CN109486851B

CN109486851B - 一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达水平的方法

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Publication number: CN109486851B
Application number: CN201811190984.9A
Authority: CN
Inventors: 杨代常; 曹京; 尹恒; 李坤鹏
Original assignee: Wuhan Healthgen Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Healthgen Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: CN109486851A; WO2020074002A1; CN114634559A

Abstract

本发明提供一种提高胚乳生物反应器重组蛋白表达水平的方法，所述方法利用储藏谷蛋白突变体(LGC‑1)杂交、基因编辑(TALEN技术和CripsrCas9)技术定向敲除内源储藏蛋白基因，降低内源储藏蛋白含量，缓解内质网胁迫，改善重组蛋白在胚乳细胞转运效率，从而提高重组蛋白在胚乳细胞的表达，实现Oryz^HiEXP技术平台下重组蛋白水稻品系的产量提高和外源重组蛋白表达水平的显著提高。

Description

一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达水平的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过降低内源蛋白表达，缓解内质网胁迫的技术途径，来提高胚乳生物反应器重组蛋白表达水平的方法。

背景技术

自1986年以来利用农业生物制药技术通过植物细胞生产在医药、疾病治疗、分子疫苗等方面有着广泛的用途的重组蛋白。由于农业生物制药技术存在表达量低、工艺复杂和规模化困难的问题，一致不能进入市场。因此提高重组蛋白的表达量是农业生物制药的关键核心技术。提高表达量通常采用较强转录活性的启动子、密码子优化和定向储存等技术来提高表达量，本申请人早期采用水稻胚乳特异性启动子、水稻偏爱密码子优化、蛋白质定向存储等综合技术策略 (Oryz^HiExp技术)，实现了多种重组蛋白在水稻胚乳中特异性高水平表达，最高表达量达到了2.76克/公斤糙米(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011，108(47):19078-19083)，表达量已经达到现有技术的极限(PlantCell Report.2014， 33:585–594；NatureNews)。然而通过对高效表达重组蛋白的水稻胚乳细胞的细胞学和分子生物学分析，发现当重组蛋白在水稻胚乳细胞超量表达后，胚乳细胞中的内质网和蛋白体的细胞学形态发生显著改变(JournalofProteomeResearch, 2009，8,829–837；JournalofBiotechnol.2012，164：300-308；Plant MolecularBiology. 2013,83:153-161)，对其分子机理的研究结果，发现协助蛋白折叠分子伴侣分子提高，内源蛋白显著降低，与此同时，胚乳细胞为了应对超量表达重组蛋白，通过启动未折叠蛋白的应急反应(UnfoldingProteinResponse，UPR)，对外源蛋白进行泛素化，然后介导重组蛋白进入26S蛋白酶体进行降解，以缓解内质网胁迫，保证细胞正常的生长(JournalofProteomeResearch,2009，8,829–837)。

根据以上研究结果和发现，要继续提高重组蛋白在胚乳细胞的表达，仅靠提高转录水平，增加mRNA水平是不够的，在超量表达重组蛋白时，过量外源基因的表达，重组蛋白与内源蛋白与内源蛋白基因不仅在基因转录，而且在转译水平上在蛋白转运、蛋白合成、运输和储藏空间等资源进行竞争，在造成内质网胁迫(ERStress)，而胚乳细胞为了应对胁迫，被动地启动一系列应急反应，包括通过增加分子伴侣加快蛋白折叠，最后启动UnfoldingProteinResponse，UPR (Annu.Rev.Med.1999,50,57–74；Mol.Biotechnol.2006,34(2),279–90.)，26S 蛋白酶体的蛋白质降解途径来降解过量的蛋白质，缓解内质网胁迫，保障细胞正常发育(图1)。因此，我们假设如果主动通过降低内源蛋白含量，减少胚乳细胞的基因转录、转译和蛋白转运与储藏的负担，就可以提高外源蛋白的表达量(图2)。

发明内容

本发明的目的是针对重组蛋白在水稻胚乳细胞超量表达后引起的内质网胁迫，导致内源蛋白含量降低，细胞启动UPR反应，降解内源和外源蛋白的研究结果，提出通过降低内源储藏蛋白含量，缓解胚乳细胞胁迫的技术路线，可以改善重组蛋白的转运效率，提高重组蛋白的表达量。

为了证实这个假设，我们利用一个天然的低谷蛋白突变体，该突变体在谷蛋白编码基因增加了一个DNA片段倒置重复，不仅失活了该基因，而且形成了一个类似miRNA的结构，可以显著降低内源谷蛋白的表达(The Plant Cell,2003， 15,1455–1467)；采用常规育种方式，利用高效表达重组人血清白蛋白的品系 114-7-4与LowGlutelinContent 1(LGC-1)进行杂交，经过分子标记辅助选择，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有LGC-1的基因遗传背景下，重组人血清白蛋白的表达量由2.76g/kg糙米提高到9.6克/kg，提高了3.47倍。

采用相同方法将超量表达重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)品系与LGC-1 杂交，经过分子标记辅助选择，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有 LGC-1的基因遗传背景下，重组人碱性成纤维生长因子的表达量由57mg/kg糙米提高到150mg/kg，提高了2.62倍。

采用相同方法将超量表达重组人乳铁蛋白(LF)品系与LGC-1杂交，经过分子标记辅助选择，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有LGC-1的基因遗传背景下，重组人LF的表达量由1.5g/kg糙米提高到6.1g/kg，提高了4.07倍。

这些实例充分证明了通过降低内源蛋白含量，缓解内质网胁迫，为重组蛋白提供更多转录、转译、蛋白转运和储藏的空间可以提高蛋白表达的假设。

因此，本发明提供一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达量的方法，所述方法包括通过缓解水稻胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径来提高重组蛋白的表达量。

其中所述缓解水稻胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径的方法选自下述方法的一种或几种结合：

1)自然育种与选育；

2)利用基因编辑技术敲除内源储藏蛋白基因降低内源蛋白表达；

3)利用内源蛋白的自然突变降低内源蛋白表达。

本发明方法中，所述自然育种与选育包括下述步骤：

(1)以水稻胚乳生物反应器表达外源蛋白稳定的水稻品种为亲本A，以天然Gt1储藏蛋白基因突变体LGC-1或其他储藏蛋白基因突变体为亲本B，，将亲本A与亲本B进行有性杂交，获得F1代种子；

(2)利用种植F1代种子，收获单株种子，再次种植得到F2代群体；

(3)从F2代群体中，筛选分子标记辅助选择方法筛选具有LGC-1基因的单株，利用用于鉴定Lgc-1和重组蛋白特异性分子标记引物进行PCR扩增，获得具有LGC-1和重组蛋白基因阳性的单株，在成熟时F2代并收获种子；然后对对LGC-1阳性单株的重组人血清白蛋白、重组人乳铁蛋白和重组人成纤维细胞生长因子进行表达量的筛选，

(4)在F3代选择表达量最高的单株进行纯合子检测，筛选纯合子单株种植得到F4代群体；

(5)从F4代群体中，选择农艺性状稳定，LGC-1和重组蛋白基因纯合的单株。进行加代观察重组蛋白表达量和农艺性状，选择农艺性状和重组蛋白表达量不再分离的单株，培育成高效表达重组蛋白的品系。

其中所述的亲本A为选自水稻胚乳特异性启动子介导表达重组人血清白蛋白、重组人乳铁蛋白和重组人成纤维细胞生长因子和其他任何在胚乳细胞表达重组蛋白的水稻品种；本领域技术人员可以理解，其他的由水稻胚乳特异性启动子介导的表达重组蛋白的水稻品种也适用于本发明的方法。

本发明方法中，包含亲本A与亲本B之间的有性杂交，亲本A与亲本B均可以作为母本或父本。

根据本发明的另一方面，本发明方法也可以利用基因编辑(CrisprCas9或 TALEN技术)技术敲除水稻储藏蛋白基因，降低内源储藏蛋白的含量，来缓解内质网胁迫，提高重组蛋白在水稻胚乳细胞的表达，所述使用CrisprCas9技术的基因编辑方法包括以下步骤：

(a)根据水稻储藏蛋白基因序列设计特异性的设计CrisprCas9；

(b)构建CrisprCas9表达载体，采用35S启动子介导CrisprCas9的表达；

(c)利用具有CrisprCas9载体通过农杆菌介导的遗传转化愈伤组织，通过特异性PCR鉴定定点敲除水稻内源储藏蛋白基因的转基因植株；

(d)通过加代和分子标记辅助选择获得遗传稳定的内源储藏蛋白基因敲除植株，并以此为遗传转化受体，表达重组蛋白。

有益效果：

本发明方法通过降低内源储藏蛋白含量可以缓解内质网胁迫，显著提高胚乳生物反应器的外源重组蛋白表达水平，可提高表达量2-4倍，降低成本2-4倍。

附图说明

图1 Unfolding Protein Response示意图，显示ER胁迫引起ERAD接到的 UPR途径；

图2通过缓解内质网胁迫提高重组蛋白表达的示意图；

左图：在水稻胚乳细胞正常蛋白质合成与转运；中图：超量表达重组蛋白引起内质网胁迫，造成重组蛋白转运受阻，引起ERAD介导UPR蛋白降解途径；右图：通过降低内源蛋白量缓解ER胁迫，恢复重组蛋白在胚乳细胞的正常转运，从而提高重组蛋白的表达。

图3为转HSA基因品系改良前后的Western Blot比较结果；

利用低谷蛋白突变体杂交，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有 LGC-1的基因遗传背景下，重组人血清白蛋白的表达量由2.76g/kg糙米提高到 9.6克/kg，提高了3.47倍。泳道1-4为杂交后的重组人血清白蛋白表达量；泳道 5为杂交前的供体重组人血清白蛋白的表达量。

图4为转HSA基因品系改良前后的SouthernBlot结果图；

泳道1：4-114-7-2(供体)；泳道2：114-7-9-9-37；泳道3：114-7-9-4-7；泳道 4：114-7-9-9-9；泳道5：114-7-9-9-120。EcoRI限制性内切酶消化，HindIII限制性内切酶消化。野生型谷蛋白基因的理论杂交片段大小是8.5kb，而LGC-1突变体的则是5kb。

Southern Blotting结果显示：杂交后的HSA基因拷贝数没有变化；而转HSA 基因的4-114-7-2的基因组DNA由HindⅢ酶切后，采用LGC-1特异性探针，杂交产生的条带大小为8.5kb，而其他几个株系产生的条带大小为5kb，同时由 EcoRⅠ酶切后杂交产生的片段要比其他株系酶切后产生的片段大一点，说明与理论值相同，说明4-114-7-2是不含有LGC-1突变基因，而杂交选育后的株系含有LGC-1突变。

图5，转HSA基因品系经杂交整合LGC-1基因后，内源谷蛋白的变化。 A为谷蛋白；B为球蛋白；

泳道1：TP309；泳道2：4-114-7-2；泳道3：4-114-7-9-9-37-36；泳道4： 4-114-7A-9-9-37-83；泳道5：4-114-7-9-9-37-101；泳道6：4-114-7--4-7-132；泳道7：4-114-7-L-4-7-233。

通过Western Blotting比较对照TP309和没整合LGC-1的转HSA基因和整合LGC-1基因的不同品系胚乳蛋白中谷蛋白的含量，在以非转基因品种TP309 的谷蛋白含量最高，而高表达OsrHSA品系中谷蛋白含量明显低于不含有LGC-1 突变供体品种的含量，但各品系中球蛋白的含量则没有明显差异。

图6超量表达和降低内源蛋白对缓解内质网胁迫的效果

在超表达重组蛋白的胚乳细胞的出现明显的内质网胁迫，蛋白体细胞学形态出现明显改变；在降低内源蛋白后，胚乳细胞的蛋白体形态明显改善；对照 TP309蛋白体形态。

图7为转bFGF基因品系改良前后的PAGE结果比较；

经整合LGC-1基因后，bFGF蛋白含量显著高于未整合LGC-1基因的品系。利用低谷蛋白突变体杂交，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有LGC-1 的基因遗传背景下，重组人碱性成纤维细胞生长因子的表达量由57mg/kg糙米提高到150mg/kg，提高了2.67倍。

图8为转LF基因品系改良前后的PAGE结果比较；

利用低谷蛋白突变体杂交，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有 LGC-1的基因遗传背景下，重组人乳铁蛋白子的表达量由1.5g/kg糙米提高到 6.1g/kg，提高了4.07倍。

图9CrisprCas9定向敲除基因的示意图。

Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域(RuvC-likedomain和HNH domain)，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA以及tracrRNA结合成复合物，通过PAM(NGG)序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

图10CrisprCas9敲除储藏蛋白基因的表达盒构建PCR的检测图；

根据水稻内源球蛋白设计两个靶位点，3靶点使用U6a启动子，1靶点使用 U6b启动子，第一轮PCR分别用U-F/靶点接头反向引物(1PCR第一泳道)，和用靶点接头正向引物/gR-R(1轮PCR第二泳道，其中接头正向引物/gR-R产物长度恒定，约140bp)；第二轮为Overlapping PCR,双靶点分别用位置特异引物对PT1，PT2R扩增出表达盒产物(2轮PCR泳道)(Maker为1kb plus)。

图11CrisprCas9载体构建阳性克隆PCR检测图；

使用载体通用引物SP-ML与3靶点接头反向引物进行PCR检测，产物片段大小为U6a启动子大小，约629bp，泳道1-11为待检样品，泳道12为阴性对照 (Maker为1kb plus)。

图12CrisprCas9载体酶切检测图；

使用MluI酶切CrisprCas9质粒，获得sgRNA表达盒切，大小为1259bp，对照为为酶切质粒(Maker为1kb plus)。

图13pYLCRISPRCas9Pubi-H-Glb测序比对；

使用CRISPRCas9载体上通用引物SP-R测序，获得的测序结果(深色箭头) 与pYLCRISPRCas9P35S-H-Glb比对，sgRNA表达盒上球蛋白靶位点序列以及启动子序列完全正确。

图14pYLCRISPRCas9Pubi-H-Glb质粒图谱；

质粒为35S启动子驱动的潮霉素抗性，球蛋白两靶点分别使用U6a与U6b 启动子串联。

图15CrisprCas9载体转农杆菌EHA105阳性克隆PCR检测图。

使用3靶点接头正向引物与1靶点接头反向引物进行PCR检测，产物片段大小为U6b启动子大小，约515bp，泳道1-10为待检样品，泳道11为阳性对照，泳道12为阴性对照(Maker为1kb plus)。

具体实施方式

下文将通过实施例和附图以详细说明本发明的技术方案，从而更好地阐述本发明的特点和优势。所提供的实施例应被解释为对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的技术方案。

材料来源：

亲本A：转HSA基因水稻品系4-114-7(PNAS.USA,2011，108(47): 19078-19083)

转BFGF基因水稻品系277-122-2(ZL2012105534797.4)

转LF基因水稻610-3-2(ZL201310131488.7)

亲本B：LGC-1品系(南京农业大学)

pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F)和CRISPR/sgRNAvectors菌种(DH10B)：华南农业大学

【实施例1】利用低谷蛋白品系提高HSA的表达量

转HSA基因人血清白蛋白水稻4-114-7与LGC-1品系杂交得到F1代，种植形成F2代单株。田间选择具有LGC-1的性状特点的单株共500株，利用LGC-1 插入位点特异性引物(LGC-1正引物Fc/LGC-1反向引物F5(Kusaba等，The Plant Cell 15.6(2003):1455-1467)和HSA插入位点特异性引物(HSA‐CHR1-F/HSA-2, HSA‐CHR1-R/HSA-1,HSA‐CHR4-F/HSA-1,HSA‐CHR4-R/HSA-2)进行PCR，选择具有HSA特异性插入以及LGC-1位点纯合的单株共65株，列为候选单株。

表1 LGC-1及HSA特异性插入位点的引物序列

待F2代候选单株成熟结实，取1g米粉加入5ml的HSA提取液(10mM Na₂HPO₄﹒12H₂O、2mM NaH₂PO₄、8.5mM NaAc、10mM(NH₄)₂SO₄、7.2mM 辛酸钠、0.1mM乙酰色氨酸，定容至1L，调节pH为7.5)室温垂直旋转提取 1h，取上清液利用ELISA方法进行HSA蛋白含量检测。(方法参考：Proc.Natl. Acad.Sci.USA,2011，108(47):19078-19083)，选择其中表达量最高的5个单株进行纯合子鉴定，结果显示均为纯合子，5个候选单株种植形成F3代，每个单株种植200个单株。

从F3代群体中，继续筛选矮杆、直立穗具有LGC-1性状的株系，每株系随机选择不低于16个单株的叶片混合研磨并提取DNA，使用HSA插入位点两侧特异性分子标记引物(HSA‐CHR1-F/HSA‐CHR1-R,和HSA‐CHR4-F和 HSA‐CHR4-R)进行PCR扩增，均能够得到证明其为相应重组蛋白的唯一的6.5kb 和4.3kb大小的特异性条带，测序确认为HSA完整片段；每个株系中随机选择不低于4个单株分别提取其DNA，利用Lgc-1的分子标记引物(LGC-1正引物 Fc/LGC-1反向引物F5)进行PCR扩增，每个株系的随机4个单株均能得到唯一一条约1.5kb大小的条带，测序确认为LGC-1突变片段，剔除非LGC-1性状的单株，剩余单株混收得到表达量提高的新品系，利用ELISA检测新品系的蛋白含量，结果显示新品系的蛋白表达量为9.6g/kg，为原品系(2.76g/kg)的3.47 倍。

对杂交后的纯合株系的Southern杂交分析，理论杂交结果野生型的谷蛋白基因的杂交片段大小是8.5kb，而LGC-1突变体的则是5kb。Southern Blotting 结果显示：杂交后的HSA基因拷贝数没有变化(图4)；而转HSA基因的4-114-7-2 的基因组DNA由HindⅢ酶切后，采用LGC-1特异性探针，杂交产生的条带大小为8.5kb，而其他几个株系产生的条带大小为5kb，同时由EcoRⅠ酶切后杂交产生的片段要比其他株系酶切后产生的片段大一点，说明与理论值相同，说明 4-114-7-2是不含有LGC-1突变基因，而杂交选育后的株系含有LGC-1突变基因 (图4)。

为了证明是否缓解了内质网胁迫，我们分析了内源谷蛋白含量和胚乳细胞学结构。结果显示：在与LGC-1品种杂交后的转基因后代的内源储藏蛋白的古蛋白和球蛋白均显著降低(图5)；在超表达重组蛋白的水稻胚乳细胞的蛋白体 I和蛋白体II形态较阳性对照水稻胚乳细胞TP309显著变小和增多，有一些蛋白体结构还留在内质网腔内，不能从内质网分离形成正常的蛋白体结构；而在降低内源蛋白表达的水稻胚乳细胞不论是蛋白体I和蛋白体II没有保留在内质网腔内，蛋白体的结构恢复到接近正常形态(图6)。

【实施例2】利用上述方法提高bFGF的表达量

转bFGF基因重组碱性成纤维细胞因子水稻277-122-2与LGC-1品系杂交得到F1代，种植形成F2代单株。田间选择具有LGC-1的性状特点的单株共500 株，利用LGC-1特异性引物(LGC-1正引物Fc/LGC-1反向引物F5)和bFGF 插入位点特异性引物(bFGF‐CHR1-F/bFGF-2,bFGF‐CHR1-R/bFGF-1,)进行PCR，选择具有bFGF特异性插入以及LGC-1位点纯合的单株共109株，列为候选单株。

表2 LGC-1及bFGF特异性插入位点的引物序列

待F2代候选单株成熟结实，取1g米粉加入5ml的BFGF提取液(20mM PB， 250mMNaCl，5mM EDTA，2mM还原型谷胱甘肽，pH7.2)室温垂直旋转提取 1h，取上清液利用ELISA方法进行bFGF蛋白含量检测(Parsi MK等，Matrix Biol., 2010；29(5):393-401)，选择其中表达量最高的5个单株进行纯合子鉴定，结果显示均为纯合子，将5个候选单株种植形成F3代，每个单株种植200单株。

从F3代群体中，继续筛选矮杆、直立穗具有LGC-1性状的株系，每株系随机选择不低于4个单株的叶片混合研磨并提取DNA，使用BFGF插入位点两侧特异性分子标记引物(bFGF-CHR1-F/bFGF-CHR1-R)进行PCR扩增，全部都得到证明其为相应重组蛋白的唯一的3.0kb大小的特异性条带，测序确认为 BFGF完整片段；每个株系中随机选择至少4个单株分别提取其DNA，利用Lgc-1 的分子标记引物(LGC-1正引物Fc/LGC-1反向引物F5)进行PCR扩增，选择具有把bFGF特异性插入以及LGC-1位点纯合的单株列为候选单株。取F4代纯合株系的种子，取1g米粉加入5ml的bFGF提取液(50mM pH7.5的PB、1mM EDTA、1mM L-还原型谷胱甘肽、250mMNaCl)室温垂直旋转提取1h，取上清液利用ELISA方法和蛋白免疫印迹法检测新品系的蛋白表达量，结果显示新品系的蛋白表达量为150mg/kg，为原品系(57mg/kg)的2.67倍(图7)。

【实施例3】利用上述方法提高LF的表达量

转LF基因重组人乳铁蛋白水稻610-003-2与LGC-1品系杂交得到F1代，种植形成F2代单株。田间选择具有具有矮秆直立穗的单株共500株，利用LGC-1 特异性引物(LGC-1正引物Fc/LGC-1反向引物F5)和LF插入位点特异性引物 (LF‐CHR4-F/LF-2,LF‐CHR4-R/LF-1,LF‐CHR8-F/LF-1,LF‐CHR8-R/LF-2)进行 PCR，选择具有LF特异性插入以及LGC-1位点纯合的单株共80株，列为候选单株。

表3 LGC-1及LF特异性插入位点的引物序列

待F2代候选单株成熟结实，取1g米粉加入5ml的hLF提取液(20mM Tris， 25mMNaAC，200mM NaCl，pH6.5)室温垂直旋转提取1h，取上清液利用ELISA 方法进行LF蛋白含量检测(Gomes JA等，Neurocrit Care 21:285-93(2014)，选择其中表达量最高的5个单株，采用点杂交的方式进行纯合子鉴定，鉴定结果全部为纯合子，将5个候选单株种植形成F3代，每个单株种植200株。

从F3代群体中，每株系随机选择不低于16株单株的叶片，混合研磨提取 DNA，使用LF插入位点两侧特异性分子标记引物(LF-CHR6-F/LF-CHR6-R， LF-CHR8-F/LF-CHR8-R)进行PCR扩增，选择具有把bFGF特异性插入以及 LGC-1位点纯合的单株列为候选单株，取F4代纯合株系的种子，取1g米粉加入5ml的LF提取液(20mMTris、15mMNaAC，150mMNaCl，pH6.5)室温垂直旋转提取1h，取上清液利用ELISA和和蛋白免疫印迹法检测该品系的LF蛋白含量，结果显示新品系的蛋白表达量为6.1g/kg，为供品系OsrLF的表达量的 (1.5g/kg)的4.07倍(图8)。

【实施例4】利用CrisprCas9技术降低内源储藏蛋白含量提高重组蛋白表达

(1)菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F)和 CRISPR/sgRNAvectors菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养用于提取质粒。

(2)靶点接头制备：将接头引物TE(提供引物序列)溶解成100μM母液，各取1μl加入到98μl 0.5x TE混合稀释到1μM。约90℃30s，移至室温冷却完成退火。

(3)sgRNA载体酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒(提供来源)各1 μg，在25μl反应用10U Bsa I酶切20min，冷冻保存。

(4)sgRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应。

(5)第一轮扩增：每个sgRNA表达盒分为2个PCR反应，各15μl反应体系：取0.5μl连接产物为模板，使用表4引物U-F/接头反向引物(反应1)，和接头正向引物/gR-R(反应2)，各0.2μM,适量高保真PCR酶。25-28循环： 94℃10s，60℃15s，68℃20s。

(6)第二轮PCR：

按表4通用引物所述，预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5 μM：

引物组合

1个靶点：PT1R；

2个靶点：PT1，PT2R；

3个靶点：PT1，PT2，PT3R；

4个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4R；

5个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5R；

6个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6R；

7个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7R；

8个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，PT8R

(7)根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化。

(8)双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应，用变温循环进行酶切连接约10-15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。

(9)连接产物转化(电激法)：将连接产物进行过柱脱盐。取1-1.5μl连接产物电激转化E.coli DH5α感受态细胞，电激后加入1ml SOC，37℃培养1-1.5 h，4000rpm/min离心2min后全部涂板，37℃培养12-16小时。

(10)提取质粒，AscI酶切电泳检测sgRNA表达盒连接片段；导入农杆菌，获得的克隆电激转化农杆菌(EHA105)。

表4.sgRNA表达盒通用引物

农杆菌介导的遗传转化过程

1.愈伤诱导

(1)将成熟的种子脱壳后用70％酒精浸泡灭菌1min，20％次氯酸钠再处理30min；

(2)用灭菌单蒸水清洗5-7次；

(3)将处理好的种子接种到诱导培养基上，每皿接种6-8粒；

(4)在32℃、光照下处理大约5-7天。

2.农杆菌准备

将准备浸染的农杆菌进行扩大培养。在相应抗性平皿中涂菌，28℃培养箱中培养2－3天。

3.农杆菌悬浮培养准备

将培养好的农杆菌用接种环挑取到悬浮培养基中，28℃摇菌培养。一般 100ml培养基可用接种环刮入3至4环。

4.农杆菌侵染(共培养)

(1)将愈伤组织转移到一灭菌的三角瓶中；

(2)调整农杆菌悬浮液OD600值于0.05-0.1之间；

(3)将种子悬浮在AAM培养基中，侵染90s，其中不停要摇晃，轻幌1.5min；

(4)弃菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30-45min(最好尽快用滤纸吸干菌液)；

(5)把无菌滤纸放在2N6-AS培养基上。再把含有AS的500uL AAM滴在直径9cm的无菌滤纸上，把侵染过的愈伤放在滤纸上，25度黑暗共培养3天。

5.水洗和筛选

(1)将已经经过共培养的愈伤组织转移到一灭菌的三角瓶中；

(2)用灭菌单蒸水清洗5-7次愈伤；

(3)用含有0.5g/L浓度的头孢霉素灭菌水浸泡愈伤组织大约30min(同样可封好口后，于28度，180-200RPM摇20－30min)；

(4)倒去含有抗生素的灭菌水后，将三角瓶倒置于含滤纸的灭菌培养皿中大约15min；

(5)将愈伤在灭菌的滤纸上晾干；

(6)转移愈伤组织到相应抗性的筛选培养基上筛选(20-30天)。

6.分化

(1)将已经经过筛选得到的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，每皿接种 7个左右；

(2)在26℃光照培养，大约需20－30天。

7.生根

(1)从分化培养基的瓶中挑选出要做生根的苗子，注意同一块愈伤所生长出来的苗子只选取一棵；

(2)同时剪掉所有原有的根，要注意的是不要剪掉分生组织；

(3)将处理过的苗子转移到生根培养基，在28℃光照培养30天。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

武汉禾元生物科技股份有限公司

<120> 一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达水平的方法

<130> WH1190-18P122154

<160> 36

<170> PatentIn version 3.3

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Claims

1.一种提高转基因水稻的胚乳生物反应器中重组蛋白表达量的方法，所述方法包括通过缓解转基因水稻的胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径来提高重组蛋白的表达量；

其中所述缓解转基因水稻的胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径的方法选自下述方法：自然育种与选育；

所述的转基因水稻选自水稻胚乳特异性启动子介导表达重组人血清白蛋白、重组人乳铁蛋白和重组人成纤维细胞生长因子的转基因水稻品种；

在自然育种与选育中，将所述转基因水稻与低谷蛋白品系分别作为亲本，其中所述转基因水稻亲本为：转人血清白蛋白基因水稻品系4-114-7、转人成纤维细胞生长因子基因水稻品系277-122-2、或转人乳铁蛋白基因水稻品系610-3-2；

低谷蛋白品系亲本为：LGC-1品系。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述自然育种与选育包括下述步骤：

(1)以水稻胚乳生物反应器表达外源蛋白稳定的水稻品种为亲本A，以天然Gt1储藏蛋白基因突变体LGC-1为亲本B，将亲本A与亲本B进行有性杂交，获得F1代种子；

(3)从F2代群体中，筛选分子标记辅助选择方法筛选含有LGC-1基因的单株，利用用于鉴定Lgc-1和重组蛋白特异性分子标记引物进行PCR扩增，获得具有LGC-1和重组蛋白基因阳性的单株，在成熟时F2代并收获种子；然后对LGC-1阳性单株的重组蛋白进行表达量的筛选；

(5)从F4代群体中，选择农艺性状稳定，LGC-1和重组蛋白基因纯合的单株,进行加代观察重组蛋白表达量和农艺性状，选择农艺性状和重组蛋白表达量不再分离的单株，培育成高效表达重组蛋白的品系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中，包含亲本A与亲本B之间的有性杂交，亲本A与亲本B作为母本或父本。