CN107177622A - 一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，属于遗传转化领域。本发明利用根癌农杆菌介导的转化方法，操作简单，转化率高并且转化稳定，成功实现了意大利青霉的高效遗传转化，使得意大利青霉中进行同源敲除、过表达、异源表达成为可能，为基因工程手段对该菌株进行遗传改良，探究其侵染柑橘的致病机理奠定基础。

Description

一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法
技术领域
本发明涉及意大利青霉(penicillium italicum)的遗传转化方法，属于遗传转化领域。
背景技术
柑橘类水果以其独特的香气和味道，在日常销售的水果中非常受欢迎并在营养供给和促进健康等方面发挥重要作用。意大利青霉在柑橘的采后贮藏、运输期间引起大批量的果实腐烂，给农业生产带来巨大的经济损失。通过农杆菌介导的遗传转化技术，可对意大利青霉的特定基因的功能进行探索，从而进一步探究意大利青霉的致病机理、更有效的防治该病害。
跟癌农杆菌介导转化是目前应用最为广泛的遗传转化方法。根癌农杆菌是一种特殊的植物病原菌，能够通过位于Ti质粒上的T-DNA经IV型分泌系统转移到宿主上，T-DNA上的基因编码酶可以影响植物生长调节剂的产生，并且它们的表达导致植物细胞的不受控制的生长，形成冠状肿瘤。根癌农杆菌的这种DNA转移能力可用于真菌的转化，为此使用二元载体系统，即含有24bp边界重复的目的DNA的双元载体和含有对DNA转移十分重要Vir区域(毒力区域)的Ti质粒。Vir区编码的蛋白质参与T-DNA的形成和转运。酚类化合物如乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir区基因的活化和表达。
农杆菌介导转化有着以下优点：(1)转化效率相比其他方法来说显著提高；(2)该方法可以适用于大多数的真菌，包括一些顽抗的真菌；(3)农杆菌介导转化可以使用多种起始材料，除原生质体之外，还可以使用较易获得的分生孢子、菌丝体、子实体，从而避免了原生质体提取的繁琐过程；(4)农杆菌介导转化的单拷贝数较高；(5)农杆菌介导转化的遗传稳定性比较高。
发明内容
本发明的目的之一是提供根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，包括以下步骤：
1)以潮霉素B抗性基因作为筛选标记，以pacC的上、下游序列作为同源臂，敲除意大利青霉的pacC基因，构建含有潮霉素B抗性基因的基因敲除载体pacC3300；
2)将步骤1)的基因敲除载体pacC3300转化根癌农杆菌感受态细胞，得到含有敲除载体的根癌农杆菌；
3)将含有敲除载体的根癌农杆菌在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上扩大培养至OD600为0.8，然后再转入含有诱导剂的IM培养基培养至OD600为0.5，得到根癌农杆菌菌液；
4)将萌发的意大利青霉制成浓度为1x105/mL的孢子悬浮液；
5)将步骤2)的根癌农杆菌菌液与步骤3)的意大利青霉孢子悬浮液按1:1的体积比混合，在带有承载膜的Co-IM固体培养基上共培养，培养温度25℃，培养时间36h，最后转入含有50ug/ml的潮霉素B和200ug/ml的头孢霉素的PDA培养基中进行抗性培养，筛选获得转化子，
所述pacC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述潮霉素B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明为了测试野生型意大利青霉对筛选基因潮霉素B的敏感性，开展了意大利青霉对潮霉素B敏感性实验，结果表明潮霉素B>5ug/ml时，可完全抑制意大利青霉的生长，因此可以使用潮霉素B作为筛选标记。
本发明为了探究能介导意大利青霉转化的根癌农杆菌类型，使用AGL-1和GV3101作为农杆菌原料，经为实验，农杆菌AGL-1介导转化得到了许多转化子而GV3101并没有得到转化子，因此所述的用于介导意大利青霉的根癌农杆菌为AGL-1。
本发明为了探究意大利青霉孢子悬浮液的浓度对转化的效率，所述的孢子悬浮液的浓度为1x104-1x107cfu/ml，进行转化实验，更为优选的是1x105cfu/ml。
本发明为了探究共培养的温度对意大利青霉转化的影响，所述的共培养温度为22℃，25℃和28℃，更优选的是25℃。
本发明为了探究IM预诱导农杆菌时乙酰丁香酮的影响，所述的方式为不加乙酰丁香酮和添加乙酰丁香酮，更优选的是添加乙酰丁香酮。
本发明为了探究共培养的时间对意大利青霉转化的影响，所述的共培养时间为12h，24h，36h和48h，更优选的是36h。
本发明对上述方法获得的转化子的遗传稳定性进行了随机抽取，提DNA进行PCR验证，结果表明该方法可稳定遗传。
本研究对上述方法获得的转化子进行验证，结果表明利用根癌农杆菌介导的转化，成功的实现了pacC基因的敲除，并且成功的将外源的DNA片段转化到意大利青霉中。
本发明利用所建立的根癌农杆菌接到的意大利青霉遗传转化方法并应用所构建的同源重组基因敲除原理，成功的建立了一个小型的意大利青霉T-DNA随机插入突变体库，其中有两个突变株有着敲除基因的特性。
本研究与现有的技术相比具有以下有益效果：
本研究利用根癌农杆菌介导的转化方法，操作简单，转化率高并且转化稳定，成功实现了意大利青霉的高效遗传转化，使得意大利青霉中进行同源敲除、过表达、异源表达成为可能，为基因工程手段对该菌株进行遗传改良，探究其侵染柑橘的致病机理奠定基础。
附图说明
图1：敲除载体的构建示意图。
图2：根癌农杆菌类型对转化的影响。
图3：意大利青霉孢子浓度对转化效率的影响。
图4：共培养温度对转化效率的影响
图5：共培养时间对转化效率的影响。
图6：添加乙酰丁香酮对转化的影响。
图7：不同的承载膜对转化的影响。
图8：检验转化子的遗传稳定性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。
1.实验材料
1.1菌株及载体
根癌农杆菌GV3101、根癌农杆菌AGL-1、大肠杆菌DH5α
pMD19-T载体、质粒pSKH、质粒pCAMBIA3300用于构建敲除载体pacC3300
1.2培养基
土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，煮沸后取滤液加入蔗糖10g，琼脂20g，用于意大利青霉的培养。
牛肉膏蛋白胨液体培养基(LB)：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl10g，用NaOH调pH至7.4，加ddH2O至1L。
牛肉蛋白胨固体培养基(LBA)：在LB培养基的基础上加20g琼脂
表1培养基成分表
注：葡萄糖、AS及MES需过滤除菌。
2.敲除载体的构建
2.1敲除盒的构建
以提取的野生型意大利青霉基因组DNA为模板，引物Up-F/Up-R为引物对，扩增pacC基因的上游序列作为5’UTR，带有KpnⅠ酶切位点，以及与抗性基因互补的序列；Down-F/Down-R为引物对，扩增pacC基因的下游序列作为3’UTR，带有XhoⅠ酶切位点以及与抗性基因互补的序列；以质粒pSKH为模板，HygB-F/HygB-R为引物对，扩增潮霉素B抗性基因，具体引物如表2所示。
表2引物序列表
引物/Primers 序列5’-3’/Sequences5’-3’
Up-F GGGGTACCCCACCTCGGGATGATGACAAGC
Up-R CAATATCATCTTCTGTCGACCGCCGTAGTAGAAGGGGTAT
HygB-F GTCGACAGAAGATGATATTG
HygB-R CTAGAAAGAAGGATTACCTC
Down-F GAGGTAATCCTTCTTTCTAGGGAGTCTTTTATCCCACATTACG
Down-R CCGCTCGAGCGGTCGCGTGGAGAACGTGTAT
将5’UTR胶回收产物、HygB抗性基因以及3’UTR胶回收产物以摩尔比1:2:1(DNA总量不少于800ng)加入至融合体系，不添加引物，使用Ex Taq酶进行三个片段的融合，融合PCR程序如下：
以融合产物为模板，引物Up-F和引物Down-R为引物对进行常规PCR扩增融合片段。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定目的片段，并胶回收。
2.2敲除载体的构建
将敲除盒的融合片段，按照pMD19-T载体的说明书连接至T载体，按照大肠杆菌DH5α说明书所述步骤转化至大肠杆菌DH5α。用Kpn1和Xho1双酶切质粒，并回收融合片段；同样将pCAMBIA3300用Kpn1和Xho1双酶切后回收大片段，T4连接酶16℃过夜连接两个胶回收片段，得到敲除载体pacC3300，示意图如图1所示。
3.农杆菌介导意大利青霉转化体系的建立
3.1.意大利青霉对潮霉素B的敏感性检测
不同的菌株对潮霉素B的敏感程度不一，为了筛选转化子，需要对潮霉素B的浓度进行筛选，筛选方法如下：
(1)将意大利青霉菌株接种至PDA培养基上，于25℃条件下培养2-3d，使其产孢，用无菌水收集孢子于1.5ml离心管中，通过血球计数板对意大利青霉的孢子进行计数，并将最后浓度稀释至1x106、1x107cfu/ml；
(2)在24孔细胞板中加入含不同浓度潮霉素的PDA培养基3ml，浓度依次为：0mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml；
(3)将1x106、1x107cfu/ml的意大利青霉孢子悬浮液10ul，接种于添加了PDA培养基的24孔细胞板上，25℃培养，观察孢子生长情况。
3.2.根癌农杆菌介导意大利青霉转化
3.2.1意大利青霉孢子悬浮液的制备
(1)意大利青霉接种于PDA斜面培养基，25℃培养3d后；
(2)用无菌水刮洗青霉菌孢子，以3层无菌的擦镜纸过滤，血球板计数孢子数，离心，收集孢子，备用；
(3)将孢子悬浮液用无菌水稀释至1x105cfu/ml。
3.2.2农杆菌的诱导
(1)将含有敲除载体的农杆菌在含有卡那霉素的LB固体培养基上划线，28℃培养2d；
(2)挑选单菌落于8ml含卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，180r/min震荡培养至OD600为0.8；
(3)5000r/min离心5min收集农杆菌菌体；
(4)用5ml IM培养基将菌体重悬浮至OD600为0.25，28℃，180r/min震荡培养至OD600在0.5左右。
3.2.3共培养
(1)诱导后的农杆菌与意大利青霉孢子悬浮液1:1混合；
(2)涂布至铺有无菌玻璃纸的Co-IM平板上；
(3)25℃培养36h-48h。
3.2.4转化子的筛选
(1)共培养后，将玻璃纸揭其，转至孔的无菌培养皿中，然后在培养皿中加入含有浓度为50ug/ml的潮霉素B溶液和浓度为200ug/ml的头孢霉素的PDA培养基；
(2)28℃培养，从第三d开始观察，将长出的但菌落转移至含有50ug/ml潮霉素B的PDA培养基上；
(3)若能继续生长，则为阳性转化子，保存并提DNA验证。
4.不同的根癌农杆菌类型对转化的影响
可用于丝状真菌转化的农杆菌菌株有很多种，常用的有：AGL-1、EHA105、GV3101、LBA4404等，研究表明，不同的农杆菌种类对不同真菌的转化效率并不相同。本实验使用实验室已有的农杆菌GV3101，以及广泛用于转化青霉菌的AGL-1，将构建好的敲除载体pacC3300分别转入农杆菌菌株GV3101和AGL-1，进行转化实验，其余条件保持一致，通过比较转化后长出的转化子的数量，探究这两种农杆菌种类对农杆菌转化意大利青霉效率的影响。
结果如图2所示：a为用AGL-1转化，b为用GV3101转化。用AGL-1转化得到了数个转化子，而用GV3101进行转化并未得到转化子，最终用于介导意大利青霉转化的农杆菌种类为AGL-1。
5.意大利青霉孢子浓度对转化影响
对转化效率造成巨大影响的是转化时使用的真菌材料的初始量，为了避免真菌或者根癌农杆菌的生长背景过高引起的低转化效率，应该对农杆菌和真菌浓度之间的配比进行摸索。本实验将农杆菌的浓度控制在OD600＝0.8，使用不同的意大利青霉孢子悬浮液浓度与农杆菌1:1混合，以确定不同的意大利青霉孢子悬浮液对转化效率的影响，以及对后续筛选实验的影响，设置的意大利青霉孢子悬浮液浓度为1x104、1x105、1x106、1x107cfu/ml，分别为图3中的a、b、c、d。
如图3所示，当意大利青霉孢子悬浮液的浓度为1x104cfu/ml时，只长出了两个转化子；悬浮液的浓度为1x105cfu/ml时，长出了数十个转化子；而当悬浮液的浓度达到106cfu/ml及以上时，虽然长出来很多的转化子，但却不好挑选单菌落。故农杆菌介导意大利青霉转化体系最终选定的孢子浓度是105cfu/ml。
6.不同共培养温度对转化的影响
转化过程中的关键因素是共培养的温度，研究表明，较低的温度(20℃-25℃)有益于根癌农杆菌转移其T-DNA，选择共培养温度时应该集中考虑农杆菌适宜转化的温度以及受体真菌的最适生长温度，以避免农杆菌或真菌的高背景生长。本实验设置不同的共培养温度，分别为22℃、25℃和28℃，其余条件同保持一致，进行转化实验，通过比较不同共培养温度条件下转化子的个数研究不同的共培养温度对转化子的影响，以筛选出最佳的共培养温度。
结果如图4所示，a、b、c分别为共培养温度22℃、25℃、28℃。22℃时，转板时，玻璃纸上的菌落较少，最终得到的转化子的个数也比较少；25℃时，农杆菌与意大利青霉菌的生长速度相当，长出了较多的单菌落转化子；而在28℃时，得到的转化子个数相比25℃较少，推测原因是农杆菌在最适生长温度生长，抑制了意大利青霉菌的生长。综上所述，本实验最终确定的共培养温度为25℃。
7.不同共培养时间对转化的影响
意大利青霉和根癌农杆菌的共培养时间对农杆菌介导转化的影响同样不可忽视，共培养时间过长，会导致非转化子背景过重，不便于后续的筛选实验；而共培养时间过短，会导致农杆菌未完成T-DNA转移，严重影响转化效率。本实验根据意大利青霉的生长速率，设置不同的共培养时间，分别为24h，36h和48h，其余条件保持一致。
如图5所示：a、b、c、d分别为共培养时间12h、24h、36h、48h。共培养12h、24h时，意大利青霉和菌丝均未得到广泛生长，而共培养48h时，均生长过旺，这说明36h是共培养较为合适的时间，随后将玻璃纸掀起转至含有潮霉素B和头孢霉素的PDA培养基这一步骤也证明了这一个观点，共培养12h时无转化子长出，24h时转化子个数不超过三个，而时间达到48h时，虽长出了大量的转化子，但在操作过程中由于菌丝生长过于旺盛，在玻璃纸上倒培养基时容易将菌丝冲起，影响后续实验。综上所述，本实验最终确定的共培养温度为36h。
8.添加乙酰丁香酮对转化的影响
共培养期间乙酰丁香酮作为诱导剂的加入对转化是必须的，但在根癌农杆菌的预诱导期间乙酰丁香酮是否加入也可能会对转化效率造成影响。本实验在诱导农杆菌时，设置了不加AS和加AS的两个对照，AS的浓度为200umol/l，其余条件保持一致。
如图6所示，a为预诱导时不添加AS，b为预诱导时添加AS。预诱导时不添加AS的平板上只长出几个转化子，而添加了AS的长出了数十个转化子，这说明，预诱导时AS的添加极大的影响意大利青霉的转化效率。
9.不同的过滤膜对转化的影响
承载膜的种类同样对转化效率有影响，常用的材料有玻璃纸、微孔滤膜以及PVDF过滤器、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。本实验选用了较易得到的微孔滤膜和玻璃纸，探究承载膜对农杆菌介导意大利青霉转化的影响。其余条件保持一致。
如图7所示：a为使用微孔滤膜作为承载材料，b为使用玻璃纸作为承载材料。使用微孔滤膜作为承载膜材料时，转板后只长出了8个转化子；而用玻璃纸的则长出了很多转化子。玻璃纸作为意大利青霉的转化的承载膜材料，转化效率比微孔滤膜高，为较优材料。
10.检验转化子的遗传稳定性
挑选长出的单菌落，在含有50ug/ml潮霉素B的PDA培养基上培养，能继续长出的转化子即为阳性转化子。将阳性转化子在无潮霉素B抗性的PDA培养基上连续传代培养，再转移至含有50ug/ml潮霉素B的PDA培养基上，观察转化子在潮霉素B抗性平板上是否能继续生长，继续生长的转化子提取DNA，验证是否为所需转化子。
如图8所示，泳道1-3为随机挑选的转化子，泳道4为野生型意大利青霉，图中抗性基因的条带大小在2000bp，与预期的2.1kb相符合，而野生型对照并未出现条带证明了该扩增实验的可信度，得出结论：该转化体系所得的转化子较为稳定。
11.转化子验证
将阳性转化子在铺有玻璃纸的、不含抗生素的PDA培养基上涂布培养，长出后保存，并PCR验证转化子。按照以下步骤对转化子的DNA进行提取：
(1)刮取平板面积1/3的菌丝体于无菌2ml离心管内，加入800ul 65℃预热的CTAB；
(2)超声5min后在65℃水浴30min，每十分钟上下摇晃混匀，冷却至室温；
(3)每管加入Tris酚/氯仿(1:1)溶液至近满，充分混匀，12000rpm室温离心10min，取上清液400ul于无菌1.5ml离心管中；
(4)加入等体积的氯仿溶液，混匀，12000rpm离心10min，取上清液300ul于无菌1.5ml离心管中；
(5)加入1/10体积3mol/l NaAc，0.6倍体积的异丙醇以沉淀DNA，震荡混匀后-20℃放置1h以上；
(6)12000rpm离心10min，弃上清，用500ul 75％乙醇吹吸洗涤沉淀，12000rpm离心5min，弃上清；
(7)重复步骤(6)，室温蒸发75％乙醇；
(8)加灭菌蒸馏水20ul，37℃水浴至沉淀溶解。
以上述提取的转化子DNA为模板，使用Easy Taq常规扩增敲除目的基因pacC以及潮霉素B抗性基因。电泳检测，同时满足目的基因无条带、抗性基因有条带的转化子则为敲除突变子；有抗性基因条带的则为随机插入转化子，可用于构建突变体库。
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<213> 潮霉素B抗性基因
<400> 2
CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACAGAAGATGATATTGAAGGAGCACTTTTTGGGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAACAATGAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAGCAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACATTATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGAACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCATCGATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATTCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCATCAAACAGCTTGACGAATCTGGATATAAGATCGTTGGTGTCGATGTCAGCTCCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGAGTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTCTAATTGTACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCAGCCCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCACTGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGGACACACATTCATCGTAGGTATAAACCTCGAAAATCATTCCTACTAAGATGGGTATACAATAGTAACCATGGTTGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGAAACTTTTTTACAACTCTCCTATGAGTCGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCA

Claims (4)

1.一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以潮霉素B抗性基因作为筛选标记，以pacC基因的上、下游序列作为同源臂，敲除意大利青霉pacC基因，构建含有潮霉素B抗性基因的基因敲除载体pacC3300；
2)将步骤1)的基因敲除载体pacC3300转化根癌农杆菌感受态细胞，得到含有敲除载体的根癌农杆菌；
3)将含有敲除载体的根癌农杆菌在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上扩大培养至OD600为0.8，然后再转入含有诱导剂的IM培养基培养至OD600为0.5，得到根癌农杆菌菌液；
4)将萌发的意大利青霉制成浓度为1x105cfu/mL的孢子悬浮液；
5)将步骤2)的根癌农杆菌菌液与步骤3)的意大利青霉孢子悬浮液按1:1的体积比混合，在带有承载膜的Co-IM固体培养基上共培养，培养温度25℃，培养时间36h-48h，最后转入含有50ug/ml的潮霉素B和200ug/ml的头孢霉素的PDA培养基中进行抗性培养，筛选获得转化子，
所述pacC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述潮霉素B抗性基因如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于：所述根癌农杆菌为农杆菌AGL-1。
3.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于：所述诱导剂为乙酰丁香酮。
4.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于：所述的承载膜是玻璃纸。
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