DK165640B - Fremgangsmaade til fremstilling af rekombinant humicola lipase og rekombinante humicola lipaser, der kan fremstilles ved fremgangsmaaden. - Google Patents

Description

DK 165640 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant Humicola lipase og hidtil ukendte rekombinante Humicola lipaser, der kan fremstilles ved fremgangsmåden.

5 Humicola lipaser kan fås fra stammer hørende til termofile Humicola sp., omfattende termofile Thermomyces sp., såsom H. lanuginosa (Griffon og Maublanc) Bunce, H. stellata Bunce, H. grisea var. thermoidea, Cooney & Emerson, H. insolens, Cooney & Emerson, Thermomyces ibadanensis, 10 Apinis & Eggins, H. hyalothermophila Moubasher, Mazen og Abdel-Hafez, H. grisea var. indica Subrahmanyam, H. brevis var. thermoidea, Subrahmanyam og Thirumalachar og H. brevispora subrahmanyam og Thirumalachar.

H. lanuginosa er også blevet beskrevet under syno-15 nymerne Thermomyces lanuginosus Tsiklinsky, Sepedonium lan-uginosum Griffon og Maublanc, Sepedonium thermaphilum cyclo-sporum og S. thermaphilum ovosporum Velich, Acremoniella sp.

Rege, Acremoniella thermophila Curzi og Monotospora lanuginosa (Griffon og Maublanc) Mason.

20 Desuden blev arterne Scytalidium thermophilum (Cooney & Emerson) Austwich af Hedger (1975, The ecology of thermophilic fungi in Indonesia. I Biodegradation et Humification. Rapport du ler Colloque International - Nancy 1974 (ed. G. Kilbertius, 0. Reisinger, A. Mourey & J.A.

25 Cancela Da Fonseca), Sarreguemines: Pierron Editeur - 57206) betragtet som tilhørende Humicola insolens.

Fremstilling af Humicola lanuginosa lipase er beskrevet i publiseret japansk patentansøgning nr. 48-62990 og i EP patentansøgning nr. 0258.068A. Sidstnævnte beskriver 30 også anvendelsen af denne lipase i lipolytiske detergentadditiver.

På grund af den verdensomfattende anvendelse af enzymadditiver i detergenter og på grund af, at Humicola lipaser har vist sig at være bedre end kendte deter-35 gentlipaser både med hensyn til vaskeevne og stabilitet, er den kommercielle interesse i sådanne lipaser høj.

Ved produktion af industrielle enzymer har udbytter altid været vigtige for økonomien af produktionsproces-

DK 165640B

2 sen. Den traditionelle måde til at gøre forbedringer på er at mutere vildstammen, sådan at der opnås højere ydende mutanter. Ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi er en yderligere mulighed at transformere genet, der koder for det 5 ønskede produkt, ind i en værtsorganisme, der er i stand til at producere højere udbytter end vildstammen eller som har andre fordelagtige egenskaber.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at udvikle en metode til fremstilling af Humicola 10 lipaser ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi.

Der har op til nu været udviklet utallige processer til fremstilling af polypeptider eller proteiner ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi. Hovedinteressen har koncentreret sig om bakterier og gær, f.eks. E. coli, Bacillus 15 subtilis og Saccharomyces cerevisiae, der er velkendte arter med hensyn til f.eks. ekspressions- og selektionssystemer.

Foruden de ovennævnte mikroorganismer er filamentøse svampe, især Aspergillus sp., såsom Aspergillus ni-ger og Aspergillus oryzae, attraktive kandidater som værts-20 organismer for rekombinante DNA-vektorer, fordi de nævnte mikroorganismer er velkarakteriserede og anvendt i vid udstrækning til kommerciel produktion af enzymer.

I de seneste år er der blevet beskrevet selekteringsmarkører til transformering af Aspergillus nidulans, 25 og der er for nylig blevet udviklet procedurer til in-tegrativ transformering af den filamentøse svamp Aspergillus nidulans med det formål at undersøge de genetiske og molekylære processer, der kontrollerer svampecelledifferentiering.

Transformering af A. nidulans er blevet demonstre-30 ret ved anvendelse af plasmider indeholdende Neurospora crassa pyr-4 genet (Ballance, D.J. et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983), 284-289), A.

nidulans amdS genet (Tilburn, J.G. et al., Gene 26 (1983), 205-221), A. nidulans trpC genet (Yelton, M.M. et al., 35 Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 81 (1984), 1470-1474) og A.

DK 165640B

3 nidulans argB genet (John, M.A. og Peberdy J., Microb. Technol. 6 (1984), 386-389). Det transformerede DNA fandtes at være integreret i værtsgenomet med temmelig lave frekvenser (typisk < 1000 transfoirmanter/^g DNA) .

5 Transformering af Aspergillus niger med aradS genet fra A. nidulans er beskrevet (Kelly, J.M. og Hynes, M.J., EMBO Journal 4 (1985) , 475-479) , og amdS blev vist at være en potentiel selektionsmarkør til anvendelse ved transformering af Aspergillus niger, der ikke kan gro stærkt på 10 acetamid som den eneste nitrogenkilde. Transformering af Aspergillus niger under anvendelse af argB genet fra Aspergillus nidulans er også blevet beskrevet for nylig (Buxton.

F.P. et al., Gene 37 (1985), 207-214).

En fremgangmåde til fremstilling af transformenter 15 af Aspergillus niger er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 0184.438A, 0215.594 og 0249.350, der beskriver ekspression af heterologe polypeptider i filamentøse svampe. Endelig beskriver WO patentansøgning nr. 87/04464 ekspression af højere eukaryote gener i Aspergillus.

20

Det har ifølge den foreliggende opfindelse nu vist sig, at det er muligt at opnå et højt ekspressionsniveau af Humicola sp. lipaser i Aspergillus sp. stammer.

25 I overensstemmelse hermed vedrører den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af en rekombinant Humicola lipase i Aspergillus, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved følgende trin: (a) tilvejebringelse af et rekombinant DNA-klo-30 ningsvektorsystem, der er i stand til at integreres ind i genomet i en Aspergillusvært i en eller flere kopier, og som omfatter: DNA-sekvenser, der koder for funktioner, der letter genekspression, en selektionsmarkør til selektion af transformanter, og en DNA-sekvens, der koder for en Humicola 35 lipase,

DK 165640 B

4 (b) transformering af Aspergillusværten, der ikke indeholder en funktionelt gen for den valgte selektionsmarkør, med det rekombinante DNA-kloningsvektorsystem fra trin (a), og, 5 (c) dyrkning af den transformerede Aspergillus vært i et næringsmedium og eventuel udvinding af lipasen fra næringsmediet.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der et hidtil ukendt rekombinant Humi-10 cola lipaseprodukt, der er karakteriseret ved en glykosyle-ring, der er forskellig fra glykosyleringen af de hidtil kendte native Humicola lipaser og ved en større termisk stabilitet end de native Humicola lipaser. Det vil sige, at arten og eventuelt mængden af glykosyleringen af den 15 rekombinante Humicola lipase ifølge den foreliggende opfindelse er forskellig fra den, der fås fra de naturligt forekommende Humicola stammer. Humicola lipaseproduktet ifølge denne opfindelse er desuden karakteriseret ved at have en forbedret termostabilitet i sammenligning med den 20 tilsvarende native Humicola lipase. Den hidtil ukendte Humicola lipase kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Mere specielt er den hidtil ukendte rekombinante Humicola lipase karakteriseret ved, at kulhydratindholdet er 25 omtrent af samme størrelse eller større end kulhydratindholdet i den naturlige lipase, mens arten af glykosyleringen er forskellig fra den native Humicola lipase, dvs. at den hidtil ukendte Humicola lipase indeholder andre kulhydrater end den native lipase. Kulhydratindholdet kan typisk ligge fra 30 ca. 5 til ca. 30% (vægt/vægt), mens kulhydratindholdet i den native lipase er ca. 4,9% (vægt/vægt). Mere specifikt kan kulhydratindholdet være af størrelsesordenen fra ca. 5 til ca. 15% (vægt/vægt) , og endnu mere specifikt kan det være fra ca. 7,5% til ca. 8,5% (vægt/vægt).

DK 165640 B

5

Det her omhandlede rekombinante Humicola lipase-produkt kan anvendes som enzymatisk detergentadditiv i detergenter på samme måde som den native lipase, dvs. som beskrevet i EP patentansøgning nr. 0258.068A.

5 Som anvendt i den foreliggende beskrivelse anven des udtrykket "rekombinant Humicola lipase" for en Humicola lipase, der er fremstillet ved dyrkning af en mikroorganisme af slægten Aspergillus, der er transformeret med cDNA, der koder for en nativ Humicola lipase. Udtrykket "nativ 10 Humicola lipase" anvendes for den Humicola lipase, der fås fra naturlige kilder for termofile Humicola sp., omfattende de termofile Thermomyces sp., der beskrives i den indledende del af beskrivelsen.

Det har vist sig, at den rekombinante Humicola 15 lipase fra A. oryzae ikke er identisk med den native Humicola lipase, og dette uanset at peptidsekvensen er den samme. Værtsmikroorganismen glykosylerer nemlig det udtrykte polypeptid på en måde, der er forskellig fra donormikroorganismen og med forskellige sukkerrester. I A. niger 20 ser graden af glykosyleringen ud til at være på samme niveau, mens sukkerresterne ser ud til at være af samme art som i A. oryzae. Differentiering og identificering af den native lipase og den rekombinante lipase er mulig ved måling af deres glykosylering. Eksempelvis er den native Humicola 25 lanuginosa lipase og den rekombinante form af denne lipase fra A. oryzae-transformanter begge N-glykosylerede lipaser, men med forskellige sukkerrester. Den native lipase indeholder ikke galactose og har mindre mannose end den rekombinante lipase og er også glykosyleret i en anden udstræk-30 ning, idet den native lipase har kulhydratrester, der forøger molekylvægten med ca. 1500 Dalton (ca. 5%) og den rekombinante lipase har kulhydratrester, der forøger molekylvægten med ca. 2600 Dalton (ca. 8%). Flere detaljer angives i det efterfølgende eksempel 5.

DK 165640 B

6

Den her omhandlede hidtil ukendte rekombinante Humicola lipase kan indeholde fra ca. 1 til ca. 12 mol galactose pr. mol lipaseprotein og mere specielt fra ca. 1 til ca. 6 mol galactose pr. mol lipaseprotein. Indholdet af man-5 nose kan være fra ca. 3 til ca. 20 og mere specielt fra ca.

3 til ca. 12 mol mannose pr. mol lipaseprotein. Den rekombinante Humicola lipase vil typisk indeholde ca. 2 mol N-acetylglucosamin, fra ca. 3 til ca. 20 mol mannose og fra ca. l til ca. 12 mol galactose pr. mol lipaseprotein. Mere 10 specielt vil den rekombinante Humicola lipase indeholde ca.

2 mol N-acetylglucosamin, ca. 3 til ca. 12 mol mannose og ca. 1 til ca. 6 mol galactose pr. mol lipaseprodukt. Endnu mere specielt vil den rekombinante Humicola lipase indeholde ca. 2 mol N-acetylglykosamin, ca. 6 til ca. 9 mol mannose og 15 ca. 2 til ca. 4 mol galactose pr. mol lipaseprotein.

Forskellene i glykosylering har nogen effekt på enzymegenskaberne. I særdeleshed er den termiske stabilitet af højt oprenset H. lanuginosa rekombinant lipase overlegen i forhold til den termiske stabilitet af en nativ lipase af 20 sammenlignelig renhed. Desuden er stabiliteten af den rene rekombinante lipase i nærværelse af et alkalisk Bacillus protease (Esperase®) undersøgt ved 40°C og 55°C overlegen i forhold til en nativ lipase af sammenlignelig renhed.

Enzymprodukter, her lipaseprodukter, i særdeleshed 25 ekstracellulære lipaseprodukter, vil karakteristisk indeholde enzymaktiviteter, især proteolytisk aktivitet, og ikke-enzymatisk aktive peptider og aminosyrer hidrørende fra bestanddelene i næringsmediet.

I tilfælde af Humicola lanuginosa lipasen har det 30 rekombinante lipaseprodukt, fremstillet i A. oryzae, vist sig at være termisk mere stabilt end det sammenlignelige native lipaseprodukt. Vi mener at kunne drage den slutning, at en del af forbedringen i den termiske stabilitet hidrører fra den forskellige glykosylering, og at en anden del kan 35 hidrøre fra fravær af Humicola proteolytisk aktivitet i det 7

DK 165640 B

rekombinante lipaseprodukt. I tilfælde af lipasen fra H. lanuginosa viser en kort beskrivelse heraf i USA-patents-krift nr. 4.707.291, at et kommercielt tilgængeligt H. lanuginosa lipaseprodukt (Amano CE) indeholdt en væsentlig pro-5 teolytisk aktivitet. Vort native H. lanuginosa lipaseprodukt, fremstillet ved dyrkning af DSM 4109, indeholdt også en betydelig mængde af proteolytisk aktivitet. Ved forøgede temperaturer kan især proteasen forventes at nedbryde andre enzymer. Forbedringen af den termiske stabilitet, der 10 kan tilskrives fraværet af protease, virker imidlertid forstærkende i forhold til den forbedring, der kan tilskrives den forskellige glykosylering (se eksempel 6).

Som allerede nævnt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til at fremstille høje udbytter 15 af Humicola lipaser ved dyrkning af transformerede Aspergillus stammer, og en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden er fremstilling af rekombinant Humicola lanuginosa lipase ved dyrkning af en transformant af en A. oryzae eller A. niger værtscelle. A. oryzae er den mest 20 foretrukne værtsorganisme.

A. oryzae har i årevis været anvendt i kommerciel skala til produktion af TAKA-amylaseenzymet og til produktion af proteolytiske enzymer, hvorfor fermenteringstekno-logi til dyrkning af denne mikroorganisme er veludviklet, og 25 mikroorganismen selv er godkendt til anvendelse i fødevareindustrien. Den foreliggende opfindelse giver mulighed for at anvende A. oryzae til industriel produktion af store mængder af rekombinant Humicola lipase.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer desuden 30 et rekombinant Humicola lipaseprodukt, der er overlegent i forhold til det native Humicola lipaseprodukt ved at have en forøget termostabilitet og en forøget stabilitet i nærværelse af alkaliske Bacillus proteaser, se fig. 6 og 9.

35

DK 165640 B

8

Kort beskrivelse af tegningerne:

Den foreliggende opfindelse skal yderligere illustreres under henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 viser DNA-sekvensen af TAKA-amylasepromoteren og up-5 stream-promoterregioner, præregionen og .5'-delen af det strukturelle gen for TAKA-amylasen, fjg. 2 viser et endonucleaserestriktionskort for plasmid PTAKA17, fjg. 3 viser konstruktionen af plasmid pHLL, 10 fjg. 4 viser konstruktionen af plasmid p960, fjg. 5a og 5b viser DNA-sekvensen af præpro Humicola lanuginosa lipase cDNA sammen med den heraf afledte aminosyrese-kvens angivet ved trebogstavsforkortelser, fjg. 6 viser restaktiviteten af det rekombinante Humicola 15 lipaseprodukt (RHL, fremstillet i eksempel 3) . i sammenligning med restaktiviteten af det native Humicola lipaseprodukt (HLL) efter 2 timer ved 55° C og 60’C ved forskellig pH-værdi, fig. 7 viser en SDS-PAGE-gradientgel af RHL- og HLL-prøven 20 behandlet med sukkerfraspaltende enzymer, se eksempel 5, fig. 8 viser restaktiviteten efter 2 timer ved 55°C af det rekombinante Humicola lipaseprodukt og af det native Humicola lipaseprodukt sammen med restaktiviteten efter 2 timer ved 55°C af den native Humicola lipase, der indeholder en 25 proteaseinhibitor (PMSF), og fig. 9 viser restaktiviteten ved 40’C og 55’C af den native og rekombinante Humicola lipase i nærværelse af et alkalisk Bacillus proteaseprodukt (Esperase®).

Den anvendte transformeringsteknik var en metode 30 tilpasset fra metoderne til transformering af A. nidulans (Ballance et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983), 284-289, Tilburn et al., Gene 26 (1983, 205-221, Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81 (1984), 1470-1474) og analog med metoden beskrevet af’ Buxton et al., (Gene 37 35 (1985), 207-214) til transformering af A. niger. Ved frem-

DK 165640 ES

9 gangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse transformeres Aspergillus med et vektorsystem, der indeholder en selektionsmarkør, og som er i stand til at inkorporeres i værtsstammens genom, men som ikke indeholdes i værtsstammen før 5 transformering. Der kan derpå selekteres for transformanter, og disse kan isoleres fra ikke-transformanter på basis af den inkorporerede selektionsmarkør.

Foretrukne selektionsmarkører er argB (A. nidulans eller A. niger), trpC (A. nidulans), amdS (A. nidulans) el-10 ler pyr4 (Neurospora crassa) generne, eller DHFR (dihydro-folatreduktase eller mutanter deraf) genet. Mere foretrukne selektionsmarkører er argB eller amdS genet, vildtype A. oryzae stammer er normalt argB+ (dvs. argB genet er funktionelt i A. oryzae). Hvis argB vælges som selektionsmarkøren, 15 må der som værtsorganisme anvendes en argB mutantstamme af A. oryzae, der har en defekt i genet for denne markør. A. oryzae argB mutanter kan fremstilles som beskrevet af F.P. Buxton et al., (Gene 37. (1985), 207-214). En argB mutant er defineret som en mutant, der har en defekt i ornithintrans-20 carbamylasegenet. På den anden side kan amdS genet anvendes som selektionsmarkør for transformering af vildtype A. oryzae, da vildtypestammerne ikke indeholder dette gen.

DNA-sekvenser, der koder for funktioner, der letter genekspressionen, er typisk promotorer, transskrip-25 tionsterminatorer og polyadenyleringssignaler.

Promotoren, ovenfor hvilken der som bekendt kan findes upstream-aktiverende sekvenser og enhancersekvenser, kan være enhver DNA-sekvens, der udviser en stærk transskriptionsaktivitet i Aspergillus og kan afledes fra gener, 30 der koder for både ekstracellulære og intracellulære proteiner, såsom amylaser, glucoamylaser, proteaser, lipaser, cellulaser og glykolytiske enzymer. Egnede promotorer kan fås fra gener for A. oryzae TAKA-amylase, Rhizomucor miehei aspartat proteinase, A. niger glucoamylase, A. niger neutral 35 α-amylase, A. niger syrestabil α-amylase og Rhizomucor

DK 165640B

ίο miehei lipase. Eksempler på promotorer, der er afledt fra gener, der koder for glykolytiske enzymer, er triose-phosphatisomerase-, alkoholdehydrogenase- og phospho-glyceratkinasepromotorerne.

5 En foretrukken promotor ifølge den foreliggende opfindelse er A. oryzae TAKA-amylase-promotoren. TAKA-amyla-sen er en velkendt a-amylase (Toda et al., Proc.Japan.Acad.

58 Ser. B (1982), 208-212). DNA, der koder for promotor regionen, blev isoleret fra TAKA-amylasegenomklonen som be-10 skrevet i EP patentansøgning nr. 0238.023A. Sekvensen for promotoren og regioner oven for promotoren sammen med præregionen og 5'-enden af det strukturelle gen for TAKA-amyla-se er illustreret i fig. 1.

TAKA-amylasepromotoren er tilgængelig fra plasmid 15 pTAKA 17, der er blevet deponeret i forbindelse med EP patentansøgning nr. 0238.023A. Endonukleaserestrik-tionskortet af plasmid pTAKA17 er vist i fig. 2.

Fra pTAKA17 kan hele promotorsekvensen og sekvenser ovenfor promotoren eller funktionelle dele deraf 20 isoleres på måder, der er indlysende for en fagmand. Promotorsekvensen kan forsynes med linkere med det formål at indføre et specifikt restriktionsspaltningssted, der gør det nemmere at ligere promotorsekvensen med yderligere DNA, f.eks. genet, der koder for det ønskede proteinprodukt, el-25 ler forskellige præregioner (signalpeptider).

Ved en foretrukken fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse er sekvensen fra nucleotid -1144 (se fig. 1) (der repræsenterer starten af en Sall spaltningssted) til nukleotid -10 blevet anvendt som et eksempel på en 30 velfungerende del af promotorregionen. I en yderligere udførelsesform for den foreliggende opfindelse var nukleotid-sekvensen fra nukleotid -1176 til -1 forudgået af et endnu ikke sekventeret 1,05 kb fragment fra pTAKA17. Det er indlysende for en fagmand, at der kan anvendes forskellige 35 fragmenter.

DK 165640 B

11

Ifølge en udførelsesform for den foreliggende opfindelse har promotor- og upstreamaktiveringssekvenserne følgende sekvens eller en funktionelt ækvivalent nukleotid-sekvens: 5

GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT

ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA

AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC

10 TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT

TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA

GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG

CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA

GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG

15 TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT

AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT

TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT

CGGTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA

TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA

20 GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT

CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC

AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG

CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA

TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA

25 GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT

CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA

AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC

ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG

30 der repræsenterer sekvensen fra nukleotid -1144 til -10 i fig. 1.

Ifølge en yderligere udførelsesform for den foreliggende opfindelse har promotoren og upstreamaktiverings-sekvenserne følgende sekvens eller en funktionelt ækvivalent 35 nukleotidsekvens:

DK 165640 B

12 AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA CTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG 5 ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA 10 ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTACTAAA 15 ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA 20 AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT 25 der repræsenterer sekvensen fra nukleotid -1176 til -1 i fig. 1.

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse kan den endnu ikke sekventerede upstream-region 30 på 1,05 kb fra pTAKA17 (position 0 til 1,05 i fig. 2) gå forud for den sidstnævnte sekvens.

Terminator- og polyadenyleringssekvenserne kan fås fra de samme kilder som promotorerne. Enhancersekvenser kan også indsættes i konstruktionen.

13

DK 165640 B

Det udtrykte produkt kan akkumuleres inden for cellerne, hvilket kræver en sprængning af cellerne for at isolere produktet. For at undgå dette yderligere trin og også for at minimere mængden af eventuel nedbrydning af det 5 udtrykte produkt i cellerne, foretrækkes det, at produktet secerneres fra cellerne. Til dette formål udstyres genet for det ønskede produkt med en præregion, der sikrer effektiv dirigering af det udtrykte produkt ind i cellens sekretionsvej . Denne præregion, som kan være et naturligt forekommende 10 signal- eller lederpeptid eller funktionelle dele deraf, eller syntetiske sekvenser, der tilvejebringer sekretion, fraspaltes fra det ønskede produkt under sekretionen, hvorved det modne produkt er klar til isolering fra næringsvæsken.

DNA, der koder for præregionen kan fås fra gener 15 for secernerede proteiner fra vilkårlige organismer.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan præregionen fås fra et glucoamylase- eller amylasegen fra en Aspergil-lusart, et amylasegen fra en Bacillusart, et lipase- eller proteinasegen fra Rhizomucor miehei, genet for a-faktoren 20 fra S. cerevisiae eller kalveprochymosingenet. Mere foretrukket fås præregionen fra genet for Humicola lanuginosa lipase, A. oryzae TAKA amylase, A. niger neutral a-amylase, A. niger syrestabil α-amylase, B. licheniformis a-amylase, den maltogene amylase fra Bacillus NCIB 11837, B. stearo-25 thermophilus α-amylase eller B. licheniformis subtilisin. Humicola lanuginosa signalpeptidet har følgende sekvens ATGAGGAGGTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCTCTGCGTGGACGGCCTTGGCC MetArgSerSerLeuValLeuPhePheValSerAlaTrpThrAlaLeuAla 30 TAKA-amylasesignalpeptidet har følgende sekvens

ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCT

MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaPro 35

DK 165640 B

14

GCTTTGGCT

AlaLeuAla

Genet for Humicola lipasen, der funktionelt er 5 forbundet med promotor- og terminatorsekvenser, inkorporeres i en vektor, der indeholder en selektionsmarkør, eller anbringes på en separat vektor eller et separat plasmid, der er i stand til at integreres i værtsstammens genom. Som anvendt her betyder udtrykket "vektorsystem" en enkelt vek-10 tor eller et enkelt plasmid eller to eller flere vektorer eller plasmider, der sammen indeholder den totale DNA-information, der skal integreres i værtsgenomet. Vektorer kan være lineære eller lukkede cirkulære molekyler. Ifølge en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse 15 kotransformeres værtsorganismen med to vektorer, hvoraf den ene indeholder selektionsmarkøren, og den anden omfatter det resterende fremmede DNA, der skal introduceres i værtsorganismen, inklusive promotoren, genet for det ønskede produkt og trans skripti onsterminator og 20 polyadenyleringssekvenser.

Normalt er transformanterne stabile og kan dyrkes i fravær af et selektionstryk. Hvis trans formanterne viser sig at være ustabile, kan selektionsmarkøren anvendes til selektion under dyrkningen. De transformerede celler dyrkes 25 da under et selektionstryk, der svarer til den anvendte markør.

Plasmider anvendt som udgangsmateriale i de følgende eksempler er som følger: p285: (ATCC nr. 20581) 30 pSal43: Berse et al. Gene 25 (1983), 109- 117

John & Peberdy, Enzyme Microb.

Technol. 5 (1984), 386-389. p3SR2: J.M. Kelly and M.J. Hynes, EMBO

35 Journal 4 (1985), 475-479.

DK 165640 B

15 pSP62-K2 og pCDVI-PL: Noma et al., Nature, 319, (1986), 640-646).

p775: EP patentansøgning nr. 238 023.

5 pUC19: Vieira et al., Gene 19 (1982), 259- 268 and Messing, Meth. i Enzymology 101 (1983), 20-27.

De anvendte stammer er som følger: 10 A. oryzae*: ATCC 20423, IF0 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 144488-11491, ATCC 11601 og ATCC 12892.

E. coli: MC1000 (Casabadan, M.J. og Cohen, 15 S.N., J.Mol.Biol. 13£, 179-207) (NCIB 11956).

H. lanuginosa: DSM 4109 A. niger*: ATCC 1015, ATCC 10582.

20 * ArgB-mutanter af disse stammer kan fremstilles som beskrevet af F.P. Buxton et al. (Gene 37 (1987), 207-214). En ArgB mutant er defineret som en mutant, der har en defekt i ornithin trans-carbamylasegenet.

25

Identificering af Humicola lanuginosa lipase (HLL) amino-svresekvensen

For at opnå en information, der tillader konstruktionen af en specifik oligonukleotidprobe, blev der udført 30 en delvis sekvensbestemmelse på oprenset Humicola lanuginosa lipase. Supernatanten fra næringsmediet af Humicola lanuginosa, fra hvilket mycelium og lavmolekylære stoffer var blevet fjernet, blev underkastet en kolonnekromatografering udført ved hjælp af DEAE-sepharose (anion udbytningskromato-35 grafi), phenylsepharose (hydrofobisk interaktionskromatogra-

DK 165640 B

16 fi) efterfulgt af gelfiltrering på TSK G3000 SW. Sekvensbe-stexnmelsen blev udført ved hjælp af en Gasfasesekvenator (Applied Biosystems model 47OA) som beskrevet af Thim, L. et al. (FEBS Lett. 212, 307-312 (1987).

5 Følgende N-terminale sekvens blev. fundet: 5 10 15

Glu-Val-Ser-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Gln-Phe-Asn-Leu-Phe-Ala-Gln- 20 25 10 Tyr-Ser-Ala-Ala-Ala-Tyr-X-Gly-Lys-Asn-

Denne sekvens tillader konstruktion af to specifikke blandede oligonukleotidprober, der indeholder sekvensen fra aminosyrerest nr. 7 - nr. 11 (Phe-Asn-Gln-Phe-Asn) 15 og aminosyrerest nr. 13 - nr. 16 (Phe-Ala-Gln-Tyr) .

Screening af et Humicola lanuginosa cDNA bibliotek ved anvendelse af HLL-specifikke oligonukleotidblandinger svarende til de ovennævnte sekvenser er beskrevet i eksempel 1.

20 Eksempel 1

Konstruktion af et Humicola lanuginosa cDNA bibliotek i E. coli

Total RNA blev ekstraheret fra homogeniseret H. lanuginosa mycelium ved anvendelse af de metoder, der er 25 beskrevet af Boel et al. (EMBO J., 3, 1097-1102, (1984)) og

Chirgwin et al. (Biochemistry (Wash.) 18, 5294-5299 (1979)).

Poly(A)-indeholdende RNA blev opnået ved hjælp af to affini-tetskromatograficykler på oligo(dT)-cellulose som beskrevet af Aviv og Leder (PNAS, USA 69, 1408-1412 (1972)). cDNA blev 30 syntetiseret ved hjælp af metoden beskrevet af Okayama og Berg (Molec.Cell. Biol. 2, 161-170 (1982)) og ved hjælp af vektorerne pSP62-K2 og pCDVI-PL beskrevet af Noma et al. (Nature 319. 640-646 (1986)). Det syntetiserede cDNA blev transformeret ind i et hsdR*· M* derivat af E. coli MC1000 17

DK Ί65640 B

(Casadaban og Cohen, J.Mol.Biol. 138. 179-207 (1980)) til fremstilling af rekombinante kloner.

Identificering af Humicola lanuginosa lioase (HLL)-specifik-5 ke cDNÅ-rekombinanter

En blanding af 32 pentadecamer oligodeoxyribo-nukleotider 10 d ( AttaAAATG^TT'^AA )

G G G G G

af hvilken en er komplementær til HLL mRNA i den region, der 15 koder for Phe-Asn-Gln-Phe-Asn, blev syntetiseret på en Applied Biosystems, Inc. DNA-syntesemaskine og oprenset ved polyacrylamidgel-elektroforese. Omtrent 10.000 E. coli re-kombinanter fra Humicola lanuginosa cDNA biblioteket blev overført på Whatman 540 filtrerpapir. Kolonierne blev lyse-20 ret og immobiliseret som beskrevet af Gergen et al. (Nucleic Acids Res. 7, 2115-2135 (1979)). Filtrerne blev hybridiseret med 32P-mærket HLL-specifik pentadecamerblanding som beskrevet af Boel et al. (EMBO J. 3, 1097-1102 (1984)). Hybri-disering og vask af filtrerne blev udført ved henholdsvis 25 37“C og 43eC efterfulgt af autoradiografi i 24 timer med en forstærkningsskærm. Miniprep plasmid DNA blev isoleret fra to hybridiserede kolonier, pHLL 702.3 og pHLL 702.4 ved hjælp af standardprocedurer (Birnboim og Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)), og DNA-sekvensen af det indsatte 30 cDNA-stykke blev bestemt ved hjælp af Maxam og Gilberts procedure (Methods Enzymol. 65, 499-560, 1980).

For at lette det yderligere konstruktionsarbejde med HLL cDNA blev der tilføjet DNA-sekvenser, der indeholder unikke restriktionsspaltningssteder, til 5'- og 3'-enderne 35 af cDNA'et på følgende måde: pHLL 702.3 blev fordøjet med Sau96I, som nedbryder HLL cDNA i den 3'-ikke-translaterede

DK 165640 B

18 region, og de fremkomne ender blev udfyldt med E. coli DNA-polymerase (Klenow fragment) og de fire dNTP'er. Dette DNA blev derpå fordøjet med SacI, der skærer HLL cDNA én gang netop efter startmethionincodonen. Det fremkomne 0,9 kb HLL 5 cDNA-fragment blev oprenset ved agarosegelelektroforese,

elektroelueret og gjort klar til ligeringsreaktioner. Der blev fremstillet to oligonukleotider, 927 og 928 som 5'-adaptorer. Sekvensen af adaptoren er vist i fig. 3. Denne adaptor er designet således at den tilfører et Hindlll og et 10 BamHI spaltningssted netop oven for start-Met-codonen i HLL cDNA. De to oligomerer blev kineret med ATP og T4 polynukleo-tidkinase, hybridiseret til hinanden og ligeret til den op-rensede 0,9 kb HLL cDNA-sekvens i en pUC19-vektor, der var blevet fordøjet med Hindlll og Hindi, og oprenset på en 15 0,7% agarosegel. Det fremkomne plasmid pHLL indeholdt HLL

cDNA som et transporterbart 0,9 kb BamHI-fragment. Konstruktionen af pHLL er vist i fig. 3.

Efter BamHI-fordøjelse og oprensning af det 0,9 kb HLL cDNA-fragment på en agarosegel blev det ligeret til 20 BamHI fordøjet og phosphataseret p775 til dannelse af p960, hvori HLL cDNA er under transskriptionskontrol af TAKA-pro-motoren fra Aspergillus oryzae og AMG-terminatoren fra Aspergillus niger. Konstruktionen af p960 er vist i fig. 4.

Konstruktion af p775 er beskrevet i europæisk 25 publiceret patentansøgning nr. 238 023.

p775 indeholder TAKA-promotoren og AMG-terminatoren og har et unikt BamHI-spaltningssted som kloningssted.

Fig. 5a og b viser sekvensen af præpro HLL cDNA 30 med den heraf afledte aminosyresekvens. Nukleotiderne er nummereret fra den første base i det klonede cDNA. Fra denne cDNA-sekvens kan det konkluderes, at HLL syntetiseres som en precursor med 291 aminosyrerester med et signalpeptid på 17 aminosyrerester og et kort propeptid på 5 rester. Det pu-35 tative signalpeptidasespaltningssted (von Heijne, Eur.J.

DK 165640 B

19

Biochem. 133. 17-21, 1983) er angivet med en pil, der peger på peptidbindingen mellem en Ala- og en Ser-rest. Den N-terminale ende af det modne enzym identificeret ved hjælp af aminoterminal aminosyresekventering er angivet.

5

Aminosvresammensætnina af Humicola lanuginosa lipase (HLL)

Aminosyreanalysen blev udført ved hjælp af en Beckman Aminosyreanalysator (model JL1 MB) på 40 jig prøver, der på forhånd var hydrolyseret i forseglede ampuller i 6 M 10 HCl eller 4 M methansulfonsyre ved 110®C i 24, 48 og 96 timer. Halv-cystein blev bestemt som S-B-(4-pyridylethyl)-cystein efter reduktion med tributylphosphin efterfulgt af kobling med 4-vinylpyridin. Alle kemikalier var af højeste renhed.

15 Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel og sammenlignet med aminosyresammensætningen bestemt vej hjælp af cDNA-sekventering.

DK 165640 B

20

Aminosyre_Fundet Nærmeste hele tal cDNA

•c

Ala 20,85 21 21

Arg 14,42 14 14

Asn 36,91 37 19 5 Asp 19

Cysc 5,54 6 6

Gin 18,20 18 6

Glu 12

Gly 27,51 28 28 10 His 5,94 6 6

Ileb 14,99 15 16

Leu 20,06 20 20

Lys 7,05 7 7

Met 0 0 0 15 Phe 14,80 15 15

Pro 11,90 12 12

Sera 16,76 17 17

Thra 18,46 18 19

Trp 3,58 4 4 20 Tyr 9,84 10 10

Valb 18,24 18 18 a) ekstrapoleret værdi til hydrolysetid 0 b) esktrapoleret værdi til uendelig hydrolysetid 25 c) bestemt som S-β-(4-pyridylethyl)-cystein.

Eksempel 2

Transformering af Aspergillus orvzae (generel procedure) 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Gene-30 tics, Cold Spring Harbour Laboratory, 1981) blev podet med sporer af A. oryzae, A. niger eller argB mutanter heraf, og inkuberedes under omrystning ved 37°C i ca. to dage. Myceliet blev høstet ved filtrering gennem miraklæde og vasket med 200 ml 0,6 M MgS04. Myceliet blev suspenderet i 15 ml 1,2 35 M MgS04, 10 mM NaH2PQ4, pH = 5,8. Suspensionen blev afkølet 21

UK Ibbb^UB

på is, og der blev tilsat 1 ml puffer indeholdende 120 mg •s

Novozym(R> 234, batch 1687. Efter 5 minutters forløb blev der tilsat 1 ml af 12 mg/ml BSA (Sigma type H25), og inkube-ringen blev fortsat under mild omrøring i 1,5 - 2,5 timer 5 ved 37eC, indtil et stort antal protoplaster var synlige i en prøve undersøgt under mikroskop.

Suspensionen blev filtreret gennem miraklæde, filtratet blev overført til sterile rør og belagt med 5 ml 0,6 M sorbitol, 100 mM Tris-HCl pH = 7,0. Der blev centrifugeret 10 i 15 minutter ved 1000 g, og protoplaster blev samlet fra toppen af MgSO^-laget. Der blev tilsat 2 rumfang STC (1,2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM CaCl2) til proto-plastsuspensionen, og blandingen blev centrifugeret i 5 minutter ved 1000 g. Protoplastpillen blev resuspenderet i 3 15 ml STC og repelleteret. Dette blev gentaget. Til slut blev protoplasterne resuspenderet i 0,2 - 1 ml STC.

100 μΐ af protoplastsuspensionen blev blandet med 5-25 jug af det pågældende DNA i 10 μΐ STC. Protoplasterne fra argB-stammerne blev blandet med pSal43 DNA (et plasmid 20 bærende et A. nidulans argB gen), og protoplaster fra argB+ stammerne blev blandet med p3SR2 (et plasmid bærende et A. nidulans amdS-gen). Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 25 minutter, og der blev tilsat 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl2 og 10 mM Tris-HCl pH = 7,5, og 25 der blev blandet omhyggeligt (to gange), hvorpå der til slut blev tilsat 0,85 ml af den samme opløsning og blandet omhyggeligt. Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 25 minutter, centrifugeret i 15 minutter ved 2500 g, og pillen blev resuspenderet i 2 ml 1,2 M sorbitol. Efter en yder-30 ligere sedimentering blev protoplasterne spredt ud på passende plader. Protoplaster fra argB-stammerne transformeret med pSal43 blev spredt ud på minimalplader (Cove, Biochem. Biophys.Acta 113 (1966), 51-56) med glucose og urinstof som henholdsvis carbon- og nitrogenkilde og indeholdende 1,2 M 35 sorbitol til osmotisk stabilisering. Protoplaster fra argB+-

DK 165640 B

22 stammerne transformeret med p3SR2 blev udspredt på minimalplader (Cove, Biochem.Biophys.Acta 113 (1966), 51-56) inde holdende 1,0 M sucrose, pH = 7,0, 10 mM acetamid som nitrogenkilde og 20 mM CsCl til inhibering af baggrundsvæksten.

5 Efter inkubering i 4-7 dage ved 37°C blev sporerne taget op, suspenderet i sterilt vand og spredt ud til enkeltkolonier.

Denne procedure blev gentaget, og sporerne fra en enkelt koloni efter den anden reisolering blev opbevaret som en specifik transformant.

10

Eksempel 3

Ekspression af rekombinant Humicola lipase (RHL) i en A. orvzae stamme p960 er transformeret ind i A. oryzae IFO 4177 ved 15 cotransformering med p3SR2, der indeholder amdS-genet fra A. nidulans, som beskrevet i eksempel 2. Protoplaster fremstillet som beskrevet blev inkuberet med en blanding af lige store mængder p960 og p3SR2 (ca. 5 μg af hver) . Transfor-manter, der kan anvende acetamid som eneste nitrogenkilde, 20 reisoleres to gange. Efter vækst på YPD (Sherman et al, 1981) i tre dage analyseres kultursupernatanterne ved SDS-PAGE. Gelerne farves med Comassie Brilliant Blue R. De bedste transformanter udvælges til yderligere undersøgelser og vækst i en 2 liter Kieler fermenteringsbeholder på 4% 25 sojabønnemel, idet der tilføres glukose under væksten. Kulturen omrøres kraftigt under gæringen. Det rekombinante Hu-micola lipaseprodukt (RHL) blev isoleret fra kulturvæsken ved fjernelse af celler ved centrifugering, ultrafiltrering af supernatanten og frysetørring. Et udbytte på 5000 LU/ml 30 supernatant blev målt.

Eksempel 4

Ekspression af en Humicola lipase i en A. niaer stamme p960 blev transformeret ind i A. niger argB ved 35 cotransformering med pSal43, der indeholder argB-genet fra 23 A. nidulans, som beskrevet i eksempel 2. Protoplaster blev inkuberet med lige mængder af hvert plasmid, ca. 5 /xg. Transformanter blev udvalgt på minimalplader (Cove Biochim. Biophys.Acta 113 (1966), 55-56) ved hjælp af argeninkrav.

5 Efter to reisoleringer af conidiosporer blev transformanterne dyrket i syv dage i YPD (Sherman et al., 1981) ved 30*C. Kultursupernatanterne blev analyseret ved hjælp af SDS-PAGE. De fleste af transformanterne producerede Humicola lipase i deres supernatanter. Et udbytte på 2390 10 LU/ml supernatant blev målt.

Kulhydratindholdet blev analyseret ved Endo H behandling som beskrevet i eksempel 5. Det blev konstateret, at kulhydratindholdet var af ca. samme størrelsesorden som for den native Humicola lipase. Endo H følsomheden var den 15 samme som for den rekombinante Humicola lipase fra A. oryzae. Det blev derfor konkluderet, at arten af glykosyle-ringen er den samme i A. oryzae og A. niger.

Eksempel 5 20 Bestemmelse af kulhydratindholdet i RHL (rekom- binant lipaseprodukt fra eksempel 3) og HLL (nativt lipase-produkt fra dyrkning af DSM4109).

Behandling med enzymer, der er i stand til at fraspalte kulhydratsidekæder (Endo H og Glykopeptidase F).

25 RHL og HLL blev behandlet med glykopeptidase F

(Boehringer nr. 91378, 100 enheder. 1 ampul opløst i 500 μΐ vand) og Endo H (Sigma nr. E6878, opløst i citratpuffer pH 5,5).

HLL og RHL blev hver opløst i 10 mM Tris pH 7,5 (1 30 mg/ml. Der blev tilsat 2 μΐ glykopeptidase F til 100 μΐ af både HLL og RHL, og prøverne blev inkuberet ved 37"C i 20 timer.

HLL og RHL blev desuden hver opløst i 10 mM Tris pH 7,5 (1 mg/ml), og der blev tilsat 25 μΐ Endo H og 50 μΐ 24

DK 165640 B

0,X M natriumacetat pH 5,0 til henholdsvis 25 μΐ af HLL og RHL. Prøverne blev inkuberet ved 37°C i 20 timer.

Prøverne blev kørt på SDS-PAGE-gradientgeler 7,5-20% sammen ubehandlet HLL og RHL. SDS-PAGE-gradientgelen er 5 vist i fig. 7. Prøverne i fig. 7 er som følger:

1) Standard: 92K, 67K, 43K, 30K, 20, 1K, 14, 4K

2) HLL, 1 mg/ml i 10 mM Tris pH 7,5.

3) HLL + Endo H

10 4) RHL + Endo H

5) RHL + Glykopeptidase F

6) HLL + Glycopeptidase F

7) RHL + Endo H

8) RHL + Glykopeptidase F

15 9) RHL, 1 mg/ml i 10 mM Tris pH 7,5.

Det fremgår af fig. 7, at glykopeptidase F er i stand til at fraspalte kulhydratdelen fra både HLL og RHL, og at det resterende protein er samme størrelse. Endo H er 20 på den anden side kun i stand til at fraspalte kulhydrat fra RHL, mens Endo H behandling af HLL ikke har nogen effekt.

Både HLL og RHL er derfor N-glykosylerede. Glyko-syleringen er imidlertid af en forskellig natur.

Kulhydratanalysen blev udført ved hjælp af metoden 25 beskrevet af Thim et al., indleveret til publicering i Biochemistry, Chaplin, M.F. (1982), Anal.Biochem. 123, 336-341 og Jentoft, N. (1985), Anal.Biochem. 148, 424-433.

Kort fortalt blev prøver indeholdende lipase underkastet methanolyse efterfulgt af re-N-acetylering af 30 aminosukker og eliminering af O-acetyl grupper ved et yderligere, mildt methanolysetrin. Derivater egnet til analyse ved omvendt fase højtryksvæskekromatografi blev opnået ved perbenzoylering af methylglykosiderne.

Resultatet af analysen er vist i følgende tabel.

35

LIIV IDODH-U D

25

Nativ Rekombinant ·*.

Humicola lipase Humicola lipase

HLL RHL

mol/mol_ mol/mol_ 5 N-acetylglukosamin 1,2 1,2

Mannose 5,7 8,6

Galactose 0 3,3

Kulhydratdelen i nativ Humicola lipase, HLL er 10 sammensat af to monosaccharider fundet i N-glykosyleringer af højmannosetypen (Montrenil, J. et al. (1986) i "Carbohydrate analysis: a practical approach", Chaplin, M.F. og Kennedey, J.F. (Eds.), IRL Press, Oxford, side 143). Resultatet for N-acetylglucosamin (< 2 mol/mol) indikerer, at 15 den primære sekvens kun indeholder en enkelt N-glykosyle- ring. Dette kan desuden afledes fra cDNA-sekvensen (fig. 5a + 5b) . Yderligere kan mannose være O-glykosidisk bundet til serin- eller threoninrester.

Foruden N-acetylgluksamin og mannose indeholder 20 den rekombinante Humicola lipase RHL galactose i betydelig mængde. Som nativ lipase indikerer indholdet af N-acetylglukosamin tilstedeværelsen af en enkelt N-glykosylering, skønt denne er af en kompleks type eller hybridtype, hvis galak-tose er en del heraf. O-glykosylering ved serin- eller 25 threoninrester må imidlertid være ansvarlige for tilstedeværelsen af galaktose, hvis N-glykosyleringen af den rekombinante RHL-lipase er af højmannosetypen, således som det var tilfældet for den native HLL-lipase.

Gennemsnitlig forøger kulhydratsidekæderne mole-30 kylvægten af nativ Humicola lipase HLL med ca. 1500 D, og af den rekombinante Humicola lipase RHL med ca. 2600 D. Dette svarer til et kulhydratindhold på henholdsvis ca. 4,9% og 8,1%.

35

DK 165640 B

26

Eksempel 6

Indvirkning af pH og temperatur på stabiliteten af RHL oa HLL.

RHL (1,4 x 106 LU/g) og HLL (0,2 x 106 LU/g) blev 5 hver opløst i pufferopløsninger af varierende pH og in kuberet i to timer ved temperaturer på 55°C og 60°C.

Pufferopløsningerne blev fremstillet ud fra 47,5 mM natriumacetat, MOPS (3-(N-morpholino)-propansulfonsyre) og borsyre, med pH-indstillinger til 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 10 ved hjælp af 1 N HC1 eller 1 N NaOH. Foruden den anvendte pufferopløsning blev der i et separat forsøg med en prøve af HLL, der var blevet oprenset til 1,5 x 106 LU/g sat PMSF (phenylmethansulfonfluorid) for at inhibere proteaseindhol-det i det native lipaseprodukt.

15 Lipasekoncentrationerne i opløsningen blev ind stillet til ca. 10-15 LU/ml.

Umiddelbart efter inkuberingen blev lipaseopløs-ningerne afkølet i et vandigt isbad og holdt ved denne temperatur indtil analyse den samme dag (LU-metode, Novo 20 Nordisk analyseforskrift nr. AF 95/5).

Resultaterne er angivet i fig. 6 og fig. 8.

Det fremgår af fig. 6, at termostabiliteten af RHL er større end termostabiliteten af HLL ved pH 5-10 både ved 55“C og 60eC.

25 Det fremgår af fig. 8, at den større termostabili tet af RHL kun delvis skyldes fravær af H. lanuginosa prote-aseaktivitet.

Eksempel 7 30 Stabilitet af RHL og HLL med en sammenlignelig aktivitet på 4 x 106 LU/g i nærværelse af en typisk alkalisk Bacillus sp. protease (her det kommercielt tilgængelige detergentenzym Esperase®).

Inkuberingsbetingelserne var 0,1 M borsyre, pH 9,5 35 og 40°C eller 55°C under anvendelse af koncentrationer på

UIV IOODH-U D

27 3600 LU/liter og 0,057 AU/liter (AU/LU = 0,016 x 10'3). Restaktiviteterne blev beregnet på basis af referenceinkube-ringerne.

Resultaterne er angivet i fig. 9.

5 Det fremgår af fig. 9, at termostabiliteten af RHL

i nærværelse af en alkalisk Bacillus protease er overlegen i forhold til termostabiliteten af HLL, hvilket indicerer, at der er forskel i deres følsomhed over for proteaseangreb.

10 Eksempel 8

Sammenligningsforsøg a) Fremstilling af rekombinant Humicola lipase ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen:

En rekombinant fremstillet som beskrevet i eks. 3 15 blev inokuleret fra et YPG-agar substrat (YPG-agar: 0,4% gærekstrakt, 1,5% glucose, 0,1% K2HP04, 0,05% MgS04-7H20, 2% agar) ind i en 500 ml kolbe med 130 ml næringsmedium med følgende sammensætning:

Soyamel 3% 20 Maltodextrin (Glucidex 6 fra Roquette Fréres) 1,5%

Bactopeptone (Difco) 0,5%

Pluronic 61 L 0,02%

Kolben blev rystet i 4 dage ved 308C med 275 om- 25 drejninger pr. minut. Et udbytte på 2990 LU/g blev målt.

b) Fremstilling af nativ Humicola lipase ved dyrkning af Humicola lanuginosa.

DK 165640 B

28

Humicola lanuginosa, DSM nr. 4109, blev dyrket i et GTS-la substrat, bestående af: 10 g/1 gærekstrakt 5 g/1 Span 80 5 5 g/1 Tween 80 2 g/1 MgS04.7H2o

0,1 g/1 Cacl2.2H2Q

2 g/1 Nalco 10 pH før autoklavering : 6,0.

10 Gæring forløb ved 45°C i 3 døgn. Herefter måltes lipaseaktiviteten i 2 kolber til henholdsvis 541 LU/ml og 440 LU/ml.

Claims (36)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en rekom- binant Humicola lipase i Aspergillus sp., kendetegnet ved (a) tilvejebringelse af et rekombinant DNA-klo-ningsvektorsystem, der er i stand til at integreres i 10 genomet af en egnet Aspergillus sp. vært i én eller flere kopier, og som omfatter: DNA-sekvenser, der koder for funktioner, der letter genekspression,en selektionsmarkør til selektion af transformanter, og en DNA-sekvens, der koder for en Humicola lipase, 15 (b) transformering af Aspergillus værten, der ikke indeholder et funktionelt gen for den valgte . selektionsmarkør, med det rekombinante DNA-kloningsvektor-system fra trin a, (c) dyrkning af den transformerede Aspergillus 20 vært i et næringsmedium og eventuel udvinding af lipasen fra næringsmediet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at DNA-sekvenserne, der koder for funktioner, der letter genekspression, omfatter en promoter, transskriptions- 25 startsteder og transskriptionsterminator- og polyadenyleringsfunktioner.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der oven for promotoren findes upstream-aktiverings-sekvenser.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at selektionsmarkøren er A. nidulans eller A. niger argB genet, A. nidulans trpC genet, A. nidulans amdS genet eller, Neurospora crassae Pyr4 genet eller DHFR genet. DK 165640 B

• 5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at selektionsmarkøren er ArgB-genet fra A. nidulans eller A. niger eller amdS-genet fra A. nidulans.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, 5 at promotor- og upstream-aktiveringssekvenserne er afledt fra et gen, der koder for et ekstracellulært eller intracel-lulært protein, såsom en amylase, en glukoamylase, en protease, en lipase, en cellulase eller et glykolytisk enzym.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 10 at promotor- og upstream-aktiveringssekvenserne er afledt fra et gen, der koder for A. oryzae TAKA-amylase, Rhizomucor miehei aspartatproteinase, A. niger neutral a-amylase, A. niger syrestabil α-amylase, A. niger glukoamylase eller Rhizomucor miehei lipase.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Aspergillus værten er en Aspergillys oryzae stamme.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at promotoren er A. oryzae TAKA-amylasepromotoren eller funktionelle dele deraf.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at promotor og upstream-aktiverende sekvenser har følgende sekvens: GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC 25 CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at promotor- og upstream-aktiveringssekvenserne har følgende sekvens: AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at sekvensen i krav 11 forudgåes af den 1,05 kb ikke-se-kventerede upstream-region fra position 0 til 1,05 i pTAKA 17.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at vektorsystemet desuden indeholder en DNA-sekvens, som koder for en præregion, der sikrer sekretion af det udtrykte produkt ud i kulturvæsken.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, 20 at præregionen fås fra et glukoamylase- eller et amylasegen fra en Aspergillus art, et amylasegen fra en Bacillus art, et lipase- eller proteinasegen fra Rhizomucor miehei, genet for α-faktoren fra S. cerevisiae eller et Humicola lipase-gen.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at præregionen fås fra genet for Humicola lanuginosa lipasen, genet for A. oryzae TAKA-amylasen, A. niger neutral· θ'-amylase, A. niger syrestabil α-amylase, B. licheniformis a-amylase, den maltogene amylase fra Bacillus NCIB 11837, B. 30 stearothermophilus α-amylase eller B. licheniformis sub-tilisin.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at vektorsystemet består af to vektorer, hvoraf det ene indeholder selektionsmarkøren, og det andet indeholder DNA- sekvenser, der koder for funktioner, der letter genekspres-sion, og en DNA-sekvens, der koder for Humicola lipasen.

17. Rekombinant Humicola sp. lipase, kendetegnet ved, at den kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge krav 5 1, og at den har en glykosylering, der er forskellig fra glykosyleringen af den native Humicola sp. lipase.

18. Rekombinant Humicola sp. lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at kulhydrat indholdet er fra ca. 5 til ca. 30% (vægt/vægt).

19. Rekombinant Humicola sp. lipase ifølge krav 18, kendetegnet ved, at kulhydratindholdet er fra ca. 5 til ca. 15% (vægt/vægt).

20. Rekombinant Humicola sp. lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at kulhydrat indholdet er fra ca. 6 til 15 ca. 10% (vægt/vægt).

20 CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA CTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC

21. Rekombinant Humicola sp. lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at kulhydratindholdet er fra ca. 7,5 til ca. 8,5% (vægt/vægt).

22. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, 20 kendetegnet ved, at den indeholder galaktose.

23. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den indeholder N-acetylglukosamin, mannose og galactose.

24. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 22, 25 kendetegnet ved, at den indeholder fra ca. 1 til ca. 12 mol galactose pr. mol lipaseprotein.

25. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 22, kendetegnet ved, at den indeholder fra ca. 1 til ca. 6 mol galactose pr. mol lipaseprotein.

25 CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT

26. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den indeholder fra ca. 3 til ca. 20 mol mannose pr. mol lipaseprotein.

27. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den indeholder fra ca. 3 til ca. 12 mol 35 mannose pr. mol lipaseprotein. DK 165640 B

28. Rekombinant 'Humicola lipase ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den pr. mol lipaseprotein indeholder ca. 2 mol N-acetylglukosamin, fra ca. 3 til ca. 20 mol mannose og fra ca. 1 til ca. 12 mol galactose.

29. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 24, kendetegnet ved, at den pr. mol lipaseprotein indeholder ca. 2 mol N-acetylglukosamin, ca. 3 til ca. 12 mol mannose og ca. 1 til ca. 6 mol galactose.

30. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 24, 10 kendetegnet ved, at den pr. lipaseprotein indeholder ca. 2 mol N-acetylglukosamin, fra ca. 6 til ca. 9 mol mannose og fra ca. 2 til ca. 4 mol galactose.

30 AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTACTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT

30 GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT

31. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den har en restaktivitet efter 2 timer 15 ved 60°C på mindst 90% ved en pH-værdi fra ca. 6 til ca. 9.

32. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den har en restaktivitet efter 2 timer ved 60“C på mindst 80% ved en pH-vaerdi fra ca. 5,5 til ca. 9,2.

33. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den har en restaktivitet efter 2 timer ved 55°C på mindst 95% ved en pH-værdi fra ca. 6 til ca. 9,5.

34. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, 25 kendetegnet ved, at den har en restaktivitet efter 2 timer ved 55°C ved en pH-værdi på 9 på ca. 99%.

35. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den har en restaktivitet efter 2 timer ved 55°C ved en pH-værdi på 10 på mindst 85%.

35 CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC DK 165640 B GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA'TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC 5 CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT eller funktionelt ækvivalent nukleotidsekvens. 10

35 TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC 5 AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA 10 AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG eller en funktionel ækvivalent nukleotidsekvens.

36. Rekombinant Humicola lipase ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det er en Humicola lanuginosa lipase.