酸リチウム/セシウム溶液(pH 7.5)中で穏やかに細胞を再懸濁する。
5. 穏やかに振とうしながら30℃で1時間インキュベートする。
6. 細胞をペレットにするために、400 x gで5分間遠心し、そして上清を捨てる。
7. 1LのTE(pH 7.5)中で穏やかに再懸濁する。.細胞はこれで形質転換の準備完了である。
8. 1.5 mlのチューブにおいて
・100μlの酵母細胞
・5μlのキャリアーDNA (10 mg/ml)
・5μlのヒスタミン溶液
・10μlの体積(最大)中1/5 量のEVAC調製物(1つのEVAC調製物は、100μgのコンカテマー化反応混合物から作られる)
9. 穏やかに混合し、そして室温で30分間インキュベートする。
10. 別々のチューブ内で、各形質転換反応液につき、0.8 ml 50% (w/v) PEG 4000及び0.1 mlのTE 及び0.1 mlの1 M LiAcを一緒にする。1 mlのこのPEG/TE/LiAc混合物を各形質転換反応液に添加する。穏やかにピペッティングしながら細胞を溶液中に混合させる。
11. 1時間30℃でインキュベートする。
12. 42℃で15分間熱ショックを与え;30℃に冷却する。
13. 微量遠心機内で、高速で5秒間細胞をペレットにし、そして上清を除去する。
14. 200μlの高濃度の培養液を再懸濁し、そして適当な選択的培地中にプレーティングする。
15. 形質転換コロニーが出現するまで、30℃で48〜72時間インキュベートする。
100 mlのYPDに1つの酵母のコロニーを接種し、そしてOD600 = 1.3〜1.5にまで増殖させる。培養物を4000 x g 、4℃で遠心することによって採集する。細胞を16mlの滅菌水中で再懸濁する。2 mlの10 x TE 緩衝液(pH 7.5)を添加し、そして回転させて混合する。30℃で45分穏やかに振とうする。回転させながら1.0 mlの0.5 M DTEを添加する。30℃で穏やかに15分間振とうする。酵母の懸濁液を滅菌水で100mlに希釈する。細胞を洗浄し、そして4000 x gで遠心し、50mlの氷冷した滅菌水中で再懸濁し、4000 x gで遠心し、5mlの氷冷した滅菌水中で再懸濁し、4000 x gで遠心し、そしてペレットを0.1mlの氷冷した滅菌1Mソルビトール中で再懸濁することによって濃縮する。エレクトロポレーションは、Bio-Rad Gene Pulserを用いて行った。滅菌した1.5mlの微量遠心管中で、40μlの濃縮された酵母細胞を5μlの1:10に希釈したEVAC調製物と混合した。酵母ーDNA混合物を氷冷した0.2-cm-ギャップの使い捨てのエレクトロポレーションキュベットに移し、そして1.5 kV, 25 F, 200Ωでパルスにかけた。1mlの氷冷した1Mソルビトールをキュベットに添加し、そして酵母を回収する。アリコートを1Mソルビトールを含む選択的プレート上に広げる。コロニーが出現するまで30℃でインキュベートする。
本実施例において、レア制限酵素をそれらの認識配列及び開裂点と一緒に列記する。(^)は開裂点の5'-3'配列を示し、そして(_)は相補配列の開裂点を示す。
W=A又はT ; N=A, C, G, 又はT
6a) 独特なパリンドロームのオーバーハング
使用した材料:
pYAC4 (Sigma. Burke et al. 1987, science, vol 236, p 806) をEcoR1及びBamH1で消化し、そして脱リン酸化したpSE420 (invitrogen)を、EcoR1を用いて直鎖化し、そしてコンカテマー化のためのモデルフラグメントとして使用した。
T4 DNA リガーゼ(Amersham-pharmacia biotech)を、取扱説明書に従い、ライゲーションに使用した。
YAC12内への発現カセットの組込みは、本質的にSears D. D., Hieter P., Simchen G., Genetics, 1994,138,1055-1065にて行われたように行った。
YAC12を含む酵母菌株(Sears D. D., Hieter P., Simchen G., Genetics, 1994, 138, 1055-1065) は、実施例4aに記載のプロトコールに従い、EVACで形質転換した。形質転換細胞は、YAC12及びEVACの両方を含む細胞を選択するプレート上にプレーティングされた。
クローンを滅菌した楊枝でピッキングし、そして4つの抑制され、そして/あるいは誘導された条件(-Ura/-Trp,-Ura/Trp/-Met,-Ura/-Trp/+200μM Cu2SO4,-Ura/-Trp/-MeV+200μM Cu2S04)に相当するプレート上に逐次ストリーキングした。20 mgのアデニンを、オーカーの表現型を抑制するために培地に加えた。
Claims (43)
- 5’→3’方向に、一般式
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
のヌクレオチド配列のカセットを含んで成り、
rs1とrs2は共に開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能するプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧10であり、そして
少なくとも第一カセットは第二カセットと異なる、
ヌクレオチドコンカテマー。 - ヌクレオチド配列がcDNA、ゲノムDNAから成る群から選択されるDNA配列を含んで成る、請求項1に記載のコンカテマー。
- 少なくとも2つのカセットのrs 1 -rs 2 制限部位が、同一の制限酵素によって認識される、請求項1又は2に記載のコンカテマー。
- 少なくとも1つのカセットがプロモーターと発現可能なヌクレオチド配列との間にイントロンを含んで成る、請求項1〜3のいずれか1項に記載のコンカテマー。
- 少なくとも1つのカセットが一次ベクター由来のカセットを含んで成る、請求項1〜4のいずれか1項に記載のコンカテマー。
- 人工染色体内に含まれる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のコンカテマー。
- 人工染色体が、酵母人工染色体、メガ酵母染色体、細菌人工染色体、マウス人工染色体、哺乳類人工染色体、昆虫人工染色体、鳥類人工染色体、バクテリオファージ人工染色体、バキュロウイルス人工染色体、又はヒト人工染色体から成る群から選択される、請求項6に記載のコンカテマー。
- 異なる発現可能なヌクレオチド配列が、少なくとも2つの異なる組織を表す異なる発現状態に由来する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のコンカテマー。
- 異なる発現可能なヌクレオチド配列が、少なくとも2つの種を表す異なる発現状態に由来する、請求項8に記載のコンカテマー。
- コンカテマー化の方法であって、各カセットが第一の粘着末端、スペーサー配列、プロモーター、発現可能なヌクレオチド配列、ターミネーター、スペーサー配列及び第二の粘着末端を含んで成る、ヌクレオチド配列の少なくとも2つのカセットをコンカテマー化する段階を含んで成り、
一次ベクター[RS1-RS2-SP-PR-X-TR-SP-RS2'-RS1']
から出発し、
ここで、Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRはプロモーターを表し、
TRはターミネーターを表す、
i) RS2及びRS2'に特異的な少なくとも1つの制限酵素の力を借りて一次ベクターを切断し、一般式[rs 2 -SP-PR-X-TR-SP-rs 1 ] を有するカセットを獲得し、ここで、rs 1 及びrs 2 は一緒に、開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位RS2又はRS2'を表す、
ii) rs 1 とrs 2 との間の相互作用を介して、切り出されたカセットを構築すること、
を更に含んで成る、方法。 - 一方の末端にRS2又はRS2'を、そして他方の末端に非相補的なオーバーハング又は平滑末端をそれぞれが有するベクターアームの添加を更に含んで成る、請求項10に記載の方法。
- 一方の末端にRS2又はRS2'を、そして他方の末端に非相補的なオーバーハング又は平滑末端をそれぞれが有するストッパーフラグメントの添加を更に含んで成る、請求項10に記載の方法。
- ベクターアームをストッパーフラグメントにライゲーションすることを更に含んで成る、請求項12に記載の方法。
- 更に、
iv)発現状態からmRNAを単離し、
v)当該mRNA配列に相当する完全長のcDNAを獲得し、
vi)一次ベクター内の、5’→3’方向の一般式:
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
のカセットのクローニング部位内に完全長のcDNAクローンを挿入すること、
を含んで成り、
ここで、CSはクローニング部位を表す、
請求項10に記載の方法。 - RS1とRS1'が同一であり、そしてRS2とRS2'が同一である、請求項10に記載の方法。
- コンカテマーが、酵母人工染色体、メガ酵母染色体、細菌人工染色体、マウス人工染色体、ヒト人工染色体から成る群から選択される人工染色体内にライゲーションされる、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つのカセット内のRS2及びRS2'が1つの制限酵素によって開裂する、請求項10〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 各コンカテマーが5’→3’方向に以下の式:
[rs 2 -SP-PR-X-TR-SP-rs 1 ] n
のオリゴヌクレオチドを含んで成り、
ここで、rs 1 とrs 2 は共に開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能するプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧10であり、そして
少なくとも2つの発現可能なヌクレオチド配列が異なる発現状態に由来する、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも1つのコンカテマーを含んで成る細胞。 - 各コンカテマーが5’→3’方向に以下の式:
[rs 2 -SP-PR-X-TR-SP-rs 1 ] n
のオリゴヌクレオチドを含んで成り、
ここで、rs 1 とrs 2 は共に開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能するプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧10であり、そして
少なくとも2つのカセットのrs 1 -rs 2 が同一の制限酵素によって認識される、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも1つのコンカテマーを含んで成る細胞。 - 全てのrs 1 -rs 2 配列が同一の制限酵素によって認識される、請求項18又は19に記載の細胞。
- パン酵母, クルイベロマイセス・マリキシャヌス(Kluyveromyces marxianus), K.ラクチス(K. lactis), カンジダ・ウチリス(Candida utilis), ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma), サッカロマイセス・ボウラジイ(Saccharomyces boulardii), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・パラフィニカ(Candida paraffinica), シュワニオマイセス・カステリイ(Schwanniomyces castellii), ピキア・スチピチス(Pichia stipitis), カンジダ・シェハタエ(Candida shehatae), ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis), リポマイセス・リポフェル(Lipomyces lipofer), クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcos curvatus), カンジダ種(Candida spp), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii), カンジダ属(Candida), ロドトルラ種(Rhodotorula spp), サッカロマイセス種(Saccharomycopsis spp)., アウレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans), カンジダ・ブルンプチイ(Candida brumptii), カンジダ・ハイドロカーボフマリカ(Candida hydrocarbofumarica), トルロプシス属(Torulopsis), カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis), サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae), ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra), カンジダ・フラベリ(Candida flaveri), エレモテシウム・アシュビイ(Eremothecium ashbyii), ピキア種(Pichia spp.), クルイベロマイセス属(Kluyveromyces), ハンセヌラ属(Hansenula), クロエケラ属(Kloeckera), ピキア属(Pichia), パチソレン種(Pachysolen spp.), 又はトルロプシス・ボンビコラ(Torulopsis bombicola)を含んで成る群から選択される酵母細胞である、請求項18又は19に記載の細胞。
- 少なくとも1つのコンカテマーが、請求項1〜7のいずれか1項に記載のコンカテマーである、請求項18〜21のいずれか1項に記載の細胞。
- 少なくとも1つのヌクレオチドコンカテマーを含んで成る人工染色体であって、当該コンカテマーが、
5’→3’方向に、一般式
[rs 2 -SP-PR-X-TR-SP-rs 1 ] n
のヌクレオチド配列カセットを含んで成り、
ここで、
rs 1 とrs 2 は共に開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能するプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧10である、人工染色体。 - 前記コンカテマーが、請求項1〜7のいずれか1項に記載のコンカテマーである、請求項23に記載の人工染色体。
- 請求項23又は24に記載の少なくとも1つの人工染色体を含んで成る細胞。
- トランスジェニック細胞を産生するための方法であって、宿主細胞に、請求項1〜7のいずれか1項に記載のコンカテマーを挿入することを含んで成る方法。
- 5’→3’方向に、一般式
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
のヌクレオチド配列カセットを含んで成り、
ここで、
RS1及びRS1'は開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる、開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、そして
TRはターミネーターを表す、一次ベクター。 - ヌクレオチド配列がDNA配列である、請求項27に記載のベクター。
- プロモーターとクローニング部位との間及び/又はクローニング部位とターミネーターとの間にイントロン配列を更に含んで成る、請求項27又は28に記載のベクター。
- クローニング部位が発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る、請求項27〜29のいずれか1項に記載のベクター。
- RS2とRS2'が同一である、請求項27〜30のいずれか1項に記載のベクター。
- RS1とRS1'が同一である、請求項27〜31のいずれか1項に記載のベクター。
- TRとRS2'との間にスペーサー配列を更に含んで成る、請求項27〜32のいずれか1項に記載のベクター。
- プロモーターが外部から制御可能なプロモーターである、請求項27〜33のいずれか1項に記載のベクター。
- カセットを含んで成る一次ベクターが、高コピー数を有し、E.コリにおいて増殖することができ、そしてE.コリにおける維持のための選択マーカーを有するプラスミドベクターである、請求項27〜34のいずれか1項に記載のベクター。
- 一次ベクターを調製する方法であって、5’→3’方向に、一般式
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
のヌクレオチド配列を含んで成るカセットを含んで成る一次ベクターのクローニング部位内に発現可能なヌクレオチド配列を挿入すること、
を含んで成り、
ここで、
RS1及びRS1'は開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる、開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、
TRはターミネーターを表す、方法。 - 発現状態から全mRNAを単離し、そしてベクター内への挿入のために完全長のcDNAを獲得すること、を更に含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 完全長のcDNAを得るために、cDNAの選択を更に含んで成る、請求項37に記載の方法。
- 5’→3’方向に、一般式:
[RS1-RS2-SP-PR-X-TR-SP-RS2'-RS1']
のヌクレオチド配列のカセットをそれぞれが含んで成る少なくとも2つの一次ベクターを含んで成り、
ここで、
RS1及びRS1'は開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる、開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、
−ここで、当該発現可能なヌクレオチド配列は、1つの発現状態から単離され、そして
−少なくとも第一及び第二の一次ベクターが、前記第一及び第二の一次ベクター内の2つの異なるプロモーターの制御下で発現可能な同一のペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る、ヌクレオチドライブラリー。 - 宿主細胞が、細菌又は真菌を含んで成る群から選択される、請求項39に記載のライブラリー。
- 全てのベクターが同一のRS2及びRS2'配列を含んで成る、請求項39に記載のライブラリー。
- 請求項27〜35のいずれか1項に記載の少なくとも1つの一次ベクターを含んで成る、請求項39〜41のいずれか1項に記載のライブラリー。
- ヌクレオチドライブラリーを調製する方法であって、発現可能なヌクレオチド配列を獲得し、当該発現可能なヌクレオチド配列を、
一般式
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
のヌクレオチド配列を5’→3’方向に含んで成るカセットを含んで成る一次ベクター混合物のクローニング部位内にクローニングし、そして一次ベクターを宿主細胞内に伝達すること、
を含んで成り、
ここで、
RS1及びRS1'は開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる、開裂及び再構築の後に制限酵素で開裂して再構築することができる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも2つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、そして
TRはターミネーターを表す、方法。
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