CN112391400A - 一种适用于巴戟天内生真菌a761的农杆菌介导的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于巴戟天内生真菌A761的农杆菌介导的遗传转化方法。本发明建立了一种巴戟天内生真菌C.rhizophorae A761的农杆菌遗传操作体系，从而促进C.rhizophorae的基因工程改造，并为发掘更多新颖的具有显著生物学活性的二苯甲酮类cytosporaphenones衍生物奠定分子生物学基础。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种适用于巴戟天内生真菌A761的农杆菌介导的遗传转化方法。
背景技术
Cytospora rhizophorae A761是一种分离自巴戟天的内生真菌。该内生真菌能产生一系列骨架新颖、高度氧化的二苯甲酮类cytosporaphenones化合物，且这类化合物具有抗肿瘤活性。二苯甲酮类化合物广泛应用于医药、工业和农业等领域，如在医药方面可作为酮基布洛芬、安定、苯海拉明、双环己哌啶等药物的中间体或原料。
根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)，即以农杆菌为媒介，侵染植物组织或者细胞将外源基因转入或者整合到植物细胞。根癌农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌，它可以侵染受伤的植物组织从而让其产生瘿瘤，使T-DNA序列进入植物细胞并整合到植物染色体上稳定遗传。农杆菌介导已由最初应用在双子叶植物，到现在已经广泛应用于丝状真菌。农杆菌介导遗传方法受受体材料的影响较小，转化效率高、遗传稳定性好、大部分DNA插入是单拷贝，并且操作方便，成本低(Davidson et al.,2000)。但是目前在巴戟天内生真菌中尚未研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于巴戟天内生真菌A761的农杆菌介导的遗传转化方法。
本发明的适用于巴戟天内生真菌A761的农杆菌介导的遗传转化方法，包括以下步骤：
a.将基于pFC332载体构建的目的基因敲除载体与农杆菌感受态细胞混合，进行热击转化，然后加入LB培养基培养，离心弃上清，取余下液体涂在含Amp的LB固体培养基上，培养过夜，挑取单菌落，扩增潮霉素片段和基因敲除靶标片段，验证载体转入农杆菌，构建得到重组农杆菌；
b.取重组农杆菌于添加有Amp和乙酰丁香酮的IM培养基中培养，取菌液与巴戟天内生真菌A761孢子混匀，用滤纸片沾取混合液，放置在添加有cefotaxime和潮霉素的IM固体培养基上培养，挑取单菌落在含潮霉素的PDA平板上各传代多次，然后挑取单菌落并提取其基因组DNA，PCR扩增ITS和Hyg2片段并将产物测序，验证目的基因敲除载体导入，获得重组巴戟天内生真菌A761。
优选，所述的步骤a，具体如下：将基于pFC332载体构建的目的基因敲除载体与农杆菌感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热击90s，然后冰浴3min，然后加入LB培养基，37℃、180r/min培养1h，离心弃上清，取余下液体涂在含Amp的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，扩增潮霉素片段和基因敲除靶标片段，验证载体转入农杆菌，构建得到重组农杆菌。
优选，所述的步骤b，具体如下：取重组农杆菌于添加有终浓度为100μg/mL Amp和100μg/mL乙酰丁香酮的IM培养基中培养，28℃培养至OD600为0.6-0.8，取菌液与浓度为106-107cfu/mL的巴戟天内生真菌A761孢子以体积比1:0.8的比例混匀，用滤纸片沾取混合液，放置在添加有终浓度为100μM cefotaxime和80μg/mL潮霉素的IM固体培养基上，28℃培养5-6d，挑取单菌落依次在含30μg/mL、60μg/mL、80μg/mL潮霉素的PDA平板上各传代1次，然后挑取单菌落并提取其基因组DNA，PCR扩增ITS和Hyg2片段并将产物测序，验证目的基因敲除载体导入，获得重组巴戟天内生真菌A761。
优选，所述的农杆菌为根癌农杆菌GV3101。
优选，所述的滤纸片灭过菌的直径为6mm的圆形滤纸片。
本发明还提供所述的方法在巴戟天内生真菌A761中二苯甲酮类cytosporaphenones化合物生物合成基因敲除中的应用。
优选，所述的方法中，基于pFC332载体构建的目的基因敲除载体为基因敲除载体pFC332-bam和/或pFC332-proL，从而对cytosporaphenones生物合成基因进行敲除。
优选，所述的基因敲除载体pFC332-bam，其是通过如下方法构建得到的：
在pFC332载体的基础上，设计bam基因的靶点序列5′-GCAGTGGGAACAGGAGAGAT-3′，设计并利用PCR扩增5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段作为模板，通过同源重组将两个片段整合到一起，构建得到5S rRNA-bam-sgRNA片段；
用限制性内切酶BglⅡ和PacⅠ双酶切pFC332载体、5S rRNA-bam-sgRNA片段，用T4连接酶将双酶切的5S rRNA-bam-sgRNA连接至双酶切的pFC332载体中，构建得到基因敲除载体pFC332-bam。
优选，所述的基因敲除载体pFC332-proL，其是通过如下方法构建得到的：
在pFC332载体的基础上，设计proL基因的靶点序列5′-GATTGGCCGCATACCCAGCT-3′，设计并利用PCR扩增5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段作为模板，通过同源重组将两个片段整合到一起，构建得到5S rRNA-proL-sgRNA片段；
用限制性内切酶BglⅡ和PacⅠ双酶切pFC332载体、5S rRNA-proL-sgRNA片段，用T4连接酶将双酶切的5S rRNA-proL-sgRNA连接至双酶切的pFC332载体中，构建得到基因敲除载体pFC332-proL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前对内生真菌功能基因编辑的研究相对较少，对真菌基因编辑的方法有CRISPR/Cas9、Cre/loxP同源重组、RNAi沉默基因等，介导方式主要包括PEG介导至原生质体、农杆菌介导侵染法、电击转化法等。但Cre/loxp同源重组的方法存在载体构建过程繁琐、同源重组效率低等缺点，导致丝状真菌基因编辑进展缓慢，阻碍了丝状真菌的代谢工程改造和新型活性天然产物的发掘。而CRISPR/Cas9基因敲除系统具有载体构建方便，基因敲除效率较高等优势。PEG介导和电击转化法存在介导效率低，受材料限制大。农杆菌介导遗传方法受体材料的影响较小，转化效率高、遗传稳定性好，有利于C.rhizophorae A761中cytosporaphenones的生物合成相关研究，从而发掘更多具有生物活性的先导化合物。
因此，本发明将构建适用于巴戟天内生真菌C.rhizophorae A761的农杆菌的遗传操作体系，为后期cytosporaphenones类化合物生物合成关键基因bam(编码苯甲酮单加氧酶)、proL(编码2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶)的敲除、解析C.rhizophorae A761中cytosporaphenones类化合物生物合成机制及发掘新型的具有较强生物学活性的cytosporaphenones类化合物奠定分子生物学基础，从而促进cytosporaphenones类化合物的开发利用。
附图说明
图1为靶向cytosporaphenones生物合成基因bam重组载体pFC332-bam-sgRNA构建图；图a中的1、2是5S rRNA片段扩增，3是含bam靶点的sgRNA片段扩增；图b为含靶标gRNA的5S rRNA启动子和含有sgRNA骨架及其终止子片段的扩增图；图c为重组载体pFC332-bam-sgRNA构建验证图；M为DNA Marker 2k plus(北京全式金)。
图2为靶向cytosporaphenones生物合成基因proL重组载体pFC332-proL-sgRNA构建图；图a中的1-3是5s rRNA片段扩增，4-6是含proL的sgRNA片段扩增；图b为含靶标gRNA的5S rRNA启动子和含有sgRNA骨架及其终止子片段的扩增图；图c为重组载体pFC332-proL-sgRNA构建验证图；M为DNA Marker 2k plus(北京全式金)。
图3为敲除重组质粒导入农杆菌感受态验证图；图a是pFC332-proL、pFC332-bam转化子潮霉素扩增，其中H2O是空白对照，1-6是pFC332-proL转化子潮霉素扩增片段，7-14是pFC332-bam转化子潮霉素扩增片段；图b是pFC332-proL、pFC332-bam转化子靶点扩增，其中H2O是空白对照，1-6是pFC332-proL转化子靶点扩增片段，7-14是pFC332-bam转化子靶点扩增片段；M为DNA Marker 2k plus(北京全式金)。
图4为重组侵染株；图a是pFC332-proL重组侵染株；图b是pFC332-bam重组侵染株。
图5是pFC332-proL、pFC332-bam重组侵染株ITS序列和含Hyg2片段扩增；H2O是空白对照；1-5是pFC332-proL重组侵染株ITS序列扩增片段；6-9是pFC332-bam重组侵染株ITS序列扩增片段；10是空白对照；11-15是pFC332-proL重组侵染株含Hyg2片段扩增；16-19是pFC332-bam重组侵染株含Hyg2片段扩增；M为DNA Marker 2k plus(北京全式金)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：重组敲除载体pFC332-bam-sgRNA和pFC332-proL-sgRNA的构建
根据bam(GenBank登录号:MT336152)和proL基因序列(GenBank登录号：MN180086))在网站http://www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html设计bam和proL的靶点序列分别是5′-GCAGTGGGAACAGGAGAGAT-3′、5′-GATTGGCCGCATACCCAGCT-3′。设计5S rRNA启动子和含靶点序列的sgRNA及相应终止子片段，利用同源重组将两个片段整合到一起，对应分别得到5S rRNA-bam-sgRNA及5S rRNA-proL-sgRNA片段。具体如下：
(1)设计5S rRNA扩增引物，分别是5S rRNA-F：5′-CGGGAAGATCTCACATACGACCACAGGG-3′，5S rRNA-R：5′-CATACAACAGAAGGGATTCGCTGGTG-3′。
含靶点序列的sgRNA片段的扩增引物：sgRNA-F(bam)：5′-CGAATCCCTTCTGTTGTGCAGTGGGAACAGGAGAGATGGGGTTTTAGAGCTAGA-3′，sgRNA-F(proL)：5′-CGAATCCCTTCTGTTGTGATTGGCCGCATACCCAGCTGGGGTTTTAGAGCTAGA-3′，sgRNA-R：5′-GTCTTAATTAAGCGGCCCTCTAGATGCATGC-3′。引物由广州天一辉远公司合成。
分别以5S rRNA启动子片段，含靶点序列的sgRNA片段为模板，利用PCR扩增5SrRNA和含靶点序列的sgRNA片段。5S rRNA启动子片段扩增反应体系50μL：引物5SrRNA-F0.5μL，引物5S rRNA-R 0.5μL，模板5S rRNA启动子片段1μL，2×prime star 25μL，ddH2O23μL。PCR程序：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环，最后72℃延伸10min。含靶点序列的sgRNA片段扩增方法同上，只是替换一下相对应的模板和引物，分别扩增得到5S rRNA启动子和含靶点序列的sgRNA片段(电泳验证结果如图1-a和图2-a)；然后再将5S rRNA启动子和含靶点序列的sgRNA片段为模板，以5S rRNA-F和sgRNA-R为引物，利用同源重组将两个片段整合到一起，分别构建得到5S rRNA-bam-sgRNA(其序列如SEQ ID NO.1所示，共313bp，电泳验证结果如图1-b)和5S rRNA-proL-sgRNA片段(其序列如SEQ ID NO.2所示，共313bp，电泳验证结果如图2-b)。
(2)用限制性内切酶BglⅡ和PacⅠ双酶切质粒pFC332、5S rRNA-bam-sgRNA片段、5SrRNA-proL-sgRNA片段，37℃孵育3h。用T4连接酶将双酶切后的5S rRNA-bam-sgRNA、5SrRNA-proL-sgRNA分别连接至双酶切的pFC332载体中，构建pFC332-bam和pFC332-proL敲除载体(pFC332-sgRNA-bam、pFC332-sgRNA-proL)，然后分别转化至Trans5α感受态细胞，用含氨苄的LB平板筛选，挑取克隆扩大培养，以5S rRNA-F和sgRNA-R为引物，菌液PCR筛选阳性克隆(电泳验证结果如图1-c和图2-c)。将阳性克隆子扩大培养，提取质粒进行测序鉴定。测序由广州天一辉远测序公司完成。由此确认获得基因敲除载体pFC332-bam和pFC332-proL。
实施例2：构建农杆菌的敲除重组载体体系
分别将构建好的基因敲除载体pFC332-bam、pFC332-proL各5μg加入到100μL根癌农杆菌感受态细胞GV3101，冰置30min，42℃热击90s，而后冰浴3min，在超净工作台向感受态加入500μL无抗LB培养基，37℃、180r/min培养1h。4000×g离心3min。弃上清400μL，剩余150μL用移液枪轻轻吹打混匀，取50μL均匀涂在Amp LB固体培养基上。37℃培养过夜。挑取单菌落验证，对基因敲除载体pFC332-bam转入农杆菌感受态细胞长出的单菌落进行潮霉素和5S rRNA-bam-sgRNA扩增以此验证基因敲除载体pFC332-bam是否转入农杆菌；对基因敲除载体pFC332-proL转入农杆菌感受态细胞长出的单菌落进行潮霉素和5S rRNA-proL-sgRNA以此验证基因敲除载体pFC332-proL是否转入农杆菌。由图3可知，图3-a泳道2-6、8-10扩增出潮霉素条带，图3-b中泳道2-6、7-9、11-14扩增出靶标片段，该结果表明基因敲除载体pFC332-proL、pFC332-bam成功导入了农杆菌感受态细胞。
实施例3：C.rhizophorae A761中农杆菌遗传转化体系的构建
菌株C.rhizophorae A761为丝状真菌，在进行农杆菌介导之前，需确定C.rhizophorae A761是否产孢及产孢时间。因此，首先将C.rhizophorae A761接种于PDA平板中培养1-2天至菌丝为浅褐色，挑取菌丝在显微镜下镜检，观察孢子形态及计算数量；备用。
将成功导入基因敲除载体pFC332-bam、pFC332-proL的农杆菌菌液分别扩大培养10mL，然后各从中取1mL加9mL IM培养基，并添加浓度为100mg/mL Amp 10μL，加100mg/mL的诱导剂乙酰丁香酮(AS)10μL，28℃培养至OD600为0.6-0.8(约2d)。从中取菌液100μL加入80μL C.rhizophorae A761孢子(约106-107cfu/mL)混匀，用灭过菌的直径为6mm的圆形滤纸片均匀沾取混合液，放置在100μM cefotaxime和80μg/mL潮霉素抗性IM固体培养基上，28℃培养5-6d。而后将单菌落在潮霉素抗性PDA平板上传代3次，潮霉素的浓度分别是30、60、80μg/mL。提取最后一代单菌落提取其基因组DNA，扩增ITS和含潮霉素片段的Hyg2片段。
结果表明把导入基因敲除载体的农杆菌菌液侵染C.rhizophorae A761的孢子，在100μM cefotaxime和80μg/mL潮霉素抗性IM固体平板上初步筛选重组侵染菌单菌株，单菌株经过三次潮霉素抗性筛选，通过80μg/mL潮霉素抗性平板筛选导入基因敲除载体pFC332-proL、pFC332-bam的重组菌株，分别筛选出5个和4个重组侵染菌株(图4-a和图4-b)。
提取筛选出的重组侵染株基因组DNA，以基因组DNA为模板扩增ITS序列和含潮霉素抗性基因的Hyg2片段(引物分别是：Hyg2-F：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCG-3′；Hyg2-R：5′-CTTAAGCTCGGGCCCCCTGGGC-3′)。结果如图5所示，菌体未被污染，仍然为C.rhizophoraeA761，基因敲除载体pFC332-proL、pFC332-bam通过根癌农杆菌侵染导入到了C.rhizophorae A761中，成功构建适用于巴戟天内生真菌A761的根癌农杆菌遗传操作体系，且该方法转化率较高，pFC332-proL转化至C.rhizophorae A761的转化率为80％，说明本遗传操作体系能高效地将外源基因导入至巴戟天内生真菌C.rhizophorae A761中，从而为其代谢工程改造及其次级代谢产物生物合成机制的解析奠定了基础。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种适用于巴戟天内生真菌A761的农杆菌介导的遗传转化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatctcaca tacgaccaca gggtgtggaa aacagggctt cccgtccgct cagccgtact 60
taagccacac gccgggaggt tagtagttgg gtgggtgacc accagcgaat cccttctgtt 120
gtatggcagt gggaacagga gagatgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg gtgctttttt tgttttttat 240
gtctgaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gagcatgcat ctagagggcc 300
gcttaattaa gac 313
<210> 2
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatctcaca tacgaccaca gggtgtggaa aacagggctt cccgtccgct cagccgtact 60
taagccacac gccgggaggt tagtagttgg gtgggtgacc accagcgaat cccttctgtt 120
gtatggattg gccgcatacc cagctgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg gtgctttttt tgttttttat 240
gtctgaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gagcatgcat ctagagggcc 300
gcttaattaa gac 313
Claims (9)
1.一种适用于巴戟天内生真菌A761的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将基于pFC332载体构建的目的基因敲除载体与农杆菌感受态细胞混合，进行热击转化，然后加入LB培养基培养，离心弃上清，取余下液体涂在含Amp的LB固体培养基上，培养过夜，挑取单菌落，扩增潮霉素片段和基因敲除靶标片段，验证载体转入农杆菌，构建得到重组农杆菌；
b.取重组农杆菌于添加有Amp和乙酰丁香酮的IM培养基中培养，取菌液与巴戟天内生真菌A761孢子混匀，用滤纸片沾取混合液，放置在添加有cefotaxime和潮霉素的IM固体培养基上培养，挑取单菌落在含潮霉素的PDA平板上各传代多次，然后挑取单菌落并提取其基因组DNA，PCR扩增ITS和Hyg2片段并将产物测序，验证目的基因敲除载体导入，获得重组巴戟天内生真菌A761。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a，具体如下：将基于pFC332载体构建的目的基因敲除载体与农杆菌感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴3min，然后加入LB培养基，37℃、180r/min培养1h，离心弃上清，取余下液体涂在含Amp的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，扩增潮霉素片段和基因敲除靶标片段，验证载体转入农杆菌，构建得到重组农杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b，具体如下：取重组农杆菌于添加有终浓度为100μg/mL Amp和100μg/mL乙酰丁香酮的IM培养基中培养，28℃培养至OD600为0.6-0.8，取菌液与浓度为106-107cfu/mL的巴戟天内生真菌A761孢子以体积比1:0.8的比例混匀，用滤纸片沾取混合液，放置在添加有终浓度为100μM cefotaxime和80μg/mL潮霉素的IM固体培养基上，28℃培养5-6d，挑取单菌落依次在含30μg/mL、60μg/mL、80μg/mL潮霉素的PDA平板上各传代1次，然后挑取单菌落并提取其基因组DNA，PCR扩增ITS和Hyg2片段并将产物测序，验证目的基因敲除载体导入，获得重组巴戟天内生真菌A761。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌为农杆菌GV3101。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的滤纸片灭过菌的直径为6mm的圆形滤纸片。
6.权利要求1所述的方法在巴戟天内生真菌A761中二苯甲酮类cytosporaphenones化合物生物合成基因敲除中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的方法中，基于pFC332载体构建的目的基因敲除载体为基因敲除载体pFC332-bam和/或pFC332-proL，从而对cytosporaphenones生物合成基因进行敲除。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的基因敲除载体pFC332-bam，其是通过如下方法构建得到的：
在pFC332载体的基础上，设计bam基因的靶点序列5'-GCAGTGGGAACAGGAGAGAT-3'，设计并利用PCR扩增5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段作为模板，通过同源重组将两个片段整合到一起，构建得到5S rRNA-bam-sgRNA片段；
用限制性内切酶BglⅡ和PacⅠ双酶切pFC332载体、5S rRNA-bam-sgRNA片段，用T4连接酶将双酶切的5S rRNA-bam-sgRNA连接至双酶切的pFC332载体中，构建得到基因敲除载体pFC332-bam。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的基因敲除载体pFC332-proL，其是通过如下方法构建得到的：
在pFC332载体的基础上，设计proL基因的靶点序列5′-GATTGGCCGCATACCCAGCT-3′，设计并利用PCR扩增5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA和含靶点序列的sgRNA片段作为模板，通过同源重组将两个片段整合到一起，构建得到5S rRNA-pr oL-sgRNA片段；
用限制性内切酶BglⅡ和PacⅠ双酶切pFC332载体、5S rRNA-proL-sgRNA片段，用T4连接酶将双酶切的5S rRNA-proL-sgRNA连接至双酶切的pFC332载体中，构建得到基因敲除载体pFC332-proL。
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