DE69704845T2

DE69704845T2 - Herstellung von toilettenpapier

Info

Publication number: DE69704845T2
Application number: DE69704845T
Authority: DE
Inventors: E. Franks; Katsunori Kida; Masahiro Onishi; Hiromichi Sakaguchi; Martin Schuelein; Masaki Sharyo; Mamoru Takahashi; Hitoshi Tamagawa
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 2001-12-20
Anticipated expiration: 2017-01-24
Also published as: EP0876534B1; JP2000504939A; JP2005042296A; ES2159106T3; AU1437997A; US6468391B1; EP0876534A1; WO1997027363A1; BR9707176A; DE69704845D1

Description

STAND DER TECHNIK

Sanitäres Papier wie Toilettenpapier, Gesichts-Papiertaschentücher, Papierservietten, Damenbinden, Windeln etc. werden üblicherweise aus Zellstoff zur Papierherstellung hergestellt. Es ist im allgemeinen wünschenswert, das sanitäre Papier weicher zu machen ohne dabei die Papierfestigkeit herabzusetzen.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Tokai Hei (JP-A) 5-148794 offenbart, daß eine Behandlung von Zellstoff mit einer Cellulase-Zubereitung für diesen Zweck wirksam ist. Die Cellulase-Zubereitungen, die darin beschrieben werden, werden durch Züchten von Mikroorganismen erzeugt und enthalten bekanntermaßen Gemische verschiedener Cellulase-Bestandteile mit und ohne Cellulosebindenden Domänen. Die Cellulasen, die keine Cellulose-bindende Domäne enthalten, sind in WO-A-95/24471 offenbart, und es wird darin festgestellt, daß derartige Cellulasen u. a. in der Papierindustrie nützlich sind. WO-A-96/00811 offenbart, daß Cellulasen im allgemeinen bei der Herstellung von sanitärem Papier nützlich sind.
Es ist die Aufgabe dieser Erfindung, das bekannte Verfahren zu verbessern, um eine bessere Wirkung zu erzielen.

DIE ERFINDUNG

Uberaschenderweise haben wir festgestellt, daß ein bestimmter Typ von Cellulase-Bestandteilen sehr wirksam bei der Herabsetzung der Papiersteifigkeit ohne einen bedeutenden Verlust der Papierfestigkeit (oder in einigen Fällen sogar mit einem Anstieg der Papierfestigkeit) ist. Der fragliche Cellulase-Bestandteil ist dadurch gekennzeichnet, daß er nicht eine Cellulose-bindende Domäne ("cellulose-binding domain"; CBD) enthält, und wirksamer ist als eine herkömmliche Cellulase-Zubereitung, die ein Gemisch verschiedener Cellulase-Bestandteile enthält.
Demgemäß stellt die Erfindung, wie sie in Anspruch 1 beschrieben ist, ein Verfahren bereit, wobei ein Zellstoff für die Papierherstellung mit einer Cellulase in Abwesenheit einer Cellulosebindenden Domäne behandelt wird. Der behandelte Zellstoff wird zur Herstellung von sanitärem Papier verwendet.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Sanitäres Papier

Das erfindungsgemäß hergestellte sanitäre Papier kann Toilettenpapier, Gesichts- Papiertaschentücher, Wischtücher, Papierservietten, Papierhandtücher, Damenbinden, eine Windel etc. sein.

Zellstoff für die Papierherstellung

Ein beliebiger Zellstoff für die Papierherstellung, der üblicherweise für die Herstellung von sanitärem Papier verwendet wird, kann gemäß der Erfindung behandelt werden. Bei diesem Zellstoff kann es sich um Neuzellstoff oder um Recycling-Zellstoff handeln.
Der Zellstoff für die Papierherstellung kann ein Holzzellstoff, ein Nicht- Holzzellstoff oder ein Zellstoff sein, der aus Altpapier hergestellt wurde. Ein Holzzellstoff kann aus Weichholz wie Kiefer, Redwood, Tanne, Fichte, Zeder und der Hemlock-Tanne oder aus Hartholz wie Ahorn, Erle, Birke, Hickory, Buche, Espe, Akazie und Eukalyptus. Ein Nicht-Holzzellstoff kann hergestellt werden z. B. aus Bagasse, Bambus, Baumwolle oder Kenaf. Ein Altpapierzellstoff kann hergestellt werden durch erneuten Zellstoffaufschluß von Altpapier wie Zeitungspapier, gemischtes Büroaltpapier, Computerausdrucke, Aufzeichnungsbücher, Magazine, Milchkartons, Papierbecher etc.
Vorzugsweise umfaßt der zu behandelnde Zellstoff für die Papierherstellung sowohl Hartholzzellstoff als auch Weichholzzellstoff. Wir haben vorteilhafterweise festgestellt, daß eine Cellulase ohne eine Cellulose-bindende Domäne (CBD), die gemäß der Erfindung verwendet wird, besonders wirksam bei dem Weichmachen eines derartigen gemischten Zellstoffs ist. Somit kann der Zellstoff für die Papierherstellung 5-95% (insbesondere 25-75%) Weichholzzellstoff und 5-95% (insbesondere 25-75%) Hartholzzellstoff (% der Trockenmasse des Zellstoffs) umfassen.
Der zu behandelnde Holzzellstoff kann ein mechanischer ZellstofffHolzschliff (wie zermahlener Holzzellstoff, "ground wood pulp", GP), ein chemischer Zellstoff (wie Kraft-Zellstoff oder Sulfit-Zellstoff), ein Halbzellstoff ("semichemical pulp", SCP), ein thermomechanischer Zellstoff ("thermomechanical pulp", TMP), ein chemithermomechanischer Zellstoff ("chemithermomechanical pulp", CTMP) oder ein gebleichter chemithermomechanischer Zellstoff ("bleached chemithermomechanical pulp", BCTMP) sein.
Der zu behandelnde Kraft-Zellstoff kann ein gebleichter Kraft-Zellstoff sein, der aus gebleichtem Kraft-Weichholz besteht ("soft wood bleached Kraft"; SWBK, auch genannt NBKP), aus gebleichtem Kraft-Hartholz ("hartwood bleached Kraft"; HWBK, auch LBKP genannt) oder einem Gemisch dieser. Eine gute weichmachende Wirkung gemäß dieser Erfindung wird gesehen bei einem Gemisch aus NBKP und LBKP, z. B. mit einem Gewichtsverhältnis (auf Trockenbasis) von NBKP: LBKP in einem Bereich von 3 : 1 bis 1 : 3. Ein bevorzugtes Gemisch besteht aus SWBK mit einer Grobkörnigkeit über 18 und HWBK mit einer Grobkörnigkeit über 10. Ein anderes bevorzugtes Gemisch besteht aus SWBK mit einer Grobkörnigkeit unter 18 und HWBK mit einer Grobkörnigkeit unter 10. Die Grobkörnigkeit des Zellstoffs wird gemäß dem TAPPI-Verfahren T271 (pm-91) bestimmt und wird in Einheiten von mg pro 100 m ausgedrückt.
Wenn ein Altpapier-Zellstoff behandelt wird, kann die Cellulase-Behandlung während oder nach dem Zellstoffaufschluß ("pulping") des Altpapiers stattfinden. Die Cellulase-Behandlung kann gleichzeitig dazu dienen, Partikel von Druckerfarben von den Cellulosefasern freizusetzen, wonach die freigesetzten Druckerfarbpartikel entfernt werden können unter Erhalt von de-inktem Zellstoff, wie in JP-A-5-9299, JP- A-63-59494, JP-A-2-80683 und JP-A-3-882 beschrieben.
Das sanitäre Papier kann aus getrocknetem Zellstoff hergestellt werden. In diesem Falle wird die Cellulase-Behandlung bei der Herstellung des getrockneten Zellstoffs angewandt oder er kann xvährend oder nach dem erneuten Zellstoffaufschluß (Disintegration) des getrockneten Zellstoffs angewendet werden.

Cellulase ohne CBD

Die Erfindung verwendet eine Cellulase in Abwesenheit einer Cellulose-bindende Domäne (CBD). Der Begriff "Cellulase" bezeichnet ein Enzym, das zu der Hydrolyse von Cellulose beiträgt, wie eine Cellobiohydrolase (Enzymnomenklatur E. C. 3.2.1.91), eine Endoglucanase (nachfolgend abgekürzt als "EG", E. C. 3.2.1.4) oder eine beta-Glucosidase (E. C. 3.2.1.21).
Cellulose-bindende Domänen sind durch P. Tomme et al., in J. N. Saddler & M. H. Penner (Hrsg.), "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates" (ACS Symposium Series, Nr. 618) 1996, beschrieben worden. Es ist bekannt, daß eine Anzahl von Cellulasen eine katalytische Domäne ohne eine CBD enthalten; eine derartige Cellulase kann als solche in der Erfindung verwendet werden. Es ist auch bekannt, daß andere Cellulasen eine katalytische Domäne und eine CBD enthalten; eine derartige Cellulase kann verkürzt werden unter Erhalt einer katalytischen Kerndomäne ohne die CBD, und dieser Kern kann in der Erfindung verwendet werden.
Die in dieser Erfindung verwendete Cellulase kann eine einzelne Komponente sein oder ein Gemisch von Cellulasen kann verwendet werden, vorausgesetzt jede Cellulase hat keine CBD.
Die Cellulasen können in Familien klassifiziert werden auf Grundlage von Aminosäuresequenz-Ähnlichkeiten gemäß dem Klassifikationssystem, das in Henrissat, B. et al.: Biochem. J, (1991) 280, S. 309-16, und Henrissat, B. et al.: Biochem J., (1993), 293, S. 781-788, beschrieben wird. Einige bevorzugte Cellulasen sind j ene, die zu der Familie 5, 7, 12 und 45 gehören.

Cellulase der Familie 5

Eine bevorzugte Cellulase der Familie S ohne CBD ist eine alkalische Cellulase, die von einem Stamm von Bacillus abgeleitet ist. Eine derartige Familie 5- Cellulase ist die Endoglucanase aus dem Bacillus-Stamm KSM-64 (FERM BP- 2886). Die Cellulase und ihre Aminosäuresequenz sind in JP-A-4-190793 (Kao) und Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (6), 8723-877 (1992) beschrieben.
Eine andere Familie 5-Cellulase aus Bacillus ist die Endoglucanase aus dem Stamm KSM-635 (FERM BP-1485). Die Cellulase und ihre Aminosäuresequenz werden in JP-A-1-281090 (Kao), US-A-4,945,053 und Y. Ozaki et al., Journal of General Microbiology, 1990, Band 136, S. 1973-1979, beschrieben.
Eine dritte Familie 5-Cellulase aus BacH/us ist die Endoglucanase aus dem Stamm 1139. Die Cellulase und ihre Aminosäuresequenz sind in Fukumori, F. et al., J. Gen. Microbiol., 132: 2329-233 (1986) und JP-A-62-232386 (Riken) beschrieben.
Wiederum eine andere bevorzugte Familie 5-Cellulase ohne CBD ist eine Endobeta-1,4-Glucanase, die aus einem Stamm von Aspergillus, vorzugsweise A. aculeatus, am stärksten bevorzugt dem Stamm CBS 101.43, beschrieben in WO-A- 93/20193 (Novo Nordisk), abgeleitet ist.

Cellulase der Familie 7

Die Familie 7-Cellulase kann von einem Stamm von Humicola abgeleitet sein, vorzugsweise H. insolens. Ein Beispiel ist die Endoglucanase EG I, die von dem H. insolens-Stamm DSM 1800 abgeleitet ist, und die in WO-A-91/17244 (Novo Nordisk) beschrieben ist. Die maturierte Cellulase besitzt eine Sequenz der 415 Aminosäuren, die an Positionen 21-435 in Fig. 14 des Dokuments gezeigt ist, und hat eine spezifische Aktivität von 200 ECU/mg (basierend auf dem reinen Enzymprotein). Diese Cellulase kann an dem C-Terminus weiter verkürzt werden, um bis zu 18 Aminosäuren, um so mindestens 397 Aminosäuren zu enthalten. Als Beispiele kann die Cellulase auf 402, 406, 408 oder 412 Aminosäuren verkürzt sein. Ein anderes Beispiel ist eine Variante hiervon, die als Endoglucanase EG I bezeichnet wird, beschrieben in WO-A-95/24471 (Novo Nordisk) und eine Sequenz von 402 Aminosäuren besitzt, die in Fig. 3 darin gezeigt ist.
Alternativ dazu kann die Familie 7-Cellulase von einem Stamm von Myceliophthora abgeleitet sein, vorzugsweise PL thermophila, am stärksten bevorzugt der Stamm CBS 117.65. Ein Beispiel ist eine Endoglucanase, die in WO-A-95/24471 (Novo Nordisk) beschrieben ist, die die Aminosäuren 21-420 umfaßt und wahlweise auch die Aminosäuren 1-20 und/oder 421-456 der Sequenz, die in der Fig. 6 darin gezeigt ist.
Als eine weitere Alternative kann die Familie 7-Cellulase von einem Stamm von Fusarium abgeleitet sein, vorzugsweise F. oxysporum. Ein Beispiel ist eine Endoglucanase, die von F. oxysporum abgeleitet ist, die in WO-A-91/17244 (Novo Nordisk) und Sheppard, P. O. et al., Gene 150: 163-167, 1994, beschrieben ist. Die richtige Aminosäuresequenz ist in der letzteren Druckschrift angegeben. Diese Cellulase besitzt eine spezifische Aktivität von 350 ECU/mg.

Cellulase der Familie 12

Eine bevorzugte Familie 12-Cellulase ohne CBD ist CMC 1, die aus Humicola insolens DSM 1800 abgeleitet ist, die in WO-A-93/11249 (Novo Nordisk) beschrieben wird.
Eine weitere bevorzugte Familie 12-Cellulase ohne CBD ist die EG III-Cellulase von Trichoderma, insbesondere Trichoderma viride oder Trichoderma reesei, die in WO-A-92/06184 (Genencor) beschrieben ist.
Alternativ dazu kann die Familie 12-Cellulase von einem Stamm von Myceliophthora abgeleitet sein, vorzugsweise M. thermophila, am stärksten bevorzugt dem Stamm CBS 117.65. Eine derartige Cellulase (genannt C173) kann erzeugt werden durch Klonieren von DNA aus CBS 117.65, und anschließendes Transformieren von Aspergillus oryzae, einem nicht-cellulolytischem Wirtsorganismus, und Exprimieren der Cellulase durch Züchten des transformierten Wirts, und Abtrennen des einzigen cellulolytisch aktiven Bestandteils aus dem Kulturmedium. C173 besitzt ein Aktivitätsoptimum bei pH 4-6,5, eine spezifische Aktivität von 226 ECU pro mg Protein und ein Molekulargewicht von 26 kDa (für das maturierte Protein). Die Sequenz von einer cDNA, die C173 codiert (vom Start-Kodon bis zum Stopp-Kodon) und die Aminosäuresequenz des maturierten C 173- Proteins sind in dem Sequenzprotokoll als SEQ ID-NO: 1 und 2 gezeigt.

Cellulase der Familie 45

Eine bevorzugte Familie 45-Cellulase ohne CBD ist das EG V-Kernprotein, abgeleitet von Hurnicola insolens, das in Boisset, C., Borsali, R., Schulein, M., und Henrissat, B., FEBS Letters 376: 49-52, 1995, beschrieben ist. Es besitzt die Aminosäuresequenz, die in Positionen 1-213 von SEQ ID-NO: 1 von WO-A-91117243 (Novo Nordisk) gezeigt ist.
Eine andere bevorzugte Familie 45-Cellulase ohne CBD ist die FI-CMCase aus Aspergillus aculeatus, die von Ooi et al., Nucleic Acids Research, Band 18, Nr. 19, S. 5884 (1990), beschrieben ist.

Ein-Komponenten-Cellulase

Enzyme, die aus einer einzelnen Komponente bestehen, können auf wirtschaftliche Weise durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden, d. h. sie können durch Klonieren einer DNA-Sequenz erzeugt werden, die die einzelne Komponente codiert, mit anschließendem Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit der DNA-Sequenz und Exprimieren der Komponente in dem Wirt.
Demgemäß kann die DNA-Sequenz, die eine nützliche Cellulase codiert, durch ein allgemeines Verfahren isoliert werden, wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet:
- Klonieren, in geeigneten Vektoren, einer DNA-Bank, z. B. aus einem der später in dieser Anmeldung angegebenen Mikroorganismen,
- Transformieren geeigneter Hefe-Wirtszellen mit den Vektoren,
- Züchten der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zum Exprimieren eines beliebigen interessierenden Enzyms, das durch einen Klon in der DNA- Bank codiert wird,
Durchmustern auf positive Klone durch Bestimmen einer beliebigen Cellulase-Aktivität des Enzyms, das durch derartige Klone erzeugt wird, Isolieren der DNA, die das Enzym codiert, aus derartigen Klonen.
Das allgemeine Verfahren wird weiterhin in WO-A-94/14953 offenbart, dessen Inhalt hierdurch durch Inbezugnahme aufgenommen wird.
Die DNA-Sequenz, die für eine nützliche Cellulase codiert, kann z. B. durch Durchmustern einer cDNA-Bank des fraglichen Mikroorganismus und Selektieren auf Klone hin, die die geeignete Enzymaktivität (d. h. die Cellulase-Aktivität) exprimieren, isoliert werden.
Eine DNA-Sequenz, die für ein homologes Enzym codiert, d. h. eine analoge DNA-Sequenz, kann aus einem anderen Mikroorganismus erhältlich sein. Beispielsweise kann die DNA-Sequenz abgeleitet werden durch ein ähnliches Durchmustern einer cDNA-Bank eines anderen Pilzes, wie eines Stamms einer Aspergillus sp., insbesondere einem Stamm von A. aculeatus oder A. niger, eines Stammes Trichoderma sp., insbesondere einem Stamm von T. reesei, T. viride, T. longibrccchiatum, T. harzianum oder T. koningii oder einem Stamm einer Neocallimastix sp., einer Piomyces sp., einer Penicillium sp., einer Agaricus sp., oder einer Phanerochaete sp.
Alternativ dazu kann die DNA, die für eine nützliche Cellulase codiert, in Übereinstimmung mit wohlbekannten Verfahren, auf zweckmäßige Weise aus DNA einer geeigneten Quelle isoliert werden, wie einer beliebigen der vorstehend erwähnten Organismen, durch Verwendung von synthetischen Oligonucleotid- Sonden, die auf der Grundlage einer bekannten DNA-Sequenz hergestellt wurden.
Die DNA-Sequenz kann anschließend in einen rekombinanten Expressionsvektor insertiert werden. Dies kann ein beliebiger Vektor sein, der auf zweckmäßige Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in die er einzuführen ist. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, wobei seine Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem Chromosom bzw. den Chromosomen, in das/die es integriert worden ist, repliziert wird.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, die die Cellulase codiert, auf operative Weise mit einer geeigneten Promoter- und Terminator-Sequenz verbunden sein. Der Promoter kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine codieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Die Verfahren, die zum Legieren der DNA-Sequenzen, die die Cellulase codieren, des Promoters bzw. des Terminators, und zum Insertieren dieser in geeignete Vektoren verwendet werden, sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Die Wirtszelle, die mit der DNA-Sequenz transformiert wird, ist vorzugsweise eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle, wie eine Hefezelle oder eine Zelle eines filamentösen Pilzes. Insbesondere kann die Zelle zu einer Spezies von Aspergillus oder Trichoderma, am stärksten bevorzugt Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gehören. Die Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das eine Protoplasten-Bildung und eine Transformation des Protoplasten beinhaltet, gefolgt von der Regeneration der Zellwand auf eine an sich bekannte Weise. Die Verwendung von Aspergillus als ein Wirtsorganismus wird in EP-A-238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, deren Inhalt hiermit durch Inbezugnahme aufgenommen wird. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle sein. z. B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces sp., wie Schizosaccharomyces pombe, ein Stamm von Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp., wie Yarrowia lipolytica, oder Kluyveromyces sp., wie Kluyveromyces lactis.
In dem vorliegenden Zusammenhang ist beabsichtigt, daß der Begriff "homolog" oder "homologe Sequenz" eine Aminosäuresequenz bezeichnet, die sich von jenen, die in jedem der Sequenzprotokolle, die nachfolgend gezeigt sind, unterscheidet durch eine oder mehrere Aminosäurereste. Die homologe Sequenz kann eine sein, die aus der Modifizierung einer Aminosäuresequenz resultiert, die in diesen Protokollen gezeigt ist, wobei sie z. B. eine Substitution einer oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren verschiedenen Stellen in der Aminosäuresequenz, einer Deletion einer oder mehrerer Aminosäurereste an einem oder beiden Enden des Enzyms oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz oder einer Insertion von einem oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz beinhaltet.
Es wird jedoch dem Fachmann offensichtlich sein, daß Aminosäure- Veränderungen vorzugsweise von geringerer Art sind, d. h. konservative Aminosäure-Substitutionen, die nicht wesentlich die Faltung oder Aktivität des Proteins beeinträchtigen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren, kleine Amino- oder Carboxy-terminale Erweiterungen, wie einen Amino-terminalen Methionin-Rest, ein kleines Linker-Peptid von bis zu ungefähr 20-25 Resten, oder eine kleine Erweiterung, die die Reinigung erleichtert, wie ein poly-Histidin-Streifen, ein antigenisches Epitop oder eine bindende Domäne. Siehe im allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107. 1991. Beispiele von konservativen Substitutionen sind innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylanalin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
Es wird dem Fachmann auch offensichtlich sein, daß derartige Substitutionen außerhalb der Regionen durchgeführt werden können, die kritisch für die Funktion des Moleküls sind, und noch zu einem aktiven Polypeptid führen. Aminosäuren, die für die Aktivität des Polypeptids, das durch das erfindungsgemäße DNA- Konstrukt codiert wird, wesentlich sind, und deshalb vorzugsweise nicht einer Substitution unterzogen werden, können gemäß den im Stand der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden, wie Stellen-gerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). Bei dem letztgenannten Verfahren werden Mutationen an jedem Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutanten Moleküle werden auf ihre biologische (d. h. Cellulase-) Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen einer Substrat- Enzym-Wechselwirkung können auch durch Analyse von Kristallstrukturen bestimmt werden, wie durch derartige Verfahren wie Kernmagnetische Resonanz (NMR), Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung. Siehe beispielsweise de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992.
Die Modifikation der Aminosäuresequenz kann geeigneterweise durchgeführt werden durch Modifizieren der das Enzym codierenden DNA-Sequenz, z. B. durch Stellen-gerichtete oder durch Zufalls-Mutagenese oder eine Kombination dieser Techniken in Übereinstimmung mit wohlbekannten Verfahren. Alternativ dazu kann die homologe Sequenz eine eines Enzyms sein, das von einer anderen Herkunft abgeleitet ist als die Cellulasen, die den Aminosäuresequenzen entsprechen, die in jedem der Sequenzprotokolle gezeigt sind, die nachfolgend gezeigt sind. Somit kann "homolog" z. B. ein Polypeptid bezeichnen, das durch eine DNA codiert wird, die mit der gleichen Sonde wie die DNA, die für die Cellulase mit der fraglichen Aminosäuresequenz codiert, unter bestimmten angegebenen Bedingungen (wie ein Vorxveichen in 5 · SSC und ein Prähybridisieren für 1 h bei 40ºC in einer Lösung von 20% Formamid, SxDenhardtscher Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8 und 50 mg denaturierter Ultraschall-behandelter Kalbsthymus-DNA, gefolat von einer Hybridisierung in der gleichen Lösung, die mit 100 mM ATP ergänzt ist für 18 h bei 40ºC) hybridisiert. Die homologe Sequenz wird normalerweise einen Homologiegrad (identitätsmäßig) von mindestens 50% aufweisen, wie mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder sogar 95% mit den Aminosäuresequenzen, die in jeder der nachfolgend gezeigten Sequenzprotokolle gezeigt sind.
Die Homologie, auf die vorangehend bezug genommen wurde, wird als der Identitätsgrad zwischen zwei Sequenzen angegeben, der eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten bedeutet. Die Homologie kann geeigneterweise von im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen wie GAP bestimmt werden, das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt wird (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, 1970).

Verfahrensbedingungen

Die Verfahrensbedingungen sollten gemäß den Charakteristika der zu verwendenden Cellulase ausgewählt werden. Für die vorangehend beschriebenen Cellulasen können im allgemeinen die folgenden Bedingungen verwendet werden: pH 4-9,5 (z. B. 5-9,5, insbesondere 6-8), 10-70ºC (insbesondere 30-50ºC) und eine Reaktionszeit von 30 Minuten - 5 Stunden. Die Zellstoff-Konsistenz wird im allgemeinen in dem Bereich von 0,3-40% sein (typischerweise 2-20%), insbesondere in dem Bereich von 2-10% für nicht wiederverwerteten Zellstoff und 10-20% für Zellstoff aus wiederverwertetem Altpapier. Für die typischen Prozeßbedingungen wird die Cellulase bei einer Dosierung von 50-2000 ECU/kg Zellstoff- Trockenmasse, insbesondere 100-1000 ECU/kg (die ECU-Einheit wird nachfolgend definiert) verwendet.
Der Zellstoff kann wahlweise in einer herkömmlichen Mahlmaschine oder einem Refiner entweder vor, während oder nach der Behandlung mit einer Cellulase gemahlen oder veredelt werden; es ist im allgemeinen bevorzugt, ein exzessives Mahlen oder Veredeln zu vermeiden, das dazu neigt, die Weichheit des sanitären Papiers herabzusetzen, und in einigen Fällen kann das Mahlen oder Veredeln weggelassen werden.
Nach der Cellulase-Behandlung kann das sanitäre Papier aus dem behandelten Zellstoff in einer herkömmlichen Maschine zur Papierherstellung hergestellt werden.

Assay für die Cellulase-Aktivität (ECU)

Die Cellulase-endo-Aktivitiät wird durch Herabsetzen der Viskosität von CMC (Carboxymethylcellulose) in einem Vibrationsviskosimeter bestimmt. Ein ECU (endo-cellulase unit; Endo-Cellulase-Einheit) ist die Menge an Aktivität, die eine 10fache Herabsetzung der Viskosität verursacht, wenn sie mit 1 ml einer Lösung von 34,0 g/l CMC (Handelsname Aqualon 7LFD) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), 40ºC für 30 Minuten inkubiert wird.

BEISPIELE

Beispiel 1

Der in diesem Beispiel verwendete Zellstoff war ein 1 : 1-Gemisch von NBKP und LBKP. Der NBKP wurde aus einem südlichen Weichholz-Gemisch von Kiefer (karibisch und Monterey), Douglas Tanne und Redwood hergestellt. Der LBKP wurde aus Hartholz hergestellt, das Ahorn; Erle, Birke, Hickory und Espe enthielt. Die Grobkörnigkeit betrug 19,3 für den NBKP und 16,8 für den LBKP.
Die in diesem Beispiel verwendete Cellulase war EG 1 aus Humicola insolens DSM 1800 (Familie 7). Die folgenden Bedingungen wurden verwendet:
Zellstoff-Konsistenz: 5% w/w
pH: 7
Temperatur: 40ºC
Reaktionszeit: 2 Stunden
Rühren: 350 Upm
Aus dem behandelten Zellstoff wurden gemäß dem Japanischen Industriestandard JIS 8209 Handbögen hergestellt. Bögen von 20 g/m² wurden auf Steifigkeit getestet (Japanischer Industriestand JIS P8143), und Bögen von 60 g/m² wurden auf ihre Bruchdehnung (breaking length; JIS P8113) getestet.
Die nachfolgende Tabelle gibt die absoluten Werte für die Steifigkeit und die Bruchdehnung für eine Kontrolle, die ohne Cellulase behandelt wurde, wieder. Für die Experimente mit einer Cellulase-Behandlung zeigt die Tabelle die relativen Veränderungen (in %) dieser Werte im Vergleich zu der Kontrolle. Idealerweise sollte somit die Steifigkeit abnehmen, während die Bruchdehnung sich erhöhen oder konstant bleiben sollte.
Die vorangehenden Ergebnisse zeigen, daß eine Cellulase-Behandlung gemäß der Erfindung eine herabgesetzte Steifigkeit ergibt, d. h. ein weicheres Papier. Die Papierfestigkeit (Bruchdehnung) war nahezu unverändert. Die besten Ergebnisse wurden bei einer Dosierung von 300 ECU/kg Zellstoff-Trockenmasse erhalten.

Beispiel 2

Der in diesem Experiment verwendete Zellstoff war ein 50 : 50-Gemisch von NBKP mit einer Grobkörnigkeit von 15,8 und LBKP mit einer Grobkörnigkeit von 8,5. Der NBKP wurde aus einem nördlichen Weichholzgemisch aus Tanne, Fichte, Ponderosa-Kiefer, Zeder und Hemlock-Tanne hergestellt und der LBKP wurde aus einem Hartholzgemisch aus Akazie und Eukalyptus hergestellt. Der Zellstoff wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bei den nachfolgend gezeigten Enzymdosierungen behandelt. Ergebnisse:
Vorteilhafterweise zeigen die Ergebnisse mit diesem Zellstoff, daß bei der höchsten getesteten Dosierung das sanitäre Papier signifikant weicher und stärker wurde.

Beispiel 3

Der in Beispiel 1 verwendete Zellstoff wurde mit den folgenden Cellulasen gemäß der Erfindung behandelt: C173 aus Myceliophthora thermophila (Familie 12), EG V-Kern-Cellulase aus Humicola insolens (Familie 45). Der Zellstoff wurde bei pH 6 behandelt, da dies nahe dem optimalen pH-Wert für die Cellulasen ist.
Andere Prozeßbedingungen waren: Zellstoff-Konsistenz 3% w/w, Temperatur 30ºC, Reaktionszeit 2 Stunden, Rühren 400 Upm. Handbögen wurden hergestellt und getestet wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse sind als absolute Werte für die Kontrolle gezeigt, und als Prozentveränderung (im Vergleich zu der Kontrolle) für die anderen Experimente.
Die vorangehenden Ergebnisse zeigen, daß beide Cellulasen gemäß der Erfindung wirksam dafür sind, daß sanitäre Papier weicher und stärker zu machen.

Beispiel 4

EG I aus Humicola insolens DSM 1800 (Familie 7) wurde bei den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 getestet, mit der Ausnahme, daß ein pH-Wen von 7 als für diese Cellulase geeignet ausgewählt wurde.
Dieses Beispiel wurde mit dem gleichen Zellstoff und Cellulase wie in Beispiel 1 gemacht, aber bei verschiedenen Bedingungen (Temperatur, Zellstoff-Konsistenz, Rühren und Dosierung). Die Ergebnisse zeigen, daß auch bei diesen Bedingungen die Cellulase-Behandlung ein weicheres Papier mit nahezu unveränderter Festigkeit ergab. Das beste Ergebnis wurde bei einer Dosierung von 300 ECU/kg Zellstoff-Trockenmasse erhalten.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Novo Nordisk A/S
(B) STRASSE: Novo Alle
(C) ORT: Bagsvaerd
(E) LAND: Dänemark
(F) POSTLEITZAHL: DK-2800
(G) TELEFON: +45 4444 8888
(H) TELEFAX: +45 4449 3256
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Herstellung von sanitärem Papier
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID-NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 744 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Myceliophthora thermophila
(B) STAMM: CBS 117,65
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: reifes Peptid
(B) LAGE: 1..744
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1..744 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID-NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 248 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NO: 2:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von sanitärem Papier, umfassend:

(a) Behandeln eines Zellstoffs für die Papierherstellung mit einer Cellulase, und

(b) Herstellen des sanitären Papiers aus dem behandelten Zellstoff, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulase keine Cellulose-bindende Domäne enthält.

2. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase zu der Familie 7 gehört.

3. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase EG I ist, abgeleitet aus einem Stamm von Humicola, vorzugsweise H. insolens, und am stärksten bevorzugt den Stamm DSM 1800 oder eine Cellulase mit mindestens 60% Homologie mit dieser Cellulase.

4. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase eine Aminosäuresequenz besitzt, die die Aminosäurereste 21-417 umfaßt und wahlweise sämtliche oder einen Teil der Reste 418-435 in der Sequenz von EG I von H insolens DSM 1800 oder mindestens 60% Homologie dieser Sequenz besitzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Cellulase zu der Familie 12 gehört.

6. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase eine Cellulase ist, die von Myceliophthora, vorzugsweise M. thermophila, abgeleitet ist, am stärksten bevorzugt CBS 117.65 oder einer Cellulase mit mindestens 60% Homologie mit dieser Cellulase.

7. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase, die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt oder mindestens 60% Homologie mit dieser Sequenz besitzt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Cellulase zu der Familie 45 gehört.

9. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase eine verkürzte EG V ist, abgeleitet aus einem Stamm von Humicola, vorzugsweise einem Stamm von H. insolens, am stärksten bevorzugt von dem Stamm DSM 1800 oder mindestens 60% Homologie mit der verkürzten EG V besitzt.

10. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die EG V auf die Positionen 1-213 verkürzt ist.

11. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase im wesentlichen aus einer einzelnen Komponente besteht.

12. Verfahren nach einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei der Zellstoff zur Papierherstellung 5-95% Weichholz-Zellstoff und 5-95% Hartholz- Zellstoff umfaßt.

13. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei der Zellstoff für die Papierherstellung gebleichter Weichholz-Kraftzellstoff ("softwood bleached kraft pulp"; SWBK) und gebleichter Hartholz-Kraftzellstoff ("hardwood bleached kraft pulp", HWBK) ist.

14. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die SWBK eine Grobkörnigkeit über 18 und die HWBK eine Grobkörnigkeit über 10 besitzt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Zellstoff zur Papierherstellung ein Gemisch von SWBK mit einer Grobkömigkeit unter 18 und HWBK mit einer Grobkörnigkeit unter 10 ist.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Zellstoff für die Papierherstellung durch Desintegrieren eines getrockneten Zellstoffs in Wasser hergestellt wird.

17. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, das nicht das Mahlen oder Veredeln des Zellstoffs für die Papierherstellung umfaßt.

18. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Cellulase in einer Dosierung von 50-2000 ECU pro kg der Trockenmasse des Zellstoffs verwendet wird.

19. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Behandlung bei einer Temperatur in dem Bereich von 10-70ºC durchgeführt wird.

20. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Behandlung bei einem pH-Wert in dem Bereich von 4-9,5 durchgeführt wird.

21. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Behandlung für einen Zeitraum von 30 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt wird.

22. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Behandlung bei einer Zellstoffkonsistenz von 0,3-40% durchgeführt wird.