CN102154358B - 一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明申请所述的一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法，先将获得潮霉素抗性表达盒克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒，然后利用PCR技术分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒，最后，将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。得到的高效表达的产脂肪酶基因质粒，经转化后得到高表达脂肪酶的基因工程青霉菌，表达高效稳定，较常规的脂肪酶的生产方法具有较大的优势。
Description
技术领域：
本发明申请涉及一种质粒的构建方法，具体来说，是一种能够高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
近年来脂肪酶(Lipase EC)在工业应用方面取得了很大进展，碱性脂肪酶是在碱性条件下水解的脂肪酶，它可以水解天然油脂，产生脂肪酸和甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪作用等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛的应用，并已经成为全世界酶制剂市场上重要的品种。
在现有的技术中，通过对大量的微生物菌种进行选育，已经获得了产碱性脂肪酶能力较强的扩展青霉(P.expansium)菌株，其产脂肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费力而且收效不明显，目前通过采用这些方法来提高该菌株产脂肪酶的能力已经非常有限，潜力小。
发明内容
本发明申请即是针对目前在获取脂肪酶的技术中存在的缺乏一种稳定高效的，并且能够在转化青霉菌后高效表达脂肪酶的质粒，本发明申请的另一目的是提供该种质粒的构建方法。
为了以后的表述方便，下文中提到的“PEL”是指青霉的脂肪酶基因，“PgpdA”是指构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子，“TtrpC”是指构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，PtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子，这些和以下提到的质粒都是基因工程技术中常见的术语，这里不再赘述。
具体来说，本发明申请所述的一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法，其特征在于：所述的构建方法包括下述的步骤：
1、获得潮霉素抗性表达盒克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；
2、利用PCR技术分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；
3、将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。
所述的步骤1中的潮霉素抗性表达盒为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子(PtrpC)驱动的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因表达盒。
所述的构建方法中，目标质粒包括pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300或pHB。
所述的构建方法中，步骤1中，获得潮霉素抗性表达盒的方法包括PCR技术或限制性酶切技术。
所述的构建方法中，步骤2中，获得青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)的方法包括PCR扩增、限制酶克隆或化学合成技术克隆。
具体的，所述构建方法包括如下的步骤：
1)利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；
2)PCR扩增构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)后将PgpdA克隆至目标质粒，得到重组质粒；
3)PCR扩增脂肪酶基因(PEL)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，产物经凝胶回收后克隆至目标质粒的相应位点，得到含PEL基因表达盒的载体；
4)利用限制性酶切技术获得PEL基因表达盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重组质粒上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。
进一步的，所述构建方法包括如下步骤：
1)利用限制性内切酶将潮霉素抗性表达盒酶切下来，克隆到质粒pCAMBIA2300，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；
2)PCR扩增强启动子PgpdA，将PgpdA克隆至目标载体，得到含有强启动子的重组质粒；
3)PCR扩增PEL和TtrpC，然后将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收，限制性内切酶消化后克隆至PgpdA启动子之后，得到含有PEL基因表达盒的载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC；
4)利用限制性内切酶对载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒pCHAMBIA2302上，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC。
更进一步，所述构建方法包括如下步骤：
1)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到pCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；
2)PCR扩增质粒pAN7-1上的强启动子PgpdA，将PgpdA克隆至PMD-18-T载体，得到重组质粒PMD-18-T::PgpdA；
3)PCR扩增PEL和TtrpC，然后利用重叠延伸PCR技术将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收，限制性内切酶SpeI和PmeI消化后克隆至PMD-18-T::PgpdA的相应位点，得到含有PEL基因表达盒的载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC；
4)利用限制性内切酶Sal I，Pme I对载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒pCHAMBIA2302上，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC。
本发明申请所述的构建方法得到的高效表达的产脂肪酶基因质粒，经转化后得到高表达脂肪酶的基因工程青霉菌，表达高效稳定，较常规的脂肪酶的生产方法具有较大的优势。
附图说明
图1为PV2+载体的结构示意图；
图2为pCAMBIA2300载体的结构示意图；
图3为pCAMBIA2302载体的结构示意图；
图4为PMD18-T::gpdA-Lip-TtrpC载体的结构示意图；
图5为pCHAMBIA2302::PgpdA-Lip-TtrpC最终载体的结构示意图；
图6为超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图；
图7为构建的超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的PCR鉴定图谱；
其中，1-6：独立的农杆菌转化子、+：阳性对照、-：阴性对照、M：DL-2000Marker；
图8为青霉转基因菌株的PCR鉴定图谱；
其中，1-5：独立的农杆菌转化子、+：阳性对照、-：阴性对照、M：DL-2000Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明申请所述的本发明申请所述的一种高效表达的产脂肪酶基因质粒进行进一步描述，目的是为了公众更好的理解本发明的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在本发明精神实质内，对本发明申请所述高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法的改进，目标质粒和限制性内切酶的替换都是本领域一般技术人员无需创造性的劳动即可获得的，因此都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。
实施例一、超表达载体的构建
采用如下的步骤：
(1)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来(如图1所示)，片段经凝胶回收，克隆到pCAMBIA2300质粒(如图2所示)的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302(如图3所示)；潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA或者直接合成，用于构建PEL基因超表达载体的质粒除pCAMBIA2300外，还可用能在丝状真菌中表达的质粒如pCAMBIA1300、pCAMBIA3300等pCAMBIA系列载体和pHB载体；
(2)根据扩展青霉菌P.expansium的脂肪酶基因PEL(AF330635)的序列设计引物(正向引物：TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT下划线的序列为限制性酶Spe I切点；反向引物：TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下划线的序列为限制性酶Not I切点)，利用PCR技术扩增全基因序列，PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s，35个循环；72℃ 10min；
(3)根据质粒pPAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56：117-124)的序列设计引物(正向引物：GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA，下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物：GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC，下划线的序列为限制性酶Pme I切点)，利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子TtrpC，PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 10min；
(4)取(2)和(3)的反应液各1μL作为模板，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，进行PCR扩增，PCR的反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 150s，35个循环；72℃ 10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并克隆到PMD-18-T：载体，获得中间载体PMD-18-T::PEL-TtrpC；
(5)根据质粒pPAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56：117-124的序列设计引物(正向引物：GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物：GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下划线的序列为限制性酶Pme I切点)利用PCR技术扩增强启动子PgpdA。PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 150s，35个循环；72℃10min。利用限制性内切酶Sal I和Spe I将PgpdA克隆到载体PMD-18-T::PEL-TtrpC的相应位点，获得中间载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC(如图4所示)；
(6)利用限制内切酶Sal I和Pme I对载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，回收表达盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相应位点，获得最终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC(如图5所示)，整个的构建过程如图6所示；
(7)对含有最终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的菌进行扩大培养，并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105，随机挑选6株转化子，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T::PEL-TtrpC为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对这6株菌进行PCR鉴定，结果显示这6株菌均为阳性，见图7。
实施例二、青霉基因工程菌的获得
所述青霉基因工程菌的活动包括如下的步骤：
(1)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于28℃培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子；
(2)将实例一中含终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有链霉素、卡那霉素(均为100μg/ml)的LB液体培养基中28℃，200rpm过夜培养，用含有链霉素和卡那霉素(均为100μg/ml)的MM培养基重新活化，28℃，220rpm培养48小时。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM液体培养基洗涤，最后用IM液体培养基稀释至OD600＝0.15，然后在28℃，220rpm的条件下培养6-8小时，至OD600＝0.5-0.6；
(3)将第(1)步得到的新鲜孢子配制成1×107个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(2)中的工程农杆菌等体积混合，取200μL均匀涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基(含AS 200μg/mL)之上，28℃共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素(100μg/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500μg/mL，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上28℃培养2天，揭下玻璃纸，在28℃条件下培养1-3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述的青霉基因工程菌，如此获得了30株青霉基因工程菌。随机挑选5株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T::PEL-TtrpC为阳性对照，野生型青霉基因组DNA为阴性对照，对这5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性，见图8。
MM培养基的成分如下所述：
1M K2HPO4-KH2PO4(PH7.0)10mL，M-N(MgSO4·7H2O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl2·2H2O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO4 10mL，Spore element(ZnSO4·7H2O 100mg/L，CuSO4·5H2O 100mg/L，H3BO3 100mg/L，MnSO4·H2O100mg/L，Na2MoO4·2H2O 100mg/L)5mL，20％NH4NO3 2.5mL，无菌水941.5mL。
IM培养基的成分如下所述：
1M K-buffer(PH4.9)10mL，M-N(MgSO4·7H2O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl2·2H2O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO4 10mL，Spore element(ZnSO4·7H2O 100mg/L，CuSO4·5H2O 100mg/L，H3BO3 100mg/L，MnSO4·H2O 100mg/L，Na2MoO4·2H2O 100mg/L)5mL，20％NH4NO3 2.5mL，50％甘油10mL，1M MES(PH5.5)40mL，100mM AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌水898.7mL
CM培养基：加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5％琼脂，其它成份同IM培养基。
PDA培养基(g/L)：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，15；PH自然。
实施例三、产脂肪酶能力对比实验
随机挑选实例2所得的青霉基因工程菌接种到PDA培养基上，培养10天后分别接入种子培养基50mL中，在28℃，210rpm摇床培养24h，然后以10％的接种量分别转入发酵培养基(250mL三角瓶装30mL发酵培养基)，在28℃，210rpm条件下发酵48h；然后将发酵液离心，取上清液进行脂肪酶活力检测。
利用酸碱滴定法对脂肪酶活力进行检测。
步骤：
取100mL三角瓶20只，分别加入4.0mL pH9.4的Gly-NaOH缓冲液和5.0mL橄榄油乳化液；放入震荡恒温水浴锅36℃水浴锅预热5分钟.酶液过滤后，用0.05mol/L pH9.4的Gly-NaOH缓冲液稀释使酶活为4-5u/mL后测定。往其中两个各加入1mL稀释好的酶液，缓慢振荡(60次/min)10分钟(精确计时).另外两瓶做空白对照.立即加入95％酒精20mL(空白对照加入1mL稀释好的酶液)，摇匀，加入10mL 30％的氯化钠溶液，摇匀；用0.01mol/LNaOH溶液滴定样品使其与空白对照的pH相同，记下0.01mol/LNaOH用量。
计算
X＝A×B×1/T×n
式中：
X——样品的酶活力(u/g或u/mL)；
A——滴定样品时消耗标准0.01mol/LNaOH的体积(mL)；
B—-滴定用NaOH的浓度(μmol/mL)
T——酶促反应时间(min)，
n——稀释倍数；
同时做两份平行，结果取平均值，所得结果表示至整数。平行试验相对误差不得超过5.0％。
PDA培养基(g/L)：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，15；PH自然
种子培养基(％)：黄豆饼粉4，玉米淀粉0.8，NaNO3 0.3，Na2HPO4 0.2，K2SO4 0.25，MgSO4 0.03，FeSO4 0.003
发酵培养基(％)：黄豆饼粉6，玉米淀粉1，NaNO3 0.4，Na2HPO4 0.2，K2SO40.3，MgSO4 0.035，FeSO4 0.02，CaCO3 0.5，Na2CO3 0.02
橄榄油乳化液的制取：4％PVA溶液和橄榄油为2∶1(v/v)，放到小三角瓶里(外包冰块)，调整为转速为10000转/分，—次乳化3分钟，间隔3分钟，共乳化3次。
转基因青霉和非转基因青霉的酶活力测定结果见下表
其中WT为青霉野生型菌株，T1，T2，T3，T4，T5：为独立的青霉转化子，由表可知，转基因青霉的酶活力显著高于非转基因青霉的酶活力。
Claims (6)
1.一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法，其特征在于：所述的构建方法包括下述的步骤：
1)获得构巢曲霉色氨酸合成酶启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶基因表达盒克隆至目标质粒pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300或pHB上，获得潮霉素抗性的重组质粒；
2)利用PCR技术分别扩增青霉的脂肪酶基因、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；
3)将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤1）中，获得构巢曲霉色氨酸合成酶启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶基因表达盒的方法包括PCR技术或限制性酶切技术。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤2）中，获得青霉的脂肪酶基因、构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子的方法包括PCR扩增、限制酶克隆或化学合成技术克隆。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下的步骤：
1)利用PCR技术或限制性酶切技术获得构巢曲霉色氨酸合成酶启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶基因表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；
2)PCR扩增构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子后将其克隆至目标质粒，得到重组质粒；
3)PCR扩增青霉的脂肪酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，产物经凝胶回收后克隆至步骤2）得到的重组质粒的相应位点，得到含PEL基因表达盒的载体；
4)利用限制性酶切技术获得PEL基因表达盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重组质粒上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下步骤：
1)利用限制性内切酶将构巢曲霉色氨酸合成酶启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶基因表达盒酶切下来，克隆到质粒pCAMBIA2300，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；
2)PCR扩增构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子，将其克隆至目标载体，得到含有强启动子的重组质粒；
3)PCR扩增青霉的脂肪酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，然后将青霉的脂肪酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子进行连接，融合片段经凝胶回收，限制性内切酶消化后克隆至构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子之后，得到含有PEL基因表达盒的载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC；
4)利用限制性内切酶对载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒pCHAMBIA2302上，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下步骤：
1)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将构巢曲霉色氨酸合成酶启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶基因表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到pCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；
2)PCR扩增质粒pAN7-1上的构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子，将其克隆至PMD-18-T载体，得到重组质粒PMD-18-T::PgpdA；
3)PCR扩增青霉的脂肪酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，然后利用重叠延伸PCR技术将青霉的脂肪酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子进行连接，融合片段经凝胶回收，限制性内切酶SpeI和PmeI消化后克隆至PMD-18-T::PgpdA的相应位点，得到含有PEL基因表达盒的载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC；
4)利用限制性内切酶Sal I，Pme I对载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒pCHAMBIA2302上，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC。
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