KR20200018506A - 세포 대체 요법을 제공하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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사라 페버
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오르제네시스 엘티디.
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Abstract

본 발명은, 전환분화된 세포가 스캐폴드가 없는 3D 세포 클러스터 및 2차원 (2D) 단층으로서 배양된 유사한 전환분화된 세포와 비교해, 강화된 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 가지는, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3차원 (3D) 세포 클러스터를 개시한다.

Description

세포 대체 요법을 제공하기 위한 조성물 및 방법
본원에 제시된 내용은 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 가진 전환분화된 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3차원 (3D) 세포, 및 이의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본원의 내용은 상기한 3D 클러스터를 이용한 췌장 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
일반적으로 당뇨병으로 지칭되는 진성 당뇨병은 인슐린의 분비 및/또는 이용 부족을 특징으로 하는 임상 장애로서, 2030년에 주요 사망 원인 7번째가 될 것으로 예상되는 생명을 위협하는 증상을 야기한다. 당뇨병의 치료 옵션은 인슐린을 자가 주사하는데 집중되어 있는데, 이는 불편하고 부정확한 방법이다. 질병의 중증 합병증을 앓고 있는 환자에는 췌장 이식도 고려된다. 췌장 이식은 >80%의 환자들에서 인슐린 비의존성과 연관되어 있지만, 이환율과 사망률이 높은 복잡한 시술이다.
당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반의 `피를 개발하기 위한 대부분의 시도도들은 췌장 섬 (pancreatic islet)을 이용하는 것이지만, 최근에는 다양한 소스로부터 유래된 세포를 인슐린 생산 세포 (IPC)로 분화시키고자 하는 연구 시도들이 증가하고 있다. 췌장 전사 인자 (pTF)의 이소성 발현을 통해 성체 인간 간 세포를 IPC로 리프로그래밍하는 것도 β-세포를 보충하는 무제한 소스로서 제안된 바 있다. 전환분화된 간 세포가, 당뇨병 SCID 마우스에 생체내 이식에 의해, 글루코스-조절된 방식으로 인슐린을 생산, 가공 처리 및 분비하여, 고혈당을 개선하는 것으로 입증되었다. 인슐린 분비를 달성하기 위해, 간 세포를 pTF로 형질전이하여, 글루코스-조절된 인슐린-생산 세포로 분화되게 유도한다.
일반적으로 세포, 특히 췌장 β-세포는 복잡한 세포-세포 상호작용과 세포-기질 상호작용, 그리고 영양분과 세포에 대한 복잡한 수송 다이나믹스가 존재하는 3차원 (3D) 미세환경에 존재한다. 표준 2차원 (2D) 또는 단층 세포 배양물은 이러한 환경을 충분히 표현하지 못한다. 3D 세포 배양물은 세포 교류 (cellular communication) 및 세포외 기질 형성 측면에서 생체내 조직과 더 비슷하다. 이들 기질은 세포가 살아있는 조직에서 기능하는 방식과 비슷한 방식으로 세포 기능을 돕는다. 일반적으로, 3D 세포 배양물은 또한 2D 세포 배양물과 비교해 안정성이 더 우수하고, 수명이 길다. 이는, 숙주에 장기간 이식 및 세포의 장기적인 작용에 더 적합하다는 것을 의미한다.
3D 세포 클러스터는 세포 부착 및 조직 발생을 위한 구조적인 지지를 제공하는 스캐폴드에서 생장시킬 수 있다. 스캐폴드는 일반적으로 부착 부위를 제공함으로써, 일부 경우에는 관련 인자를 제공함으로써, 세포의 세포외 환경과 비슷하다. 다수의 합성 및 생흡수성 폴리머 생체물질들이 세포 스캐폴드로 사용된다. 그 중, 폴리(글리세롤 세바케이트) (PGS)가 수많은 장점들로 인해 인기가 올라가고 있다.
당뇨병에 대한 개선된 치료법이 절실히 필요하다는 것은 명백하다. 본원에 기술된 3D 세포 배양물은 당해 기술 분야에 공지된 당뇨병 치료뿐 아니라 다른 인슐린 생산 세포 (IPC)에 비해 더 유리하게 만드는 몇가지 특징들을 가지고 있다. 이러한 클러스터들이 이식 테라피에 사용될 수 있어, 현재 당뇨병을 치료하는데 필요한 인슐린을 수차례 자가 주사하지 않아도 된다.
일 측면에서, 본원은 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하며, 이들 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된, 3차원 (3D) 세포 클러스터를 개시한다.
관련 측면에서, 스캐폴드는 고체 스캐폴드, 하이드로겔, 세포외 기질, 세포외 기질 하이드로겔, 단백질 하이드로겔, 펩타이드 하이드로겔, 폴리머 하이드로겔, 목질 나노셀룰로스 하이드로겔, 폴리글리세롤 세바케이트 (PGS) 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
다른 측면에서, PGS는 물질과 가교된다. 관련 측면에서, 이러한 물질은 라미닌 (laminin), 파이브로넥틴, 피브린, 콜라겐 타입 I/III 및 엘라스틴, 및 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 관련 측면에서, 스캐폴드는 복수의 미세입자들을 포함한다. 관련 측면에서, 스캐폴드는 PGS를 포함하며, 미세입자는 직경 약 1 ㎛ 내지 약 1 mm 범위이다.
다른 측면에서, 미세입자는 직경 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 범위이다. 관련 측면에서, 3D 세포 클러스터는 캡슐화 물질 (encapsulation agent)에 의해 캡슐화된다. 관련 측면에서, 캡슐화 물질은 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 아가로스, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리-L-라이신 (PLL), 폴리설폰 (PSU), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리락트산 (PLA), 아크릴레이트 및 저 분자량 덱스트란 설페이트 (LMW-DS), 또는 이의 임의 유도체 및 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다.
다른 측면에서, 스캐폴드는 전환분화된 세포를 캡슐화한다. 관련 측면에서, 전환분화된 세포는, 단층 세포 배양물로부터 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 글루코스-조절된 C-펩타이드 분비 개선, 글루코스-조절된 인슐린 분비 개선, 인슐린 양적 증가, GCG 발현 증가, NKX6.1 발현 증가 또는 PAX6 발현 증가, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
다른 측면에서, 전환분화된 세포는 높은 글루코스 농도에 반응하여 C-펩타이드를 적어도 20 pm/h*106(세포)로 분비한다. 관련 측면에서, 세포는 이소적으로 (ectopically) 발현된 전사 인자에 의해 전환분화되며, 이소적으로 발현되는 췌장 전사 인자는, 이소적으로 발현된 췌장 전사 인자에 의해 유사하게 전환분화되고 단층 세포 배양물로서 배양된 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 가진 전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, 발현이 증가된다.
다른 측면에서, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포의 생존성은, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포의 생존성과 비슷하다. 관련 측면에서, 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포는 상피 세포, 내피 세포, 각질 형성 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간 세포 (hepatocyte 또는 liver cell), 혈액 세포, 줄기 또는 전구 (progenitor) 세포, 간 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 또는 전구 세포, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
관련 측면에서, 줄기 또는 전구 세포는 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간 및 지방세포 조직, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 수득된다.
일 측면에서, 본원은, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하되 상기 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된 3D 세포 클러스터를 포함하는, 약학적 조성물을 개시한다.
일 측면에서, 본원은, 스캐폴드를 제공하는 단계; 일차 성체 포유류 비-췌장성 세포를 수득하는 단계; 이전 단계의 일차 성체 포유류 비-췌장성 세포를 증식 및 증폭시키는 단계; 이전 단계의 증식 및 증폭된 세포를 전환분화하는 단계; 이전 단계의 전환분화된 세포의 적어도 일부를 스캐폴드에 부착시키는 단계; 이로써, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포를 포함하되 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된 3D 세포 클러스터가 구축되는 것을 포함하는, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하되 이들 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된, 3D 세포 클러스터를 구축하는 방법을 개시한다.
다른 측면에서, 전환분화는, 증폭된 세포에, 인간 PDX-1 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를, 제1 시점에 감염시키는 단계; 이전 단계의 증폭된 세포에, 제2 인간 췌장 전사 인자 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를, 제2 시점에 감염시키는 단계; 및 이전 단계의 증폭된 세포에, 인간 MafA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를, 제3 시점에 감염시키는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 제2 췌장 전사 인자는 NeuroD1 및 Pax4로부터 선택된다. 관련 측면에서, 제1 시점과 제2 시점은 동시적이다. 관련 측면에서, 세포의 증식 및 증폭, 세포의 전환분화 또는 이들의 조합은 비-부착성 세포 배양 조건 하에 수행된다.
일 측면에서, 본원은, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 개체에 투여하는 단계를 포함하며; 이로써 개체에서 질환이 치료되는 것을 포함하는, 개체에서 췌장 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 개시한다.
다른 측면에서, 투여는 개체에 3D 세포 배양물의 진피내, 복막내 또는 외과적 투여, 또는 이들의 임의 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 관련 측면에서, 질환은 I형 당뇨병, II형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 췌장암, 고혈당, 췌장염, 췌장 가성낭종, 상해로 인한 췌장 외상, 3형 당뇨병 또는 췌장절제술 (pancreatectomy)의 합병증 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
도 1은 폴리글리세롤 세바케이트 (PGS)와 이의 합성 과정을 도시한 것이다. 도 1a는 3D PGS의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 도시한 것이다. 도 1b는 PGS를 화학 합성하는 반응식을 도시한 것이다.
도 2는 3차원 (3D) 세포 클러스터의 제조 공정을 개괄적으로 도시한 것이다. 다음의 단계들을 포함한다: 옵션 단계 1 - 간 조직 (예, 간 생검) 수득; 단계 2 - 조직을 가공 처리하여 일차 간 세포 수득; 단계 3 - 일차 간 세포를 지정된 세포 수로 증식; 단계 4 - 일차 간 세포의 전환분화; 단계 5 - 비-부착성 조건에서 배양; 단계 6 - 3D 세포 배양물 회수; 및 단계 7 - 전환분화된 세포의 정성 보증 (quality assurance) 및 정성 관리 (quality control) 검사 (즉, 안전성, 순도 및 효능). 선택 단계는 초기 계대 배양한 간 세포의 냉동보존; 향후 사용을 위해 냉동보존된 세포의 해동; 3D 클러스터로부터 단일 세포 분리; 및 향후 사용을 위한 전환분화된 세포 보관을 포함한다.
도 3a-3d는 실시예 2-5에서 사용된 배양 방법과 프로토콜을 개괄적으로 도시한 것이다. 도 3a는 부착 (2차원 (2D)) 및 비-부착 (3D) 조건에서 전환분화된 (TD) 간 세포를 배양하기 위해 사용된 방법의 도식도이다. 도 3b는 여러가지 실험 배양 조건을 도시한 것이다. 도 3c는 실험 6일째에 수행된 공정을 도시한 것이다. 도 3d는 실험 7일째 수행된 공정을 도시한 것이다.
도 4는 실시예 4 및 5에 기술된 실험들에서 세포를 비-부착 (3D) 조건하에 전환분화하기 위해 사용된 방법의 도식도이다.
도 5는 실시예 6에 사용된 비-부착 조건에서 전환분화된 (TD) 간 세포를 배양하기 위해 사용된 방법의 도식도이다.
도 6은 여러가지 크기의 3D 세포 클러스터, 및 클러스터 크기와 접종 세포 수 간의 상관성을 나타낸 것이다.
도 7a-7c는 여러가지 농도로 접종하여 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건에서 배양한 TD 세포의 표현형을 나타낸 것이다. 도 7a는 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 이소성 유전자 발현을 도시한 것이다. 도 7b는 NKX6.1, 소마스타틴 (SST) 및 글루카곤 (GCG)의 췌장 유전자 발현을 도시한 것이다. 도 7c는 C-펩타이드 분비를 도시한 것이다.
도 8은 여러가지 배지에서 비-부착 조건하에 구축하고, 이후 부착 조건하에 접종한, 3D 세포 클러스터를 나타낸 것이다.
도 9a-9b는 여러가지 배지에서 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건하에 배양한 전환분화된 세포의 C-펩타이드 분비를 나타낸 것이다. 도 9a는 분비된 C-펩타이드 pmol을 나타낸 것이다. 도 9b는 RNA μg에 따라 표준화한 시간 당 C-펩타이드 pmole을 나타낸 것이다.
도 10a-10d는 6일 및 7일에 여러가지 배지에서 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건하에 배양한 TD 세포의 유전자 발현을 나타낸 것이다. 도 10a는 PDX-1, NeuroD 1 및 MafA의 이소성 발현을 나타낸 것이다. 도 10b는 NKX6.1의 발현을 나타낸 것이다. 도 1Oc는 GCG의 발현을 나타낸 것이다. 도 10d는 PAX6의 발현을 나타낸 것이다.
도 11a-11c는 여러가지 조건에서 배양한 3D 세포 클러스터의 형태를 나타낸 것이다. 도 11a는 75T 플라스크에서 세포 2.5 x 106개를 배지 12.5 ml에 접종하여 구축한 클러스터의 형태를 나타낸 것이다. 도 11b는 세포 3x 105개를 6웰 플레이트내 배지 4 ml에 접종하여 구축한 클러스터의 형태를 나타낸 것이다. 도 11c는 세포 3.75 x 105개를 6웰 플레이트내 배지 4 ml에 접종하여 구축한 클러스터의 형태를 나타낸 것이다.
도 12a-12b는 여러가지 크기의 플라스크에서 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건하에 배양한 TD 세포의 유전자 발현을 나타낸 것이다. 도 12a는 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 이소성 발현을 나타낸 것이다. 도 12b는 췌장-특이적인 글루카곤 (GCG) 및 NKX6.1의 발현을 나타낸 것이다.
도 13a-13b는 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건하에 배양하고, Pall Inc (USA) 사에서 제조한 바이러스를 이용해 전환분화한, TD 세포의 표현형을 나타낸 것이다. 도 13a는 NKX6.1, 글루카곤 (GCG) 및 소마스타틴 (SST)의 유전자 발현을 나타낸 것이다. 도 13b는 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 이소성 발현을 나타낸 것이다.
도 14는 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건하에 배양하고, 여러 제조사로부터 제공된 바이러스를 이용해 전환분화한, TD 세포의 유전자 발현을 나타낸 것이다. 도 14a는 NKX6.1, 글루카곤 (GCG) 및 소마스타틴 (SST)의 유전자 발현을 나타낸 것이다. 도 14b는 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 이소성 발현을 나타낸 것이다. *: OD260 Inc. (ID, USA) 아데노바이러스로 감염된 세포; **: Pall Inc. (USA) 아데노바이러스로 감염된 세포.
도 15a-15b는 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건하에 배양하고, 여러 제조사로부터 제공된 바이러스를 이용해 전환분화한, TD 세포의 C-펩타이드 분비를 나타낸 것이다. 도 15a는 분비된 C-펩타이드를 pmole/ml로 나타낸 것이다. 도 15b는 pmole/시간/세포 106을 나타낸 것이다. *: OD260 Inc. (ID, USA) 아데노바이러스로 감염된 세포; **: Pall Inc. (USA) 아데노바이러스로 감염된 세포.
도 16은 AggreWells (150 세포/웰)에서 배양한, 무처리 (UT) 및 전환분화된 (TD) 일차 인간 성체 간 세포 세포의, 대표적인 클러스터를 나타낸 것이다. 광 현미경 사진을 7일 및 15일에 촬영하였다. 상단 패널은 UT 및 TD 세포 150개/웰에서 형성된 응집체를 나타낸다.
도 17a-17b는 부착 (2D) 및 비-부착 (3D) 조건에서 배양한 전환분화된 (TD) 세포의 유전자 발현을 나타낸 것이다. 도 17a는 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 이소성 발현을 나타낸 것이다. 도 17b는 NKX6.1 및 글루카곤 (GCG)의 내인성 유전자 발현을 나타낸 것이다.
본 발명의 내용은 본 개시 내용의 일부를 구성하는 아래 상세한 설명을 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 수 있다. 본 개시 내용은 본원에 기술 및/또는 도시된 구체적인 생성물, 방법, 조건 또는 파라미터로 제한되지 않으며, 본원에 사용된 용어는 단순 예로서 구체적인 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐 청구된 내용을 제한하고자 하는 것은 아니다.
본원에서 달리 정의되지 않은 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당해 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않은 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함하여야 한다.
본원에서, 단수형 "a," "an," 및 "the"은 복수도 포함하며, 구체적인 수치 값에 대한 언급은 명확하게 달리 기술되지 않은 한 그 구체적인 수치를 적어도 포함한다. 본원에서, "복수"는 하나 보다 많은 것을 의미한다. 수치 범위로 표현된 경우, 다른 구현예는 하나의 특정 값에서 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 마찬가지로, 수치들 앞에 "약"을 사용해 대략치로 표현되는 경우, 개개 값이 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해된다. 모든 범위는 포괄적이며, 조합가능하다.
일부 구현예에서, 용어 "약"은 표시된 수치 또는 수치 범위로부터 0.0001-5%의 편차를 의미한다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 표시된 수치 또는 수치 범위로부터 1-10% 범위의 편차를 의미한다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 표시된 수치 또는 수치 범위로부터 최대 25%의 편차를 의미한다.
본원은 췌장, 간 및 기타 질환을 치료하기 위해 전환분화된 세포를 제공하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본원은 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하되 클러스터가 스캐폴드에 부착된, 3차원 (3D) 세포 클러스터를 개시한다. 일부 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 호르몬을 생산 및 분비할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 스캐폴드 안에 캡슐화된다. 또한, 본원은 스캐폴드에 부착된 전환분화된 세포의 3D 세포 클러스터를 제조하는 방법을 개시한다. 또한, 본원은 스캐폴드에 부착된 전환분화된 세포의 3D 세포 클러스터를 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 췌장 장애를 치료하는 방법을 개시한다.
3차원 (3D) 세포 클러스터
일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 (IPC) 및 스캐폴드를 포함하되 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된, 3차원 (3D) 세포 클러스터를 개시한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "3D 세포 클러스터"가 물리적으로 서로 접촉되어 있으며 3차원 "3D" 구조로 조직화된 일군의 세포를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 3D 클러스터에서 세포는 자체에 대해 임의 방향 (즉, 위, 아래 및 옆)으로 위치한 다른 세포들과 접촉할 수 있다. 3D 클러스터는 배양 배지에 현탁되어, 모든 외부 표면이 배지에 접촉할 수 있다. 이는 2차원 "2D" 세포 클러스터 또는 다른 타입의 단층 세포 배양물과 대조된다. 2D 클러스터 내 세포는 한쪽 사이드가 플레이트와 접촉하므로, 이의 측면에 위치한 다른 세포와만 접촉할 수 있다. 마찬가지로, 2D 클러스터의 한쪽 사이드만 배지와 물리적으로 접촉할 수 있다.
용어 "3D 세포 클러스터"는 특성 및 의미가 모두 동일한 "세포 스페로이드 (cell spheroid)", "다세포 스페로이드", "3D 세포 콜로니" 및 "세포 클러스터"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 10 내지 50 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 50 내지 100 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 100 내지 200 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 200 내지 300 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 300 내지 400 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 400 내지 500 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 500 내지 600 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 600 내지 700 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 700 내지 800 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 800 내지 900 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 약 900 내지 1000 ㎛의 크기를 가진다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 1000 ㎛ 보다 큰 크기를 가진다.
일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포를 10주 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포 약 10 내지 50주를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포 약 50 내지 500주를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포 약 500 내지 1000주를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포 약 1000 내지 2000주를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포 약 2000 내지 3000주를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포 약 3000 내지 4000주를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포 약 4000 내지 5000주를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 세포를 5000주 보다 더 많이 포함한다.
일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 동종 (homogeneous) 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 이종 (heterogeneous) 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 비슷한 표현형을 포함하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 여러가지 표현형을 포함하는 세포를 포함한다.
스캐폴드
일부 구현예에서, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 (IPC)들 중 일부 (subset)는 스캐폴드에 부착된다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 10% 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 10% 내지 20%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 20% 내지 30%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 30% 내지 40%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 40% 내지 50%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 50% 내지 60%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 60% 내지 70%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 70% 내지 80%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 80% 내지 90%를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포들 중 일부는 세포들의 약 90% 내지 100%를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "스캐폴드"는 세포 부착을 위한 구조적 지지체를 제공하는 물질을 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 스캐폴드는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 6,379,962 및 미국 특허 6,143,293에 기술되어 있으며, 이들 각각은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 스캐폴드는 섬 (islets)의 천연 세포외 환경을 모방한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 가수분해성 또는 효소적 분해에 대해 저항성을 제공한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 인간 췌장 섬의 계층화된 (hierarchical) 구조를 모방한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 세포를 면역-보호성 (immune-protective) 생체물질 내에 캡슐화하여, 숙주에서 이식 통합 (transplant integration)을 강화한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드의 다공성은 염증성 세포와 항체의 유입은 방지하면서 산소와 영양분의 교환은 촉진하도록 조정된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "세포 부착"이 세포 부착 분자, 셀렉틴, 인테그린, 신데칸 및 카드헤린과 같은 세포 표면 분자의 상호작용에 의해 매개되는, 세포와 표면, 기질 또는 다른 세포와의 물리적 상호작용을 포함함을, 알 것이다. 용어 "세포 부착"은 특성 및 의미가 모두 동일한 "세포 부착", "세포 결합", "세포 로딩" 및 "세포 결합"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표면에의 세포 접종은 세포를 표면에 부착시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 세포 부착은 비-공유력 (non-covalent force)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 스캐폴드에 공유적으로 부착된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 스캐폴드의 물리-기계적, 생화학적 및 기능적인 특징들을 분석 및 최적화할 수 있음을, 이해할 것이다. 세포 부착 및 증식에 영향을 미치는 기계적 특성과 같은 스캐폴드의 관련 물리-기계적 특성 (예, 탄성, 압축성, 점탄성 거동, 인장 강도)을 조사할 수 있다. 스캐폴드의 생리학적 조건에서의 안정성 역시 조사할 수 있다. 이를 위해, 스캐폴드를 이식 부위의 천연 환경을 모방하는 인자들의 조합 (pH, 효소, 온도 등)에 노출함으로써, 스캐폴드의 분해를 조사할 수 있다. 생체적합성 (biocompatibility), 세포 부착, 세포 생존성 및 세포 증식을 평가하기 위한 시험관내 세포 배양 실험을 수행할 수 있다. 대조 현미경 (contrast microscopy)을 이용한 세포 형태, 세포 회수 및 트립판 블루 배제 분석을 이용한 세포 생존성 평가 실험을 수행할 수 있다. 분자 수준에서 세포 기능성을 평가하기 위한 실시간 PCR에 의한 pTF 및 호르몬의 발현 분석 등의 실험을 수행할 수 있다. 디티존 염색에 의한 인슐린 함량 측정, ELISA에 의한 C-펩타이드 농도 측정에 의한 인슐린 분비 및 분비량 측정, 그리고 글루코스 자극된 인슐린 분비 (GSIS) 측정 등의, 세포 수준에서 세포 기능성을 평가하는 실험을 수행할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 스캐폴드의 면역학적 프로파일을 평가 및 최적화할 수 있음을 알 것이다. 면역원성은, 예를 들어, 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)를 전환분화된 세포가 첨가 또는 비-첨가된 스캐폴드에 노출시키고, 사이토카인 및 T 세포 증식을 측정함으로써, 검사할 수 있다. 48시간 후 PBMC 상층액을 수집하고, 상업적으로 입수가능한 키트를 사용해 사이토카인을 측정함으로써, IFNγ와 같은 사이토카인의 분비를 분석할 수 있다. T 세포의 증식은 5일간 공동-배양한 후 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 염색함으로써 조사할 수 있다. CFSE 표지는 각 세포 분열에 따라 희석되므로, 따라서 유세포 측정으로 T 세포의 증식을 평가할 수 있다. T 세포 아종 (CD8, CD4, T 세포)을 분석하기 전에 표지할 수 있다. 전환분화된 세포가 로딩된 스캐폴드 또는 스캐폴드 단독을 동물에 이식함으로써 생체내 결과를 검증할 수 있다. 이러한 생체내 실험에서, 이식 후 지정된 시점에 마우스를 희생시키고, 이식물을 회수한다. 회수한 이식물 절반은 배양 및 염색하고, 광 및 형광 현미경으로 관찰하여, 세포 형태, 생존성 및 조직 과잉 생장 (tissue overgrowth)을 평가한다. 회수된 마이크로캡슐의 다른 절반은 반응성 CD8 T 세포를 동정하기 위한 조직학적 분석에 사용된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 스캐폴드에 부착된 전환분화된 인슐린 생산 세포의 생존성과 기능에 대해, 세포 보관, 포장 및 수송이 미치는 효과를 분석 및 최적화할 수 있음을 알 것이다. 현재 섬 보존 방법은 4℃ 저온 저장을 기본으로 하며, 단 24-48시간 동안의 제한적인 세포 생존이 가능하다. 스캐폴드 전환분화된 세포의 기능성을 여러가지 온도 및 보존 배지에서 검사할 수 있다. 스캐폴드와 함께 또는 스캐폴드 없이, 여러 시점에 세포 생존성, 유전자 발현 및 세포 효능 (cell potency)을 측정할 수 있다. 안정기 종료 시점에 기능적 활성 및 효능이, 대조군 산물에서 수득되는 값의 70% 미만으로 떨어지지 않는다면, 이는 성공적인 것으로 간주할 수 있다. 3종 이상의 여러 공여체로부터 유래된 세포를 조사할 수 있다. 수송 배지의 2가지 후보 제형 용액을 구축된 배치 비교에서 사용할 수 있다. 포장재 (주로, 백)의 효과는 시간, 온도, 최종 세포 밀도 및 최적의 적용 부피 측면에서 확립할 수 있다.
일부 구현예에서, 스캐폴드는 고체 스캐폴드이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 세포외 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 세포외 기질 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 단백질 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 펩타이드 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 폴리머 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 목질 나노셀룰로스 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 폴리글리세롤 세바케이트 (PGS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 유연하며, 의도하지 않은 위치로 이동되지 않게 정 위치에 고정될 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 세포를 둘러싸 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 세포를 포함하는 스캐폴드는 캡슐화 물질 안에 캡슐화된다.
일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착되는 세포는 동일한 타입의 세포들이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 2가지 타입 이상의 세포들이 부착된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 2가지 타입의 세포들이 부착된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 3가지 타입의 세포들이 부착된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 4가지 타입의 세포들이 부착된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 5가지 타입 이상의 세포들이 부착된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착되는 세포는 전환분화된 인슐린 생산 세포이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착되는 세포는 인슐린 생산 세포 및 림프구이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착되는 세포는 인슐린 생산 세포 및 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착되는 세포는 인슐린 생산 세포, 림프구 및 PBMC이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착된 세포의 타입이 전환분화된 인슐린 생산 세포에 대해 지지 기능을 제공해준다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착된 세포의 타입이 면역관용 환경을 형성한다. 일부 구현예에서, 면역관용 환경이 이식 및 이식된 세포의 생존을 촉진한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "세포 타입" 또는 "세포의 타입"이 형태적으로 또는 표현형적으로 구분되는 세포 형태를 구별하기 위해 사용되는 분류를 포함함을, 이해할 것이다. 세포 타입에 대한 일부 비-제한적인 예로는 상피 세포, 내피 세포, 각질 형성 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간 세포 (hepatocyte 또는 liver cell), 혈액 세포, 줄기 또는 전구 세포, 배아 심근 세포, 간 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 인슐린 생산 세포, 전환분화된 인슐린 생산 세포, 췌장 베타 세포 표현형을 가진 전환분화된 세포, 췌장 베타 세포 표현형을 가진 전환분화된 간 세포, 림프구, PBMC, 췌장 베타 세포 이외의 췌장 세포, 선방 세포, 알파-세포를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 간 세포의 바이러스 형질감염이 현탁액에서 매우 효율적이지만, 부착 간 세포의 형질감염은 어렵다는 것을, 알 것이다. 따라서, 여러가지 물리-기계적 및 기능적 특징을 가진 여러가지 스캐폴드 아키텍처들에서 스캐폴드에 부착된 상태에서 간 세포의 전환분화를 촉진하는 능력을 검사할 수 있다. 일 구현예에서, 효율은 EDTA를 저 농도로 사용해 온도 및 트립신 농도와 같은 주요 파라미터들을 최적화함으로써, 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 스캐폴드는 보관, 포장 및 수송 이후의 세포 생존성 및 기능을 개선한다. 일 구현예에서, 세포 생존성은 24시간 이상으로 증가한다. 일 구현예에서, 세포 생존성은 48시간 이상으로 증가한다. 일 구현예에서, 안정기 종료 시점에 기능적 활성 및 효능은 대조군 물질에서 수득되는 값의 70% 미만으로 떨어지지 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 보존 온도 및 보존 배지를 달리함으로써 세포 기능성에 영향을 미칠 수 있음을 알 것이다. 이를 위해, PGS 스캐폴드와 함께 또는 스캐폴드 없이 여러 시점에 세포 생존성, 유전자 발현 및 세포 효능을 측정할 것이다.
폴리글리세롤 세바케이트 ( PGS )
일 구현예에서, 스캐폴드는 폴리글리세롤 세바케이트 (PGS)를 포함한다. PGS는 당해 기술 분야에 잘 알려진 폴리머이며, 예를 들어 미국 특허 9,359,472 및 7,722,894에 충분히 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. PGS 폴리머 제조 방법 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 9,359,472 및 7,722,894에 충분히 기술되어 있다.
일부 구현예에서, PGS 폴리머는 복수의 미세입자를 포함한다. 미세입자는 세포 배양 용량을 높이기 위해 부피 대비 높은 표면적 비율을 제공한다 (도 1a). PGS 합성시 선택되는 일반적인 출발 물질은 글리세롤과 세바스산이다 (도 1b). 글리세롤 (CH2(OH)CH(OH)CH2OH)은 전술한 설계 기준에 적합한 지질의 기본 빌딩 블럭이다. 마찬가지로, 세바스산 (HOOC(CH2)8COOH)은 독성 및 폴리머 화학 관점에서 산성 모노머로서 선택된다. 세포 배양에 적합한 PGS 미세입자는 당해 기술 분야에 공지된 임의 기법, 예를 들어 열 경화와 조합된 에멀젼 기법을 통해 제조할 수 있다. 일 예로, 온도, 전단 혼합, 에멀젼 외상 (outer phase) 및 계면활성제 농도를 달리함으로써, PGS 미세입자의 크기를 조정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 생체적합성을 높이고, 세포 부착, 증폭 및/또는 전환분화를 위한 PGS 스캐폴드의 표면 특성을 변형하기 위해, 여러가지 방식들을 사용할 수 있음을, 알 것이다. 친수성, 표면 전하, 표면 토포그라피 (surface topography) 및 흡착된 생체 분자들 모두 세포 부착에 영향을 미치며, 화학적 에칭 기법 (예, NaOH 처리), 효소 처리, 친수성 기의 그래프팅 및 스캐폴드 표면에 부착성 단백질의 코팅에 의해, 변형할 수 있다. 마찬가지로, 경화 온도, 세바스산에 대한 글리세롤의 몰비 및 경화 시간을 달리하여, PGS의 변성 카이네틱스를 개선할 수 있으며, 즉 PGS 세포독성 효과를 낮출 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 스캐폴드 표면적 전체에 세포의 효과적인 부착, 심지어 분포를 촉진하는 조건을, 예를 들어, 스캐폴드 농도, 접종 밀도, 배지 제형, 최소 교반 속도 및 배지 구성성분에 변화를 줌으로써, 최적화할 수 있음을, 알 것이다. 예를 들어, 배지내 높은 단백질 농도가 세포의 스캐폴드 부착을 차단하거나 또는 지연할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 세포를 스캐폴드로부터 분리시키는 고 전단력을 유발하지 않으면서 양호한 산소 전달은 유지하는데 필요한 파라미터를 결정하기 위해, 실험을 수행할 수 있음을, 알 것이다. 이러한 실험들에서, 생물반응조 안에 균질한 조건을 유지시키고, 염기 또는 소포제와 같은 공급물을 신속하게 배분하고, 세포 호흡을 위해 배양 배지내 적절한 산소 흡수와 이산화탄소 제거를 유지하기 위한 충분한 믹싱이 제공되는지를 모니터링하면서, 유체역학적 전단 응력을 가능한 많이 줄인다. 이러한 실험은, 예를 들어, 5L 1회용 백이 장착된 Wave 생물반응조에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, PGS 스캐폴드는 물질과 가교된다. 일부 구현예에서, 이러한 물질은 라미닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 물질은 파이브로넥틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 물질은 피브린을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 물질은 콜라겐 타입 I/III을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 물질은 엘라스틴을 포함한다. 일부 구현예에서, PGS 스캐폴드는 상기한 물질들의 조합과 가교된다.
일 구현예에서, 스캐폴드는 복수의 미세입자를 포함한다. 일 구현예에서, 미세입자는 직경 약 0.1 ㎛ 내지 약 1 ㎛의 범위이다. 일 구현예에서, 미세입자는 직경 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 범위이다. 일 구현예에서, 미세입자는 직경 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 범위이다. 일 구현예에서, 미세입자는 직경 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 범위이다. 일 구현예에서, 미세입자는 직경 약 100 ㎛ 내지 약 1 mm의 범위이다. 일 구현예에서, 미세입자는 직경 약 1 mm 내지 약 10 mm의 범위이다. 일 구현예에서, 미세입자는 직경 약 1 ㎛ 내지 약 1 mm의 범위이다.
캡슐화
일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 전환분화된 포유류 비-췌장성 베타 IPC 및 스캐폴드를 포함하며, 이들 세포들 중 적어도 일부는 스캐폴드에 부착되고, 캡슐화 물질에 의해 둘러싸인다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "캡슐화 물질"이 세포를 둘러싸고 있으며, 세포 대사에 필수적인 분자의 유입과 치료학적 가치가 있는 분자 및 폐기물의 유출을 포함하여, 원하는 분자의 양방향 확산을 선택적으로 허용하는, 폴리머성 반-투과 막을 지칭함을, 알 것이다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전환분화된 세포를 환자의 면역 거부 반응으로부터 보호한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전환분화된 세포의 생존성을 비-캡슐화된 전환분화된 세포와 비교해 증가시킨다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전환분화된 세포로부터의 인슐린 분비를 비-캡슐화된 전환분화된 세포와 비교해 증가시킨다. 당해 기술 분야의 당업자라면, "캡슐화한다"가 대상을 막 안으로 둘러싸는 것을 의미함을, 알 것이다. 일부 구현예에서, 막은 폴리머성 반투과 막이다.
일부 구현예에서, 포유류 비-췌장성 베타 세포는 캡슐화된 후 스캐폴드에 부착된다. 일부 구현예에서, 포유류 비-췌장성 베타 세포들 중 적어도 일부는 스캐폴드 안에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 대부분의 포유류 비-췌장성 베타 세포는 스캐폴드 안에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 포유류 비-췌장성 베타 세포 전체가 스캐폴드 안에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 비-췌장성 베타 세포는 스캐폴드 상에 접종되며, 이후 세포 접종된 스캐폴드가 캡슐화 물질 안에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 용해성 인자 (soluble factor)가 캡슐화 물질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 세포의 전환분화를 촉진하는 인자가 캡슐화 물질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 세포 생존을 촉진하는 인자가 캡슐화 물질 내에 포함된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 반-투과성 막으로 캡슐화된 전환분화된 세포의 이식이 여러가지 유용함을, 알 것이다. 첫째, 캡슐화된 그래프트는 면역 시스템에 의해 거부되지 않는다. 둘째, 캡슐화는 그래프트의 생존성을 높인다. 세째, 캡슐화는 부적절한 부작용을 낮춘다. 넷째, 캡슐화는 장기간 면역억제제의 사용 필요성을 떨어뜨린다. 또한, 캡슐화는 생체내 세포 효능을 추적하기 위해 또는 그래프트가 손상되었거나 또는 이식된 환자에게 위험할 경우, 환자로부터 그래프트를 회수할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 알기네이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 셀룰로스 설페이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 콜라겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 키토산을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 젤라틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 아가로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 폴리-L-라이신 (PLL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 폴리설폰 (PSU)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 폴리비닐 알코올 (PVA)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 폴리락트산 (PLA)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 아크릴레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 저 분자량 덱스트란 설페이트 (LMW-DS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전술한 물질들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전술한 물질들의 임의 조합을 포함한다.
전환분화된 세포
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "전환분화"는 세포가 배아 특징을 가진 단계를 통해 진행되지 않고 제1 세포 타입이 식별 특징을 상실하여 표현형이 제2 세포 타입의 표현형으로 바뀌는 프로세스를 지칭함을, 알 것이다. 일부 구현예들에서, 제1 세포 및 제2 세포는 서로 다른 조직 또는 세포 계통들로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 전환분화는 성숙한 또는 분화된 세포를, 다른 성숙한 또는 분화된 세포로 전환하는 과정을 수반한다. 세포를 분화 또는 전환분화하는 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단들을 이용할 수 있다. 구체적으로, 계통-특이적인 전사 인자 (TF)가 성체 세포를 내분비 췌장 세포, 뉴론, 조혈 세포 및 심근세포 계통으로 전환하는 유익한 역할을 수행하는 것으로 제시된 바 있으며, 이는 전환분화 프로세스가 광범위한 환경에서 발생함을 시사한다. 모든 전환분화 프로토콜에서, 이소성 전사 인자는 잠재적인 광의의, 기능적이고 비가역적인 발생 프로세스에 대한 단기 촉발자로서 사용된다.
일부 구현예에서, 전환분화는 췌장 베타 세포 계통의 전구 세포의 분화, 예를 들어, 만능성 줄기 세포, 내배엽 세포, 췌장 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 내분비 전구 세포 또는 내분비 섬 계통의 전구체의 분화를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 일부 구현예에서, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형이, 글루코스-감지 (GLUT2 (마우스의 경우) 및 GLUT1 (인간의 경우)의 발현이 필요함), 세포 흥분 (SUR1 및 KIR6.2의 발현이 필요함), 인슐린 프로세싱 (PCSK1 및 PCSK2의 발현이 필요함), 인슐린-분비 과립구 (insulin-secretory granule)에의 아연 흡수 (ZNT8의 발현이 필요함), 및 크로모그라닌-B (CHGB) 및 유로코르틴 3 (UCN3)의 분비 작용들 중 한가지 이상의 작용에 세포를 참여시킬 수 있는 능력을 포함함을 알 것이다. 일부 구현예에서, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형은 UCN3, ZNT8, MAFA, CX36, PSCK1, PSCK2, MafB (인간에서), PAX4, NEUROD1, ISL1, NKX6.1, GLUT2, INS 및 PDX-1의 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형은 유전자 MAFB (마우스의 경우) 및 NGN3의 불활성화를 포함한다.
일부 구현예에서, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형 및 기능은 췌장 호르몬의 발현, 생산 및/또는 분비를 포함한다. 췌장 호르몬은, 비-제한적으로, 인슐린, 소마스타틴, 글루카곤 (GCG) 또는 섬 아밀로이드 폴리펩타이드 (IAPP)를 포함할 수 있다. 인슐린은 간 인슐린 또는 혈청 인슐린일 수 있다. 일부 구현예에서, 인슐린은 글루코스 이용, 및 탄수화물, 지방 및 단백질 대사를 촉진할 수 있는 인슐린의 완전히 가공된 형태 (fully process form)이다. 일부 구현예에서, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형 및 기능은 췌장 전사 인자의 발현 및/또는 생산을 포함한다. 췌장 전사 인자는 Pdx1, Ngn3, NeuroD1, Pax4, MafA, NKX6.1, NKX2.2, Hnflα, Hnf4α, Foxo1, CREB 패밀리 멤버, NFAT, FoxM1, Snail 및/또는 Asc-2를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 췌장 호르몬은 "프로호르몬" 형태이다. 다른 구현예에서, 췌장 호르몬은 호르몬의 완전히 가공 처리된 생물학적 활성 형태이다. 다른 구현예들에서, 췌장 호르몬은 조절성 통제 하에 있으며, 즉, 호르몬의 분비는 내인성으로 생산되는 췌장 호르몬과 비슷한 영양 및 호르몬에 의한 통제 하에 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 구현예에서, 호르몬은 글루코스의 제어성 통제 하에 존재한다.
췌장 베타 세포의 표현형은, 예를 들어 췌장 호르몬의 생산, 즉, 인슐린, 소마스타틴 또는 글루카곤 단백질 mRNA 또는 단백질 발현을 측정함으로써 확인할 수 있다. 호르몬 생산은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해, 즉, 면역분석, 웨스턴 블롯, 수용체 결합 분석에 의해 또는 당뇨병 숙주에의 이식시 고혈당 완화 능력에 의해 기능적으로 측정할 수 있다. 인슐린 분비는, 예를 들어, C-펩타이드 가공 및 분비에 의해 측정할 수도 있다. 다른 구현예에서, 고-민감도 분석으로 인슐린 분비를 측정할 수 있다. 다른 구현예에서, 고-민감도 분석은 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 메조스케일 검색 분석 (mesoscale discovery assay, MSD) 또는 효소-연계된 면역스팟 분석 (ELISpot) 또는 당해 기술 분야에 공지된 분석을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 본원에 명시된 방법을 이용해 인슐린을 생산 및 분비하게 될 수 있다. 세포의 인슐린 생산력은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 분석할 수 있다. 예를 들어, 인슐린 mRNA를 RT-PCR에 의해 검출하거나, 인슐린에 대해 만들어진 항체에 의해 인슐린을 검출할 수 있다. 아울러, 췌장 분화에 대한 또다른 표시인자로는, 유전자 Isl-1, Pdx-1, Pax-4, Pax-6 및 Glut-2의 발현을 포함한다. 섬 세포를 동정하기 위한 다른 표현형 마커들이 US 2003/0138948에 기술되어 있으며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
췌장 β-세포의 표현형은 예를 들어 췌장-특이적인 유전자의 프로모터의 활성화에 의해 측정할 수 있다. 특히 중요한 췌장-특이적인 프로모터로는 인슐린 및 췌장 전사 인자들의 프로모터들, 즉, 내인성 PDX-1의 프로모터를 포함한다. 프로모터의 활성화는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해, 예컨대 루시퍼라제 분석, EMSA 또는 하류 유전자 발현의 검출에 의해 측정할 수 있다.
일부 구현예들에서, 췌장 β-세포의 표현형은 또한 췌장 유전자 발현 프로파일을 유도함으로써 측정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, "췌장 유전자 발현 프로파일"은, 프로파일이 비-내분비 조직에서는 정상적으로 전사되지 않는 하나 이상의 유전자, 즉, 췌장 전사 인자, 췌장 효소 또는 췌장 호르몬의 발현을 포괄하는 것임을 알 것이다. 췌장 효소는, 예를 들어, PCSK2 (PC2 또는 프로호르몬 컨버타제), PC 1/3 (프로호르몬 컨버타제 1/3), 글루코키나제, 글루코스 트랜스포터 2 (GLUT-2)이다. 췌장-특이적인 전사 인자는, 예를 들어, Nkx2.2, Nkx6.1, Pax-4, Pax-6, MafA, NeuroD1, NeuroG3, Ngn3, beta-2, ARX, BRAIN4 및 Isl-1을 포함한다.
췌장 유전자 발현 프로파일의 유도는 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 공지된 기법을 이용해 검출할 수 있다. 예를 들어, 췌장 호르몬 RNA 서열은, 예컨대 노던 블롯 혼성화 분석, 역전사-기반의 중합효소 연쇄 반응 등의 증폭-기반의 검출 방법 또는 마이크로어레이 칩 분석에 의한 시스템 검출 (systemic detection)로 검출할 수 있다. 다른 예로, 발현은 또한 단백질 수준에서, 즉, 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 수준 측정에 의해 측정할 수 있다. 특정 구현예에서, PC1/3 유전자 또는 단백질 발현은 프로호르몬을 이의 활성형의 성숙한 형태로 가공하는 이의 활성에 의해 확인할 수 있다. 이러한 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 유전자에 의해 코딩된 단백질에 대한 항체를 이용한 면역분석, 또는 가공된 프로호르몬의 HPLC를 포함한다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 10% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 200% 내지 300%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 300% 내지 400%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 400% 내지 500%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 500% 내지 600%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 600% 내지 700%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 700% 내지 800%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 800% 내지 900%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 약 900% 내지 1000%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 증가는 1000% 보다 높다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 10% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 200% 내지 300%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 300% 내지 400%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 400% 내지 500%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 500% 내지 600%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 600% 내지 700%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 700% 내지 800%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 800% 내지 900%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 약 900% 내지 1000%이다. 일부 구현예에서, 상기한 글루코스-조절된 인슐린의 분비 증가는 1000% 보다 높다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 인슐린 함량 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 인슐린 함량 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 인슐린 분비 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 인슐린 분비 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비-전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, 인슐린 분비 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, C-펩타이드 분비 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, C-펩타이드 분비 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비-전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, C-펩타이드 분비 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 인슐린 함량 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 인슐린 함량 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비-전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, 인슐린 함량 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, GCG 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, GCG 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비-전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, GCG 발현 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 10% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 200% 내지 300%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 300% 내지 400%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 400% 내지 500%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 500% 내지 600%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 600% 내지 700%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 700% 내지 800%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 800% 내지 900%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 약 900% 내지 1000%이다. 일부 구현예에서, 상기한 GCG 발현 증가는 1000% 보다 높다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, NKX6.1의 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, NKX6.1의 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비-전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, NKX6.1의 발현 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 2배 미만이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 2배 내지 5배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 5배 내지 10배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 10배 내지 20배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 20배 내지 30배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 30배 내지 40배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 40배 내지 50배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 50배 내지 60배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 60배 내지 70배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 70배 내지 80배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 80배 내지 90배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 약 90배 내지 100배이다. 일부 구현예에서, NKX6.1의 발현 증가는 100배 보다 높다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, PAX6 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, PAX6 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비-전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, PAX6 발현 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 10% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 200% 내지 300%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 300% 내지 400%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 400% 내지 500%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 500% 내지 600%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 600% 내지 700%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 700% 내지 800%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 800% 내지 900%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 약 900% 내지 1000%이다. 일부 구현예에서, 상기한 PAX6 발현 증가는 1000% 보다 높다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 2 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 5 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 10 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 20 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 50 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 100 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 200 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 500 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 글루코스 고 농도에 반응하여, C-펩타이드를 적어도 1000 pm C-펩타이드/106 세포/시간으로 분비한다.
일부 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.001 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.002 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.003 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.005 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.007 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.01 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.1 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 0.5 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 1 pg 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 5 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 10 pg 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 50 pg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 100 pg 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 500 pg 인슐린/106 세포/시간으로 분비한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 1 ng 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 5 ng 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 10 ng 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 50 ng 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 100 ng 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 500 ng 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 1 μg 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 5 μg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 10 μg 인슐린/ 106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 50 μg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다. 다른 구현예에서, 글루코스-조절된 인슐린 분비는 적어도 100 μg 인슐린/106 세포/시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 글루코스 고 농도는 2mM보다 높은 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 글루코스 고 농도는 5mM보다 높은 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 글루코스 고 농도는 1OmM보다 높은 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 글루코스 고 농도는 15mM보다 높은 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 글루코스 고 농도는 17.5mM보다 높은 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 글루코스 고 농도는 20mM보다 높은 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비슷한 이소성 췌장 전사 인자를 사용해 전환분화되고 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 전환분화를 위해 사용된 이소성 췌장 전사 인자의 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 비슷한 이소성 췌장 전사 인자를 사용해 전환분화되고 스캐폴드없이 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 전환분화를 위해 사용된 이소성 췌장 전사 인자의 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 이소성 췌장 전사 인자는 PDX1, NeuroD1, Pax4 및/또는 MafA 또는 이들의 임의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 이소성 PDX1의 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 25% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 50% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 100% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 200% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 500% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 1,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 2,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 10,000% 증가한다.
일부 구현예에서, 이소성 PDX1의 발현은, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포에서, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 세포와 비교해, 적어도 25% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 50% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 100% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 200% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 500% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 1,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 2,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 10,000% 증가한다.
일부 구현예에서, 이소성 NeuroD1의 발현은, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포에서, 단일층으로서 배양된 전환분화된 세포와 비교해, 적어도 25% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 50% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 100% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 200% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 500% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 1,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 2,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 10,000% 증가한다.
일부 구현예에서, 이소성 NeuroD1의 이소성 발현은, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포에서, 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 세포와 비교해, 적어도 25% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 50% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 100% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 200% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 500% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 1,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 2,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 10,000% 증가한다.
일부 구현예에서, 이소성 MafA의 발현은, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포에서, 단일층으로서 배양된 전환분화된 세포와 비교해, 적어도 25% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 50% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 100% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 200% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 500% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 1,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 2,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 단일층으로서 배양된 세포와 비교해 적어도 10,000% 증가한다.
일부 구현예에서, 이소성 MafA의 발현은, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포에서, 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 세포와 비교해, 적어도 25% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 50% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 100% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 200% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 500% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 1,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 2,000% 증가한다. 일부 구현예에서, 상기한 발현은 스캐폴드 없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 세포와 비교해 적어도 10,000% 증가한다
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "단층 세포 배양"이 세포가 다른 세포의 위에서 자라지 않고, 모든 세포들이 옆으로 증식하여 종종 같은 증식 표면으로 서로 접촉하는 배양 타입을 내포함을, 알 것이다. 용어 "단층 세포 배양"은 특성과 의미가 동일한 "2D 세포 배양"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 증가된 생존성을 가진다. 일부 구현예에서, 전환분화된 세포는, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와, 비슷한 생존성을 가진다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는, 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해, 증가된 생존성을 가진다. 일부 구현예에서, 스캐폴드와 함께 3D 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포는 스캐폴드없이 3D 세포 클러스터로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비슷한 생존성을 가진다.
일부 구현예에서, 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포는 상피 세포, 내피 세포, 각질 형성 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간 세포 (hepatocyte 또는 liver cell), 혈액 세포, 줄기 또는 전구 세포, 간 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 또는 전구 세포, 또는 이들의 임의 조합이다. 일 구현예에서, 세포는 전능성 (totipotent) 또는 만능성 (pluripotent) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유도된 만능성 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기 또는 전구 세포는 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간, 지방세포 조직, 또는 이들의 임의 조합으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 포유류 비-췌장성 베타 세포는 여러가지 세포 타입들의 조합이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단의 소스는 인간 소스이다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단의 소스는 인슐린 치료가 필요한 개체의 자가 인간 소스이다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단의 소스는 인슐린 치료가 필요한 개체의 동종이계 인간 소스이다.
특정 구현예에서, 세포는 지방세포 조직, 골수, 피부, 태반, 탯줄, 와튼젤리 (Wharton's jelly) 또는 제대혈로부터 유래되는 간엽 기질 세포라고도 하는 간엽 줄기 세포이다. "제대혈 (umbilical cord blood 또는 cord blood)은 신생아 또는 태아, 가장 바람직하게는 신생아로부터 수득되는 혈액을 지칭하는 것이며, 바람직하게는 출생시 탯줄 또는 태반으로부터 수득되는 혈액을 의미한다. 이들 세포는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 통상적인 방법에 따라 수득할 수 있다. MSC는, 비-제한적인 예로, CD105, CD73 및 CD90 등의 특정 세포 표면 마커의 발현, 및 조골세포, 지방세포 및 연골모세포 등의 복수의 계통으로 분화할 수 있는 능력에 의해, 규정된다. MSC는 플라스틱 부착, STRO-1과 같은 단일클론 항체를 이용한 분리 또는 상피-간엽 이행 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)이 진행 중인 상피 세포를 통해서와 같이, 통상적인 단리 기법에 의해 조직으로부터 수득할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, "지방세포 조직-유래 간엽 줄기 세포"가 지방세포 조직으로부터 단리된 미-분화된 성체 줄기 세포를 포함할 수 있으며, 또한 특성과 의미가 모두 동일한 "지방세포 줄기 세포"로도 지칭될 수 있음을, 알 것이다. 이들 세포는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 통상적인 방법에 따라 수득할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "태반-유래 간엽 줄기 세포"가 태반으로부터 단리된 미-분화된 성체 줄기 세포를 포함할 수 있으며, 또한 특성과 의미가 모두 동일한 "태반 줄기 세포"로 본원에 언급될 수 있음을, 알 것이다.
일부 구현예에서, 화합물 (즉, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9 폴리펩타이드 또는 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산)에 노출, 즉 이와 접촉하는 세포 집단은, 임의 개수의 세포, 즉 하나 이상의 세포일 수 있으며, 시험관내, 생체내 또는 생체외로 제공될 수 있다. 전사 인자와 접촉되는 세포 집단은 전사 인자와의 접촉 전에 시험관내에서 증폭될 수 있다. 형성된 세포 집단은 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 나타낸다. 이들 세포는, 전환분화 및 베타-세포 계통을 따른 성숙화 이전에, 그리고 이를 필요로하는 환자 또는 개체에 투여 또는 전달되기 전에, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 시험관내에서 증폭될 수 있다.
치료학적 조성물
본원에 기술된, 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된, 전환분화된 3차원 (3D) 클러스터는, 치료학적으로 사용될 경우, 본원에서 "치료제"로 언급된다. 치료제의 투여 방법으로는 비-제한적으로, 진피내, 복막내, 정맥내, 임플란트와 같은 수술 및 경구 경로 등이 있다. 본원에 제시된 치료제는 임의의 편리한 경로를 통해, 예를 들어, 주입에 의해, 볼루스 주사에 의해, 외과적 이식에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성 물질과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소, 예를 들어, 간 또는 췌장으로의 간문맥 전달일 있다. 또한, 필요가 필요한 영역에 치료제를 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있으며; 이는 예를 들어, 비-제한적으로, 수술 중의 국소 주입, 주사, 카테터의 사용 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 정맥내로 투여된다. 특히 치료제는 간문맥 주입을 통해 전달될 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "치료학적인 유효량"이 의미있는 환자 효용, 즉, 해당 의학 상태의 치료, 치유, 예방 또는 완화, 또는 이러한 상태들의 치료율, 치유율, 예방율 또는 완화율 증가를 나타내는데 충분한 약학적 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총량을 포함할 수 있음을, 알 것이다. 단독 투여되는 개개 활성 성분에 적용되는 경우, 이 용어는 단일 성분에 대해 사용된다. 조합물에 적용되는 경우, 이 용어는 조합, 연속 또는 동시 투여되든간에, 치료학적 효과를 발휘하는 활성 성분의 총량을 지칭한다.
본원에 제시된 치료제를 정맥내 투여하기 위한 적정 투여량 범위는 통상적으로 전환분화된 세포 백만개 이상, 전환분화된 세포 2백만개 이상, 전환분화된 세포 5백만개 이상, 전환분화된 세포 천만개 이상, 전환분화된 세포 2천5백만개 이상, 전환분화된 세포 5천만개 이상, 전환분화된 세포 1억개 이상, 전환분화된 세포 2억개 이상, 전환분화된 세포 3억개 이상, 전환분화된 세포 4억개 이상, 전환분화된 세포 5억개 이상, 전환분화된 세포 6억개 이상, 전환분화된 세포 7억개 이상, 전환분화된 세포 8억개 이상, 전환분화된 세포 9억개 이상, 전환분화된 세포 10억개 이상, 전환분화된 세포 20억개 이상, 전환분화된 세포 30억개 이상, 전환분화된 세포 40억개 이상 또는 전환분화된 세포 50억개 이상이다. 일부 구현예에서, 투여량은 체중이 60-75 kg인 개체의 경우, 전환분화된 세포 10억 - 20억개이다. 당해 기술 분야의 당업자는, 유효량을 시험관내 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 확보된 용량-반응 그래프로부터 추정할 수 있음을 알 것이다. 다른 구현예에서, 유효량은 간문맥 정맥을 통해 정맥내로 투여될 수 있다.
또한, 증식을 위해 또는 세포에 대한 바람직한 효과 또는 세포에서 바람직한 활성을 나타내기 위해, 세포는 또한 본원에 제시된 치료제의 존재하에 생체외 배양할 수 있다. 그런 후, 처리된 세포를 본원에 기술된 투여 경로를 통해 치료학적 목적으로 생체내 도입할 수 있다.
약학적 조성물
본원에 기술된, 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된, 전환분화된 3차원 (3D) 클러스터는, 투여에 적합한 약학적 조성물로 통합될 수 있다. 이러한 조성물은, 전형적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 약학적인 투여로 사용가능한, 임의의, 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 적절한 담체는 본 분야의 표준 참조문헌인 Remington's Pharmaceutical Sciences의 최신 개정판에 기술되어 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 담체 또는 희석제에 대한 바람직한 예로는, 비-제한적으로, 물, 식염수, 핑거 (finger) 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민 등이 있다. 리포좀 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정 오일 (fixed oil)도 사용될 수 있다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 시약의 사용은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질은 활성 화합물과 혼용불가하지 않은 한, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물도 조성물에 투입될 수 있다.
본원에 개시된 약학적 조성물은 의도한 투여 경로에 적합하게 제형화된다. 주사 용도로 적합한 약학적 조성물은, 멸균 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 무균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한, 무균 산제를 포함한다. 정맥내 투여하는 경우, 적절한 담체로는 생리 식염수, 제균수 (bacteriostatic water), Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)가 있다. 모든 경우에, 조성물은 무균성이어야 하며, 용이한 주사가 가능한 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균 등의 미생물 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유한, 용매 또는 분산액일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴 등의 코팅제를 사용하거나, 분산제의 경우 필요한 입자 크기를 유지하거나, 계면활성제를 이용함으로써, 유지시킬 수 있다. 미생물 작용 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써, 달성할 수 있다.
무균 주사 용액 (sterile injectable solution)은 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매 중에 필요에 따라 전술한 성분들 중 한가지 또는 성분들의 조합과 함께 첨가한 다음, 여과 멸균 (filtered sterilization)함으로써, 제조할 수 있다. 통상적으로, 분산제는, 활성 화합물을 기본 분산 매질과 전술한 성분들 중 필요한 기타 성분을 포함하는 무균성 비히클에 투입함으로써, 제조한다. 무균 주사 용액을 제조하기 위한 무균성 산제의 경우, 제조 방법은, 활성 성분 + 미리 멸균 여과한 용액으로부터 유래된 임의의 부가적인 적절한 성분의 분말을 수득하는, 진공 건조 및 동결-건조이다.
일부 구현예에서, 활성 화합물은, 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템 등의, 제어 방출형 제형과 같이, 화합물이 신체에서 빠르게 없어지지 않게 하는 방지하는 담체를 사용해 조제된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성의 생체적합한 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 재료들은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁제 (바이러스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 표적화하는 리포좀 등)가 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
3차원 (3D) 세포 배양물의 구축 방법
본원은, 전환분화된 세포들 중 적어도 일부가 스캐폴드에 부착된, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포의 3D 세포 클러스터의 구축 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 세포 증식, 증폭, 전환분화 및 스캐폴드에의 부착을 포함한다. 일부 구현예에서, 췌장 베타 세포 표현형은 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 인간 조직으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 인간 조직을 가공 처리하여 일차 인간 비-췌장성 세포를 회수한다. 일부 구현예에서, 세포를 스캐폴드에 접종하고, 그 위에서 증식 및/또는 증폭시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 스캐폴드에 부착된 채 전환분화된다. 일부 구현예에서, 세포는 전환분화 후 스캐폴드에 부착된다. 일부 구현예에서, 세포는 비-부착성 세포 배양 조건에서 증식 및/또는 증폭된다. 일부 구현예에서, 세포는 비-부착 조건에서 전환분화된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, "비-부착성 세포 배양 조건"이 액체 배지 중에 현탁된 채 단일 세포 또는 작은 세포 응집체를 배양하는 유형의 배양을 포함하며, 이 용어는 특징과 의미가 동일한 "세포 현탁 배양"과 상호 호환적으로 사용될 수 있음을 알 것이다.
일부 구현예에서, 세포는 배치 배양에서와 같은 비-부착 조건, 즉 배치 배양, 즉 교반된 배지를 지정된 부피로 수용한 밀폐된 시스템에서, 영양분 첨가 또는 폐기물의 제거없이 배양할 수 있다. 배치 배양은 오르비탈 플랫폼 교반기 상에 탑재된 플라스크, 코니칼 플라스크 또는 웰 플레이트와 같은 용기 (recipient) 내에서 유지할 수 있다. 다른 구현예에서, 배치 배양은, 세포를 배지 및 공기에 얼터너티브로 노출시키는, 니플 플라스크 안에서 유지할 수 있다. 다른 구현예로, 배치 배양물은, 지정된 속도로 축을 중심으로 회전하고 통상적으로 지정된 각도로 기울어 있는, 약 10 L의 배지 부피를 담고 있는 더 큰 용기로 구성되는, 스피닝 배양으로 유지될 수 있다. 다른 예로, 배치 배양은 무균 공기를 기포로 주입하거나 및/또는 교반기에 의해 교반되는 배지를 수용한 큰 배양 용기로 구성되는, 교반 배양으로 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 비-부착 조건에서 연속 배양으로, 즉 세포에 영양분을 공급하고 폐기물을 제거하기 위해 배지를 교체하는 시스템으로 배양할 수 있다. 연속 배양은 밀폐된 타입, 즉 세포를 회수하여 다시 배양물에 투입하는 시스템일 수 있다. 연속 배양은 개방형 타입, 즉 세포와 배지가 신선한 배지로 교체되는 타입일 수 있다. 개방형 연속 배양은 화학조절기 생물반응조 (chemostat bioreactor), 즉 신선한 배지가 계속적으로 첨가되면서, 현 배지는 동일한 비율로 계속적으로 제거되는 생물반응조에서 수행될 수 있다. 개방형 연속 배양은, 배지 혼탁도에 의해 결정되는 배지내 세포 농도에 따라 배지 유속을 동적으로 조절하는, 혼탁조절장치 (turbidostat)에서 수행될 수 있다. 개방형 연속 배양은 pH, 산소, 에탄올 농도, 당 농도 등과 같이 수집된 측정치에 따라 배지의 유속을 동적으로 조절하는, 옥소스타트 (auxostat)에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착된 3D 클러스터는 생물반응조에서 배양할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 세포 생존, 증식 또는 췌장 베타 세포 유사 표현형을 촉진하기 위해, 생물반응조가 IPC 생리학적 환경을 시뮬레이션할 수 있음을 알 것이다. 생리학적 환경은 온도, 산소 농도, 이산화탄소 농도 또는 임의의 기타 관련 생물학적, 화학적 또는 기계적 자극과 같은 파라미터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 생물반응조는 3D 클러스터를 배양하는데 적합한 온도와 습도 조건을 모니터링하는 하나 이상의 소형 플라스틱 실린더형 챔버를 포함한다. 또한, 생물반응조는, 폴리에틸렌 테레프탈레이트와 같은 생활성 합성 물질을 사용해, 임의의 대상 용해성 인자들이 제공될 수 있는 밀폐된 환경으로 3D 클러스터를 둘러쌀 수 있다. 생물반응조의 챔버는 모든 방향으로 동일한 세포 증식이 이루어지도록 회전할 수 있다.
일부 구현예에서, 일차 세포들 중 적어도 일부는 스캐폴드에 부착된다. 일부 구현예에서, 증식 및 증폭된 세포들 중 적어도 일부는 스캐폴드에 부착된다. 일부 구현예에서, 전환분화된 세포들 중 적어도 일부는 스캐폴드에 부착된다.
세포를 전환분화하는 방법은 미국 특허 6,774,120, 미국 특허 공개공보 2005/0090465, 미국 특허 공개공보 2016/0220616에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 모든 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 포유류 유래 비-췌장성 세포를 PDX-1, Pax-4, NeuroD1 및 MafA와 같은 췌장 전사 인자와 특정 시점에 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 제1 단계의 세포를 Pax-4와 제2 시점에 접촉시키는 단계; 및 제2 단계의 세포를 MafA와 제3 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 제1 단계의 세포를 NeuroD1과 제2 시점에 접촉시키는 단계; 및 제2 단계의 세포를 MafA와 제3 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1 및 제2 전사 인자와 접촉시키는 단계; 및 제1 단계의 세포를 MafA와 제2 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 전사 인자는 NeuroD1 및 Pax4로부터 선택된다. 다른 구현예에서, PDX-1과 함께 제공되는 전사 인자는 Pax-4, NeuroD1, Ngn3 또는 Sox-9을 포함한다. 다른 구현예에서, PDX-1과 함께 제공되는 전사 인자는 Pax-4를 포함한다. 다른 구현예에서, PDX-1과 함께 제공되는 전사 인자는 NeuroD1을 포함한다. 다른 구현예에서, PDX-1과 함께 제공되는 전사 인자는 Ngn3를 포함한다. 다른 구현예에서, PDX-1과 함께 제공되는 전사 인자는 Sox-9을 포함한다.
다른 구현예들에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 제1 단계의 세포를 Ngn3와 제2 시점에 접촉시키는 단계; 및 제2 단계의 세포를 MafA와 제3 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예들에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 제1 단계의 세포를 Sox9과 제2 시점에 접촉시키는 단계; 및 제2 단계의 세포를 MafA와 제3 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1 및 제2 전사 인자와 접촉시키는 단계; 및 제1 단계의 세포를 MafA와 제2 시점에 접촉시키는 단계를 포함하며, 제2 전사 인자가 NeuroD1, Ngn3, Sox9 및 Pax4로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 및 제1 단계의 세포를 MafA와 제2 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1 및 Pax4와 접촉시키는 단계; 및 제1 단계의 세포를 MafA와 제2 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1 및 Ngn3와 접촉시키는 단계; 및 제1 단계의 세포를 MafA와 제2 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 이 방법은 제1 시점에 포유류 비-췌장성 세포를 PDX-1 및 Sox9와 접촉시키는 단계; 및 제1 단계의 세포를 MafA와 제2 시점에 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 세포는 3개의 인자 모두 (PDX-1; NeuroD1 또는 Pax4 또는 Ngn3; 및 MafA)와 동시에 접촉하지만, 이의 발현 수준은 제1 시점에는 PDX-1이, 제2 시점에는 NeuroD1 또는 Pax4 또는 Ngn3가, 그리고 제3 시점에는 MafA가 세포내에서 발현되는 방식으로 조절된다. 발현의 조절은, mRNA 수준을 변화시키거나 또는 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단에 의해, 유전자들이 순차적으로 발현되도록, 각 유전자에 대해 적절한 프로모터를 사용해, 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 상기한 임의 단계 전 또는 단계 이후에 세포를 전사 인자 Sox9과 접촉시키는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 시점과 제2 시점은 동일하며, 따라서 제1 시점에 세포 집단을 하나 이상이 PDX-1을 포함하는 pTF 2종과 접촉시킨 다음, 수득된 세포 집단을 제2 시점에 MafA인 제3의 pTF와 접촉시킨다.
화합물 (즉, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9 폴리펩타이드 또는 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산)에 노출된, 즉 이와 접촉되는 세포 집단은 임의 개수의 세포, 즉 하나 이상의 세포일 수 있으며, 시험관내, 생체내 또는 생체외로 제공될 수 있다. 전사 인자와 접촉되는 세포 집단은, 전사 인자와의 접촉 전, 시험관내에서 증폭될 수 있다. 생산된 세포 집단은 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 발휘한다. 이들 세포는, 전환분화 및 β-세포 계통을 따른 성숙화 수행 전, 그리고 필요한 환자 또는 개체에 투여 또는 전달하기 위해, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 시험관내에서 증폭될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 시점은 제1 시점 후 적어도 24시간이다. 다른 구현예에서, 제2 시점은 제1 시점 후 24시간 미만이다. 다른 구현예에서, 제2 시점은 제1 시점 후 약 1시간, 제2 시점 후 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 또는 약 12시간이다. 일부 구현예에서, 제2 시점은 제1 시점 후 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간 및 적어도 1주일 이상일 수 있다.
다른 구현예에서, 제3 시점은 제2 시점 후 적어도 24시간이다. 다른 구현예에서, 제3 시점은 제2 시점 후 24시간 미만이다. 다른 구현예에서, 제3 시점은 제2 시점와 동일하다. 다른 구현예에서, 제3 시점은 제2 시점 후 약 1시간, 제2 시점 후 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간이다. 다른 구현예들에서, 제3 시점은 제2 시점 후 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간 및 적어도 1주일 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 시점, 제2 시점 및 제3 시점은 동시적이며, 따라서, 하나 이상의 pTF가 PDX-1을 포함하고 하나 이상의 pTF가 NeuroD1 또는 Pax4를 포함하고 하나 이상의 pTF가 MafA를 포함하는, 3가지 pTF를, 세포 집단과 단일 시점 (single timepoint)에 접촉시킨다. 다른 구현예에서, 제1 시점, 제2 시점 및 제3 시점은 동시적이며, 따라서, 하나의 pTF가 PDX-1으로 이루어지고 하나의 pTF가 NeuroD1 또는 Pax4로 이루어지고 하나의 pTF가 MafA로 이루어진, 3가지 pTF를, 세포 집단과 단일 시점에 접촉시킨다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "시점"이 특정 시점 또는 특정 순간 (specific instant)을 포함함을 알 것이다. 일부 구현예에서, 시점은 짧은 시간 경과를 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 24시간 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 12시간 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 6시간 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 3시간 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 1시간 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 30분 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 10분 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 5분 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 1분 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 시점은 10초 미만을 포함한다.
일부 구현예에서, 전사 인자는 폴리펩타이드, 또는 전사 인자 폴리펩타이드를 코딩하는 리보핵산 또는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 전사 인자는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 전사 인자는 전사 인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 전사 인자는 전사 인자를 코딩하는 데옥시리보뉴클레익산 서열 (DNA)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, DNA는 cDNA를 포함한다. 다른 구현예에서, 전사 인자는 전사 인자를 코딩하는 리보뉴클레익산 서열 (RNA)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RNA는 mRNA를 포함한다.
본원에 제시된 개시 내용에 사용하기 위한 전사 인자는 폴리펩타이드, 리보핵산 또는 핵산일 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "핵산"이 DNA 분자 (예, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예, mRNA, microRNA 또는 기타 RNA 유도체), 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 제조된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이들의 유도체, 단편 및 상동체를 포괄할 수 있음을 알 것이다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다. 다른 구현예에서, 핵산은 mRNA이다. PDX-1의 일시적인 발현이 췌장 베타 세포를 생산하는데 충분하므로, mRNA가 본원에 기술된 방법에 특히 유용하다. 폴리펩타이드, 리보핵산 또는 핵산은, 비-제한적인 예로, 바이러스 벡터의 감염, 전기천공 및 리포펙션 등의 당해 기술 분야에 공지된 수단에 의해 세포에 전달될 수도 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드, 리보핵산 또는 핵산은 바이러스 벡터에 의해 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 리보핵산 또는 핵산은 발현 벡터 또는 바이러스 벡터에 통합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 제1 세대 아데노바이러스 (FGAD) 벡터이다. 다른 구현예에서, FGAD는 세포 게놈에 통합되기 불안정하다. 다른 구현예에서, FGAD는 E1-결손된 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 다른 구현예에서, FGAD는 코딩된 폴리펩타이드의 일시적인 발현을 제공한다.
바이러스 벡터의 발현은 형질감염, 전기천공, 감염 또는 형질도입 중 어느 방식에 의해 세포에 도입될 수 있다. 다른 구현예들에서, 핵산은 mRNA이고, 이는 예를 들어 전기천공에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 전기천공 방법은 유동 전기천공 (flow electroporation) 기법을 포함한다. 예를 들어, 다른 구현예에서, 전기천공의 방법은 MaxCyte 전기천공 시스템 (MaxCyte Inc. Georgia USA)의 사용을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 전사 인자는 PDX-1, Pax-4, NeuroD1 및 MafA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예들에서, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 전사 인자는 PDX-1, Pax-4, NeuroD1, MafA, Ngn3 및 Sox9으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
호메오도메인 단백질 PDX-1 (췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자-1)은 또한 IDX-1, IPF-1, STF-1 또는 IUF-1으로도 알려져 있으며, 췌장 섬 발생 및 기능 조절에 중요한 역할을 수행한다. PDX-1은, 예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 소마스타틴, 프로인슐린 컨버타제 1/3 (PC 1/3), GLUT-2 및 글루코키나제와 같은 다양한 유전자들의 섬-세포 특이적인 발현에 직접 또는 간접적으로 참여한다. 아울러, PDX-1은 글루코스에 반응하여 인슐린 유전자 전사를 매개한다. PDX-1을 코딩하는 핵산에 대한 적절한 소스로는, 예를 들어, GenBank 등재 번호 U35632 및 AAA88820로 각각 이용가능한 인간 PDX-1 핵산 (및 코딩된 단백질 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, PDX-1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타낸다:
Figure pct00001
일부 구현예에서, PDX-1 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 서열번호 2에 나타낸다:
Figure pct00002
PDX-1 서열에 대한 다른 소스로는 GenBank 등재 번호 U35632 및 AAA18355로 각각 나타낸 랫 PDX 핵산 및 단백질 서열 등이 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 부가적인 소스로는 GenBank 등재 번호 AF036325 및 AAC41260에 각각 나타낸 제브라피쉬 PDX-1 핵산 및 단백질 서열 등이 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
Pax-4는, 또한 페이어드 박스 (paired box) 4, 페이어드 박스 단백질 4, 페이어드 박스 유전자 4, MODY9 및 KPD로도 알려져 있으며, 이는 글루카곤, 인슐린 및 소마스타틴 프로모터 내 인자들에 결합하는 췌장-특이적인 전사 인자이며, 이는 췌장 섬 베타 세포의 분화 및 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 일부 세포 경우에, Pax-4는 억제제 (repressor) 활성을 발휘한다. Pax-4를 코딩하는 핵산에 대한 적절한 소스로는, 예를 들어, GenBank 등재 번호 NM_006193.2 및 AAD02289.1으로 각각 이용가능한, 인간 Pax-4 핵산 (및 코딩된 단백질 서열) 등이 있다.
MafA는, V-maf 근건막성 섬유육종 온코진 상동체 A 또는 RIPE3B1이라고도 하며, 베타-세포 특이적이며, 인슐린 유전자 발현에서 글루코스-조절된 전사 활성인자이다. MafA는 β-세포의 기능 및 발생에 참여할 뿐만 아니라 당뇨병의 발병에도 관여할 수 있다. MafA를 코딩하는 핵산에 대한 적절한 소스로는, 예를 들어 각각 GenBank 등재 번호 NM_201589.3 및 P_963883.2로서 이용가능한 인간 MafA 핵산 (및 코딩 단백질 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, MafA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타낸다:
Figure pct00003
다른 구현예에서, MafA 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 서열번호 4로 표시된다:
Figure pct00004
Neurog3는, 뉴로게닌 3 또는 Ngn3라고도 하며, 췌장 및 장에서 내분비 발생에 필수적인 베이직 나선-루프-나선 (bHLH)형 전사 인자이다. Neurog3를 코딩하는 핵산에 대한 적절한 소스로는, 예를 들어 각각 등재 번호 NM_020999.3 및 NP_066279.2로서 이용가능한 인간 Neurog3 핵산 (및 코딩 단백질 서열) 등이 있다.
NeuroD1은, 뉴로 분화 (Neuro Differentiation) 1 또는 NeuroD 및 beta-2 (β2)라고도 하며, 이는 Neuro D-타입 전사 인자 (Neuro D-type transcription factor)이다. 이것은, 다른 bHLH 단백질과 헤테로다이머를 형성하는 베이직 나선-루프-나선형 전사 인자이며, E-박스로 알려진 특정 DNA 서열을 포함하는 유전자의 전사를 활성화한다. 이것은 인슐린 유전자의 발현을 조절하며, 이 유전자에 돌연변이가 발생하면 2형 진성 당뇨병이 발병한다. NeuroD1을 코딩하는 핵산에 대한 적절한 소스로는, 예를 들어, 각각 GenBank 등재 번호 NM_002500.4 및 NP_002491.2로서 이용가능한 인간 NeuroD 1 핵산 (및 코딩된 단백질 서열) 등이 있다.
일부 구현예에서, NeuroD1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시된다:
Figure pct00005
다른 구현예에서, NeuroD1 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 서열번호 6으로 표시된다:
Figure pct00006
Sox9은 배아 발생에 관여하는 전사 인자이다. Sox9은 특히 뼈와 골격 발생에서의 중요성이 조사된 바 있다. SOX-9은 HMG-박스 클래스 DNA-결합 단백질에 속하는 다른 구성원과 더불어 서열 CCTTGAG를 인지한다. 본원에 제시된 개시 내용에서, Sox9의 사용은 전환분화의 유도 전 또는 유도 후, 췌장 전구 세포 매스 (progenitor cell mass)를 유지하는데 관여할 수 있다. Sox9을 코딩하는 핵산에 대한 적절한 소스로는, 예를 들어 각각 GenBank 등재 번호 NM_000346.3 및 NP_000337.1으로서 이용가능한 인간 Sox9 핵산 (및 코딩된 단백질 서열) 등이 있다.
상동성은, 일부 구현예에서, 서열 정렬을 위한 컴퓨터 알고리즘에 의해, 당해 기술 분야에 널리 기술된 방법에 의해 결정한다. 예를 들어, 핵산 서열 상동성에 대한 컴퓨터 알고리즘 분석은, 예를 들어, BLAST, DOMAIN, BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT 및 TREMBL 패키지 등의 이용가능한 수종의 소프트웨어 패키지를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, "상동성"은 서열번호 1-6으로부터 선택되는 서열에 대해 60% 보다 높은 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"은 서열번호 1-6으로부터 선택되는 서열에 대해 70% 보다 높은 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, 상동성은 75% 보다, 78% 보다, 80% 보다, 82% 보다, 83% 보다, 85% 보다, 87% 보다, 88% 보다, 90% 보다, 92% 보다, 93% 보다, 95% 보다, 96% 보다, 97% 보다, 98% 보다 또는 99% 보다 높다. 다른 구현예에서, 동일성은 100%이다. 각각의 가능성은 본원에 제시된 개시 내용의 개별 구현예를 나타낸다.
다른 구현예에서, 상동성은 후보 서열의 혼성화 측정을 통해 결정되며, 이의 방법은 당해 기술 분야에 잘 설명되어 있다 (예, "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. L, Eds. (1985); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). 예를 들어, 혼성화 방법은, 보통 내지 엄격 조건에서 천연의 카스파제 펩타이드를 코딩하는 DNA의 상보체에 대해 수행할 수 있다. 혼성화 조건은, 예를 들어, 변성 및 전단된 (denatured, sheared) 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에서, 밤새 42℃에서 인큐베이션하는 것이다.
본원에 열거된 임의 아미노산 서열에 대한 단백질 및/또는 펩타이드 상동성은, 일부 구현예에서, 면역블롯 분석 등의 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 또는 아미노산 서열의 컴퓨터 알고리즘 분석을 통해, 이용가능한 복수의 소프트웨어 패키지들 중 어느 하나를 이용하여, 확립된 방법을 통해, 결정한다. 이들 패키지들 중 일부로는 FASTA, BLAST, MPsrch 또는 Scanps 패키지 등이 있을 수 있으며, 예를 들어, 스미스 및 워터맨 알고리즘 및/또는 글로벌/로컬 또는 BLOCKS 정렬이 분석에 사용될 수 있다. 상동성을 결정하는 각각의 방법은 본원에 제시된 개시 내용의 개별 구현예가 된다.
본원에 기술된 다른 구현예는 벡터에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용되는 벡터는 발현 벡터를 포함한다. 다른 구현예에서, 발현 벡터는 PDX-1, Pax-4, NeuroD1 또는 MafA 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 기타 췌장 전사 인자, 예로 Ngn3, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체, 상동체 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 다음과 같은 전사 인자 중 어느 하나를 코딩하는 단일 핵산을 포함한다: PDX-1, Pax-4, NeuroD1, Ngn3, MafA 또는 Sox-9, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 다음과 같은 전사 인자들의 임의 조합을 코딩하는 2가지 핵산을 포함한다: PDX-1, Pax-4, NeuroD1, Ngn3, MafA 또는 Sox-9, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편. 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 PDX-1 및 NeuroD1을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 PDX-1 및 Pax4를 코딩하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 발현 벡터는 MafA를 코딩하는 핵산을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "벡터"가 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포괄함을 알 것이다. 벡터의 한가지 타입은 "플라스미드"로서, 이는 부가적인 DNA 세그먼트가 연결될 수 있는 선형 또는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 망라한다. 벡터의 다른 타입은 부가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 연결될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제를 수행할 수 있다 (예, 박테리아 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 포유류 에피좀 벡터). 기타 벡터 (예, 비-에피좀 형태의 포유류 벡터)는 숙주 세포로 도입되면 숙주 세포의 게놈으로 삽입되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 아울러, 일부 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자들의 발현을 이끌 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 "발현 벡터"라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드 형태이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "플라스미드"와 "벡터"가 특성 및 의미 상 모두 동일하여, 상호 호환적으로 사용될 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 용어 "플라스미드"는 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이다. 그러나, 본원에 제시된 개시 내용은, 동일한 기능을 제공하는, 바이러스 벡터 (예, 복제 결함성 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-부속 바이러스)와 같은, 다른 형태의 발현 벡터를 포괄하는 것으로 의도된다. 또한, 일부 바이러스 벡터는 특이적으로 또는 비-특이적으로 특정 세포 타입을 타겟팅할 수 있다.
본원에 개시된 재조합 발현 벡터는, 숙주 세포에서 핵산을 발현시키기에 적합한 형태로, 본원에 개시된 핵산을 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용될 숙주 세포를 토대로 선택되는, 즉, 발현할 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는, 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터에서, 당해 기술 분야의 당업자라면, "작동가능하게 연결된"은 대상 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 (예, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포로 도입된 숙주 세포에서) 조절 서열(들)에 연결되는 것을 망라함을, 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "조절 서열"이 프로모터, 인핸서 및 그외 발현 조절 인자 (예, 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있음을, 알 것이다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기술되어 있다. 조절 서열은 다수 타입의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열을 구성적으로 발현하게 하는 조절 서열과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열이 발현되게 하는 조절 서열 (예, 조직-특이적인 조절 서열)을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 발현 벡터의 설계는 형질전환할 숙주 세포, 원하는 단백질의 발현 수준 등의 선택으로서 이러한 인자에 따라 결정될 수 있음을 알 것이다. 본원에 기술된 벡터는 숙주 세포에 도입되어, 본원에 기술된 핵산에 의해 코딩된, 융합 단백질 또는 펩타이드 등의, 단백질 또는 펩타이드 (예, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 단백질, 또는 이들의 돌연변이 형태 또는 융합 단백질 등)를 생산할 수 있다.
예를 들어, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사 인자를 코딩하는 핵산 하나를 포함한다. 전사 인자들을 코딩하는 2개의 핵산을 포함하는 발현 벡터에서, 각각의 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 각 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터들은 서로 상이하거나 또는 동일할 수 있다. 다른 예로, 2개의 핵산은 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에 기술된 발현 벡터에 사용가능한 프로모터는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 프로모터일 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 핵산을 발현시킬 숙주 세포, 바람직한 단백질 발현 수준 또는 발현 시기 등에 적합한 프로모터를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 프로모터는 구성적인 프로모터, 유도성 프로모터 또는 세포-타입 특이적인 프로모터일 수 있다.
본원에 기술된 재조합 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 PDX-1을 발현하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9은 E. coli 등의 박테리아 세포, 곤충 세포 (베큘로바이러스 발현 벡터를 이용함), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주 세포들은 Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 추가적으로 기술되어 있다. 다른 예로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용해, 시험관내에서 전사 및 번역할 수 있다.
다른 구현예에서, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지애 발현용 벡터의 예로는 pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBO J 6:229-234), pMFa (Kujan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) 및 picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.) 등이 있다.
다른 예로, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9은 베큘로바이러스 발현 벡터를 사용해 곤충 세포에서 발현시킬 수 있다. 배양한 곤충 세포 (예, SF9 세포)에서 단백질 발현을 위해 이용가능한 베큘로바이러스 벡터로는 pAc 시리즈 (Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39) 등이 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 핵산은 포유류 발현 벡터를 사용해 포유류에서 발현된다. 포유류 발현 벡터의 예로는 pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187-195) 등이 있다. 포유류 세포를 이용하는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 대개 바이러스 조절 인자들에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마 바이러스 (polyoma), 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 유인원 바이러스 40으로부터 유래된다. 진핵생물 및 원핵생물 세포 둘다에 적합한 기타 발현 시스템에 대해서는, 예를 들어, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989의 제16장과 제17항을 참조한다.
다른 구현예에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 타입에서 선호적으로 핵산의 발현을 지시할 수 있다 (예, 조직-특이적인 조절 인자들을 사용해 핵산을 발현함). 조직-특이적인 조절 인자들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적인 프로모터에 대한 비-제한적인 예로는 알부민 프로모터 (간-특이적임; Pinkert et al. (1987) Genes Dev 1 :268-277), 림프구-특이적인 프로모터 (Calame and Eaton (1988) Adv Immunol 43 :235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J 8:729-733) 및 면역글로불린 (Banerji et al. (1983) Cell 33 :729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748), 뉴런-특이적인 프로모터 (예, 미세신경섬유 프로모터; Byrne 및 Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), 췌장-특이적인 프로모터 (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) 및 유선-특이적인 프로모터 (예, 유청 (milk whey) 프로모터; 미국 특허 4,873,316 및 유럽 출원 공개번호 264,166) 등이 있다. 발생에 따라 조절되는 프로모터, 예컨대, 뮤라인 hox 프로모터 (Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) 및 alpha-페토프로테인 프로모터 (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3:537-546) 등도 있다.
본원에 기술된 다른 구현예는 본원에 기술된 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 특정 대상 세포뿐 아니라 이러한 세포의 후대 또는 잠재적인 후대를 지칭하는 것으로 이해된다. 일부 변형이 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 연속 세대들에 생길 수 있으므로, 이러한 후대는 실제 모 세포와 동일하진 않을 수 있지만, 여전히 본원에서는 이러한 용어의 범위에 포함된다. 본원에서, 아울러, 숙주 세포는 일단 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 또는 이들의 조합의 발현시 조정될 수 있으며, 오리지날 특징들을 유지하거나 또는 느슨해질 수도 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환, 형질도입, 감염 또는 형질감염 기법들을 통해 세포에 도입될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "형질전환", "형질도입", "감염" 및 "형질감염"이, 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공 등의, 외래 핵산 (예, DNA)를 숙주 세포로 도입하는 다양한 당해 기술 분야에서 인정되는 기법을 망라할 수 있음을, 알 것이다. 아울러, 형질감염은 형질감염제 (transfection agent)에 의해 매개될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "형질감염제"가 숙주 세포에 DNA의 통합을 매개하는 임의의 화합물, 예를 들어, 리포좀을 포함할 수 있음을, 알 것이다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염하는 적절한 방법들은 Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 및 기타 실험 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
형질감염은 "안정적" (즉, 외래 DNA가 숙주 게놈에 삽입됨)이거나 또는 "일시적" (즉, DNA가 숙주 세포에서 에피좀으로 발현되거나, 또는 mRNA가 세포에 전기천공으로 도입됨)일 수 있다.
포유류 세포를 안정적으로 형질감염하는 경우, 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라, 세포들 중 일부 적은 비율만 외래 DNA를 자신의 게놈으로 삽입시킬 수 있으며 나머지 DNA는 에피좀으로 남을 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 이러한 삽입체 (integrant)를 식별 및 선별하기 위해, 선별성 마커 (selectable marker) (예, 항생제 내성)를 코딩하는 유전자를 통상적으로 대상 유전자와 함께 숙주 세포에 도입한다. 다양한 선별성 마커로는 G418, 히그로마이신 및 메토트렉세이트 등의 약물에 내성을 부여하는 것 등이 있다. 선별성 마커를 코딩하는 핵산은 PDX-1를 코딩하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포로 도입되거나, 또는 별개의 벡터 상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별 (예, 선별성 마커 유전자가 삽입된 세포는 생존하고, 그외 세포는 사멸함)에 의해 동정할 수 있다. 다른 구현예에서, PDX-1에 의해 조정된 세포 또는 형질감염된 세포는 내인성 리포터 유전자의 발현을 유도함으로써 동정한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 그린 형광 단백질 (GFP)의 발현을 구동하는 인슐린 프로모터이다.
일 구현예에서, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 핵산은 바이러스 벡터에 존재한다. 일부 구현예에서, PDX-1 및 NeuroD1 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 존재한다. 다른 구현예에서, PDX-1 및 Pax-4 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 존재한다. 다른 구현예에서, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 핵산은 바이러스 안에 캡슐화된다. 다른 구현예에서, PDX-1 및 NeuroD1은 바이러스 안에 캡슐화된다 (즉, PDX-1 및 NeuroD1을 코딩하는 핵산들이 동일한 바이러스 입자 안에 캡슐화됨). 다른 구현예들에서, PDX-1 및 Pax-4는 바이러스 안에 캡슐화된다 (즉, PDX-1 및 Pax4를 코딩하는 핵산들이 동일한 바이러스 입자 안에 캡슐화됨). 일부 구현예에서, 바이러스는 다양한 조직 타입의 만능성 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포를 감염시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스는 간 친화성 (hepatotropic)이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용어 "간 친화성"은, 바이러스가 간의 세포를 특이적으로 또는 비-특이적으로 표적하는 능력을 가지는 의미임을 알 것이다. 추가적인 구현예들에서, 바이러스는 조정된 (modulated) 간염 바이러스, SV-40 또는 엡스타인-바 바이러스이다. 또 다른 구현예에서, 바이러스는 아데노바이러스이다.
일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 단일 세포로 해리 (dissociation)된다. 일부 구현예에서, 해리는 단백질분해 활성 및/또는 콜라겐분해 활성을 가진 임의의 효소 또는 효소들의 조합에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 해리는 트립신, 콜라게나제, 히알루로니다제, 파파인, 프로테아제 타입 XIV, 프로나제 및/또는 프로테이나제 K에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 해리는 Accutase®를 사용해 달성된다. 일부 구현예에서, 해리된 세포들은 부착 조건에서 추가적으로 접종된다.
도 2는 인간 인슐린 생산 세포의 제조 공정의 일 구현예를 나타낸 것으로, 출발 물질은 간 조직을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 비-췌장성 베타-세포 조직의 임의 소스를 이러한 제조 공정에 사용할 수 있음을, 알 것이다.
도 2에 제시된 여러 단계들에 대한 구현예들이 본원 전체에 상세히 기술되어 있으며, 이는 여기서 고려되어야 하지만 반복하진 않을 것이다. 또한, 이러한 여러 단계들을 예시하는 실시예 1-2를 참조한다. 간략하게는, 제조 공정은 아래 제시된 단계들을 기반으로 이해할 수 있다.
옵션 단계 1: 간 조직 수득 단계. 일부 구현예에서, 조직 또는 장기로부터 일차 세포를 수득한다. 일부 구현예에서, 간 조직은 인간 간 조직이다. 다른 구현예에서, 간 조직은 생검의 일부로서 수득된다. 다른 구현예에서, 간 조직은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 외과적 시술을 이용해 수득된다. 다른 구현예에서, 간 조직 수득은 숙련된 의료 실무자에 의해 달성된다. 다른 구현예에서, 수득된 간 조직은 건강한 개체로부터 유래된 간 조직이다. 관련 구현예에서, 건강한 개체는 글루코스-조절된 방식으로 가공 처리된 인슐린을 제공하는 세포성 테라피가 필요한 환자, 예를 들어 I형 진성 당뇨병 환자 또는 췌장염을 앓고 있는 환자에 대해 동종이계 공여체이다. 다른 구현예에서, 공여체 스크리닝 및 공여체 검사를 수행하여, 공여체로부터 수득된 조직이, AIP 세포의 제조로부터 유래되는, 감염성 또는 악성 질환에 대한 임상적인 또는 신체적인 증거 또는 위험 인자를 나타내지 않음을, 확인한다. 또 다른 구현예에서, 간 조직은 글루코스-조절된 방식으로 가공 처리된 인슐린을 제공하는 세포성 테라피가 필요한 환자, 예를 들어 I형 진성 당뇨병 환자 또는 췌장염을 앓고 있는 환자로부터 수득된다. 또 다른 구현예에서, 간 조직은 글루코스-조절된 방식으로 가공 처리된 인슐린을 제공하는 세포성 테라피가 필요한 환자, 예를 들어 I형 진성 당뇨병 환자 또는 췌장염을 앓고 있는 환자의 자가 조직이다.
단계 2: 일차 간 세포의 회수 및 가공 처리. 간 조직은 추가적인 가공 처리에 사용할 부착 세포를 회수하기 위해 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법으로 가공 처리한다. 일부 구현예에서, 간 조직을 약 1-2 mm의 작은 조각으로 절단하고, 멸균 완충제 용액 중에서 파이펫을 사용해 부드럽게 상하로 파이펫팅한다. 그런 후, 샘플을 콜라게나제와 함께 인큐베이션하여, 조직을 분해할 수 있다. 일련의 세척 단계를 수행한 후, 다른 구현예에서, 일차 간 세포를 전처리된 파이브로넥티-코팅된 조직 배양 조직 디쉬 상에 접종할 수 있다. 그런 후, 당해 기술 분야의 당업자라면, 널리 공지된 간 세포 증식 기법에 따라 세포를 처리 (계대 배양)할 것이다. 간략하게는, 세포를 증식 배지에서 배양할 수 있으며, 여러번의 접종 및 회수를 통해 세포 수를 증가시킬 수 있다. 세포가 80% 컨플루언스에 도달하면 분할하여, 다시 접종할 수 있다. 다른 구현예에서, 세척 단계 후, 일차 간 세포를 비-부착 조건 하에 접종한다. 일 구현예에서, 세척 단계 후, 일차 간 세포를 스캐폴드에 부착시킨다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 프로토콜의 증폭기 (단계 3)를 시작하기 전, 예를 들어, 2주의 기간에, 충분한 세포들이 필요함을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 2주의 기간이 세포를 증폭시키기 위한 출발점의 일 예이며, 세포는 이 기간 전 또는 이후에 증폭에 이용할 준비가 될 수 있음을, 알 것이다. 일부 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리시, 세포의 2회 계대 배양 후, 세포는 적어도 1 x 105주로 수득된다. 다른 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리시, 세포의 2회 계대 배양 후, 세포는 적어도 1 x 106주로 수득된다. 다른 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리시, 세포의 2회 계대 배양 후, 세포는 적어도 2 x 106주로 수득된다. 다른 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리시, 세포의 2회 계대 배양 후, 세포는 적어도 5 x 106주로 수득된다. 다른 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리시, 세포의 2회 계대 배양 후, 세포는 적어도 1 x 107주로 수득된다. 다른 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리시, 세포의 2회 계대 배양 후, 세포는 1 x 105 내지 1 x 106주로 수득된다. 다른 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리시, 세포의 2회 계대 배양 후, 세포는 1 x 106 내지 1 x 107주로 수득된다. 다른 구현예에서, 일차 세포의 회수 및 가공 처리로, 단계 3, 세포의 대규모 증폭에서 적절한 접종 밀도를 위해, 2번의 계대 배양 후 충분한 세포 수득을 보장하도록 충분한 출발 조직을 사용한다.
다른 구현예에서, 초기 계대 배양 일차 세포 (early passage primary cell)는 향후 사용을 위해 냉동 보존된다. 일부 구현예에서, 1차 계대 배양 일차 세포는 향후 사용을 위해 냉동 보존된다. 또 다른 구현예에서, 2차 계대 배양 일차 세포는 향후 사용을 위해 냉동 보존된다.
단계 3: 일차 간 세포의 증식/배양. 단계 3은 제조 공정의 대규모 증폭기 (expansion phase)이다. 일부 구현예에서, 세포를 스캐폴드에서 증식/배양한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 프로토콜의 전환분화기 (단계 4)에 착수하기 전, 5주의 기간 동안 충분한 세포가 필요함을 알 것이며, 지정된 수의 세포가 환자를 치료하기 위해 필요함을 예상할 수 있다. 일부 구현예에서, 전환분화 전에 필요한 세포의 지정된 개수는 일차 세포 약 1 x 108개를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 전에 필요한 세포의 지정된 개수는 일차 세포 약 2 x 108개를 포함한다. 일부 구현예에서, 전환분화 전에 필요한 세포의 지정된 개수는 일차 세포 약 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109 또는 1 x 1010개를 포함한다.
일부 구현예에서, 스캐폴드 상에 세포를 접종한다. 일부 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 1 x 103 내지 1O x 1O3 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 1 x 103 - 8 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 1 x 1O3 - 5 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 5 x 103 - 10x10s 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 1O x 1O3 - 20 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 20 x 103 - 30 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 30 x 103 - 40 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 40 x 103 - 50 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 50 x 103 - 1OO x 1O3 세포/cm2를 포함한다.
다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 1 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 2 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 3 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 4 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 5 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 6 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 7 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 8 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 9 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 10 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 20 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 40 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에서 세포 접종 밀도는 약 60 x 103 세포/cm2를 포함한다.
다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성 범위는 60-100%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성 범위는 생존성 약 70-99%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 60%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 65%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 70%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 75%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 80%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 85%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 90%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 95%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 99%를 포함한다. 다른 구현예에서, 증폭기에 세포 접종물의 생존성은 생존성 약 99.9%를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면 출발 조직 물질에 대한 편차 (variability)를 인지할 것이다. 따라서, 다른 구현예에서, 증폭기는 2주 내지 6주 동안 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 증폭기는 2주 내지 7주 동안 이루어진다. 다른 구현예에서, 증폭기는 2주 내지 4주 동안 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 증폭기는 일차 세포가 필요한 개수로 증식되었을 때까지 수행한다.
일부 구현예에서, 생물반응조를 사용해, 전환분화 단계 전 일차 세포를 증폭 및 배양한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드에 부착된 3D 클러스터로 응집된 세포를 생물반응조에서 배양한다. 생물반응조를 사용해 세포를 배양할 수 있으며, 이러한 조건은 높은 세포 농도에 적합하다. 다른 구현예에서, 생물반응조는 세포를 증폭시키기 위한 밀폐된 시스템을 제공한다. 다른 구현예에서, 세포 증폭을 위해 복수의 생물반응조를 시리즈로 사용된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용되는 생물반응조는 1회용 생물반응조이다. 다른 구현예에서, 사용되는 생물반응조는 다회용 생물반응조이다. 또 다른 구현예에서, 생물반응조는 공정의 파라미터를 모니터링하고 제어하기 위한 제어 유닛을 포함한다. 다른 구현예에서, 모니터링 및 제어하는 파라미터는 용존 산소 (Dissolve Oxygen, DO), pH, 기체 및 온도를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 간 세포는 비-부착 조건 하에 배양한다. 일부 구현예에서, 일차 간 세포는 스캐폴드에 부착된다. 일부 구현예에서, 일차 간 세포는 스캐폴드 상에서 배양한다.
단계 4: 일차 간 세포의 전환분화 (TD). 일부 구현예에서, 전환분화는 본원에 기술된 임의의 전환분화 방법을 포함한다. 예를 들어, 전환분화는, 본원에 기술된 바와 같이, "계층적 (hierarchy)" (1+1+1) 프로토콜 또는 "2+1"을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "계층적" 또는 1+1+1 프로토콜은, 3종의 pTF를 순차적인 방식으로, 췌장 베타 세포 분화시 발현 순서에 따라 투여하는, 프로토콜을 의미한다. 일부 구현예에서, 3종의 pTF는 PDX-1, NeuroD1 및 MafA이다. 일부 구현예에서, "2+1" 프로토콜은 제1 시점에 2종의 pTF를 투여하고, 이후의 제2 시점에 제3 pTF를 투여하는, 전환분화 프로토콜을 의미한다.
일부 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 췌장 표현형과 기능을 가진 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 성숙한 베타-세포 췌장 표현형과 기능을 가진 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 인슐린 함?이 증가된 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 글루코스-조절된 방식으로 가공 처리된 인슐린을 분비할 수 있는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 C-펩타이드 수준이 증가된 전환분화된 세포를 포함한다.
다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 하나 이상의 췌장 유전자 마커의 내인성 발현이 증가된 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 내인성 발현은 2종 이상의 췌장 유전자 마커에서 증가된다. 다른 구현예에서, 내인성 발현은 3종 이상의 췌장 유전자 마커에서 증가된다. 다른 구현예에서, 내인성 발현은 4종 이상의 췌장 유전자 마커에서 증가된다. 관련 구현예에서, 췌장 유전자 마커는 PDX-1, NeuroD1, MafA, Nkx6.1, 글루카곤, 소마스타틴 및 Pax4를 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 PDX-1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 102배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 PDX-1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 103배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 PDX-1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 104배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 PDX-1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 105배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 PDX-1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 106배 이상 높다.
다른 구현예에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 102배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 103배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 104배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비-전환분화된 세포 대비 105배 이상 높다.
다른 구현예에서, 내인성 MafA 발현은 비-전환분화된 세포 대비 102배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 MafA 발현은 비-전환분화된 세포 대비 103배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 MafA 발현은 비-전환분화된 세포 대비 104배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 MafA 발현은 비-전환분화된 세포 대비 105배 이상 높다.
다른 구현예에서, 내인성 글루카곤 발현은 비-전환분화된 세포 대비 10배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 글루카곤 발현은 비-전환분화된 세포 대비 102배 이상 높다. 다른 구현예에서, 내인성 글루카곤 발현은 비-전환분화된 세포 대비 103배 이상 높다.
다른 구현예에서, PDX-1, NeuroD1, MafA 또는 이들의 임의 조합의 내인성 발현은 비-전환분화된 세포 대비 각각 60% 이상 높다. 다른 구현예에서, PDX-1, NeuroD1, MafA 또는 이들의 임의 조합의 내인성 발현은 비-전환분화된 세포 대비 각각 70% 이상 높다. 다른 구현예에서, PDX-1, NeuroD1, MafA 또는 이들의 임의 조합의 내인성 발현은 비-전환분화된 세포 대비 각각 80% 이상 높다.
다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 생존성이 60% 이상인 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 생존성이 70% 이상인 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 생존성이 80% 이상인 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전환분화 후 수득되는 세포 집단은 생존성이 90% 이상인 전환분화된 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 구축된 성숙한 베타-세포 표현형을 나타내는 세포는 오리지날 세포의 유전자 발현 프로파일 또는 하나 이상의 유전자를 억제할 수 있다. 예를 들어, 성숙한 베타-세포 표현형을 발휘하도록 유도된 간 세포는 하나 이상의 간-특이적인 유전자를 억제할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 오리지날 세포 및 생산된 세포의 간-특이적인 유전자 발현을 쉽게 확인할 수 있으며, 즉, 유전자에 의해 코딩된 mRNA 또는 폴리펩타이드의 수준을 측정할 수 있다. 비교시, 간-특이적인 유전자 발현의 감소는 전환분화가 발생되었음을 의미할 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 전환분화된 세포는 간 표현형 마커의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민, alpha-1 항-트립신 또는 이들 조합의 발현 감소가 존재한다. 다른 구현예에서, 내인성 PDX-1을 발현하는 세포 집단들 중 5% 미만이 알부민 및 alpha-1 항-트립신을 발현한다. 다른 구현예에서, 내인성 PDX-1을 발현하는 세포 집단들 중 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이 알부민 및 alpha-1 항-트립신을 발현한다.
다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 적어도 6개월 동안 췌장 표현형과 기능을 유지한다. 다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 표현형과 기능을 적어도 12개월 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 표현형과 기능을 적어도 18개월 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 표현형과 기능을 적어도 24개월 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 표현형과 기능을 적어도 36개월 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 표현형과 기능을 적어도 48개월 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 표현형과 기능을 적어도 4년 동안 유지한다. 다른 구현예에서, 전환분화된 세포는 췌장 표현형과 기능을 적어도 5년 동안 유지한다.
일부 구현예에서, 전환분화 중에 세포 수는 유지된다. 다른 구현예에서, 전환분화 동안에 세포 수는 5% 미만으로 감소한다. 다른 구현예에서, 전환분화 동안에 세포 수는 10% 미만으로 감소한다. 다른 구현예에서, 전환분화 동안에 세포 수는 15% 미만으로 감소한다. 다른 구현예에서, 전환분화 동안에 세포 수는 20% 미만으로 감소한다. 다른 구현예에서, 전환분화 동안에 세포 수는 25% 미만으로 감소한다.
일부 구현예에서, 일차 간 세포는 비-부착 조건에서 전환분화된다. 일부 구현예에서, 일차 간 세포는 스캐폴드 상에 접종되며, 그 위에서 전환분화된다.
단계 5: 스캐폴드에서의 배양. 일부 구현예에서, 전환분화된 세포를 스캐폴드에 접종한다. 일부 구현예에서, 세포 접종 밀도는 1 x 103 - lO x 1O3 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 1 x 103 - 8 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 1 x 103 - 5 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 1 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 2 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 3 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 4 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 5 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 6 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 7 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 8 x 103를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 9 x 103 세포/cm2를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 접종 밀도는 10 x 103 세포/cm2를 포함한다.
일부 구현예에서, 접종된 세포는 배지와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포는 5 x 103 내지 10 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 10 x 103 내지 20 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 20 x 103 내지 30 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 30 x 103 내지 40 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 40 x 103 내지 50 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 50 x 103 내지 60 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 60 x 103 내지 70 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 70 x 103 내지 80 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 80 x 103 내지 90 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 90 x 103 내지 100 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 100 x 103 내지 200 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 200 x 103 내지 500 x 103 세포/ml의 밀도로 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 500 x 103 세포/ml 보다 높은 밀도로 접종된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 3D 세포 클러스터의 크기가 특히 세포 접종 및 세포 배양 조건에 의해 결정됨을, 알 것이다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터의 크기는 접종된 세포 수에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터의 크기는 웰 면적에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터의 크기는 웰 체적에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터의 크기는 웰 형태에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터의 크기는 세포/면적 농도에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터의 크기는 세포/체적 농도에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 지정된 (predetermined) 개수의 세포를 지정된 면적의 웰에 접종한다. 일부 구현예에서, 지정된 개수의 세포를 지정된 체적을 가진 웰에 접종한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 여러가지 체적의 웰에 세포를 여러 개수로 접종하고, 공지된 방법에 의해 평균 3D 세포 클러스터 크기를 측정하고, 원하는 크기가 달성되는 세포 수 및 웰 체적을 선택함으로써, 3D 세포 클러스터 크기를 최적화할 수 있음을, 알 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 지정된 크기를 가진 균일한 응집체를 Urdin et al. PLoS One (2008) 3(2): el565에 기술된 바와 같이 마이크로웰을 사용해 구축할 수 있음을, 알 것이다. 간략하게는, 세포를 여러가지 수집 체적 (numerous collecting volumes)으로 구성된 텍스처 표면 (textured surface)을 포함하는 웰 또는 플레이트 내, 또는 마이크로웰 내, 플레이트의 기저부에 접종한다. 마이크로웰은 공통 수집 포인트 (common collecting point)로 기울어진 경사진 수집 표면 (angled collecting surface)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 96웰 및 384웰 플레이트에 각각 100 ㎕ 또는 25 ㎕ 체적으로 상기와 같이 준비된 플레이트에 로딩한다. 그런 후, 플레이트를 5분간 200xg로 원심분리한 다음 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 1분간 50xg로 역상 원심분리 (inverted centrifugation)함으로써 웰의 내용물을 회수한다. 일부 구현예에서, 대구경 (large bore) "게놈" 파이펫 팁 (Molecular Bioproducts, cat# 3531)을 이용한 파이펫팅에 의해 웰 내용물을 회수한다. 형성된 응집물은 역상 필터 유닛으로 분배하여, 비-통합된 세포, 파편 또는 소형 세포 클러스터를 제거할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 바람직한 3D 세포 클러스터 크기는 세포의 접종 개수 및/또는 마이크로웰 체적과 같은 변수를 달리함으로써 확보할 수 있음을, 알 것이다. 일부 구현예에서, 특성 및 의미가 모두 동일한 용어 "마이크로웰", "웰", "수집 체적", "챔버" 및 "마이크로채널"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 마이크로웰은 20 ㎛3 보다 작은 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 약 20 ㎛3 내지 약 50 ㎛3 범위의 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 약 50 ㎛3 내지 약 100 ㎛3 범위의 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 약 100 ㎛3 내지 약 250 ㎛3 범위의 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 약 250 ㎛3 내지 약 500 ㎛3 범위의 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 약 500 ㎛3 내지 약 750 ㎛3 범위의 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 약 750 ㎛3 내지 약 1000 ㎛3 범위의 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 1000 ㎛3 보다 큰 체적을 가진다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 400 ㎛3의 체적을 가진다.
일부 구현예에서, 평균적으로 10개 미만의 세포를 각 마이크로웰에 접종한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 10-50개의 세포를 각 마이크로웰에 접종한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 50 내지 250개의 세포를 각 마이크로웰에 접종한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 250 내지 500개의 세포를 각 마이크로웰에 접종한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 500 내지 1000개의 세포를 각 마이크로웰에 접종한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 1000개 이상의 세포를 각 마이크로웰에 접종한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 약 150개의 세포를 각 마이크로웰에 접종한다.
일부 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 1 x 1O3 - 1 x 1O5 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 1 x 1O4 - 5 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 1 x 1O4 - 4 x 1O4 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 1 x 1O3 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 2 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 3 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 4 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 5 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 6 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 7 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 8 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 9 x 103 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 1 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 2 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 3 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 4 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 5 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 6 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 7 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 8 x 104 세포/cm2이다. 다른 구현예에서, 제조 공정 종료시 스캐폴드 상의 전환분화된 세포의 밀도는 약 9 x 104 세포/cm2이다.
다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성의 범위는 50-100%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성의 범위는 60-100%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성의 범위는 50-90%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성의 범위는 생존성 약 60-99%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성의 범위는 생존성 약 60-90%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 60%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 65%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 70%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 75%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 80%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 85%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 90%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 95%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 99%를 포함한다. 다른 구현예에서, 제조 공정의 종료시 세포 생존성은 생존성 약 99.9%를 포함한다.
다른 구현예에서, 인간 인슐린 생산 세포를 포함하는 전환분화된 일차 간 세포는 향후에 세포성 테라피에 사용하기 위해 보관된다. 다른 구현예에서, 보관은 세포의 냉동 보존을 포함한다.
일부 구현예에서, 회수된 3D 세포 클러스터를 단일 세포로 해리한다. 세포는 단백질분해 활성 또는 콜라겐분해 활성을 가진 임의 효소 또는 효소들의 조합을 이용해 해리할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 트립신을 사용해 해리한다. 일부 구현예에서, 세포는 Accuttase®를 사용해 해리한다. 일부 구현예에서, 해리된 세포는 부착 조건하에 접종한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 바람직한 특징을 가진 3D 세포 클러스터를 분리한다. 일부 구현예에서, 바람직한 특징은 3D 클러스터 크기, 3D 클러스터 체적, 3D 클러스터의 세포 수, 3D 클러스터의 세포 표면 마커를 포함하는 군으로부터 선택된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이들 바람직한 특징들에 따라 3D 클러스터를 분리하는 방법들이 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있음을, 알 것이다.
일부 구현예에서, 세포 클러스터를 이의 크기에 따라 분리한다. 일부 구현예에서, 크기에 의한 분리는 여과 단계를 포함한다. 여과에 의한 분리는 지정된 크기의 포어가 존재하는 필터 상에 세포 클러스터를 로딩하는 것을 포함하며, 이때 포어 보다 더 작은 클러스터는 포어를 통과하지만 포어 보다 큰 클러스터는 남게된다. 일부 구현예에서, 크기에 의한 분리는 원심분리 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 크기에 의한 분리는 침강 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 5 ㎛ 내지 10 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 10 ㎛ 내지 25 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 25 ㎛ 내지 50 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 50 ㎛ 내지 75 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 75 ㎛ 내지 100 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 100 ㎛ 내지 250 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 250 ㎛ 내지 500 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 500 ㎛ 내지 750 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 750 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 1000 ㎛ 보다 큰 포어를 가진 필터를 사용해 분리한다.
단계 6: 정성 분석/정성 관리. 세포성 테라피에서 전환분화된 세포를 임의 사용하기 전에, 전환분화된 세포에 대해 정성 분석/정성 관리 평가를 실시하여야 한다. FACS 분석 및/또는 RT-PCR을 사용해, 막 마커와 유전자 발현을 정확하게 측정할 수 있다. 나아가, 인슐린 분비를 분석하는 방법들이 ELISA, MSD, ELISpot, HPLC, RP-HPLC를 포함하여 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 인슐린 분비 검사는 글루코스 저 농도 (약 2 mM)에서 글루코스 고 농도 (약 17.5 mM)와 비교해 수행된다.
췌장 장애의 치료 방법
본원은, 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 가진 전환분화된 세포를 포함하며 적어도 세포들 중 일부가 스캐폴드에 부착된 3차원 (3D) 세포 클러스터를 제공하는 것을 포함하는, 췌장 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 췌장 질환 또는 장애의 치료는 질환 또는 장애를 예방하거나, 발병을 지연하거나 또는 증상을 완화하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 진피내 투여된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 복막내 투여된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 외과적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 좌측 신장낭 (kidney capsule) 아래에 이식된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 간문맥 정맥에 이식된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 복막강에 이식된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 망 착공 (omental punch)에 이식된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 피하 공간에 이식된다. 일부 구현예에서, 3D 세포 클러스터는 여러가지 경로들의 임의 조합으로 투여된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 이식하기 위한 대안적인 부위가, 낮은 산소 장력 및 생착을 손상시켜 임플란트에 상당한 손실을 유도할 수 있는 잠재적인 염증 반응으로 인해 제한적인 간 문맥 정맥에 비해, 유리하게 만들 수 있는 몇가지 특징들을 가지고 있음을, 알 것이다. 표 1은 스캐폴드에 부착된 전환분화된 세포를 포함하는 3D 세포 클러스터를 이식하기 위한 부위로서 복막강, 망 착공 및 피하 공간의 주요 장점과 단점 몇가지를 기술한다.
표 1: 여러가지 이식 부위들의 비교
섬 이식 부위 장점 단점
복막강 최소 침습성의 복강경 시술
큰 섬 덩어리 이식 가능		 그래프트의 신경 재분포 결핍
이식된 스캐폴드가 응집될 수 있음
회수하기 위해 모든 스캐폴드의 위치를 파악하기 어려움
망 착공 전용 문맥 배액 (exclusive portal drainage)
높은 혈관 밀도
양호한 신혈관생성
비-정제된 섬 수용가능
큰 섬/IPC 덩어리 이식 가능		 반복 이식하기 어려운 복잡한 이식 절차
피하 공간 쉬운 접근성 (침습성이 최소화된 이식 시술 및 생검)
큰 섬/IPC 덩어리 이식 가능 		혈액 공급 부족
일부 구현예에서, 췌장 장애는 퇴행성 췌장 장애이다. 본원에 개시된 방법은 췌장 세포, 예를 들어, 섬 베타 세포의 감소, 또는 췌장 세포의 기능 감소에 의해 유발되거나 또는 이를 발생시키는 췌장 장애에 특히 유용하다. 개체는, 일부 구현예에서, 포유류이다. 포유류는 예를 들어 인간, 인간을 제외한 영장류, 마우스, 랫, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있다.
통상적인 퇴행성 췌장 장애로는 당뇨병 (예, I형, II형 또는 임신성) 및 췌장암을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본원에 개시된 방법을 이용함으로써 치료할 수 있는 그외 췌장 장애 또는 췌장-관련 장애는, 예를 들어, 고혈당, 췌장염, 췌장 가성낭종, 상해로 인한 췌장 외상, 3형 당뇨병 또는 췌장절제술 (pancreatectomy)의 합병증이다. 또한, 췌장절제술을 받은 개체 역시 본원에 개시된 방법으로 치료하기 또한 적합하다.
일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 췌장 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 I형 당뇨병을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 II형 당뇨병을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 임신성 당뇨병을 치료하는 방법을 개시한다.
일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 췌장암을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 고혈당을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 췌장염을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 췌장 가성낭종을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 상해로 인한 췌장 외상을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본원은, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 췌장절제술에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법을 개시한다.
당뇨병은 3가지 형태, 즉 1형, 2형 및 임신성으로 발견되는 대사 장애이다. 1형 또는 IDDM은 자가면역 질환이고; 면역계는 인슐린을 췌장의 인슐린-생산 베타 세포를 파괴하여, 췌장의 인슐린 생산 능력을 감소시키거나 또는 제거한다. 1형 당뇨병 환자는 삶을 지속하기 위해 매일 인슐린 보충제를 투여하여야 한다. 증상은 전형적으로 빠르게 진행되며, 증가된 갈증 및 배뇨, 만성 허기, 체중 감소, 흐린 시력 및 피로 등을 포함한다. 2형 당뇨병은 당뇨병 환자의 90% 내지 95%에서 발견되는 가장 흔한 형태이다. 이는 고령, 비만, 가족력, 이전의 임신성 당뇨, 신체 활동 부족 (physical inactivity) 및 인종과 관련된다. 임신성 당뇨병은 임신 중에만 생긴다. 임신성 당뇨병이 발생한 여성은 5년 내지 10년 내에 2형 당뇨병이 발생할 가능성이 20% 내지 50%이다.
당뇨병을 앓고 있거나 또는 당뇨병 발병 위험성이 있는 개체는 혈당 수치 측정과 같은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 동정하며, 예를 들어, 밤새 금식 후에 2회 이상 혈당치 140 ㎎/dL 초과는 당뇨병을 앓고 있다는 것을 의미한다. 당뇨병을 앓고 있지 않거나 또는 당뇨병 발병 위험성이 없는 개체는 공복 혈당치 70 내지 110㎎/dL로 특정된다.
당뇨병 증상으로는 피로, 구역질, 빈뇨, 과도한 갈증, 체중 감소, 흐린 시력, 빈번한 감염 및 상처 또는 궤양의 느린 치유, 약 140/90으로 또는 그 보다 높게 계속 유지되는 혈압, HDL 콜레스테롤 수치 35 ㎎/dL 미만 또는 트라이글리세라이드 수치 250 ㎎/dL 초과, 고혈당증, 저혈당증, 인슐린 결핍증 또는 내성 등이 있다. 화합물이 투여되는 당뇨병 또는 당뇨병 전증 환자 (pre-diabetic patient)는 당업계에 공지된 진단 방법으로 동정한다.
고혈당증은 과량의 글루코스가 혈액 혈장에서 순환하는 췌장-관련 장애이다. 이는 일반적으로 글루코스 수치가 (200㎎/dl)보다 높다. 고혈당증 개체는 당뇨병을 앓고 있거나, 앓고 있지 않을 수도 있다.
췌장암은 미국에서 4번째로 흔한 암으로, 주로 60세 이상에서 발생하며, 임의의 암 중 가장 낮은 5년 생존률을 가진다. 췌장암의 가장 흔한 유형인 선암종은 췌장관의 라이닝에서 발생하며; 낭선암종 및 선방 세포 암종 (acinar cell carcinoma)은 드물다. 그러나, 양성 종양은 또한 췌장 내에서 증식하며; 이는 인슐린종 (insulinoma) (인슐린을 분비하는 종양), 가스트린종 (정상보다 더 높은 수준으로 가스트린 분비), 및 글루카곤종 (글루카곤을 분비하는 종양)을 포함한다.
췌장암은 공지된 원인은 없지만, 당뇨병, 흡연 및 만성 췌장염 등의 몇가지 위험 요인이 있다. 증상으로는 상복부 통증, 식욕 부족, 황달, 체중 감소, 소화불량, 구역질 또는 구토, 설사, 피로, 가려움 또는 복부 장기 비대증 등이 있을 수 있다. 진단은 초음파, 컴퓨터 단층촬영 스캔, 자기 공명 영상, ERCP, 경피 간경유 담도 조영술 (percutaneous transhepatic cholangiography), 췌장 생검 또는 혈액 검사를 통해 이루어진다. 치료는 수술, 방사선 요법 또는 화학요법, 통증 또는 소양증에 대한 약물, 경구 효소 제제 또는 인슐린 치료를 수반할 수 있다.
췌장염은 췌장의 염증과 자가소화이다. 자가소화의 경우, 췌장이 자체 효소에 의해 파괴되어, 염증을 유발한다. 급성 췌장염은 전형적으로 단 1회 발병하며, 이후 췌장은 정상으로 회복될 것이다. 그러나, 만성 췌장염은 췌장 및 췌장 기능에 대한 영구적인 손상을 수반하며, 섬유증으로 이어질 수 있다. 다른 예로, 이는 수회 공격 후 해소될 수도 있다. 췌장염은 췌도를 막고 있는 담석에 의해 또는 알코올 남용에 의해 가장 빈번하게 유발되며, 이는 작은 췌장 소도관을 막을 수도 있다. 다른 요인으로는 복부 외상 또는 수술, 감염, 신부전, 낭창, 낭포성 섬유증, 종양 또는 전갈 독침 등이 있다.
췌장염과 빈번하게 관련된 증상으로는 복통, 잠재적으로는 등 또는 흉부로 발산되는 통증, 구역질 또는 구토, 빠른 맥박, 열, 상복부 종창, 복수, 저혈압 또는 경증의 황달 등이 있다. 증상은, 췌장염과 관련된 것으로 식별되기 전, 다른 질병으로 인한 것일 수 있다.
본원에 제시된 개시 내용은 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약, 및 본원에 기술된 예들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용되는 용어 및 예들은 단지 구체적인 구현예를 설명하고, 당업자에 대한 가이드를 제공하고자 하는 의도 및 목적일 뿐, 본원에 제시된 개시 내용의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 일반적인 방법
인간 간 세포: 임상 시험 위원회 (심사 위원회)로부터의 승인 하에, 성체 인간 간 조직을 3-23세 또는 그 이상의 연령의 개체로부터 수득하였다. 인간 간 세포의 분리는 문헌 (Sapir et al, (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102: 7964-7969; Meivar-Levy et al, (2007) Hepatology 46: 898-905)에 개시된 바와 같이 단리하였다. 간 세포는 10% 소 태아 혈청, 100 units/ml 페니실린; 100 ng/ml 스트렙토마이신; 250 ng/ml 암포테리신 B (Biological Industries, Israel)가 첨가된 둘베코의 최소 기본 배지 (1 g/L 글루코스)에서 배양하고, 5% CO2 및 95% 공기로 구성된 가습 분위기 하에 37℃에서 배양하였다.
바이러스 감염 및 전환분화: 본 연구에 사용되는 아데노바이러스는 다음과 같다: 사용된 바이러스는 Ad-CMV-Pdx-1, Ad-CMV-MafA 및 Ad-CMV-NeuroD1 (WO2016108237A1)이었다. 표준 프로토콜에 따라 바이러스 입자를 제조하였다 (He et al, (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95: 2509-2514). 실시예 또는 도에서 달리 명시되지 않은 한, MOI는 Ad-CMV-Pdx-1 (1000 MOI), Ad-CMV-MafA (50 MOI) 및 Ad-NeuroD1 (250 MOI)이다. 바이러스는 OD260 Inc. (ID, USA) 또는 Pall Inc. (USA)에서 제조하였다. 1일에, 세포에 Ad-CMV-PDX-1 및 Ad-NeuroD1을 감염시키고, 표준 플레이트에서 TM (하기 참조) 중에 접종하였다. 다른 예로, 세포에 PDX-1 및 NeuroD1 둘다를 코딩하는 싱글 아데노바이러스 벡터를 감염시킬 수 있다. 3일에, 세포를 회수하고, Ad-CMV-MafA로 감염시킨 후, 부착 또는 비-부착 조건 하에 접종하였다. 6일 또는 7일에 세포를 회수하였다.
실험에 사용된 세포 배양 배지는 다음과 같다: (1) 전환분화 배지 (TM, DMEM 1 g/L 글루코스 + 10% 소 태아 혈청, 100 unit/ml 페니실린; 100 ng/ml 스트렙토마이신; 250 ng/ml 암포테리신 B, 10 mM 니코틴아미드 (Sigma, Israel), 20 ng/ml EGF (Cytolab, Israel), 5nM Ex4; (2) 무혈청 배지 (SFM): DMEM 1 g/L 글루코스 + 100 unit/ml 페니실린; 100 ng/ml 스트렙토마이신; 250 ng/ml 암포테리신 B 1% ITS (vol/vol), 10 mM NIC, 20 ng/ml EGF, 5nM Ex4; 및 (3) "CMRL+B27": CMRL 배지 + lOO unit/ml 페니실린; 100 ng/ml 스트렙토마이신; 250 ng/ml 암포테리신 B 2% B27 vol/vol, lOgr/L 알부민, 1% ITS, 10 mM NIC, 20 ng/ml EGF, 5nM Ex4.
비-부착 조건에서의 세포 배양: 전환분화된 세포의 3차원 (3D) 세포 클러스터를 구축하기 위해 3가지 방법을 사용하였다. 3가지 방법 모두, 일차 간 세포를 본 섹션의 상기 기술한 바와 같이 전환분화하였다. 그러나, 이들 방법은 3일부터 세포 인큐베이션 조건에 차이가 있다.
제1 방법으로, 3일에 MafA 감염 후, 세포를 저-결합성 6웰 플레이트에 접종하였다. 실시예에서 후술한 바와 같이, 여러 실험들에 여러가지 세포 배양 배지를 사용하였다. 일부 실험에서는, GSIS 실험을 위해 또는 RNA 추출을 위해 6일에 세포를 회수하였다. 그런 후, 응집체를 레귤러 배양 6웰 플레이트로 이동시켰다. 응집체는 GSIS 분석 수행 전 24시간 동안 플레이트 표면에 부착시켰다 (도 3A).
제2 방법으로, 3일에 MafA 감염 후, 세포를 저-결합성 T 플라스크에 접종하였다. 일부 실험에서는, GSIS 실험을 위해 또는 RNA 추출을 위해 6일에 세포를 회수하였다. 그런 후, 응집체를 12 ㎛ Millicel® 세포 인서트 (Millipore)에 제조사의 지침에 따라 이동시켰다. 이 인서트에는, 필터를 자유롭게 통과하는 단일 세포와 큰 응집체를 분리하는 12 ㎛ 필터가 하부에 장착되어 있다. 세포 인서트에서 GSIS 분석을 수행하였다 (도 4).
제3 방법으로, 3일에 MafA 감염 후, 세포를 AggreWell™ 400 (STEMCELL Technologies) 플레이트에 제조사의 지침에 따라 접종하였다. 세포를 15일까지 AggreWell™ 플레이트에서 배양하였다 (도 5). 세포는 40 ㎛ EASY strainer (deGrout)를 이용한 RNA용으로 수집하거나 또는 GSIS 분석을 위해 12 ㎛ Millicel® 세포 인서트 (Millipore)로 이동시켰다.
RNA 단리, RT 및 RT- PCR 반응: 전체 RNA를 단리하고, cDNA를 기존에 기술된 바와 같이 증폭시켰다 (Ber et al, (2003) J Biol Chem 278: 31950-31957; Sapir et al, (2005) 상기 참조). 기존에 기술된 바와 같이, ABI 스텝 온 플러스 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems, CA, USA)을 사용해 정량적인 실시간 PCR을 수행하였다 (Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) J Biol Chem 284: 33509-33520).
C- 펩타이드 및 인슐린 분비 검출: 문헌 (Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) 상기 참조)에 언급된 바와 같이, 바이러스에 최초 노출시킨 다음 6일 또는 7일간 배양 세포의 정적 인큐베이션에 의해, C-펩타이드 및 인슐린 분비를 측정하였다. 글루코스-자극된 인슐린 분비 (GSIS)를 글루코스 2 mM (저 농도) 및 17.5 mM (고 농도)에서 측정하였으며, 후자는 유해한 효과를 나타내지 않으면서 전환분화된 간 세포로부터 인슐린 분비를 최대한으로 유도하기 위해 농도-의존적인 분석에 의해 결정하였다 (Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) 상기 참조). 인간 C-펩타이드 방사성면역측정 키트 (Linco Research, St. Charles, MO; 인간 프로인슐린에 대한 교차-반응성 <4%)를 이용한 방사성면역측정에 의해, 또는 인간 초-민감도 ELISA 키트 (Mercodia, Uppsala, Sweden; 인간 프로인슐린에 대한 교차-반응성 <5%)에 의해, C-펩타이드 분비를 검출하였다. 인간 인슐린 방사성면역측정 키트 (DPC, Angeles, CA; 인간 프로인슐린에 대한 교차 반응성 32%)를 이용한 방사성면역분석에 의해 인슐린 분비를 검출하였다. 비-부착 조건에서 배양한 세포를 분석하기 전 부착성 6웰 플레이트로 이동시켰다.
Accutase ® 및 트립신 처리: 세포를 PBS로 헹군 후 Accutase® 세포 탈착 용액 (Merck Millipore)으로 헹구거나, 또는 트립신 (0.5 ml)을 첨가하여 제조 프로토콜에 따라 37℃에서 20분간 두었다.
세포 생존성: 세포 생존성은 트립판 블루 배제 분석 (Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조)으로 분석하였다.
통계 분석: 통계 분석을 2-샘플 스튜던트 t-검정으로 수행하여, 비균등 분산 (unequal variances)을 추정하였다.
실시예 2: 무처리 및 전환분화된 간 세포의 3차원 (3D) 클러스터 형성
목표: 3차원 (3D) 클러스터를 형성하기 위한 조건 결정. 3D 클러스터로 배양된 인슐린 생산 세포 (IPC)의 표현형과 단층으로 배양된 IPC의 표현형 비교.
실험 설계 및 방법: 인간 성체 일차 간 세포 3 x 106개를 2명의 공여체로부터 수득하였으며, 실시예 1에 기술된 방법에 따라 전환분화하였다. 감염 후, 세포를 표준 부착성 6웰 마이크로플레이트 또는 코닝 울트라-저 부착성 6웰 마이크로플레이트 (Sigma, Israel, Cat #: CLS3471)에, 무혈청성 배지 (SFM) 중에 여러가지 농도 (100,000-500,000 세포/웰)로 접종하였다. 6일에 세포를 회수하였다. 비-감염 대조군 세포도 비슷한 조건에서 배양하였다.
비- 부착성 조건에서 배양한 비-감염 세포 및 전환분화된 세포 둘다 3D 세포 클러스터를 형성한다
울트라-저 부착성 6웰 플레이트에서 배양한 전환분화된 세포를 가시적으로 관찰한 결과, 접종 후 4-6시간 후 3D 클러스터가 형성되었다. 클러스터의 직경은 처음에 접종한 세포 수와 관련 있었으며; 세포 100,000개를 접종한 웰에서는 직경 100 ㎛의 클러스터가 관찰되었고, 세포 500,000개를 접종한 웰에서는 직경 400 ㎛의 클러스터가 관찰되었다 (도 6). 직경이 200 ㎛ 보다 큰 3D 세포 클러스터의 중앙에 다크 코어가 관찰되었으며, 이는 클러스터 내부의 산소 부족이 원인일 수 있는 세포 농도 및 생존성의 급격한 감소로서 해석되었다.
비-부착 조건에서의 전환분화된 세포의 배양이 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 촉진한다
이소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 발현 수준과 내인성 성숙한 췌장 베타 세포 마커 NKX6.1, SST 및 GCG의 발현 수준을 RT-PCR로 분석하였다. 비-부착 조건에서 배양된 세포는 부착 조건에서 배양된 세포와 비슷한 수준으로 이소성 pTF를 발현하였다 (도 7A). 3D 클러스터는 NKX6.1, SST 및 GCG의 발현 증가를 나타내었으며, 이는 비-부착 조건이 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 촉진함을 시사한다 (도 7B).
다음으로, 글루코스-조절된 C-펩타이드 분석을 부착 조건 및 비-부착 조건에서 배양한 세포들에서 비교하였다. 비-부착 조건에서 배양된 세포는, 부착 배양 조건에서 배양된 대조군 세포와 비교해, 글루코스-조절된 C-펩타이드 분비 증가를 나타내었다 (도 7C).
실시예 3: 비-부착 배양 방법의 최적화
목표: 전환분화된 인슐린 생산 세포 (IPC)의 3차원 (3D) 클러스터를 구축하기 위한 최적의 조건 결정.
실험 설계 및 방법: 2명의 공여체로부터 수득한 인간 성체 일차 간 세포 3 x 106개를 전술한 방법에 따라 전환분화하였다. 감염 후, 세포를 부착성 6웰 마이크로플레이트 또는 코닝 울트라-저 부착성 6웰 마이크로플레이트에 접종하였다. 비-감염 대조군 세포도 비슷한 조건하에 접종하였다. 각 배양 플레이트 타입에 따라, 세포를 a) TM, b) SFM 또는 c) CMRL+B27에서 인큐베이션하였다. 6일에, 세포를 회수하였다. 세포들 중 일부는 RNA 추출에 사용하였으며, 일부는 GSIS 분석을 위해 부착성 6웰 플레이트로 옮겼다. 7일에, 세포 수 및 생존성을 평가하였으며, GSIS를 분석하고, 세포의 RNA를 추출하였다. 배양 방법에 대한 전반적인 내용은 도 3A에 나타낸다. 현 실험에서 검사한 조건은 도 3B-D에 나타낸다.
3차원 (3D) 세포 클러스터는 부착성 조건에서 다시 접종하였을 때 형태를 유지한다
전환분화된 세포 및 무처리 세포를 실험의 4일부터 6일까지 비-부착 조건에서 배양한 다음 부착성 6웰 플레이트에 TM, SFM 또는 CMRL+B27 배지 중에 다시 접종하였다. 가시적인 관찰 결과, 세포 클러스터는 재 접종된 후에도 유지되는 것으로 확인되었다 (도 8).
부착 조건은 사용된 세포 배지와 무관하게 전환분화 효율에 영향을 미친다
7일에, 부착 조건 및 비-부착 조건에서 TM, SFM 또는 CMRL+B27 배지 중에 배양한 세포 간에 글루코스-조절된 C-펩타이드 분비를 비교하였다. 비-부착 조건에서 배양된 세포는, 부착 조건에서 배양된 세포와 비교해, 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비가 개선된 것으로 관찰되었다. 개선은 TM, SFM 및 CMRL+B27 배지에서 배양한 세포에서 확인되었다 (도 9A 및 9B). 여러가지 배지에서 배양한 세포들 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
Nkx6.1, GCG 및 PAX6의 mRNA 발현 수준과, 이소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 발현 수준을, 부착 조건 및 비-부착 조건하에, TM, SFM 및 CMRL+B27 배지에서 배양한 세포에서, 6일 및 7일에 측정하였다. 이소성 유전자의 발현 수준은, 부착 조건에서 배양한 세포와 비교해, 비-부착 조건에서 배양한 세포에서 더 높았다. 이러한 증가는 6일 및 7일 모두에, 사용한 모든 배지들에서 관찰되었다 (도 10A). 모든 조건들에서 감염 속도가 비슷하다고 가정하면, 이러한 발현 증가는 비-부착 조건에서 관찰된 세포의 낮은 증식에 의해 설명될 수 있는데, 이는 감염된 세포의 비율이 더 높다는 것을 암시한다. Nkx6.1, GCG 및 PAX6의 발현 수준은, 부착 조건에서 배양한 세포와 비해, 비-부착 조건에서 배양한 세포에서 더 높았다. 이러한 증가는 6일 및 7일에 모든 사용 배지들에서 관찰되었다 (도 10B, 1OC 및 10D).
실시예 4: 비-부착 배양 방법의 최적화
목표: 1. 울트라 -저 부착 조건에서 전환분화된 세포의 클러스터를 구축하기 위한 방법의 최적화; 2. 소규모 배양이 가능한 6웰 플레이트에서의 작동 방법 개발; 3. 3D 세포 클러스터에 적합한 GSIS 분석 방법 개발; 4. 3D 클러스터를 단일 세포로 분리하는 방법 개발; 및 5. 3D 클러스터를 부착 조건에서 재 접종하는 방법 개발.
실험 설계 및 방법: 성체 일차 간 세포 3 x 106개를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 전환분화하였다. MafA를 감염시킨 후, 세포를 a) 6웰 마이크로플레이트, b) 울트라-저 부착 6웰 마이크로플레이트, 또는 c) 울트라-저 부착 75T 플라스크 코닝 (Sigma, Israel, Cat #: CLS3814)에 표 2에 나타낸 조건에 따라 접종하였다. 그런 후, 세포들 중 일부는 표 3에 상세히 기술된 조건에 따라 전환분화되었다.
표 2: 접종 조건
세포 수 웰 크기
(㎠)		 세포 밀도
(세포/㎠)		 배지 체적
(ml)		 세포/ml
표준 6웰 플레이트 100,000 9.5 ~10,000 4 25,000
울트라 저 부착 6웰 플레이트 300,000 9.5 ~30,000 4 75,000
75T 플라스크 2,500,000 75 ~33,00 25 100,000
표 3: 형질감염 및 세포 배양 조건
그룹 처리 배지 조건 세포 수 플레이트 타입
1 무처리 TD + 혈청 부착 100,000 6웰 플레이트*
2 TD 부착 100,000 6웰 플레이트*
5 무처리 SFM + ITS 비-부착 2,500,000 75T 플라스크
6 TD 비-부착 2,500,000 75T 플라스크
7 무처리 비-부착 300,000 3X 웰**
8 TD 비-부착 300,000 3X 웰**
6일에 회수: 75T 플라스크에서 배양한 세포 배양물을 수집하여 50 ml 코니칼 튜브로 옮긴 다음 500RPM에서 5분간 원심분리한 다음 배지 15 ml을 제거하였다. 세포 (약 2.5 x 106, 배지 10 ml)를 분할하여, 표 4에 상세히 기술된 분석에 사용하였다. 울트라-저 부착 6웰 플레이트에서 배양한 세포를 GSIS 분석을 위해 부착성 6웰 플레이트로 옮겼다. 비-부착 조건으로의 이동은 플라스크에서 수집한 SFM 4 ml 중에 수행하였다. 6웰 플레이트에서 배양한 클러스터의 조건을 모방하기 위해 신선한 배지는 첨가하지 않았다.
표 4: 75T 플라스크에서 배양한 세포에 수행한 분석
분석 배지 체적 (ml) 접종 세포 리피트
1 세포 인서트에서 GSIS 1.5 375,000 2
2 RNA 1 250,000 2
3 2D로 이동 1 250,000 3
4 Accutase를 이용한 세포 해리 0.75 187,500 1
6 트립신을 이용한 트립신 처리 0.75 187,500 1
7일 회수: 3D 세포 클러스터를 수집하고, 세포 수를 계수하였다. 클러스터의 세포들 중 일부는 부가적인 GSIS 분석을 위해 비-부착 조건하에 재 접종하였으며, 나머지 일부는 RNA 추출에 사용하였다.
세포 스페로이드 형태
울트라-저 부착 75T 플라스크에서 배양한 비-전환분화된 세포 및 전환분화된 세포 둘다 6웰 플레이트에서 배양한 세포와 비교해 더 작은 클러스터를 형성하였다. 75T 플라스크에서의 클러스터는 플라스크 전체 면적을 따라 균일하게 퍼져 있었다 (도 11A). 비-부착성 6웰 플레이트에서 관찰된 세포 클러스터는 이전 실험에서 관찰된 3D 클러스터와 비슷하였다. 6웰 플레이트에서 형성된 3D 클러스터가 더 컸으며, 웰 가운데 위치하였으며, 다소 서로 부착되었다 (도 11B). 75T 플라스크에서 기원한 3D 세포 클러스터는 부착성 6웰 플레이트로 이동된 후, 75T 플라스크에서 기원한 3D 세포 클러스터는 웰 가운데 자리잡은 다음 표면에 부착하였다 (도 11C). 3D 세포 클러스터는, 부착 조건에서 재접종하였을 때 그 표현형을 유지하였다.
최적의 전환분화 조건을 결정하기 위해, 이소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 발현 수준과, 췌장 베타 세포 유전자 마커 GCG 및 NKX6.1의 발현 수준을, 6웰 플레이트에서 부착 및 비-부착 조건에서 배양한, 그리고 75T 플라스크에서 비-부착 조건에서 배양한 전환분화된 세포 및 무처리 세포에서, 측정하였다.
비-부착 배양 조건이 이소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 발현뿐 아니라 GCG 및 NKX6.1의 발현을, 부착 배양 조건과 비교해, 증가시키는 것으로 관찰되었다 (도 12A 및 도 12B). 부착 조건하에 재접종하고 미리 75T 플라스크 또는 울트라-저 부착 6웰 플레이트에서 배양된 세포는, 이소적으로 발현되는 PDX-1, NeuroD1 및 MafA, 및 GCG 및 NKX6.1을 비슷하게 발현하였다 (도 12A 및 도 12B).
6일에 회수한 세포는, 7일에 회수한 세포와 비교해, 이소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA에 대해 더 높은 발현성을 나타내었다 (도 12A). 예상치 못하게도, GCG 및 NKX6.1의 발현은 6일에 회수한 세포에서 더 높았으며 (도 12B), 이는 부가적인 배양 일, 부착 조건에서의 재 접종 또는 부가적인 GSIS 분석이 췌장 베타 세포 표현형으로 세포 성숙화에 부정적으로 영향을 미친다는 것을 의미한다.
본 분석 (인간 섬)에 사용한 양성 대조군에서 NKX6.1 발현 수준은 일반적인 경우보다 4배 낮았다. 이는 본 실험에서 검출된 NKX6.1의 낮은 수준을 설명할 수 있다.
모든 분석 그룹에 대한 역치 사이클 수를 나타낸 표 5에 RT-PCR 결과를 요약 개시한다.
표 5: 도 12A 및 12B에 제시된 RT-PCR 역치 사이클 수.
일 배양 조건 처리 PDX1 NeuroD1 MafA GCG NKX6.1 SST
D6 3D-플라스크 UT 4.21E-02 1.11E-02 4.95E-02 1.72E-05 1.02E-03 3.37E-04
TD 1.3E-02 12.6 66.7 1.92E-04 3.36E-02 3.37E-04
D7 3D-웰 UT 6.4E-03 1.13E-02 1.01E-01 7.42E-06 1.11E-03 1.34E-04
TD 20.08 46.9 46.9 1.39E-04 6.79E-03 1.21E-04
3D-플라스크 UT 6.34E-03 1.82E-01 1.82E-01 7.41E-06 1.17E-03
TD 21.75 33.5 33.5 1.14E-04 5.08E-03
2D UT 1.15E-03 2.76E-02 2.76E-02 1.42E-04 1.22E-03 3.64E-05
TD 2.35 2.78E-01 4.22 2.11E-05 3.37E-03 3.94E-05
Accutase ®는 3D 세포 클러스터로부터 세포를 효과적으로 탈착시킨다
3D 클러스터로부터 세포를 해리시키는 Accutase® 및 트립신의 효과를 75T 플라스크에서 구축한 세포 클러스터에서 비교하였다. Accutase는 클러스터를 효과적으로 해리시켰다. Accutase를 사용하였을 때 해리된 세포의 생존율은 여전히 낮았으며, 무처리 세포의 경우 생존율이 71%, 전환분화된 세포의 경우 생존율이 78%이었으며, 이는 트립신 처리와 비교해 상당해 개선되었다. 트립신은 3D 클러스터에서 개별 세포 몇개만 탈착시켰으며, 탈착된 세포들은 사멸하였다.
실시예 5: 여러가지 제조사의 바이러스
목표: 다른 제조사로부터 공급받은 아데노바이러스를 이용한 이전 결과 검증.
실험 설계 및 방법: 인간 성체 일차 간 세포를 2명의 공여체로부터 수득하였으며, 상기에 기술된 방법에 따라 전환분화하였다. 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 전환분화하였다. 일차 간 세포에 OD260 Inc. (ID, USA) 또는 Pall Inc. (USA) 사로부터 제공받은 아데노바이러스를 감염시켰다. 감염 후, 세포를 부착성 6웰 마이크로플레이트 또는 울트라-저 부착 T75 플라스크에 CMRL-SFM 배지 중에 접종하였다. 무처리 대조군을 비슷한 조건에서 배양하였다. 6일에, 세포를 회수하고, RNA를 추출하였다.
비-부착 조건에서의 전환분화된 세포 배양이 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 촉진한다
췌장 베타 세포 유전자 마커와 국소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 발현 수준을, 6웰 플레이트에서 부착 조건 및 비-부착 조건하에 배양하고 Pall Inc. (USA) 아데노바이러스를 감염시킨 전환분화된 세포에서 측정하였다. 비-전환분화된 세포를 대조군으로 사용하였다.
비-부착 배양 조건이 GCG, NKX6.1 및 SST의 발현 (도 13A)과 이소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA (도 13B)의 발현을, 부착 배양 조건과 비교해, 증가시키는 것으로, 확인되었다.
여러가지 제조사의 바이러스에 의한 세포 감염시 비슷한 전환분화 효과가 달성된다
췌장 베타 세포 유전자 마커와 이소적으로 발현된 PDX-1, NeuroD1 및 MafA의 발현 수준을, OD260 Inc. (ID, USA) 또는 Pall Inc. (USA) 사에서 제조된 비슷한 바이러스를 사용해 전환분화한 세포에서 측정하였다. 그룹들 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 14A 및 도 14B, *: OD260 Inc. (ID, USA) 아데노바이러스로 감염된 세포; **: Pall Inc. (USA) 아데노바이러스로 감염된 세포).
글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비를 부착 조건 및 비-부착 조건에서 배양한 세포들 간에, 그리고 OD260 또는 Pall 바이러스를 형질감염시킨 세포들 간에 비교하였다. 비-부착 조건에서 배양한 세포는, 부착 조건에서 배양한 세포와 비교해, 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 개선을 나타내었다. OD260 바이러스로 형질감염된 세포와 Pall 바이러스로 형질감염된 세포에서 C-펩타이드 분비 수준은 비슷하였다 (도 15A 및 15B, *: OD260 Inc. (ID, USA) 아데노바이러스로 감염된 세포; **: Pall Inc. (USA) 아데노바이러스로 감염된 세포).
실시예 6: 마이크로웰에서 3D 클러스터 구축
목표: 지정된 크기를 가진 3차원 (3D) 세포 클러스터 구축 방법 개발.
실험 설계 및 방법: 실시예 1에 언급된 바와 같이 세포를 전환분화하였다. 3일에 MafA로 감염 후, 세포를 AggreWell™ 400 플레이트 (StemCell Technologies)에 접종하였다. AggreWell™ 400 플레이트를 사용해, 재현가능하며 매우 균일한 방식으로 세포 응집체를 제조하였다. AggreWell™ 플레이트의 각각의 웰은 400 ㎛3 마이크로웰들로 된 표준 어레이를 수용한다. 인풋 세포 밀도를 조정함으로써 클러스터의 크기를 제어할 수 있다. 사용 전, 제조사의 지침에 따라, 각각의 웰을 세포 부착을 방지하고 효과적인 응집체 형성을 촉진하는 항-부착 세척 용액으로 헹구었다. 그런 후, 무처리 (UT) 및 전환분화된 (TD) 세포의 단일 세포 현탁물을 SFM 배지 중에 준비하였다. 세포를 계수하여, 살아있는 세포 농도를 측정한 다음 각 웰에 세포 150개를 접종하였다. 세포를 웰에 균일하게 분산시키고, 3분간 100 xg로 원심분리하여 마이크로웰에 세포를 포획하였다. AggreWell 플레이트를 37℃, 5% C02 및 습도 95%에서 2주간 인큐베이션하였으며, 광 현미경 하에 응집체 형성을 관찰하였다. RT-PCR용 RNA 추출을 위해 7일 또는 15일에 세포를 회수하였다
결과: TD 세포는 7일 및 15일에 UT 세포와 비교해 더 큰 클러스터를 형성하였다. 또한, TD 세포 클러스터는 UT 세포 보다 더 높은 분산 계수 (coefficient of variance, CV) 퍼센트를 나타내었다. 표 6은 TD 및 UT 세포의 CV 및 관찰된 클러스터 크기를 요약 개시한다. 도 16은 7일 및 15일에 TD 세포 및 UT 세포의 대표적인 3D 세포 클러스터를 도시한다.
표 6. Aggrewell™ 플레이트에서 제조된 3D 세포 클러스터의 크기
처리 15일 - CV (%) 15일 - 클러스터 평균 크기 (㎛) 7일 - CV (%) 7일 - 클러스터 평균 크기 (㎛)
TD (150 세포/마이크로웰) 16% 156 11% 140
UT (150 세포/마이크로웰) 9% 117 5% 113
단층 (2D)으로 배양하거나 또는 응집체 (3D)를 형성하기 위해 AggreWell에서 배양한 TD 세포에서 유전자 발현 프로파일을 조사하였다. 이소적으로 발현된 Pdx-1, NeuroD1 및 MafA와, 내인성 췌장 유전자 Nkx6.1 및 GCG의 발현을 측정하였다. 7일 및 15일 모두, 3D 클러스터로 배양된 TD 세포는, 2D로 배양된 TD 세포와 비교해, 더 높은 이소성 유전자 발현을 나타내었다 (도 17A). 3D 클러스터로 배양된 TD 세포의 경우, 2D로 배양된 TD 세포와 비교해, 7일과 15일 모두 더 높은 수준의 Nkx6.1 및 GCG 유전자 발현이 관찰되었다 (도 17B).
SEQUENCE LISTING <110> ORGENESIS LTD TEL HASHOMER MEDICAL RESEARCH INFRASTRUCTURE AND SERVICES LTD. FERBER, Sarah <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROVIDING CELL REPLACEMENT THERAPY <130> P-570812-PC1 <150> 62/512,085 <151> 2017-05-29 <150> 62/512,083 <151> 2017-05-29 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Gly Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Ser Ala Ser Pro 20 25 30 Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro His 35 40 45 Pro Phe Pro Gly Ala Leu Gly Ala Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp 50 55 60 Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Asp Asp Pro Ala Val Ala 65 70 75 80 His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Ala Leu Pro His Pro Pro 85 90 95 Ala Gly Pro Phe Pro Glu Gly Ala Glu Pro Gly Val Leu Glu Glu Pro 100 105 110 Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His 115 120 125 Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu 130 135 140 Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu 145 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300 ccggagggag ccgagccggg cgtcctggag gagcccaacc gcgtccagct gcctttccca 360 tggatgaagt ctaccaaagc tcacgcgtgg aaaggccagt gggcaggcgg cgcctacgct 420 gcggagccgg aggagaacaa gcggacgcgc acggcctaca cgcgcgcaca gctgctagag 480 ctggagaagg agttcctatt caacaagtac atctcacggc cgcgccgggt ggagctggct 540 gtcatgttga acttgaccga gagacacatc aagatctggt tccaaaaccg ccgcatgaag 600 tggaaaaagg aggaggacaa gaagcgcggc ggcgggacag ctgtcggggg tggcggggtc 660 gcggagcctg agcaggactg cgccgtgacc tccggcgagg agcttctggc gctgccgccg 720 ccgccgcccc ccggaggtgc tgtgccgccc gctgcccccg ttgccgcccg agagggccgc 780 ctgccgcctg gccttagcgc gtcgccacag ccctccagcg tcgcgcctcg gcggccgcag 840 gaaccacgat ga 852 <210> 3 <211> 353 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Ala Glu Leu Ala Met Gly Ala Glu Leu Pro Ser Ser Pro Leu 1 5 10 15 Ala Ile Glu Tyr Val Asn Asp Phe Asp Leu Met Lys Phe Glu Val Lys 20 25 30 Lys Glu Pro Pro Glu Ala Glu Arg Phe Cys His Arg Leu Pro Pro Gly 35 40 45 Ser Leu Ser Ser Thr Pro Leu Ser Thr Pro Cys Ser Ser Val Pro Ser 50 55 60 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Arg Val Gln Gln Arg His Ile Leu Glu Ser Glu Lys Cys Gln 275 280 285 Leu Gln Ser Gln Val Glu Gln Leu Lys Leu Glu Val Gly Arg Leu Ala 290 295 300 Lys Glu Arg Asp Leu Tyr Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Leu Ala Gly Arg 305 310 315 320 Gly Gly Pro Gly Ser Ala Gly Gly Ala Gly Phe Pro Arg Glu Pro Ser 325 330 335 Pro Pro Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe 340 345 350 Leu <210> 4 <211> 1059 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggccgcgg agctggcgat gggcgccgag ctgcccagca gcccgctggc catcgagtac 60 gtcaacgact tcgacctgat gaagttcgag gtgaagaagg agcctcccga ggccgagcgc 120 ttctgccacc gcctgccgcc aggctcgctg tcctcgacgc cgctcagcac gccctgctcc 180 tccgtgccct cctcgcccag cttctgcgcg cccagcccgg gcaccggcgg cggcggcggc 240 gcggggggcg gcggcggctc gtctcaggcc gggggcgccc ccgggccgcc gagcgggggc 300 cccggcgccg tcgggggcac ctcggggaag ccggcgctgg aggatctgta ctggatgagc 360 ggctaccagc atcacctcaa ccccgaggcg ctcaacctga cgcccgagga cgcggtggag 420 gcgctcatcg gcagcggcca ccacggcgcg caccacggcg cgcaccaccc ggcggccgcc 480 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Glu Asp Glu Asp Glu 50 55 60 Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys 65 70 75 80 Pro Lys Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys Lys Met Thr Lys Ala Arg Leu 85 90 95 Glu Arg Phe Lys Leu Arg Arg Met Lys Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn 100 105 110 Arg Met His Gly Leu Asn Ala Ala Leu Asp Asn Leu Arg Lys Val Val 115 120 125 Pro Cys Tyr Ser Lys Thr Gln Lys Leu Ser Lys Ile Glu Thr Leu Arg 130 135 140 Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Ser Glu Ile Leu Arg Ser Gly 145 150 155 160 Lys Ser Pro Asp Leu Val Ser Phe Val Gln Thr Leu Cys Lys Gly Leu 165 170 175 Ser Gln Pro Thr Thr Asn Leu Val Ala Gly Cys Leu Gln Leu Asn Pro 180 185 190 Arg Thr Phe Leu Pro Glu Gln Asn Gln Asp Met Pro Pro His Leu Pro 195 200 205 Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro 210 215 220 Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asp Ser Ser His Val Phe 225 230 235 240 His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe 245 250 255 Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro 260 265 270 Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly Asn Phe Ser Phe Lys His Glu 275 280 285 Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr Ala Phe Thr Met His Tyr Pro 290 295 300 Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Gln Ser His Gly Ser Ile Phe Ser Gly 305 310 315 320 Thr Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro Ile Asp Asn Ile Met Ser Phe 325 330 335 Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val Met Ser Ala Gln Leu Asn Ala 340 345 350 Ile Phe His Asp 355 <210> 6 <211> 1071 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgaccaaat cgtacagcga gagtgggctg atgggcgagc ctcagcccca aggtcctcca 60 agctggacag acgagtgtct cagttctcag gacgaggagc acgaggcaga caagaaggag 120 gacgacctcg aagccatgaa cgcagaggag gactcactga ggaacggggg agaggaggag 180 gacgaagatg aggacctgga agaggaggaa gaagaggaag aggaggatga cgatcaaaag 240 cccaagagac gcggccccaa aaagaagaag atgactaagg ctcgcctgga gcgttttaaa 300 ttgagacgca tgaaggctaa cgcccgggag cggaaccgca tgcacggact gaacgcggcg 360 ctagacaacc tgcgcaaggt ggtgccttgc tattctaaga cgcagaagct gtccaaaatc 420 gagactctgc gcttggccaa gaactacatc tgggctctgt cggagatctc gcgctcaggc 480 aaaagcccag acctggtctc cttcgttcag acgctttgca agggcttatc ccaacccacc 540 accaacctgg ttgcgggctg cctgcaactc aatcctcgga cttttctgcc tgagcagaac 600 caggacatgc ccccgcacct gccgacggcc agcgcttcct tccctgtaca cccctactcc 660 taccagtcgc ctgggctgcc cagtccgcct tacggtacca tggacagctc ccatgtcttc 720 cacgttaagc ctccgccgca cgcctacagc gcagcgctgg agcccttctt tgaaagccct 780 ctgactgatt gcaccagccc ttcctttgat ggacccctca gcccgccgct cagcatcaat 840 ggcaacttct ctttcaaaca cgaaccgtcc gccgagtttg agaaaaatta tgcctttacc 900 atgcactatc ctgcagcgac actggcaggg gcccaaagcc acggatcaat cttctcaggc 960 accgctgccc ctcgctgcga gatccccata gacaatatta tgtccttcga tagccattca 1020 catcatgagc gagtcatgag tgcccagctc aatgccatat ttcatgatta g 1071

Claims (38)

  1. 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포 (transdifferentiated adult mammalian non-pancreatic beta cell) 및 스캐폴드를 포함하며, 적어도 일부의 세포가 상기 스캐폴드에 부착된, 3차원 (3D) 세포 클러스터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 고체 스캐폴드, 하이드로겔, 세포외 기질, 세포외 기질 하이드로겔, 단백질 하이드로겔, 펩타이드 하이드로겔, 폴리머 하이드로겔, 목질 나노셀룰로스 하이드로겔 (wood-based nanocellulose hydrogel), 폴리글리세롤 세바케이트 (PGS) 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 3D 세포 클러스터.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 PGS가 물질과 가교된, 3D 세포 클러스터.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 물질이 라미닌 (laminin), 파이브로넥틴, 피브린, 콜라겐 타입 I/III, 엘라스틴 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 3D 세포 클러스터.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 복수의 미세입자를 포함하는, 3D 세포 클러스터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 PGS를 포함하고,
    상기 미세입자가 직경 약 1 ㎛ 내지 약 1 mm의 범위인, 3D 세포 클러스터.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 미세입자가 직경 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 범위인, 3D 세포 클러스터.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 3D 세포 클러스터가 캡슐화 물질 (encapsulation agent)에 의해 캡슐화된, 3D 세포 클러스터.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 캡슐화 물질이 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 아가로스, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리-L-라이신 (PLL), 폴리설폰 (PSU), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리락트산 (PLA), 아크릴레이트 및 저 분자량 덱스트란 설페이트 (LMW-DS), 또는 이들의 유도체 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는, 3D 세포 클러스터.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 상기 전환분화된 세포를 캡슐로 둘러싼, 3D 세포 클러스터.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 전환분화된 세포가, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해,
    (a) 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 개선, 글루코스-조절된 인슐린의 분비 개선, 인슐린 양적 증가 또는 이들의 조합; 또는
    (b) GCG 발현 증가, NKX6.1 발현 증가, PAX6 발현 증가 또는 이들의 조합; 또는
    (c) (a)와 (b)의 조합을 포함하는, 3D 세포 클러스터.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 전환분화된 세포가 글루코스 고 농도에 반응하여 C-펩타이드를 적어도 20 pm/h*106(세포)로 분비하는, 3D 세포 클러스터.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 이소적으로 발현된 췌장 전사 인자 (ectopically expressed pancreatic transcription factor)에 의해 전환분화되며,
    상기 이소적으로 발현된 췌장 전사 인자는, 이소적으로 발현된 췌장 전사 인자에 의해 유사하게 전환분화되고 단층 세포 배양물로서 배양된 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 가진 전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, 발현이 증가된, 3D 세포 클러스터.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포가 상피 세포, 내피 세포, 각질 형성 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간 세포 (hepatocyte 또는 liver cell), 혈액 세포, 줄기 또는 전구 (progenitor) 세포, 간 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 또는 전구 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 3D 세포 클러스터.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구 세포가 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간 및 지방세포 조직 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 수득되는, 3D 세포 클러스터.
  16. 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하되 적어도 일부의 세포가 상기 스캐폴드에 부착된 3차원 (3D) 세포 클러스터를 포함하는, 약학적 조성물.
  17. 성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하되 적어도 일부의 세포가 상기 스캐폴드에 부착된 3차원 (3D) 세포 클러스터의 구축 방법으로서,
    (a) 스캐폴드를 제공하는 단계;
    (b) 일차 성체 포유류 비-췌장성 세포를 수득하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 세포를 지정된 세포 수로 증식 및 증폭시키는 단계;
    (d) 단계 (c)의 세포를 전환분화하는 단계; 및
    단계 (b), (c) 또는 (d) 후, 상기 스캐폴드에 적어도 일부의 세포를 부착시키는 단계를 포함하며,
    이로써, 전환분화된 포유류 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포를 포함하되 적어도 일부의 세포가 상기 스캐폴드에 부착된 3D 세포 클러스터가 구축되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    단계 (d)에서, 상기 전환분화가,
    (a) 상기 증폭된 세포에, 인간 PDX-1 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를, 제1 시점에 감염시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 증폭된 세포에, 제2 인간 췌장 전사 인자 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를, 제2 시점에 감염시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 증폭된 세포에, 인간 MafA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를, 제3 시점에 감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제2 췌장 전사 인자가 NeuroD1 및 Pax4로부터 선택되는, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 제1 시점과 제2 시점이 동시적인, 방법.
  21. 제17항에 있어서,
    단계 (c), 단계 (d) 또는 이들의 조합이 비-부착성 세포 배양 조건 (non-adherent cell culture condition) 하에 수행되는, 방법.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 고체 스캐폴드, 하이드로겔, 세포외 기질, 세포외 기질 하이드로겔, 단백질 하이드로겔, 펩타이드 하이드로겔, 폴리머 하이드로겔, 목질 나노셀룰로스 하이드로겔, 폴리글리세롤 세바케이트 (PGS) 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 PGS가 물질과 가교된, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 물질이 라미닌, 파이브로넥틴, 피브린, 콜라겐 타입 I/III, 엘라스틴 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제17항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 복수의 미세입자를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 PGS를 포함하고,
    상기 미세입자가 직경 약 1 ㎛ 내지 약 1 mm의 범위인, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 미세입자가 직경 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 범위인, 방법.
  28. 제17항에 있어서,
    상기 3D 세포 클러스터가 캡슐화 물질에 의해 캡슐화되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 캡슐화 물질이 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 아가로스, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리-L-라이신 (PLL), 폴리설폰 (PSU), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리락트산 (PLA), 아크릴레이트 및 저 분자량 덱스트란 설페이트 (LMW-DS), 또는 이들의 유도체 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는, 방법.
  30. 제17항에 있어서,
    상기 스캐폴드가 상기 전환분화된 세포를 둘러싸 캡슐화하는, 방법.
  31. 제17항에 있어서,
    상기 전환분화된 세포가, 단층 세포 배양물로서 배양된 전환분화된 비-췌장성 인슐린 생산 베타 세포와 비교해,
    (a) 글루코스-조절된 C-펩타이드의 분비 개선, 글루코스-조절된 인슐린의 분비 개선, 인슐린 양적 증가 또는 이들의 조합; 또는
    (b) GCG 발현 증가, NKX6.1 발현 증가, PAX6 발현 증가 또는 이들의 조합; 또는
    (c) (a)와 (b)의 조합을 포함하는, 방법.
  32. 제17항에 있어서,
    상기 전환분화된 세포가 글루코스 고 농도에 반응하여 C-펩타이드를 적어도 20 pm/h*106(세포)로 분비하는, 방법.
  33. 제17항에 있어서,
    상기 전환분화된 세포는, 유사한 이소성 췌장 전사 인자로 전환분화되고 단층 세포 배양물로서 배양된 성숙한 췌장 베타 세포 표현형을 가진 전환분화된 비-췌장성 베타 세포와 비교해, 전환분화를 위해 사용된 이소성 췌장 전사 인자들의 발현 증가를 포함하는, 방법.
  34. 제17항에 있어서,
    상기 성체 포유류 비-췌장성 베타 세포가 상피 세포, 내피 세포, 각질 형성 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간 세포 (hepatocyte 또는 liver cell), 혈액 세포, 줄기 또는 전구 세포, 간 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 또는 전구 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 줄기 또는 전구 세포가 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간 및 지방세포 조직 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 수득되는, 방법.
  36. 개체에서 췌장 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서,
    성숙한 췌장 베타 세포 표현형과 기능을 가진 전환분화된 포유류 비-췌장성 베타 세포 및 스캐폴드를 포함하는 3D 세포 클러스터를 상기 개체에 투여하는 것을 포함하며, 이로써 상기 개체에서 질환이 치료되는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 투여가 상기 개체에 3D 세포 클러스터의 진피내, 복막내 또는 외과적 투여, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 질환이 I형 당뇨병, II형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 췌장암, 고혈당, 췌장염, 췌장 가성낭종, 상해로 인한 췌장 외상, 3형 당뇨병 또는 췌장절제술 (pancreatectomy)의 합병증 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
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