WO2019148938A1 - 植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用 - Google Patents

植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用 Download PDF

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Abstract

植物作为宿主在表达利妥昔抗体的应用。利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的表达平台，利用农杆菌介导真空渗透方法来表达利妥昔单克隆抗体。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS-PAGE法确定重组利妥昔抗体成功表达。伯基特淋巴瘤抑制实验证明生菜生产的利妥昔抗体具有抑制淋巴瘤细胞的生物学活性。

Description

植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用
本申请要求于2018年01月30日提交中国专利局、申请号为201810089050.X、发明名称为“植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。
背景技术
淋巴瘤是恶性血液肿瘤的一种。从发病率和死亡率上看，根据《中国肿瘤登记年报》的数据，2003至2013年间，恶性淋巴瘤的发病率约为6.68/10万，每年新发病数近9万例，位列所有恶性肿瘤发病率第八位。男性发病率高于女性，致死率为3.75/105，位列第十位。从疾病分类上看，淋巴瘤通常分为两大类：霍奇金氏淋巴瘤(HL占所有淋巴瘤的10％)和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL，占所有淋巴瘤的90％)，共计有70余种亚型。
利妥昔单克隆抗体(Rituximab，Rituxan，美罗华)是美国食品药物管理局(FDA)批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)，某些类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，以及某些自体免疫性疾病。利妥昔单抗是一种嵌合鼠/人的单克隆抗体，利妥昔单抗经常与其它药物联合使用来治疗华氏巨球蛋白血症(WM)，包括合并使用化疗和其它标靶治疗。利妥昔单抗针对正常B细胞和恶性B细胞上的CD20抗原。利妥昔单抗与CD20抗原结合之后，身体的天然免疫防御被招募来攻击和杀死被利妥昔单抗标记的B细胞。但在造血干细胞，不成熟B细胞，正常血浆细胞，或其他正常组织中没有CD20抗原，所以不会被利妥昔单抗攻击。这使得健康的B细胞在治疗后得以再生。
自1997年美国上市以来销售快速增长，2012年销售额已经超过了“70亿美元”。现阶段主要利用动物细胞生产利妥昔单抗。但是动物细胞培养需要价格昂贵的培养液，严格的厂房条件，操作复杂，时间周期至少两周， 而且动物细胞生产能力低，生产成本极高。有时候动物细胞所带的病毒可以侵染人类，安全性低。因此，提供一种利妥昔抗体的表达方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了利妥昔抗体。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产利妥昔抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。优选的，所述抗体为单克隆抗体。所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
本发明还提供了一种表达载体，包括利妥昔的重链序列或轻链序列以及载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述利妥昔的重链序列或轻链序列为将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的利妥昔的重链序列或优化的利妥昔的轻链序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的利妥昔的重链序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的利妥昔的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述优化的利妥昔的轻链序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的利妥昔的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：
步骤1：分别将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的 密码子，获得：
ⅰ.优化的利妥昔的重链序列；
ⅱ.优化的利妥昔的轻链序列；
步骤2：在所述优化的利妥昔的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sac I位点；
在所述优化的利妥昔的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sac I位点；
由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体；
步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L。
具体的，为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人利妥昔重链以及轻链(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00073)氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.idtdna.com/CodonOpt)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的利妥昔重链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl位点。在利妥昔轻链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体(图1)。基因片段通过XbaI/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L(图2)。
本发明还提供了所述的表达载体在表达利妥昔抗体中的应用。
此外，本发明还提供了一种植物作为宿主表达利妥昔抗体的方法，将本发明提供共的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得利妥昔抗体。所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
具体的，将两种植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆 菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO 4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO4)中至O.D.600为0.5。
将制备好的含有p35S-Rit-H和p35S-Rit-L农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5；。将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：
步骤1：抽真空25～45s；
步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；
步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；
重复上述步骤2～3次，避光处理4d。
在本发明的一些具体实施方案中，农杆菌具体为根癌土壤杆菌GV3101。
本发明所述克隆pRit-H，pRit-L基因片段(图1)，并且构建两种双元植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L(图2)，在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4 天后显示淡黄褐色区域。
提取、分离蛋白质具体为：将经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mM KPi，pH 7.8；2mM EDTA；10m Mβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。
SDS-PAGE凝胶电泳具体为：收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4-12％
Figure PCTCN2018116147-appb-000001
Bis-Tris Plus SDS-变性凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。
植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组利妥昔抗体经过变性凝胶SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约分别为23kDa以及50kDa(图3A，泳道2)，与商业利妥昔抗体跑带大小一致(图3A，泳道3)，符合利妥昔抗体轻重链的蛋白大小。而非侵染的生菜提取液当中没有发现条带。在非变性的凝胶电泳中观察到大约150kDa(图3B，泳道2)的条带，证明生菜重组轻重链成功的结合为抗体结构，符合利妥昔抗体蛋白分子量(图3B，泳道3，商业利妥昔抗体)。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为0.86mg/g。
伯基特淋巴瘤(BL)是非霍奇金淋巴瘤，更常见于儿童和青少年。经癌症细胞抑制试验验证获得的抗体，人伯基特淋巴瘤系CA46细胞在补充有10％FBS(Gibco，USA)的RPMI-1640培养基(Gibco，USA)中 生长。所有细胞在37℃的5％CO2加湿气氛中培养，每天更新培养基，一周后在培养孔中加入生菜纯化的10μg利妥昔抗体以及商业用利妥昔抗体。共培养一周后细胞在PBS中的2％戊二醛中固定，然后在4℃下在1％四氧化锇中后固定12小时。通过透射电子显微镜检查，样品用乙酸双氧铀和柠檬酸铅复染，以评估凋亡细胞的比例。
通过细胞实验研究纯化利妥昔抗体对伯基特淋巴瘤细胞(CA46)的抑制。通过加入纯化的生菜重组利妥昔抗体培养CA46细胞，在一周后检查细胞生长结果表明，没有任何处理的CA46细胞生长良好。相比之下，使用纯化的生菜重组利妥昔抗体以及商业用利妥昔抗体培养的细胞大部分消失(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源利妥昔抗体具有生物学活性并且可以杀死淋巴瘤细胞(CA46)。结果表明，植物尤其生菜是一种生产利妥昔抗体的合适的生物反应器。
本发明利用生菜来瞬时表达利妥昔抗体，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产利妥昔单克隆抗体，可以大大缩短生产周期和生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示克隆载体pRit-H以及pRit-L示意图；
图2示利妥昔植物双元表达载体p35S-Rit-H(重链)以及p35S-Rit-L(轻链)构建流程；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下利妥昔H重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Rit-H；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下利妥昔抗体轻链，重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI 位点，生成植物双元表达载体p35S-Rit-L，p35S-Rit-H；
LB and RB:Ti质粒左右边界；35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV 35S启动子；NPT II，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos 3’，终止子；
图3(A)示SDS-PAGE凝胶电泳结果；图3(B)示非变性凝胶电泳结果；泳道1：非侵染生菜；泳道2：生菜表达的利妥昔重组抗体；泳道3：商业利妥昔重组抗体；
图4示通过细胞实验证明生菜纯化的利妥昔抗体对伯基特淋巴瘤细胞(CA46)的抑制，具有显著的生物学活性。
具体实施方式
本发明公开了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，是一种快速的瞬时表达重组蛋白质的方法。本发明描述的真空农杆菌渗透方法简单，快速，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统短时间内大规模生产利妥昔单克隆抗体。
本发明提供的植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 植物瞬时表达载体的构建
为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，将人利妥昔抗体重链，轻链，(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00073)氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.idtdna.com/CodonOpt)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的利妥昔重链序列5'末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3'末端分别加入SacI位点。在利妥昔轻链序列5'末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3'末端分别加入Sacl位点。并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体(图1)，基因片段通过Xbal/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体，pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L(图2)。将两种植物表达载体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO 4)中至O.D.600为0.5。
实施例2 农杆菌介导的真空渗透
将制备好的含有p35S-Rit-H以及p35S-Rit-L农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5。将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60秒。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2至3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取 出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4天。
实施例3 蛋白质提取和分离
经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10m Mβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1-2分钟。将匀浆物调节至pH 8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15分钟以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15分钟。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60分钟，再次在4℃下以10,000g离心15分钟。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mM KPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。
植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。
实施例4 SDS-PAGE凝胶电泳
收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％
Figure PCTCN2018116147-appb-000002
Bis-Tris Plus SDS-变性凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。重组利妥昔抗体经过变性凝胶SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为23kDa以及50kDa条带(图3A)，符合利妥昔抗体轻，重链的蛋白大小。在非变性的凝胶电泳中观察到大约150kDa(图3B)的条带，证明生菜重组轻重链成功的结合为抗体结构，符合利妥昔抗体蛋白分子量。基于Bradford测定 法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为0.86mg/g。
实施例5 伯基特淋巴瘤细胞抑制实验
伯基特淋巴瘤(BL)是非霍奇金淋巴瘤，更常见于儿童和青少年。经癌症细胞抑制试验验证获得的抗体，人伯基特淋巴瘤系CA46细胞在补充有10％FBS(Gibco，USA)的RPMI-1640培养基(Gibco，USA)中生长。所有细胞在37℃的5％CO2加湿气氛中培养，每天更新培养基，一周后在培养孔中加入生菜纯化的10μg利妥昔抗体以及商业用利妥昔抗体。共培养一周后细胞在PBS中的2％戊二醛中固定，然后在4℃下在1％四氧化锇中后固定12小时。通过透射电子显微镜检查，样品用乙酸双氧铀和柠檬酸铅复染，以评估凋亡细胞的比例。
通过细胞实验研究纯化利妥昔抗体对伯基特淋巴瘤细胞(CA46)的抑制。通过加入纯化的生菜重组利妥昔抗体培养CA46细胞，在一周后检查细胞生长结果表明，没有任何处理的CA46细胞生长良好。相比之下，使用纯化的生菜重组利妥昔抗体以及商业用利妥昔抗体培养的细胞大部分消失(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源利妥昔抗体具有生物学活性并且可以杀死淋巴瘤细胞(CA46)。结果表明，植物尤其生菜是一种生产利妥昔抗体的合适的生物反应器。
本发明利用生菜来瞬时表达利妥昔抗体，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产利妥昔单克隆抗体，可以大大缩短生产周期和生产成本
实施例6
对照组：利用动物细胞生产利妥昔抗体；
实验组1：本发明提供的植物生产利妥昔抗体；
实验组2：利用烟叶生产利妥昔抗体；
表1利妥昔抗体
Figure PCTCN2018116147-appb-000003
*示与对照组相比P≤0.05； **示与对照组相比P≤0.01；
#示与实验组2相比P≤0.05； ##示与实验组2相比P≤0.01；
由表1可知，实验组1与对照组的动物系统相比，本发明提供的生菜瞬时表达利妥昔抗体，极显著(P≤0.01)缩短了生产周期，极显著(P≤0.01)提高了蛋白含量，极显著(P≤0.01)提高了CD20亲和活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。
实验组1与实验组2的烟叶系统相比，生菜瞬时表达利妥昔抗体，显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，显著(P≤0.05)提高了CD20亲和活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。
实验组2与对照组相比，烟叶瞬时表达利妥昔抗体比动物系统显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，简化了蛋 白纯化的难易程度，显著(P≤0.05)降低了生产成本。综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产利妥昔抗体单克隆抗体。
以上对本发明所提供的植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用进行了详细介绍。本文应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
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Figure PCTCN2018116147-appb-000005
Figure PCTCN2018116147-appb-000006
Figure PCTCN2018116147-appb-000007
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Claims (9)

  1. 植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
  2. 一种表达载体，其特征在于，包括利妥昔的重链序列或轻链序列以及载体。
  3. 根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述利妥昔的重链序列或轻链序列为将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的利妥昔的重链序列或优化的利妥昔的轻链序列。
  4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化的利妥昔的重链序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的利妥昔的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
    所述优化的利妥昔的轻链序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的利妥昔的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
  5. 根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。
  6. 根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：
    步骤1：分别将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：
    ⅰ.优化的利妥昔的重链序列；
    ⅱ.优化的利妥昔的轻链序列；
    步骤2：在所述优化的利妥昔的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sac I位点；
    在所述优化的利妥昔的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sac I位点；
    克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体；
    步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片 段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L。
  7. 根据权利要求2至6任一项所述的表达载体在表达利妥昔抗体中的应用。
  8. 一种植物作为宿主表达利妥昔抗体的方法，其特征在于，将如权利要求2至6任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得利妥昔抗体；
    所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
  9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：
    步骤1：抽真空25～45s；
    步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；
    步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；
    重复上述步骤2～3次，避光处理4d。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
WO2014116721A1 (en) * 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
CN106432497A (zh) * 2016-11-05 2017-02-22 吉林农业大学 利用红花悬浮细胞生产cd20抗体的方法
CN107083398A (zh) * 2017-06-16 2017-08-22 深圳惠升生物科技有限公司 植物作为宿主在表达pd‑1抗体和/或pd‑l1抗体中的应用
CN107236759A (zh) * 2017-06-16 2017-10-10 深圳惠升生物科技有限公司 生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103403170B (zh) * 2011-01-17 2015-11-25 菲利普莫里斯生产公司 植物中的蛋白质表达
KR20220151036A (ko) * 2014-05-27 2022-11-11 아카데미아 시니카 항-ｃｄ20 글리코항체 및 이의 용도
CN107254486A (zh) * 2017-06-16 2017-10-17 深圳惠升生物科技有限公司 生菜作为宿主在表达生长因子中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
WO2014116721A1 (en) * 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
CN106432497A (zh) * 2016-11-05 2017-02-22 吉林农业大学 利用红花悬浮细胞生产cd20抗体的方法
CN107083398A (zh) * 2017-06-16 2017-08-22 深圳惠升生物科技有限公司 植物作为宿主在表达pd‑1抗体和/或pd‑l1抗体中的应用
CN107236759A (zh) * 2017-06-16 2017-10-10 深圳惠升生物科技有限公司 生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DU, J. ET AL.: "Chain L, Light Chain Of The Rituximab Fab Fragment", GENBANK: PDB: 20SL_L, 26 October 2017 (2017-10-26) *
DU, J. ET AL.: "Heavy Chain Of The Rituximab Fab Fragment", PROTEIN DATA BANK: PDB: 2OSL _A, 26 October 2017 (2017-10-26) *
MARUSIC, C. ET AL.: "Production of an active anti- CD 20-hIL-2 immunocytokine", PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. 14, no. 1, 16 April 2015 (2015-04-16), pages 240 - 251, XP002775353, doi:10.1111/pbi.12378 *
SILVA-MARTIN, N. ET AL.: "Chain A, Ig Gamma-1 Chain C Region", GENBANK: PDB: 4CDH_A, 25 February 2015 (2015-02-25) *
WANG, D. ET AL.: "Expression of bioactive anti- CD 20 antibody fragments", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 99, 9 May 2015 (2015-05-09), XP035521148, doi:10.1007/s00253-015-6601-6 *

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