CN110092833A

CN110092833A - 植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用

Info

Publication number: CN110092833A
Application number: CN201810089050.XA
Authority: CN
Inventors: 王跃驹; 陈书元; 陈雪
Original assignee: Beijing Ruicheng Haiway Health Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Ruicheng Haiway Health Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: WO2019148938A1; CN110092833B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达利妥昔抗体的应用。本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达利妥昔单克隆抗体(Rituximab，Rituxan，美罗华)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法确定重组利妥昔抗体成功表达。伯基特淋巴瘤抑制实验证明生菜生产的利妥昔抗体具有抑制淋巴瘤细胞的生物学活性。

Description

植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。

背景技术

淋巴瘤是恶性血液肿瘤的一种。从发病率和死亡率上看，根据《中国肿瘤登记年报》的数据，2003至2013年间，恶性淋巴瘤的发病率约为6.68/10万，每年新发病数近9万例，位列所有恶性肿瘤发病率第八位。男性发病率高于女性，致死率为3.75/105，位列第十位。从疾病分类上看，淋巴瘤通常分为两大类：霍奇金氏淋巴瘤(HL占所有淋巴瘤的10％)和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL，占所有淋巴瘤的90％)，共计有70余种亚型。

利妥昔单克隆抗体(Rituximab，Rituxan，美罗华)是美国食品药物管理局(FDA)批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)，某些类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，以及某些自体免疫性疾病。利妥昔单抗是一种嵌合鼠/人的单克隆抗体，利妥昔单抗经常与其它药物联合使用来治疗华氏巨球蛋白血症(WM)，包括合并使用化疗和其它标靶治疗。利妥昔单抗针对正常B细胞和恶性B细胞上的CD20抗原。利妥昔单抗与CD20抗原结合之后，身体的天然免疫防御被招募来攻击和杀死被利妥昔单抗标记的B细胞。但在造血干细胞，不成熟B细胞，正常血浆细胞，或其他正常组织中没有CD20抗原，所以不会被利妥昔单抗攻击。这使得健康的B细胞在治疗后得以再生。

自1997年美国上市以来销售快速增长，2012年销售额已经超过了“70亿美元”。现阶段主要利用动物细胞生产利妥昔单抗。但是动物细胞培养需要价格昂贵的培养液，严格的厂房条件，操作复杂，时间周期至少两周，而且动物细胞生产能力低，生产成本极高。有时候动物细胞所带的病毒可以侵染人类，安全性低。因此，提供一种利妥昔抗体的表达方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了利妥昔抗体。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产利妥昔抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。优选的，所述抗体为单克隆抗体。所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

本发明还提供了一种表达载体，包括利妥昔的重链序列或轻链序列以及载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述利妥昔的重链序列或轻链序列为将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的利妥昔的重链序列或优化的利妥昔的轻链序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的利妥昔的重链序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的利妥昔的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述优化的利妥昔的轻链序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的利妥昔的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：分别将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：

ⅰ.优化的利妥昔的重链序列；

ⅱ.优化的利妥昔的轻链序列；

步骤2：在所述优化的利妥昔的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sac I位点；

在所述优化的利妥昔的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sac I位点；

由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体；

步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L。具体的，为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人利妥昔重链以及轻链(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00073)氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.idtdna.com/CodonOpt)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的利妥昔重链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl位点。在利妥昔轻链序列5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体(图1)。基因片段通过XbaI/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L(图2)。

本发明还提供了所述的表达载体在表达利妥昔抗体中的应用。

此外，本发明还提供了一种植物作为宿主表达利妥昔抗体的方法，将本发明提供共的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得利妥昔抗体。所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

具体的，将两种植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO₄，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mMMgSO4)中至O.D.600为0.5。

将制备好的含有p35S-Rit-H和p35S-Rit-L农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5；。将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

在本发明的一些具体实施方案中，农杆菌具体为根癌土壤杆菌GV3101。

本发明所述克隆pRit-H，pRit-L基因片段(图1)，并且构建两种双元植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L(图2)，在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。

提取、分离蛋白质具体为：将经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mM KPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

SDS-PAGE凝胶电泳具体为：收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4-12％Plus SDS-变性凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组利妥昔抗体经过变性凝胶SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约分别为23kDa以及50kDa(图3A，泳道2)，与商业利妥昔抗体跑带大小一致(图3A，泳道3)，符合利妥昔抗体轻重链的蛋白大小。而非侵染的生菜提取液当中没有发现条带。在非变性的凝胶电泳中观察到大约150kDa(图3B，泳道2)的条带，证明生菜重组轻重链成功的结合为抗体结构，符合利妥昔抗体蛋白分子量(图3B，泳道3，商业利妥昔抗体)。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为0.86mg/g。

伯基特淋巴瘤(BL)是非霍奇金淋巴瘤，更常见于儿童和青少年。经癌症细胞抑制试验验证获得的抗体，人伯基特淋巴瘤系CA46细胞在补充有10％FBS(Gibco，USA)的RPMI-1640培养基(Gibco，USA)中生长。所有细胞在37℃的5％CO2加湿气氛中培养，每天更新培养基，一周后在培养孔中加入生菜纯化的10μg利妥昔抗体以及商业用利妥昔抗体。共培养一周后细胞在PBS中的2％戊二醛中固定，然后在4℃下在1％四氧化锇中后固定12小时。通过透射电子显微镜检查，样品用乙酸双氧铀和柠檬酸铅复染，以评估凋亡细胞的比例。

通过细胞实验研究纯化利妥昔抗体对伯基特淋巴瘤细胞(CA46)的抑制。通过加入纯化的生菜重组利妥昔抗体培养CA46细胞，在一周后检查细胞生长结果表明，没有任何处理的CA46细胞生长良好。相比之下，使用纯化的生菜重组利妥昔抗体以及商业用利妥昔抗体培养的细胞大部分消失(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源利妥昔抗体具有生物学活性并且可以杀死淋巴瘤细胞(CA46)。结果表明，植物尤其生菜是一种生产利妥昔抗体的合适的生物反应器。

本发明利用生菜来瞬时表达利妥昔抗体，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产利妥昔单克隆抗体，可以大大缩短生产周期和生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示克隆载体pRit-H以及pRit-L示意图；

图2示利妥昔植物双元表达载体p35S-Rit-H(重链)以及p35S-Rit-L(轻链)构建流程；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下利妥昔H重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Rit-H；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下利妥昔抗体轻链，重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Rit-L，p35S-Rit-H；

LB and RB:Ti质粒左右边界；35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV 35S启动子；NPT II，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos3’，终止子；

图3(A)示SDS-PAGE凝胶电泳结果；图3(B)示非变性凝胶电泳结果；泳道1：非侵染生菜；泳道2：生菜表达的利妥昔重组抗体；泳道3：商业利妥昔重组抗体；

图4示通过细胞实验证明生菜纯化的利妥昔抗体对伯基特淋巴瘤细胞(CA46)的抑制，具有显著的生物学活性。

具体实施方式

本发明公开了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，是一种快速的瞬时表达重组蛋白质的方法。本发明描述的真空农杆菌渗透方法简单，快速，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统短时间内大规模生产利妥昔单克隆抗体。

本发明提供的植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，将人利妥昔抗体重链，轻链，(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00073)氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.idtdna.com/CodonOpt)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的利妥昔重链序列5'末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3'末端分别加入SacI位点。在利妥昔轻链序列5'末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3'末端分别加入Sacl位点。并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体(图1)，基因片段通过Xbal/Sacl分别从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体，pCam35S，分别产生植物表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L(图2)。将两种植物表达载体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

将制备好的含有p35S-Rit-H以及p35S-Rit-L农杆菌等量混匀至O.D.600为0.5。将培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60秒。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2至3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4天。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1-2分钟。将匀浆物调节至pH8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15分钟以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15分钟。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60分钟，再次在4℃下以10,000g离心15分钟。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。

实施例4 SDS-PAGE凝胶电泳

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Plus SDS-变性凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。重组利妥昔抗体经过变性凝胶SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为23kDa以及50kDa条带(图3A)，符合利妥昔抗体轻，重链的蛋白大小。在非变性的凝胶电泳中观察到大约150kDa(图3B)的条带，证明生菜重组轻重链成功的结合为抗体结构，符合利妥昔抗体蛋白分子量。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为0.86mg/g。

实施例5伯基特淋巴瘤细胞抑制实验

本发明利用生菜来瞬时表达利妥昔抗体，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产利妥昔单克隆抗体，可以大大缩短生产周期和生产成本

实施例6

对照组：利用动物细胞生产利妥昔抗体；

实验组1：本发明提供的植物生产利妥昔抗体；

实验组2：利用烟叶生产利妥昔抗体；

表1利妥昔抗体

^*示与对照组相比P≤0.05；^**示与对照组相比P≤0.01；

^#示与实验组2相比P≤0.05；^##示与实验组2相比P≤0.01；

由表1可知，实验组1与对照组的动物系统相比，本发明提供的生菜瞬时表达利妥昔抗体，极显著(P≤0.01)缩短了生产周期，极显著(P≤0.01)提高了蛋白含量，极显著(P≤0.01)提高了CD20亲和活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。

实验组1与实验组2的烟叶系统相比，生菜瞬时表达利妥昔抗体，显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，显著(P≤0.05)提高了CD20亲和活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。

实验组2与对照组相比，烟叶瞬时表达利妥昔抗体比动物系统显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，简化了蛋白纯化的难易程度，显著(P≤0.05)降低了生产成本。综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产利妥昔抗体单克隆抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京睿诚海汇健康科技有限公司

<120> 植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用

<130> MP1724893

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> 利妥昔重链(heavy chain of Rit)

<400> 1

atgcaagtcc agctgcaaca gccgggagct gaactcgtta agccaggtgc ttctgtaaaa 60

atgtcatgca aagccagcgg ctacacattt acaagttaca atatgcattg ggttaaacag 120

accccagggc gaggtctcga atggataggc gcaatttacc caggaaatgg cgacaccagc 180

tacaatcaaa agttcaaagg taaagccaca ctgacggctg ataaatcctc aagcaccgct 240

tacatgcaac tgagcagctt aactagcgag gattcagcag tatattactg tgcccgatca 300

acatactacg gcggcgactg gtacttcaac gtttggggag ccggaactac tgtgacagtt 360

agtgctgcct ctacgaaagg accatctgtt ttccccctgg ctcccagctc aaagtctaca 420

agcggcggca cagccgccct gggctgtctt gtcaaagatt acttcccaga gcccgtcact 480

gttagttgga attctggcgc acttacttca ggcgtccata cgtttcccgc agtcttgcaa 540

agctccgggc tgtactccct ttctagtgtt gtgaccgtcc cttcatcatc cttgggaaca 600

caaacctaca tttgtaacgt gaaccacaag ccgagcaata ccaaggttga caaaaaagct 660

gaacccaaaa gctgcgataa aactcacacc tgccctccat gcccggctcc tgagctctta 720

ggaggccctt cagttttctt gttcccgcct aaaccgaagg atacgttaat gatctcaaga 780

actcctgaag ttacttgcgt cgtggtagac gtttcccatg aagacccgga agtgaaattt 840

aactggtatg tggacggtgt cgaagttcat aatgcaaaaa ccaaacctag ggaagaacaa 900

tataattcta cgtatagagt cgtttctgta cttaccgtac tgcaccagga ctggttgaat 960

ggtaaggaat ataaatgcaa ggtctccaac aaggcacttc cagctcccat agaaaagacc 1020

attagtaagg ctaagggcca gccccgagag cctcaggtat atactctgcc gccgtctagg 1080

gatgaattaa caaaaaacca agtgtccctg acttgcttgg tcaaagggtt ttatccttca 1140

gacattgcag ttgagtggga gtctaatgga cagccggaaa acaactataa aaccaccccc 1200

cctgttcttg atagtgacgg atcttttttt ctctacagca aattaacggt ggataaaagc 1260

agatggcaac aaggtaatgt gttctcttgc agcgtgatgc atgaagcctt gcacaaccac 1320

tatacacaga aatccctgtc tttgtcaccg gggaaa 1356

<210> 2

<211> 451

<212> PRT

<213> 利妥昔重链(heavy chain of Rit)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 3

<211> 642

<212> DNA

<213> 利妥昔轻链(light chain of Rit)

<400> 3

atgcagatag tcttgagtca gtctcccgcc attttgtccg catctccagg cgagaaagtt 60

actatgacat gccgagccag ctctagcgtc agttacatac attggtttca acagaagccg 120

ggctcatcac ctaagccctg gatatatgct accagcaact tggcctcagg agttcccgtg 180

cgtttctcag gttcaggctc aggaacatcc tatagcctca cgatctccag ggtggaagct 240

gaggacgctg ccacgtacta ctgccagcag tggacttcta accctcctac gtttgggggc 300

ggaacgaagt tagaaataaa gagaacggtt gccgccccgt cagtcttcat cttcccaccc 360

tctgacgagc agctcaaaag cggtaccgct tccgttgtct gccttctgaa taacttctac 420

cccagggagg caaaagttca atggaaggtg gacaatgcct tgcaaagtgg taactcccaa 480

gagtctgtga ccgaacagga tagcaaggac tcaacgtact cactgtccag cacacttacg 540

ttatctaagg cagactatga aaagcataag gtatacgctt gtgaagtcac tcatcagggg 600

ctctcaagtc cagttacgaa gagttttaac cgtggcgagt gc 642

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 利妥昔轻链(light chain of Rit)

<400> 4

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

2.一种表达载体，其特征在于，包括利妥昔的重链序列或轻链序列以及载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述利妥昔的重链序列或轻链序列为将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的利妥昔的重链序列或优化的利妥昔的轻链序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化的利妥昔的重链序列如SEQID No.1所示；所述优化的利妥昔的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。

6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：

ⅰ.优化的利妥昔的重链序列；

ⅱ.优化的利妥昔的轻链序列；

克隆到pUC57载体中，分别获得pRit-H，pRit-L克隆载体；

步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Rit-H，p35S-Rit-L。

7.根据权利要求2至6任一项所述的表达载体在表达利妥昔抗体中的应用。

8.一种植物作为宿主表达利妥昔抗体的方法，其特征在于，将如权利要求2至6任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得利妥昔抗体；

所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。