EA005682B1 - Трансформированные грибы, в частности рода chrysosporium, способные к синтезу гетерологичных полипептидов - Google Patents

Трансформированные грибы, в частности рода chrysosporium, способные к синтезу гетерологичных полипептидов Download PDF

Info

Publication number
EA005682B1
EA005682B1 EA200100419A EA200100419A EA005682B1 EA 005682 B1 EA005682 B1 EA 005682B1 EA 200100419 A EA200100419 A EA 200100419A EA 200100419 A EA200100419 A EA 200100419A EA 005682 B1 EA005682 B1 EA 005682B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
strain
polypeptide
expression
protein
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA200100419A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200100419A1 (ru
Inventor
Марк Аарон Эмалфарб
Ричард Пол Берлингейм
Филип Терри Олсон
Аркадий Пантелеймонович Синицин
Мартин Парриш
Жан Кристоф Буссон
Кристин Мари Пиннонен
Питер Ян Пант
Корнелия Мария Йоханна Ван Зейл
Original Assignee
Марк Аарон Эмалфарб
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Марк Аарон Эмалфарб filed Critical Марк Аарон Эмалфарб
Publication of EA200100419A1 publication Critical patent/EA200100419A1/ru
Publication of EA005682B1 publication Critical patent/EA005682B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Radio Relay Systems (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Описана новая трансформационная система в области использования грибков-гифомицетов в качестве хозяев для экспрессии и секреции гетерологичных белков или полипептидов. Также настоящее изобретение охватывает способ получения больших количеств полипептида или белка в промышленном масштабе. Данная система включает трансформированный или трансфицированный грибковый штамм рода Chrysosporium, более конкретно Chrysosporium lucknowense, и производные от него мутанты. Также оно охватывает трансформанты, включающие кодирующие последовательности Chrysosporium, а также регулирующие экспрессию последовательности генов Chrysosporium.

Description

Краткое содержание изобретения
Предмет настоящего изобретения относится к новой трансформационной системе в области грибовгифомицетов для экспрессии и секреции гетерологичных белков или полипептидов. Также настоящее изобретение охватывает способ выработки больших количеств полипептида в промышленном масштабе. Данная система включает трансформированный или трансфицированный грибковый штамм рода Сйгуюкротшш, более конкретно вида Сйтукокротшт 1искпо\тсп5с или его мутантов или производных. Также оно охватывает трансформантов, несущих кодирующие последовательности Сйтукокротшт. Заявлены новые мутантные штаммы Сйтукокротшт, а также получаемые от них новые ферменты.
Предпосылки изобретения
Ряд организмов-хозяев для экспрессии генов и способы трансформации были описаны в данной области техники ранее. Часто упоминаются бактерии, например, ЕксйепсШа сой. Однако, Е.сой - это микроорганизм, который не способен секретировать ряд белков или полипептидов, и поэтому он является нежелательной клеткой-хозяином с точки зрения выработки белка или полипептида в промышленном масштабе. Дополнительным недостатком Е.соН, который справедлив и для бактерий в целом, является то, что прокариотические организмы не могут обеспечивать дополнительные модификации, необходимые для большинства эукариотических белков или полипептидов, которые должны быть выработаны в активной форме. Гликозилирование белков и точная пространственная укладка белков - примеры процессинга, необходимого для обеспечения выработки активного белка или полипептида. Для обеспечения такого процессинга иногда можно использовать клетки млекопитающих: однако, недостатком таких клеток является то, что часто их трудно воспроизводить и для них нужны дорогостоящие культуральные среды. Следовательно, такие трансформационные системы непригодны для выработки белков или полипептидов в промышленном масштабе. Они могут быть рентабельны в случае получения очень дорогих фармацевтических соединений, требующихся в относительно небольшом количестве, но это не относится к ферментам, имеющим промышленное значение.
Был разработан ряд грибковых экспрессионных систем, например, АкретдШик шдет, АкретдШик а\\'атоп. АкретдШик шби1аи8, Тпсйобегта теекек То же предполагалось и для ряда других объектов, но по различным причинам они не были приняты или не нашли широкого применения. В целом, идеальный организм-хозяин должен удовлетворять большому числу критериев:
идеальный хозяин должен легко ферментироваться с использованием недорогих сред;
идеальный хозяин должен эффективно утилизировать питательную среду;
идеальный хозяин должен вырабатывать полипептид или белок с высоким выходом, т. е. должен проявлять высокое отношение количества белка к биомассе;
идеальный хозяин должен быть способным к эффективной секреции данного белка или полипептида;
идеальный хозяин должен обеспечивать простые выделение и очистку желательного белка или полипептида;
идеальный хозяин должен процессировать желательный белок или полипептид таким образом, чтобы он вырабатывался в активной форме и чтобы не требовалось дополнительных стадий активации или модификации;
идеальный хозяин должен легко подвергаться трансформации;
идеальный хозяин должен позволять использовать широкий круг элементов, регулирующих экспрессию, тем самым обеспечивая простоту применения и эксплуатационную гибкость;
идеальный хозяин должен позволять использовать простые селективные маркеры, использование которых недорого;
идеальный хозяин должен продуцировать стабильные трансформанты;
идеальный хозяин должен культивироваться в условиях, не являющихся вредными для экспрессируемого белка или полипептида, например, при низкой вязкости, низком сдвиговом усилии (при перемешивании).
Грибковые системы, которые еще не нашли широкого применения, описаны, например, в патенте США № 5578463 (Ветка е1 а1.), представляющем Ыеитокрога, Робокрога, Еибо!Ыа, Мисог, Сосйо1Ьо1и8 и Рупси1апа наряду с АкретдШик и Тпсйобегта. Однако, иллюстрации трансформации и экспрессии были представлены только для АкретдШик и Тпсйобегша и отсутствовали подробности в случае с любыми другими предусмотренными хозяевами.
Международная патентная заявка \¥О 96/02563 и патенты США №№ 5602004, 5604129 и 5695985, выданные Ыоуо НогбЕк, описывают недостатки систем АкретдШик и Тпсйобегша и предлагают условия культивирования для других грибков, которые могли бы быть более подходящими для крупномасштабной выработки белка. Единственными представленными примерами среди возможных трансформированных культур являются примеры штаммов МусейорЫйота 1йетшорЫ1а, Астетошит а1аЬатеи8е, ТЫе1ау1а 1еггеь(г18 и Брогобгсйит се11и1орЫ1ит. Штамм Брогобтсйит описан как лизирующий и вырабатывающий зеленый пигмент в таких условиях ферментации, которые не дают такого результата в случае с другими штаммами. Неспорулирующий мутант ТЫе1ау1а 1еггеь(г18 описан как организм выбора благодаря его морфологии. Однако при этом же подтверждается, что эффективность образования протопла
-1005682 стов ТЫе1ау1а и Асгетошит (где использованный штамм Асгетошит был представлен несовершенной стадией использованного штамма ТЫе1ау1а) низка и что гигромицин неприменим в качестве селективного маркера. Для большой группы других объектов также предположено потенциальное применение исходя из их морфологических параметров, однако их трансформация не описана. Предполагаемые штаммы относятся к родам Согуиаксик, Тйегтоаксик, СйаеЕотшт, СЕепотусек, 8суЕа11бшт и Та1аготусек. Трансформированные хозяева упоминались исключительно как вырабатывающие низкие уровни внесенной ксиланазы Ншшсокг причем наименьшее ее количество вырабатывалось в ТЫе1ау1а; однако, информация носит неясный характер и может скрывать то, что на самом деле лучшим оказался вариант с ТЫе1ау1а. Номенклатура этих ссылок основывается на наименованиях АТСС для промышленных грибков от 1994г. Таким образом, ясно, что не было достигнуто высокого уровня гетерологичной экспрессии и на самом деле нет положительной корреляции между выбираемой морфологией и уровнем экспрессии. Если какая-либо корреляция и может иметь место, то скорее всего отрицательная. В соответствии с классификацией грибков АТСС от 1996г. штамм 8рогоЕпсЫит ЕйегторйНит АТСС 20493 является штаммом Мусе1юрйЕйога ЕйегторйНа. В настоящее время этот штамм идентифицируется как МусейорйЕйога ЕйегторЫ1а. На основании этих недавних материалов видна непредсказуемость данной области техники.
Также была описана (АШкои еЕ а1., 1992, Сшт. Сене!.. 21, 225-229) трансформация Ниш1со1а дпкеа сорта ЕйегтоИеа с использованием литий-ацетатного метода и последовательность, кодирующая фермент Нит1со1а, однако, сообщений об экспрессии гетерологичного белка этим штаммом представлено не было.
В 1997 г. Нагеаи ВюЕесйио1оду Сгоир был выдан патент на трансформированный грибок Иеигокрога, предназначенный для экспрессии такого пептида млекопитающих, как химозин. Для трансформации ауксотрофных Иеигокрога сгакка использовали сферопласты. Были внесены эндогенные элементы регуляции транскрипции с осуществлением котрансформации. Ничего не говорится о других организмаххозяевах и других способах трансформации. Из имеющегося описания ничего нельзя сказать об уровне экспрессии. Сомнительно, чтобы уровень экспрессии был высоким, потому что иммунологические методы (применимые для выявления малых количеств белка) были единственными методами, использовавшимися для того, чтобы показать присутствие данного белка. Реального выделения белка заявлено не было.
Международная патентная заявка АО 97/26330 от Иоуо ИогФкк предлагает способ получения мутантов родительских клеток грибов-гифомицетов, обладающих улучшенным свойством вырабатывать гетерологичный полипептид. Этот способ включает вначале обнаружение специфически измененной морфологии с последующей оценкой того, вырабатывал ли трансформант больше гетерологичного полипептида по сравнению с его родительским штаммом. Данный способ проиллюстрирован только на штаммах Бикагшт А3/5 и АкрегдШик огухае. Предполагается, что данный способ применим для АкрегдШик, Тпсйобегта, ТЫе1ау1а, Бикагшт, Иеигокрога, Асгетошит, То1ур1осабшт, Ншшсокг 8суЕа11бшт, МусейоркЕкога или Мисог. Как отмечено выше, непредсказуемость данной области техники и также непредсказуемость способа процитированной заявки не дает принципиально применимой идеи для обоснованного достижения успеха.
Подробное описание изобретения
Теперь авторами изобретения будет описана альтернативная грибковая экспрессионная система, характеризующаяся упрощенным использованием по сравнению с упоминавшимися выше АкрегдйИ и Тпсйобегта, удовлетворяющая приведенным выше требованиям. Эта новая система не подразумевалась и не предполагалась в известной области техники. Эта новая система в соответствии с настоящим изобретением представляет дополнительные преимущества в том, что уровни трансформации выше тех, которые характерны для часто используемой системы Тпсйобегта геекек Кроме того, условия культивирования предоставляют дополнительный плюс, т.к. являются преимущественными для экспрессируемого полипептида. По мере обращения в данном описании и прилагающейся формуле изобретения к «полипептидам» или «представляющим интерес полипептидам», как продуктам экспрессионной системы по настоящему изобретению, этот термин также охватывает белки, т.е. полипептиды, обладающие конкретной функцией и/или вторичной, и/или третичной структурой.
Величина рН культуральной среды может быть нейтральной или щелочной, т. е. без агрессивного и потенциально инактивирующего воздействия кислого рН на выработанный белок или полипептид. Также возможным является культивирование и при кислых значениях рН, например, рН=4, в случаях, когда белок или полипептид больше подходит для кислой среды. Предпочтительно культуры могут иметь место при рН=4,0-10,0. Однако предпочтение отдается нейтральному-щелочному рН, поскольку штаммхозяин лучше растет при таких величинах рН, как, например, между 6 и 9. Рост при щелочных значениях может происходить при рН=8 и выше и даже при таком высоком значении, как рН=10, что также в некоторых случаях является хорошей альтернативой. Также температура культивирования таких штаммовхозяев обеспечивает преимущество некоторым типам вырабатываемых полипептидов с точки зрения их стабильности. Подходящей температурой культивирования является температура 25-43°С. Температура в диапазоне от 40°С и ниже до 23 или 30°С также имеет преимущество по ее применению. Ясно, что такие условия представляют особенный интерес для выработки полипептидов млекопитающих. Выбирае
-2005682 мая температура будет зависеть от рентабельности культивирования и чувствительности полипептида или культивируемого штамма. Эти условия будут определены специалистом в данной области техники в каждом конкретном случае без излишних экспериментов, что является обычным в данной области техники.
Также было установлено, что отношение биомассы к вязкости и количество выработанного белка является весьма предпочтительным для организма-хозяина по настоящему изобретению. Для проведения сравнений использовали Тпсйойегта 1опд1ЬгасЫа1ит (ранее известный также как Тпсйойегта гееке1) и АкрегдШик шдег. Тпсйойегта 1опд1ЬгасЫа1ит дал 2,5-5 г/л биомассы, АкрегдШик шдег - 5-10 г/л биомассы, а хозяин по настоящему изобретению - 0,5-1 г/л биомассы при соответствующих для него оптимизированных условиях. Таким образом, это означает 5-10-кратное улучшение по сравнению с используемыми промышленными штаммами. Эти промышленные штаммы являются штаммами, которые сами по себе рассматриваются в данной области техники как интенсивные продуценты белков и поэтому они успешно используются для промышленной выработки белков. Их культивируют при оптимальных для них условиях, разработанных и осуществляемых в масштабах крупных промышленных ферментационных установок. Те же штаммы были использованы для того, чтобы продемонстрировать огромное улучшение параметров вязкости для культур организма-хозяина по настоящему изобретению. В конце процесса ферментации Тпсйойегта 1опд1ЬгасЫа1ит дает значение динамической вязкости 200-600 сПз (сантипуаз), АкрегдШик шдег - величину 1500-2000 сПз, а хозяин по настоящему изобретению - величину менее 10 сПз. Таким образом, это дает по крайней мере 20-200-кратное улучшение значений вязкости по сравнению с использованными промышленными штаммами. Следующим весьма неожиданным аспектом явилось то, что уровни белка, определенные для клеток-хозяев по настоящему изобретению, оказались более высокими по сравнению с промышленными штаммами Акрегдйй и Тпсйойегта геекег даже при упоминавшихся выше неожиданно меньших уровнях биомассы и вязкости. Как итог, внедряется простота использования гибкой улучшенной трансформационной системы и экспрессионной системы с улучшенными условиями культивирования. Штаммы по настоящему изобретению вырабатывают неожиданно высокие уровни белка при этих улучшенных условиях, и, кроме того, они обеспечивают это за более короткое время ферментации.
Настоящее изобретение направлено на мутантные штаммы Сйгукокрогшт, включающие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный белок или полипептид, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты функционально соединена с регулирующим экспрессию сегментом и необязательно - с последовательностью, кодирующей секреторный сигнал, и/или с последовательностью, кодирующей белок-переносчик. Предпочтительно рекомбинантный штамм по настоящему изобретению должен секретировать представляющий интерес полипептид. Это позволит избежать необходимости разрушать клетку с целью выделения интересующего полипептида и также сведет к минимуму риск разрушения экспрессированного продукта другими компонентами клетки-хозяина.
Сйгукокрогшт может быть классифицирован по морфологии в соответствии с представленным у Батей & НшИег. 1972, Шик1га1ей Сепега оГ 1трегГес1 ЕцпдГ', 3й Ей., Вигдекк РиЬ1. Со. Известны и другие источники, описывающие подробности, касающиеся классификации грибков рода Сйгукокрогшт, например, классификация по Саттону (С.А.И. Уап Оогксйо! е! а1., 1980, А геуЩоп оГ Сйгукокрогшт апй а1йей депега. 1п 81ий1ек ш Мусо1оду, Ио. 20. СВ8, Ваат, №Шег1апйк, рр. 1-36). СВ8 - это одно из депозитарных учреждений, в соответствии с Будапештским договором. В соответствии с этими данными род Сйгукокрогшт входит в состав семейства МопШасеае, относящегося к отряду Нурйотусе1а1ек (гифомицеты). Критерии, которые могут быть учтены, таковы.
1. Признаки отряда Нурйотусе1а1ек.
Конидии образуются непосредственно на мицелии - на отдельных спороносных клетках или на обособленных конидиеносцах.
2. Признаки семейства МопШасеае.
Конидии и конидиеносцы (если они присутствуют) прозрачные или яркоокрашенные; конидиеносцы одиночные или образуют рыхлые пучки (коремии).
3. Признаки рода Сйгукокрогшт Согйа, 1833. Колонии обычно распластанные, белые, иногда кремовые, бледно-коричневые или желтые, бархатистые и/или порошковидные. Гифы почти всегда прозрачные, с гладкой поверхностью, с нерегулярным, более или менее ортотопическим ветвлением. Плодные гифы слабо дифференцированы или не дифференцированы вовсе. Конидии концевые и боковые, таллические, всегда расположенные на верхней стороне гиф, сидячие или расположенные на коротких ножках или боковых веточках, полупрозрачные или бледно-желтые, тонко- или толстостенные, почти шаровидные, булавовидные, грушевидные, обратнояйцевидные, одноклеточные, редко двуклеточные, усеченные. Иногда присутствующие интеркалярные конидии одиночные, в редких случаях образующие цепочки, полупрозрачные или бледно-желтые, шире нижележащей гифы, обычно одноклеточные, усеченные по обоим концам. Иногда присутствуют хламидоспоры.
Другим источником, представляющим информацию по номенклатуре грибков, является АТСС (США). Сайт в Интернете этой коллекции - Й11р://ет^ет.а1сс.огд. СВ8 также имеет свой сайт в Интернете (Ь11р://^ет^.сЬк.кпает.п1), представляющий соответствующую информацию. Подходящим источником
-3005682 такой информации является коллекция УКМ в Москве: ее адрес в Интернете 11ир://\у\у\у.ЬбЮгд.Ьг.Ьб1ткбпл'кт/депега1. Другим источником является адрес 1И1р:/^Т.агкдпп.доу/Гипда1ба1аЬакек. Все эти источники могут предоставить информацию по диагностическим признакам СНгукокрогшт.
Штаммы, определяемые как Мусе1юр1111тога 111сгтор1и1а. не рассматриваются как определяющие штаммы СНгукокрогшт в соответствии с определяемым в настоящем изобретении. В последнее время имелись существенные разногласия в номенклатуре некоторых штаммов Мусе1юрй1йога. Предпочтительными СНгукокрогшт по настоящему изобретению являются те штаммы, которые четко определяются и не могут быть перепутаны с МусейорЫйога, 8рого1пс1шт или РНапегосНае1е СНгукокрогшт.
Следующие штаммы определяются как представляющие СНгукокрогшт, хотя определение СНгукокрогшш не ограничивается этими штаммами: С.Ьо1гуо1бек, С.сатисНаеПг С.сгаккйишса1ит, С.еигорае, С.еуо1сеапиш, С.Гапшсо1а, С.Гакббшт, С.ГШГогте, С.деогщае. С.ДоЫГегит. С.д1оЫГегшп уаг. агйси1а1ит, С.д1оЫГегшп уаг. шуеит, С.Ыгипбо, С.Ыкрашсит, С.1ю1ти. С.тбкит, Сторк, С.кегабиорЫ1ит, С.кгекеШ, С.киζи^оν^аиит, С.Ц^погит, С.1оЬа1ит, Окс^оуете, С.1искпо\уепке Сагд 27К, С.тебшт, С.тебшт уаг. крткексепк, С.терЫНсит, С.тегбапит, С.тегбагшт уаг. гокеит, С.тшог, С.раптсок-г С.рагуит, С.рагуит уаг. сгексепк, С.рйокит, С.ркеиботегбапит, С.руг1£огт1к, С.^иееиκ1аиб^сит, С.к1ц1егС С.ки1Гигеит, С.^упсНгопит, Сбгоркит, С.ииби1аΐит, 0^11^1^11^1^ С.уекрегййит, С.хопаШт.
С.1искиоуеике является одним из видов СНгукокрогшт, которые привлекали конкретное внимание потому, что он представляет собой естественный интенсивный продуцент целлюлазных белков (νθ 98/15633 и связанный патент США 5811381). Характеристики Сбиеклоуепзе таковы:
Колонии за 14 дней достигают 55 мм в диаметре при росте на агаре с глюкозой ЗаЬоигаиб, окрашены в кремовый цвет, пушистые и бархатистые; плотные, 3-5 мм в высоту; края четкие, правильной формы и бахромчатые; обратная сторона от бледно-желтой до кремовой. Гифы прозрачные, гладко- и тонкостенные, слабо ветвящиеся. Большинство воздушных гиф плодущие и имеют часто расположенные перегородки, шириной примерно 1-3,5 мм. Погруженные гифы бесплодны, примерно 1-4,5 мм в ширину, а более тонкие гифы обычно бывают закрученными. Конидии концевые и боковые, в основном сидячие или на коротких, часто на конических ножках или коротких боковых веточках. Конидии одиночные, но расположены плотно друг к другу, на 1 клетке гифы развивается по 1-4 конидии - полупрозрачные, отчетливо тонко- и гладкостенные, в основном почти шарообразные, также булавовидные и обратно яйцевидные, 1-клеточные, 2,5х11х1,5-6 мм, с широкими базальными рубцами (1-2 мм). Интеркалярные конидии отсутствуют. Хламидоспоры отсутствуют. Примерами штаммов СНгукокрогшт 1искиоуеи8е являются АТСС 44006, СВ8 251.72, СВ8 143.77 и СВ8 272.77, а другие примеры представлены в νθ 98/15633 и в патенте США № 5811381.
У этого вида был выделен еще один штамм, характеризующийся даже более высокой способностью вырабатывать целлюлазы. Этот штамм обозначен С1 в соответствии с собственной индексацией и был депонирован в Международный депозитарий Всероссийской коллекции микроорганизмов Российской Академии наук по адресу: Россия 113184, Москва, ул. Бахрушина, 8, - 29 августа 1996г. в соответствии с Будапештским договором под депозитарным № УКМ Γ-3500Ό. Он называется СНгукокрогшт 1искпоуеп8е Сагд 27К. Характеристики штамма С1 таковы.
Примерно за 7 дней колонии вырастают на картофельно-декстрозном агаре до примерно 55-66 мм в диаметре; окрашены в беловато-кремовый цвет, пушистые, в центре высотой 2-3 мм; края четкие, правильной формы, бахромчатые; обратная сторона бледно-кремовая. Гифы прозрачные, гладко- и тонкостенные, слабо ветвящиеся. Воздушные гифы - плодущие, с перегородками, шириной 2-3 мм. Погруженные гифы бесплодные. Конидии концевые и боковые; сидячие или находящиеся на коротких боковых веточках; отсутствуют; одиночные, но расположены близко друг от друга, прозрачные, тонко- и гладкостенные, почти шаровидные, булавовидные или обратнояйцевидные, 1-клеточные, 4-10 мм. Хламидоспоры отсутствуют. Интеркалярные конидии отсутствуют.
Способ выделения штамма С1 описан в νθ 98/15633 и в патенте США № 5811381. Штаммы, характеризующиеся такой морфологией, включены в определение СНгукокрогшт в соответствии с настоящим изобретением. Также в диапазон определения СНгукокрогшт включаются штаммы, производные от предшественников СНгукокрогшт, включая те, которые были мутированы так или иначе либо нативным путем, либо с помощью индуцированного мутагенеза. В частности, настоящее изобретение охватывает мутанты СЬукокрогшш, полученные с помощью индуцированного мутагенеза, например, путем сочетания облучения и химического мутагенеза.
Например, штамм С1 был мутирован путем воздействия на него ультрафиолета с образованием штамма ИУ13-6. Этот штамм был после этого мутирован действием №метил-№-нитро-№ нитрозогуанидина с получением штамма NС7С-19. Последний штамм, в свою очередь, подвергали мутированию действием ультрафиолета с получением штамма ИУ18-25. В ходе этого мутационного процесса морфологические признаки в некоторой степени варьировались как в жидкой культуре и на чашках, так и при анализе под микроскопом. На каждом последующем этапе мутагенеза культуры проявляли менее пушистый и бархатистый вид на чашках по сравнению с тем, что было описано в характеристике СНгукокрогшш, вплоть до получения плоских и матовых колоний. Также у мутантных штаммов в меньшей сте
-4005682 пени выражен коричневый пигмент, выявляемый в некоторых средах у штамма дикого типа. В жидкой культуре мутант ИУ18-25 заметно менее вязок по сравнению с диким типом С1 и мутантами ИУ13-6 и N070-19. Хотя все штаммы сохраняют основные микроскопические характеристики Сйгузозрогшт, мицелий становится все уже по мере последовательного мутирования, и у штамма ИУ18-25 можно наблюдать отчетливую фрагментацию мицелия. По-видимому, эта фрагментация мицелия обусловлена меньшей вязкостью, характерной для культур ИУ18-25. Способность штаммов к споруляцими снижается с каждым этапом мутирования. Вышесказанное иллюстрирует то, что для штаммов, принадлежащих к роду Сйгузозрогшт, характерно некоторое отклонение от описанных выше морфологических критериев. Помимо этого на каждом этапе мутирования выработка целлюлазы и внеклеточных белков также увеличивается, хотя некоторые мутации обусловливают снижение экспрессии протеаз. Критерии, на основании которых может быть определена таксономия грибков, доступны, например, от СВ8, УКМР и АТСС.
В частности, анаморф Сйгузозрогшт, как было обнаружено, пригоден для использования в выработке по настоящему изобретению. Метаболизм у анаморфа делает его исключительно подходящим для высокоинтенсивной экспрессии. Телеоморф также должен быть пригоден потому, что генетические основы анаморфов и телеоморфов идентичны. Различие между анаморфом и телеоморфом состоит в том, что один из них представляет бесполый тип, а другой - половой тип. Эти два типа в некоторых условиях характеризуются неодинаковой морфологией.
Предпочтительно использовать нетоксичные штаммы Сйгузозрогшт, значительное число которых известно в данной области техники, потому что они будут снижать опасность для окружающей среды в случае крупномасштабной выработки и будут упрощать процедуры выработки при соответствующем снижении себестоимости.
Регулирующим экспрессию участком является последовательность ДНК, распознаваемая в связи с экспрессией штаммом-хозяином Сйгузозрогшт. Он включает промоторную последовательность, функционально соединенную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей предназначенный для экспрессии полипептид. Промотор присоединен таким образом, чтобы расположенный вслед за ним инициирующий кодон в последовательности, предназначенной для экспрессии, обеспечивал экспрессию. Промоторная последовательность может быть конститутивной или индуцибельной. Рассматривается любая регулирующая экспрессию последовательность или их сочетание, способные обеспечивать экспрессию полипептида в штамме Сйгузозролит. Предпочтительно регулирующая экспрессию последовательность является грибковым регулирующим экспрессию участком, например, регуляторным участком аскомицета. Подходящим грибковым регулирующим экспрессию участком является участок от любого из следующих родов грибков: АзрегдШиз, Тлсйобегта, Сйгузозролит, Наи8епи1а, Мисог, Р1сЫа, №игозрога, То1урос1абшт, КЫхотисог, Ризалит, РешсШшт, Бассйаготусез, То1аготусез или их альтернативные половые типы, такие как Етепсе11а, Нуросгеа, например, промотор целлобиогидролазы Тпсйобегта, промотор глюкоамилазы АзрегдШиз, промотор глицеральдегидфосфатдегидрогеназы АзрегдШиз, промотор алкогольдегидрогеназы-А и алкоголь-дегидрогеназы-Р АзрегдШиз, промотор амилазы ТАКА АзрегдШиз, промоторы факторов контроля фосфоглицератных и связанных метаболических путей №игозрога, промотор аспартопротеазы РЫхотисог 1ше11ег промотор липазы РЫхотисог 1ше11е1 и промотор βгалактозидазы РешсШшт сапезсепз. Наиболее подходящей является регулирующая экспрессию последовательность от представителя того же рода, что и штамм-хозяин, поскольку в этом случае наиболее вероятно удастся направленно приспособить его к конкретному хозяину. Таким образом, предпочтительная регулирующая экспрессию последовательность происходит от штамма Сйгузозрогшт.
Авторы изобретения обнаружили конкретные штаммы Сйгузозрогшт, экспрессирующие белки в очень высоких количествах, и конкретный интерес представляют естественные регулирующие экспрессию последовательности от этих штаммов. Эти штаммы согласно собственной номенклатуре обозначены как штамм С1, штамм ИУ13-6, штамм N070-19 и штамм ИУ18-25 Сйгузозрогшт. Они были депонированы в соответствии с Будапештским договором в депозитарий Всероссийской коллекции (УКМ) в Москве. Штамм дикого типа С1 был депонирован в соответствии с Будапештским договором под номером УКМ Р-3500 Ό, дата депонирования - 29 августа 1996 г., мутант С1 ИУ13-6 был депонирован под номером УКМ Р-3632 Ό, дата депонирования - 2 сентября 1998 г., мутант С1 Ν07€’-19 был депонирован под номером УКМ Р-3633 Ό, дата депонирования - 2 сентября 1998 г., а мутант С1 ИУ18-25 был депонирован под номером УКМ Р-3631 Ό, дата депонирования - 2 сентября 1998 г.
Предпочтительно используется регулирующий экспрессию участок, обеспечивающий интенсивную экспрессию в выбранном хозяине. Также им может быть регулирующий интенсивную экспрессию участок, производный от гетерологичного хозяина, такого как те, которые хорошо известны в данной области техники. Конкретными примерами белков, для которых известна экспрессируемость в больших количествах и которые поэтому предоставляют подходящие регулирующие экспрессию последовательности по настоящему изобретению, являются, тем самым не ограничиваясь, гидрофобии, протеаза, амилаза, ксиланаза, пектиназа, эстераза, β-галактозидаза, целлюлаза (например, эндоглюканаза, целлобиогидролаза) и полигалактуроназа. Интенсивная выработка была установлена в условиях и твердофазной, и глубинной ферментации. Тесты на оценку присутствия или выработки таких белков хорошо известны в
-5005682 данной области техники. Многочисленные примеры можно найти, например, в каталогах 81дта и Медахуте. Фирма Медахуте находится в Ирландии: Вгау Ви81пе88 Рагк, Вгау, СошНу \νίο1<1ο\ν. У фирмы 81дта А1бпс11 имеется много филиалов в различных странах мира, например, в США: Р.О.Вох 14508, 81.Ьош8, МО. Для целлюлазы авторы использовали доступные из коммерческих источников тесты, такие как тесты С'.'МСахе, эндовискометрические тесты, тесты с авицелазой, β-глюканазные тесты, тесты КВВСМСазе, тесты Се11ахуте-С. Альтернативные тесты хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть найдены в научной литературе, касающейся данного объекта, и такая информация включена здесь для сведения в виде библиографических ссылок. В качестве примера авторы ссылаются на журнал Ме11юбх ΐη Епхуто1оду от 1-го тома (1955) до томов 297-299, вышедших в 1998 г. Предпочтительно используется промоторная последовательность СНгухохропит с целью обеспечения хорошего распознавания ее организмом-хозяином.
Авторы изобретения обнаружили, что гетерологичные регулирующие экспрессию последовательности работают в СНгухохропит столь же эффективно, как и нативные последовательности СНгухохропит. Это позволяет использовать хорошо известные конструкции и векторы для трансформации Сйтузозропит, равно как и предоставляет многочисленные иные возможности для конструирования векторов, обеспечивающих хорошие уровни экспрессии в данном новом экспрессирующем и секретирующем хозяине. Например, стандартные способы трансформации АхрегдШих могут быть использованы в соответствии с описанным, например, у СНпхбапхеп е! а1., 1988, ВюТесНпоС 6, 1419-1422. Другие документы, в которых имеются подробности о векторах для трансформации АзрегдШиз, например, патенты США №№ 4816405, 5198345, 5503991, 5364770 и 5578463, ЕР-В-215594 (также для Тпсйобегта), и их содержание включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок. Поскольку для штаммов СНгухохропит были установлены исключительно высокие уровни экспрессии целлюлазы, то конкретно предпочтительными являются регулирующие экспрессию участки таких белков. В качестве конкретных примеров авторы ссылаются на ранее упоминавшиеся депонированные штаммы СНгухохропит.
Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая участок, регулирующий экспрессию нуклеиновой кислоты, из Сйтузовротшт, предпочтительно из СНгухохрогшт 1искпотепзе или его производного, образует отдельный вариант настоящего изобретения, как это имеет место в мутантном штамме СНгухохропит, у которого он функционально присоединен к полипептиду, который должен быть экспрессирован. Предпочтительно такая конструкция нуклеиновой кислоты будет являться регулирующим экспрессию участком из Сйтузозропит, связанным с экспрессией целлюлазы или ксиланазы, предпочтительно с экспрессией целлобиогидролазы, более конкретно с экспрессией целлобиогидролазы 55 кД. В качестве примера рассматриваются промоторные последовательности эндоглюканазы 25 кД (С1-ЕС5) и эндоглюканазы 43 кД (С1-ЕС6) Сйтузовротшт, причем молекулярные массы определяют по данным электрофореза в ДСН-ПААГ (по параметрам аминокислотных последовательностей молекулярные массы составили 21,9 кД и 39,5 кД). Таким образом, промоторные последовательности гидрофобина, протеазы, амилазы, ксиланазы, эстеразы, пектиназы, β-галактозидазы, целлюлазы (например, эндоглюканазы, целлобиогидролазы) и полигалактуроназы рассматриваются как также попадающие в объем настоящего изобретения. Подходящим образом могут быть использованы любые промоторные или регуляторные участки экспрессируемых ферментов, описанных в табл. А или В. Последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению подходящим образом может быть получена от штамма СНгухохропит в соответствии с настоящим изобретением, причем такой штамм определен в другой части данного описания. Способы, с помощью которых могут быть определены промоторные последовательности, многочисленны и хорошо известны в данной области техники. На такую последовательность будут указывать эксперименты по нуклеазному удалению участка, находящегося перед кодоном АТС в начале анализируемого гена. Также, например, к нахождению представляющего интерес гена может привести анализ консенсусных последовательностей. С применением методов гибридизации и амплификации специалист в данной области техники легко сможет достичь соответствующих промоторных последовательностей.
Промоторные последовательности эндоглюканаз С1 были идентифицированы таким путем с помощью клонирования соответствующих генов и приведены в 8Е0 Ш N0 2 (ЕС5) и 1 (ЕС6), соответственно. Другими предпочтительными промоторами в соответствии с настоящим изобретением являются промотор целлобиогидролазы 55 кД (СВН1) и промотор ксиланазы 30 кД (Ху1Е), поскольку эти ферменты экспрессируются на высоком уровне под контролем их собственных промоторов. Соответствующие промоторные последовательности могут быть идентифицированы напрямую путем клонирования в соответствии с описанным ниже для промоторов эндоглюканазы с использованием информации о частичных последовательностях, приведенных в 8Е0 Ш N0 4 (для СВН1) и 8Е0 Ш N0 5 (для Ху1Е), соответственно. Промоторы ферментов Сйтузовротшт, разрушающих углеводы, особенно промоторы С1, могут иметь преимущество в использовании для экспрессии желательных полипептидов в организме-хозяине, особенно в грибке или ином микробном организме-хозяине. Частью настоящего изобретения являются промоторные последовательности, характеризующиеся идентичностью нуклеотидных последовательностей по крайней мере на 60%, предпочтительно по крайней мере 70%, наиболее предпочтительно по крайней
-6005682 мере 80% по отношению к последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ N0 1 и 2 или последовательностям, обнаруживаемым в других генах Сйгузозрогшт.
В качестве вариантов рекомбинантного штамма и последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению авторы также ссылаются на примеры. Также авторы изобретения ссылаются на рекомбинантные штаммы в известной области техники, описывающей обеспечивающие интенсивную экспрессию промоторные последовательности, в частности, те, которые обеспечивают интенсивную экспрессию в грибках, например, такие, которые заявлены для АзрегдШиз и ТпеНобегта. В известной области техники представлен ряд регулирующих экспрессию участков для использования в АзрегдШиз, например, в патенте США № 5252726, Νονο, и в патенте США № 5705358, ипПегег. Содержание таких документов из известной области техники включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок.
Ген гидрофобина является грибковым геном, характеризующимся интенсивной экспрессией. Так, предполагается, что промоторная последовательность гена гидрофобина, предпочтительно от Сйгузозрогшт, может быть подходящим образом использована в качестве регулирующей экспрессию последовательности в предпочтительном варианте настоящего изобретения. Последовательности генов гидрофобина Тпейобегта гее8е1 и ТпеНобегта йагаапит были описаны, например, в известной области техники, равно как и последовательность гена АзрегдШиз ГитщаШз и АзрегдШиз шби1апв, и соответствующая информация о последовательностях включена здесь в виде библиографических ссылок (Мнпох е! а1., 1997, Сигг. Сепе!., 32 [3], 225-230; Т. Ν%ιπ-%Ί;ι1;ι е! а1., 1996, Еиг. 1. Вюейет., 235 [1-2], 248-255; М. Райа е! а1., 1994, 1пГее!. 1ттипо1., 62 [10], 4389-4395; М.А. §!гтдег е! а1., 1995, Мо1. М1егоЫо1., 16 [1], 33-44). С использованием информации по этим последовательностям специалист в данной области может получить регулирующие экспрессию последовательности генов гидрофобина СНгузозрогшт без дополнительных экспериментов с помощью стандартных методов, которые уже упоминались выше. Рекомбинантный штамм СНгузозрогшт по настоящему изобретению может включать участок регуляции гидрофобина, функционально присоединенный к последовательности, кодирующей интересующий полипептид.
Регулирующая экспрессию последовательность также может включать дополнительно энхансер или силенсер. Они также хорошо известны в данной области техники и обычно располагаются на некотором расстоянии от промотора. Регулирующие экспрессию последовательности также могут включать промоторы с сайтами связывания активаторов и сайтов связывания репрессоров. В некоторых случаях такие сайты также могут быть модифицированы с целью удаления такого типа регуляции. Были описаны промоторы грибков-гифомицетов, в составе которых имеются сайты сгеА. Такие сайты сгеА могут быть мутированы с целью исключения глюкозной репрессии, которая в норме обусловливается присутствием немутированных сайтов. Этот принцип проиллюстрирован в \У0 94/13820 от С18!-Вгоеабе8. Использование такого промотора обеспечивает выработку полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, регулируемой данным промотором в присутствии глюкозы. Тот же принцип также ясен из международной патентной заявки \У0 97/09438. Данные промоторы могут быть использованы либо с сайтами сгеА, либо без них. Мутанты, у которых были мутированы сайты сгеА, могут быть использованы в качестве регулирующих экспрессию последовательностей в рекомбинантных штаммах по настоящему изобретению, а последовательность нуклеиновой кислоты, которую они регулируют, может быть затем экспрессирована в присутствии глюкозы. Такие промоторы СНгузозрогшт обеспечивают дерепрессию аналогично тому, что показано в международной патентной заявке \¥0 97/09438. В данной области техники известна идентичность сайтов сгеА. С другой стороны, возможным является использование промотора с сайтами связывания СгеА, которые не были подвергнуты мутированию, в штамме-хозяине, несущем мутацию где-либо еще в составе репрессибельной системы, например в самом гене сгеА, таким образом, что этот штамм способен, несмотря на присутствие сайтов связывания сгеА, вырабатывать белок или полипептид в присутствии глюкозы.
Терминаторные последовательности также являются регулирующими экспрессию последовательностями, и они функционально присоединены к 3'-концу последовательности, которая должна быть экспрессирована. По-видимому, любой грибковый терминатор может быть функциональным в штаммехозяине СНгузозрогшт по настоящему изобретению. Примерами являются терминатор 1грС А.шби1апз (1), терминатор α-глюкозидазы А.шдег (2), терминатор глюкоамилазы А.шдег (3), терминатор карбоксипротеазы Мисог 1ше11е1 (патент США № 5578463) и терминатор целлобиогидролазы ТпеНобегта геезег В естественных условиях терминаторные последовательности СНгузозрогшт будут функционировать в СНгузозрогшт и они являются подходящими, например, терминатор ЕС6.
Подходящий рекомбинантный штамм СНгузозрогшт по настоящему изобретению несет предназначенную для экспрессии последовательность нуклеиновой кислоты, функционально соединенную с последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, определяемую как сигнальная последовательность. Сигнальная последовательность - это аминокислотная последовательность, которая, в случае функционального соединения с аминокислотной последовательностью экспрессированного полипептида, позволяет ей секретироваться из грибка-хозяина. Такая сигнальная последовательность может быть нативно ассоциированной с гетерологичным полипептидом или может являться нативной для данного хозяина. Также она может быть чужеродной и для хозяина, и для полипептида. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальную последовательность, должна располагаться в пре
-7005682 делах общей рамки считывания, чтобы была обеспечена трансляция сигнальной последовательности и гетерологичного полипептида. Рассматривается любая сигнальная последовательность, способная обеспечивать секрецию полипептида из штамма Сйгузозрогшш. Предпочтительно такая сигнальная последовательность является грибковой сигнальной последовательностью, предпочтительно сигнальной последовательностью аскомицета.
Подходящими примерами сигнальных последовательностей могут быть производные дрожжей в целом или любых из следующих конкретных родов грибков: АзрегдШиз, Тпсйобсгша. Сйгузозрогшш, Р1сЫа, №игозрога, РЫхотисог. Нап8епи1а, Нит1со1а, Мисог, То1урос1абшт, Ризалит, РешсШшт, 8ассйаготусез, Та1аготусез или их альтернативные половые типы, подобные Етепсе11а, Нуросгеа. В частности, применимыми часто являются сигнальные последовательности, которые естественным образом связаны со следующими белками - целлобиогидролазой, эндоглюканазой, β-галактозидазой, ксиланазой, пектиназой, эстеразой, гидрофобином, протеазой или амилазой. Примерами являются амилаза или глюкоамилаза АзрегдШиз или Нцтюо1а (4), ТАКА-амилаза АзрегдШиз огухае, α-амилаза АзрегдШиз шдег, карбоксипептидаза Мисог (патент США № 5578463), липаза или протеиназа РЫхотисог 1ше11ег целлобиогидролаза Тпсйобегта (5), β-галактозидаза РешсШшш сапезсепз и α-фактор полового типа дрожжей 8ассйагошусез.
Как альтернатива, сигнальная последовательность может происходить от гена амилазы или субтилизина штамма ВасШиз. Сигнальная последовательность от того же рода, к которому относится конкретный штамм-хозяин, является наиболее подходящей потому, что она с наибольшей вероятностью специфическим образом приспособится к конкретному хозяину: следовательно, предпочтительной сигнальной последовательность является сигнальная последовательность Сйгузозрогшш. Авторами изобретения были обнаружены отдельные штаммы Сйгузозрогшш, выделяющие белки в очень высоких количествах, поэтому нативные сигнальные последовательности из таких штаммов представляют конкретный интерес. Согласно собственной номенклатуре эти штаммы обозначаются как штамм С1, штамм ИУ13-6, штамм N070-19 и штамм ИУ18-25 Сйгузозрогшш. Они были депонированы в соответствии с Будапештским договором, что описано в другой части настоящей заявки. Применимы сигнальные последовательности от грибков-гифомицетов, дрожжей и бактерий. Также рассматриваются как применимые сигнальные последовательности негрибкового происхождения, в частности, бактериальные, растительные и от млекопитающих.
Рекомбинантный штамм Сйгузозрогшш по любому из вариантов настоящего изобретения может дополнительно включать селективный маркер. Такой селективный маркер будет обеспечивать простой отбор трансформированных или трансфицированных клеток. Часто селективный маркер кодирует генный продукт, обеспечивающий специфический тип резистентности, нехарактерный для нетрансформированного штамма. Это может быть резистентность к тяжелым металлам, антибиотикам и биоцидам в целом. Применимым селективным маркером, не связанным с антибиотиками, также является прототрофия. Не являющиеся антибиотиками селективные маркеры могут быть предпочтительными тогда, когда интересующий белок или полипептид предназначен для использования в пищевом или фармацевтическом продукте, с точки зрения более быстрого или менее сложного пути официальной сертификации такого продукта. Очень часто в качестве таких маркеров используется индикация ОКА.8. Для специалиста в данной области техники доступное значительное количество таких маркеров. Например, такой список предоставляет ΕΌΑ. Наиболее часто используемыми являются селективные маркёры, выбираемые из группы, придающей резистентность к лекарственному средству или восстановление пищевого дефекта, например, из группы, включающей ашб8 (ацетамидаза), йрй (гигромицинфосфотрансфераза), ругС (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза), 1грС (антранилатсинтаза), агдВ (орнитинкарбамоилтрансфераза), зС (сульфатаденилтрансфераза), Баг (фосфинотрицинацетилтрансфераза) резистентность к глюфозинату, шаЭ (нитратредуктаза), ген резистентности к блеомицину, более конкретно 8й-Ые, резистентность к сульфонилмочевине, например, ацетолактатсинтазная мутация Ϊ1ν1. Также отбор может быть проведен с использованием котрансформации, когда селективный маркер входит в состав отдельного вектора или когда селективный маркер находится в том же фрагменте нуклеиновой кислоты, что и последовательность, кодирующая интересующий полипептид.
По использованию в данном тексте термин «гетерологичный полипептид» обозначает белок или полипептид, который в норме не экспрессируется и не секретируется штаммом-хозяином Сйгузозрогшш, используемым для экспрессии в соответствии с настоящим изобретением. Полипептид может происходить от растения или животного (позвоночного или беспозвоночного), например, от млекопитающего, рыбы, насекомого, или от микроорганизма, при условии, что он отсутствует в штамме-хозяине. Млекопитающим может являться человек. Микроорганизмами являются вирусы, бактерии, архебактерии и грибки, например, гифомицеты и дрожжи. Соответствующие списки бактерий и архебактерии представлены в руководстве Вегдеу'з Мапиа1 £ог Вас1епа1 Ое1егт1по1оду. С точки зрения фармацевтических целей весьма часто преимущество будут получать белки человека, поэтому рекомбинантный хозяин по настоящему изобретению, сформированный в предпочтительном варианте, будет являться хозяином, в котором полипептид происходит от человека. Для таких целей, как выработка пищевых продуктов, подходящий гетерологичный полипептид будет производным от животного, растения или водорослей. Следо
-8005682 вательно, такие варианты также рассматриваются как подходящие примеры настоящего изобретения. Альтернативные применимые варианты также включают гетерологичный полипептид любого бактериального, дрожжевого, вирусного, архебактериального и грибкового происхождения. Наиболее предпочтительным является грибковое происхождение.
Подходящий вариант настоящего изобретения будет включать последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты с адаптированной библиотекой кодонов. Такая последовательность кодирует нативную аминокислотную последовательность организма-хозяина, от которой она происходит, но характеризуется отличающейся нуклеотидной последовательностью, т. е. нуклеотидной последовательностью, в которой определенные кодоны были заменены другими кодонами, кодирующими ту же аминокислоту, но которые чаще используются штаммом-хозяином, используемым для экспрессии. Это может обеспечивать лучшую экспрессию последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты. Это является обычной практикой для специалистов в данной области техники. Такая коррекция библиотеки кодонов может быть осуществлена на основе известной библиотеки кодонов при сопоставлении грибковых и не грибковых библиотек. Она также может быть еще более целенаправленно адаптирована к библиотеке кодонов Сйгузозрогшт. Уровни сходства таковы, что библиотеки кодонов, выявляемые у Тпсйобегта, Нит1со1а и АзрегдШиз, должны обеспечивать обмен последовательностями таких организмов без коррекции библиотеки кодонов. Подробности, касающиеся библиотек кодонов этих грибков, доступны специалистам и включены здесь для сведения в виде библиографических ссылок.
Настоящее изобретение не ограничивается вышеупомянутыми рекомбинантными штаммами Сйгузозрогшт, но также охватывает рекомбинантный штамм Сйгузозрогшт, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гомологичный для штамма Сйгузозрогшт белок, при том, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты функционально присоединена к регулирующему экспрессию участку, а указанный рекомбинантный штамм экспрессирует упомянутый белок более интенсивно, чем соответствующий нерекомбинантный штамм, при соблюдении одинаковых условий. В случае интересующего гомологичного полипептида им предпочтительно является нейтральный или щелочной фермент, такой как гидролаза, протеаза или фермент, разрушающий углеводы, описанные в литературе. Также полипептид может быть кислым. Предпочтительно рекомбинантный штамм будет экспрессировать полипептид в большем количестве, чем нерекомбинантный штамм. Все замечания, приведенные выше для гетерологичного белка, также справедливы (в равной степени) для гомологичного полипептида целлюлазы.
Таким образом, настоящее изобретение также охватывает генетически сконструированные штаммы Сйгузозрогшт, причем внесенная последовательность может происходить от Сйгузозрогшт. Однако такой штамм может отличаться от встречающихся в природе штаммов тем, что, например, в последовательности нуклеиновой кислоты, использованной для трансформации или трансфекции Сйгузозрогшт, имеются гетерологичные последовательности, тем фактом, что присутствуют множественные копии последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид, или тем фактом, что они экспрессируются в количестве, превышающем таковое у генетически несконструированного штамма при идентичности условий, или тем фактом, что экспрессия происходит в таких условиях, в которых в норме экспрессия отсутствует. Последнее может иметь место в случае, если индуцибельный промотор регулирует интересующую последовательность в противоположность ситуации с нерекомбинантным штаммом, или если иной фактор индуцирует экспрессию, чего не происходит в случае генетически несконструированного штамма. В соответствии с определенными предыдущими вариантами настоящее изобретение не призвано охватить штаммы Сйгузозрогшт, встречающиеся в естественных условиях. Настоящее изобретение направлено на штаммы, сконструированные с применением либо классических генетических методов, либо генноинженерных методик.
Все рекомбинантные штаммы по настоящему изобретению могут включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный белок, выбираемый из разрушающих углеводы ферментов (целлюлаз, ксиланаз, маннаназ, маннозидаз, пектиназ, амилаз, например, глюкоамилаз, αамилаз, α- и β-галактозидаз, α- и β-глюкозидаз, β-глюканаз, хитиназ, хитаназ), протеаз (эндопротеаз, аминопротеаз, амино- и карбоксипептидаз), других гидролаз (липаз, эстераз, фитаз), оксидоредуктаз (каталаз, глюкооксидаз) и трансфераз (трансгликозилаз, трансглютаминаз, изомераз и инвертаз).
-9005682
Таблица А. Диапазон рН, при которых ферменты сохраняют активность и/или стабильность
Образец Диапазон рН, Сохраняющий >50% каталитической активности Диапазон рН, сохраняющий >70% каталитической активности Стабильность (20 часов при 50°С), % от максимума
СМС аве кввсмсаве Другие субстраты СМС аве кввсмсаве Другие субстраты рН 7,5/8
30 кД, протеаза (щелочная) 12,5 12,0
Ху1 (щелочная) - - 10,0 - - 8,5 80
51 кД Ху1 - - 8,0 - - 7,5 -
60 кД Ху1 - - 9,5 - - 9,0 85
45 кД эндо 7,0 8,0 - 6,5 7,0 - 75
55 кД эндо 8,0 8,0 - 7,0 7,0 - 55
25кД(21,8кД* **)эндо 7,5 10,0 - 6,5 9,0 - 80
43 кД (39,6 кД*) эндо 8,0 8,0 - 7,2 7,2 - -
45 кД α,β-ΟθΙ/β-ΟΙιιο - - 6,8 - - 5,7 -
48 кД СВН со следами β- 61ис 5,2 7,5 8,0 5,0 6,8
55 кД СВН 8,0 9,0 - 7,4 8,5 - 70
65 кД рои - - 8,0 - - 7,3 -
90 кД протеаза - - 9,0 - - 9,0 -
100 кД эстераза - - 9,0 - - 9,0 -
* - молекулярные массы (по данным ΜΑΙ .О!).
Примечание: * все другие молекулярные массы по данным электрофореза в ДСН-ПААГ * фе'рме'нгы были взяты при равном количестве белка * Ху1 = ксиланаза * эндо = эндоглюканаза * Оа1 = галактозидаза * О1ис = глюкозидаза * СВН = целлобиогидролаза * РСи = полигалактуроназа
Таблица В. Активности ферментов, выделенных из ультрафильтратов штамма 18-25, в отношении рамичных субстратов (при рН=5), ед./мг белка
Образец X СМС . квв ’ СМС - СМС : 41 я> СМС (йк! : р-тян > т ' р ΠΡΟ. ------3---- Ь мм» бнааа Айсе миг целле блиц мир- Д ПИЛ миг- кснл· 1 пд - мкт·· ИС·* мм ММ' гамм ЛФ·•им маем миг- гягам· »мд пмк - тема· мам рНР-с гам к тмвд ‘ гамм т«»Д 1фаса: явный кам· ρΝΡ· (упрет
50оС 40оС 40оС 50оС 40оС 50о< : 40оС 40»С 40еС : 40вС 40оС : 4ОеС 40оС 40оС 50оС 5О®С 40еС 50оС «ьс : 4О»С 40аС «ОвС
30 кД протеи· 3.9 0 0 0 0 0 0 - 0 О 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.4 0
30 кД Ху1 9.1 4.1 2 0.1 0.16 0.1 0 0 О 0 О 0 25 0 0 0 о - 0 0
51кДХу! 8.7 0.1 42 - 0.19 О 0 - 0 0 О О 19 0 0 0 0 - 0 0
60кДХу1 4.7 0 - - 0 - 0 0 - 0 0.14 0.02 0.04 163 0 О О О 0 0 0
45 иД андо б 51 м 7.6 02 47 36 0 - 0.5 0 0 0 1 - 0 1.1 0 - 0 0
55 кД енде 4.9 47 94 7.7 ОЗ 39 23 0 - 0.5 а 0 О 0 - 0 0.4 о - 0 О
25 кД (21,8 кД·) андо 4.1 19 15 3.9 од 11 3.8 0 0 0.05 0 0 О 0.03 0 - 0 0 0 0 0
43 кД (39.6 кД*) аидо 42 0.43 02 0.1 О 02 02 - 0 0 О 0 0 0 0 0 0 0 0 0 О
45 кД п,р.Са1/р-61ис 43 О 0 0 0 0.01 0.01 0 0.4 0.06 О о 0 - 0.01 о 0.1 0.1 03 02 03 0 1.7
48 нД СВН со следами |1С1ис+ гпюкоко-41 - 4.4 0.67 13 и 0.4 0.1 0.Т7 0 1.7 0.01 О 02 036 0 0 0.1 0.4 0 0 0 0 23
лактон 0 036
55кДСВН со следам· р-С1ис+ глюконо-сТ 4.4 0.7 0.16 037 0.4 0.1 0.1 - 0.05 с.оя 0.46 03 0.7 - О 0.1 0 - 0 О 0 о 0
лактон О 0.14 а.£
65 кд рев 4.4 0 0 0 0 0 0 - 0 0 О 0 0 - о О 1 - 0 О 0 О О
90 кД протеаза 42 0.01
100 кД эстераза 4,5 ° 0 О О 0 0 0 . 0 0 0 0 * 0 О 0 0 0 о 0 0 04 _
* молекулярные массы (по данным ΜΑΓΟΙ) ** активность в отношении красильного казеина выражена в условных единицах на мг
-10005682
Наиболее интересными продуктами, которые должны быть получены в соответствии с настоящим изобретением, являются целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, липазы и протеазы, причем целлюлазы и ксиланазы расщепляют в-1,4-связи, а целлюлазы включают эндоглюканазы, целлобиогидролазы и βглюкозидазы. Эти белки характеризуются интенсивным применением в различных производственных процессах, известных в данной области техники. Конкретно в связи с целлюлазами авторы ссылаются, например, на \¥О 98/15633, описывающую использование целлобиогидролаз и эндоглюканаз. Содержание упомянутой заявки включено здесь для сведения. Также авторы изобретения ссылаются на таблицы А и В, дающие дополнительную информацию о представляющих интерес белках Сйгузозрогшт.
В настоящем изобретении было обнаружено, что мутанты Сйгузозрогшт могут быть получены таким образом, чтобы снизить экспрессию протеазы, делая их еще более подходящими для выработки продуктов белковой природы, особенно в случаях, когда такой белковый продукт чувствителен к протеазной активности. Таким образом, настоящее изобретение также включает мутантный штамм Сйгузозрогшт, который вырабатывает меньше протеазы, чем немутантный штамм Сйгузозрогшт, например, меньше, чем штамм С'.1искпо\\'сп8с С1 (УКМ Е-3500 Ό). В частности, протеазная активность таких штаммов составляет менее половины того количества, в частности, менее 30% от того количества, которое вырабатывается штаммом С1. Для определения снижения протеазной активности можно использовать известные методыб, такие как измерение образующихся ореолов на пленках снятого молока или определение уровня разрушения БСА.
Представляющим конкретный интерес вариантом настоящего изобретения является рекомбинантный Сйгузозрогшт по настоящему изобретению, у которого последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая интересующий полипептид, кодирует полипептид, который инактивируется или нестабилен при кислых рН, т.е. при рН менее 6, даже менее 5,5, предпочтительнее рН менее 5 и даже на уровне рН=4 и меньше. Это является конкретным интересным вариантом потому, что в целом имеющиеся грибковые экспрессионные системы не культивируют в условиях, являющихся нейтральными или щелочными, но культивируются при кислом рН. Таким образом, система по настоящему изобретению представляет грибковую экспрессионную систему, безопасную для белков или полипептидов, которые чувствительны по инактивации или являются нестабильными при кислых значениях рН.
Более конкретно рекомбинантный штамм в соответствии с определенным в любом из вариантов настоящего изобретения, у которого нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид, кодирует белок или полипептид, проявляющий оптимальную активность и/или стабильность при рН выше 5, предпочтительно при нейтральном или щелочном рН (т.е. выше 7), и/или при рН выше 6, рассматривается как предпочтительный вариант по настоящему изобретению. Более 50%, более 70% и даже более 90% от оптимальной активности при таких значениях рН принимается как соответствующее конкретным применимым вариантам. Полипептид, экспрессируемый при данных условиях культивирования, необязательно должен быть активным при этих условиях культивирования, а на самом деле предпочтительным для него может быть то, чтобы культивирование проходило при условиях, при которых он неактивен, поскольку его активная форма могла бы быть опасной для хозяина. Например, это относится к случаю с протеазами. Однако то, что необходимо, -это стабильность белка или полипептида в условиях культивирования. Стабильность может быть термостабильностью. Она также может быть стабильностью против конкретных композиций или химических веществ, таких как те, которые присутствуют, например, в композициях или процессах выработки, или при применении интересующих полипептида или белка. ЬАБ в детергентных композициях, содержащих целлюлазы или липазы и т.п., - это пример химически опасного влияния на белки. Продолжительность практического использования может варьироваться от кратковременной до длительного воздействия, поэтому стабильность может варьироваться в связи со временем действия, варьирующегося в связи с конкретным применением. Специалист сможет установить конкретные условия по параметрам конкретного случая. Можно использовать ряд доступных коммерческих тестов для определения оптимальных активностей различных ферментных продуктов. Например, такое можно найти в каталогах Зщта и Медахуте. Упоминания конкретных примеров таких тестов имеются в данном описании. Производители предоставляют руководства по применению.
Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что штамм Сйгузозрогшт, который подходящим образом может быть использован для трансформации или трансфекции интересующей последовательности, предназначенной для экспрессии, является штаммом, характеризующимся относительно низкой биомассой. Было обнаружено, что штаммы Сйгузозрогшт, характеризующиеся в 2-5 раз меньшей биомассой при сравнении с Тпсйобегша гсс8С1 в случае культивирования до уровня вязкости 200-600 сПз в конечный момент ферментации, также проявляют в 10-20 раз меньшую биомассу по сравнению с АзрегдШиз шдег при культивировании до вязкости 1500-2000 сПз в соответствующих условиях, т.е. их соответствующие оптимальные условия культивирования могут обеспечивать высокий уровень экспрессии. Этот уровень экспрессии намного превосходит таковые уровни у двух коммерческих контрольных штаммов при существенно меньшей биомассе и при существенно меньшей вязкости. Это означает, что выход экспрессии у таких штаммов Сйгузозрогшт будет заметно выше, чем у АзрегдШиз шдег и Тпс1ю
-11005682 бегша геекег Такой трансформированный или трансфицированный штамм Сйгукокрогшш образует соответствующий вариант настоящего изобретения.
Была установлена биомасса 0,5-1,0 г/л штамма С1(18-25) Сйгукокрогшш в противоположность 2,55,0 г/л для Тпейобегша гес5С1 и 5-10 г/л для ЛкрегдШш шдег в описанных выше условиях. Подробности этого будут описаны в примерах.
В предпочтительном варианте рекомбинантный штамм Сйгукокрогшш по настоящему изобретению вырабатывает белок или полипептид в количестве, по крайней мере эквивалентном выработке (в молях на литр) целлюлазы штаммами ИУ13-6 или С-19, а наиболее предпочтительно - по крайней мере эквивалентном или превосходящем по отношению к штамму ИУ18-25, при соблюдении соответствующих или идентичных условий, т. е. в соответствующих оптимальных для них условиях культивирования.
Также заявителями было установлено, что уровни экспрессии и секреции чрезвычайно высоки при использовании штамма Сйгукокрогшш, характеризующегося морфологией мицелия штамма ИУ18-25, т.е. имеющего короткий фрагментированный мицелий. Таким образом, рекомбинантный штамм по настоящему изобретению преимущественно должен проявлять такую морфологию. Однако, настоящее изобретение также охватывает нерекомбинантные штаммы или по-иному сконструированные штаммы Сйгукокрогшш, проявляющие данный новый и изобретательский признак. Также настоящим изобретением охватывается рекомбинантный штамм Сйгукокрогшш в связи с любым из описанных вариантов настоящего изобретения, который дополнительно характеризуется сниженной споруляцией по сравнению с С1, предпочтительно ниже уровня штамма ИУ13-6, предпочтительно ниже такового у Ν67ί.'-19. предпочтительно ниже такового у ИУ18-25 при эквивалентных условиях ферментации. Также настоящим изобретением охватывается рекомбинантный штамм Скукокрогшш в связи с любым из описанных вариантов настоящего изобретения, который дополнительно проявляет по крайней мере то же отношение количества вырабатываемого белка к биомассе по сравнению с С1, предпочтительно по сравнению с таковым у любого из штаммов ИУ13-6, N670'-19 и ИУ18-25 при эквивалентных условиях ферментации. Однако настоящее изобретение также охватывает нерекомбинантные штаммы или по-иному сконструированные штаммы Сйгукокрогшш, проявляющие этот новый и изобретательский признак сам по себе или в сочетании с любым из других вариантов.
Другой привлекательный вариант настоящего изобретения также охватывает рекомбинантный штамм Сйгукокрогшш, проявляющий вязкость, меньшую таковой у штамма N07^19, предпочтительно меньшую чем у ИУ18-25 при соответствующих или идентичных условиях ферментации. Однако настоящее изобретение также охватывает нерекомбинантные или по-иному сконструированные штаммы С1гукокрогшш, проявляющие этот новый и изобретательский признак сам по себе или в сочетании с любым из других вариантов. Заявители определили, что вязкость культуры ИУ18-25 ниже 10 сПз в противопоставление таковой у Тпейобегша геекец составляющей порядка 200-600 сПз, и таковой у ЛкрегдШш ищет составляющей порядка 1500-2000 сПз, при оптимальных условиях культивирования в конце процесса ферментации. Способ, использованный для такой оценки, рассмотрен в примерах.
Во многих случаях вязкость может быть оценена путем визуального контроля. Текучесть вещества может варьироваться в очень широких пределах, т.е. оно может быть почти твердым, соусо-подобным или жидким. Также вязкость может быть легко определена с помощью ротационных вискозиметров Брукфилда, с использованием трубок для анализа кинематической вязкости, вискозиметра с падающим шариком (Стокса) или чашечного вискозиметра. Выходы в таких культурах с низкой вязкостью выше таковых, характерных для известных промышленных высоковязких культур, в расчете на единицу времени и на клетку.
Обработка таких культур с низкой вязкостью по настоящему изобретению, в частности, имеет преимущество при повышении масштаба культивирования. Рассматриваемые штаммы Сйгукокрогшш с низкой вязкостью хорошо культивируются в объемах вплоть до 150000 л. Таким образом, любой объем культуры вплоть до 150000 л представляет собой применимый вариант настоящего изобретения. С использованием штаммов по настоящему изобретению любой стандартный ферментационный объем должен быть осуществлен успешно. До этого проблемы создавало то, что при крупномасштабном производстве могут образовываться агрегации, содержащие слишком плотный мицелий и/или неравномерно распределенный мицелий. В результате культуральная среда не может быть эффективно утилизирована в ходе культивирования, что, следовательно, ведет к неэффективности производственного процесса, в частности, при крупномасштабной ферментации, например, более 150000 л. Проблематичными становятся аэрация и перемешивание, что приводит к кислородному и пищевому голоданию, а, следовательно, к снижению концентрации продуктивной биомассы и снижению выхода полипептида в ходе культивирования, и/или может привести к более продолжительному времени ферментации. Кроме того, высокая вязкость и высокое сдвиговое усилие являются нежелательными в промышленных ферментационных процессах, и в современных промышленных процессах они являются факторами, ограничивающими производительность. Все эти негативные аспекты могут быть преодолены с помощью хозяина Сйгукокропиш по настоящему изобретению, который проявляет лучшие характеристики по сравнению с Тпе1юбегша геекец ЛкрегдШш шдег и ЛкрегдШш огу/ае, которые применяются для этого в промышленности, т.е. проявляет более высокие уровни выработки белка и лучшие параметры вязкости и биомассы.
-12005682
Очень хорошо различные аспекты настоящего изобретения иллюстрируются штаммом Сйгузозрогшш, выбираемым из С1, υνΐ3-6, ЫО7С-19 и ИУ18-25. Однако настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные штаммы или иным путем сконструированные штаммы Сйгузоврогшт, производные от четырех депонированных штаммов, которые также проявляют любой из новых и изобретательских признаков сам по себе или в сочетании. Данные по депонированию этих штаммов приведены в другой части настоящей заявки. Также настоящее изобретение охватывает рекомбинантные штаммы или по-иному сконструированные штаммы Сйгузозрогшт, производные от четырех депонированных штаммов, которые также проявляют любой из новых и изобретательских признаков сам по себе или в сочетании. Штамм Сйгузоврогшт по настоящему изобретению также включает штамм, проявляющий при соответствующих условиях культивирования уровень биомассы, который вдвое ниже, чем у Тпсйобегша геезе1, предпочтительно даже более чем в 5 раз ниже, чем у Тпсйобегша геезе1, в частности, чем у Тпсйобегша геехег проявляющей вязкость на уровне 200-600 сПз, показанном при условиях, описанных в примерах. Штамм Сйгузоврогшт по настоящему изобретению также включает штамм, вырабатывающий полипептид целлюлазы по крайней мере в том же количестве (в молях на литр), что и штаммы С1, υνΐ3-6, ЫО7С-19 или υν18-25, при соответствующих или идентичных условиях.
Штаммы Сйгузоврогшт по настоящему изобретению являются дополнительно предпочтительными тогда, когда они проявляют оптимальные параметры роста при нейтральном-щелочном рН и температурах 25-43°С. Предпочтение может быть отдано нейтральной или даже щелочной рН. Такие условия производства предпочтительны для ряда полипептидов и белков, в частности, для тех, которые чувствительны к действию кислого рН, или тех, которые неактивны или нестабильны при низких температурах. Однако, также имеется вариант изобретения, включающий штаммы Сйгузоврогшт, которые можно культивировать при кислом рН, что применимо для определенных белков и полипептидов. Подходящие кислые рН начинаются, снижаясь от 7,0. Кислый рН менее 6,5 рассматривается как представляющий эффективный вариант настоящего изобретения. рН в диапазоне 5,0-7,0 также является подходящим вариантом. Нейтральный рН может составлять 7,0 или быть около 7 - например, 6,5-7,5. Как описано в литературе, оптимальный рН зависит от ряда факторов, которые очевидны специалистам в данной области техники. Могут быть использованы рН выше 7,5, т.е. щелочные, предпочтительно в диапазоне 7,5-9,0.
При сравнении параметров штаммов по настоящему изобретению с параметрами других штаммов, предположительно обладающих иными оптимальными условиями (например, ЛзрегдШиз и Тпсйобегша). с помощью измерений вязкости, определения биомассы или выработки белка, эти сравнения должны быть осуществлены с использованием соответствующих оптимальных условий для соответствующего штамма. Это должно быть очевидно для специалистов в данной области техники.
Штамм Сйгузоврогшт по любому из описанных выше вариантов настоящего изобретения, причем указанный штамм дополнительно характеризуется выработкой одного или нескольких грибковых ферментов, выбираемых из разрушающих углеводы ферментов, протеаз, других гидролаз, оксидоредуктаз и трансфераз, упоминавшихся выше, рассматривается как конкретный применимый вариант настоящего изобретения. Конкретными наиболее интересными продуктами являются целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, липазы и протеазы. Однако, также в качестве применимого варианта настоящего изобретения рассматривается штамм Сйгузоврогшт, характеризующийся выработкой одного или нескольких грибковых ферментов, который проявляет оптимальную стабильность и/или активность в нейтральных или щелочных условиях, предпочтительно оптимальную стабильность и/или активность при щелочных условиях, причем упомянутый фермент выбирают из разрушающих углеводы ферментов, гидролаз и протеаз, предпочтительно гидролаз и разрушающих углеводы ферментов. В случае нерекомбинантного Сйгузозрогшт предпочтительно такими ферментами являются иные ферменты, нежели целлюлазы, которые были заявлены в XVО 98/15633. Представляющими конкретный интерес ферментами являются ксиланазы, протеазы, эстеразы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, β-глюканазы и пектиназы. Эти ферменты не ограничиваются вышеперечисленным. Замечания, касающиеся стабильности и активности в других частях данного описания, также справедливы и здесь.
Также настоящее изобретение охватывает способ получения интересующего полипептида, причем упомянутый способ включает культивирование штамма Сйгузоврогшт в любом из вариантов настоящего изобретения в условиях, обеспечивающих экспрессию и предпочтительно секрецию полипептида и последующее выделение выработанного интересующего полипептида.
При упоминании белка или полипептида подразумевается, что включаются варианты и мутанты, например, мутанты с заменами, вставками или делениями естественно встречающихся белков, которые проявляют активность немутантного варианта. То же самое справедливо для соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот. Такие способы, как «перемешивание» генов, белковая инженерия и направленное изменение с помощью сайт-специфичного мутагенеза и случайного мутагенеза, являются способами, с помощью которых могут быть получены такие полипептиды, варианты или мутанты. Направленные изменения представлены в патентах США №№ 5223409, 5780279 и 5770356. С помощью этих способов в любом типе клеток, применяя вносящую ошибки ПЦР, создают библиотеку случайно мутировавших генных последовательностей, сформированных, например, по методу «перемешивания» генов. Каждый ген включает секреторный сигнал и иммобилизующий участок, прикрепленный к нему
-13005682 так, чтобы образующийся в результате белок секретировался и оставался прикрепленным к поверхности хозяина. Соответственно, создаются условия, которые необходимы для биологической активности конкретного полипептида. Этот процесс включает ряд циклов, в конечном счете приводящих к окончательному гену с желательными параметрами. Другими словами, ускоряется процесс направленного изменения. Также патент США № 5763192 описывает способ получения ДНК, РНК, пептидов, полипептидов или белка путем синтетического сочетания полинуклеотидов, полученных от случайным образом сформированных последовательностей, внесения их в организм-хозяин с последующим отбором клеткихозяина с соответствующим заданным признаком.
Стандартные методы клонирования и выделения белка или полипептида могут быть использованы для получения необходимой информации о последовательности. Участки известных последовательностей можно использовать в качестве зондов для выделения других гомологов у других родов и штаммов (видов). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая конкретную ферментативную активность, можно использовать для скрининга, например, библиотеки Сйгузозрогшт. Специалист в данной области техники сможет понять, какие условия гибридизации являются подходящими. Стандартные методы гибридизации нуклеиновых кислот из библиотек и методы клонирования описаны у 8ашЬгоок е! а1. (Ебз.), 1989, Мо1еси1аг С1ошид: А ЕаЬогаЮгу Мапиа1, Со16 8ргтд НагЬог, Ргезз Ρΐαίηνίο^. ΝΥ, и у ΛιΐδΐιЬе1 е! а1. (Ебз.), 1987, Сштеп! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1о1т АПеу & 8оп5, ΝΥ. Соответствующая информация также может происходить из более поздних руководств и патентов, равно как и из доступных на коммерческой основе различных наборов для данной области техники.
В альтернативном варианте упомянутый способ включает культивирование штамма по настоящему изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию и предпочтительно секрецию белка или полипептида, или их предшественника, и выделение полученного в результате полипептида, и необязательно дополнительные стадии выделения и очистки предшественника с целью получения представляющего интерес полипептида. Такой способ предпочтительно должен включать стадию расщепления предшественника на интересующий полипептид или предшественник. Стадия расщепления может быть расщеплением Кех2-подобной протеазой, любой протеазой, конъюгирующей с основной аминокислотой, или Кех-2, например, в случае, когда сайт протеазного расщепления связывает эффективно секретируемый белок-переносчик и интересующий полипептид. Специалист в данной области техники легко сможет найти Кех2-подобные протеазные последовательности, поскольку подробное описание их консенсусной последовательности доступно, а также уже был описан ряд альтернатив, например фурин.
Предпочтительно в способе выработки полипептида по любому из вариантов по настоящему изобретению культивирование осуществляют при рН выше 5, предпочтительно при 5-10, более предпочтительно при 6-9. Предпочтительно в таком способе культивирование проводят при температуре в диапазоне 25-43°С, предпочтительно при 30-40°С. Штамм Сйгузозрогшт, используемый в способе по настоящему изобретению, предпочтительно является рекомбинантным штаммом Сйгузозрогшт по любому из заявляемых вариантов. В этом случае способ по настоящему изобретению может дополнительно предвосхищаться стадией получения рекомбинантного штамма Сйгузозрогшт по настоящему изобретению. Выбор подходящих условий будет зависеть от природы полипептида, который должен быть экспрессирован, и такой выбор находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники.
Способ получения рекомбинантного штамма Сйгузозрогшт по настоящему изобретению также является частью предмета настоящего изобретения. Этот способ включает стабильное встраивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный или гомологичный полипептид, в штамм Сйгузозрогшт, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты функционально присоединена к регулирующему экспрессию участку, причем упомянутое встраивание осуществляется путем, уже известным для трансформации грибков-гифомицетов. Как отмечалось выше, доступны многочисленные источники, и небольшая их часть была процитирована. Представленная информация достаточна для того, чтобы специалист осуществил данный способ без излишней нагрузки. Способ включает встраивание последовательности нуклеиновой кислоты, включающей любые из элементов нуклеиновой кислоты, описанных в различных вариантах рекомбинантного Сйгузозрогшт по настоящему изобретению, как по отдельности, так и в сочетании.
В качестве примера способа встраивание можно использовать метод трансформации протопластов. Этот способ описан в примерах. Известны альтернативные методы трансформации протопластов или сферопластов: они могут быть использованы в соответствии с описанным в известной области техники для других грибков-гифомицетов. Подробности таких способов можно найти во многих процитированных материалах и включены для сведения в качестве библиографических ссылок. Способ по настоящему изобретению предпочтительно включает использование нерекомбинантного штамма Сйгузозрогшт по настоящему изобретению в качестве исходного материала для внесения желательной последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид.
Настоящее изобретение также охватывает способ получения фермента Сйгузозрогшт, причем упомянутый способ включает культивирование штамма Сйгузозрогшт по любому из вариантов настоящего изобретения в соответствии с описанным выше в или на культуральной среде при рН выше 5, предпоч
-14005682 тительно при 5-10, более предпочтительно при 6-9, предпочтительно при 6-7,5 и при 7,5-9, как примерах нейтрального и щелочного диапазонов рН.
Также настоящее изобретение охватывает такой способ с использованием культуральной среды при температуре в диапазоне 25-43°С, предпочтительно при 30-40°С. Сочетание предпочтительных рН и температуры является особенно предпочтительным вариантом способа получения фермента Сйгузозрогшт по настоящему изобретению.
В целом, дополнительно настоящее изобретение охватывает способ выработки фермента, проявляющего нейтральную или щелочную оптимальную активность и/или стабильность, предпочтительно щелочную оптимальную активность и/или стабильность. Предпочтительные диапазоны рН и оптимальной активности, равно как и тесты для их определения, описаны в других частях настоящей заявки. Фермент должен быть выбран из разрушающих углеводы ферментов, протеаз, других гидролаз, оксидоредуктаз и трансфераз в соответствии с описанным выше, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей соответствующий фермент. Предпочтительно таким ферментом будет фермент Сйгузозропит. Предпочтительный способ, такой как этот, включает конкретную выработку целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, липазы и протеазы, причем целлюлаза и ксиланаза расщепляют в-1,4-связи, а целлюлаза включает эндоглюканазу, целлобиогидролазу и β-глюкозидазу. Способ по настоящему изобретению может включать культивирование любого хозяина Сйгузозрогшт по настоящему изобретению, несущего нуклеиновую кислоту, кодирующую такие упоминавшиеся выше ферменты. Предпочтительно получение нерекомбинантных хозяев Сйгузозрогшт по настоящему изобретению направлено на выработку ферментов, разрушающих углеводы, гидролаз и протеаз. В таком случае ферментом предпочтительно является иной фермент, нежели целлюлаза. Подходящие примеры продуктов, предназначенных для получения, приведены в табл. А и В. Способы их выделения аналогичны таковым, которые описаны в νθ 98/15633, и включены здесь для сведения.
Ферменты, вырабатываемые штаммами Сйгузозрогшт по настоящему изобретению, также охватываются настоящим изобретением. Также охватываются ферменты, происходящие от Сйгузозрогшт, которые могут быть выделены из нерекомбинантных штаммов Сйгузозрогшт по настоящему изобретению. Они проявляют указывавшиеся выше параметры стабильности и активности. Предпочтительно они стабильны в присутствии БА8. В частности, заявляются протеазы с р1=4-9,5, протеазы с молекулярной массой 25-95 кД, ксиланазы с р1=4,0-9,5, ксиланазы с молекулярной массой от 25 до 65 кД, эндоглюканазы с р1=3,5-6,5, эндоглюканазы с молекулярной массой 25-55 кД, β-глюкозидазы, α,β-галактозидазы с р1=44,5, β-глюкозидазы, α,β-галактозидазы с молекулярной массой 45-50 кД, целлобиогидролазы с р1=4-5, целлобиогидролазы с молекулярной массой 45-60 кД, например с молекулярной массой 55 кД и р1=4,4, полигалактуроназы с р1=4,0-5,0, полигалактуроназы с 60-70 кД, например 65 кД, эстеразы с р1=4-5 и эстеразы с молекулярной массой 95-105 кД с упоминавшимися выше параметрами стабильности и активности. Молекулярные массы (Μν) определены в методе электрофореза в ДСН-ПААГ. Нерекомбинантный, т.е. встречающийся в естественных условиях фермент - иной, нежели целлюлаза, как заявлено в νθ 98/15633. Фермент, заявленный в νθ 98/15633, исключается. Ферменты в соответствии с настоящим изобретением, представлены ферментами табл. В. Также охватываются ферменты, характеризующиеся сочетанием указанных выше значений р1 и молекулярной массы.
Также настоящее изобретение касается (сверх)выработки мутантными (рекомбинантными) штаммами по настоящему изобретению небелковых продуктов. Такими небелковыми продуктами являются первичные метаболиты, такие как органические кислоты, аминокислоты, и вторичные метаболиты, такие как антибиотики, например, пенициллины и цефалоспорины. Эти продукты являются результатом сочетаний биохимических механизмов, вовлекающих некоторые интересующие грибковые гены. Грибковые первичные и вторичные метаболиты и способы получения этих метаболитов в организмах грибков хорошо известны в данной области техники. Примеры выработки первичных метаболитов были описаны у Μ. Майсу, 1992, Т1с РгобисДоп о£ Огдашс Ашбз, Сигг. Ясу. Вю1сс11по1.. 12, 87-132. Примеры получения вторичных метаболитов были описаны у Рспа1уа с! а1., 1998, Т1с ОрШш/аОоп о£ РсшсШш Вю8уп1йс818 ίη Ецпд1, Тгспбз ίη Вю1ссйпо1.,16, 483-489.
Примеры
Примеры определения биомассы и вязкости
Диапазоны следующих операционных параметров были определены для процессов грибковой ферментации с использованием трех различных видов грибков. Сравниваемые виды грибков таковы: ТпсНобсгта 1опд1ЬтасЫа1ит (ранее - Т.гсс8с1), АзрсгдШиз шдсг и Сйгузозрогшт 1искпо\усп8с (ИУ18-25).
Вязкость.
Вязкость определяли с помощью вискозиметра ВгоокйсИ БУР с адаптером для малых образцов и шпулькой № 31.
Включение водяного насоса на 5 мин перед применением вискозиметра использовали для уравновешивания водяной рубашки. Температура водяной рубашки должна составлять 30°С.
-15005682
Получают свежий образец ферментационного бульона и помещают 10 мл этого бульона в шпульку для малого объема образца. Выбирают скорость вращения шпульки для снятия показаний в диапазоне 10-80. Ожидают четыре (4) мин и снимают показания со шкалы вискозиметра. Умножают показания на приведенные ниже коэффициенты для получения значения вязкости в сантипуазах (сП).
Скорость вращения шпульки Коэффициент
6 50
12 25
30 10
60 5
Следующие диапазоны вязкости были определены для процессов ферментации с использованием указанных видов грибков с применением описанной выше процедуры:
Вязкость, сПз
Т. 1опд1ЬгасЫа1:ит 200-600
А. пхдег 1500-2000
С.Тискпоиепзе (ϋνΐδ-25) ЬТ 10
Биомасса.
Биомассу определяли в следующей процедуре.
На алюминиевой чашке весов предварительно взвешивают фильтровальную бумагу 5,5 см (\\'11а1тап 54).
Фильтруют 5,0 мл цельного бульона через бумагу 5,5 см на бюхнеровской воронке и промывают отфильтрованный осадок с использованием 10 мл деионизованной воды, помещают промытый осадок и фильтр на чашку весов и высушивают в течение ночи при 60°С. Окончательно высушивают при 100°С в течение 1 ч, затем охлаждают в эксикаторе.
Определяют вес высушенного материала. Общая биомасса (в г/л) равна разности между исходными и конечными весами, умноженной на 200.
Следующие диапазоны биомассы были определены для процессов ферментации с использованием указанных видов грибков в описанной выше процедуре:
Биомасса, г/л
Т. ТопдНэгасЫаСит 2,5-5
А.пьдег 5-10
С.1искпомепзе (υνΐ8-25) 0,5-1
Белок.
Уровни белка определяли в тесте ВюКаб (81§та Со.). Наивысшие уровни белка выявлены у Сйгузозрогшт.
Данные, приведенные выше, представляют собой значения, определенные за 48 ч до окончания процесса ферментации. Все величины для АзрегдШиз и Тпсйобегта относятся к промышленным грибкам и действительно отражают реальные промышленные показатели.
Такой грибковый штамм, как С.1искпоАеп§е (υνΐ8-25), имеет преимущество в том, что низкая вязкость позволяет использовать меньшие мощность исходной загрузки и/или сдвиговое усилие в тех ферментационных процессах с недостатком кислорода, когда влияние сдвигового стресса (от перемешивания) на продукт может быть опасным с точки зрения снижения продуктивности из-за физического повреждения выработанных молекул. Низкий уровень биомассы при высоком уровне белка указывает на более высокую эффективность организма при превращении ферментационной среды в продукт. Таким образом, Сйгузозрогшт дает улучшенные параметры биомассы и вязкости, при этом также вырабатывая столько же белка, а на самом деле намного больше белка, чем две используемые в промышленности системы, что очевидно лучше, чем у типичных депонированных штаммов АзрегдШиз или Тпсйобегта гее§е1 из базовых открытых коллекций.
Высокий уровень белка при низкой биомассе, вырабатываемого С.1искпоАеп§е (υνΐ8-25), должен позволить разработать условия ферментации желательного продукта для большего увеличения биомассы тогда, когда увеличение биомассы будет приводить к увеличению продуктивности до достижения предельных условий ферментации. Имеющиеся в настоящее время высокие уровни биомассы и вязкости, характерные для видов Т.1оп§1ЪгасЫа1ит и А.тдег, ограничивают увеличение биомассы потому, что имеющиеся уровни биомассы и вязкости вплотную приблизились к предельным практическим условиям ферментации.
-16005682
Примеры сравнительной трансформации Сйгукокропит, Тпсйобегта и То1урос1абшт Сеодек
Два ^трансформированных штамма Сйгукокрогшт С1 и один контрольный штамм Тпсйобегта гееке1 были проанализированы в двух культуральных средах (Ск - рН=6,8, и агаровая Рпбйат, РА рН=6,8). Для анализа уровней устойчивости к антибиотикам споры собирали на 7-дневных чашках РОА. Отобранные чашки инкубировали при 32°С и анализировали через 2, 4 и 5 дней. Было установлено, что С-1 штаммы ЫС7С-19 и ЦУ18-25 характеризуются отчетливо низкой исходной устойчивостью и к флеомицину, и к гигромицину. Этот уровень сопоставим с таковым у контрольного широко используемого лабораторного штамма Т.геекеЁ Таким образом, это ясно дает понять, что эти два стандартных грибковых селективных маркера могут быть использованы в штаммах Сйгукокрогшт. Проблем с другими стандартными селективными маркерами для грибков возникнуть не должно.
Отбор 8й-Ые-трансформированных (резистентность к флеомицину) штаммов Сйгукокрогшт успешно проводили при 50 мкг/мл. Это также соответствует уровню, используемому для Т.геекек это указывает на то, что дифференцированный отбор может быть легко достигнут у Сйгукокрогшт. Те же замечания справедливы для трансформированных штаммов с резистентностью к гигромицину при концентрации 150 мкг/мл.
Таблица С
6з (рН 6,8) агар РпсИпат (РА: рН 6,8)
N67019 υνΐ8-25 Т.Г.1Ю5 N67019 υνιβ-25 Т.Г.1Ю5
Флеомицин 7,5 мкг/мл 10 мкг/мл 5-7,5 мкг/мл 2,5 мкг/мл 10 мкг/мл 2,5 мкг/мл
Гигромицин 7,5-10 мкг/мл 10 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 25 мкг/мл 15 мкг/мл
Метод трансформации протопластов использовали в отношении Сйгукокрогшт, основываясь на наиболее часто применяемых методах трансформации грибов. Все споры с 90-мм чашки РОА выделяли в 8 мл 1С1 и переносили в шейкерную колбу с 50 мл культуральной среды 1С1 для инкубации в течение 15 ч при 35°С и 200 об./мин. После этого культуру центрифугировали, полученный сгусток промывали в МпР, возвращали обратно в раствор в 10 мл МпР и 10 мг/мл Сау1аке С3 и инкубировали в течение 30 мин при 35°С при перемешивании (150 об./мин).
Раствор отфильтровывали и полученный фильтрат центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об./мин. Сгусток промывали в 10 мл МпРСа2+. Полученное центрифугировали в течение 10 мин при 25°С. Затем добавляли 50 мкл холодного МРС. Смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, после чего добавляли 2,5 мл РМС. Через 15 мин при комнатной температуре 500 мкл обработанных протопластов смешивали с 3 мл МпР 8ой и сразу высевали на чашку МпК, содержащую флеомицин или гигромицин в качестве селективного агента. Трансформанты анализировали после инкубации в течение 5 дней при 30°С (клоны становятся видимыми через 48 ч). Эффективность трансформации определяли с использованием 10 мкг контрольной плазмиды рАЫ8-119. Полученные результаты представлены в нижеследующей табл. Ό.
Таблица Ό. Эффективность трансформации (с использованием 10 мкг контрольной плазмиды рАЫ8-1)
Т.геезе! N67019 υνιβ-25
Жизнеспособность 10е на 200 мкл 5x106на 200 мкл 5x106 на 200 мкл
Трансформанты на 200 мкл 2500 104 104
Трансформанты на 10ь жизнеспособных клеток 2500 2000 2000
Полученные результаты показывают, что жизнеспособность трансформантов Сйгукокрогшт предпочтительнее таковой у Тпсйобегта. Трансформационная способность этих штаммов сравнима, поэтому число трансформантов, полученных в одном эксперименте, в 4 раза выше у Сйгукокрогшт, чем у Т.геекеЁ Таким образом, трансформационная система Сйгукокропит не только равна обычно используемой системе Т.гееке1, но даже превосходит ее. Это улучшение может быть особенно важным для векторов, которые менее эффективны по трансформационной способности по сравнению с рАЫ8-1. Примерами таких низкоэффективных трансформационных векторов являются векторы белков-переносчиков, предназначенные для выработки негрибковых белков, которые в целом проявляют в 10 раз худшую способность к трансформации.
Ряд других трансформационных и экспрессирующих векторов был сконструирован с последовательностями, кодирующими гомологичный белок Сйгукокропит, а также с последовательностями, коди
-17005682 рующими гетерологичный белок, для использования в экспериментах по трансформации Сйгузозропит. Карты этих векторов показаны на фиг. 6-11.
Предназначенный для экспрессии гомологичный белок выбирают из группы целлюлаз, вырабатываемых Сйгузозропит, включающей эндоглюканазу-6, которая принадлежит к семейству 6 (молекулярная масса 43 кД), а гетерологичный белок являлся эндоглюканазой-3, которая относится к семейству 12 (молекулярная масса 25 кД) пенициллов.
рТ6д включает фрагмент промотора эндоглюканазы-6 Сйгузозропит, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы-6 в общей рамке с открытой кодирующей рамкой эндоглюканазы-6, после которой находится терминаторная последовательность эндоглюканазы-6. Отбор трансформантов проводят с использованием котрансформации с селективным вектором.
рЦТ1150 включает промотор целлобиогидролазы Тпсйобегта геезец присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы-6 в общей рамке с открытой кодирующей рамкой эндоглюканазы-6 с последующей терминаторной последовательностью целлобиогидролазы Т.геезет Дополнительно этот вектор несет вторую экспрессионную кассету с селективным маркером, а именно геном резистентности к флеомицину (ген 8й-Ь1е).
риТ1152 включает промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы-А АзрегдШиз шби1апз, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы-6 в общей рамке с открытой кодирующей рамкой эндоглюканазы-6 с последующей терминаторной последовательностью антранилатсинтазы (1грС) А.шби1апз. Дополнительно этот вектор несет вторую экспрессионную кассету с селективным маркером, а именно геном резистентности к флеомицину (ген 8й-Ь1е).
риТ1155 включает промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы-А А. шби1апз, присоединенный к сигнальной последовательности целлобиогидролазы Тпсйобегта геезе1 в общей рамке с белкомпереносчиком 8й-Ь1е, который, в свою очередь, присоединен в общей рамке к открытой кодирующей рамке эндоглюканазы-6 с последующей терминаторной последовательностью 1грС А.шби1апз. Этот вектор основан на методологии использования белка-переносчика, химеризованного на интересующий белок, что, как известно, в значительной степени улучшает секрецию интересующего белка.
рЦТ1160 включает промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы-А АзрегдШиз шби1апз, присоединенный к сигнальной последовательности целлобиогидролазы Тпсйобегта геезе1 в общей рамке с белком-переносчиком 8й-Ь1е, который, в свою очередь, присоединен в общей рамке к открытой кодирующей рамке эндоглюканазы-3 пеницилла с последующей терминаторной последовательностью 1грС А.шби1апз.
рЦТ1162 включает промотор целлобиогидролазы Тпсйобегта геезец соединенный с сигнальной последовательностью эндоглюканазы-3 в общей рамке с открытой кодирующей рамкой эндоглюканазы-3 РешсШшт с последующей терминаторной последовательностью целлобиогидролазы Т.геезет Дополнительно этот вектор несет вторую экспрессионную кассету с селективным маркером, а именно геном резистентности к флеомицину (ген 8й-Ь1е).
Таблица Е. Сравнительная трансформация
Вектор Штамм Трансформация Число трансформантов Тестировано в жидкой культуре
риТ1150 υνΐ8-25 Т.деобез отбор «флео» отбор «флео» 285 144 5 5
риТ1152 11У18-25 Т.деобез котрансформация с ΡΑΝ8.1 котрансформация с ΡΑΝ8.1 398 45 5 4
рГбд иУ18-25 Т.деобез котрансформация с ΡΑΝ8.1 котрансформация с ΡΑΝ8.1 252 127 6 5
риТ1162 иУ18-25 Т.деобез отбор «флео» данных пока нет >400
В табл. Е показаны результаты трансформации Сйгузозропит ИУ18-25, и То1урос1абшт деобез. Использованный протокол трансформации описан в разделе по гетерологичной трансформации.
Примеры гетерологичной и гомологичной экспрессии у трансформантов Сйгузозропит
Штаммы С1 (N67019 и/или ИУ18-25) были проанализированы по их способности секретировать различные гетерологичные белки: бактериальный белок (белок резистентности к флеомицину 81гер1оа11о1е1сйиз Ыпбиз1апиз - 8й-Ь1е), грибковый белок (ксиланаза-ΙΙ Тпсйобегта геезе1 - ΧΥΝ2) и белок человека (лизоцим человека - ΗΕΖ).
-18005682
Подробности анализа таковы.
[1]. С1-секреция белка резистентности к флеомицину 81гер1оа11о1е1сйик ЫпйиПапик (8Й-Ь1е)
С1-штаммы ИС7С-19 и ЦУ18-25 были трансформированы плазмидой рИТ7202. Этот вектор представляет следующую грибковую экспрессионную кассету:
промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (дрйА) АкрегдШик тйи1апк2; синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы-Ι (сЬШ) Тпсйойегта геекеР’3; ген резистентности к флеомицину 8й-Ь1е 81гер1оа11о1е1сйик Ыпйик1апик4;
терминатор триптофансинтазы (!грС) АкрегдШик шйи1апк5.
Также этот вектор включает ген β-лактамазы (Ь1а) и сайт начала репликации Е.соН из плазмиды рИС186. Подробная карта плазмиды показана на фиг. 2.
Протопласты С1 трансформировали в соответствии с Бигапй е! а1.7, адаптируя процедуру к штамму С1 (культуральные среды и растворы композиций раскрыты в литературе). Все споры нетрансформированного штамма С1 с одной 90-мм чашки РОЛ выделяли в 8 мл 1С1 и переносили в шейкерную колбу с 50 мл культуральной среды 1С1 для инкубации в течение 15 ч при 35°С и 150 об./мин. После этого культуру центрифугировали, сгусток промывали в МпР, разводили в 10 мл МпР плюс 10 мг/мл Сау1аке С3 и инкубировали в течение 30 мин при 35°С с перемешиванием (150 об./мин). Раствор отфильтровывали и полученный фильтрат центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об./мин. Сгусток промывали в 10 мл МпРСа2+. Полученное центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об./мин и сгусток отбирали в 1 мл МпРСа2+. 10 мкг ДНК плазмиды рИТ270 добавляли к 200 мкл раствора протопластов и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре (примерно 20°С). Затем добавляли 50 мкл холодного МРС. Полученную смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, после чего добавляли 2,5 мл РМС. Через 15 мин при комнатной температуре 500 мкл обработанных протопластов смешивали с 3 мл МпК 8оГ! и сразу высевали на чашку МпК, содержащую флеомицин (50 мкг/мл при рН=6,5) в качестве селективного агента. Через 5 дней инкубации при 30°С анализировали трансформанты (клоны становятся видимыми через 48 ч).
Выработку 8й-Ь1е трансформантами С1 (резистентные к флеомицину клоны) анализировали следующим образом. Первичные трансформанты вносили на чашки со средой С8 с флеомицином (5 мкг/мл) и выращивали в течение 5 дней при 32°С для проверки резистентности. Каждый клон, для которого подтверждали резистентность, субклонировали на чашки С8. По два субклона каждого трансформанта использовали для инокуляции чашек РОЛ с целью получения спор для инициации жидких культур. Жидкие культуры в среде 1С1 выращивали в течение 5 дней при 27°С (встряхивание при 200 об./мин). Затем культуры центрифугировали (5000д, 10 мин) и собирали 500 мкл надосадочной фракции. Из этих образцов белки осаждали с помощью ТСА и ресуспендировали в буфере Шек!егп 8атр1е ВиГГег до 4 мг/мл общего белка (метод Лоури8). 10 мкл (примерно 40 мкг общего белка) загружали в 12%-ный акриламидный-ДСН гель и подвергали электрофорезу (система ВюКай М1ш Тгапк-В1о1). Вестерн-блоттинг проводили в соответствии с инструкциями фирмы ВюКай (мембрана с порами 0,2 мкм: 8сЫе1сйег & 8сйи11) с использованием кроличьей антисыворотки к 8й-Ь1е (Сау1а: № по каталогу АИТ1-0010) в качестве первичного антитела.
Полученные результаты показаны на фиг. 1 и в табл. Р.
Таблица Р. Установленные уровни выработки 8й-Ь1е в С1
Количество δή-Ые по данным Вестернблоттинга Концентрация 81п-Ые, установленная в продукционной среде
Нетрансформирован- ный N070-19 не выявляется
ΝΟ7Ο-19::720, клон 4-1 25 нг 0,25 мг/л
N070-19:1720, клон 5-1 25 нг 0,25 мг/л
N070-19:720, клон 2-2 250 нг 2,5 мг/л
Нетрансформирован- ный υνΐ8-25 не выявляется
υνί 8-25:720, клон 1-2 500 нг 5 мг/л
υνί 8-25:720, клон 3-1 250 нг 2,5 мг/л
Эти данные показывают, что
1) Гетерологичные сигналы транскрипции и трансляции из плазмиды рИТ720 функциональны в Сйгукокропит.
2) Г етерологичная сигнальная последовательность из рИТ720 функциональна в Сйгукокропит.
-19005682
3) Сйгузозрогшт можно использовать в качестве хозяина для секреции гетерологичного бактериального белка.
[2]. С1-секреция лизоцима человека (ΗΕΖ)
С1-штаммы N070-19 и ИУ18-25 были трансформированы плазмидой рИТ97009 Этот вектор включает следующую грибковую экспрессионную кассету:
промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (дрбА) АзрегдШиз шйи1апз2;
синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы-Ι (сЬЫ) Тпсйойегша гее5е11,3; ген резистентности к флеомицину 81-Ь1е 81гер1оа11о1е1сйи5 Ыпйи51апи54, используемый в качестве белка-переносчика;
шарнирный домен глюкоамилазы (д1аА2) АзрегдШиз шдег. клонированный из плазмиды рА№6211’12;
линкерный пептид (ЬОЕКК), соответствующий КЕХ2-протеазоподобному сайту расщепления1; синтетический ген лизоцима человека (11ζ)10;
терминатор триптофансинтазы (1грС) АзрегдШиз шйи1аи55.
Также этот вектор включает ген β-лактамазы (Ь1а) и сайт начала репликации Е.соН из плазмиды рИС186 Подробная карта плазмиды показана на фиг. 3.
Протопласты С1 были трансформированы плазмидой рИТ9700 в соответствии с той же процедурой, уже описанной в примере 1. Химерный белок (81-Ь1е :: шарнир САМ :: ΗΕΖ) функционален в отношении резистентности к флеомицину, позволяя тем самым легко отбирать трансформанты С1. Более того, уровень резистентности к флеомицину в определенной степени коррелирует с уровнем экспрессии 11ζ.
Выработка ΗΕΖ трансформантами С1. (резистентные к флеомицину клоны) анализировали в тесте на активность лизоцима следующим образом. Первичные трансформанты наносили на чашки со средой 08 с флеомицином (5 мкг/мл) (проверка резистентности) и также на чашки ЬУ8О (выявление активности ΗΕΖ по визуально «просветленным» зонам1,10). Чашки выращивали в течение 5 дней при 32°С. Каждый подтвержденный клон субклонировали на чашки ЬУ8О. По два субклона от каждого трансформанта использовали для инокуляции чашек РОА с целью получения спор для инициации жидких культур. Жидкие культуры в среде 1С1 выращивали в течение 5 дней при 27°С (встряхивание при 180 об./мин). Затем культуры центрифугировали (5000д, 10 мин). На материале этих образцов активность лизоцима определяли в соответствии с Мбгзку е! а1.13
Таблица 0. Уровни выработки активного ΗΕΖ в С1
Концентрация активного ΗίΖ в культуральной среде
Нетрансформированный N070-19 0 мг/л
N670-19::9706, клон 4 4 мг/л
N670-19::9706, клон 5 11 мг/л
Нетрансформированный υνί 8-25 0 мг/л
υνί 8-25: :9706, клон 1 8 мг/л
υνί 8-25::9706, клон 2 4 мг/л
υνΐ8-25::9706, клон 3 2 мг/л
υνΐ8-25::9706, клон 2 2,5 мг/л
Эти данные показывают, что
1) Выводы 1 и 2 из примера 1 подтверждены.
2) 81-Ь1е функционален в Сйгузозрогшт в качестве маркера резистентности.
3) 81-Ь1е функционален в Сйгузозрогшт в качестве белка-переносчика.
4) Сайт расщепления КЕХ2-подобной протеазой функционален в Сйгузозрогшт (другой в составе ΗΕΖ не должен быть активен).
5) Сйгузозрогшт можно использовать в качестве хозяина для секреции гетерологичного белка млекопитающих.
[3]. С1-секреция ксиланазы-ΙΙ (ΧΥΝ2) Тпсйойегша гее5е1
С1-штамм ИУ18-25 был трансформирован плазмидами рИТ1064 и РИТ1065.
Плазмида рИТ1064 включает две следующие грибковые экспрессионные кассеты:
Первая кассета позволяет вести отбор трансформантов, резистетных к флеомицину: промотор гена-1 контроля метаболических механизмов (срс-1) №иго5рога сгазза14; ген 81-Ь1е резистентности к флеомицину 8(гер(оа11о(е1сНи8 ЫпбизЕапиз4;
терминатор триптофансинтазы (1грС) АзрегдШиз шби1ап55.
Вторая кассета является кассетой выработки ксиланазы:
-20005682 промотор сЬЫ Т.геезе1 штамма ТР215;
ген хуп2 (включая его сигнальную последовательность) Т.геезе1 штамма ТР216; терминатор сЬЫ Т.геезе1 штамма ТР215.
Этот вектор также включает сайт начала репликации Е.сой из плазмиды риС196. Подробная карта этой плазмиды показана на фиг. 4.
Плазмида рЦТ1065 включает следующую грибковую экспрессионную кассету: промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (дрбА) АзрегдШиз шби1апз2; синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы-1 (сЬЫ) Тпсйобегша геезе11,3; ген резистентности к флеомицину 8й-Ь1е 8.Ыпбиз1апиз4, используемый в качестве белкапереносчика10;
линкерный пептид (8ОЕРК), характеризующий сайт расщепления КЕХ2-подобной протеазой1;
ген хуп2 (без сигнальной последовательности) Т.геезе1 штамма ТР216; терминатор триптофансинтазы (1грС) АзрегдШиз шби1апз5.
Также этот вектор включает ген β-лактамазы (Ь1а) и сайт начала репликации Е.сой из плазмиды риС186. Подробная карта плазмиды показана на фиг. 5.
Протопласты С1 трансформировали плазмидой рЦТ1064 или рЦТ1065 в соответствии с той же процедурой, уже описанной в примере 1. Химерный белок в плазмиде рЦТ1065 (8й-Ь1е :: ΧΥΝ2) функционален по отношению к резистентности к флеомицину, что позволяет легко отбирать трансформанты С1. Более того, уровень резистентности к флеомицину ориентировочно коррелирует с уровнем экспрессии хуп2. В плазмиде рЦТ1064 ген хуп2 был клонирован с его собственной сигнальной последовательностью.
Выработка ксиланазы трансформантами С1 (клоны, резистентные к флеомицину) анализировали с помощью теста на активность ксиланазы следующим образом. Первичные трансформанты наносили иглой на чашки со средой 08 с флеомицином (5 мкг/мл) (проверка резистентности) и также на чашки XΥ^ΑN (выявление активности ксиланазы путем визуализации просветляющихся зон17). Чашки культивировали в течение 5 дней при 32°С. Каждый подтвержденный клон субклонировали на чашки XΥ^ΑN. По два субклона каждого трансформанта использовали для инокуляции чашек РОА с целью получения спор для инициации жидкой культуры. Жидкие культуры в среде 1С1 плюс 5 г/л КРй1а1а!е выращивали в течение 5 дней при 27°С (встряхивание при 180 об./мин). Затем культуры центрифугировали (5000д, 10 мин). В этих образцах активность ксиланазы измеряли с помощью метода ΌΝ8 в соответствии с М111ег е1 а1.18
Таблица Н. Уровни выработки активной ΧΥΝ2 в С1 (наилучшие продуценты)
Концентрация активной ксиланазы-И в культуральной среде Специфическая I активность ксиланазы-ΙΙ в культуральной среде
Нетрансформированный и\/18-25 3,9 ед./мл 3,8 ед./мл общего белка
υνί 8-25:: 1064, клон 7-1 4,7 ед./мл 4,7 ед./мл общего белка
υνί 8-25: :1064, клон 7-2 4,4 ед./мл 4,3 ед./мл общего белка
υνί8-25:: 1065, клон 1-1 29,7 ед./мл 25,6 ед./мл общего белка
υνί 8-25:: 1065, клон 1-2 30,8 ед./мл 39,4 ед./мл общего белка
Эти данные показывают, что
1) Подтверждаются выводы 1-4 примера 2.
2) С1 можно использовать в качестве хозяина для секреции гетерологичного грибкового белка.
[4]. Авторы изобретения также показывают данные по экспрессии трансформированного ЦУ18-25, причем в табл. I приведены результаты для плазмид, которые использовали для трансформации. Эта таблица показывает хорошие уровни экспрессии эндоглюканазы и целлобиогидролазы при использовании гетерологичных регулирующих экспрессию последовательностей и сигнальных последовательностей, но также и с гомологичными регулирующими экспрессию последовательностями и сигнальными последовательностями. Подробности об этих плазмидах можно найти в других частях настоящего описания и на фигурах. Выработку осуществляли при щелочном рН и при температуре 35°С.
-21005682
Таблица I. Данные по экспрессии трансформированного штамма ИУ18-25
Культура Общий белок СМСазе β-глюканаза рН
мг/мл ед./мл ед./мг ед./мл ед./мг
*υνΐ8-25 100% 100% 100% 100% 100% 7,90
1150-23 94% 105% 111% 140% 149% 7,90
-30 96% 105% 110% 145% 151% 8,10
1152-3 94% 112% 120% 147% 156% 7,85
-4 100% 105% 105% 132% 132% 7,90
1160-2 69% 81% 118% 90% 131% 7,90
-4 73% 72% 98% 83% 114% 8,35
-1 92% 95% 103% 120% 130% 8,45
1162-1 102% 105% 103% 145% 142% 8,20
-11 112% 109% 98% 115% 103% 8,20
Е6д-20 104% 102% 98% 130% 125% 7,90
-25 - - - - - -
Условия культивирования (шейкерная колба): 88 ч, 35°С, 230 об./мин.
* - все вышеприведенные значения даны в процентах относительно исходного штамма иУ 18-25
Приложение к примерам: среды
Трансформационные среды:
Основная по Мандельсу: КН2РО4
№)2§О4
Мё8О4-7Н2О
СаС12
Олигоэлементы
МпР
МпР + сахароза
Дрожжевой экстракт
Глюкоза
Агар
Среда МпР:
2,0 г/л
1.4 г/л
0,3 г/л
0,3 г/л
1,0 мл/л
МпР Са2+:
130 г/л
2.5 г/л
2,5 г/л г/л
Основная по Мандельсу пептон - 1 г/л
МЕ8 - 2 г/л сахароза - 100 г/л рН до 5 среда МпР +
СаС12-2Н2О 50 мМ рН до 6,5
МпР 8оИ:
МпР только с 7,5 г/л агара.
МРС:
СаС12 50 мМ рН 5,8
МОР8 10 мМ
РЕО 40%
Для отбора и культивирования: 08: Глюкоза Биосояза Агар 10 г/л 5 г/л 15 г/л [Мепеих] рН должен быть 6,8
РБА:
Картофельный [БИсо];
декстрозный агар 39 г/л рН должен быть 5,5
МР0:
Основная по Мандельсу с
К.РЫа1а1е 5 г/л
Глюкоза 30 г/л
Дрожжевой экстракт 5 г/л
-22005682
Регенерационную среду (МпЯ), дополненную 50 мкг/мл флеомицина или 100-150 мкг/мл гигромицина, использовали для отбора трансформантов. Среду С8, дополненную 5 мкг/мл флеомицина, использовали для подтверждения резистентности к антибиотикам.
ΡΌΑ - это полная среда для быстрого роста и эффективной споруляции. Жидкие среды инокулировали 1/20-й суспензии спор (все споры с одной 90-мм чашки с ΡΌΑ в 5 мл 0,1% Твин). Эти культуры выращивали при 27°С в шейкерных колбах (200 об./мин).
Выделение и характеристика белков С1
Способ получения различных белков описывается с помощью ряда характеристик этих белков. В табл. А, В и 1 представлены подробности, касающиеся схемы очистки и активности. Выделение проводили из культурального фильтрата СНгухохропит с использованием ион-обменной хроматографии на ЭЕАЕ-ТоуореаН аналогично методу, который описан в ν0 98/15633, которая включена здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Несвязанные фракции (Е 60-31 СЕ), полученные на этом хроматографическом этапе, очищали с использованием макропрепаративной ион-обменной хроматографии Масго Ргер О после уравновешивания при рН=7,6. Несвязанную фракцию (ΝΕΝΕ) объединяли и связанные белки элюировали в градиенте 0-1М №С1. Фракция ΝΕΝΕ показала основные белковые бэнды 19, 30, 35 и 46 кД и минорную фракцию 51 кД. В градиенте 0-1М №1С1 белковые пики элюировали из различных фракций. Фракции 39-41 включали белки 28, 36 и 60 кД, фракции 44-48 включали белки 28, 45 и 66 кД в качестве основных белковых бэндов с белками 33, 36, 55, 60 и 67 кД, фракции 49-51 дали белки 30, 36, 56 и 68 кД, а фракции 52-59 включали основные белки 33 и 55 кД и минорные белки 28 и 36 кД. Объединенные фракции ΝΉΝΉ далее очищали с помощью гидрофобной хроматографии на фенилсуперозе. Фракцию ΝΕΝΕ уравновешивали с помощью 0,03М №1-фосфатного буфера - рН=7,0, содержащего 1,2М (ΝΗ4)2804, и загружали на колонку. Адсорбировавшиеся белки элюировали в градиенте 1,2-0,6М (ΝΗ4)2804. Таким образом, гомогенные ксиланазы с молекулярными массами 30 и 51 кД и р1 9,1 и 8,7, соответственно, были получены, равно как и протеаза 30 кД с р1=8,9.
Ксиланазы не проявляли МИЕ-целлобиазной активности и, следовательно, являются истинными ксиланазами. Щелочная ксиланаза 30 кД (р1=9,1) проявляла высокую активность в очень широком диапазоне рН=5-8, сохраняя 65% от максимальной активности при рН=9-10; она относится к семейству ксиланаз Е; ее частичные нуклеотидная и аминокислотная последовательности показаны в 8 ЕС ΙΌ Ν0 5. Приведенная частичная аминокислотная последовательность соответствует примерным аминокислотам 50-170 от Ν-конца зрелого белка. Ксиланазы по настоящему изобретению характеризуются по крайней мере 60%-ной, предпочтительно по крайней мере 70%-ной, наиболее предпочтительно по крайней мере 80%-ной идентичностью последовательностей по отношению к частичной аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ Ν0 5. Соответствующий ксиланазный промотор, который является предпочтительным вариантом настоящего изобретения, может быть идентифицирован с использованием частичной нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Ν0 5. Ксиланаза 51 кД (р1=8,7) проявляет максимальную активность при рН=6 и сохраняет по крайней мере 70% активности при рН=7,5, и сохраняет по крайней мере 50% активности при рН=8,0. Она не очень стабильна при активности только 15% при рН=5,5 и 4% при рН=7,5. Константа Михаэлиса в отношении ксилана березы составила 4,2 г/л для ксиланазы 30 кД и 3,4 г/л для ксиланазы 51 кД. Температурный оптимум был высоким и был равен у обеих ксиланаз 70°С.
Активность протеазы 30 кД, измеренная в отношении белков фракции ΝΕΝΕ, по-видимому, равна 0,4х10-3 ед./мл при 50°С и рН=7,90. Эта фракция проявляла активность в отношении красильного казеина на уровне 0,4 условных единиц на мг (рН=7). Добавление мочевины, как хаотрофного агента, приводило к 2-3-кратному увеличению активности протеазы. Влияние протеазы на активность ксиланазы было существенным. Только 30% ксиланазной активности сохранялось при рН=10,3 и 50°С после 30-минутной инкубации. При рН=8 сохранялось 95% ксиланазной активности. Добавление ЬА8 приводило к резкому снижению ксиланазной активности при рН=8 и 10,3 при наличии только 50% ксиланазной активности через 10 мин инкубации с протеазным ингибитором РМ8Е или без него. Протеаза 30 кД была щелочной при оптимуме рН 10-11. Ее активность подавлялась фенилметилсульфонилфторидом (РМ8Е), но не иодуксусной кислотой, пепстатином-А и ЭДТА, что характеризует ее как протеазу серинового типа. Эта протеаза неактивна в отношении белков С1 при нейтральном рН и при 50°С в отсутствие хаотрофного агента. Увеличение рН и добавление хаотрофных агентов, таких как ЬА8, ДСН и мочевина, в существенной степени усиливает протеолиз.
Фракция 39-41 была очищена с помощью гидрофобной хроматографии на фенолсуперозе. Фракции уравновешивали с 0,03М №1-фосфатного буфера, рН=7,2, содержащего 1,5М (ΝΗ4)2804, и загружали на колонку. Адсорбировавшиеся белки элюировали в градиенте 1,5-0М (ΝΗ4)2804. Таким образом была получена гомогенная ксиланаза с молекулярной массой 60 кД и р1=4,7. Эта ксиланаза проявляла активность в отношении ксилана, МИЕ-целлобиозы, МИЕ-ксилозида и МИЕ-лактозида. Предположительно эта ксиланаза относится к семейству 10 (семейство Е). Эта ксиланаза была стабильной при рН от 5 до 8 в течение 24 ч и сохраняла более 80% активности при 50°С. Она сохраняла 70% активности при рН=5-7 при 60°С. Она сохраняла 80% активности в течение 5 ч и 35% в течение 24 ч при 50°С и рН=9. При рН=10 60% активности сохранялось при 50°С и получасе инкубации. Было установлено, что имеющиеся 45% активности через 5 ч инкубации при рН=8 и 60°С через 24 ч снижались до 0. Она имела оптимум рН в
-23005682 диапазоне рН=6-7 и удерживала 70% активности при рН=9 и 50% своей активности при рН=9,5. Константа Михаэлиса в отношении ксилана березы составила 0,5 г/л. Температурный оптимум был высоким, равным 80°С.
Фракция 44-48 была затем очищена методом хроматофокусирования на Мопо-Р. Для элюции белков использовали градиент рН 7,63-5,96. В результате была выделена эндоглюканаза 45 кД с р1=6. «45кД эндо» имела максимум активности при рН=5 в отношении СМС и при рН=5-7 в отношении КВВСМС. «45-кД эндо» сохраняла 70% от своей максимальной активности в отношении СМС при рН=6,5, и 70% от своей максимальной активности в отношении КВВ-СМС сохранялось при рН=7,0; 50% от ее максимальной активности в отношении СМС сохранялось при рН=7, и 50% от ее максимальной активности в отношении КВВ-СМС сохранялось при рН=8. Константа Михаэлиса в отношении СМС составила 4,8 г/л. Температурный оптимум был высоким и составлял 80°С. Другие белки - 28, 33, 36, 55, 60 и 66 кД были элюированы в смеси друг с другом.
Фракцию 52-58 очищали методом хроматофокусирования также на Мопо-Р в градиенте рН=7,6-4,5. Была выделена отдельная эндоглюканаза 55 кД с р1=4,9. «55-кД эндо» была нейтральной. Она проявляла широкий оптимум рН в диапазоне 4,5-6, и 70% активности сохранялось при рН=7,0 в отношении и СМС, и КВВ-СМС, и 50% активности сохранялось при рН=8 и для СМС, и КВВ-СМС. Константа Михаэлиса в отношении СМС составила 1 г/л. Температурный оптимум был высоким и составлял 80°С. Ряд фракций также содержал белки с молекулярной массой 28, 33 и 36 кД.
Белки 45, 48 и 100 кД были выделены из связанных на ИЕАЕ-Тоуореаг1 фракций Р 60-8 ИР еопе культуры СНгузозрогшт из фракций 50-53 с использованием хроматографии Маего Ргер О.
Фракцию 50-53 уравновешивали 0,03М буфера имидазол-НС1, рН=5,75, и загружали на колонку, а адсорбировавшиеся белки элюировали в градиенте 0,1-0,25 М №1С1 в течение 4 ч. В результате в виде гомогенных компонентов были выделены белки 45 кД (р1=4,2), 48 кД (р1=4,4) и 100 кД (р1=4,5) (фиг. 17).
Белок 45 кД предположительно является α, β-галактозидазой, на что указывает его активность в отношении п-нитрофенил-а-галактозида и п-нитрофенил-в-галактозида. Оптимум рН составил 4,5: 70% активности сохранялось при рН=5,7 и 50% его активности сохранялось при рН=6,8. Температурный оптимум составил 60°С (фиг. 18).
Белок 48 кД являлся целлобиогидролазой, проявлявшей высокий уровень активности в отношении п-нитрофенил-в-галактозида, а также активность в отношении МИР-целлобиозида, МИР-лактозида и пнитрофенилбутирата. Белок 48 кД имел оптимум рН=5 в отношении СМС и 5-6 в отношении КВВ-СМС (фиг. 19).
Белок 100 кД с р1=4,5 проявлял активность только в отношении п-нитрофенилбутирата. Предположительно он является эстеразой, но не ферулоилэстеразой, поскольку он не проявлял активности в отношении сложного метилового эфира феруловой кислоты. Он имел нейтральный/щелочной оптимум рН (рН=8-9) и температурный оптимум 55-60°С (фиг. 20, 21).
Протеаза 90 кД с р1=4,2 была выделена из связанной фракции, и ее активность, измеренная в отношении белков фракции ΝΡΝΡ. оказалась равной 12х10-3 ед./мл при 50°С и рН=7,90. Эта фракция проявляла активность в отношении красильного казеина на уровне 0,01 условных ед./мг (рН=7). Добавление мочевины в качестве хаотрофного агента приводило к 2-3-кратному увеличению протеазной активности, как и добавление ЬА8 при рН и 7, и 9 (50°С). Протеаза 90 кД была нейтральной при оптимуме рН на уровне рН=8. Активность подавляется фенилметилсульфонилфторидом (РМ8Р), но не иодуксусной кислотой, пепстатином-А и ЭДТА, что характеризует ее как протеазу серинового типа.
Также из связанной фракции были выделены эндоглюканаза 43 кД с р1=4,2 (фракция 33-37) и эндоглюканаза 25 кД с р1=4,1 (фракция 39-43), целлобиогидролаза 55 кД с р1=4,9 (фракция 39-43) и полигалактуроназа 65 кД с р1=4,4 (фракция 39-43). Эндоглюканазы не проявляли активности в отношении авицеля или МИР-целлобиозида, но проявляли высокую активность в отношении МС, КВВ-СМС, СМС41, β-глюкана и эндоглюканазы. «25-кД эндо» не вырабатывала глюкозы из СМС, что отмечено для «43-кД эндо». Не образовывалась глюкоза из авицеля. Оптимум рН для белка 43 кД составил 4,5 при сохранении 70% максимальной активности при рН=7,2 и 50% при рН=8. «43-кД эндо» сохраняла 70% активности при рН=5-6 в течение 25 ч инкубации. Она удерживала только 10% при рН=7 в течение такого периода инкубации. «25-кД эндо» имела оптимальную активность при рН=5 в отношении СМС и широкий оптимум рН для активности в отношении КВВ-СМС при сохранении 70% максимальной активности при рН=9 и 50% максимальной активности при рН=10. Она сохраняла 100% активности при рН=5-6 и 80% при рН=7, 8, 8,6 и 9,6 в течение 120 ч инкубации. «25-кД эндо» имела температурный оптимум активности при 70°С. «43-кД эндо» имела температурный оптимум активности при 60°С. Константы Михаэлиса в отношении СМС составили 62 и 12,7 г/л для эндоглюканаз 25 и 43 кД, соответственно. Полигалактуроназа является пектиназой. Константа Михаэлиса в отношении РСА составила 3,8 г/л. Оптимум рН активности РСИ находится в пределах рН=5-7 и температурный оптимум - 50-65°С.
Гены, кодирующие белки С.1иекпотееи5е, были выделены с использованием ПЦР и охарактеризованы путем секвенирования. Соответствующие полноразмерные гены были получены путем (частичного) скрининга генных библиотек с использованием выделенных ПЦР-фрагментов. Полный ген эндоглюкана
-24005682 зы 43 кД (ЕС6, семейство 6) штамма С1 был клонирован, секвенирован и проанализирован (включая промоторный участок длиной 2,5 т.п.н. и терминаторный участок длиной 0,5 т.п.н.). Его нуклеотидная и аминокислотная последовательности приведены в 8ЕО ΙΌ N0 1. Предсказанная молекулярная масса зрелого белка - 39427 Д, а предсказанная р1=4,53: эти величины хорошо согласуются с данными измерений. Анализ сопоставления белков с другими гликозилгидролазами семейства 6.2 показывает, что С1-ЕС6 не включает целлюлозосвязывающий домен (СВЭ). Анализ гомологии с использованием программы δνίκ5Рго1 БЛМВЛ (алгоритм по Смиту-Уотерману; установки: дар реиайу - 12/2; аНдпшегИ - 10; В1окит62 та1пх) показывает, что С1-Е66 на 51,6% идентичен Е6-В Еикалит охукрогит (по 376 аминокислотам), на 51,0% идентичен СВН3 шампиньона Лдалсик Ыкрогик (по 353 аминокислотам) и на 50,7% идентичен СВН2 ТпсНобегта гееке1 (по 367 аминокислотам). Предполагаемая сигнальная последовательность простирается от метионина-1 до аргинина-28. Промотор включает несколько потенциальных СгеАсвязывающих сайтов, поэтому весьма вероятно, что этот промотор будет подвержен глюкозной репрессии в грибковом штамме с действующей СгеА-регуляцией.
Сходным образом полный ген эндоглюканазы 25 кД (ЕС5, семейство 45) штамма С1 был клонирован, секвенирован и проанализирован (включая промоторный участок длиной 3,3 т.п.н. и терминаторный участок длиной 0,7 т.п.н.). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности приведены в 8Е0 ΙΌ N0
2. Предсказанная молекулярная масса зрелого белка - 21858 Д, а предсказанная р1=4,66: эти величины хорошо согласуются с данными измерений. Это наименьшая из грибковых эндоглюканаз, известных к настоящему времени. Анализ сопоставления белковых последовательностей с другими гликозилгидролазами семейства 45 показывает, что С1-ЕС5 не включает ни целлюлозосвязывающего домена (СВЭ), ни домена типа «когезин/докерин». Анализ гомологии с помощью программы Ж'.'В1-ВЕЛ8ТР2 (установки: дар репаНу - 11/1; аНдпшегИ - 10; В1окит62 та1п.х) показывает, что наибольший уровень гомологии с белком С1-Е65 проявляет Е6-К Еикалит охукрогит: 63% идентичности. Предполагаемая сигнальная последовательность простирается от метионина-1 до аланина-18. Промотор включает множество потенциальных СгеА-связывающих сайтов, поэтому очень вероятно, что этот промотор будет подвержен глюкозной репрессии в грибковом штамме с действующей СгеА-регуляцией.
Более того, еще одна эндоглюканаза была обнаружена с помощью ПЦР при проведении анализа гомологии с целлюлазами семейства 12. Частичные нуклеотидная и аминокислотная последовательности этой дополнительной эндоглюканазы (ЕС3, семейство 12) даны в 8Е0 ΙΌ N0 3.
Белок 55 кД является целлобиогидролазой (в данном тексте обозначен как СВН1) с активностью в отношении к МиЕ-целлобиозида, МиЕ-лактозида, ЕР и авицеля, а также в отношении п-нитрофенил-βглюкозида, целлобиозы и п-нитрофениллактозида. Ее активность в отношении МиЕ-целлобиозида подавляется целлобиозой. Константа ингибирования была определена на уровне 0,4 мМ. Константа Михаэлиса в отношении МиЕ-целлобиозида составила 0,14 мМ, в отношении МиЕ-лактозида - 4 мМ, и в отношении СМС - 3,6 г/л. Оптимум рН достаточно широк - 4,5-7. При рН=8 удерживается 50% максимальной активности в отношении СМС и 80% активности в отношении РВВ-СМС. При рН=5-8 70-80% активности сохраняется в течение 25 ч инкубации. Температурный оптимум - 60-70°С. Предположительно СВН1 входит в семейство целлобиогидролаз 7; ее частичные нуклеотидная и аминокислотная последовательности показаны в 8Е0 ΙΌ N0 4. Приведенная частичная аминокислотная последовательность примерно соответствует аминокислотам 300-450 ^концевой части зрелого белка. Целлобиогидролаза по настоящему изобретению характеризуется по крайней мере 60%-ной, предпочтительно по крайней мере 70%-ной, наиболее предпочтительно по крайней мере 80%-ной идентичностью последовательностей по сравнению с частичной аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0 4. Соответствующий промотор СВН, который является предпочтительным вариантом настоящего изобретения, может быть идентифицирован с использованием частичной нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0 4. В процессе гидролиза авицеля был установлен эффект синергизма между эндоглюканазой 25 кД и СВН 55 кД. Максимальный коэффициент синергизма имелся при отношении «25-кД эндо» и СВН 55 кД - 80:20. Максимальный Ккуп составил 1,3.
В табл. А, В и I показаны подробности описанного выше.
-25005682
Таблица 1
Схема очистки
Очистка образцов Р 60 8 (ИР-сопс) и Р 60-31 СР
Культуральным фильтрат
Хроматография на ϋΕΑΕ- Тоуореаг!
Уровень экспрессии пяти основных генов Сйгукокрогшш был изучен с помощью Нозерн-блоттинга. Различные штаммы С.1искпо\\'еп5е выращивали в обогащенной культуральной среде, содержащей Р11агшеб1а с целлюлозой и лактозой (среда 1), или в обогащенной среде, содержащей Р11агшеб1а с глюкозой (среда 2), при 33°С. Через 48 ч собирали мицелий и выделяли РНК. РНК гибридизовали с 5 различными зондами: Е65, Е66, Е63, ХуЬР и СВН. После обработки Нозерн-блоты разрезали на полосы и вновь гибридизовали с зондом к рибосомному белку Ь3, являющемуся контролем количества мРНК на блоте. Большинство штаммов показали очень высокий уровень ответа на СВН и высокий уровень ответа на ХуЬР в среде 1; в среде 2 половина штаммов показала высокий уровень ответа на все гены, а другая половина проявила слабые ответы. На основании этих данных был определен следующий порядок уровней экспрессии: СВН>ХуЬР>ЕС5>ЕС3>ЕС6.
Табл. А, В и I иллюстрируют подробности описанного выше.
Описание чертежей
Фиг. 1 - Вестерн-блот, описанный в примерах.
Фиг. 2 - карта рИТ720.
Фиг. 3 - карта рИТ9706.
Фиг. 4 - карта рИТ1064.
Фиг. 5 - карта рИТ1065.
Фиг. 6 - карта рР6д.
Фиг. 7 - карта рИТ1150.
Фиг. 8 - карта рИТ1152.
Фиг. 9 - карта рИТ1155.
Фиг. 10 - карта рИТ1160.
Фиг. 11 - карта рИТ1162.
Фиг. 12 - ион-обменная хроматография на Масго Ргер О фракции ΝΒ после ИЕАЕ-Тоуореаг1 образца Р-60-31 СР.
Фиг. 13 - зависимость от рН активности ферментов фракций ΝΒ образца Р-60-31 СР.
Фиг. 14 - стабильность ферментов из фракции ΝΒ образца Р-60-31 СР при рН=5,5 и 7,5 (60°С). Фиг. 15 - рН-стабильность при 60°С и 50°С Ху1 60 кД (р1=4,7) из фракции ΝΒ образца Р-60-31. Фиг. 16 - зависимость от температуры ферментов из фракции ΝΒ образца Р-60-31.
Фиг. 17 - ион-обменная хроматография на Масго Ргер О связанных фракций 50-53 после ЭЕАЕТоуореаг1 образца Р-60-8.
Фиг. 18 - зависимость активности α-галактозидазы из Р-60-43, ИР-сопс от рН и температуры.
Фиг. 19 - зависимость активности СВН 48 кД (р1=4,4) из связанных фракций Р-60-8 ИР-сопс от рН.
Фиг. 20 - зависимость активности в отношении п-нитрофенилбутирата образца Р-60-8 ИР-сопс от температуры.
Фиг. 21 - зависимость активности в отношении п-нитрофенилбутирата образца Р-60-8 ИР-сопс от рН.
Фиг. 22 - связь с рН активностей протеаз 30 кД (р1=8,9) и 90 кД (р1=4,2) в отношении белков С1 (50°С, 30 мин инкубации).
Фиг. 23 - влияние «щелочной» протеазы 30 кД (р1=8,9) на ксиланазную активность фракции ΝΒΝΒ (Масго Ргер О) Р-60-31 СР при 50°С.
-26005682
Фиг. 24 - влияние «нейтральной» протеазы 90 кД (р1=4,2) на СМСазе-активность белков из связанной фракции 44-45 (ИЕАЕ-ТоуореагГ) образца Р 60-8 ИУ-сопс при 50°С.
Фиг. 25 - полный гидролиз полигалактуроновой кислоты действием полиагалактуроназы 65 кД (р1=4,4): 50°С, рН=4,5; концентрация РОА - 5 г/л, концентрация белка - 0,1 г/л.
Фиг. 26 - зависимость активности полигалактуроназы Р-60-43 ϋΡ-сопс от рН и температуры.
Фиг. 27 - подавление активности СВН 55 кД (р1=4,4) в отношении МИР-целлобиозида целлобиозой: рН=4,5, 40°С.
Фиг. 28 - эффект синергизма между 25 кД эндо (р1=4,1) и 55 кД СВН (р1=4,4) в отношении авицеля (40°С, рН=5, 25 мин).
Фиг. 29 - полный гидролиз СМС (а) и авицеля (Ь) ферментами, выделенными из связанной фракции образца Р-60-8 ИР-сопс (50°С, рН=5): концентрация СМС и авицеля - 5 г/л, концентрация 25 кД эндо 0,01 г/л, концентрация 43 кД эндо - 0,02 г/л; 1-25 кД эндо (р1=4,1), 2 - 43 кД эндо (р1=4,2).
Фиг. 30 - полный гидролиз СМС (1) и авицеля (2) действием СВН 55 кД (р1=4,4) без (а) и с (Ь) глюконо-δ-лактоном (50°С, рН=4,5): концентрация СМС и авицеля - 5 г/л, концентрация белка - 0,1 г/л, концентрация глюконо-δ-лактона - 5 г/л.
Фиг. 31 - рН-зависимость СМСаке и РВВ-СМСаке у ферментов, выделенных из образца Р-60-8 ИРсопс: 1-25 кД эндо (р1=4,1), 2-43 кД эндо (р1=4,2).
Фиг. 32 - рН-зависимость СМСаке и РВВ-СМСаке активности у СВН 55 кД (р1=4,4).
Фиг. 33 - зависимость от температуры СМСаке активности (рН=4,5) у ферментов, выделенных из связанных фракций образца Р-60-8 ИР-сопс: 1-55 кД СВН (р1=4,4), 2-25 кД эндо (р1=4,1), 3-43 кД эндо (р1=4,2).
Фиг. 34 - рН-стабильность (50°С) ферментов, выделенных из связанных фракций образца Р-60-8 ИР-сопс: 1-55 кД СВН (р1=4,4), 2-25 кД эндо (р1=4,1), 3-43 кД эндо (р1=4,2).
Фиг. 35 - адсорбция ферментов, выделенных из связанных фракций образца Р-60-8 ИР-сопс. Библиография (ее содержание включено здесь для сведения)
1. Са1те1к Т.Р., Магйп Р., Иигапб Н., апб ТпаЬу О. (1991) Рго!ео1уДс еуеп!к т Не ргосекктд оГ кесге!еб рго!ешк ш Гипдг 1. Вю1есЬпо1. 17(1): р. 51-66.
2. Рип! Р.1, Итдетапке М.А., .ТасоЬк-Меуктд ВД., Рои\\'е1к Р.Н., апб уап беп Нопбе1 С.А. (1988) 1ко1а11оп апб сЬагаскпхаДоп оГ Ле §1усега16еНу6е-3-рНокрГа1е беЬубгодепаке депе оГ АкрегдШик шби1апк. Оепе 69(1): р. 49-57.
3. 8Ьоетакег 8., 8сЬетеккаг! V., Дабпег М., Ое1Гапб Ό., Клгок 8., МуатЬо К., апб 1птк М. (1983) Мо1еси1аг с1ошпд оГ ехо-се11оЫоЬубго1аке I бепуеб Ггот ТпсЬобегта гееке1 кДаш Д27. Вю/ТесЬпо1оду Ос!.:691-696.
4. Игосоиг! Ό., Са1те1к Т., Реупек ДР., Вагоп М., апб ТпаЬу О. (1990) СаккеИек оГ Ле 81герЮа1кЮкЬик Ыпбик1апик Ь1е депе Гог ДапкГогтаДоп оГ 1о\гег апб ЫдЬег еикагуо!ек !о рЫеотусш гек1к!апсе. Νυс1е1с Ас1бк Рек 18(13): р. 4009.
5. Ми11апеу ЕД., Натег !Е., РоЬегД К.А., Уе1!оп М.М., апб Т1тЬег1аке А.Е. (1985) Рптагу к!гис!иге оГ Ле !грС депе Ггот АкрегдШик шби1апк. Мо1.Оеп. Оепе!. 199(1): р. 37-45.
6. УатксЬ-Реггоп С., У1е1га 1., апб Меккшд 1. (1987) 1тргоуеб М13 рЬаде с1ошпд уес!огк апб Бок! кДашк: пис1ео!1бе кеуиепсек оГ Ле М13тр18 апб рИС19 уес!огк. Оепе 33:103-119.
7. Иигапб Н., Вагоп М., Са1те1к Т., апб ТпаЬу О. (1988) С1акк1са1 апб то1еси1аг депеДск аррИеб !о ТпсНобегта гееке1 Гог Ле ке1есДоп оГ тргоуеб се11и1о!у!1с тбик!па1 к!гатк, ш ВюсЬеткДу апб депеДск оГ се11и1оке бедгабаДоп, ДР. АиЬег!, ЕбЬог. Асабетк Ргекк, р. 135-151.
8. До\\гу О.Н., РокеЬгоидЬ Ν.Ι, Рагг АЛ., апб Рапба11 РД. (1951) Рго!ет теакигетеп!к \νίΛ Ле ГоИп рЬепо1 геадеп!. 1. Вю1. СЬет.: 193-265.
9. РатсЬе М., Воиккоп 1С., Вагоп М., апб ТпаЬу О. Иеуе1ортеп! оГ Де!его1одоик рго!ет кесгеДоп кук!етк ш Г11атеп!оик ГипдД ш 3гб Еигореап СопГегепсе оп Рипда1 ОепеДск. 1996. Мипк!ег, Оегтапу.
10. Вагоп М., ТпаЬу О., Са1те1к Т., РатсЬе М., апб Иигапб Н. (1992) ЕГДскп! кесгеДоп оГ Нитап 1укохуте Гикеб !о !Ье 8Ь Ь1е рЬ1еотуст гек1к!апсе рго!еш Ьу !Ье Гипдик То1урос1абшт деобек. 1. Вю!есЬпо1. 24(3): р. 253-266.
11. Кепек ИД, Магсхтке В., МасКепхк И.А., апб АгсЬег И.В. (1993) А !гипса!еб д1исоату1аке депе Гикюп Гог Ье!его1одоик рго!еш кесгеДоп Ггот АкрегдШик шдег. РЕМ8 МкгоЬюД ДеИ. 107(2-3): р. 267-271.
12. 8!опе РД., МакоГГ АД., РапкЬ кН., апб РабГогб А. (1993) С1ошпд апб кес.|иепсе-апа1ук1к оГ !Ье д1исоату1аке депе оГ пеигокрога-сгакка. Сиггеп! ОепеДск 24(3): р. 205-211.
13. Мбгкку Р. (1983) ТшЫЛтеДк бекгттаДоп оГ 1укохуте \νίΛ Мкгососсик 1укобе1кДсик се11к: РеехаттаДоп оГ геасДоп сопбШопк. Апа1уДса1 ВюсЬет. 128:77-85.
14. Ра1иЬ Ш, ОгЬасЬ МД., ДедеПоп Т.Д., апб УапоГкку С. (1988) ТЬе сгокк-раЛгау соп!го1 депе оГ №игокрога сгакка, срс-1, епсобек а рго!еш ктШаг !о ОСШ оГ уеак! апб !Ье ^NА-Ь^ηб^ηд боташ оГ !Ье опсодепе ууип-епсобеб рго!ет. Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 85(11); р. 3728-32.
15. Шкап Т., Оппе1а М.Д., 11теп М., №уа1ашеп К., апб Реп!Д1а М. (1994) Рипда1 ргото!егк асДуе ш !Ье ргекепсе оГ д1исоке. Ра!еп! #АО 94/04673, А1ко.
-27005682
16. Тоггопеп А., Масй К.Ь., Меззпег К., 6опха1ех К., Ка1кктеп Ν., Нагкк1 А., апб КиЫсек С.Р. (1992) Т11е 1\\о та|ог ху1апа§е§ 1'гот Тпсйобегта геезей с11агас1сп/айоп о! Ьо(Ь епхутез апб депез. Вю1есйпо1о§у (ΝΥ) 10(11): р. 1461-5.
Последовательности Сйгузозрогшт
5Е010 Νο 1:
С1-ЕС6 43 кД (семейство 6}, полученный с помощью ПЦР на основе секвенврованвя балка ”43 кД зндо и анализа гомологии с целлюлазами семейства 6
- 2 5 0 8 (ЗСАТССАСАССТАССАТАСССОАТАСТАТССТАСССААСТеАСАТАЕО СТТОСТЛААОТААТАСОАСААСТСАОАОАССАСТССССАТАТСОСТССССААТеАССТСА АСТОССАССТСАаСТТТСССАСАСАСАССТОАСССССТСССАТСТСТОАСАТССААСССС СССЗОАТССССТТСТТСАТТААТТАТАСССААСТАСССАССААОСТТТСАССААТТОАССЗТ ОАССОТАСАТТААААССТСТАТСАТТТСАООААСЗАСОАаССАТССАССАССТТТСААСЗаС ТСААТСССТТСЗАСОАСТТААССАСССААССАССААТСАААСААТСААААаТОСбССЗАТСА ТТСТССССССТССТССТАТСТСОАСТСТТАААСААСССССТТСТАСССАСОАССТАААСА ССТССААТТТССТСТСТТСАССТТААСССАСАТАТСТСААСАТСААТАСАТСТСАСССАТ АСТСАСССТСАТСТТСТТСАТСАСТССАСАСАСТТТТСАСТТСАССАТОТТСАТТССТСА ТССАТАТСАСТТТССАГГАСТАТСТСТТТАТСТССТТСаТСААСАСТССААССААСССАТ АОСТСАССАТСССТаАСССТСССТСААССТАССАААСТАаССАТСАТСАСССАССТСТа; ОААТСОСССССТСССССАТСТСАСТССТССААСТССАСС!ОТАС(ЗАС(ЗАСАССАС6ТСАСА ТТСАСССАССАСОСТТСААСААаСАОАСАОСОАСАССТСТТаСТАСССОААТССТСаСАС ТаСАТССАСАСаССТСТСАССАСаТТТССССААССАТСАСССССТОСТССОССТТСТССА АСАААСААОТССААСАСАААААСЗААСССАААСООАААСССАСССАССЗССАТССАССАССО ОАТТ(ЗТСССАСОООвАССТССЮССАСТСААСССГГТССССТОССС(ЗТСАССТСССТССС(ЗА ССЗСОСАТТСАССАСАТСТСАССТТАТАОСССАССТСАТСССССТТСССТСТТаТССОСТС СТТССТССаТСССОАОТАСССАОСССТССССаООССТТТАОССООааСООААТСАОАСЗТС ААСАТССССССаААТТОСАССССАСАСХЗААСТТТСОТАСАаССТСАТОАТССССАСТаАС САСАСССАССССТСССТОАТССССЗТОаСССТСввСТООСААТТОСССССТААТААТСТАС СССТТААТАСАТАТССАСТ1ТССАССС(ЗСТ(ЗСАСАТАААТАА(ЗСТСТССТТТСАААСАСТ ССССТСССТАСТТТАСССАССААСТСССССТТАССаСССССАССТСАСТСТТСССАСТСС ССССАСССССАбССАССТСОССТТАбСОТАСАСАСОАССССТССАТСССЗСССАТСССССС ТССАТСССТТСАТАСТСТАССАСАСАСССТСААСТССАААТСТОССТСАТССТТОАТСАС АТСАСАСССАССССССТС6СС0ССАСССС0ССТАТССАТССССААТТСАСААСАСТСТСА ССТСТАТТССОАСССАТСООАТААААСААСААОАААААААТОСАССТТОАСТАССССССТ САСАААССАААААААААСТССОСААССАААТАТСТСОСССАТССССССССТаААСаАССС СТАСТССССаТТСССТТСТТСаСАААСА&ААСССТАСАСАСССТТТТСТССТТТаТСААА САСТТСССАСЗОТССТСТОСТССОСОААТаССТОСТаААСССАССАОСАСССАТТСТТСТГ ССАТаССТОССаСАСССТТАаССССТСАТССАСАТаССаАССТТСССАССТСАСАССТОС АССАСАСССТТОССАСОАССААООСОСТССССТСССССТСАСОаТСааАССССААТХЗАСТ ТССССАААСОООСАСАТСаАОССТССТССАТСАТССТССАААСТАСТТССАСТАТСаСАА СТАСССССвСТТОССАСОААССОТТаТТСаОССССССАСАТТТТСТСТСТСССАТСТСАА СТСТСТСТССЗТТССАСАСТТССТаССТССОССССССССТССААТТСССТААССаСАССаС <ЗС<ЗЕСАТСОССТаТААСТААСТТССАААТ<ЗААВСССаАТАТСАСа<ЗАСЗСЗСАаАТТа<ЗАТС Т<ЗаСАА<ЗССАОССАТТСОСТаСаАТССЕСАСТСОТСС<ЗТСАСССССаСАаТССАТАТССС САААСССААСТССТСООСОСеЕСТСААаТСТТСТТСССААСОТССАасссОААСЕСОССС аССАССАССЕЕСССТАТСТТССТСАТТССеАТССТаЗАТСТССАОАОАССЕВТСАССТСС сстсаАаоАсоотасАОосасАТСЕВсттсвсттсстАСА&стссоасствтстстаатс ААЕССаАЕААССССССССССССААССТСССТСТССССССАСТСАСССАТССССТТТАССС СССТСССССССАВТАТАТААААСАТСВССАТССТСТССТССТСТССТТСССААОАААВаА ТСТСТССАССАТаСАССАСАСССТАаСТСТААСССАССТТаТСЕТСТСТТаТТССССАаС
-421 -361 -301
-241 -181 -121
-61 -1
-2461 -2401 -2341 -2281 -2221 -2161 -2101 -2041 -1981 -1921 -1861 -1801 -1741 -1681 -1621 -1561 -1501 -1441 -1381 -1321 -1261 -1201 -1141 -1081 -1021 -961 -901 -841 -781 -721 -661 -601 -541 -481 агеА сгеА сгеА сгеА сгеА сгеА сгеА ансцяацяя транскрипция
АТОААСТТССТССАОТССОССАСССТОвССЗТТСССССССАССССССТСаСТССССССТСа М К Г V о Ξ А Т Ь А Г А А Т А Ъ А А Р Ξ + 6θ предполагаемая сигнальная + и лоследоавтельностк
СССАССАСТССССАОААССССССССАбСССТССЕСССССТЕСесСТССССССТСЗАСЕСТС КТТРОКРК ОАЗАССАЕАУТЬ +120
САТСССАССАССААССТСТТССАССАСТАСАСССТЕСАССССААСААСТТСТАССОТССС ϋΑ3ΤΝνΡΟΟΥΤΒΗΡΝΝΡΥΚΑ + 180
САССТССАСССТОССаСССАО<ЗССАТСТСССАСТС<3<ЗСССТС<ЗСССАСАА<ЭаСССаСААС ЕУЕАААЕАХЗОЗАЬАЕКАНК +240
СТССССаАСОТСССТАССТТССТЕТСЗСТСЕАСАССАТСаАЕААСАТТОаССаССТОаАЕ νΑΠνστΡΕΜΕΟΤΙΕΝΙΟΚΙίΕ + 300
100
СССССССТСЕАСОАССТССССТССбАОААСАТССТСаЕТСТССТСАТСТАСОАССТСССС
РАЬЕОУРСЕЫ1УСЬУ1УОЬР + 360
120
СССССТ<ЗАСТаСЕССВССАА<ЗСССТССААСЕ<ЗСОАОСТСААССТСС<ЗСС1АССТС<5АСАСС СКОСААКАЗЫСЕЬК17СЕЪОК + 420
140
ТАСААСАССЕАВТАСАТССАСАдСдадЬХаасссЬЬЬдЬддсессЬЬсЬЬЬЬсссссдад
Υ К Т Е Υ I О
480 1-ΙΐΙΗΤρΟΗ
147 ададсдСсЁддССдадиддддФФдйдадададааааФддддсдадсййааадасФдасдй.
+540 дЬЬддс(;сдсадА(ЗАТССССЕАЕАТССТСАА<ЗаСССАСТССААСАСааССТТСССССТСС
К1АЕ1ЬКАНЗЫТАРАЬ + 600
163
ТСАТССАСССССАСТСЕСТССССААССТССТСАССААТАСССАССТаСАСАССТЕССАСС νίΕΡΟ^ΕΡΝϋντΝ^οΑΟταο + 660
183
-28005682
АОАССЙСТТССаССТАСССССАСССТСТСаССТАТаСССТСААССАаСТСААССТССССА ОЗАЗСУКЕСУАУАЬКОЬЫЬР + 720
203
АсотаатсАтатАСАТсоАтсссаассАсостасстаастсаастоваАссссААСстсА ЫУУМУТОАаНССИЬСНСАКЬ + 780
223
АСССССОСССССАаСАССТССССАССОТСТАСААаТСТаСТСХЗТТСОСССТСаСААаТСС КРаАОЕЬАЗУУКЗАОЗРЗОУ + 840
243
СССОТАТСТССАССААСОТОССТОаТГСЭОААССССТОдЬаадасасесСаедесссссес καί ΒΤΝνΑαΜΝΑΜ + 900 2-»нтрон
256 д Есдд£ саа£ддсдадсддааХддсдС,д.аааСдсаХддСдсСдассС ϋ Сдаюсь БСХссс + 960 ссСссЬаеадаОАССАОСАССССаОТСАСТТСТССОАССССТСаОАТССССАОТАСААСА ΟΟΕΡ6ΕΡ3ΒΑ3ΕΑΟΥΝ + 1020
272
АСТСССАСААССАОААСАТСТАСАТСААСАССТТТСССеСТСАССТСААаТСТССССОСА КСОЫЕК1У1ИТРаАЕЬКБАСЭ + 1000
92
ТССССАЛССАССССАТСАТССАСАСТССССССААСОСТПТСАСССаТСТССССОАСОАСТ ΜΡΝΗΑΙ ТОТОНЫСУТСЬКПЕ + 1140
312 асостсАстсатасААсатсААсаассссоссттсаататасассссАстсссААСАста иаонсыуиаАараукРТАЫт + 1200
332 ассАссАССтссссоАссссттсатстасатсААассесстассаАатсссАссссАссА СОЕЬАПАГУИУКРССЕ ЗЭСТ + 1260
352
СССАСТССТС<ЗССаСССС<ЗСТАС<ЗАСАССТТСТаС<3<ЗСАА<ЗССССАСОССТТСААеСССА ЗОЗЗААКУОЗРССКРОАРКР + 1320
372
ССССССАССССЕСТАССТССААССАСаССТАСТТССАСАТССТССТСААСААССССААСС
РЕАСТИЫОАУГЕМЬЬКЫАМ + 1380
392 сстссттстААОСТССтссАССЗОсттсттастатсАатссстстоАссатсотстастоа Р 5 Р *
1440
395
Ь49 тастасссстастсстастастсстсстссасоаасА.сс<заАассААссААААтаААСтс СТССТТСААААСААААСАОАААСААСССАСССССааТССААТаСТССТССаТТССЗТСТТТ ТТТСАТСТТСССТТСТАСТСТАСТАСТТТСАТАатссТАСАТААСасСТТТСАОААССат СТСТСТОТСТССаТСТТТТТСССАСТТСТТасаАСТССТСАТТАТССССТТТОТТаСТСС ТТаСОеСАОАСТАСААССАСАСССТСТТаССаТАССАССТТССТССОТАООАСеТАООаА ААСААССТСАСАСТСТСОААТТССАСТСАСССТСССТССССССТСТАООАААССААСааС АОААССАСТАаТОССТаСАССТТАСАААСаСОАаСАТОСТСААСАТСТССОАСААААООС АОССАТСС
ВатН!
+ 1500
Ы09 + 1560 + 1620 + 1680 + 1740 +1800 + 1860 +1868
6169 6229 6289 6349 6409 6469 6477
8Ε0Ι0 1\1о2:
Ген С1-Е65 25 кД”(семейство 45 ), полученный с помощью ПЦР на основе секвенированвя белка 25 кД эндо и анализа гомологии с целлюлазами семейства 45
-3309 ССТТАООАС ААТСАССАСААССТААТТСОаСТСТАТАСТАТССаАСААОАТСАСССАОАСССАОАТТОА ОСАТСТССАСОСЗААСССТОААССАОАССАССААСААСОАСАССАСЭССТССТССССОАССТ ССТСОАСААСАТТССССАТССССТССТСваСОаСААСААСАААТССААССТООАССАТАТ ССАСАССААСССССАССССССССАСАТСОАСААССТСАОССТСТСССССССССААССССА ССАОСТОАССАОАТАСеТССАОеААСТСЗТТСССТСАОАТСАТСССССССАТСААСТТССА ТСАССАаСТТСТССАОСАСАТСТССОАССССАТСаАСААОАТСССССТССТССССААСАТ ТСТОСАССАССТССАССАССАОАТаТССАТСТТТСТАТТССАСАТСАТОСССССаТТССТ аСТТССССТТАТССАССАСАТСААОААСаАССТСаССАСТаССТССАСССАСАТСАТССА САССАССАОСССТОАССАССАСААССТСТТТаАССАССАСААСаССАСССАССССАСТСА СТСаАТСТТССССААССАССАСТТТАСТААСОТАААСССОАСССТААТСАаААССТСССА ТСТАСААТТСАаТТАСАСТСАССССАСТТСТТТССССТСТСТаТАСАТССТСААССАСАТ ССССССТСССССССССТССААССТСеТСТССТОООТССТСССССАССТСАТОСАСЮССТС ССАССАТСАСАСССТССАСаТОСАСССССТССТТСАСААСАТСАТТТАСССАСТСТТССА ССАТСССССССАССССАССАТОСССССТОАСОСССС(ЗТСС(ЗАС(3<ЗСССССАССТСА.ТСТТ СААСАТССТОСССОАСТаОТОООАССАСАТОАССОАССЗОССАССССаАСаАСТАССООаО СААССТСАССССССАООСАСТССЗАЗАОАОССОАСААССАССаССАСОСССАССАСОАСТа СССССАСООСТССООООаСААССТСААСЗАТССАСААСААСТТССаОААСаАааССССССА САСССТАСАОСАССАСЗАТССЗСООССаССССССССХЗАОаССАТСАТаООАаОССЗТСААССА СОСССТСТСаСАСССССТССАОААСССССССОаССаССАОСАСТСОТСОСАОАССАСССа ССТСССТаССТТСАТСАССАСССТССССС<ЗСа(ЗССТССТО<3<ЗССССССССТСААСАаО<1А ССАОАСАОАСТССТАССАССССаССССССОСАССОАОСАСООСССОТАСАСССАОАССАС
3301
3241
3181
3121
3061
3001
2941
2881 сгеА
2821
2761
2701
2641
2581
2521
2461
2401 сгеА
2341
2281 сгеА
2221 сгеА
2161
2101
2041
-29005682
САССаАСТАСаССТАСТСССаАОСССССТАСОСССАааСССАаТАСАССаАаАСОСАСТА С66СабС6СС66С66С66СС6СА6С0А0ТАСС6СС6СТАССЗА0САСС6ССАС6АТ6АТ6А СОССССССТССАСАССТАССбЛТАСАСббААСЛбСССАСССАСЛСССССТАССЗАСЛаСТА стс<заотосстАТсассоссс1ссА(зоАСАССАссАсстАто<зсаас(Зсс<з<зсАссас(ЗА(Э С6ААТАСАТТС6ТА6СТСССА6САОА6ТА6СТАСС36ТО6СА6СОССТАТ<36САатаоаТА СССТССТССТЗАТСААСААСАбАбСАбСбССТАТССААСТССТТАСССТССТССТОАТбА АСА6СА6А6Т66ТСаТТАТаСТ66С66СТАТ66СС6СС6ТСА66АА6АА6А0А0ТАаСА6 СТАТССААССССТТАТССТССТССТС6ТСАТ6ААСААСА6А6ССССС6ТТАТбаТС6ТСС СТАССОСССССаТСАО<ЗААаААСАаАеТАаСС36СТАТС?аААСЗТ(ЗСТТАСООТСОТСаТ(ЗА ТбААСААССбАССОбСССТТАТСаТСбТОССТАСОСССЗССбТСАТСАСЗбААСАСАССАС тосттАсассАсссзсстАтаатс13тссссАтаААСАсаАас<зссзстсастАсс<зсАстао ттАСоассассск;сасААсаАсаАООАа<ЗААСА<зоА<з(ЗАтаассзСАсассосА(зата<з<з<з ТТАСТА6С6Т6ААСТСТТССО6ССССТСТ СТТСТТСТС ААССТТС СТ6ТТССАТ666СА6 оАссаот<зсАтсАтс?ААСАсаАсосзтсс<зстатсттттттттттстсоасатсттсАтта ТТТвТТОААТСТСССТТТТСаАаОАТАСОАОСТСТСТСООаСАСаААТАОАТСААОССАА ТСТСАСАСАТТ“ГССТСТСААААААА6АСТСАТАТСТСТТССАССАТССАСТ6ТАТСТАСА ТТАСАТАСАТТАТСССССТССАСТССАТТСССАСААСССАААССААТСОСССССТСАТТС АА6ААССАТСА666СТ6ТСАТТО6СТТ6ТТТТ6Т6СС6ТСССС6С66Т6АС6СССАСТАТ аАСТСТСТОСССАССССССААСТССаТСССАСАТАТАТТААТССОООССАТАОСССАТАТ СТТССТТ<ЗАТТТСТАСАСТАСТАСТАСАСТААСССССТТСТССАСАТССССССАСТСТТС ООТАОАТСТОССССААОТ(ЗСААСТаССЗОа<ЗСС<ЗСССАААСТАаОТААТАТССТСССССТС ТССС6А6Т6С6С66АСТААСС6ТСАТТССТСССА6А66СТТССАСТСТАТС6СА66ССТТ ТТССААТААССАТССССССТТСОССаОТОАТОАТаССООТСатаССОСССАТАСООССАС 66ТА6АТА6ААААТААС6АС6СТ0СТ6ТТТТ06А6АС3666А66606АСТАТТА0666А66 6АААТАСА6О6ССА6<Ю66ТСА6АСОСЮТ6АССТТСС<36СС6ААССТС6С6СТТ6ТСААА СДАОСАССССТаТТАаСТТССТСТАСАСТАСТСТАСАТАСАТАСАТАТСТАСАТАСТСТА ТСТАСТаСАСАТАСТТТААСТТаСТвСТТСССТаТОАаССаССАааААСАТСДСААСТСС ААССОСЗААААОСССССАТАТАСССССССССТТСТССЗаСАТаССТССССССТТССОААСбб 6ТСТ6АСТТСС6АССАТТТТАССТ6СТТСАТТТ666ТАТТСТ6ССАТ66ССТ6ТТСААСС СТТССССТ66СС6ААСС6ТТТСТТС6СТС<ЗАТССТАСТаТАСАСТАСАСТАСТССТА6АС тссстссссоАСОАтссосоооААСосассАоаАататоаАатасАСАССсссссссатс АТ6ТС6Т6ТААТТАААТАТАТАА6Т6А6А6Т6ТТТТТТОАСГ6СССС666ТТСТ6СТАСТ тоААаааААсзттссАтастстстостстсотсестстсстссзстстсстсаасАтсстсс АТСС6ТСС6ССТТТ6АТААССС6СТССССОАСТСА<ЗТСАА6АСОАС<ЗСАТАСТТС<ЗСАСС
1981 1921 1861 1801 1741 1681 1621 1561 1501 1441 1381 1321 1261 1201 1141 1081
021 961 901
841 781 721 661 601 541 481 421 361 301 241 181 121 -61 сгеА
η.ϋ2 сгеА ηί12 сгеА П±С2 сгеА сгеА ηί.12 сгеА бокс ТАТА
АТаСАТСТСТСССССАССАСССССТТССТСССССТССССССССТОССССТСССССАСЗСТС МНБ5АТТ6РБАБРАБАБА о ь + 60 предполагаемая сигнальная последовательность + 120
ТСОЗССАОСОСССАСАСОАССССХЗТАСТСССАСТССТССААССССЛССТССаССТССССС 568 ООТТПУНОССКРе САКР СССААСббССССТСбТСТСССбТССАСбССТбССАСААСААСбАСААСССССТСААСбАС СКСРЗЗ РУОАСБКЫБЫРБМБ + 180
ОССОаСТССАСССбОТССООСТССОАССССООССССАаССССТАСАТатаСТССТСССАС аазткзосоАоазАУМсззо + 240
АСССССТаССССЗТСАСССАССАССТСТССТАССССТССССССССаТСААССТССССОСС
РИАУЗБЕБЗУСНААУКБАСЭ +300
100
АССТСССАСТСССАСТОСТаСТССОССТССТАССАССТСАССТТСАССАСССССССССТС ЗЗЕЗОНССАСУЕЬТРТЗСРУ +360
120
СССОССААОААСАТСАТТаТССАСвССАССААСАССССТОССаАССТОСССОАСААССАС ΑβΚΚΜίνΟΑΤΝΤβΟΟΙ'ΟΟΝΗ +420
140
ТТТСАССТаасСдЬдадСЕдссСссссССсессссддассдсссадаЬЕадаедадаСБа РОБА +480
144
-й антрон дасееСдсСсдеаааБсддессаадаСЬсссесдасБдассаасааасаесаСасдддса + 540 дАТССССОатаОСОСТОТСССТАТТТТСААССдБ аадс БддБ дс ссссдда сс сс е сссс ΐΡοαονοίΡΝ + 600
154
2-й интрон ддассссСсссссшессСссадсдадссдадССдддаСсдссдадаСсдадаасБсас + 660 асаасеесСсБсксдасадССТССАСССАССАаТАССССаСТСССССОААСааСТСООес АСТПОУСАРРЫСНО + 720
168
САССССТАССССО<ЗСАТССАТТССААааААОАСТСССААТССТТСССааАОССССТСААС ОКУ6О1НЗКЕЕСЕЗРРЕАБК + 780
188
ССССССТССААСТОССССТТССАСТОдЕ асдС ед с С С Ъдаса е ассддаа сс сааБ I: сс С ΡαΟΝΚΗΡΌΗ + 840
197
3-й интрон ссаасссссссссессесСсссссаасессдддддЬадЬсддааСдСсдсдаседасссЪ + 900 асы садСТТССААААСССССАСААССССТСаСТСАССТТССАССАССТССССТСССССТ - * А С Р
125
Ρ<3ΝΑϋΝΡ3νΤΡΟ сссасстсасстссаасаессостсстсссст-гаасасссаасасасссссстссаасоа зеьтзкзосзк*
Е V + 1020
225 + 960
214
ССаАААОАТТСААССТСТССТССТССТаОСаААССТСООСССССАСТбТОАААСТОСТСТ АААТАТТСТОССАСАСАСААССТАСТАСАОТСССТСТССССбТСССССТААСТАСССТТС СТССОСАТСТСТССАТСТТСССТССЙААСТСТССОТТССТбТТТТСаСТССЗОТСССТСАТ сттстсссаасстастсаасаатсаатсстсаоасаозстсасасасатаасатссасгт САСАААТССАОССТТСАААССААТААААААААТТССТСТОССАТСААТАТСТССТОАТСС ААССАСССТССТАССАААССТТСАСОАААТТТССТСАСбЗСАААТТСТТСАААСАСТССТ ТААССОбТССССССТАОТебТССТОТТСССССААТСССТТТСТСТТСАААТОАСАТТСОЗ ССТААСССС&ЗАСТСАТАТСАЛСТОССТАССОАААСССААТСССТССССАААСАСОСССТ СТСТААТААССТСТСССАААСААаАССТСТТСАСАСАСААААТАСССССАСАТССТОАСС АСТТСАСААСССООССССССССССОСССТТСТСААСТССАААААСТТССССАТТТСАТаС тсстатсааааааасааааааааааааааасаттгсаастсссосатсссссатттасат ТССТТ0ССТОССССААТАОАААСТТССААСАС<ЗГСЛаТСТСАТСТТССАС<ЗССТТ(За + 1080 + 1140 +1200 + 1260 +1320 +1380 + 1440 +1500 +1560 + 1620 + 1680 +1737
1В5 1145 1205 1265 попи(А)-свйт 1385 1445 1505 1565 1625 1685 1742
5Е0 10 Мо 3:
Фрагмент гена С1Е63 (семейство 12), полученный с помощью ПЦР на основе анализа гомологии с целлюлазами семейства 12
ОААТТССсооАТТАСОАССТААТОАТстЕдесадиигишсисигсипсиспсиисиисииссШсссседииаиисиа дс!уе1п11М 1сса11дс11сдссс1с11£сс11аассс1дс1дас1с1с1сС1с11д1саа1да1ас1д1аа1адССТССССАСАТТС(36СОАССТСТАССССАТСОСС
Ι,ΑΒΡΟϋνΥΡΙΟ
ТССТСССАОбаССАСОТСААССТСаСССОССАООАСТОаОАССТСТаОАССбССТТСААМОСНААСАТСССССТСТАСАОСТТСаТАССОСССАМСССС
ЗЗОСНУЫУАОаОНЕЬНТСГХСЫМКУТЗГУАРХР
СССААСАСЫТТСАСССССААСбТСААСОАСТТСТТСААСТАТСТССАОТССААССАСОССТТСССССССАССАСССААТАССТТСТСААдСааддадасда гпх£вапукд££пу1депдд£раввду11п? да1с1сдаасадсаеасса1а1а1дсд1дсдд1асаад1дсас1аассссс1111111сссд11сдсад1СТТССАС,ГГСО(ЗСАСТС ? ? 7
100
200
299
400
487
-30005682
5Е0 ГО Νο 4:
Целпаб1вг1дролаза СВН1 СЬгузозропшп
ТТТНССаСССССТСТТАСТССТАССТТССАСССТОАТСаЗССАСТСаСССТССОАОСССС ?СААГЬЬЬРСТ\71С05КСЕС
АСТССТаССССССТАССТАСАССАСССАССССТАТаСССССАТСТСССАСССССАСССАТ 6105ССаТУЗТОКУАС1СОРОС
СССАСТТСААСТСЗТАССОССАСОССААСААСАССТТСТАССССААССССАТЗАСССТСб 121 σ0ΓΝ5ΥΚ<20ΝΚΤΡΥ(3Κ(3ΜΤν
АСАССАССААСААСАТСАСООТССТСАСССАОТТССТСААСААСТСОСССОСЗСОАССТСТ
181 ΟΤΤΚΚΙΤννΤΟΡΙ,ΚΝβΑΟΕΙι
ССаАСАТСАДаСССТТСТАССТССАСААССССААССТСАТССССААСТСССАОТССАССА
241 5 Е I ΚΚΡΥνΟΝΟΚνΐ ΡΝ5Ε3Τ
ТССССССССТССАССССААСТССАТСАСССАССАСТССТЗСОАСССССАСААОЗСССССТ
301 I Р Ο V Е (3 N 5 I Т 0 β М С ϋ К О К А А
ТСООССАССТСАСССАСТТССАССАСААСОСССССАТООТССАЙАТСОССААСССССТСе 36ΐΓσηντϋΡθοκα(3ΜνθΜθΚΑΒ
ССОЭССССАТОСТССТССТСАТСТССАТАТОСаАССАССАССССАСТЫААСА
421 А С Р Μ V Ь V М 3 I И Ώ ϋ Н А 5 ? 8Е0 Ю По 5:
Ксяланаза Е Скгузоаропшп
ТОАССТТСГГССТССТТСТСССОААСААТААТАОАТААТТАССАСССОСТТССАОССТСАС 1
АТТСССССАТТСТАСССАСССССААТСААТТСААСТТТСССААСССССАСССССТТСТС 61
3ΕΝ0ΕΝΡΑΝΑϋΑνν
ААСТТТаСССАССССААССССААССТСАТССССССССАСАСССГГССТСТСССАСТСТСАС 120
ЫРАОАЫСКЬ1КОНТЬЬИНЗО
СТСССаСАСТааСТССАОААСАТСААСОАССССААСАССТТСАСССАаСТСАТСОАОААС 180
ΣΡΟΗνΟΝΙΝϋΗΝΤΕΤΟνίΕΝ
САССТСАССАСССТТОТСАСТСССТАСААССССААСАТССТССАСТСССАССТССТТААС 240 НУТТЬУТКУК(ЗК1ЬНКПУУМ
САСАТСТТТССССАССАССССТСССТССаССАСАСССТСТТСАССССССТССТСССССАС 300
Е1РАЕПС5ЬКПЗУРЗКУЬ(ЗЕ
САСТТТСТСОССАТССССТТССССССССССССССССССССАТСССААССССААССТСТАС 360
ΟΡνΟΙΑΡΚΑΑΗΑΑΟΡΝΑΚΙίΥ
АТСААССАСТАСАССТССАСА
420
I Ν ϋ Υ К 3 Т -

Claims (25)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Трансформированный микроорганизм рода Сйгузозрогшт, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую заданный полипептид, функционально связанную с гомологичным или гетерологичным участком, регулирующим экспрессию, распознаваемым указанным микроорганизмом Сйгузозропит, и, необязательно, с секреторной сигнальной последовательностью, полученный путем трансформации исходного микроорганизма Сйгузозрогшт генетической конструкцией, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полипептид.
  2. 2. Трансформированный микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид является гетерологичным полипептидом растений, животных (включая человека), водорослей, бактерий, архебактерий, вирусов или грибов.
  3. 3. Трансформированный микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид является гомологичным полипептидом, который экспрессируется на более высоком уровне по сравнению с соответствующим нетрансформированным микроорганизмом при одинаковых условиях.
  4. 4. Трансформированный микроорганизм по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный полипептид выбран из расщепляющих углеводы ферментов, протеаз, липаз, эстераз, других гидролаз, оксидоредуктаз и трансфераз.
  5. 5. Трансформированный микроорганизм по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный полипептид выбран из ферментов грибов, обеспечивающих сверхвыработку первичных метаболитов, органических кислот, вторичных метаболитов и антибиотиков.
    -31005682
  6. 6. Трансформированный микроорганизм по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанный полипептид проявляет оптимальную активность и/или стабильность при рН выше 6 и/или сохраняет более 50% своей активности и/или стабильности при рН выше 6.
  7. 7. Трансформированный микроорганизм по любому из пп.1-6, содержащий гомологичную или гетерологичную секреторную сигнальную последовательность, полученную из грибов, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей заданный полипептид.
  8. 8. Трансформированный микроорганизм по п.7, отличающийся тем, что указанная сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность целлюлазы, β-галактозидазы, ксиланазы, пектиназы, эстеразы, протеазы, амилазы, полигалактуроназы или гидрофобина.
  9. 9. Трансформированный микроорганизм по любому из пп.1-8, дополнительно содержащий селективный маркер, например маркер, обеспечивающий резистентность к лекарственному средству или восстанавливающий пищевой дефект.
  10. 10. Трансформированный микроорганизм по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный участок, регулирующий экспрессию, содержит индуцибельный или конститутивный промотор.
  11. 11. Трансформированный микроорганизм по п.10, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор целлобиогидролазы, глюкоамилазы, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы-А, алкогольдегидрогеназы-К, фосфоглицерата, аспартопротеазы, липазы, βгалактозидазы, гидрофобина, протеазы, амилазы, ксиланазы, пектиназы, эстеразы, эндоглюканазы или полигалактуроназы.
  12. 12. Мутантный штамм СНгукокрогшт 1искиоуеике, полученный с помощью мутагенеза, а именно УФ-облучением и/или обработкой №метил-№-нитро-№нитрозогуанидином штамма С. 1искпо\\'епке С1 (УКМ Γ-3500 Ό), вырабатывающий, по крайней мере, такое же количество целлюлазы в молях на литр и/или вырабатывающий протеазы меньше, чем исходный штамм.
  13. 13. Мутантный штамм по п.12, представляющий собой штамм С. 1искпо\\'епке ИУ13-6 (УКМ Γ-3632 Ό), или происходящий от него.
  14. 14. Мутантный штамм по п.12, представляющий собой штамм С. 1иекпоуеп5е NС7С-19 (УКМ Γ3633 Ό), или происходящий от него.
  15. 15. Мутантный штамм по п.12, представляющий собой штамм С. 1искпо\\'епке ИУ18-25 (УКМ Γ3631 Ό) , или происходящий от него.
  16. 16. Мутантный штамм по любому из пп.13-15, отличающийся тем, что указанный штамм характеризуется биомассой, меньшей, чем половина от таковой у Тпсйобегта гееке1, при этом указанная Тпскобегта в культуре проявляет вязкость 200-600 сП при культивировании в эквивалентных условиях.
  17. 17. Мутантный штамм по любому из пп.13-16, отличающийся тем, что вырабатывает меньше, чем половину от количества протеазы, вырабатываемой исходным штаммом, на основе которого он получен.
  18. 18. Микроорганизм по п.1, полученный путем трансформации исходного штамма С. 1искпо\\'епке С1 (УКМ Γ-3500 Ό) и любого мутантного штамма по пп.13-17.
  19. 19. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая участок, регулирующий экспрессию, происходящий от микроорганизма СНгукокрогшт кск^уете, предпочтительно от штамма С. 1искпо\\'епке С1 (УКМ Γ-3500 Ό) или С. 1искпо\\'епке ИУ18-25 (УКМ Γ-3631 Ό), функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей заданный полипептид.
  20. 20. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.19, отличающаяся тем, что указанный участок, регулирующий экспрессию, представляет собой промотор целлюлазы, ксиланазы или глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, предпочтительно целлобиогидролазы (СВН1).
  21. 21. Трансформированный штамм микроскопического гриба, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-20, способный экспрессировать полипептид, кодируемый соответствующей последовательностью нуклеиновой кислоты.
  22. 22. Способ получения полипептида, включающий культивирование микроорганизма по любому из пп.1-11, 18 и 21 в условиях, обеспечивающих экспрессию и предпочтительно секрецию полипептида, и последующее выделение полученного полипептида.
  23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при рН в диапазоне 410 и/или при температуре от 25 до 43°С.
  24. 24. Способ получения микроорганизма рода СНгукокрогшт по любому из пп.1-13, включающий стабильную трансформацию исходного микроорганизма последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей заданный полипептид, функционально связанной с участком, регулирующим экспрессию указанного полипептида.
  25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что трансформацию осуществляют методом трансформации протопластов.
EA200100419A 1998-10-06 1999-10-06 Трансформированные грибы, в частности рода chrysosporium, способные к синтезу гетерологичных полипептидов EA005682B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPPCT/EP98/06496 1998-10-06
PCT/NL1999/000618 WO2000020555A2 (en) 1998-10-06 1999-10-06 Transformation system in the field of filamentous fungal hosts: in chrysosporium

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200100419A1 EA200100419A1 (ru) 2001-10-22
EA005682B1 true EA005682B1 (ru) 2005-04-28

Family

ID=8167095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200100419A EA005682B1 (ru) 1998-10-06 1999-10-06 Трансформированные грибы, в частности рода chrysosporium, способные к синтезу гетерологичных полипептидов

Country Status (13)

Country Link
US (4) US6573086B1 (ru)
EP (1) EP1117808B1 (ru)
KR (1) KR100618495B1 (ru)
CN (1) CN1230546C (ru)
AT (1) ATE286136T1 (ru)
AU (1) AU771539C (ru)
BR (1) BRPI9914278B1 (ru)
CA (1) CA2345356C (ru)
DE (1) DE69922978T2 (ru)
DK (1) DK1117808T3 (ru)
EA (1) EA005682B1 (ru)
ES (1) ES2237159T3 (ru)
WO (1) WO2000020555A2 (ru)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
KR100618495B1 (ko) * 1998-10-06 2006-08-31 마크 아론 에말파브 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서
DK1123974T3 (da) * 1998-10-23 2010-08-23 Meiji Seika Kaisha Endoglucanaser og cellulasefremstillinger indeholdende dem
KR100312070B1 (ko) * 1999-03-15 2001-11-03 박호군 고속 선별법을 포함하는 개선된 형질을 갖는 효소 변이체의 제조방법
CZ303980B6 (cs) 2000-04-13 2013-07-31 Dyadic International (Usa), Inc. Expresi regulující sekvence nukleové kyseliny a produkty exprese v oblasti vláknitých plísní
KR20020026456A (ko) 2000-04-13 2002-04-10 에말파브 마크 아론 사상균에서 발현된 ｄｎａ 라이브러리의 고산출량 스크리닝
EP1291431B1 (en) * 2000-05-22 2006-12-27 Meiji Seika Kaisha Ltd. Endoglucanase nce5
EP2292271A3 (en) 2001-10-10 2011-09-14 BioGeneriX AG Remodelling and glycoconjugation of an antibody
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP2322229B1 (en) 2001-10-10 2016-12-21 Novo Nordisk A/S Remodeling and glycoconjugation of Factor IX
FI118339B (fi) * 2004-09-21 2007-10-15 Ab Enzymes Oy Uusi lakkaasientsyymi ja sen käyttö
US8008056B2 (en) * 2004-12-30 2011-08-30 Danisco Us Inc. Variant Hypocrea jecorina CBH2 cellulases
WO2007071820A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Ab Enzymes Oy Novel enzymes
US7256032B2 (en) 2005-12-22 2007-08-14 Ab Enzymes Oy Enzymes
FI119325B (fi) * 2005-12-22 2008-10-15 Ab Enzymes Oy Uusia endoglukanaasi polypeptidejä ja niiden tuotto ja käyttö
CN103740674A (zh) 2006-03-20 2014-04-23 诺维信股份有限公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US20110104750A1 (en) * 2006-04-05 2011-05-05 Michael Ward Filamentous Fungi Having Reduced UDP-Galactofuranose Content
US8304212B2 (en) * 2006-07-10 2012-11-06 Dyadic International, Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
US20080026376A1 (en) 2006-07-11 2008-01-31 Huaming Wang KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
EP2102366A4 (en) 2006-12-10 2010-01-27 Dyadic International Inc EXPRESSION AND HIGH-DROP SCREENING OF COMPLEX EXPRESSED DNA LIBRARIES IN FADENED MUSHROOMS
US9862956B2 (en) 2006-12-10 2018-01-09 Danisco Us Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi
EP2069491B1 (en) 2007-05-10 2018-01-03 Novozymes Inc. Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material
US7923236B2 (en) * 2007-08-02 2011-04-12 Dyadic International (Usa), Inc. Fungal enzymes
WO2009033071A2 (en) 2007-09-07 2009-03-12 Dyadic International, Inc. Novel fungal enzymes
WO2010107303A2 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Dyadic Nederland B.V. New fungal production system
BRPI1010239A2 (pt) 2009-03-31 2016-10-11 Codexis Inc endoglucanases aprimoradas, derivados e seus usos
WO2010129287A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Hemicellulose-degrading enzymes
FI121712B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121711B (fi) * 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö
WO2010148148A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Codexis, Inc. β-GLUCOSIDASE VARIANTS
FI121851B (fi) 2009-07-08 2011-05-13 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
DK2480660T5 (da) 2009-09-23 2020-11-09 Danisco Us Inc Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf
WO2011041594A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Codexis, Inc. Recombinant c1 b-glucosidase for production of sugars from cellulosic biomass
CN102666848B (zh) 2009-11-25 2014-09-24 科德克希思公司 用于从纤维素生物质产生可发酵的糖的重组嗜热子囊菌β-葡糖苷酶变体
MX355841B (es) 2009-11-25 2018-05-02 Codexis Inc Variantes de beta-glucosidasa recombinante para producción de azúcares solubles de biomasa celulósica.
DE102009055015B4 (de) * 2009-12-18 2013-12-24 Technische Universität Dresden Hefe-Sekretionssystem auf Basis einer Signalsequenz aus der Hydrophobin 1-Gensequenz von Trichoderma reesei
MX2012007224A (es) 2009-12-23 2012-07-30 Danisco Us Inc Metodos para mejorar la eficacia de las reacciones de sacarificacion y fermentacion simultaneas.
FI122937B (fi) 2009-12-30 2012-09-14 Roal Oy Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
US9322027B2 (en) 2010-08-20 2016-04-26 Shell Oil Company Expression constructs comprising fungal promoters
CA2807702C (en) 2010-08-20 2018-07-24 Codexis, Inc. Use of glycoside hydrolase 61 family proteins in processing of cellulose
AU2011317171B2 (en) * 2010-10-20 2014-09-25 Danisco Us Inc. Thermostable Trichoderma cellulase
FI123942B (fi) 2010-10-29 2013-12-31 Ab Enzymes Oy Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja
US9068235B2 (en) 2010-11-02 2015-06-30 Codexis, Inc. Fungal strains
CN103189516A (zh) 2010-11-02 2013-07-03 科德克希思公司 用于产生可发酵糖类的组合物和方法
WO2012068236A2 (en) * 2010-11-16 2012-05-24 Dyadic International (Usa) Inc. Novel fungal oxidoreductases
CN102154237A (zh) * 2011-01-04 2011-08-17 深圳市绿微康生物工程有限公司 一种有效降低动物体内胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用
CN102154358B (zh) * 2011-01-04 2013-07-10 深圳市绿微康生物工程有限公司 一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法
CN102154238A (zh) * 2011-01-04 2011-08-17 深圳市绿微康生物工程有限公司 一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用
CN102154340B (zh) * 2011-01-04 2013-07-10 深圳市绿微康生物工程有限公司 一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法
CA2830508A1 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Danisco Us Inc. Method for reducing viscosity in saccharification process
WO2012125951A1 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Danisco Us Inc Cellulase compositions and methods of using the same for improved conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars
FI123425B (fi) 2011-03-31 2013-04-30 Ab Enzymes Oy Proteaasientsyymi ja sen käytöt
CN103014036A (zh) * 2011-07-01 2013-04-03 深圳市绿微康生物工程有限公司 改型扩展青霉脂肪酶基因及其构建和表达方法
BR112014004171A2 (pt) 2011-08-22 2018-11-06 Codexis Inc variantes da proteína glicósideo hidrolase gh61 e cofatores que aumentam a atividade de gh61
WO2013048661A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Codexis, Inc. Fungal proteases
WO2013067028A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of mammalian promoters in filamentous fungi
WO2013067026A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of plant promoters in filamentous fungi
US20140234897A1 (en) * 2011-11-04 2014-08-21 Novozymes Inc. Polypeptides Having Cellobiohydrolase Activity and Polynucleotides Encoding Same
BR112014015030A2 (pt) 2011-12-20 2017-06-13 Codexis Inc variantes da endoflucanase 1b (eg1b)
BR112014031024A2 (pt) 2012-06-11 2017-06-27 Codexis Inc xilanases e xilosidases fúngicas.
WO2014070856A2 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Bp Corporation North America Inc. Thermotolerant beta-glucosidase variants
WO2014145768A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bp Corporation North America Inc. Use of non-fungal 5' utrs in filamentous fungi
ES2521940B1 (es) 2013-05-10 2015-09-09 Abengoa Bioenergía Nuevas Tecnologías, S.A. Variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida
BR112015029081A2 (pt) 2013-05-20 2017-09-19 Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa Célula hospedeira myceliophthora thermophila expressando uma enzima beta-xilosidase recombinante, enzima beta-xilosidase recombinante expressada por meio da mesma, composição, uso de célula hospedeira, enzima beta-xilosidase ou composição e métodos de produção de açúcares fermentescíveis e de produção de bioproduto a partir de biomassa
ES2527368B1 (es) 2013-07-22 2015-10-27 Abengoa Bioenergía Nuevas Tecnologías, S.A. Célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una enzima alfa-xilosidasa heteróloga y su uso en un procedimiento de degradación de biomasa
EP3074513A1 (en) 2013-11-26 2016-10-05 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
ES2542621B1 (es) 2014-02-07 2016-08-16 Abengoa Bioenergía Nuevas Tecnologías, S.A. Polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y su uso para la producción de azúcares fermentables
EP3152315B1 (en) 2014-06-06 2018-08-15 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
WO2016142536A1 (en) 2015-03-11 2016-09-15 Genencor International B.V. Enzymatic activity of lytic polysaccharide monooxygenase
KR102604503B1 (ko) 2015-05-07 2023-11-20 코덱시스, 인코포레이티드 페니실린-g 아실라아제
EP3313999B1 (en) 2015-06-24 2021-04-28 Genencor International B.V. Polypeptides having demethylating activity
EP3330375A1 (en) 2015-07-29 2018-06-06 Abengoa Bioenergía Nuevas Tecnologías, S. A. Expression of recombinant beta-xylosidase enzymes
CN108291191A (zh) 2015-12-02 2018-07-17 巴斯夫欧洲公司 在具有降低的clr1活性的丝状真菌中生产蛋白质的方法
KR20180084135A (ko) 2015-12-02 2018-07-24 바스프 에스이 감소된 clr2 활성을 갖는 사상 진균에서 단백질을 생산하는 방법
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
KR20180084756A (ko) 2015-12-07 2018-07-25 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터
ES2855728T3 (es) 2016-02-22 2021-09-24 Danisco Us Inc Sistema fúngico de producción de proteínas de alto nivel
JP7128519B2 (ja) 2016-05-05 2022-08-31 コデクシス， インコーポレイテッド ペニシリンｇアシラーゼ
ES2647322B1 (es) 2016-05-20 2018-10-05 Abengoa Bioenergía Nuevas Tecnologías, S.A. Célula hospedadora Myceliophthora thermophila con actividad celulolítica mejorada y composiciones enzimáticas obtenidas por la misma
JP2019519241A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド グルコース透過酵素ライブラリーを生成するための方法およびその使用
RU2019102378A (ru) 2016-06-30 2020-07-30 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Аспарагиновые протеазы
JP2019519242A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド 細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するための方法およびその使用
EP3565893A4 (en) 2017-01-05 2020-12-09 Codexis, Inc. PENICILLIN G ACYLASES
EP3378936B1 (en) * 2017-03-24 2021-05-12 Clariant International Ltd Cellulase suitable for use in detergent compositions
CN110719956A (zh) 2017-06-06 2020-01-21 齐默尔根公司 用于改良真菌菌株的高通量基因组工程改造平台
CA3064574A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Codexis, Inc. Engineered transaminase polypeptides for industrial biocatalysis
US11643642B2 (en) 2017-06-27 2023-05-09 Codexis, Inc. Penicillin-g acylases
CA3073646A1 (en) * 2017-08-21 2019-02-28 Dyadic International Inc. Production of flu vaccine in myceliophthora thermophila
US11319531B2 (en) 2017-11-07 2022-05-03 Codexis, Inc. Transglutaminase variants
CN109988715B (zh) * 2017-12-29 2022-03-01 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种高产木聚糖酶的突变菌株及其应用
CN110093332B (zh) * 2018-01-30 2021-12-28 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种纤维素酶突变体及其高产菌株
WO2019236848A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 Zymergen Inc. Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production
CA3103721A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Codexis, Inc. Engineered deoxyribose-phosphate aldolases
CN108913713A (zh) * 2018-07-24 2018-11-30 中国农业科学院饲料研究所 提高里氏木霉转化效率的重组表达载体及应用
EP4133064A2 (en) 2020-04-10 2023-02-15 Codexis, Inc. Engineered transaminase polypeptides
WO2021220209A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Dyadic International (Usa), Inc. Nicotinamide riboside production in filamentous fungi
US11479779B2 (en) * 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi
CN113403209B (zh) * 2021-07-30 2022-08-26 西南大学 天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用

Family Cites Families (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2974001A (en) * 1957-07-20 1961-03-07 Kalle Ag Process and compositions for enzymatic desizing and bleaching of textiles
GB1368599A (en) 1970-09-29 1974-10-02 Unilever Ltd Softening compositions
JPS5028515B2 (ru) * 1971-09-30 1975-09-16
US3966543A (en) * 1972-10-30 1976-06-29 Baxter Laboratories, Inc. Enzyme-treated paper
US4081328A (en) * 1975-10-23 1978-03-28 Stanford Research Institute Production of cellulase by a thermophilic thielavia terrestris
DK187280A (da) * 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
GB2094826B (en) 1981-03-05 1985-06-12 Kao Corp Cellulase enzyme detergent composition
JPS591598A (ja) * 1982-06-25 1984-01-06 花王株式会社 洗浄剤組成物
US4486533A (en) * 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
NL8300698A (nl) * 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
GB8306645D0 (en) * 1983-03-10 1983-04-13 Unilever Plc Detergent compositions
US4462307A (en) * 1983-05-23 1984-07-31 Pet Incorporated Humpback oven-broiler
GB8421800D0 (en) * 1984-08-29 1984-10-03 Unilever Plc Detergent compositions
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4816405A (en) * 1984-10-24 1989-03-28 The Regents Of The University Of California Vectors for transformation by ascomycetes
US4885249A (en) * 1984-12-05 1989-12-05 Allelix, Inc. Aspergillus niger transformation system
US4610800A (en) * 1985-01-25 1986-09-09 Genex Corporation Method for unclogging drainage pipes
US6492107B1 (en) * 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US5198345A (en) * 1985-04-15 1993-03-30 Gist-Brocades N.V. Vectors in use in filamentous fungi
US5364770A (en) * 1985-08-29 1994-11-15 Genencor International Inc. Heterologous polypeptides expressed in aspergillus
AU607398B2 (en) * 1985-08-29 1991-03-07 Genencor Inc. Heterologous polypeptides expressed in filamentous fungi, processes for making same, and vectors for making same
DK163591C (da) 1985-10-08 1992-08-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til behandling af et tekstilstof med en cellulase
US4935349A (en) * 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US5536661A (en) * 1987-03-10 1996-07-16 Novo Nordisk A/S Process for the production of protein products in aspergillus
US5766912A (en) * 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5252726A (en) * 1987-09-04 1993-10-12 Novo Nordisk A/S Promoters for use in aspergillus
US4832864A (en) * 1987-09-15 1989-05-23 Ecolab Inc. Compositions and methods that introduce variations in color density into cellulosic fabrics, particularly indigo dyed denim
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5122159A (en) * 1988-09-15 1992-06-16 Ecolab Inc. Cellulase compositions and methods that introduce variations in color density into cellulosic fabrics, particularly indigo dyed denim
US5006126A (en) * 1988-09-15 1991-04-09 Ecolab Inc. Cellulase compositions and methods that introduce variations in color density into cellulosic fabrics, particularly indigo dyed denim
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5571697A (en) * 1989-05-05 1996-11-05 Baylor College Of Medicine Texas Medical Center Expression of processed recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptide fragments from a fusion product in Aspergillus
JPH05503919A (ja) 1989-06-13 1993-06-24 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 単球および／またはマクロファージによるインターロイキン―１または腫瘍壊死因子生成の抑制
EP0481008B1 (en) 1989-07-07 1997-11-12 Unilever Plc Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector
US5120463A (en) * 1989-10-19 1992-06-09 Genencor International, Inc. Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991013971A1 (en) * 1990-03-13 1991-09-19 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Neurospora expression system
DK115890D0 (da) * 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992001069A1 (en) * 1990-07-13 1992-01-23 Transkaryotic Therapies, Inc. Library screening method
CA2090126C (en) * 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
JP3133774B2 (ja) * 1990-10-04 2001-02-13 日本食品化工株式会社 新規な宿主−ベクター系
US5290474A (en) * 1990-10-05 1994-03-01 Genencor International, Inc. Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp
US5780279A (en) * 1990-12-03 1998-07-14 Genentech, Inc. Method of selection of proteolytic cleavage sites by directed evolution and phagemid display
ES2182818T5 (es) * 1990-12-10 2015-07-06 Danisco Us Inc. Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de Trichoderma reesei
GB9102635D0 (en) 1991-02-07 1991-03-27 British Bio Technology Compounds
DE69230142T2 (de) * 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5858657A (en) * 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ES2136092T3 (es) * 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5516670A (en) * 1991-09-30 1996-05-14 Kuehnle; Adelheid R. Magnetophoretic particle delivery method and apparatus for the treatment of cells
BE1005432A4 (nl) 1991-10-01 1993-07-20 Dsm Nv Expressiecassette voor heterologe eiwitten.
DK0672149T3 (da) * 1991-12-09 2001-11-05 Unilever Nv Fremgangsmåde til fremstilling/udskilning af et protein med en transformeret skimmelsvamp ved anvendelse af ekspressions/udskilningsregulerende regioner afledt af et Aspergillus-endoxylanase II-gen
CA2062023A1 (en) * 1992-02-10 1993-08-11 Jagroop S. Dahiya Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production
WO1994004673A1 (en) 1992-08-19 1994-03-03 Alko Group Ltd. Fungal promoters active in the presence of glucose
WO1994005781A1 (en) * 1992-09-04 1994-03-17 The Scripps Research Institute Phagemids coexpressing a surface receptor and a surface heterologous protein
WO1994013820A1 (en) 1992-12-10 1994-06-23 Gist-Brocades N.V. Production of heterologous proteins in filamentous fungi
GB9316883D0 (en) * 1993-08-13 1993-09-29 Univ Leeds Production of heterologous peptices
EP0726940A4 (en) * 1993-11-02 2001-05-23 Merck & Co Inc DNA ENCODING A TRIOL-POLYCETIDE-SYNTHASE
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5820866A (en) * 1994-03-04 1998-10-13 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for T cell regulation
GB2289218A (en) 1994-05-06 1995-11-15 Merck & Co Inc Inhibition of TNFalpha production with agonists of the A2b subtype of the adenosine receptor
AU2733895A (en) * 1994-06-17 1996-01-15 Novo Nordisk A/S A fungus wherein the area gene has been modified and an area gene from aspergillus oryzae
US6060305A (en) * 1994-06-30 2000-05-09 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic Fusarium expression system
EP1559776A3 (en) * 1994-06-30 2006-01-11 Novozymes Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic Fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
WO1996002563A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Cornell Research Foundation, Inc. Epstein-barr virus nuclear antigen 1 protein and its expression and recovery
US5602004A (en) * 1994-07-20 1997-02-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Thermophilic fungal expression system
AU4940096A (en) 1995-03-20 1996-10-08 Novo Nordisk A/S Host cell expressing reduced levels of a metalloprotease and methods using the host cell in protein production
US6046021A (en) * 1995-04-12 2000-04-04 Biolog, Inc. Comparative phenotype analysis of two or more microorganisms using a plurality of substrates within a multiwell testing device
AU723619B2 (en) * 1995-04-24 2000-08-31 Chromaxome Corporation Methods for generating and screening novel metabolic pathways
US6030779A (en) * 1995-07-18 2000-02-29 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5958672A (en) * 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US6057103A (en) * 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
FI103133B (fi) 1995-09-01 1999-04-30 Valtion Teknillinen Menetelmä glukoosirepression modifioimiseksi
EP0796328A2 (en) 1995-10-13 1997-09-24 Gist-Brocades B.V. Protein detection
US5939250A (en) * 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US5830696A (en) * 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US5776730A (en) * 1995-12-15 1998-07-07 University Of Hawaii Neurospora hosts for the production of recombinant proteins, and methods for producing same
AU1750697A (en) * 1996-01-19 1997-08-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Morphological mutants of filamentous fungi
DE69704845T2 (de) 1996-01-26 2001-12-20 Novozymes As Herstellung von toilettenpapier
US5753477A (en) * 1996-03-19 1998-05-19 University Technology Corporation Magneto-biolistic methods
US5783431A (en) * 1996-04-24 1998-07-21 Chromaxome Corporation Methods for generating and screening novel metabolic pathways
US7883872B2 (en) * 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US5811381A (en) * 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
US5879921A (en) * 1996-11-07 1999-03-09 Novo Nordisk A/S Recombinant expression of a glucose oxidase from a cladosporium strain
JP4275741B2 (ja) * 1996-12-13 2009-06-10 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス， インコーポレーテッド 血小板由来増殖因子タンパク質の分析および分離
US5989814A (en) * 1997-04-01 1999-11-23 Reagents Of The University Of California Screening methods in eucaryotic cells
US6573068B1 (en) * 1997-11-13 2003-06-03 Genset, S. A. Claudin-50 protein
ES2143408B1 (es) 1998-04-02 2000-12-01 Urquima Sa Promotor y construcciones para expresion de proteinas recombinantes en hongos filamentosos.
US5914245A (en) 1998-04-20 1999-06-22 Kairos Scientific Inc. Solid phase enzyme kinetics screening in microcolonies
US6413776B1 (en) 1998-06-12 2002-07-02 Galapagos Geonomics N.V. High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications
EP1088229A4 (en) 1998-06-25 2002-05-08 Caliper Techn Corp HIGH THROUGHPUT METHODS, SYSTEMS AND APPARATUS FOR CELL SCREENING TEST
ATE547532T1 (de) 1998-06-29 2012-03-15 Bristol Myers Squibb Co Verfahren zur erzeugung von hochgradig diversen bibliotheken
KR100618495B1 (ko) * 1998-10-06 2006-08-31 마크 아론 에말파브 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서
US6518042B1 (en) * 1999-02-24 2003-02-11 Novozymes A/S Process for making DNA libraries in filamentous fungal cells using a novel cloned gene involved in the mismatch repair system of filamentous fungal cells
JP4620253B2 (ja) 1999-03-22 2011-01-26 ノボザイムス，インコーポレイティド 菌類細胞中で遺伝子を発現させるためのプロモーター
US6121034A (en) * 1999-05-13 2000-09-19 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Coniothyrium minitans xylanase gene Cxy1
WO2001025468A1 (en) 1999-10-06 2001-04-12 Mark Aaron Emalfarb High-throughput screening of expressed dna libraries in filamentous fungi
JP5138855B2 (ja) 2000-04-13 2013-02-06 ダイアディック・インターナショナル・（ユーエスエイ）・インコーポレーテッド 糸状菌において発現されるｄｎａライブラリーのハイスループットスクリーニング
CZ303980B6 (cs) * 2000-04-13 2013-07-31 Dyadic International (Usa), Inc. Expresi regulující sekvence nukleové kyseliny a produkty exprese v oblasti vláknitých plísní
KR20020026456A (ko) * 2000-04-13 2002-04-10 에말파브 마크 아론 사상균에서 발현된 ｄｎａ 라이브러리의 고산출량 스크리닝
WO2002064741A2 (en) * 2001-02-13 2002-08-22 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins
AU2003279841A1 (en) 2002-10-07 2004-05-04 Zymogenetics, Inc. Uses of human zven antagonists
ATE438711T1 (de) * 2002-12-20 2009-08-15 Novozymes As Polypeptide mit cellobiohydrolase ii-aktivität und dafür kodierende polynucleotide
ES2469874T3 (es) * 2004-01-30 2014-06-20 Novozymes Inc Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos que los codifican
US7271244B2 (en) * 2004-02-06 2007-09-18 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US7332319B2 (en) * 2004-05-27 2008-02-19 Genencor International, Inc. Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
US20060105361A1 (en) * 2004-08-24 2006-05-18 Rothstein Rodney J Donor yeast strain for transfer of genetic material
MX2007008050A (es) * 2005-01-06 2007-08-21 Novozymes Inc Polipeptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
BRPI0616721A2 (pt) * 2005-09-30 2011-06-28 Novozymes Inc métodos para degradar ou converter um material celulósico e para produzir uma substáncia, e, composição detergente
US7923236B2 (en) * 2007-08-02 2011-04-12 Dyadic International (Usa), Inc. Fungal enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
EP1117808B1 (en) 2004-12-29
US8268585B2 (en) 2012-09-18
KR100618495B1 (ko) 2006-08-31
US6573086B1 (en) 2003-06-03
KR20010103596A (ko) 2001-11-23
US8871493B2 (en) 2014-10-28
AU771539C (en) 2005-01-13
DK1117808T3 (da) 2005-04-25
ATE286136T1 (de) 2005-01-15
WO2000020555A3 (en) 2000-10-05
US20080194005A1 (en) 2008-08-14
CA2345356A1 (en) 2000-04-13
CN1330717A (zh) 2002-01-09
EP1117808A2 (en) 2001-07-25
US7399627B2 (en) 2008-07-15
ES2237159T3 (es) 2005-07-16
DE69922978D1 (de) 2005-02-03
EA200100419A1 (ru) 2001-10-22
DE69922978T2 (de) 2005-12-08
BRPI9914278B1 (pt) 2016-03-08
CA2345356C (en) 2012-10-02
US20140127788A1 (en) 2014-05-08
AU771539B2 (en) 2004-03-25
BR9914278A (pt) 2001-06-19
CN1230546C (zh) 2005-12-07
US20040002136A1 (en) 2004-01-01
WO2000020555A2 (en) 2000-04-13
AU6232699A (en) 2000-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA005682B1 (ru) Трансформированные грибы, в частности рода chrysosporium, способные к синтезу гетерологичных полипептидов
CA2755417C (en) New fungal production system
CN105308171B (zh) Agse缺陷菌株
EP0305216B1 (en) Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases
ES2283402T3 (es) Secuencias reguladoras de la expresion del hongo filamentoso.
KR20150113170A (ko) 탄수화물 분해 폴리펩티드 및 이의 용도
US6077702A (en) Endo β-1,4-glucanase from Aspergillus
WO2001025468A1 (en) High-throughput screening of expressed dna libraries in filamentous fungi
WO1998006858A1 (en) BETA-1,4-ENDOGLUCANASE FROM $i(ASPERGILLUS NIGER)
MXPA01003462A (en) Transformation system in the field of filamentous fungal hosts
DK165640B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af rekombinant humicola lipase og rekombinante humicola lipaser, der kan fremstilles ved fremgangsmaaden.
BRPI0110090B1 (pt) Construction of nucleic acid, process for producing a polipeptde, and microbial recombinant cepa

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU