CN114410688B - 一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法，方法为：第一步、利用染色质lncRNA原位逆转录测序CLIST‑seq方法筛选与多能基因Oct4启动子结合的多能性退出相关lncRNA，并验证其在各组织中的表达；第二步、构建lncRNA Peln1过表达质粒并通过慢病毒包装后感染目的细胞；第三步、过表达lncRNAPeln1对三胚层分化的影响：诱导iPSC分化，设三个实验组；第四步、过表达lncRNAPeln1对iPSC‑分化胰岛细胞效率的影响。有益效果：本发明采用过表达lncRNAPeln1的方式，提高了iPSC向内胚层分化的比例；本发明采用过表达lncRNAPeln1的方式,提高了体外定向诱导iPSC向胰岛β样细胞分化的效率，能够提高约38％。为优化或建立iPSC向胰岛β样细胞高效、定向分化方案奠定理论基础，推动诱导干细胞产品治疗糖尿病的临床转化。

Description

一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种定向分化为胰岛β样细胞的方法，特别涉及一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法。

背景技术

目前，糖尿病因其发病率逐年升高且易出现诸多并发症，严重威胁人类健康，并且耗费大量卫生资源。目前所用药物及胰岛素皆不能从根本上治愈糖尿病，虽然胰岛移植是治疗糖尿病的一个较好的方法，但由于供体缺乏及免疫排斥等问题，大大限制了其临床应用。目前，干细胞作为一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，已成为细胞治疗及组织器官再生领域最具前景的种子细胞，而诱导型多能干细胞(induced pluripotent stemcell,iPSC)因可由体细胞重编程获得，且不存在伦理和免疫排斥限制，成为能无限提供分泌胰岛素细胞来源的种子细胞,开启了自体干细胞治疗糖尿病的新篇章。定向诱导iPSC分化成胰岛β样细胞成为近年来的研究热点。

近年,许多研究通过改变一些生物小分子，如使用甲状腺激素，色甘酸钠，视黄酸，表皮生长因子等，或抑制骨形成蛋白的表达及改变分化微环境等因素来增加iPSC定向诱导为胰岛β样细胞的成功率和准确性，但目前尚无统一标准诱导方法大量并稳定的获得胰岛β样细胞,且有报道提出诱导出的单个细胞分泌的胰岛素量很低(约只有正常胰岛的几十分之一)、缺乏合理的动态分泌曲线及体外诱导效率低下等问题。

长链非编码RNA(lncRNA)在诸多生理和病理活动中都扮演重要角色。随着对lncRNA功能的不断挖掘，发现诸多lncRNA是ESC自我更新和分化的潜在调控因素。相继有研究报道了lncRNA调控干细胞定向肌肉细胞分化、神经分化及脂肪细胞分化的重要作用，但lncRNA在iPSC向胰岛细胞分化过程中的调控作用仍不清楚，在此领域的lncRNA研究有着巨大潜力，找到在此过程中有重要调控作用的lncRNA并建立以lncRNA为媒介的细胞定向分化控制技术有可能成为胰岛β细胞体外分化技术的突破口，推动诱导干细胞产品治疗糖尿病的临床转化，其学术、社会和经济价值巨大。

发明内容

本发明的主要目的为了通过“染色质lncRNA原位逆转录测序”的方法，筛选出在成纤维细胞及胰腺中高表达，且与多能基因Oct4启动子结合的与细胞分化相关的lncRNAPeln1，利用过表达Peln1提高iPSC向胰岛β样细胞定向分化的效率，而提供的一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法。

本发明提供的lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法，其方法包括如下步骤：

第一步、利用染色质lncRNA原位逆转录测序CLIST-seq方法筛选与多能基因Oct4启动子结合的多能性退出相关lncRNA，并验证其在各组织中的表达，具体步骤如下：

步骤一、收集转染了Cas9-Oct4质粒的mFBC并用2％甲醛固定；

步骤二、裂解细胞膜，收集细胞核；

步骤三、细胞核内RNA逆转录；

步骤四、Cas9-gRNA复合体的分离；

步骤五、Cas9-gRNA-lncRNA复合物的分离；

步骤六、lncRNA的提取；

步骤七、样品质量验证；

步骤八、文库的建立与扩增；

步骤九、lncRNA文库分析及筛选；

步骤十、lncRNAPeln1在各组织中的表达；

取小鼠肺、大脑、血管、肌肉脾脏、肾脏、肝脏、胰腺、脂肪和心脏器官组织提取RNA，逆转录成cDNA，利用RT-PCR验证lncRNAPeln1在各组织中的表达情况；

第二步、构建lncRNA Peln1过表达质粒并通过慢病毒包装后感染目的细胞；

第三步、过表达lncRNAPeln1对三胚层分化的影响：诱导iPSC分化，设三个实验组，第一组为空白对照，即iPSC；第二组为转入对照质粒，即iPSC+对照质粒；第三组为过表达lncRNAPeln1组，即iPSC+Peln1，在诱导分化前将lncRNAPeln1及对照质粒分别转染至iPSC中然后用拟胚体的方法诱导分化，在诱导分化的第0、2、4、6和8天分别收集细胞，设计引物检测三胚层特异标记物，比较不同组间各胚层标志物表达情况；

第四步、过表达lncRNAPeln1对iPSC-分化胰岛细胞效率的影响：利用三部诱导法诱导iPSC向胰岛细胞分化，设三个实验组，第一组为空白对照，第二组为转入对照质粒，第三组为过表达lncRNAPeln1，在诱导分化前将lncRNAPeln1及对照质粒分别在相同的条件下转入iPSC中，然后诱导分化，观察三组的诱导效率及形成胰岛细胞的质量有无差别，利用免疫荧光染色对诱导初期及后期的细胞进行胰岛素及C-肽分泌情况的检测，统计染色阳性细胞数，比较诱导效率。

本发明的有益效果：

本发明提供的lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法采用CLIST-seq的方法有效的筛选与多能基因Oct4启动子结合的多能性退出相关lncRNAPeln1；本发明采用过表达lncRNAPeln1的方式，提高了iPSC向内胚层分化的比例；本发明采用过表达lncRNAPeln1的方式,提高了体外定向诱导iPSC向胰岛β样细胞分化的效率，能够提高约38％。为优化或建立iPSC向胰岛β样细胞高效、定向分化方案奠定理论基础，推动诱导干细胞产品治疗糖尿病的临床转化。

附图说明

图1为本发明所述的Cas9与Oct4启动子特异性结合示意图，图1中通过gRNA将Cas9的目标靶点设定在Oct4基因的启动子上，用携带Cas9 Oct4-gRNA、Cas9-gCt(随机gRNA)和空Cas9载体的慢病毒转染成纤维细胞。Cas9免疫沉淀后，选取Oct4启动子区域(Site I)及远离启动子区域(SiteII)两个位点设计引物，用Q-PCR验证Cas9与Oct4启动子的结合情况。E1-E5；外显子1-5；pOct4：Oct4启动子。Vector：携带空载体组；gCT：携带Cas9-随机gRNA组；gRNA：携带Cas9 Oct4-gRNA组。

图2为本发明所述的lncRNA Peln1在重编程过程中差异表达示意图，图2中比较小鼠成纤维细胞(Fib)，重编程不成功的细胞(non-iPSC)，小鼠诱导多能干细胞(iPSC)及小鼠胚胎干细胞(E14)四种细胞中lncRNAPeln1的表达差异。

图3为本发明所述的lncRNA Peln1在不同细胞及组织中的差异性表达示意图，图3中Fib：小鼠成纤维细胞；non-iPSC：重编程不成功的细胞；iPSC：小鼠诱导多能干细胞；E14：小鼠胚胎干细胞。

图4为本发明所述的lncRNAPeln1对三胚层标志性基因表达的影响示意图，图4中在iPSC中过表达lncRNAPeln1后，利用拟胚体诱导分化，收集细胞，用定量PCR检测3个胚层标记基因，用空载体和未经处理的iPSC作为对照。

图5为本发明所述的lncRNAPeln1增加iPSC向胰岛细胞分化效率示意图，图5中将过表达了lncRNAPeln1的iPSC,过表达了空载体的iPSC以及空的iPSC三组细胞同时利用三部诱导法诱导iPSC向胰岛细胞分化，结果显示过表达了lncRNAPeln1组的诱导效率较其它两组明显增高，约提38％。iPSC：未做处理的iPSC；Vector：转入空载体的iPSC；Peln1：转入lncRNAPeln1的iPSC。

具体实施方式

请参阅图1至图5所示：

实施例1、CLIST-seq具体方法：

1、细胞固定：取转染了Cas9-Oct4质粒的生长至70％-90％的6孔盘的2个孔的小鼠成纤维细胞(mFBC)消化酶消化后加入1ml培养液悬浮细胞，向培养液中加入37％甲醛54ul固定10min，加入62.5ul 2M甘氨酸(终浓度为0.125M)中和5min，4℃，3500r离心5min，弃上清。

2、裂解细胞膜：向固定好的细胞中加入低渗缓冲液置于冰上裂解2-5min，3000r/min离心7min，弃上清，再加入500μL低渗缓冲液清洗沉淀2次。

3、细胞核内RNA逆转录：在65℃金属浴的条件下进行细胞核内逆转录，在配置好的dNTP中加入Biotin-CTP得到Biotin-dNTP作为原料，同时加入RNA酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及Maxima逆转录酶，65℃反应半小时，离心收集逆转录后的细胞核。

4、Cas9-gRNA复合体的分离：首先将逆转录之后的产物用超声缓冲液重悬，应用Branson超声仪进行基因破碎。超声波碎裂条件为40％输出率，90％工作周期，运行10s，停10s，运行15min。

用A/G蛋白磁珠(Protein A/G Beads)去掉非特异性背景后将Cas9单克隆抗体(DYKDDDK)和IgG单克隆抗体分别孵育样本过夜。次日，加入A/G蛋白磁珠孵育半小时。洗涤磁珠后洗脱得到与DNA、RNA以及蛋白质结合的Cas9-gRNA复合物。

5、Cas9-gRNA-lncRNA复合物的分离：在上一次洗脱得到与DNA、RNA以及蛋白质结合的Cas9-gRNA复合物样品中加入亲和素磁珠(Dynabeads M-280 Streptavidin)，使用之前需先用清洗缓冲液清洗磁珠，反复清洗3遍后)将两者在室温下孵育30分钟后用溶解缓冲液将复合物从磁珠上洗脱下来，反复洗脱2-3次得到Cas9-gRNA-lncRNA复合物。

6、lncRNA的提取：为了从Cas9-gRNA-lncRNA复合物中提取lncRNA，首先需要打开复合物交联。在样品中加入蛋白酶K，70℃金属浴震荡1小时，消化Cas9蛋白，解开其与核酸复合物之间的交联。用核酸沉淀方法沉淀lncRNA-cDNA后按照试剂盒说明合成第2条cDNA链。再次用核酸沉淀方法沉淀，得到lncRNA对应的双链cDNA。

7、样品质量验证：因为我们将sgRNA的目标靶点设定在Oct4基因的启动子上，从而试图找寻与之结合的lncRNA，因此在通过Cas9免疫沉淀方法得到的提纯样本中需要含有sgRNA在Oct4基因的启动子上的结合位点片段才能认定样品具有Oct4启动子区结合特异性。因此，应用PCR方法在样品中对sgRNA在Oct4基因启动子上的结合位点进行扩增检验：如果PCR结果显示Cas9-gRNA样品扩增条带明显，则说明CLIST-seq方法能够特异性的结合到Oct4启动子区域并得到与启动子区域结合的lncRNA(图1)。

8、文库的建立与扩增：利用NEB公司制作核酸文库的试剂盒对得到的DNA进行扩增，将得到的标本送至上海博奥公司进行测序，测序方法如下：应用软件SICER识别序列中的H3.3富集区，H3.3富集区与基因的启动子(转录起始位点±2kb，Transcription startsites，TSSs)，外显子，内含子，远端调节区(转录起始位点-50kb)有关。通过对比样品中H3.3富集区域与正常小鼠基因数据库中已经定位好的H3.3富集区，对样品序列进行标记注释。

9、lncRNA文库分析及筛选：对文库测序结果中大量的lncRNA进行分析，从中寻找与细胞分化密切相关的lncRNA，并对比其在iPSC与mFBC中的表达差异。筛选出仅在mFBC细胞中特异表达，而在iPSC中不表达的lncRNA。发现一条位于小鼠六号染色体上的全新lncRNA，将其命名为Pluripotency exit-associated lncRNA 1，简称Peln1。将此序列与人的基因序列比对，发现同源性为78.77％。lncRNAPeln1在小鼠成纤维细胞中高表达，且与Oct4启动子区结合，而在iPSCs中不表达(图2)。

10、验证lncRNAPeln1在各组织中的表达：取小鼠肺，大脑，血管，肌肉脾脏，肾脏，肝脏，胰腺，脂肪，心脏等器官组织提取RNA，逆转录成cDNA，利用RT-PCR验证lncRNAPeln1在各组织中的表达情况。发现lncRNAPeln1在胰腺组织中高表达(图3)。

实施例2、构建lncRNA Peln1过表达质粒：

1、通过PCR体外扩增lncRNA Peln1

设计引物

JH5220 5’-GGGCGCCAGATATCTAATGTATACCATAGTACCAGTAGG-3’

JH5221 5’-GAATCGAAGAATTCTTAATTCAGCATCACTTGTTTTATTT-3’

克隆Peln1所需PCR体系(50μL)

PCR条件

将PCR产物跑核酸胶，验证大小，大小正确则回收进行下一步实验。

2、酶切：将Peln1目的片段及lenti-RsRED目的载体用同样的快速限制性内切酶EcoRI和EcoRV分别切开(酶切体系如下)，并分别跑胶回收。

载体酶切体系(20μL)

3、连接：

将上一步回收的Peln1全长片段与载体用T4连接酶22℃连接0.5h。

连接体系如下：

4、转化、扩增培养、鉴定：

将合成的质粒转入到大肠杆菌感受态细胞中，进行扩增培养后涂布于LB固体培养基上，待长出菌落后进行挑菌PCR鉴定，最后将鉴定阳性的菌落送测序确定Peln1序列全部正确，说明Peln1过表达质粒合成成功。

5、慢病毒包装、感染目的细胞及筛选：

利用慢病毒包装技术在细胞中进行病毒的包装，包装好的病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，过滤后可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达目的基因。

(1)、慢病毒包装：

①我们采用293T细胞进行病毒包装，6孔板培养293T细胞，当细胞长至70％左右时进行慢病毒包装，将目的质粒(过表达及对照质粒，敲低及对照质粒)、慢病毒包装质粒psPAX2及pMD2G按恰当比例混合好加入100μL Opti-MEM中混合均匀，同时将1μL浓度为5μg/μL的PEI加入100μLOpti-MEM中混合均匀，两种混合液同时于室温静置5分钟后将两种液体混合均匀，于室温静置20min，接下来进行病毒包装，将以上混合液均匀点滴至293T细胞的培养液中后将细胞放回培养箱中继续培养。

②6-8h后更换培养液，让细胞在正常DMEM培养液中继续培养。从更换培养液之后开始计时，分别收集24h、48h、72h的病毒上清并用0.45μM滤膜过滤，过滤后直接感染目的细胞，剩余的病毒上清分装存于-80℃冰箱备用。

(2)、感染目的细胞及筛选：

①将待转染的iPSCs接种于6孔板培养板，待细胞生长至50％-60％时可用于感染病毒。

②将新鲜制备好的病毒液按一定比例均匀点滴至目的细胞的培养液中，可同时加入Polybrene作为助转剂(使得Polybrene在整个细胞配液也中终浓度为8ng/μL)。

③待病毒作用24h后，弃去含有病毒的培养液，更换为正常的培养液，将原液浓度10mg/mL的嘌呤霉素(Puromycin)稀释100倍配制成0.1μg/μL的工作液。取10μL嘌呤霉素工作液加入培养液中，使嘌呤霉素从浓度为0.5μg/mL开始进行筛选。

④观察细胞死亡情况，增加嘌呤霉素浓度至2μg/mL，细胞仍不能被嘌呤霉素杀死时，耐药克隆确认。

实施例3、过表达lncRNAPeln1对三胚层分化的影响：

诱导iPSC分化，设三个实验组，第一组为空白对照(iPSC)，第二组为转入对照质粒(iPSC+对照质粒)，第三组实验组为过表达Peln1组(iPSC+Peln1)。在诱导分化前将Peln1及对照质粒分别转染至iPSC中并稳定表达后，用拟胚体的方法诱导分化，具体方法如下：

将处于对数生长期的iPSC消化后用不含白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor，LIF)的培养液重悬，将iPSC稀释至密度为3×10⁴mL，按每滴20-30μL点滴到10cm培养皿的盖子上，然后小心将盖子扣在培养皿上，使细胞悬挂于盖子上，为避免没有足够水份，于培养皿中加足够量的PBS，置于细胞培养箱中培养，每天观察细胞变化，于培养第3-4天左右，可于每滴细胞滴中肉眼可见白色的拟胚体。于第4天，每滴细胞中已肉眼可见明显的拟胚体，将拟胚体冲至超低吸附力的培养皿中使其悬浮生长，未避免其贴壁，放入摇床中摇晃悬浮培养。每隔1天进行细胞换液1次，在诱导分化的第0，2，4，6，8天分别收集细胞，设计引物检测三胚层特异标记物，比较不同组间各胚层标志物表达情况。发现过表达lncRNAPeln1可促进内胚层标志性基因，尤其是向胰岛方向分化相关基因的表达(图4)。

实施例4、过表达lncRNAPeln1对iPSC-分化胰岛细胞效率的影响：

利用三部诱导法诱导iPSC向胰岛细胞分化，设三个实验组，第一组为空白对照，第二组为转入对照质粒，第三组实验组过表达Peln1，在诱导分化前将Peln1及对照质粒分别在相同的条件下转入iPSC中，然后诱导分化，观察三组的诱导效率及形成胰岛细胞的质量有无差别。利用免疫荧光染色对诱导初期及后期的细胞进行胰岛素及C-肽分泌情况的检测。

三步诱导法操作方法：第一步：诱导产生拟胚体embryonic body(EB)。将iPS细胞悬浮于添加10％FBS/DMEM的培养板中。48小时后，收集EB细胞，转入事先经过Mariel包被的培养板中继续培养，2小时后，转入添加activin A的FBS/DMEM中培养24小时，然后转入新的FBS/DMEM中6-8小时。再转入添加RA的FBS/DMEM中培养24小时。第二步：扩大培养能产生胰岛素的前体细胞，将已分化的ES细胞于添加10％FBS/DMEM和10ng/ml成纤维细胞生长因子的培养基中继续培养3-5天。第三步：诱导细胞成熟，将第二步中的细胞转入添加胰岛β细胞成熟促进剂的培养基中培养3-5天，在显微镜下进行形态观察，进行胰岛素及C-肽免疫荧光染色并统计染色阳性细胞数，比较诱导效率。结果显示过表达了lncRNA Peln1组的诱导效率较其它两组明显增高，约提高38％(图5)。

表1.PCR引物

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法

<160> 43

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

tgtttttgtt tttgtttttt ttaatgtata ccatagtacc agtaggggct tataataaag 60

gattgtaata ctatttagga agttgaactc tgtagtacat aataggaggt aggattgagg 120

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ttatgtgata tttcacattt aaatcttttt tcttttttac atgttttctc ttgtgcatca 240

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tttttcccaa atcagaaaaa aaatacacac taaataaagc agcaataaaa tataaatcat 360

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tgatgaaatt atttttacat ctgaggaaaa aaatctagga aaataaaaca agtgatgctg 600

aattaa 606

<210> 2

<211> 419

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

aagttttttg aaattatgtg acattttaca ttaaattttt tttacatttt ttgggcagca 60

atttaaatgt tatgactatg taaactactt ctcttgttag gtaatttttt tcacctagat 120

ttttttccca attgagaaaa atatatacta aacaaaatag caataaaaca taatcactct 180

atttgaagaa aatatcttgt tttctgccaa tagatttttt aaaatgtagt cagcaaaatg 240

ggggtgggga agcagagcat gtcctagttc aatgttgact tttttttttt ttaaagaaaa 300

gcattaagac ataaaattct ttcactttgg cagaagcatt tgttttcttg atgaaattat 360

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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ggtacccaga catcttcatg 20

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 35

ttctggaacc agaccttgac 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

ccctggctcg tgtggattt 19

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

gaccgatacc actcctctgt c 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

acagagttct tcgcaacctg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

catctgagct tcatccgagt 20

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

agccaccagc tacatcgcct ac 22

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

gccatccgcc ttcttgagtt c 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

gccggagacc tagatgtcat t 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

cccacgccct gtttctttga 20

Claims (1)

1.一种lncRNA Peln1促进iPSC定向分化为胰岛β样细胞的方法，其特征在于：其方法包括如下步骤：

第一步、利用染色质lncRNA原位逆转录测序CLIST-seq方法筛选与多能基因Oct4启动子结合的多能性退出相关lncRNA，并验证其在各组织中的表达，具体步骤如下：

步骤一、收集转染了Cas9-Oct4质粒的mFBC并用2%甲醛固定；

步骤二、裂解细胞膜，收集细胞核；

步骤三、细胞核内RNA逆转录；

步骤四、Cas9-gRNA复合体的分离；

步骤五、Cas9-gRNA-lncRNA复合物的分离；

步骤六、lncRNA的提取；

步骤七、样品质量验证；

步骤八、文库的建立与扩增；

步骤九、lncRNA文库分析及筛选；

步骤十、lncRNAPeln1在各组织中的表达；

取小鼠肺、大脑、血管、肌肉脾脏、肾脏、肝脏、胰腺、脂肪和心脏器官组织提取RNA，逆转录成cDNA，利用RT-PCR验证lncRNAPeln1在各组织中的表达情况；其中Peln1的核苷酸序列为序列1中第22至606位所示的核苷酸序列；

第二步、构建lncRNA Peln1过表达质粒并通过慢病毒包装后感染目的细胞；

第三步、过表达lncRNA Peln1对三胚层分化的影响：诱导iPSC分化，设三个实验组，第一组为空白对照，即iPSC；第二组为转入对照质粒，即iPSC+对照质粒；第三组为过表达lncRNA Peln1组，即iPSC+Peln1，在诱导分化前将lncRNA Peln1及对照质粒分别转染至iPSC中然后用拟胚体的方法诱导分化，在诱导分化的第0、2、4、6和8天分别收集细胞，设计引物检测三胚层特异标记物，比较不同组间各胚层标志物表达情况；

第四步、过表达lncRNAPeln1对iPSC-分化胰岛细胞效率的影响：利用三部诱导法诱导iPSC向胰岛细胞分化，设三个实验组，第一组为空白对照，第二组为转入对照质粒，第三组为过表达lncRNAPeln1，在诱导分化前将lncRNA Peln1及对照质粒分别在相同的条件下转入iPSC中，然后诱导分化，观察三组的诱导效率及形成胰岛细胞的质量有无差别，利用免疫荧光染色对诱导初期及后期的细胞进行胰岛素及C-肽分泌情况的检测，统计染色阳性细胞数，比较诱导效率。