CN1580246A

CN1580246A - 一种诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的方法

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Publication number: CN1580246A
Application number: CNA031500935A
Authority: CN
Inventors: 王常勇; 张妍; 郭希民; 段翠密; 王秀丽
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2005-02-16

Abstract

本发明涉及一种诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的方法，属于细胞生物学领域。本发明采用5种优化培养基诱导胚胎干细胞定向分化为能分泌胰岛素的细胞，诱导分化一定时间后可得到能分泌胰岛素的胰岛样细胞。本发明所述方法具有能够显著提高诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的比例的特点，可为糖尿病的细胞治疗和相关新药物的开发奠定基础，具有明显的临床应用前景。

Description

一种诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体地说涉及一种诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的方法。

背景技术

移植胰岛细胞是治疗糖尿病最有前景的方法。但由于缺少合适的可供移植的胰岛组织，而使得这种方法的应用发展受到了限制。此外，成体胰岛干细胞的筛选和培养目前还都比较困难，因而这些成体干细胞不能大规模地的应用于临床治疗

胚胎干细胞培养技术的发展兴起为糖尿病的细胞替代疗法带来了希望。胚胎干细胞不仅具有强大的自我更新能力，而且体内或体外还可分化形成包括外胚层、中胚层、内胚层三个胚层在内的所有细胞。这就为在体外获得足量的有功能的某种细胞成分用于细胞治疗或组织工程提供了可能。自胚胎干细胞分离培养成功以来，国内外的学者们一直在尝试体外定向诱导胚胎干细胞分化成为胰岛细胞用于糖尿病的细胞治疗。目前国外已有报道(Rajagopal JA，Science2003；299(5605)：363)从小鼠胚胎干细胞和人的胚胎干细胞成功诱导出可分泌胰岛素的胰岛样细胞，并且把这些细胞移植到患糖尿病小鼠体内可以使其血糖恢复至正常水平。尽管如此，国内外研究均表明，采用目前的方法从胚胎干细胞中诱导分化而来的胰岛素分泌细胞仅占细胞总数的一少部分(10～30％)，而且RT-PCR检测不到Insulin-I的表达。因此，提高定向诱导胚胎干细胞分化成为β-细胞的效率就显得尤为重要。

硒是一种微量元素，也是一种抗氧化剂，可以保护细胞膜脂类物质不受氧化剂的损伤。硒的抗氧化作用直接与谷光甘肽过氧化酶的组成和活性密切相关。谷光甘肽过氧化酶是一种食硒蛋白质，如果缺硒，则该酶的活性降低，直接导致动物在新陈代谢过程中产生的过氧化物难以清除。近年来的研究(Heart E.JCell Biochem.2003；88(4)：719)还表明，硒在糖尿病的治疗过程也有着重要的作用，表现为一种类胰岛素的行为，硒能够促进3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖转移因子的表达，而葡萄糖转移因子在β-细胞中起着很重要的作用，可以促进β-细胞分泌成熟的胰岛素。硒对诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞是否具有促进作用目前尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效经济的诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征是以硒作为主要诱导剂，在五种不同的培养基里分阶段诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞。本发明以硒作为主要诱导剂，来提高胚胎干细胞诱导为胰岛样细胞的效率，其技术方案如下：

1)原代胎鼠成纤维细胞(PMEF)的制备

取出孕13.5～14.5天小鼠子宫中的胎鼠，其中孕鼠可以是昆明小鼠。无菌条件下，把胎鼠剪碎，消化，制成细胞悬液，以一定的密度接种到培养皿或培养瓶中，培养过夜，次日冻存细胞。

2)饲养层细胞的制备

复苏原代PMEF，制成细胞悬液，以一定密度接种到培养皿或培养瓶中，待细胞有50％融合时，用丝裂霉素C处理，胰蛋白溶液消化，制成细胞悬液，接种到组织培养皿里贴壁培养。

3)胚胎干细胞的未分化培养

无菌条件下取胚胎干细胞接种到经丝裂霉素处理的PMEF饲养层上，在第一种培养基，即含非必需氨基酸、β-巯基乙醇、庆大霉素的DMEM培养液里培养。

4)拟胚体(EB)的获得

将胚胎干细胞用胰酶消化，转入细菌培养皿，在第二种培养基，即含非必需氨基酸、烟酰胺、β-巯基乙醇和庆大霉素的DMEM培养液中悬浮培养。

5)拟胚体(EB)的贴壁培养

无菌条件下取拟胚体接种到用明胶包被过的组织培养皿里，在第三种培养基，即含HEPES缓冲液、葡萄糖、碳酸氢钠、谷氨酰胺、胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白和纤维连粘素的DMEM/F12(1∶1)中贴壁培养。

6)胰岛样细胞的获得

取贴壁培养的EB，将其培养在第四种培养基，即含HEPES缓冲液、葡萄糖、碳酸氢钠、谷氨酰胺、胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白、纤维连粘素、bFGF、酮、腐胺及B27添加物的DMEM/F12(1∶1)。随后再将培养液换成第五种培养基，即含10～20％的胎牛血清、烟酰胺和亚硒酸钠的H-DMEM。

本发明提供一种诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的方法。使用诱导剂硒可以显著提高胚胎干细胞中胰岛样细胞所占的比例，而且在25mmol/L葡萄糖浓度的刺激下每个胰岛样细胞团可以分泌0.63ng胰岛素，比国外相关文献报道的分泌量要高；另外，硒是一种微量元素，价格低廉，成本低；最后，本方法可为今后糖尿病的治疗和相关新药的开发奠定基础，具有明显的临床应用前景。

附图说明

图1未分化的小鼠胚胎干细胞ES-D3(×100)。显示未分化的胚胎干细胞为表面光滑的细胞集落。

图2悬浮培养7天后的EB(×50)。显示EB已具有原始内胚层的结构。

图3DTZ对培养35天后胰岛素分泌细胞团的染色结果，阳性为深红色(×50)显示分泌胰岛素的细胞。

图4体视学对DTZ阳性细胞的分析结果，与对照组相比^*P＜0.05(n＝9)。

图5不同亚硒酸钠浓度组细胞释放胰岛素的ELISA检测结果，与对照组相比^*P＜0.05(n＝9)

图6a诱导28d后RT-PCR检测结果1.相对分子质量标准DL2000；2.β-actin；3.a-amylase-2A；4.Glucagon；5.OCT-4；6.GATA-4；7.carboxypeptidasea 8.IAPP 9.PDX-I 10.HNF3β11.Glut2 12.insulin-II

图6b诱导35d后RT-PCR检测结果1.β-actin；2.Insulin-I；3.IAPP；4.相对分子质量标准DL2000

具体实施方式：

实施例1 PMEF的制备

在无菌条件下，取出孕13.5天昆明鼠子宫中的胎鼠，用无菌眼科弯镊和弯剪将胎鼠剪成1mm³大小，置于0.25％胰酶溶液中，37℃消化10分钟，获得的单细胞用含10～15％胎牛血清的DMEM培养F：\张岩\张妍发明专利说明书1.DOC液制成细胞悬液，以6～8×10⁸的密度接种到75ml培养瓶中，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱中培养，第二天细胞长满，用含30％胎牛血清和10％DMSO的DMEM培养液冻存细胞。

实施例2 饲养层细胞的制备

复苏实施例1制备的PMEF，用含20％胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，3～5×10⁶的密度接种到培养皿或培养瓶中，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱培养，当细胞有50％融合时，用含10μg/ml丝裂霉素C和20％胎牛血清的DMEM的培养液处理2～3小时，然后用0.25％的胰蛋白溶液进行消化，用含20％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，以1×10⁶个/ml的细胞密度接种到用0.1％明胶包被过的组织培养皿里，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱中培养。

本实施例中1×10⁶个/ml的饲养层细胞密度，有利于维持胚胎干细胞的未分化状态。

实施例3 小鼠胚胎干细胞的未分化培养

无菌条件下取129小鼠胚胎干细胞系，以2×10⁶个/ml的细胞密度接种到实施例2制备的饲养层细胞上，在含15％胎牛血清、100mmol/L非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2×10⁴u/L庆大霉素的DMEM培养液里，培养扩增3代，共7天。

本实施例可得到生长状态良好的小鼠胚胎干细胞(图1)。

实施例4 胚体(EB)的获得

在无菌条件下，将实施例3制备的小鼠胚胎干细胞用0.1％胰酶和0.08％EDTA按1∶1混合进行消化，然后转入10-cm细菌培养皿，在含20％胎牛血清，100mmol/L非必需氨基酸、10mM/L烟酰胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇和2×10⁴u/L庆大霉素的DMEM培养液中悬浮培养7天。

本实施例可得到具有原始内胚层结构的EB(图2)。

实施例5 拟胚体(EB)的贴壁培养

在无菌条件下，将实施例4制备的拟胚体接种到用0.1％明胶包被过的组织培养皿里，在含5mmol/L HEPES缓冲液、0.6％葡萄糖、3mmol/L碳酸氢钠2mmol/L谷氨酰胺、5g/ml胰岛素、30nmol/L亚硒酸钠、50g/ml转铁蛋白和5g/ml纤维连粘素的DMEM/F12(1∶1)中贴壁培养7天。

实施例6 胰岛样细胞的获得

在无菌条件下，将实施例5制备的EB培养在含5mmol/L HEPES缓冲液、0.6％葡萄糖、3mmol/L碳酸氢钠2mmol/L谷氨酰胺、5g/ml胰岛素、30nmol/L亚硒酸钠、50g/ml转铁蛋白、5g/ml纤维连粘素、10ng/ml bFGF、20nmol/L孕酮、100mol/L腐胺及B27添加物的DMEM/F12(1∶1)培养液里，贴壁培养7天，然后将培养液换成H-DMEM，其中含15％的胎牛血清、10mmol/L烟酰胺和30～810nmol/L浓度的亚硒酸钠，贴壁培养细胞7天，其中亚硒酸钠最佳浓度是通过体视学分析和胰岛素分泌量检测来确定的。采用单因素ANOVA和最小显著差数法(LSD法)检验评估实验组和对照组间的结果(图4，5)，最后得到270nmol/L亚硒酸钠可以显著提高胚胎干细胞中胰岛样细胞所占的比例。

实施例7 胰岛样细胞的检测

1)双硫腙(DTZ)染色

将100mg DTZ溶于10ml二甲基亚砜(DMSO)，-20℃保存，作为工作液。将10l工作液加至1ml培养液中，37℃孵育实施例6制备的细胞15分钟，撤掉DTZ。DTZ阳性细胞为深红色(图3)。

2)RT-PCR检测

分别取诱导分化第28天和第35天实施例6的EB，进行RT-PCR检测。诱导第28d时(图6a)胰岛素分泌细胞团表达决定胰腺发育的一个关键性转录因子——胰腺十二指肠同源基因-1(pancreatic and duodenal homeobox gene-1，PDX-I)。同时还检测到胰腺组织其它相关基因的表达，如：葡萄糖转运子-2(glucose transporter-2，Glut2)、胰高血糖素(Glucagon)、羧基肽酶(carboxypeptidase)及a-淀粉酶-2A(a-amylase-2A)。另外还检测出胚胎发育过程中内胚层相关基因：HNF3β、GATA-4。但未检测出胰岛素-I(Insulin-I)、胰岛素-II(insulin-II)及胰淀多肽(islet amyloid polypeptide，IAPP)。诱导第35d时，除上述基因外，还检测出Insulin-I和IAPP，但未检测到insulin-II和PDX-I的表达(图6b)。OCT-4(octamer-binding transcription factor-4，OCT-4)是一种检测胚胎干细胞未分化状态的标志基因，在两次PCR检测中均没有检测到。

Claims

1.一种诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征是以5种优化培养基分5个阶段诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞。其中在第一阶段用第一种培养基贴壁培养7-10天，第二阶段在第二种培养基中悬浮培养7-10天，第三阶段在第三种培养基中贴壁培养7-10天，第四阶段在第四种培养基中贴壁培养7-20天，第五阶段在第五种培养基中贴壁培养7-30天。特别是在第五种培养基中添加硒，可显著提高诱导胚胎干细胞分化为胰岛样细胞的比例。

2.根据权利要求1中所述的方法，其中胚胎干细胞可以是建系的小鼠胚胎干细胞，也可以是人或其它动物来源的胚胎干细胞。

3.根据权利要求1中所述的方法，其中第一种培养基可以是不含丙酮酸钠的H-DMEM，其中含15％胎牛血清、100mmol/L非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇和2×10⁴u/L庆大霉素。

4.根据权利要求1中所述的方法，其中第二种培养基可以是H-DMEM，其中含20％胎牛血清、100mmol/L非必需氨基酸、10mmol/L烟酰胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇和2×10⁴u/L庆大霉素。

5.根据权利要求1中所述的方法，其中第三种培养基可以是DMEM/F12(1∶1)，其中含5mmol/L HEPES缓冲液、0.6％葡萄糖、3mmol/L碳酸氢钠2mmol/L谷氨酰胺、5g/ml胰岛素、30nmol/L亚硒酸钠、50g/ml转铁蛋白和5g/ml纤维连粘素。

6.根据权利要求1中所述的方法，其中第四种培养基可以是DMEM/F12(1∶1)，其中含5mmol/L HEPES缓冲液、0.6％葡萄糖、3mmol/L碳酸氢钠、2mmol/L谷氨酰胺、5g/ml胰岛素、30nmol/L亚硒酸钠、50g/ml转铁蛋白、5g/ml纤维连粘素、10ng/ml bFGF、20nmol/L孕酮、100mol/L腐胺及B27添加物。

7.根据权利要求1中所述的方法，其中第五中培养基可以是H-DMEM，其中含15％的胎牛血清和10mmol/L烟酰胺和一定浓度的亚硒酸钠。

8.根据权利要求7中的所述的方法，其中亚硒酸钠浓度可以是可在30～7290nmol/L，亚硒酸钠浓度在小鼠胚胎干细胞诱导为胰岛样细胞的过程中起关键性作用，它可以大幅度地提高所培养细胞中胰岛样细胞的比例含量。