CN106432497A - 利用红花悬浮细胞生产cd20抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用红花悬浮细胞系统生产CD20单链抗体的方法。本发明按照植物偏好性密码子，人工合成CD20单链抗体基因，将其连接到含有35S启动子的植物表达载体pBasta上，采用农杆菌介导的方法转化红花愈伤组织，筛选出具有抗性的愈伤组织然后进行悬浮细胞培养，最后获得大量悬浮细胞，提取蛋白进行纯化并检测，结果表明，利用红花悬浮细胞表达的CD20抗体的活性高于利用拟南芥种子系统表达的抗体活性，利用红花悬浮系统表达突变后的TK‑CD20活性明显高于原有序列的表达活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体的说是利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法。
背景技术
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。近年来，植物悬浮细胞表达系统已成为有前途的替代传统的微生物发酵和哺乳动物细胞的生物反应器，其特点在于：⑴细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；⑵可以提供大量较为均匀的细胞；⑶内源蛋白水解酶活性低；⑷可以进行稳定表达和瞬时表达；⑸蛋白表达稳定性高；⑹具有蛋白翻译后修饰的能力及产品能够工业化生产。自1993年来，关于植物悬浮细胞表达系统的研究专利，我国仅有相关研究专利5篇，且从2006年才开始申报。而国外在1993年就已经有水稻原生质体悬浮细胞表达蛋白的专利出现，在专利申报方面国内与国外存在较大的差距。
CD20 是一种磷酸化蛋白质分子, 分子质量约为53kD, 属于 4 次跨膜的蛋白质超家族, 为B淋巴细胞表面特有的分化抗原。CD20 分子具有不易脱落、与抗体结合后不内化、在人体血清中无游离形式存在等特征，因此作为治疗B细胞淋巴瘤的理想作用靶点受到了人们的关注。目前，关于CD20的抗体药物陆续被批准上市，且价格越来越昂贵，生产成本较高。大肠杆菌表达系统是单链抗体最常用的原核表达系统，很多单链抗体的研究均选择此表达系统。然而大肠杆菌是原核生物，普遍认为，其表达产物缺乏糖基化等加工修饰而在人体内稳定性较差易被降解。另外，大肠杆菌表达系统中的有热原质（pyrogen），生物制品或注射液除去热原质比较困难。
本项目拟建立植物（红花）的悬浮细胞表达体系，利用植物悬浮细胞系统来表达具有重要生物活性的CD20单链抗体药物，为推动我国抗体药物市场的发展开辟新的生产途径。
本发明的目的是为了解决大肠杆菌表达系统中表达产物缺乏糖基化等加工修饰而在人体内稳定性较差易被降解、存在热原质问题，提高CD20单链抗体的活，而提供一种CD20单链抗体基因及利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法。
一种CD20单链抗体基因，它的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20，将序列表SEQ ID NO.2所示的基因插入了植物表达载体pBasta。
利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法,它包括：
1）重组质粒pBasta-LPH-CD20转化到感受态农杆菌中；所述的重组质粒pBasta-LPH-CD20，是在植物表达载体pBasta插入了序列表SEQ ID NO.1或2所示的基因；
2）农杆菌侵染外植体，所述的外植体为红花叶片；
3) 转入共培养培养基共培养；2mg/L NAA+ 0.5mg/ L6-BA的MS培养基
4) 转到愈伤继代培养基中抑菌培养；
5）诱导分化出愈伤组织接种到进行继代培养。
6）获得愈伤组织后进行液体摇瓶培养，继代三次后获得悬浮细胞，将获得的悬浮细胞进行蛋白提取；
步骤3所述的培养基为2mg/L NAA+ 0.5mg/ L6-BA的MS培养基；
步骤4所述的培养基为2mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 头孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培养基；
步骤5所述的培养基为1mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 头孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培养基。
本发明提供一种利用红花悬浮细胞系统生产CD20单链抗体的方法。本发明按照植物偏好性密码子，人工合成CD20单链抗体基因，将其连接到含有35S启动子的植物表达载体pBasta上，采用农杆菌介导的方法转化红花愈伤组织，筛选出具有抗性的愈伤组织然后进行悬浮细胞培养，最后获得大量悬浮细胞，提取蛋白进行纯化并检测，结果表明，利用红花悬浮细胞表达的CD20抗体的活性高于利用拟南芥种子系统表达的抗体活性，利用红花悬浮系统表达突变后的TK-CD20活性明显高于原有序列的表达活性。
附图说明
附图1 CD20基因的PCR扩增结果；
附图2 pEASY-T1-CD20的PCR鉴定结果；
附图3 pBasta-LPH-CD20双酶切鉴定结果；
附图4 pBasta-LPH-CD20的农杆菌菌液PCR检测；
附图5红花悬浮细胞体系鉴定结果；
附图6 pBasta-LPH-CD20转基因红花悬浮细胞Western blot检测；
附图7利用外周血单核淋巴细胞对CD20的活性检测结果；
附图8利用Fv区突变体对CD20的活性检测结果。
具体实施方式
实施例1 CD20单链抗体基因重组植物表达载体的构建
1、CD20单链抗体基因的获得
人工合成CD20单链抗体基因，设计序列时将其优化为植物偏好型密码子，基因由生物公司合成，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。设计上游含Xmal酶切位点（CCCGGG）和下游含EcoRI的酶切位点（GAATTC）的引物。
上游引物CD20F： AATACCCGGGATGGCCCACGCCCGCGTCCTC
下游引物CD20R： AATAGAATTCTTATTTACCAGGTGACAATGA
以人工合成的基因为模板，采用上述引物对其进行常规PCR扩增，获得了全长为1482bp的目的基因，如图1所示。
2、目的基因的克隆
采用常规重组克隆载体构建技术，将上述目的基因的PCR产物与克隆载体pEASY-T1连接，构建pEASY-T1-CD20，并转化大肠杆菌感受态DH5α，经卡那霉素筛选阳性克隆子后，对其进行菌体扩增培养。待菌液OD600为0.6-0.8时，收获菌液，试剂盒提取质粒，采用PCR初步鉴定，如图2所示，获得了与预期大小相符的条带。将该重组克隆质粒送往上海生工生物工程公司测序，结果表明，成功获得了优化密码子之后的CD20基因。
3、重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20的构建
采用Xmal和EcoRI限制性内切酶，分别对pEASY-T1- CD20和pBasta进行双酶切，试剂盒回收CD20基因和pBasta载体大片段，采用T4 DNA连接酶对其进行连接。连接产物转化转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选阳性克隆子进行增菌培养，提取质粒，进行Xmal和EcoRI双酶切鉴定。如图3所示，在预期大小位置可见条带，表明成功构建了重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20。
实施例2 重组农杆菌的获得
采用常规农杆菌转化方法，将实施例1所述的重组质粒pBasta-LPH-CD20转化到农杆菌EHA105感受态中，过夜培养，挑取单菌落，进行菌液PCR验证，结果再预期位置可见清晰条带，表明成功获得了携带pBasta-LPH-CD20ab的重组农杆菌。
实施例3 红花悬浮细胞体系的建立
利用云红一号红花品种，叶片作为外植体，建立红花的最佳悬浮细胞体系，种子培养基以MS为基本培养基。最佳愈伤诱导培养基为MS+2mg/LNAA+0.5mg/L 6-BA（如图5A所示），最佳愈伤继代培养基为MS+1mg/L的NAA+0.5mg/L6-BA（如图图5B所示），最佳液体悬浮培养基为不加琼脂粉的MS+1mg/L NAA+0.5mg/L6-BA+600mg/LCH（如图5C所示）。每100mL 的三角瓶中加入液体悬浮培养基50mL, 摇床转速为120r/min, 温度为25℃, 黑暗培养。
实施例4 构建稳定表达CD20单链抗体的红花悬浮细胞系
1、pBasta-LPH-CD20重组农杆菌侵染
挑取携带pBasta-CD20的根癌农杆菌单菌落接种于50 mL 含100 mg/ L Kan 的液体YEP培养基中, 28℃, 200 r/ min 恒温振荡培养过夜, 当菌液OD 值为0.6-0.8 左右时收集菌液,待用。切下无菌苗的叶片投入到用上述YEP液体培养基重悬的菌液中,侵染10min,倒去菌液后, 把外植体置于无菌滤纸上吸去多余菌液, 转入共培养培养基（2mg/L NAA+0.5mg/ L6-BA的MS培养基）中, 于25℃黑暗条件下进行共培养72小时。然后转到2mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 头孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培养基进行抑菌培养20天，诱导分化出愈伤组织接种到1mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 头孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培养基进行继代培养。获得愈伤组织后进行液体摇瓶培养，继代三次后获得悬浮细胞，将获得的悬浮细胞进行蛋白提取检测。
2、SF-CD20重组蛋白的检测
分别纯化提取液体培养后的沉淀和上清蛋白，进行常规Western blot检测，如图6所示，目的蛋白大小为53.33KDa，与预期蛋白分子量相符，表明成功在红花悬浮细胞中表达了CD20单链抗体。
实施例5 活性检测
1、利用外周血单核淋巴细胞进行活性检测
将红花悬浮细胞表达CD20（命名为SF-CD20）和拟南芥种子系统表达CD20（命名为AR-CD20)进行活性对比实验。活性实验通过所表达的CD20ab对外周血单核淋巴细胞的作用来体现，具体操作如下：
1)以无酚红 RPMI-1640 培养基将SF-CD20调整至 100 μg/mL、20 μg/mL、4 μg/mL、0.8μg/mL、0.16μg/mL；
2) 每管加入 400 μL 调整好密度的 Daudi 细胞，4℃作用 30 min，离心收集，细胞后PBS 洗 2 次，重悬于 400 μL 无酚红 RPMI-1640 培养基中；
3) 设置效应细胞+靶细胞自发 LDH 释放孔、靶细胞+靶细胞最大 LDH 释放孔、培养基背景孔，将与抗体作用完毕后的细胞悬液加入至 96 孔板中，100 μL 每孔，每种情况均为3 平行复孔；
4) 以 100 μL 每孔加入效应细胞，在细胞培养箱中正常条件培养 6-18 h；
5) 1100 rpm，5 min 离心 96 孔板，吸取上清至一新的 96 孔板中，按照 CytoTox96试剂盒指南配制显色液，每孔 50 μL，避光室温反应 30 min；
6) 每孔加入 50 μL 反应终止液，用注射器枕头挑破气泡，酶标仪读取 490 nm吸光值；
7) 根据试剂盒指南中的计算公式对细胞毒性百分比进行计算。结果如图7所示，利用红花悬浮细胞表达的CD20抗体的活性高于利用拟南芥种子系统表达的抗体活性。
2、利用Fv区突变体进行活性检测
将CD20抗体序列的scFv区进行突变，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示，利用红花悬浮系统表达，蛋白（命名为TK-CD20)活性测定方法同上。结果如图8所示，利用红花悬浮系统表达突变后的TK-CD20活性明显高于原有序列的表达活性。
<110> 吉林农业大学
<120> 利用红花悬浮细胞生产CD20抗体的方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
atggcccacg cccgcgtcct cctcctggcg ctcgccgtcc tggccacggc cgccgtcgcc 60
gtcgcccaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt cagcttctcc tggagagaag 120
gtgactatga cttgcagggc ttcttcatct gtttcttaca tccactggtt ccagcagaag 180
cctggttctt cacctaagcc ttggatctac gctacatcta acttggcatc tggagtgcct 240
gtgaggttct ctggttctgg ttcaggtact tcttactctt tgacaatctc tagggtggag 300
gctgaggacg ctgctactta ctactgccag cagtggacat ctaaccctcc aacattcgga 360
ggtggtacta agttggagat caagggtgga ggtggatctg gaggaggagg atctggtgga 420
ggaggttctc aggtgcagtt gcaacagcct ggagctgagt tggtgaagcc tggtgcttct 480
gtgaagatgt cttgtaaggc ttctggatac acattcactt cttacaacat gcactgggtg 540
aagcagactc ctggtagggg tttggagtgg atcggagcta tctacccagg aaacggagac 600
acatcttaca accagaagtt caagggtaag gctacattga ctgctgacaa gtcttcatct 660
actgcttaca tgcaattgtc ttctttgaca tctgaggact ctgcagttta ctactgcgct 720
aggtctacat actacggagg tgactggtac ttcaacgtgt ggggagcagg taccacggtc 780
actgtctctg catctagaga caagactcac acttgccctc catgcccagc tccagagttg 840
ttgggaggac catctgtgtt ccttttccca ccaaagccaa aagacactct tatgatctct 900
aggactcctg aggtgacatg cgtggttgtg gatgtgtcac acgaggatcc tgaggtgaag 960
ttcaattggt acgtggacgg tgtggaggtg cataacgcaa agactaagcc aagggaggag 1020
cagtacaact caacttacag ggtggtgtct gtgcttacag tgcttcacca ggactggttg 1080
aatggtaagg aatacaaatg taaggtgtca aacaaggcat tgcctgcacc tatcgagaag 1140
actatttcaa aggcaaaggg tcaaccaagg gagcctcagg tgtacacttt gccaccttca 1200
agggaagaga tgactaagaa ccaagtttct ttgacttgct tggtgaaggg attctaccct 1260
tctgacatcg cagtggaatg ggagtctaac ggtcagccag aaaataacta caaaacaaca 1320
cctccagtgt tggactctga tggttctttc tttttgtatt caaagttgac tgtggacaag 1380
tcaaggtggc agcagggtaa cgtgttctct tgctctgtga tgcacgaggc acttcataac 1440
cactacacac aaaagtcttt gtcattgtca cctggtaaat aa 1482
<160> 1
<210> 2
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
atggcccacg cccgcgtcct cctcctggcg ctcgccgtcc tggccacggc cgccgtcgcc 60
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ggaggttctc aggtgcagtt gcaacagcct ggagctgagt tggtgaagcc tggtgcttct 480
gtgaagatgt cttgtaaggc ttctggatac acattcactt cttacaacat gcactgggtg 540
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acatcttaca accagaagtt caagggtaag gctacattga ctgctgacaa gtcttcatct 660
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cactacacac aaaagtcttt gtcattgtca cctggtaaat aa 1482
Claims (6)
1. 一种CD20单链抗体基因，它的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
2. 重组植物表达载体pBasta-LPH-CD20，将序列表SEQ ID NO.2所示的基因插入了植物表达载体pBasta。
3.利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法，它包括：
1）重组质粒pBasta-LPH-CD20转化到感受态农杆菌中；所述的重组质粒pBasta-LPH-CD20，是在植物表达载体pBasta插入了序列表SEQ ID NO.1或2所示的基因；
2）农杆菌侵染外植体，所述的外植体为红花叶片；
3) 转入共培养培养基共培养；
4) 转到愈伤继代培养基中，抑菌培养；
5）诱导分化出愈伤组织接种到进行继代培养；
6）获得愈伤组织后进行液体摇瓶培养，继代三次后获得悬浮细胞，将获得的悬浮细胞进行蛋白提取。
4.根据权利要求3所述的利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法，其特征在于：步骤3所述的培养基为2mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA的MS培养基。
5.根据权利要求3或4所述的利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法，其特征在于：步骤4所述的培养基为2mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 头孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培养基。
6.根据权利要求5所述的利用红花悬浮细胞系统表达CD20单链抗体的方法，其特征在于：步骤5所述的培养基为1mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 头孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培养基。
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|---|---|---|---|---|
| WO2019148938A1 (zh) * | 2018-01-30 | 2019-08-08 | 王跃驹 | 植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用 |
| CN111183899A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-22 | 贵州大学 | 一种快速诱导红花毛状根的方法 |
Citations (1)
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| CN103981191A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-08-13 | 吉林农业大学 | 一种抗cd20单链抗体的植物种子表达系统 |
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