WO2004056993A1 - 種子中のタンパク質含量が低減した植物ならびにその作出法および利用法 - Google Patents

種子中のタンパク質含量が低減した植物ならびにその作出法および利用法 Download PDF

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WO2004056993A1
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Masaharu Kuroda
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Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Bio-Oriented Research Organization
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Definitions

  • the present invention relates to improving the function of a plant. More specifically, the present invention relates to a method for reducing the expression of a storage protein and a method for efficiently expressing a foreign protein, and an antisense construct, an RNAi construct, a composition, a device, and the like used for them. In another aspect, the present invention relates to a method for expressing a protein of interest in place of a native protein. Background art
  • the protein content in the seeds is estimated to be several percent to 10%, and most of them exist in the form of storage proteins.
  • the stored protein is a source of nitrogen during germination, and has no other physiological functions. Have been.
  • proteins are roughly classified into four groups based on their solubility: glutelin, prolamin, globulin, and albumin.
  • glopurin is often the main storage protein, while in monocotyledons such as cereals, prolamin is the main storage protein with some exceptions (J. Exp. Botany 53: 9 4 7-9 5 8 (200 2)).
  • glutelin is the major storage protein in cereals, accounting for 60-70% of the seed protein.
  • the glutelin gene group is composed of about 10 genes per haploid genome, and these gene groups show 60 to 65% homology at the amino acid level in the coding region.
  • G 1 uB G 1 uB.
  • each subfamily contains about 5 genes showing homology of 80% or more at the amino acid level.
  • Glutelin is evolutionarily related to legume storage protein globulin and has a relatively rich amino acid composition and high nutritional value. When probolamin makes up 20-30% of rice seed protein, it has the second highest content after glutelin. It is characterized by high amounts of glutamine and relatively high amounts of proline, but very few essential amino acids, lysine and low nutritional value.
  • prolamin has a plurality of genes having similar structures with slightly different amino acid sequences in the genome, and the total number is estimated to be between 25 and 100.
  • globulin with a molecular weight of 26 KDa accounts for several percent.
  • storage proteins accumulate in granular intracellular structures called protein bodies. If the seeds are to be protein factories, the protein bodies act as protein storage.
  • Rice is also characterized by the fact that two types of protein bodies with completely different origins and appearances coexist in endosperm. Protein body 1 (accumulates prolamin) and protein body 2 (where glutelin and globulin Accumulation) 28: 151 7-1527 (1987); P ant P hysiol.
  • the RNAi phenomenon is used to suppress the expression of a storage protein.However, by using a construction gene having an optimal structure, the efficiency of expression suppression is greatly increased, and technically, Significant progress is being made.
  • Another problem common to low glutelin rice strains is that glutelin is greatly reduced compared to the original cultivar, but the reaction is a marked increase in prolamin. This is due to the fact that, in general, a regulatory mechanism is working to keep the protein in the seed constant, and it senses the lack of glutelin to increase prolamin synthesis. In that sense. Low glutelin strains, even rice with modified storage protein composition, have not been sufficiently successful in reducing protein.
  • Prolamin is considered to be poor in nutritional value, poor in digestibility, and degraded in cooking characteristics of rice and the taste of cooked rice. Although some mutant rice is already known (Iida, S. eta 1. (1997) Theor. Ap. 1. Genet. 94, 177-183; lida, S. etal. (1993) Theory. Ap pl. Ge net. 87, 374-378; Breeding studies 4 (Annex 1) 66 (2002); Breeding studies Magazine 47 (Ex. 2) 632 (1997); Breeding Journal 47 (Ex. 2) 176 (199 7); Breeding Journal 45 (Ex. 2) 502 (1995); and Breeding Journal 45 (Ex.
  • seeds have a long history of eating as a food, so they have the advantage of low risk of contamination with harmful substances, and they can be eaten without any special refining operations.
  • the use of seeds with reduced storage protein may increase expression, as surplus amino acids are efficiently diverted to foreign protein synthesis.
  • the amount of stored proteins was reduced and replaced with useful proteins, it could function as a nitrogen source, so it would be unlikely that there would be any problems with seed physiology.
  • the signal sequence of the storage protein prolamin is highly homologous not only in the same species but also in grass seeds, such as wheat, corn, and corn storage proteins.Therefore, these sequences are used to integrate proteins in protein body 1. It could be possible.
  • Low protein rice is useful because it can remove protein with little effort when using rice protein in some form. It is also preferable that the protein is low in protein as a raw material for general edible rice and rice processed foods. 1 9 9 5); “Seed Bioscience” Seed Physiological and Biochemical Research Society, edited by Academic Society Press Center 4. Rice processed products 3 5 9— 3 6 5 (1 995) and “Seed Bioscience” Seed Physiological and Biochemical Research Society, edited by Academic Society Publishing Center 5. Sake and Sake 36 6-3 7 1 (1995)) Power In areas where needs are increasing in recent years, allergen-reduced rice materials can be considered. It is said that people who have some allergies account for about 1/3 of Japanese people, and among them, rice patients, who had not had much allergy in the past, are increasing allergy sufferers.
  • Allergens in rice are mainly globulin proteins.
  • globulin proteins For example, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-170400, an attempt is made to remove globulin proteins by applying a protease to rice to remove allergens. ing.
  • Japanese Patent Publication No. 3055 729 discloses a method of dissolving and removing allergens from low protein rice as a raw material by alkali washing. In all cases, since the main objective is to remove proteins, low protein rice should be more effective in extracting and removing proteins.
  • the present invention provides a method for reducing the protein content of seeds and a technique necessary for the method, a plant developed by such a method and seeds thereof, and a method for using such plants and seeds. Make it an issue. Disclosure of the invention
  • antisense molecules complementary to at least a portion of the gene sequence encoding certain prolamins significantly reduce the overall expression of prolamin multigenes.
  • the inventors have found that the protein content of seeds can be reduced, thereby solving the above problem.
  • the present invention provides the following.
  • nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence having a length of at least 15 contiguous nucleotides complementary to the gene sequence encoding the prolamin polypeptide.
  • nucleic acid molecule of claim 1 wherein said complementary at least 15 consecutive nucleotides are at least 50 discontinuous nucleotides.
  • nucleic acid molecule according to item 1 wherein the complementary nucleic acid sequence having a length of at least 15 consecutive nucleotides includes a complementary sequence of a full-length sequence encoding the prolamin polypeptide.
  • nucleic acid molecule according to item 1, wherein the nucleic acid sequence having at least 15 consecutive nucleotides; S is the 5 'end of the nucleic acid sequence encoding the prolamin polypeptide.
  • nucleic acid molecule according to item 1 wherein the at least 15 consecutive nucleotides in length are 50 nucleotides or less in nucleotide length.
  • nucleic acid molecule according to item 1, wherein the complementary at least 15 consecutive nucleotides have a nucleotide length of 30 nucleotides or less.
  • the complementary at least 15 consecutive nucleotides have a length of at least 15 nucleotides in a nucleic acid sequence encoding one amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 98 to 101. 3.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of 8, 40, 42, 44 and 46 at least one or several amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion.
  • DNA allele consisting of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of 23, 25, 27, 29, 31, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 and 45 A polynucleotide that is a genetic variant;
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 20, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 3 A polynucleotide encoding a species homolog or ortholog of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: selected from the group consisting of 8, 40, 42, 44 * 3 and 46;
  • polynucleotide of any one of (a) to (e) or a complementary sequence thereof;
  • a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 70% identity to a polypeptide and encoding a polypeptide having biological activity;
  • nucleic acid molecule of item 1 comprising a nucleic acid sequence at least 15 contiguous nucleotides in length that is complementary to:
  • nucleic acid molecule according to item 13 wherein the antisense activity reduces the expression of the prolamin polypeptide.
  • A at least a nucleic acid sequence having a length of at least 15 contiguous nucleotides derived from a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide or the nucleic acid sequence having a complementary length of at least 15 contiguous nucleotides;
  • a nucleic acid sequence A comprising about 70% homologous nucleic acid sequence;
  • nucleic acid sequence B for a nucleic acid sequence having at least 15 contiguous nucleotides complementary to a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide or the complementary nucleic acid sequence having at least 15 contiguous nucleotides
  • a nucleic acid sequence B comprising at least about 70% homologous nucleic acid sequence
  • a nucleic acid molecule A nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule according to item 16, wherein the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B include portions that are substantially complementary to each other.
  • nucleic acid molecule according to item 16, wherein the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B are substantially complementary to each other.
  • nucleic acid molecule according to item 16 further comprising a spacer sequence.
  • the spacer sequence includes an intron sequence.
  • nucleic acid molecule according to item 19, wherein the spacer sequence is included between the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B.
  • nucleic acid set comprising at least about 70% homologous nucleic acid sequence B.
  • nucleic acid cassette according to item 23 further comprising a nucleic acid sequence encoding a foreign gene.
  • nucleic acid cassette according to item 25 further comprising a spacer sequence.
  • spacer sequence includes an intron sequence.
  • nucleic acid cassette according to item 25 further comprising a signal sequence.
  • the signal sequence is a signal sequence of a storage protein.
  • 29. The nucleic acid cassette according to 29.
  • nucleic acid cassette according to item 24 further comprising a promoter sequence.
  • the promoter sequence is operably linked to both the foreign gene and the nucleic acid sequence B.
  • the promoter sequence operably linked to the foreign gene (promoter sequence A) and the promoter sequence operably linked to the nucleic acid sequence B (mouth motor sequence B) are different from each other.
  • the above promoter sequence B is composed of porubiquitin promoter, 26k globulin promoter, gnoreterin A promoter, gnoreterin B promoter 1, 16kDa prolamin promoter, 13kDa prolamin promoter and 10kD a
  • the nucleic acid cassette according to item 36 which is derived from a promoter selected from the group consisting of a prolamin promoter.
  • the nucleic acid cassette according to item 36 wherein the promoter sequence A is a promoter sequence naturally associated with the nucleic acid sequence B. 4 3.
  • the above promoter sequence A is composed of a 26 kDa globulin promoter, a geterin A promoter, a g ⁇ / thelin B promoter, a 16 kDa prolamin promoter, a 10 kDa prolamin promoter and a 13 kDa Item 36.
  • the nucleic acid cassette according to Item 36 which is derived from a promoter selected from the group consisting of prolamin promoters.
  • nucleic acid cassette according to item 33 comprising an in-frame signal sequence between the foreign gene and the promoter sequence.
  • nucleic acid cassette according to item 47 wherein the sequence of the terminator is a sequence of a terminator of 10 kDa prolamin.
  • nucleic acid cassette of item 25 further comprising a foreign gene, wherein the foreign gene is located upstream of the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B.
  • nucleic acid cassette according to item 49 comprising an intron sequence between the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B.
  • a method for producing a nucleic acid cassette comprising:
  • a betta comprising the nucleic acid molecule according to item 1.
  • the vector of item 53 further comprising a sequence having promoter activity.
  • the vector of item 53 further comprising a sequence encoding a selectable marker.
  • the vector according to item 53 further comprising a sequence encoding a foreign gene different from the nucleic acid molecule according to item 1.
  • a plant cell comprising the nucleic acid molecule according to item 1.
  • the plant cell according to item 60 further comprising a nucleic acid molecule encoding a foreign gene different from the nucleic acid molecule according to item 1.
  • a plant species from which the above prolamin is derived The plant cell according to item 60, wherein the plant species is rice.
  • a plant cell from which the above-mentioned prolamin is derived The plant cell according to item 60, wherein the above-mentioned plant species is a rice plant of Japonii species.
  • a plant tissue comprising the plant cell according to item 60.
  • a plant comprising the nucleic acid molecule according to item 1.
  • the plant according to item 68 further comprising a nucleic acid molecule encoding a foreign gene different from the nucleic acid molecule according to item 1.
  • the plant species from which the prolamin is derived The plant according to item 68, wherein the plant species is rice.
  • composition comprising the gene product of the exogenous gene produced from the plant according to item 69 or the seed according to item 76.
  • the method of introduction described above is the method described in item 79 by the agglomeration method.
  • Item 79 The method according to Item 79.
  • Item 83 The method according to Item 83.
  • G a step of isolating the gene product of the foreign gene from the seed
  • Item 83 The method according to Item 83.
  • composition comprising the gene product of the foreign gene produced by the method according to item 83.
  • nucleic acid molecule according to item 1 for reducing the expression level of a protein in a seed in a plant.
  • nucleic acid molecule according to item 1 for expressing a foreign gene in plant seeds.
  • FIG. 1 shows a modified version of an existing vector and promoter for facilitating the construction of a prolamin antisense gene cassette, a useful gene expression cassette and a vector using the same in Honoki.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the structure of a prolamin antisense gene vector actually constructed and introduced.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the seed protein of the LP 13K line (line into which the 13 kDa prolamin antisense gene cassette was introduced), which is the seed of the present invention, by SDS-PAGE electrophoresis.
  • the protein was detected by Coomassie brilliant blue staining.
  • Figure 5 shows that, among rice plants transfected with prolamin antisense gene expression cassettes of various structures, seeds were randomly selected for a line with a remarkable inhibitory effect, and anti-13kDa prolamin (Nipponbare) antibody was selected for its prolamin-reducing trait.
  • SDS-PAGE was followed by coomassie brilliant blue staining (using 15 ⁇ l of seed extract protein).
  • SDS-PAGE was followed by transfer to PVDF membrane, and estan analysis was performed with anti- 13 kDa prolamin (Nipponbare) polyclonal antibody (0.5 ⁇ l of seed extract protein was used). The relative ratio of the absorbance of the band is shown below the lane.
  • Figures 6 show images of LP 13K endosperm surface cells observed by transmission electron microscopy.
  • the observed image is presented as it is, and in b, the type of protein body is superimposed on it.
  • Protein body 1 is a gray spherical granule (prolamin accumulates). In b), it is indicated by a black triangle.
  • Protein body 2 is a rather large granule that looks dark (dark) in color (stores dalterin and globulin). In b), it is indicated by a white triangle.
  • FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE of seed proteins of various varieties and the results of Western analysis using an anti-13 kDa prolamin polyclonal antibody. 13 kDa prolamin, which responds well to antibodies, was detected in both the varieties of Japoni and Indy, indicating that the structure is highly conserved.
  • FIG. 8 shows an example of an expression vector structure used to verify the possibility of applying the present invention as a useful protein expression system.
  • FIG. 9 is a comparison of representative prolamin sequences.
  • FIG. 10 shows an experimental example and the results of electrophoresis in Example 8.
  • FIG. 11 shows the structure of a constructed gene used in a foreign gene expression experiment in rice seed using GFP as a model protein in Example 11; It was shown that simultaneous introduction of a 13 kDa prolamin expression suppression cassette, that is, reduction of storage proteins, enhances GFP expression.
  • FIG. 12 shows the structure of the constructed gene used in Example 12 based on the results of Example 11.
  • FIG. 13 shows the results of protein electrophoresis of rice seeds into which genes 5 and 6 of FIG. 12 have been introduced, and the results of quantification of the amount of GFP.
  • Figure 14 shows the results of directly confirming the N-terminal sequence of the protein that the signal sequence was cut off as expected and the correct GFP protein was expressed as designed for the constructed gene in Figure 12. It is. This demonstrates the superiority of the structure of the constructed gene of the present invention.
  • FIG. 15 is an example of Example 13 in which cystatin, which is an actually useful protein, was produced using the technology of the present invention. As expected, cystatin expression was achieved at levels far exceeding existing results.
  • FIG. 16 summarizes the regulation modes of storage protein composition in rice seeds, which were elucidated in the course of the present invention. This has clarified a method of efficiently converting amino acids used for storage proteins to foreign proteins, which is the basic theory of the present invention.
  • Figure 17 summarizes all the results and presents the concept of a universally useful construct gene for efficient foreign protein expression in seeds. Description of Sequence Listing
  • SEQ ID NO: 1 Nucleic acid sequence of 13 kDa prolamin (RM9)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of 13 kDa prolamin (RM9)
  • SEQ ID NO: 3 Nucleic acid sequence of 13 kDa prolamin (RM 1)
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of 13 kDa prolamin (RM 1)
  • SEQ ID NOS: 5-30 Representative 13 kDa prolamin sequence
  • SEQ ID NOS: 31-32 Representative 16 kDa prolamin sequence
  • SEQ ID Nos: 33-46 Representative lOkDa prolamin sequences
  • SEQ ID NO: 47 Promoter sequence derived from rice 10 kDa prolamin gene
  • SEQ ID NO: 48 Promoter sequence derived from rice glutelin B1 gene
  • SEQ ID NO: 49 Promoter sequence derived from C aMV35 S gene
  • SEQ ID NO: 50 Antisense of full length cDNA (SEQ ID NO: 1) encoding 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 51 N-terminal 67 bp antisense sequence of cDNA encoding 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 52 N-terminal 15 bp antisense sequence of cDNA encoding 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 54 hygromycin phosphotransferase
  • SEQ ID NO: 56 Modified gene mHP T amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 57 Selection marker expression cassette linked to the C aMV 35 S promoter and a nos terminator so as not to be cut by a restriction enzyme
  • SEQ ID NO: 58 Sequence of mRUb i P promoter
  • SEQ ID NO: 59 GUS gene fragment
  • SEQ ID NO: 61 A sequence of a 10 kDa prolamin terminator
  • SEQ ID NO: 62 Glutelin A3 promoter sequence
  • SEQ ID NOS: 63 to 72 Other exemplary sequences of antisense
  • SEQ ID NOS: 73 to 84 Corresponding amino acid sequences of exemplary sequences of antisense
  • SEQ ID NOS: 85 to 88 Characteristic motif of prolamin
  • SEQ ID NO: 90 RM5 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 94 RM4 nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 95 RM5 nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 96 RM7 nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 97 rice aspartate protease gene intron sequence
  • SEQ ID NO: 98 consensus sequence example 1 of 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 99 consensus sequence example 2 for 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 101 Example 4 of consensus sequence for 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 102 encoding nucleic acid sequence for consensus sequence example 1 for 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 103 coding nucleic acid sequence of consensus sequence example 2 for 13 kDa prolamin
  • SEQ ID NO: 104 encoding nucleic acid of consensus sequence example 3 for 13 kDa prolamin Array
  • SEQ ID NO: 105 consensus sequence example for 13 kDa prolamin Encoding nucleic acid sequence of 4
  • SEQ ID NO: 1 14 Glutelin B1 signal sequence (nucleic acid)
  • SEQ ID NO: 118 determined sequence in Example 11.
  • seed protein refers to a protein that accumulates in the seed of a crop. It is often classified according to the difference in solubility in solvents, and is broadly classified into water-soluble albumin, saline-soluble globulin, prolamin soluble in aqueous alcohol, and glutelin soluble in dilute acid or dilute alcohol. .
  • prolamin is a generic term for proteins that are soluble in about 50-90% aqueous alcohol, and cereal seeds are characterized by the fact that this prolamin-type protein is the main storage protein .
  • Each cereal has its own unique name, typical of which are wheat glutenin, omg hordin, corn and autogum vane, but in rice, it is simply called prolamin.
  • prolamin is the major protein that makes up 60-70% of the seed protein, followed by prolamin with a content of 20-30% and globulin at a few percent.
  • prolamin Although the molecular weight of prolamin often differs from plant species to plant species, a common feature is that their amino acid sequences are rich in glutamine and are contiguous (eg, G1n—G1n, G1n — Gin—Gin) or a region that appears for every certain amino acid (for example, G1nXaa-G1n—Xaa-G1n).
  • a motif consisting of several amino acids or more including proline and cysteine in addition to glutamine eg, G1uPhe-Va1-Arg-Gln-Gln-Cys-Ser-Pro (SEQ ID NO: 85)
  • Another feature is that they are commonly stored in the sequence. The positions of Cys residues involved in SS binding are well conserved.
  • prolamin gene is known to be present in multiple copies in the genome and to be a multigene. Proteins produced from each gene and having slightly different amino acid sequences are present in the seed in a mixture.
  • Rice prolamin is efficiently extracted by 55-60% of 1-propanol (Sugimo to, T. etal., Agric. Biol. Chem. 50, 2409-2410, 1986).
  • the number of genes is estimated to be 25 to 100 by genomic Southern analysis and cDNA cloning @ isoelectric focusing. These can be divided into several subfamilies, with different classification methods and protein designations depending on the researcher and the variety used in the experiment, but the most common classifications are 1 This is based on the molecular weight in two-dimensional SDS electrophoresis.
  • 13KDa prolamin includes 14KDa
  • 16KDa prolamin includes this 18KDa
  • each prolamin band is one in one-dimensional SDS electrophoresis, many types of proteins are mixed in it, and one or more of It is known that there are more than 3 kinds of 16 KDa, and 12 kinds of 13 KDa with the highest multiplicity.
  • 13K Da prolamin a detailed study based on the correspondence between protein spots and cDNA (Mitsukawa, Neta 1., PlantBiotec h.
  • prolamin can be determined by 1) dissolving in hydroalcoholic alcohol, 2) glutamine-rich amino acid sequence (at least 10% or more) or Very little lysine (3% or less) No power, 3) Glutamine residue appears every 1 to several amino acids, or multiple places where 2 or more glutamines appear consecutively 4) Glutamine And a sequence motif containing amino acids such as proline and cysteine (G1u—Phe—Va1—Arg—Gin—Gin—Cys—Ser—Pro (SEQ ID NO: 85), or Cy s—G 1 n -V a 1—Me t -G 1n— G ln— G ln—Cys-C ys—G 1 n—G 1 n (SEQ ID NO: 86) or 50% or more homology with it Motifs that have the same characteristics) I can separate.
  • proline and cysteine G1u—Phe—Va1—Arg—Gin—Gin—Cys—Ser—Pro (
  • the motif GlnGln-Cys-Cys-Gln-Gin (SEQ ID NO: 87) can be used for rice prolamin as well.
  • G 1 uP he -Va 1—Ar g—G in—G in (SEQ ID NO: 88) is highly conserved in lutenin, and is stored in rice prolamin, corn gliadin, otomegiabenin, etc. Have been.
  • cereal prolamin is recognized as a member of the prolamin gene superfamily, which shares the same ancestral gene, despite differences in molecular weight and low homology of the entire protein (Shewry, PE eta1 Plant C).
  • prolamins include, for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 13, 15, 17, 19, 21, 21, 23, 25, 27, 29 ( Selected from the group consisting of 13 kDa prolamin), 31 (16 kDa prolamin), 33, 35, 37, 39, 41, 43 and 45 (10 kDa prolamin).
  • any other prolamin gene can be used as long as it is a prolamin gene registered in gene punctures such as Genbank :, NCBI, EBML, and DDBJ.
  • 13KDa prolamin generally indicates a prolamin having a molecular weight of around 13KDa in Sap electrophoresis in Japonica rice, and is the most prolamin contained in rice.
  • the gene is more in the genome
  • it has been confirmed that there are at least 12 or more genes with slightly different amino acid sequences. It is estimated that the number is large.
  • SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27, or 29 The nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 12, 14, 16, 18, 20, 20, 22, 24, 26, 28 or 30 A prolamin containing an amino acid sequence, and a corresponding prolamin gene of another plant corresponding to the prolamin gene, but not limited thereto.
  • the term “storage protein” refers to a protein that is highly accumulated in plant seeds and has no other physiological functions in plants, such as enzymatic activity, and is usually accumulated in a protein body.
  • protein body refers to a granular intracellular structure that accumulates storage proteins. Normally, there is usually one species in one plant, but in rice and oats, two types of protein bodies with distinctly different appearance and morphology are formed. In the case of rice, there are two types, protein body type 1 that accumulates prolamin and protein body type 2 that accumulates gnoreterin and globulin. Both are distinctly different in appearance, morphology, size, origin, etc., and the correspondence between protein bodies and storage proteins is strictly controlled.
  • Prolamin conserved sequences useful in the present invention include the following.
  • an antisense sequence encoding such a conserved sequence can be exemplified as a preferable sequence.
  • System U1 Gin Val Met Gin Gin Gin Gin Cys Cys Gin Gin Leu Arg Leu Val Ala Gin Gin Ser His Tyr Gin Ala lie Ser Ser Val Gin Ala lie Val Gin Gin Leu Gin Leu Gin Gin (SEQ ID NO: 9 8)
  • Sequence 4 Tyr Phe Asp Gin Thr Gin Ala Gin Ala Gin Ala Leu Leu Ala Leu Asn Leu Pro Serlie Cys Glylie Tyr Pro Asn Tyr Tyr lie Ala Pro (SEQ ID NO: 101) It has been shown that sequences that are antisense to sequences encoding at least 5 amino acids can be used to actually suppress prolamin gene expression.
  • protein As used herein, the terms "protein,” “polypeptide,” “oligopeptide,” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. Amino acids may be natural or non-natural, and may be modified amino acids. The term can also be assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also encompasses naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptidomimetic compounds (eg, peptoids) and other known in the art. Modifications are included.
  • polynucleotide As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to any length Refers to a polymer of nucleotides. The term also includes “derivative oligonucleotides” or “derivative polynucleotides.” “Derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide that contains a derivative of a nucleotide or has unusual linkages between nucleotides, and is used interchangeably.
  • oligonucleotides include 2′-O-methyl-liponucleotide, derivative oligonucleotides in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, oligonucleotide, The phosphoric diester bond in N 3
  • oligonucleotide converted to phosphoramidate bond
  • Peracil in oligonucleotide is C Derivatives Oligonucleotides substituted with 5-propynylperacyl, Derivatives Oligonucleotides in which peracyl in oligonucleotides are substituted with C-5 thiazylperacyl, Cytosine in oligonucleotides is substituted with C-15 propiercytosine Derivative oligonucleotide, a derivative oligonucleotide in which cytosine in the oligonucleotide is replaced by phenoxazine-modified cytosine, a derivative oligo in which the lipose in DNA is replaced by 2,1-O-propy
  • nucleic acid sequence also includes conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and complementary sequences, as well as explicitly stated sequences. It is contemplated to include Specifically, degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons has been replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 508) 1 (1991); Oh tsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., MoI. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)) .
  • degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons has been replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue.
  • nucleic acid molecule is also used interchangeably herein with nucleic acids, oligonucleotides, and polynucleotides, and includes cDNA, mRNA, genomic DNA, and the like.
  • nucleic acids and nucleic acid molecules may be included in the term "gene”.
  • Nucleic acid molecules encoding a gene sequence also include “splice variants.”
  • a particular protein encoded by a nucleic acid includes any protein encoded by a splice variant of the nucleic acid.
  • splice variants are the products of alternative splicing of a gene.
  • an initial nucleic acid transcript may be spliced such that different (alternate) nucleic acid splice products encode different polypeptides.
  • the mechanism of production of splice variants varies, but involves alternative splicing of exons.
  • Another polypeptide derived from the same nucleic acid by read-through transcription is also included in this definition. Any product of a splicing reaction, including recombinant forms of the splice product, is included in this definition.
  • an “isolated” biological agent eg, a nucleic acid or protein
  • a nucleic acid or protein is another biological agent in the cells of an organism in which the biological agent occurs in nature.
  • a nucleic acid a nucleic acid containing a factor other than the nucleic acid and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid
  • a protein a protein containing a factor other than the protein and an amino acid sequence other than the target protein
  • isolated nucleic acids and proteins include nucleic acids and proteins that have been purified by standard purification methods.
  • isolated nucleic acids and proteins include chemically synthesized nucleic acids and proteins.
  • a “purified” biological agent eg, a nucleic acid or tamper
  • a purified biological agent means that at least a part of a factor naturally associated with the biological factor has been removed.
  • the purity of a biological agent in a purified biological agent is higher (ie, more concentrated) than the state in which the biological agent is normally present.
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually, they are arranged in a certain order on chromosomes, but extrachromosomal ones are also included in the category of genes as long as they define the genetic trait. It is called a structural gene that defines the primary structure of a protein, and a regulatory gene that controls its expression.
  • gene may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”.
  • gene product refers to "polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” expressed by a gene and Z or "protein” “polypeptide”, “oligopeptide” and “ Peptide ". Those skilled in the art can understand what a gene product is, depending on the situation.
  • homology of a gene (eg, nucleic acid sequence, amino acid sequence, etc.)
  • “Gender” refers to the degree of identity between two or more gene sequences relative to each other. Thus, the higher the homology between two genes, the higher the identity or similarity between their sequences. Whether the two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, by the hybridization method under stringent conditions. When two gene sequences are directly compared, the DNA sequences between the gene sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 8% identical. If 0%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, then the genes are homologous.
  • similarity of a gene refers to a conservative substitution positive (identical) in the above homology. Refers to the degree of identity between two or more gene sequences relative to each other. Thus, if there are conservative substitutions, identity and similarity will vary depending on the presence of the conservative substitution. In the absence of conservative substitutions, identity and similarity indicate the same value.
  • the comparison of similarity, identity, and homology of nucleotide sequences is calculated using BLAST, which is a sequence analysis tool, using default parameters.
  • BLAST a sequence analysis tool
  • the term "foreign gene” refers to a gene that is not naturally present in a plant. Such a foreign gene may be a gene obtained by modifying a gene naturally present in the plant, a gene naturally present in another plant, or a gene artificially synthesized. Or a complex thereof (for example, a fusion). Plants containing such foreign genes may express gene products that are not naturally expressed.
  • Th e B ioch em istryofthe Nucleic Acids, Ch a pma n & Ha l 1; S habarova, Z. eta 1. (1 994).
  • the “foreign gene” may be any gene as long as it can be expressed in a plant.
  • the “foreign gene” may be any that encodes a useful protein that is intended to be expressed in large amounts, and such Included in the range.
  • Such foreign genes include, for example, pharmaceutically active peptides (eg, cytokines (interleukins, chemokines, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M _CSF), hematopoietic factors such as granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), mu1ti-CSF (IL_3), erythropoietin (EPO), leukemia inhibitory factor (LIF), c-kit ligand (SCF), tumor Lung death factor, interferons, platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), etc.) , Hormones (insulin, growth hormone, thyroid hormone, etc.), vaccine antigens, blood products, peptides useful for agricultural production, such as antibacterial proteins, physiological actions and pharmacology Various enzymes and
  • Examples include, but are not limited to, artificial proteins designed to cut out peptides.
  • Nutritionally significant substances include, but are not limited to, casein, legumin albumin / globulin, and vitamins / sugar / lipid synthase.
  • proteins that enhance the palatability and functionality of foods such as cyclodextrin polysaccharides, ⁇ -aminoacetic acid and other specialty sugars and amino acids synthases
  • a group of proteins involved in the synthesis of pigments and taste components that enhance the appearance, or peptides that have physiological effects by undergoing enzymatic digestion in the gastrointestinal tract (eg, angiotensin converting enzyme inhibitors that have a blood pressure effect). But not limited to artificial proteins designed to excise the peptide.
  • sugar chain refers to a compound formed by linking one or more unit sugars (monosaccharides and / or derivatives thereof). When two or more unit sugars are linked, each unit sugar is usually bonded by dehydration condensation through a glycosidic bond.
  • sugar chains include, for example, polysaccharides contained in the living body (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, ⁇ -acetinol regolecosamine, ⁇ -acetylgalactosamine, and sialic acid, for example).
  • sugar chains decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteodalicans, glycosaminoglycans, and glycolipids. But not limited to them. Therefore, in the present specification, the sugar chain may be used interchangeably with “polysaccharide”, “saccharide”, and “carbohydrate”. Unless otherwise specified, the term “sugar chain” in this specification may include both a sugar chain and a sugar chain-containing substance.
  • a “monosaccharide” is a polyhydroxyaldehyde or polyhydroxyketone that is not hydrolyzed to simpler molecules and contains at least one hydroxyl group and at least one aldehyde or ketone group.
  • ⁇ refers to the dielectric.
  • the monosaccharide is represented by the general formula C ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ , but is not limited thereto, and includes fucose (doxyhexose), ⁇ -acetyl darcosamine, and the like.
  • ⁇ 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 are replaced by geos, triose, tetroses, pentose, and hex respectively.
  • Sauce heptose, ota toose, nonose and decos. Generally, they correspond to aldehydes or ketones of chain polyhydric alcohols. The former is called aldose, and the latter is called ketose.
  • a monosaccharide derivative refers to a substance resulting from the substitution of one or more hydroxyl groups on an unsubstituted monosaccharide for another substituent.
  • Examples of such monosaccharide derivatives include sugars having a carboxyl group (eg, aldonic acid in which the C-1 position has been oxidized to a carboxylic acid (eg, D-gluconic acid in which D-glucose has been oxidized), Sugars containing peronic acid (D-glucuronic acid in which D-glucose is oxidized) in which the C atom has become carboxylic acid, an amino group or a derivative of an amino group (for example, an acetylated amino group)
  • N-acetyl-D-darcosamine, N-acetyl-D-galactosamine, etc. sugars having both an amino group and a carboxyl group (eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid), N-acetylmuramic acid, etc.)
  • Deoxylated sugars for example, 2-deoxy D-report
  • sulfated sugars containing sulfate groups for
  • the term “monosaccharide” includes the above derivatives, or, in a saccharide having a hemiacetal structure, dalicoside having an acetal structure by reacting with an alcohol also falls within the range of the monosaccharide. is there.
  • asparagine-linked sugar chain structure is indicated by Takahashi et al.'S nomenclature (http: // w. Gak. Co.jp; In this specification, asparagine-linked sugar chain structure is indicated by Takahashi et al. Method (http: ⁇ ww. Gak. C0 . Jp; edited by Reiko Takazaki, Biochemistry Experiment Method 23, Glycoprotein Glycoprotein Research Method, Gakkai Shuppan Center, 1989; Takahashi N, i'omiya ⁇ ' ⁇ Analysis of Pp. 209-241, CRC Press, Boca Raton, FL, 1992.
  • glycoamidase A (1) In the case of N-acetyl lactosamine type (complex type) glycans, (A) the number of branches is indicated by the first number of three digits (B) reducing end When fucose is bound to the N-acetyldarcosamine in al, 6 bond, put 1 in the middle, and when not linked, put 0 in the middle of the three-digit number. (C) Core structure When N-acetyldarcosamine is linked to mannose of pentasaccharide by 1,4, put 1 at the end, and when not linked, put 0 at the end of the three-digit number. Place a.
  • N-acetylgalactosamine has galactose instead of galactose, add the symbol as galactose, and then N-acetyl is a if the number of ratatosamine is 1, b if it is 2, and (3 if (3, 5) 6) Core structure N-Acetyl lactosamine type if it can be classified into N-acetyl lactosamine type and high mannose type or mixed type such as pentasaccharide Give priority to the naming of 7) If sialic acid is present, write the number of sialic acid residues, then, if the sialic acid molecular species is N-acetylneuraminsan, enter A, and set the unique number.
  • Examples of such a display method include galactose ⁇ 1,4- ⁇ ⁇ - ⁇ -cetyldarcosamine ⁇ 1,2-mannose ⁇ ⁇ , 3- (mannose al, 3— (mannose a 1,6-) mannose ⁇ 1 , 6-) Mannose ⁇ 1,4- ⁇ -acetyl-darcosamine] 3,1,4- --acetyl-dalcosamine, which is referred to as ⁇ 5.12, but is not limited thereto.
  • the protein produced according to the present invention undergoes post-translational modification in plants, and a specific sugar chain is bound thereto.
  • Such sugar chains are preferably the same when used in animals, and can be used without any problem if the modification in plants is the same. There is no. In addition, even if the sugar chains are modified in a different manner, they can be effectively used in animals and can be used without any problem, preferably without side effects. When it is desired to change the modification mode, the modification can be changed using enzymatic techniques or the like.
  • foreign gene to be expressed those having homology to the above-described native foreign gene can also be used.
  • Foreign genes having such homology include, for example, at least about 30%, about 35%, and about 4% of the foreign gene of the control when compared using the default parameters of Biast.
  • nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence having 0%, about 95%, about 99% identity or similarity or at least about 30 ° / 0 , about 35%, about 40%, about 45%, About 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, Include, but are not limited to, polypeptide molecules having amino acid sequences having about 99% identity or similarity.
  • expression of a gene, polynucleotide, polypeptide, or the like means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo and takes on another form.
  • it means that a gene, polynucleotide, etc. is transcribed and translated to form a polypeptide.
  • transcription and production of mRNA may also be a form of expression. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed.
  • the decrease in expression includes a decrease in the expression level of the polypeptide. More specifically, a decrease in expression means that the expression level after the factor is reduced by at least about 10% as compared to before the factor, more preferably at least about 20%, and even more preferably At least about 30%, more preferably at least about 40%, more preferably at least about 50%, more preferably at least about 75%, more preferably at least about 90%, more preferably It means that it has decreased by almost 100%.
  • the term "increase" in "expression" of a gene, polynucleotide, polypeptide, or the like means that the amount of expression is significantly increased when the factor of the present invention is applied, as compared to when it is not used.
  • increasing the expression comprises increasing the expression level of the polypeptide. More specifically, the expression level is increased when the expression level after the action is increased by at least about 10% as compared to before the action of the factor, more preferably at least about 20 ° / 0 , More preferably at least about 30%, more preferably at least about 40%, more preferably at least about 50%, more preferably at least about 75%, more preferably at least about 90%, more preferably at least about 90%. It means that it has increased by at least 100%, more preferably about 200%, or that the one that has not been expressed before the action becomes expressed.
  • amino acid may be natural or non-natural.
  • “Derivative amino acids” or “amino acid analogs” refer to amino acids that differ from naturally occurring amino acids but have the same function as the original amino acids. Such derivative amino acids and amino acid analogs are well known in the art.
  • the term "natural amino acid” means the L-isomer of a natural amino acid.
  • Natural amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, fenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, gnoretami Acid, glutamine, ⁇ -carboxyglutamic acid, arginine, orditin, and lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are
  • unnatural amino acid refers to an amino acid that is not normally found in nature in proteins.
  • unnatural amino acids include norleucine, para-nitropheninoleanine, homopheninoleanine, parafunoleolofe2 / realanine, D- or L-form and D-form of 3-amino-2-benzylpropionic acid, homoarginine. Phenylalanine.
  • Amino acid analog refers to a molecule that is not an amino acid, but that is similar in physical properties and / or function to the amino acid.
  • amino acid analog examples include ethionin, canavanine, and 2-methyldaltamine.
  • Amino acid mimetics that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, a compound that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid Tsu Rere 0.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three-letter symbols or the one-letter symbols recommended by the IUPAC-I UB Chemical Nomenclature Committee. Nucleotides may also be referred to by the generally recognized one-letter code.
  • the term "corresponding" amino acid or nucleic acid refers to the action of a given polypeptide or polynucleotide molecule in a manner similar to a given amino acid or nucleotide in a polypeptide or polynucleotide as a reference for comparison.
  • An amino acid or nucleotide predicted to have, or particularly to an enzyme molecule refers to an amino acid that is present at a similar position in the active site and has a similar contribution to catalytic activity.
  • corresponding amino acids or nucleic acids may be a range of domains or domains. Therefore, in such cases, Referred to as the "corresponding" region or domain.
  • a “corresponding” gene refers to a gene that has, or has the same effect as, a given gene in a species that is a reference for comparison in a certain species. Predicted gene in another species, often a region where a particular amino acid sequence is highly conserved. Such features are such that they have the same ancestor in evolution, and the corresponding gene of a gene may be the ortholog of that gene.
  • Corresponding genes include cognate genes.
  • the wheat gene corresponding to rice prolamin can be wheat glutenin.
  • Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art.
  • the corresponding gene in an organism is obtained by using the sequence of the reference gene of the corresponding gene (for example, a gene such as rice prolamin) as a query sequence to obtain the sequence data of the organism (for example, wheat, corn, etc.). Can be found by searching the base.
  • the sequence of the reference gene of the corresponding gene for example, a gene such as rice prolamin
  • the sequence data of the organism for example, wheat, corn, etc.
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • “Derivative nucleotides” or “nucleotide analogs” refer to those that are different from naturally occurring nucleotides but have a function similar to the original nucleotide. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include phosphorothioate, phosphoramidate, methylphosphonate, chiral methylphosphonate, 2-O-methylliponucleotide, peptide-nucleic acid (PNA) However, it is not limited to these.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length from l to n-1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n).
  • the length of the fragment can be changed as appropriate according to its purpose.
  • the lower limit of the length may be a polyp
  • 3 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids are mentioned.
  • Lengths represented by integers not explicitly listed (eg, 11) may also be appropriate as lower bounds.
  • 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 25, 30, 40, 50, 75, 100, and more nucleotides are used.
  • Lengths represented by integers not specifically listed here may also be suitable as lower limits.
  • the lengths of the polypeptide and the polynucleotide can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above.
  • the above-mentioned numbers are not absolute, and are limited as long as they have the same function.
  • the above-mentioned number as the lower limit is intended to include a few above and below (or, for example, 10% above and below) the number.
  • “about” may be used before the number. It should be understood, however, that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of the numerical value herein.
  • biological activity refers to an activity that can be possessed by a certain factor (for example, a polypeptide or a protein) in a living body, and includes activities that exert various functions.
  • a factor for example, a polypeptide or a protein
  • its biological activity includes binding to the nucleic acid molecule of interest, thereby suppressing expression.
  • a factor is an enzyme
  • its biological activity includes the enzymatic activity.
  • an agent is a ligand
  • the ligand involves binding to the corresponding receptor.
  • Such a biological activity can be measured by techniques well known in the art.
  • the term “antisense activity” refers to an activity capable of specifically suppressing or reducing the expression of a target gene. More specifically, depending on the nucleotide sequence introduced into a cell, the amount of mRNA of a gene having a nucleotide sequence region complementary to that sequence is specifically reduced to thereby reduce protein. An activity that can reduce the expression level. Methods include directly introducing RNA molecules complementary to mRNA generated from the target gene into cells, and introducing a construction vector capable of expressing RNA complementary to the target gene in cells. The latter is more common in plants.
  • Antisense activity is usually achieved by a nucleic acid sequence of at least 8 contiguous nucleotides that is complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest.
  • a nucleic acid sequence preferably has at least 9 contiguous nucleotides in length, more preferably 10 contiguous nucleotides in length, even more preferably 11 contiguous nucleotides in length, 12 contiguous nucleotides in length, 13 contiguous nucleotides in length, Consecutive nucleotide length, 14 contiguous nucleotide lengths, 15 contiguous nucleotide lengths, 20 contiguous nucleotide lengths, 25 contiguous nucleotide lengths, 30 contiguous nucleotide lengths, 40 contiguous lengths Nucleic acid sequence of 50 contiguous nucleotides in length.
  • nucleic acid sequences include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably 90% homologous, and 95% homologous to the above-described sequences. .
  • Such antisense activity is preferably complementary to the sequence at the 5 'end of the nucleic acid sequence of the gene of interest.
  • Such antisense nucleic acid sequences also include those that have one or more or one or more nucleotide substitutions, additions and / or deletions from the sequences described above.
  • “antisense activity” includes, but is not limited to, a decrease in the expression level of a gene.
  • RNA interference is a short length with a sequence homologous to the target gene
  • double-stranded RNA about 20 bases
  • the mRNA of the target gene homologous to the RNA sequence is specifically degraded and the expression level decreases.
  • RNAi Ribonucleic acid
  • one DNA sequence complementary to the nucleotide sequence of the target gene is linked to an appropriate promoter, and an expression vector that expresses artificial mRNA under the control of the promoter is constructed.
  • An introduction was made.
  • Recent findings use expression vectors designed so that double-stranded RNA can be constructed in cells. The basic structure is created by ligating one DNA sequence complementary to a target gene under the promoter, and ligating the same one in the opposite direction.
  • RNAi RNA degradation of the target gene according to the mechanism of RNAi.
  • examples used in Arabidopsis have been reported (Smith, NA eta 1., Nature 407. 319-320, 2000).
  • a general review of RNAi has been compiled in a recent review (Morita and Yoshida, Proteins, Nucleic Acids, Enzymes 47, 1939–1945, 2002). The contents described in these documents are incorporated herein by reference in their entirety.
  • RNAi is an abbreviation of RNA interference.
  • a factor that causes RNAi such as double-stranded RNA (also referred to as dsRNA)
  • dsRNA double-stranded RNA
  • homologous mRNA can be specifically identified. It is a phenomenon that is decomposed and the synthesis of transgene products is suppressed, or the technology used for it.
  • RNAi may also be used synonymously with factors that cause RNAi in some cases.
  • the term "factor that causes RNAi” refers to any factor that can cause RNAi.
  • the term “factor that causes RNAi” for “gene” means that it causes RNAi for the gene and achieves the effect of RNAi (for example, suppression of expression of the gene). To be done.
  • a factor that causes RNAi include a sequence having at least about 70% homology to a part of the nucleic acid sequence of the target gene or a sequence that hybridizes under stringent conditions. Examples include, but are not limited to, RNAs containing at least a 10-nucleotide long double-stranded portion or variants thereof.
  • the factor preferably includes a 3 ′ overhang, and more preferably, the overhang 3 may be DNA having a length of 2 or more nucleotides (eg, DNA having a length of 2 to 4 nucleotides).
  • RNAi used in the present invention include, but are not limited to, a primer having a short inverted complementary sequence (for example, 15 bp or more, for example, 23 bp or the like). .
  • RNAi gene indicates a gene or construct (expression cassette) that causes RNAi.
  • a gene encoding the polypeptide is incorporated into an appropriate expression vector using a gene manipulation technique, and the expression host is used by using the gene.
  • a recombinant polypeptide can be obtained from the culture supernatant of the transformed cells.
  • the host cell is not particularly limited as long as it expresses a polypeptide that retains at least one biological activity of a foreign gene.
  • Various host cells conventionally used in genetic engineering (eg, plant cells) E. coli, yeast, animal cells, etc.) It can be used.
  • the polypeptide derived from the cells obtained in this manner can be substituted or added with one or more amino acids in the amino acid sequence as long as it has substantially the same action as the native polypeptide. Or a sugar chain may be substituted, added and / or deleted.
  • Certain amino acids can be substituted for other amino acids in a protein structure such as, for example, a cationic region or a binding site of a substrate molecule, without appreciable loss or loss of interaction binding capacity.
  • What defines the biological function of a protein is the nature and ability of the protein to interact.
  • certain amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence, or at the level of the DNA coding sequence, resulting in a protein that retains its original properties after the substitution.
  • various modifications may be made in the peptide disclosed herein or the corresponding DNA encoding the peptide without appreciable loss of biological utility.
  • the hydropathic index of amino acids can be considered.
  • the importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions on proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doo 1 itt 1 e, RF J. Mo. 1. Biol. 157 (1): 105-132, 1982).
  • the hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the resulting protein, which in turn defines the interaction of that protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.).
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge properties.
  • one 'amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still yield a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzymatic activity). It is well known.
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within 0.5. It is understood in the art that such substitution of amino acids based on hydrophobicity is efficient.
  • hydrophilicity index may also be considered.
  • the hydrophilicity index may also be considered.
  • the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); asparagine. Acid (+3.0 ⁇ 1); glutamic acid (+3.0 earth 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); Leonine (10.4); proline (10.5 ⁇ 1); alanine (10.5); histidine (10.5); cysteine (11.0); methionine (1.1.3).
  • the amino acid can be replaced with another that has a similar hydrophilicity index and still provide a bioisostere.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • conservative substitution refers to a substitution in an amino acid substitution wherein the original amino acid and the amino acid to be substituted have a similar hydrophilicity index or Z and hydrophobicity index as described above.
  • conservative substitutions include, for example, those having a hydrophilicity index or a hydrophobicity index of less than 2 or less, preferably those of ⁇ 1 or less. More preferably, they are within ⁇ 0.5, but are not limited thereto.
  • conservative substitutions are well known to those of skill in the art and include, for example, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; glutamic and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and Asparagine; and, but not limited to, norin, leucine, and isoleucine.
  • variant refers to a substance in which a substance such as an original polypeptide or a polynucleotide is partially modified. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles are genetic variants that belong to the same locus and are distinct from each other. Therefore, “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship to a certain gene. Such allelic variants usually have sequences that are identical or very similar to their corresponding alleles, usually have nearly the same biological activity, but rarely have different biological activities. May have activity.
  • a species homolog or homolog is defined as being homologous (preferably 60% or more homology, more preferably 60% or more, (A homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more) A method for obtaining such a species homolog is apparent from the description of the present specification.
  • the term “ortholog” is also called an orthologous gene, and refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the example of the hemoglobin gene famili having a multigene structure, the human and mouse ⁇ -hemoglobin genes are orthologs, whereas the human ⁇ : hemoglobin mouth gene and hemoglobin genes are It is a paralog (gene generated by gene duplication).
  • human cystatin ⁇ ⁇ a cystine protease inhibitor
  • rice cystatin ⁇ ⁇ Compared with zacystatin, only three conserved short amino acid motifs, which are considered important for the interaction with the target protease, have very low commonality with other amino acids. However, both belong to the cystatin gene superfamily and are said to have a common ancestral gene, so that not only overall amino acid homology but also amino acid sequences with locally high homology are common. If present, it may be an ortholog. Thus, orthologs can usually perform the same function as the original species in another species, and thus can be useful in the present invention.
  • the target prolamin forms a family having a large number of members, and such a prolamin can be said to be a conservatively modified variant.
  • Constant (modified) variants applies to both amino acid and nucleic acid sequences.
  • a conservatively modified variant refers to a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, and if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, To the same sequence. Due to the degeneracy of the genetic code, many functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode alanine amino acid. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, that codon can be changed to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide.
  • Such a nucleic acid variation is a “silent modification (mutation),” which is one type of conservatively modified mutation.
  • Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of the nucleic acid.
  • each codon in a nucleic acid except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tributofan, produces a functionally identical molecule. It is understood that it can be modified to Thus, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Included in silence.
  • such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that has a significant effect on the conformation of the polypeptide.
  • a nucleotide sequence modification method include cleavage with a restriction enzyme or the like, ligation treatment with a DNA polymerase, a Klenow fragment, DNA ligase, or the like, site-specific base substitution using a synthetic oligonucleotide, or the like. Method (specific site-directed mutagenesis; Mark Zollerand Michae 1 Smitn, Methodsin Enzymology, 100, 468-500 (1 983)). Modifications can also be made by methods used in the field.
  • amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides.
  • Amino acid substitution refers to substitution of the original peptide with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3 amino acids.
  • the addition of an amino acid refers to adding one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3, amino acids to the original peptide chain.
  • Amino acid deletion refers to deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3, amino acids from the original peptide.
  • Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like.
  • the amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, an unnatural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • peptide analog refers to a compound that is different from a peptide, but that has at least one chemical or biological function equivalent to the peptide.
  • a peptide analog may contain one or more amino acid analogs relative to the original peptide. Or those in which an amino acid derivative is added or substituted.
  • Peptide analogs have a function similar to that of the original peptide (e.g., a similar pKa value, similar functional groups, and a similar mode of binding to other molecules). Such additions or substitutions are substantially the same as those having similar water solubility.
  • Such peptide analogs can be made using techniques well known in the art.
  • a peptide analog can be a polymer comprising an amino acid analog.
  • polynucleotide analog and “nucleic acid analog” are used interchangeably and are different from a polynucleotide or a nucleic acid, but a polynucleotide or a nucleic acid and at least one chemical function or a biological compound. Are those whose functional functions are equivalent.
  • polynucleotide or nucleic acid analogs include those in which one or more nucleotide analogs or nucleotide derivatives have been added or substituted with the original peptide.
  • a nucleic acid molecule as used herein may have a deletion or other portion of the nucleic acid sequence as described above, as long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the native polypeptide. May be substituted, or another nucleic acid sequence may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5 'end and / or the 3 end. Further, a nucleic acid molecule which hybridizes a gene encoding a polypeptide under stringent conditions and encodes a polypeptide having substantially the same function as the polypeptide may be used. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.
  • Such a nucleic acid can be obtained by the well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method, a hybridization method, and the like.
  • substitution, addition, "And / or deletion” refers to the replacement, addition, or removal of an amino acid or a substitute thereof, or a nucleotide or a substitute thereof, respectively, for an original polypeptide or polynucleotide.
  • Techniques for such substitution, addition or deletion are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques.
  • the number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as it is one or more, and such a number may be the number of the desired function (eg, hormone, Can be increased as long as the information transfer function is maintained.
  • such a number may be one or several, and preferably, is within 20%, within 10%, or 100 or less, 50 or less, 25 or less of the total length. It may be as follows.
  • the term "specifically expresses" a gene means that the gene is expressed at a particular site or stage of the plant at a different (preferably higher) level than at other sites or stages. Say. To be specifically expressed may be expressed only at a certain site (specific site), or may be expressed at other sites. Preferably, specifically expressed means to be expressed only at a certain site.
  • a gene is “specifically repressed” when the gene is repressed at a particular site or stage of the plant at a different (preferably higher) level than at other sites or stages. That means.
  • To be specifically expressed may be suppressed only at a certain site (specific site) or may be suppressed at other sites.
  • specifically suppressed means that it is suppressed only at a certain site.
  • a “vector” refers to a vector that can transfer a target polynucleotide sequence into a target cell.
  • Such vectors include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insects A cell which is capable of autonomous replication in a host cell such as a cell, an animal individual, a plant individual or the like, or which can be integrated into a chromosome, and which contains a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention.
  • the vector may be an expression vector, a thread vector, or the like.
  • examples of the vector include a vector that can be replicated in a general vector used in gene experiments (typically, an Escherichia coli strain derived from Escherichia coli K12 strain) and that can be isolated and purified. This is necessary to construct the target gene to be introduced into the plant.
  • a general vector used in gene experiments typically, an Escherichia coli strain derived from Escherichia coli K12 strain
  • This is necessary to construct the target gene to be introduced into the plant.
  • plasmids such as UC18, pUC19, pBluescript and pGEM-T.
  • a gene fragment is directly introduced into a plant cell and transformed by an electroporation method, a polyethylene glycol method, a particle gun method or the like, the gene fragment is introduced using such a commercially available general plasmid. What is necessary is just to construct a gene.
  • a vector when a plant cell is transformed by a gene transfer method via an agrobacterium, the replication origin of both Escherichia coli and agrobacterium, and the boundaries that can be introduced into a plant, It is necessary to use a plasmid called a "binary vector" having a nucleotide sequence corresponding to the border sequence (Leftborder and Right Border) derived from T-DN ⁇ indicating the border region.
  • pB1101 commercially available from C1ontech
  • BIN Bevan, N., Nucleic Acid Research 12, 871 1-8721, 1 984
  • BI NP lus van Enge 1 en, FA eta 1., Tranegenic Research 4, 288—290, 1995
  • pTN or pTH Fukuoka Het. Al "Plant Cell Reports 19, 2000
  • p PZP Ha j duk i ew icz Peta 1 ⁇ , Plant Mo lecular Biology 25, 989—994, 1994
  • a vector that can be used is a tobacco mosaic virus vector.However, since this type of vector does not introduce the target gene into the plant chromosome, it is necessary to propagate the transgenic plant through seeds. If not, the use is limited, but it can be used in the present invention.
  • the expression cassette refers to a structural gene, a promoter sequence that regulates its expression, various regulatory elements, and a terminator sequence that terminates mRNA transcription.
  • Typical examples include a selection marker (for example, a hygromycin resistance gene) expression cassette for selecting only the host cell into which the gene has been introduced, or an expression cassette for a useful protein gene to be expressed in the host cell. Is exemplified.
  • the type, structure and number of expression cassettes to be prepared should be appropriately used depending on the organism, host cell, and purpose, and the combination is well known to those skilled in the art.
  • an “expression vector” is defined as a “vector” that can include one or more of the above “expression cassettes”.
  • the target gene expression cassette to be introduced into the plant may be arranged on a separate vector, or all expression cassettes may be ligated on one vector.
  • the expression vector for plants used in the present invention may be a binary vector type. Further, the vector may contain a gene expression cassette to be introduced and, at the same time, a selectable marker (eg, hygromycin resistance gene) expression capability set suitable for the host plant.
  • Examples of the selectable marker used in the present specification include, but are not limited to, hygromycin phosphotransferase, mutant acetate butyrate synthase, and the like.
  • Examples of promoters that can be used for the selectable marker expression cassette include the C a MV35S promoter and its modified promoter, and the ubiquitin promoter.
  • Terminators include the Nos terminator, the Tml terminator, and the 10 kDa Prolamin terminator, 13kDa pro Lamin terminator, 16 kDa prolamin terminator, but not limited thereto.
  • terminal 1 is a sequence that is located downstream of a gene coding region of a gene and is involved in terminating transcription when DNA is transcribed into mRNA and adding a polyA sequence. is there.
  • the terminator include, but are not limited to, a CaMV35S terminator, a nopaline synthase gene terminator (Tnos), and a tapaco PR1a gene terminator.
  • any sequence that exhibits the activity of a terminator in a plant can be used.
  • promoter refers to a region on DNA that determines the transcription initiation site of a gene and that directly regulates the frequency of transcription, and is a base sequence to which RNA polymerase starts transcription upon binding. Since the promoter region is usually found in a region within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region, it is necessary to predict the protein coding region in the genomic nucleotide sequence using software for DNA analysis. For example, the promoter region can be estimated. The putative promoter region varies for each structural gene, but is usually not limited to the force S upstream of the structural gene, and may be present in or downstream of the structural gene.
  • the putative promoter region is located within about 2 kp upstream of the first exon translation initiation site, but is not so limited, and there are other promoters.
  • a promoter that specifically expresses may be used.
  • Such a specific promoter is preferably, but not limited to, a promoter that drives specific expression in a storage protein.
  • a promoter derived from a storage protein for example, prolamin
  • a promoter derived from 16 kDa prolamin a promoter derived from 13 kDa prolamin
  • a promoter derived from 10 kDa prolamin May be used.
  • a terminator may affect the expression intensity.
  • NOS terminators are used in most cases, regardless of the promoter used, based on past experience.
  • the present invention employs a terminator derived from prolamin (particularly 10 kDa prolamin).
  • This terminator has a short nucleotide sequence, does not have a restriction enzyme site at the multiple cloning site, and is combined with various storage protein promoters, ubiquitin promoters, actin promoters, and the CaMV35S promoter.
  • a general-purpose terminator derived from a new plant (rice) that can be used instead of the NOS terminator has been obtained.
  • site specificity generally refers to a site (for example, in the case of a plant, a protein body, a root, a stem, a stem, a leaf, The specificity of expression of the gene in flowers, seeds, endosperm, germ, embryo, fruit, etc.
  • Tempooral specificity refers to the stage of development of an organism (eg, a plant) (eg, the growth stage of a plant (eg, the specific time of protein body formation, the number of days after germination). It refers to the specificity of the expression of that gene. Such specificity can be introduced into a desired organism by selecting an appropriate promoter.
  • the expression of the promoter of the present invention is “constitutive” when it is expressed in almost all tissues of an organism in an almost constant amount during the juvenile or mature stages of growth of the organism. It refers to the property that is expressed. Specifically, when Northern plot analysis is performed under the same conditions as the examples in the present specification, for example, at any time (for example, two or more points (for example, day 5 and day 15)) Expression is constitutive, by definition of the present invention, when expression is found at either the same or corresponding sites. Constitutive promoters are thought to play a role in homeostasis of organisms in their normal growth environment.
  • the expression of the Honkiaki promoter is “stress
  • responsiveness (or stimulus) refers to a property in which the expression level changes when at least one stress (or stimulus) is given to an organism.
  • stress (or stimulation) inducibility the property of increasing the expression level
  • stress (or stimulation) reducing property the property of decreasing the expression level.
  • stress (or stimulation) reduction is a concept that overlaps with “constitutive” expression because it is assumed that the expression is observed in normal times.
  • Plants or plant parts transformed with a vector that incorporates a stress (or stimulus) inducible promoter together with the nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention are identified by the expression of the promoter.
  • a stress (or stimulus) inducible promoter together with the nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention are identified by the expression of the promoter.
  • enhancer can be used to increase the expression efficiency of a target gene.
  • the enhancer is preferably, for example, an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter.
  • a plurality of enhancers may be used, but one may or may not be used.
  • silencer refers to a sequence having a function of suppressing gene expression and quiescent.
  • any type of silencer may be used as long as it has the function, and a silencer may not be used.
  • operably linked refers to a transcription / translation regulatory sequence (eg, a promoter, an enhancer, etc.) or a translation regulatory sequence under which a desired sequence is expressed (activated).
  • a promoter eg, an enhancer, etc.
  • the promoter will usually be located immediately upstream of the gene, but need not be located adjacent to it.
  • any technique for introducing a nucleic acid molecule into cells may be used, including, for example, transformation, transduction, transfection, and the like. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Au sube 1 FA et al.
  • any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used, and examples thereof include transfection, transformation, and transformation (for example, calcium phosphate method, ribosome Method, DEA E dextran method, electoral poration method, particle gun (gene gun) method, etc., lipofection method, spheroplast method [Proc. Nat 1. Ac ad. Sci. USA, 84 , 1929 (1 978)], the lithium acetate method [J. B acteriol., 153, 163 (1 983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). )).
  • transfection, transformation, and transformation for example, calcium phosphate method, ribosome Method, DEA E dextran method, electoral poration method, particle gun (gene gun) method, etc., lipofection method, spheroplast method [Proc. Nat 1. Ac ad. Sci. USA, 84 , 1929 (1 978)], the lithium acetate method [J. B acteriol
  • the term “gene introduction reagent” refers to a reagent used to promote the efficiency of introduction in a gene introduction method.
  • a gene introduction reagent include, but are not limited to, cationic polymers, cationic lipids, polyamine-based reagents, polyimine-based reagents, calcium phosphate, and the like.
  • Specific examples of reagents used in transfection include reagents commercially available from various sources. For example, Effectene Transfection Reagent (cat. No.
  • a method well known to those skilled in the art for example, a method via an agrobacterium and a method for direct introduction into a cell, can be used to introduce a plant expression vector into a plant cell.
  • a method via the agrobacterium for example, the method of Nage 1 et al. (Nagel et al. (1990), Microbiol. Lett., 67, 325) can be used.
  • an agrobacterium is transformed by electroporation using, for example, an expression vector suitable for a plant, and then the transformed agrobacterium is transformed into Ge1Vin et al.
  • Cells into which the plant expression vector has been introduced are first selected for drug resistance such as hygromycin resistance and kanamycin resistance. It can then be regenerated into plant tissues, plant organs and Z or plants by methods well known in the art. Further, seeds can be obtained from the plant matter.
  • the expression of the introduced gene can be detected by Northern blotting or PCR. If necessary, the expression of the protein as a gene product can be confirmed by, for example, a stamp lot method.
  • the invention has been shown to be particularly useful in plants, but can be used in other organisms.
  • the molecular biology techniques used in the present invention are well-known and commonly used in the art, and are described, for example, in Au sube 1 FA et al. (Ed., 1988), Current Protocolsin Molecular Biology Wiley. New York, NY; Sambrook J et al. (1 987) Molecular Cloning: AL aboratory Manual, 2nd Ed. And its 3rd edition, Old Spring Harror aboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, and a separate volume, Experimental Medicine, “Methods for Gene Transfer and Expression Analysis,” Yodosha, 1997, etc.
  • transformant refers to all or a part of an organism such as a cell produced by transformation.
  • examples of the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, and the like. Transformants depend on the subject As such, it is also referred to as a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, and the like, and includes all of those forms herein, but may refer to a particular form in a particular context.
  • physical methods include a polyethylene glycol method (PEG method), an electroporation (elect-portation) method, a microinjection method, and a particle gun method.
  • PEG method polyethylene glycol method
  • electroporation (elect-portation) method electroporation (elect-portation) method
  • microinjection method a particle gun method.
  • PEG method polyethylene glycol method
  • electroporation (elect-portation) method electroporation (elect-portation) method
  • microinjection method a particle gun method.
  • methods for introducing an isolated gene using an organism include an agrobacterium method, a viral vector method, and a method using pollen as a vector, which has been recently developed. These methods have the advantages that they do not use protoplasts, but rather use plant calluses, tissues or plants for gene transfer, so that the culture does not extend over a long period of time and is less susceptible to somaclonal mutations and other disorders. ing. Of these, the method using pollen as a vector is still few in experimental examples, and there are many unknown parts in plant transformation. Although the virus vector method has the advantage that the gene to be introduced spreads throughout the plant infected with the virus, it is expressed only in a wide range in each cell and there is no guarantee that it will be transmitted to the next generation.
  • a The GLP method has many advantages, including the ability to introduce DNA of about 20 kbp or more into the chromosome without major rearrangement, the small number of copies of the introduced gene, and high reproducibility. is there. Since Agrobacterium is outside the host range for monocotyledonous plants such as grasses, the introduction of foreign genes into grasses has conventionally been performed by the physical methods described above. Have been. However, in recent years, the agrobacterium method has been applied to monocotyledonous plants, such as rice, in which a culture system has been established, and rather the agrobacterium method is now preferred. ing.
  • a foreign gene In the introduction of a foreign gene by the agrobacterium method, when a low-molecular-weight phenolic compound such as acetociringone synthesized by a plant acts on the Vir region of the Ti plasmid, the T-DNA region is cut out from the Ti plasmid, It is integrated into the nuclear chromosomal DNA of plant cells through several processes. In dicotyledonous plants, since the plant itself has a mechanism for synthesizing such a phenol compound, a foreign gene can be easily introduced by a leaf disk method or the like, and the reproducibility is high.
  • the target nucleic acid molecule in the transformant, may or may not be introduced into the chromosome.
  • the nucleic acid molecule of interest (transgene) has been introduced into a chromosome, more preferably both chromosomes.
  • Plant cells include those described herein below, including rice, potatoes, tobacco, corn, rape, soybeans, tomatoes, carrots, barley, barley, rye, Alfalpha, flax, Examples include woody plant (eg, poplar) cells. More preferably, the plant cell is rice obtain.
  • Rice includes, but is not limited to, Japonica and Indy varieties. In one preferred embodiment, the rice may be of the Japonica variety. In the present specification, rice varieties include, for example, Nipponbare, Nihonmasari, Kinnan-style, Norin No.
  • the rice may be of the Indian breed. Indica varieties include, but are not limited to, Tetep, Basmati, IR8, and Hunan Haya.
  • any method for introducing DNA into a plant cell can be used, as described in detail elsewhere in this specification.
  • (Ag robacteri um) JP-A-59-140885, JP-A-60-70080, WO 94/00977), electroporation method (JP-A-60-2518887), A method using a particle gun (gene gun) (Japanese Patent No. 2606856, Japanese Patent No. 2517813) is exemplified.
  • the term "plant” is a general term for organisms belonging to the plant kingdom, and includes organisms that do not have the ability to move and have the ability to have black mouth fills, hard cell walls, abundant permanent germinal fibrous tissue. Characterized. Typically, a plant refers to a flowering plant having cell wall formation and assimilation by black-mouth fill. “Plant” includes both monocotyledonous and dicotyledonous plants. Preferred plants include monocotyledonous plants belonging to the Poaceae family such as rice, wheat, corn, barley, and sorghum. More preferably, the plant may be rice. Examples of rice include, but are not limited to, Japonica and Indy varieties. More preferably, the rice may be of the Japonica species.
  • rice varieties include, for example, Nipponbare, Nihonmasari, Kinnan-style, Norin 22 Hikari, Akitakomachi, Dontokoi, Hinohikari, Mantsumomochi, Power Gramochi, Hakuchiyomochi, LGC—1, Chunyo, Snowy Dwarf, Te tep, Basmati, IR8, Hyokumochi, Himenomochi, Konekomochi, Mochimochi But not limited to them.
  • Varieties of Indy breeds include, but are not limited to, Te tep, Basmatic, IR 8, Hunan Haya, Kasala 1 ath.
  • rice that has been modified to reduce the expression of other storage proteins such as, for example, LGC-1 (eg, glutelin, glopurine, etc.) is used in the present invention.
  • Preferred plants are not limited to crops, but include flowers, trees, lawns, and weeds.
  • a plant means any of a plant, a plant organ, a plant tissue, a plant cell, and a seed. Examples of plant organs include roots, leaves, stems, and flowers. Examples of plant cells include callus and suspension culture cells.
  • grasses include plants belonging to Oryza, Horde num, Secale, Scccharum, E cinochloa, or Zea, such as rice, barley, rye, hee, sorghum, and corn. Including si and the like.
  • the plant used in the production method of the present invention is preferably a monocotyledonous plant, and more preferably a gramineous plant. More preferably, it may be rice. Still more preferably, the plant used in the production method of the present invention is Nipponbare, Dontokoi, LGC_1, snowy dwarf variety, Te tep, Basma ti, Koshihikari, 5 million stones, Koganemochi, Kasa Can be 1 ath. Nipponbare is preferred because its genomic sequence is published, so that the location of the chromosome where the gene has been introduced can be easily ascertained. Dontokoi is preferred because it tastes better and is shorter and easier to make than Koshihikari.
  • LGC-1 is preferred because prolamin antisense is more effective.
  • the snowy dwarfability is good because the plant is very small (20 cm), but the seeds are of normal size and can be produced in the incubator. Good.
  • Koshihikari is a mainstay variety in Japan, and is preferred because its protein quality lowers its taste and other quality. Gomangoku is preferred because it requires low-protein sake rice.
  • Koganemochi is preferred because it is required to have low protein for processed rice products such as mochi confectionery. Tetep, Basmati, and Kasala 1 ath are preferred in certain embodiments because they can be cultivated normally in the temperate region south of Honshu, Honshu, to obtain seeds.
  • tissue of an organism refers to a population of cells having a certain and similar effect in the population.
  • a tissue can be part of an organ. Organs often have cells having the same function, but sometimes have subtly different functions.Therefore, in this specification, the tissues in the present specification are of various types, as long as they share certain features. May be present in a mixture.
  • organ refers to an organ that has one independent form and is formed by combining one or more tissues to perform a specific function. Plants include, but are not limited to, calli, roots, stems, stems, leaves, flowers, seeds, germs, embryos, fruits, and endosperm.
  • organism refers to an organism (or a plant) that is used in the broadest sense in the relevant field and carries out a life phenomenon, and is typically a cell. It has various properties such as structure, proliferation (self-reproduction), growth, regulation, metabolism, and repair ability. It is usually based on the inheritance of nucleic acids and the growth of proteins involving metabolism. Attributes. Organisms include prokaryotes and eukaryotes (plants, animals, etc.). Preferably, according to the invention, the organism can be a plant. As used herein, preferably, such plants may be heterotrophic. More preferably, such plants are capable of producing seed.
  • transgenic refers to the incorporation or integration of a particular gene into an organism, including, for example, plants (such as rice).
  • cultivation of a plant can be performed by any method known in the art. Plant cultivation methods are described, for example, in Experimental Protocols for Model Plants, 1st Edition, Rice and Arabidopsis: “Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 4”; Rice Cultivation Methods (Kunoshi Okuno) p p. 28-32, and Cultivation method of Arabidopsis (Yasuo Niwa) p p. 33-40 (supervised by Isao Shimamoto and Kiyotaka Okada), which will be described in detail in the present specification because it can be easily implemented by those skilled in the art. No need.
  • Arabidopsis can be cultivated by soil cultivation, rock wool cultivation, or hydroponic cultivation.
  • the first flowers bloom about 4 weeks after sowing, and the seeds are fully ripe about 16 days after flowering.
  • 40 to 50 seeds can be obtained with one pod, and about 10,000 seeds can be obtained by 2 to 3 months after sowing until they die.
  • Seed dormancy is short, and ripe seeds germinate 2-3 days after water absorption if dried for about a week.
  • the germination is uniformed by low temperature treatment at 4 ° C for 2-4 days after water absorption and sowing.
  • Rice is cultivated mainly by soil and grown under light conditions of 10,000 lux or more. Approximately 40 days after sowing, heading is induced by short-day conditions, flowering occurs approximately 30 days after induction, and mature seeds are obtained approximately 40 days after flowering.
  • a culture medium for culturing, differentiating and regenerating plant cells, plant tissues and plants, a culture medium known in the art is used.
  • Such media include, for example, Murashige-Skoog (MS) medium, G aMb org B5 (B) medium, White medium, N itsch & N itsch (N itsch) medium, and the like. It is not limited to.
  • These media are usually used after adding an appropriate amount of a plant growth regulator (plant hormone) or the like.
  • regenerating means that the plant It means the phenomenon that the whole individual is restored from the part. For example, regeneration results in the formation of organs or plants from pieces of tissue such as cells (leaves, roots, etc.).
  • Methods for redifferentiating a transformant into a plant are well known in the art. Such methods include: Rogersetal., Methodsin Enzymology 1 18: 627-640 (1986); Tabatata 1, Plat Cell Phy Phy siol., 28: 73-82 (1 987). ; Sh aw, P lant Mo lecular Bio 1 ogy: A practical approac h. IRL ress (1988); S im amo toeta 1., Nature 338: 274 (1989); Ma ligaeta 1., Me thodsin P lant Mo lecu 1 ar Biology: A laboratorycours e. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995) and the like, but are not limited thereto.
  • transgenic plants obtained in this way have the gene of interest introduced therein, and the introduction of such a gene can be carried out according to the methods described herein, such as Northern plot, Western blot analysis or other methods. It can be confirmed by using well-known conventional techniques.
  • DNA arrays are widely reviewed in (Shujunsha, edited by Cell Engineering, “DNA Microarrays and the Latest PCR Method”). In addition, analysis of plants using DNA arrays has recently been performed (Schemk PM et al. (2000) Proc. 1 1660) o
  • Microfabrication used in DNA array technology is described, for example, in Cam pbe 11, SA (1996). The Science and Eng ineeringof Microelectronic F abrication, Ox ford Un iversity Press! Z aut, PV (1 996) .Microm om icroarray F abrication: a Practical Guideto S em iconductor P rocessing, S em icon du ctor S ervices; M adou , M. J. (1997). Fun d amen tals of Micro crofabrication, CRC 15 Press; Ra i—Ch oudury, P. (1997). Handbook of Micro crolithography, Micro oma cining, & Micro cro fabrication: Micro crolithography, etc. Which are hereby incorporated by reference in their relevant portions.
  • the regulation of the expression of the storage protein gene and its downstream gene according to the present invention can also be analyzed by gene analysis using differential display (differentiaaldisplay) technology.
  • the term "differentiant display (technology)” is a method for detecting or identifying a gene whose expression is fluctuated.
  • cDNAs are prepared from two or more samples, respectively, amplified by PCR using an arbitrary primer set, and then the generated PCR products are separated by gel electrophoresis. After patterning, the expression-variable gene is cloned based on the relative signal intensity change of each band.
  • This effort also contemplates providing drugs by computer modeling based on the present disclosure.
  • the computer technology includes a substrate type I, a pharmacophore, and a homologous model of the active site of the present invention created by several computers.
  • methods for modeling the usual characteristic groups of interacting substances for a substance from data obtained in vitro have recently been developed using the CATALYST "TM pharmacophore method (Ekins et al., Pharmacogenetics, 9 Ekinsetal., J. Pharmacol. & Exp.
  • the present invention provides a composition comprising the antisense construct of the present invention.
  • a composition may be an agricultural composition.
  • Such agricultural compositions are provided in a format that complies with regulations set by the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan or regulatory authorities in other countries.
  • Such agricultural compositions are also provided in a manner that solves ethical issues.
  • compositions may include an agriculturally acceptable carrier.
  • suitable agriculturally acceptable factors include, but are not limited to: antioxidants, preservatives, colorants, flavors, diluents, diluents, emulsifiers, suspending agents, Solvents, fillers, bulking agents, buffers, delivery vehicles, diluents, excipients and / or agricultural adjuvants.
  • the pesticidal compositions of the present invention may be administered with the agent of the present invention in the form of a composition together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • a carrier can be water or the like suitable for pesticide administration.
  • Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline, or saline mixed with serum albumin.
  • the product is formulated as a lyophilizate using appropriate excipients (eg, sucrose).
  • excipients eg, sucrose
  • Other standard carriers, diluents and excipients can be included as desired.
  • Other exemplary compositions include a pH 7.0-8.5 Tris buffer or a pH 4.0-5.5.
  • acetate buffers which may further include sorbitol or a suitable substitute thereof.
  • the pH of the solution should also be selected based on the relative solubility of the agent of the invention at various pH.
  • the solvent in the composition can have either aqueous or non-aqueous properties.
  • the vehicle may be used to modify or maintain the pH, osmolality, viscosity, clarity, color, sterility, stability, isotonicity, disintegration rate, or odor of the formulation.
  • Other formulation materials may be included.
  • the compositions of the present invention may include other formulation materials to modify or maintain the rate of release of the active ingredient, or to facilitate absorption or penetration of the active ingredient.
  • the invention provides an antisense molecule of a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide.
  • the present invention relates to a continuous nucleic acid sequence that is at least 10 nucleotides in length, more preferably 15 nucleotides in length that is complementary to a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide, or at least There is provided a nucleic acid molecule comprising about 70%, preferably at least about 80%, more preferably about 90%, homologous nucleic acid sequence.
  • sequences may include one or more nucleotide substitutions, additions or deletions. Such a modified sequence may be lower than these values as long as it can exhibit antisense activity.
  • the expression of the entire multigene family of prolamin genes is suppressed, and the expression of other storage proteins is neutral. It was unexpectedly discovered that the seed protein could be reduced due to this.
  • the expression of a certain seed protein is reduced, the expression of other proteins is increased by the maintenance mechanism of homeostasis to compensate for the decrease. Is not changed.In fact, it was confirmed that in the line in which glutelin expression was suppressed, the expression was remarkably increased by allocating that amount to prolamin, and as a result, the total amount of seed protein was hardly changed. I have.
  • the present invention even if the expression of prolamin was suppressed in a low glutelin strain, the characteristics of low glutelin were still maintained, and glopurin was not significantly increased. It can be said to be an achievement.
  • the antisense molecule may simply have an inverted partial sequence, but a hairpin using the same two opposite partial sequences by utilizing the phenomenon of RNAi.
  • a similar RNA structure may be used.
  • Such an array is All may be the same or some may not match.
  • a 10 kDa prolamin promoter, a 13 kDa prolamin promoter, a glutelin B1 promoter, a ubiquitin promoter and the like are used to promote the expression of the antisense molecule.
  • a Nos terminator, a 13 kDa prolamin terminator, a 10 kDa prolamin terminator, and the like can be used to control the expression of an antisense molecule.
  • the nucleic acid molecule has, in one embodiment, an antisense activity.
  • antisense activity includes, but is not limited to, for example, decreased expression of prolamin mRNA and decreased expression of prolamin polypeptide.
  • the nucleic acid sequence encoding the prolamin polypeptide comprises a contiguous nucleic acid sequence at least 15 nucleotides in length that is complementary. More preferably, such nucleic acid sequences are at least 20 nucleotides in length, at least 25 nucleotides in length, at least 30 nucleotides in length, at least 40 nucleotides in length. At least 50 nucleotides in length, at least 60 nucleotides in length, at least 70 nucleotides in length, at least 80 nucleotides in length, at least 90 nucleotides in length It may be a contiguous, continuous nucleic acid sequence of at least 100 nucleotides in length.
  • such a nucleic acid sequence may include a complementarity sequence of a full-length sequence encoding a prolamin polypeptide.
  • Providing a continuous complementary nucleic acid sequence usually 15 nucleotides in length, may be sufficient to exert antisense activity, but is more reliable. It is preferable to provide a longer sequence, for example, a continuous nucleic acid sequence of at least 20 nucleotides in length, or at least 30 nucleotides in length, in order to exert a sensing activity.
  • the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid molecule of the present invention may be a nucleic acid sequence complementary to the 5 'end of the nucleic acid sequence encoding prolamin polypeptide.
  • Prolamin has many sequences with high homology at the 5 'end. Also, by providing a nucleic acid sequence complementary to such a 5 ′ end sequence, the transcription and Z or translation of the gene is inhibited from the beginning of the reaction, so that it is more efficient than providing a sequence that is not.
  • a sequence other than a nucleic acid sequence complementary to a sequence at the 5 'end of a nucleic acid sequence encoding a target polypeptide can be used. You can use it.
  • the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid molecule of the present invention any nucleic acid sequence can be used as long as it is derived from prolamin, but it is derived from rice 13 kDa prolamin or an ortholog of another species corresponding thereto. It is preferable to use one that does.
  • the prolamin used in the present invention may be rice.
  • the prolamin may be of Japonica rice.
  • the prolamin is a 13 kDa prolamin of Japonica rice.
  • the prolamin is RM9 or RM1 prolamin.
  • the reason why 13 kDa prolamin is preferable is that, among prolamins contained in rice seeds, the content of the protein corresponding to 13 kDa prolamin is the highest, so that the effect when expression can be reduced is higher.
  • the nucleic acid molecule of the invention comprises
  • SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 and 45 A polynucleotide having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of or a fragment sequence thereof;
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 3 A polynucleotide that encodes a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: selected from the group consisting of 8, 40, 42, 44, and 46, or a fragment thereof;
  • One or several amino acid sequences represented by SEQ ID NOs selected from the group consisting of 2, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 and 46 A polynucleotide encoding the variant polypeptide having at least one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion, wherein the variant polypeptide has biological activity;
  • SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 1, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 1, 3, 3, 3 A polynucleotide which is an allelic variant of DNA consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: selected from the group consisting of 5, 37, 39, 41, 43, and 45;
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: A polynucleotide encoding a species homolog or ortholog; (f) a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to any one of the polynucleotides (a) to (e) and encodes a polypeptide having biological activity A polynucleotide that does; or
  • a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 70% identity to the polynucleotide of any one of (a) to (e) or its complementary sequence, and encoding a polypeptide having biological activity;
  • nucleic acid sequence may comprise a contiguous nucleic acid sequence of at least 15 nucleotides in length that is complementary to the sequence. More preferably, the nucleic acid sequence is at least 20 nucleotides in length, more preferably Alternatively, it may comprise a continuous complementary portion of at least 30 nucleotides in length, most preferably at least 5Q nucleotides in length.
  • the sequence may be SEQ ID NO: 1 or 3, and SEQ ID NO: 2 or 4 (corresponding to RM 9 and RM 1, respectively).
  • the invention provides a nucleic acid sequence having at least 15 contiguous nucleotides derived from a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide or having at least 15 contiguous nucleotides of said complementarity.
  • a nucleic acid molecule is provided that comprises a nucleic acid sequence that is at least about 70% homologous to the nucleic acid sequence. Such a sequence is a sense sequence and is also useful as a factor bearing a part of RNAi. 'Such a sequence can exert an expression suppressing effect as short as 15 nucleotides.
  • the present invention provides: (A) a nucleic acid sequence having at least 15 contiguous nucleotide lengths derived from a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide or said complementary at least 15 contiguous nucleotide lengths A nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence having at least about 70% homology to a nucleic acid sequence having the following sequence: and (B) a nucleic acid having at least 15 contiguous nucleotide lengths complementary to the nucleic acid sequence encoding the prolamin polypeptide A nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence at least about 70% homologous to the sequence or the complementary nucleic acid sequence having at least 15 contiguous nucleotides in length.
  • RNAi nucleic acid molecules are also referred to herein as RNAi nucleic acid molecules.
  • the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B can be called a sense sequence and an antisense sequence, respectively.
  • the nucleic acid molecule having such two types of sequences acts as a factor that causes RNAi, and as a result, generally suppresses the expression of the target prolamin and, consequently, decreases the expression level of the seed protein. . Since this did not occur with other seed proteins, it can be said that the effect of suppressing prolamin expression is unexpected. Because it is traditional For glutelin, even if its expression is suppressed, the expression of other seed proteins or other proteins in seeds increases, and the total protein amount remains unchanged.
  • RNAi nucleic acid molecule of the present invention is effective even when the antisense and sense sequences are as short as 15 b ⁇ , preferably about 23 bp, relative to the target prolamin sequence.
  • the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B contained in the RNAi nucleic acid molecule of the present invention include portions that are substantially complementary to each other. This is because the effect of RNAi is easily exerted when A and B contain such complementary portions. More preferably, the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B are substantially mutually complementary to each other, and more preferably completely complementary. Without wishing to be bound by theory, it is because the effect of RNAi is enhanced by the fact that complementarity is substantially complete.
  • the RNAi nucleic acid molecule of the present invention comprises a spacer sequence.
  • a spacer sequence is inserted in the RNAi nucleic acid molecule of the present invention.
  • the effect of RNAi is enhanced by proper placement of the spacer sequence.
  • the spacer sequence is preferably an intron sequence.
  • the intron sequence include, but are not limited to, intron sequences of ⁇ -globin and ⁇ -actin.
  • the present invention relates to a gene encoding a prolamin polypeptide.
  • the RNAi against prolamin of the present invention exerts an effect such as a remarkable decrease in seed protein and / or a remarkable forced expression of a foreign protein as compared with other RNAi.
  • a format such as siRNA or shRNA is possible, but in the present invention, a format in which a complementary strand is contained in the nucleic acid construct is preferable. While not wishing to be bound by theory, it is more common in plants that the complementary strand is contained in the nucleic acid construct than the siRNA or shRNA.
  • the present invention provides a nucleic acid sequence having at least 15 contiguous nucleotides complementary to a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide, or said complementary at least 15 contiguous nucleotides.
  • a nucleic acid cassette comprising a nucleic acid sequence B that is at least about 70% homologous to a nucleic acid sequence having the following sequence: Such a nucleic acid cassette can be used as an antisense cassette.
  • the nucleic acid cassette of the present invention further comprises a nucleic acid sequence encoding a foreign gene.
  • Any foreign gene may be used as long as it is intended to be expressed in place of prolamin or seed protein when modifying a plant or the like using the nucleic acid cassette of the present invention. be able to.
  • Such foreign genes include, for example, markers (fluorescent substances, phosphorescent substances, etc.), pharmaceutically active peptides (eg, cytokins (interleukins, chemokines, GM-CSF, M-CSF, G-CSF) — CSF, mu 1 ti—hematopoietic factors such as CSF (IL-13), EPO s LIF, SCF, TNF, interferons, PDGF, EGF, FGF, HGF, VEGF, etc., hormones (insulin) , Growth hormone, thyroid hormone, etc.), vaccine antigens, blood products, agriculturally useful peptides (eg, antibacterial, insect repellent, antibacterial proteins), enzymes that synthesize secondary metabolites with physiological and pharmacological effects Inhibitors that regulate responses, receptors, receptor ligands, engineered proteins, nutritionally significant Substances (eg, casein, legume albumin, glopulin, vitamins.
  • pharmaceutically active peptides eg, cytokins
  • Sugars and lipid synthases proteins involved in processing properties (eg, wheat glutenin (bread), soy globulin (tofu), milk casein Group (cheese) and other proteins that enhance the palatability and functionality of foods (for example, a group of enzymes that synthesize special sugars and amino acids such as cyclodextrin, oligosaccharides, and ⁇ -aminoacetic acid, and pigments that improve the appearance) Synthetic enzymes, taste proteins, proteins involved in taste component synthesis, or other artificial proteins).
  • the nucleic acid cassette of the invention comprises a nucleic acid sequence having at least 15 contiguous nucleotides from a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide or the complementary at least 15 contiguous nucleotides. Further comprising a nucleic acid sequence ⁇ comprising a nucleic acid sequence at least about 70% homologous to the nucleic acid sequence having Having the two types of nucleic acid sequences A and B, the nucleic acid cassette of the present invention can exert an RNAi action.
  • the nucleic acid cassette of the present invention may include a spacer sequence in addition to the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B. Without wishing to be bound by theory, it is because inclusion of the spacer sequence enhances the RNAi action. Such spacer sequences can be appropriately selected by those skilled in the art, but preferably, intron sequences can be used. Such spacer sequences, preferably intron sequences, are advantageously included between the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B. While not wishing to be bound by theory, the proper placement of the intron sequence can be more efficient when the intron portion of the pre-mRNA is excised in the cell and is more efficiently converted to a molecular structure that provides RNAi action. It is because it is considered.
  • the nucleic acid cassette of the invention comprises a signal sequence May be included.
  • a signal sequence is located upstream of the foreign gene, preferably in-frame.
  • such an arrangement is more preferably just before the translation start site of the foreign gene.
  • the signal sequence used in the present invention is advantageously a storage protein signal sequence.
  • the storage protein is transported to the endoplasmic reticulum ⁇ ⁇ ⁇ by the effect of the signal sequence, and is transported to the protein pods as appropriate, where it is stably accumulated in large quantities. Therefore, by mimicking this process, the protein encoded by the foreign gene located downstream of the storage protein signal sequence is efficiently accumulated in the seed.
  • this signal sequence is advantageously a prolamin signal sequence.
  • a prolamin promoter is more effective for the expression of a foreign gene, so that the prolamin signal sequence is more suitable for use in combination therewith.
  • the prolamin signal sequence include, but are not limited to, signal sequences of 10 kDa prolamin, 13 kDa prolamin, and 16 kDa prolamin. Such an arrangement of the signal sequence can be realized using techniques well known in the art.
  • the target sequence is It is understood that the arrangement at the desired position can be performed by cutting out and connecting to the desired position.
  • the nucleic acid vector of the invention further comprises a promoter sequence.
  • a promoter sequence By having such a promoter sequence, the prolamin-suppressing effect of the present invention can be made more efficient, and / or the expression of a foreign gene can be improved.
  • the present can be realized more efficiently or with the desired specificity.
  • the placement of the promoter can also be carried out arbitrarily by those skilled in the art using techniques known in Fenno.
  • the promoter sequence is operably linked to both the foreign gene and said nucleic acid sequence B. This is because it can drive, induce or enhance the expression of both genes (foreign gene and antisense gene).
  • both the foreign gene and the nucleic acid sequence B it is advantageous for both the foreign gene and the nucleic acid sequence B to be independently operably linked to separate promoter sequences. By including such independent and separate promoters, separate expression control can be performed.
  • a promoter sequence (promoter sequence A) operably linked to a foreign gene used in the nucleic acid cassette of the present invention and a promoter sequence (promoter sequence) operably linked to nucleic acid sequence B
  • it differs from B).
  • the promoter sequence B used in the present invention is a promoter sequence expressed in seeds, and more preferably a promoter sequence expressed at high levels in seeds. It is thought that prolamin expression can be effectively suppressed more efficiently than the promoter with high expression level. Promoters that are expressed at high levels in such seeds include, for example, promoters of storage proteins (eg, glutelin, globulin, prolamin), and genes (polyubiquitin, actin, etc.) that are essential for cell vitality. Derived from In order to achieve efficient suppression of prolamin, one of the storage proteins, the use of a promoter of prolamin itself is not an essential condition. This is because the present invention was unexpectedly shown for the first time.
  • promoters of storage proteins eg, glutelin, globulin, prolamin
  • genes polyubiquitin, actin, etc.
  • the promoter sequence B of the present invention is more preferably derived from a storage protein promoter and different from the promoter sequence A.
  • the nucleic acid cassette of the present invention can efficiently control foreign genes and prolamin suppression, and can maximize expression. It becomes possible.
  • the promoter sequence B that can be used in the present invention includes a porubiquitin promoter, a 26 kDa globulin promoter, a gnoreterin A promoter, a gnoreterin: B promoter, a 16 kDa prolamin promoter, a 13 kDa prolamin promoter, and a 1 kDa prolamin promoter. Examples include, but are not limited to, the 0 kDa prolamin promoter and variants or fusions thereof.
  • the promoter sequence A used in the present invention is derived from a storage protein promoter. Storage protein promoters are limited in their expression specificity to seed and have high expression levels.
  • a promoter connected to a foreign gene includes a promoter (eg, SEQ ID NO: 60) derived from the same type of storage protein as the storage protein (eg, 13 kDa prolamin) targeted for repression. ) Is preferably used. The reason is that the mRNA level of the target storage protein may be increased in order to overcome the suppression of expression, and the ripple effect can be used for the expression of a foreign gene. is there.
  • promoter sequence A can be a promoter naturally associated with nucleic acid sequence B.
  • a promoter derived from 13 kDa prolamin or 10 kDa prolamin can be used as the promoter.
  • 13 kDa prolamin is a multigene family but has the highest content of prolamins, and is most prominently expressed in protein mutant rice such as low glutelin strains Has the characteristic of rising.
  • the presence of l OkDa prolamin in a single gene is confirmed by the electrophoresis pattern, so a high expression level in the steady state is guaranteed, and the expression increases in protein mutant rice such as low glutelin strains There are features.
  • the promoter activity is considered to be very high in all cases, and is more useful. Whether the promoter of 13 kDa prolamin or 10 kDa prolamin is more advantageous should be judged based on the characteristics of the introduced cultivar and the characteristics of the foreign gene to be expressed.
  • the promoter sequence A connected to the foreign gene used in the present invention includes a 26K globulin promoter, dalterin A promoter, gluterin B promoter, 16 kDa prolamin promoter, 10 kDa prolamin promoter, and 13 kDa prolamin. Examples include, but are not limited to, promoters.
  • a prolamin promoter more preferably, a 13 kDa prolamin promoter or a 10 kDa prolamin promoter can be used as the promoter sequence A.
  • the promoter sequence A is derived from a prolamin promoter
  • the promoter sequence B is derived from a promoter other than the prolamin promoter. Examples of such combinations include, but are not limited to, the 13 kDa promoter and the 10 kDa promoter.
  • the nucleic acid cassette of the present invention comprises a foreign gene And a signal sequence in frame between the promoter sequence.
  • the nucleic acid cassette of the invention comprises a terminator sequence.
  • Appropriate arrangement of the terminator can control the expression appropriately.
  • the terminator sequence is preferably a 10 kDa prolamin terminator sequence.
  • the terminator sequence of the 10 kDa prolamin has not been used before, it has been shown for the first time by the present invention that it can be used for controlling gene expression in combination with various promoters. That is a special achievement. Since it is a sequence derived from a plant (rice) and is derived from a gene expressed in a seed, which is a main target organ to which the present invention is applied, it can be said that it is more preferable than one of the terminator derived from Pacteria.
  • a foreign gene contained in the nucleic acid cassette of the present invention is included, and the foreign gene is preferably present upstream of the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B.
  • adopting such an arrangement may have, but is not limited to, the advantage that foreign genes can be expressed after confirmation of prolamin suppression.
  • the nucleic acid cassette of the invention advantageously comprises a spacer sequence, preferably an intron sequence, between the nucleic acid sequence A and the nucleic acid sequence B. This is because the RNAi effect is promoted.
  • the present invention provides a method for producing a nucleic acid cassette.
  • the method comprises the steps of: A) converting a nucleic acid sequence having at least 15 consecutive nucleotides or a nucleic acid sequence having at least 15 consecutive nucleotides that is complementary to a nucleic acid sequence encoding a prolamin polypeptide; A nucleic acid sequence having at least about 15 contiguous nucleotides derived from a nucleic acid sequence encoding at least about 70% homologous nucleic acid sequence B and a prolamin polypeptide; A set comprising a nucleic acid sequence A comprising a nucleic acid sequence at least about 70% homologous to a nucleic acid sequence having a length of 5 contiguous nucleotides An upstream gene operably comprising a promoter sequence B, wherein the foreign gene is located upstream or downstream (preferably, but not limited to) upstream of the promoter sequence B; Providing a nucleic acid cassette to which sequence A is linked; B
  • the one having the activity of more efficiently reducing the expression level of prolamin is preferentially selected, so that the production efficiency of the nucleic acid cassette of the present invention and the convenience of using the present invention Rises remarkably.
  • the present invention provides a vector comprising the nucleic acid molecule of the present invention. Therefore, the vector of the present invention can be provided as a vector containing the nucleic acid cassette described above.
  • the vector may contain regulatory sequences (elements) such as a promoter sequence. Regulatory sequences include, but are not limited to, enhancers, promoters, transcription termination sequences, translation termination sequences, transcription origins, intron sequences, and the like.
  • the vector further includes a sequence having promoter activity.
  • the sequence having this promoter activity may preferably be a promoter of a storage protein. This is because a promoter of a storage protein is expected to have a transcription promoting activity in seeds. In the present invention, it has been found that, regardless of the type of storage protein, any storage protein derived from a promoter is useful for prolamin antisense sequence activity expression. At the same time, it was shown that the sequence derived from the prolamin promoter was more useful for the active expression of the antisense sequence than that derived from other storage proteins. This is a special achievement that has been proved for the first time in the present invention.
  • sequence having promoter activity is operably linked. May be the promoter of the structural gene from which the antisense sequence is derived.
  • the promoter may be from the same plant species as the plant from which the antisense sequence is derived. It is expected that the use of the same plant species will perform better.
  • the vector of the present invention may preferably further include a terminator.
  • the vector of the invention may, in another embodiment, further comprise a selectable marker.
  • a selectable marker may be any, but for convenience, an antibiotic Hi-producing gene (for example, hygromycin phosphotransferase) is preferred.
  • an antibiotic Hi-producing gene for example, hygromycin phosphotransferase
  • the vector of the present invention may include a sequence encoding a foreign gene (eg, a marker gene such as a GFP gene or a useful gene) different from the antisense sequence.
  • a foreign gene eg, a marker gene such as a GFP gene or a useful gene
  • Such a foreign gene can be a structural gene.
  • Such a foreign gene may be a protein that is desired to be expressed in large amounts.
  • Such proteins include, for example, pharmaceutically active peptides (eg, cytokines (interleukins, chemokines, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF)) Hematopoietic factors such as granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), mu1ti_CSF (IL-3), erythropoietin (EPO), leukemia inhibitory factor (LIF), c-kit ligand (SCF) Death factor (TNF), interferons, platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (V EGF)), hormones (insulin, growth hormone, thyroid hormone, etc.)), vaccine antigens, blood products, agriculturally useful peptides such as antibacterial proteins, physiological effects and pharmacology
  • cytokines interleukins, chem
  • Nutritionally significant substances include, but are not limited to, casein, albumin and globulin of legumes, and enzymes for synthesizing vitamins, sugars, and lipids.
  • proteins that contribute to food properties such as wheat glutenin (bread making), soy globulin group (tofu), milk casein group (cheese), etc.
  • Proteins to be enhanced for example, enzymes for synthesizing special sugars and amino acids such as cyclodextrins, oligosaccharides, and ⁇ / aminoacetic acid, pigments for improving the appearance, and proteins involved in the synthesis of taste components, or in the digestive tract
  • enzymes for synthesizing special sugars and amino acids such as cyclodextrins, oligosaccharides, and ⁇ / aminoacetic acid
  • pigments for improving the appearance and proteins involved in the synthesis of taste components, or in the digestive tract
  • artificial proteins designed to cut out peptides having physiological effects eg, angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides having blood pressure effects
  • Such a foreign gene is preferably operably linked to a promoter.
  • any promoter can be used, but preferably, it is derived from a storage protein. More preferably, as such a promoter, those derived from prolamin (10 kDa prolamin promoter, 13 kDa prolamin promoter, 16 kDa prolamin promoter, etc.) are used.
  • the present invention provides a plant cell comprising the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the present invention also provides a plant cell transformed with the vector of the present invention.
  • Such plant cells may be transiently transduced with the vector of the present invention or may be permanently transformed.
  • the plant cells of the present invention can also include a nucleic acid molecule encoding a foreign gene different from the antisense construct of the present invention. Examples of such foreign genes are as described above.
  • the plant species from which prolamin used in the present invention is derived and the plant species of the plant cells of the present invention may be the same or different.
  • both plant species may be the same. The varieties of these two plants may be the same or different.
  • both plant varieties may be of the same variety.
  • the plant species from which the prolamins of the invention are derived such as Z or the plant cell, may be rice. More preferably, the plant species from which the prolamin of the present invention is derived and / or the plant species of the plant cells may be Japonica or Indiana rice.
  • the nucleic acid molecule of the present invention in the plant cells of the present invention, can be introduced into chromosomes on both sides, but those introduced into only one pair may also be useful.
  • the present invention provides a plant tissue comprising the plant cell of the present invention.
  • the present invention also provides a plant tissue comprising the nucleic acid molecule of the present invention.
  • Such plant cells or nucleic acid molecules may be in the preferred forms described above.
  • the present invention provides a plant tissue (or a part, a site, or the like) of a plant comprising the polynucleotide or the vector of the present invention.
  • a plant tissue include a seed or a part derived therefrom. Therefore, any tissue that can form a protein body can be used.
  • the thread and tissue of the present invention may be those transduced with the polynucleotide or vector of the present invention.
  • the tissue of the present invention may be transiently or constantly transformed with the polynucleotide or the vector of the present invention.
  • the polynucleotides of the present invention introduced by such transformation can be expressed constitutively or specifically.
  • the present invention provides a plant comprising the nucleic acid molecule of the present invention.
  • a plant comprising the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the plant can preferably be rice.
  • This plant is It may further comprise a nucleic acid molecule encoding a foreign gene different from the antisense construct of the invention.
  • Such plants are also referred to herein as transgenic plants, and can be obtained by regenerating (regenerating) the plant cells or tissues of the present invention using techniques well known in the art.
  • a cell eg, a plant cell
  • a desired polynucleotide eg, a polynucleotide or a vector of the present invention
  • a desired percentage of such transformed cells can be obtained from such a transformed cell.
  • transgenic organisms eg, plants
  • any organism that can use the cells of the organism that can be transformed can produce a transgenic organism containing the polynucleotide or vector of the present invention.
  • the transgenic plant can be obtained, for example, by growing cells transformed with the polynucleotide or the vector of the present invention, forming a tissue or organ, and redifferentiating it. It can be a plant.
  • tissue or organs can be any, including, but not limited to, calli, roots, stems, and the like. Since a plant is basically totipotent in any organ, any plant or organ containing the polynucleotide or the vector of the present invention can be used in any plant or tissue. Can also be used for regeneration of plants. Where the present invention is a woody plant, transgenic plants can be created using protocols such as those described herein.
  • the species of the plant from which prolamin is derived and the species of the plant may be the same or different.
  • both species may be homologous.
  • both species may be the same variety or different varieties.
  • both species may be of the same variety.
  • the plant species of the plant of the present invention and the plant species from which z or prolamin are derived can be rice. More preferably, both plant species may be Japonica rice.
  • the rice may preferably be LGC-1.
  • the nucleic acid molecule of the present invention in the plant of the present invention, can be introduced into both chromosomes, but those introduced into only one pair can also be useful.
  • the present invention provides a seed produced from the plant of the present invention.
  • the protein content in particular, prolamin
  • the plant of the present invention contains the antisense construct of the present invention, the protein content (in particular, prolamin) in the seed is significantly reduced. Therefore, it is understood that when such seeds are used for food, the seeds of this effort are particularly useful in applications where low protein is preferred.
  • the plant of the present invention further contains a nucleic acid molecule encoding a foreign gene, it is recognized that the expression of the polypeptide encoded by such a foreign gene is remarkable. Therefore, the seed of the present invention can be used as a useful protein production device (bioreactor).
  • the present invention also provides a starch preparation prepared from the seed of the present invention.
  • Such starch preparations have significantly reduced protein content, including storage proteins such as prolamin.
  • storage proteins such as prolamin.
  • such starch preparations may be utilized in applications where low protein is preferred.
  • the starch preparation of the present invention contains the polypeptide encoded by the foreign gene. Since such polypeptides can be useful proteins, such starch preparations may be used as raw materials for such useful proteins or secondary sources derived from the functions of such useful proteins or useful proteins. It is preferred to provide foods to which metabolites have been added.
  • the present invention provides a composition comprising a gene product of a foreign gene produced from the plant of the present invention or the seed of the present invention. Since the gene product of such a foreign gene is efficiently produced in an edible portion by using the system of the present invention, it is used as an edible product, a nutritional supplement, a pesticide, a cosmetic product, a pharmaceutical product, or other uses. Highly preferred for use.
  • the present invention provides a method for reducing the expression level of a protein in a seed in a plant.
  • This method comprises the steps of: A) providing the nucleic acid molecule of the present invention; B) introducing the nucleic acid molecule into cells of the plant; C) re-differentiating the cells to produce a transgenic plant. And D) obtaining seeds from the transgenic plant.
  • the technique for providing the nucleic acid molecule of the present invention is well known in the art, and it is understood that any technique can be used to provide the nucleic acid molecule of the present invention. Techniques for introducing nucleic acid molecules into plant cells are also well known in the art, and such techniques are well described in the literature cited in the present invention and the like.
  • the introduction of the nucleic acid molecule into the cells of the plant can be transient or permanent.
  • Techniques for transient or homeostatic gene transfer are each well known in the art.
  • Techniques for producing transgenic plants by differentiating cells used in the present invention are also well known in the art, and it is understood that such techniques are well described in the literature cited in the present invention and the like. Is done.
  • Techniques for obtaining seeds from transgenic plants are also well known in the art, and such techniques are described in the literature cited in the present invention and the like.
  • the method of the present invention for reducing the expression level of a protein in seeds can be carried out using a known technique.
  • the gene transfer technique used in the present invention may be any technique known in the art.
  • the gene introduction step used in the present invention employs an agrobacterium method. You.
  • the method for reducing the expression level of protein in seeds in the plant of the present invention further comprises the step of: E) selecting cells of the plant into which the nucleic acid molecule of the present invention has been introduced.
  • E) selecting cells of the plant into which the nucleic acid molecule of the present invention has been introduced By including this step, transgenic plants can be grown more efficiently, but it is not always necessary to select them in the practice of the present invention.
  • selection methods vary depending on the characteristics of the introduced nucleic acid molecule. For example, when a resistance gene to an antibiotic (eg, hygromycin, kanamycin, etc.) is introduced, the specific antibiotic is used. To select the desired cells.
  • a marker gene for example, a green fluorescent gene
  • the target cell can be selected based on such a marker.
  • the present invention provides a method for expressing a foreign gene in a plant seed.
  • the method comprises the steps of: A) providing a nucleic acid molecule of the present invention; B) providing a nucleic acid molecule encoding the foreign gene; C) nucleic acid molecule according to claim 1 and a nucleic acid encoding the foreign gene.
  • the technique for providing the nucleic acid molecule of the present invention and the nucleic acid molecule encoding the foreign gene is well known in the art, and any technique can be used to provide the nucleic acid molecule of the present invention. It is understood that it is possible.
  • These two nucleic acid molecules may be provided together or separately. Preferably, both can be provided in the same vector. By providing both in the same vector, the nucleic acid molecule can be introduced into plant cells at once.
  • nucleic acid molecules into plant cells are also well known in the art, and such techniques are well described in the literature cited for the present invention.
  • Introduction of nucleic acid molecules into plant cells may be transient or permanent.
  • Techniques for transient or homeostatic gene transfer are each well known in the art.
  • Techniques for producing transgenic plants by differentiating the cells used in the present invention are also well known in the art, and such techniques are well described in the literature cited in the present invention and the like. Is understood.
  • Techniques for obtaining seeds from transgenic plants are also well known in the art, and such techniques are described in the literature cited in the present invention and the like.
  • the gene transfer step used in the present invention uses the agrobacterium method.
  • the antisense construct of the present invention and a nucleic acid molecule encoding a foreign gene are separately provided and introduced into a cell, the introduction into the cell may be performed by the same method or by different methods. May be.
  • the method for reducing the expression of a protein in seeds in the plant of the present invention further comprises the step of: F) selecting cells of the plant into which the nucleic acid molecule of the present invention has been introduced.
  • F) selecting cells of the plant into which the nucleic acid molecule of the present invention has been introduced By including this step, transgenic plants can be grown more efficiently, but it is not always necessary to select them in the practice of the present invention.
  • selection methods vary depending on the characteristics of the introduced nucleic acid molecule. For example, when a resistance gene to an antibiotic (eg, hygromycin, kanamycin, etc.) is introduced, the specific antibiotic is used. To select the desired cells.
  • a marker gene for example, a green fluorescent gene
  • the target cell can be selected based on such a marker.
  • the transfected cells may be selected based on such a difference.
  • identifiable differences include, but are not limited to, for example, the presence or absence of a dye.
  • the method for expressing a foreign gene of the present invention preferably further comprises the step of: Isolating the gene product of the exogenous gene from the above.
  • Solvent extraction method salting out method with ammonium sulfate, desalting method with organic solvent, precipitation method with organic solvent, anion using resin such as getylaminomine (DEAE)-Sepharose, DIAI ON HPA-75 (Mitsubishi Chemical) Exchange chromatography, cation-exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose, fenii sepharose, etc.
  • resin such as getylaminomine (DEAE)-Sepharose, DIAI ON HPA-75 (Mitsubishi Chemical) Exchange chromatography, cation-exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose, fenii sepharose, etc.
  • a purified sample can be obtained using a technique such as a chromatography method, a gel filtration method using a molecular sieve, an affinity-chromatography method, a chromatofocusing method, or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.
  • the cells in the culture are collected by centrifuging the culture. After washing the cells, the cells are crushed with an ultrasonic crusher, French press, Mantongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract is subjected to solvent extraction, salting out using ammonium sulfate, desalting, precipitation with an organic solvent, dimethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose (S epharose), anion exchange chromatography using a resin such as DIAI ON HPA-75 (Mitsubishi Chemical), resin such as S-Sepharose FF (Pharma cia), etc.
  • solvent extraction salting out using ammonium sulfate, desalting, precipitation with an organic solvent, dimethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose (S epharose), anion exchange chromatography using a resin such as DIAI ON HPA-75 (Mitsubishi Chemical), resin such as S-Sepharose FF (Pharma cia), etc.
  • Cation exchange chromatography using gin hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose, phenylsepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, and chromatographic
  • a refined sample can be obtained by using a technique such as a force sizing method or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.
  • a polypeptide such as the gene product of the foreign gene of the present invention was formed by forming an insoluble substance in the cells, the cells were similarly recovered, broken, and centrifuged. After recovering the polypeptide from the precipitate fraction by an ordinary method, the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a polypeptide denaturing agent. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a solution containing no polypeptide denaturing agent or a diluting solution in which the concentration of the polypeptide denaturing agent does not denature the polypeptide. After forming the three-dimensional structure, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above. In addition, when it can be accumulated in a specific organelle in a cell, for example, a protein body, the protein can be purified after separating the organelle.
  • the protein can be purified according to a general protein purification method (J. Evan. Sadler et al .: Methodsin Enzymology, 83, 458).
  • a polypeptide such as the gene product of the foreign gene of the present invention is produced as a fusion protein with another protein, and the affinity chromatography is performed using a substance having an affinity for the fused protein.
  • the method of Lawe et al. (Larseneta 1., Proc. 4, 1288 (1990)
  • the polypeptide of the present invention is produced as a fusion protein with protein A, and immunoglobulin G is used.
  • polypeptide of the present invention can be produced as a fusion protein with a FLAG peptide, and purified by affinity chromatography using an anti-FLAG antibody (Larsenetal., Proc. Natl. Ac. d. S ci., USA, 86, 8227 (1989), Kukow ska Lata 11 o JF, Genes Dev., 4, 1288 (1990)).
  • the polypeptide of the present invention can be purified by ab initia mouth chromatography using an antibody against itself.
  • the polypeptide of the present invention can be prepared by a known method [J. Biomolecular NMR, 6, 129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biochem., 110, 166-168 ( 1991)], and can be produced using an invitro transcription-translation system.
  • the present invention provides a composition containing a gene product of a foreign gene produced by the method of the present invention.
  • the gene product contained in such compositions will vary depending on the foreign gene used, but will preferably be a protein.
  • the present invention relates to the use of the nucleic acid molecule of the present invention for reducing the expression of a protein in seeds in a plant.
  • the present invention relates to the use of the nucleic acid molecule of the present invention for expressing a foreign gene in a plant seed.
  • the natural protein expression of the plant is reduced.
  • the reduced expression of native proteins makes the expression of gene products (especially proteins) of the foreign gene of interest significantly more efficient.
  • an antisense construct was constructed in which the following antisense sequences were combined with the following promoter sequences.
  • the antisense construct for the purpose of reducing prolamin is referred to as the "LP gene or LP cassette”
  • the recombinant rice strain into which it has been introduced is referred to as the "LP strain”
  • the system with a decrease is generally referred to as the “LP13K system”.
  • H Nipponbare
  • LGC-1 as LG
  • H-LP13K indicates “Nipponbare, in which prolamin is reduced by introducing the LP gene”.
  • cassettes for imparting resistance to hygromycin C aMV35 S promoter-1 (SEQ ID NO: 49), hygromycin phosphotransferase (SEQ ID NO: 54) and Those containing Nos terminator (SEQ ID NO: 55) were used.
  • the subsequent expression vector construction was carried out using Escherichia coli JM109 in accordance with a standard method in molecular biology experiments.
  • FIG. 1 shows an example in which the binary vector pPZP202 (Plant Molecular Biology 25, 989—994, 1994) and pUC19 as a support plasmid for construction are used, but other binary vectors are used. And the plasmid may be similarly modified. Briefly, the process is based on the two original vectors pUC 19 and the binary vector pPZP 202 (Plant Molecu 1 ar Biology 25, 989-994, 1994), which are known in the art (Transgenics).
  • modified vectors pUC 198 AP, pUC 198AA, pUC 198 PP and! PZP 2028 was constructed.
  • pUC198AM having AscI and one site of MluI, which is a 6-base recognition enzyme capable of being linked to AscI was also prepared.
  • the HPT gene which is a selection marker gene, produced a modified gene mHPT in which the internal EcoRI, PstI, and NcoI sites were deleted by site-specific conversion (amino acid sequence No. 56).
  • FIG. 2 shows an example of a specific expression vector structure.
  • a terminator was ligated to SacI—EcoRI of the pZH2B vector, and then a promoter was ligated to HindIII-XbaI.
  • the antisense gene fragment was ligated between the XbaI and SacI sites.
  • SacI-EcoRI was ligated with a nos terminator and HindIII-XbaI with a modified rice polyubiquitin promoter.
  • a GUS gene fragment (SEQ ID NO: 59) with the indicated restriction enzyme sites (5, Xbal and BglII on the side, Spel and BamHI on the 3 'side) or the gene aspartate protease gene
  • a basic RNAi expression vector was constructed by ligating the intron sequence (SEQ ID NO: 97) to XbaI-BamHI. Then select one suitable prolamin gene fragment to be repressed and ligate it in the opposite direction, one for XbaI or: Bg1II, one for SpeI or BamHI. Completed.
  • transgenic rice cultivars (Nippon Harupo LGC-1) were transformed to produce transgenic rice. Nipponbare was used as a typical rice variety. LGC-1 was used to confirm the effect of the present invention on prolamin more clearly because the amount of glutelin in the seeds was greatly reduced and prolamin was increased in rice caused by radiation mutation of diphtheria scorpion. .
  • Each antisense prolamin gene expression vector shown in Fig. 2 was first electroporated into agrobacterium EHA101, and the bacteria retaining the vector were transformed with 10 Omg / L of spectinomycin. LB agar medium was selected. Until the infection with Agrobacterium, the method of Raineri et al. (Raineri DM., Bio / Technology 8, 33-38, 1991) was partially modified and carried out. The operation and the medium were performed according to the method of Toki et al. (Toki. S., Plant Molecular Biology Reorter 15, 159-164, 1997).
  • rice cells were cultured at 28 ° C.
  • Gelrite (Wako Pure Chemical) having a concentration of 0.4% was used as a support for the medium.
  • Rice seeds without paddy are soaked in 70% ethanol, and then sterilized by dipping in hypochlorous acid with an effective chlorine concentration of about 2%.
  • Agurobakute potassium the AAM medium holding the introduced target gene (Mn S0 4 ⁇ 4H 2 0 1 Omg / L, H 3 B0 3 3mg / L, Z n S0 4 ⁇ 7H 2 0 2mg / L, N a 2 Mo 0 4 ⁇ 5H 2 0 0. 25m g / L, Cu S0 4 ⁇ 5H 2 0 0. 025mg / L, CoC l 2 - 6H 2 0 0.
  • the cell mass from which endosperm and sprouts were removed was also contained in a regeneration medium (NH 4 N 0 3 165), also containing 5 mg / L of hygromycin and also containing 2 mg / L of power inetine and 0.02 mg / L of NAA as hormones.
  • a regeneration medium NH 4 N 0 3 165
  • KN0 3 190 omg / L, C a C 1 2 ⁇ 2H 2 0 44 omg / L, Mg S 0 4 ⁇ 7H 2 0 37 omg / L, KH 2 P0 4 170 omg / L, F e S0 4 ⁇ 7H 2 0 27. 8mg / L, E DTA- 2N a 37.
  • Nonens culture soil containing micronutrients was placed in a plastic pot (diameter 15 cm), transferred to a hormone-free medium, and transplanted with a one-month-old rice plant. Usually, it was seeded in an isolated greenhouse under natural light. In some cases, a 16-hour light cycle (more than 15,000 lux, 30 ° C) —an 8-hour-period (25 ° C) cycle in an artificial weather device (such as Nippon Medical FH301), followed by 2 months Seeds were cultivated in a cycle of 12 hours light (15,000 lux or more, 30 ° C)-12 hours long, 25 ° C for 2 to 3 months.
  • Example 3 Using the seeds harvested in Example 3, the state of proteins present in the seeds was analyzed. The detailed procedure is shown below. Using the SDS-PAGE method, a technique well known in the art, the composition of seed protein was analyzed using an acrylamide gel at a concentration of 18%. For each independent recombinant rice line, randomly select 12 seeds, number them one by one, divide them into two so that the correspondence is clear, and half the embryos contain 5 Omg / L hygromycin The cells were seeded on a hormone-free medium. Half of the sawdust is sandwiched between the folded foils and beat with a hammer and pulverized well. ) And vortexed for 1 minute to extract the protein.
  • the dye solution 25 mM Tris, containing 10% glycerol at pH 6.8, 0.025% bromphenol, 5% 2-mercaptoethanol
  • the concentration of the band of the above gel was measured by On eD / ZeroD Scan (Analysistics Inc.).
  • FIG. 3 shows the above results.
  • the major storage proteins are shown on the right of the gel picture.
  • glutelin D and F
  • 13 KDa prolamin B
  • the prolamin antisense gene was introduced into them, 13KDa prolamin (B) was significantly reduced as shown in lanes 4 and 5, and lOKDa and 16KDa prolamin were also slightly reduced.
  • Glutelin- ⁇ globulin expression did not change.
  • the radiation mutation of diphtheria serrata caused a significant increase in prolamin (A to C) and globulin (E) in rice (LGC-1) due to the radiation mutation. Most of the decrease in glutelin content is offset.
  • a prolamin antisense gene is introduced into it, as shown in Lane 6, the content of prolamin (A to C) is significantly reduced, while the characteristic of low glutelin content is retained and globulin is also retained. I didn't. In this way, it can be seen that the gene of the present invention reduces prolamin and reduces the amount of seed protein by that much when introduced into any variety, and is very effective in producing low-protein rice. I understand. Fig.
  • the SDS-PAGE gel was measured with a densitometer to relatively quantify and compare the amount of protein.
  • SDS-PAGE was performed using an appropriate amount of the above extract (for example, 5 ⁇ l, 15 ⁇ l, 30 ⁇ l), and the concentration of the band was similarly quantified to estimate the amount of protein.
  • the DNA was transferred to a PVDF membrane, and 13 KDa prolamin was detected using an anti- 13 KDa polyclonal antibody according to a Western blot kit (BioRad, etc.). The concentration of the detected band was quantified in the same manner as in SDS-PAGE to estimate the amount of protein.
  • Fig. 5 shows the results of Western blotting.
  • the absorbance of the band recognizing 13 KDa prolamin decreased from 10% to 28% compared to the original cultivar. The measurement results suggested that prolamin may be further reduced.
  • the following table shows the results of the pan concentration of major storage proteins measured by densitometer.
  • the antisense construct of the present invention not only reduced prolamin cleavage, but also had an inhibitory or neutral effect on other storage proteins. This result is quite different from the increase in prolamin in low glutelin plants, which resulted in little change in total seed protein. This is an unexpected result.
  • the change in crude protein content was verified by measuring brown rice nitrogen content. Briefly, it is as follows.
  • the method used was the Kjeldahl method, which is a conventional method for chemical analysis of nitrogen content. Put 10 seeds in a special test tube, add decomposition promoter, 2 mL of water, and 5 mL of sulfuric acid, heat decompose at 37 ° C, cool to Distilled water was gently poured to the marked line to dilute. In this state, the nitrogen in the seeds becomes ammonia-ammonia and is retained in the sulfuric acid. 10 mL of this decomposition solution was added with an equal amount of 30% sodium hydroxide, and ammonia generated by water vapor distillation was trapped in a saturated boric acid solution. A pH indicator is added to this boric acid solution, titrated with hydrochloric acid, and the amount of ammonia is determined from the neutralization point. Then, the amount of nitrogen was calculated therefrom. The results are shown in the table below.
  • the antisense construct of the present invention is capable of significantly reducing the nitrogen content of seed protein, that is, the amount of seed protein, that is, achieving low protein. It can be said that.
  • the use of the above construct of the present invention significantly reduced the amount of 13 k prolamin expressed.
  • Other prolamins (10k, 16k) also showed similar or slight reductions.
  • Glutelin and globulin expression was comparable to the original cultivar prior to the introduction of the above constructs of the present invention. Therefore, from these results, it can be said that the construct of the present invention significantly reduces the total expression level of seed proteins.
  • prolamin antisense gene of the present invention was produced for various types of constructed genes. Seeds of 10 or more independent lines were analyzed for each 10 seeds according to the method of line selection, and the results were summarized as follows.
  • These transformed rice plants were: 1) the number of lines with at least one seed with reduced 13 kDa prolamin level, and 2) the seeds with 13 kDa prolamin level less than 50% of the non-transformants. Number of lines, 3) All the seeds that showed hygromycin resistance were analyzed for those in which the amount of 13 kDa prolamin was reduced.
  • the gel after electrophoresis was read with a gel reader, and the absolute value of the index was set to 100% for the non-transformant, and the value of the control was calculated.
  • results of items 1 and 2 above are indicators of the ability of the construct to suppress the expression of 13 KD aprolamin, and the higher the number in each item, the more efficient the construct. It can be seen that the antisense construct of the present invention efficiently suppresses the expression of the target 13 KD aprolamin, but also shows that there is a difference in efficiency depending on the structure of the construct (particularly, promoter). I have.
  • the results in item 3 indicate that the phenotypes of hygromycin resistance and antisense do not completely match.
  • the transgenic gene alone may not sufficiently exert the 13 kDa prolamin inhibitory effect on any one of the two pairs of chromosomes. Therefore, in the present invention, it may be preferable that the transgene enters both of the two chromosomes.
  • the introduced gene is randomly integrated into the chromosome, and the degree of expression varies depending on the location where the gene is inserted. It is common knowledge to those skilled in the art that even when 100 individuals into which the same gene is introduced are produced, the expression level varies from individuals in which the transgene is well expressed to individuals in which the gene is not expressed at all.
  • Example 6 Next, the protein bodies in the seeds produced in Example 6 were observed. Observation of the mouth tin body was performed according to the following procedure.
  • the flowering paddy was marked and sampled after 7, 10, 14 and 21 days. Immediately after making a cut with a power razor on the top and bottom of the seed, put it in a 3% darthal aldehyde solution, fix it on ice, under reduced pressure for 15 minutes, and then at 4 ° C for 12 hours or more. .
  • the seeds were divided into three parts, embedded in LR-White resin (sold by Oken Shoji), solidified, and cut into 90 nm sections using a diamond knife. Thereafter, the sections were processed according to a normal transmission electron microscope sample processing method, and cells on the endosperm surface layer were observed using a transmission electron microscope of JEOL.
  • Fig. 6 shows the results of observation of the seeds on day 14 after flowering.
  • 6a the observation photograph was left as it was.
  • the slightly light gray and smooth spherical shape is Is a protein body that accumulates proteins, and a darker, larger and slightly distorted protein body is a protein body that accumulates glutelin and globulin. It can be seen that the protein granules are tightly packed.
  • 6b shows the same picture as 6a with the protein body type marked. Observation in the same area of view shows that the number of protein bodies 1 is clearly smaller in the LP13K line (6b-1) than in the general variety (6b-2). This indicates that 13 KDa prolamin plays an important role in the formation of protein body 1, and that the number of protein body formation can be controlled by controlling its expression.
  • the surface layer of endosperm cells is very rich in protein, even if not so much as in the bran layer, and it is known that it is preferable to remove as much as possible in both food and processing.However, due to the effect of the prolamin antisense gene, If the amount of protein on the surface layer is greatly reduced, there is an advantage that a product of the same quality can be obtained even if such a process is simplified. In addition, the mechanism of seed homeostasis should try to compensate for the reduced protein with another, and if the gene for the useful protein is forced to be expressed there, the amino acids will be distributed preferentially, possibly It is expected to accumulate in this surface cell.
  • a method was used in which a useful protein expression cassette to be introduced with pUC198AM or pUC198AA was constructed and inserted into an Ascl site of a binary vector. This ensures that the useful protein expression cassette and the prolamin antisense cassette linked on the same plasmid are simultaneously introduced into rice.
  • a useful protein expression cassette constructed with PUC198AM was inserted, the Mlul on one side of the terminator of the input set was linked to Ascl of the vector, and the site disappeared, while the Ascl on the promoter side survived.
  • An expression cassette can be inserted in addition to Ascl.
  • genes 5 and 6 having a structure in which the signal sequence of lOkDa prolamin was inserted before GFP were constructed, and the same analysis was performed.
  • the GFP emission intensity of those seeds increased to a level where it was difficult to compare the expression level.
  • a level was reached at which a clear band not found in the original cultivar presumed to be GFP was detected.
  • the expression level further increased 1.2 times or more compared to the case of gene 5, and accumulated more than 50 // g per grain. Was estimated to be.
  • GFP was estimated to be accumulated at 150 g or more per grain, and the foreign protein was found to be abundant in the seed endosperm.
  • SDS-PAGE pattern of Hare Motoharu in Lane 1 it is well understood that it is an epoch-making invention that is far more isolated than that of another plant, far exceeding conventional expectations. You. It is understood that the use of the present invention greatly accelerates research for creating recombinant rice varieties having completely different characteristics from existing rice.
  • Example 12 Example of expression of a useful foreign gene using low prolamin rice—in the case of cystatin
  • expression of a foreign gene was attempted using cystatin.
  • Figure 15 shows an example of a system that has been studied using GFP, which was applied to actual production of useful proteins.
  • the cystatin used here has the function of specifically inhibiting cysteine protease.
  • Cysteine proteases play an important role as digestive enzymes in Coleoptera and Hemiptera pests and as essential factors for the growth of various viruses. Therefore, if cystatins in crops are enhanced to suppress the action of these cystine proteases, pest resistance and virus resistance can be imparted.
  • cystatin Since cystatin is originally contained in the eating area of crops, it has a long dietary experience, and the risk of using it is considered to be extremely low. Therefore, there is a possibility that it can be applied to the edible part where chemical treatment is difficult.
  • it when expressed in rice, it can be used as a functional rice to help control pests that cause damage to the stored pests, Kokzo ⁇ and ripening paddy, and at the same time, suppress viruses transmitted from the digestive tract. .
  • cystatin gene is expected to be used effectively, but there has been no prospect of practical use.
  • the biggest cause is that crops are not able to accumulate at high levels.
  • the native cystatin content of the crop is known to be at a very low level, suggesting that there may be some regulatory mechanism to keep the expression low, or that the protein may have low stability (prone to degradation) .
  • rice was expressed in rice to provide resistance to cocculata expression level was low and slight growth retardation was achieved, and it was not a practically acceptable level.
  • the present invention was applied to corn cystatin to produce and evaluate cystatin-accumulating rice.
  • This example is similar to Examples 2 to 4 except for the method of extracting proteins from seeds. went.
  • the seed protein extract used for the evaluation was prepared by milling the seeds, extracting with a phosphate buffer of pH 6.0 containing 200 mM sodium chloride, and treating the supernatant in boiling water for 1 minute.
  • the pattern showed exactly the same pattern as that observed for GFP, and the line where the prolamin promoter + signal sequence + cystatin gene was ligated to the prolamin antisense cassette (gene 8) and transfected at the same time Many cystatins were accumulated.
  • the enhancement effect with the prolamin antisense cassette is much greater than with GFP. This is the first time that cystatin has been introduced into plant seeds and a protein has been detected by SDS-PAGE, and it can be said that this is an example that clearly demonstrates the usefulness of the present invention.
  • Example 13 Application of the gene construct of the present invention to another storage protein
  • glutelin and globulin were treated in accordance with Examples 7 and 9.
  • the RNAi gene was constructed and introduced, and analyzed and evaluated according to Examples 2 to 4.
  • the expression of both glutelin and globulin was remarkably suppressed.
  • the foreign protein was able to be expressed efficiently while suppressing all storage proteins.
  • RNAi-type expression suppression cassette illustrated in Fig. 17
  • all the storage proteins are suppressed.
  • foreign proteins could be efficiently expressed.
  • Glutelin B1 promoter and globulin promoter are often used as promoters for expressing useful proteins in rice seeds. These signal sequences have been reported to be effective in increasing expression.
  • useful protein cassettes of genes 5 and 6 promoters (SEQ ID NOS: 47, 48, 60, 62, 106, 107) and signal sequences (SEQ ID NOs: 108 to 117) was examined by substituting it with various types of fissures.
  • the expression of the 6 gene type was enhanced more than the 5 type gene.
  • the gene construct and the structure of the present invention can be generally used for the purpose of unifying seed bioreactors, and it can be said that an extraordinary result which has not been achieved in the past was obtained.
  • the technical concept of the present invention has sufficient versatility and extension in other crop seeds, especially in monocotyledonous crop seeds.
  • it is useful to suppress a certain seed storage protein A by genetic recombination or mutation, and to introduce a gene promoter for the storage protein A or a promoter + signal sequence + a useful protein as a substitute for the gene.
  • a revolutionary new crop that has accumulated a large amount of protein It can be created.
  • Table 17 the present invention provides a demonstration example of the bioreactorization technology of crop seeds, which had been vaguely imagined, up to the specific transgene structure. It is a special achievement.
  • Storage protein promoter Generic signal mouth motor, preferably storage High level of seed, preferably storage expressed at target in D
  • Y preferably a different storage than A
  • Target sequence preferably D, preferably the motor, preferably the storage tank.
  • a protein promoter or species of the same storage protein A protein promoter or species of the same storage protein
  • Pro signal sequence of the protein storage protein which is expressed at a high level
  • a motor or a prolaminator is preferably a promoter.
  • Example 14 Use of the present invention in cooking and processed foods using rice
  • An important work process in the production of processed foods of rice is that water is used after milling (or after flouring into rice flour). This is where the starch is sufficiently immersed to absorb water, and the starch is sufficiently gelatinized by heating.
  • rice which is high in protein (especially prolamin)
  • prolamin has poor water absorption and insufficient starch gelatinization, poor rice swelling and stickiness after heating, and poor swelling and extensibility of rice cake dough, and product quality. It is known to cause a decline.
  • the low protein rice obtained by introducing the prolamin antisense gene into Niimoto and Koganemochi obtained in the previous examples was compared with the original cultivar.
  • LG-LP13K LG C-1 with a trans-lamin antisense gene introduced
  • prolamin expression-suppressing gene in this effort, rice and seeds with reduced total protein content in seeds were obtained.
  • the primary effect is that the reduced nutritive value of prolamin will increase the relative amino acid nutritional value and enhance the function of rice as a protein source.
  • low tamper Since there are many situations where high quality rice is required, it is useful for general food use, processed rice products, sake brewing, and foods for the treatment of diseases in which the absolute amount of amino acid intake is limited, such as kidney disease. Furthermore, it has high potential as a bioreactor that can efficiently express foreign useful proteins.
  • the present invention is a special achievement that has not been achieved by the conventional technology and has a great impact in various fields. Industrial applicability
  • the nutritive value of prolamin is reduced, and the nutritional value of aminoic acid is relatively increased, providing the advantage of providing rice with enhanced function as a protein source.
  • it is useful as a food for low-protein rice, such as food for general consumption, processed rice, sake brewing, and diseases in which the absolute amount of amino acid intake is limited, such as kidney disease.
  • it has a high potential as a bioreactor that can efficiently express foreign useful proteins, and expands the industrial applications of rice through the creation of new crops (rice with new traits) derived from the functions of foreign useful proteins.
  • the present invention is a special achievement that has not been able to be achieved by the conventional technology and has various impacts.

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Abstract

本発明は、貯蔵タンパク質の総量を減少させる方法およびそのために必要な技術の開発、そのような方法によって開発された植物およびその種子、ならびにそのような植物および種子の利用法を提供する。詳細には、プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な少なくとも１５の連続する核酸配列または該相補的な少なくとも１５の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約７０％相同な核酸配列を含む、核酸分子が提供される。植物において種子中のタンパク質の発現量を減少させる方法であって、Ａ）上記核酸分子を提供する工程；Ｂ）該核酸分子を該植物の細胞に導入する工程；Ｃ）該細胞を再分化させてトランスジェニック植物を作出する工程；およびＤ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程、を包含する、方法もまた提供される。

Description

明細書 種子中のタンパク質含量が低減した植物ならびにその作出法および利用法 技術分野
本発明は、 植物の機能改良に関する。 より詳細には、 本発明は、 貯蔵タンパ ク質の発現を低減させる方法および外来タンパク質を効率よく発現させる方法 ならびにそれらに使用するアンチセンス構築物、 RNA i構築物、 組成物、 装 置などに関する。 別の局面では、 本発明は、 ネイティブのタンパク質に代えて 目的のタンパク質を置き換えて発現させる方法に関する。 背景技術
イネなどの穀物を含む植物の機能改良は、 植物の遺伝子操作技術の進歩とと もに、 顕著な進展を見せている。 当初は病虫害抵抗性や除草剤耐性など、 主に 農家を対象とした栽培面における改良が進められたが、 最近ではむしろ、 消費 者にアピールできる要素の大きい食用部分の形質変換に力が入れられるように. 変わってきている。 様々な生理機能ペプチドや抗体のような外来機能性タンパ ク質を植物に発現させる研究は世界中で行われており、 特に種子については、 長期に安定して保存できることから、 そのような外来機能性タンパク質の生産 装置として注目されており （特開 2002— 58492号公報、 Mo 1 e c u 1 a r B r e e d i n g 9 ： 149- 1 58 (2002))、 同時に種子に 発現させるためのプロモーターの研究もされている （P l a n t C e l l Phy s i o l . 39 : 885— 889 (1998))。
イネなどの穀物種子では、 種子中のタンパク質含量は数％〜10%とされて おり、 その大部分は貯蔵タンパク質という形態で存在している。 貯蔵タンパク 質は、 発芽の際に窒素栄養源となるもので、 それ以外の生理機能は有さないと されている。 一般にタンパク質は、 その溶解性に基づいて、 グルテリン、 プロ ラミン、 グロプリン、 アルブミンの 4つに大別されるが、 貯蔵タンパク質のタ イブには植物種ごとに特徴がある。 マメ科種子においてはグロプリンが主要貯 蔵タンパク質であることが多い一方、 穀類などの単子葉植物では、 一部例外を 除いてプロラミンが主要貯蔵タンパク質である （J . E x p . B o t a n y 5 3 ： 9 4 7 - 9 5 8 ( 2 0 0 2 ) )。
イネは、 穀類の中では例外的にグルテリンが主要な貯蔵タンパク質で、 種子 タンパクの 6 0〜7 0 %を占める。 グルテリン遺伝子群は、 ハプロイドゲノム あたり約 1 0個の遺伝子より構成されており、 これらの遺伝子群はコード領域 においてアミノ酸レベルで 6 0〜6 5 %の相同性を示す 2つサブフアミリ一 G 1 u Aおよび G 1 u Bに分類される。 また、 それぞれのサブファミリ一にはァ ミノ酸レベルで 8 0 %以上の相同性を示す 5個程度の遺伝子が含まれている。 グルテリンは、 進化的にはマメの貯蔵タンパク質グロブリンと類縁関係を持つ ており、 アミノ酸組成は比較的必須アミノ酸に富んでいて栄養価が高い。 いつ ぼうプロラミンは、 イネ種子タンパク質の 2 0〜3 0 %を占め、 グルテリンに 次ぐ含有量を持つ。 特徴としては、 グルタミンを多量に含み、 またプロリンも 比較的多く含まれる一方、 必須アミノ酸であるリジンは極めて少なく、 栄養価 が低い。 プロラミンはゲノム中に、 少しずつアミノ酸配列が異なっている類似 した構造の遺伝子が複数存在することが知られており、 その総数は 2 5〜 1 0 0の間であると推定されている。 このほかの貯蔵タンパクとしては、 分子量 2 6 KD aのグロブリンが数％を占めている。 種子中においては、 貯蔵タンパク 質は、 プロテインボディと呼ばれる顆粒状の細胞内構造に蓄積される。 種子を タンパク質の製造工場とするなら、 プロティンボディはタンパク質の倉庫の役 割を果たす。 イネでは、 由来 ·外観が全く異なる 2種のプロテインボディを胚 乳中に共存させている点でも特徴的であり、 それぞれプロテインボディ 1 (プ 口ラミンが蓄積）、 プロテインボディ 2 (グルテリンとグロブリンが蓄積） と呼 ばれる （P l a n t Ce l l Phy s i o l . 28 ： 151 7-1527 (1987)； P 1 a n t P h y s i o l . 88 : 649— 655 (1988) ; P l a n t B i o t e c hn o l o g y, 16 : 103— 113 (1999) ; 醸協 （1 993) 414-420 ；稲学大成第 3卷 32— 39 (1 990) お よび稲学大成第 3卷 317— 325 (1990))。
貯蔵タンパク質を改変する試みは、 いろいろな作物でなされており、 主に栄 養価の改善、 加工特性の改善をめざしたものである。 イネの場合は、 日本酒醸 造や米加工食品の原料として低タンパクであることが好まれるため、 放射線照 射または変異原処理したイネ変異体プールより、 主要な種子貯蔵タンパク質の 含量ゃ糸且成が低減した変異系統の探索が精力的に行われている（I i d a， S. e t a 1. (1997) Th e o r . A p 1. Ge n e t. 94， 177- 183 ; I i d a , S. e t a 1. (1 993) Th e o r. Ap 1. G e n e t . 87， 374-378 ; C r o p S c i . 39 : 825— 831 (1 999) ;育種学研究 4 (別 1) 66 (2002) ；育種学雑詰 47 (別 2) 6 32 (1 997) ；育種学雑誌 47 (別 2) 176 ( 1 997 ) ；育種学雑詰 4 5 (別 2 ) 502 (1995) ；および育種学雑誌 45 (別 1 ) 508 (199 5 ) )。 これまでのところ、 特定のグルテリンぉよぴグルテリン含有量が減少し た変異イネは研究が進んでおり、 これはグルテリンがイネの主要な貯蔵タンパ クであり、 ターゲットとして有力であることにも起因している。 代表的な低グ ルテリンイネ系統としては、 突然変異による LGC - 1と、 アンチセンス法に よる組換え低グルテリンイネ系銃（特許 3149951号公報；育種学研究 3 ： 139 - 149 (2001) およぴ M o l e c u l a r B r e e d i n g 8 ： 273-284 (2001)) が知られている。 このうち LGC— 1につい ては、 変異の原因遺伝子は 1遺伝子で優性遺伝することが明らかにされ、 最近 単離された （Th e P l a n t Ce l l 15, 1455- 1467, (2 003))。 その構造は、 本来は向かいあわせに 2つのグルテリン遺伝子 （G 1 uB4と G l uB 5) が転写されるゲノム領域のうち、 2つの遺伝子に挟まれ た両者のターミネータ一領域が欠落していた。 これにより、 G l uB4プロモ 一ターによる転写は、 本来の終結点を超えて G 1 uB 5遺伝子までをアンチセ ンス方向に転写し、 その結果 G 1 uB 4と G 1 uB 5の相同領域が 2本鎖 RN Aを形成することで、 RNA i現象による貯蔵タンパク質グルテリン全般の発 現抑制が起きていた。 突然変異はそのまま交配育種に利用できることから、 自 身や他のイネと交配した後代の系銃が品種登録にまで至っている （農業技術 5 5 (10)、 26-29 (2000) および育種学研究 4 : 33— 42 (200 2))。 ただし、 LGC- 1遺伝子はグルテリン発現抑制のための最適構造をと つているとは言いがたく、 そのために LGC— 1においても、 なお原品種の 3 0〜50%に及ぶグルテリンが残っている。 なお本発明においても貯蔵タンパ ク質の発現抑制のために RNA i現象を利用しているが、 最適な構造の構築遣 伝子を用いることにより、 発現抑制の効率を大きく上昇させ、 技術的に大きな 進歩をもたらしていることに意義がある。 また低グルテリンイネ系統に共通す る問題点としては、 確かにグルテリンは原品種より大きく減少しているが、 そ の反動としてプロラミンの著しい増大が見られる。 これは一般に種子内のタン パク質を一定に保とうとする調節機構が働いており、 グルテリンが足りないこ とを感知してプロラミン合成を増大させるためである。 その意味では。 低グル テリン系統は、 貯蔵タンパク組成を改変した米であっても、 低タンパク質化に は十分成功していない。
いっぽう、 プロラミンについては、 栄養価に乏しく、 消化性が悪く、 米の加 ェ特性や米飯の味を低下させるとされていることから、 低下させることが望ま れている。 既にいくつかの変異イネが知られているものの （I i d a， S. e t a 1. (1997) Th e o r. Ap p 1. Ge n e t. 94， 177— 1 83 ; l i d a, S. e t a l. (1993) Th e o r. Ap p l . Ge n e t . 87， 374— 378 ；育種学研究 4 (別 1 ) 66 (2002) ;育種学 雑誌 47 (別 2) 632 (1997) ；育種学雑誌 47 (別 2) 176 (199 7) ;育種学雑誌 45 (別 2) 502 (1995) ；および育種学雑誌 45 (別 1) 508 (1995) 15〜： L 9)、 プロラミン低下の度合いが小さい、 ある いは別の変異が同時に起こって稔実しなかったなどの理由から、 有望系統の選 抜は遅れている。 このため、 プロラミンが著しく増大するという、 一連のグル テリン低減系統の問題点を解決する目処はたっていない。 このように、 低プロ ラミンイネの開発は今後の課題として残っている。
, 冒頭に述べた通り、 種子を有用タンパク質の製造装置 （バイオリアクター） として利用する研究が注目を集めている。 種子は食品として長く食べてきた歴 史もあるため、 有害物質の混入のリスクが小さいメリットがあり、 また特別な 精製操作なしに、 そのまま食べられる点も大きい。 このような場合に貯蔵タン パク質が減少した種子を使えば、 余剰のアミノ酸が効率良く外来タンパク質合 成にまわるため、 発現が増大する可能性がある。 貯蔵タンパク質を減少させ、 その分を有用タンパク質におきかえた.としても、 窒素源としての機能は果たし 得るので、種子生理的にも問題はおきにくいと考えられる。また、イネの場合、 グルテリンとプロラミンは厳密にわけられて別々の顆粒に集積することから、 そのしくみをうまく使って、 プロティンボディに集積させることでより発現量 を高めたり、 有用タンパク質を精製しやすくすることも考えられている。 例え ば、 貯蔵タンパク質プロラミンのシグナル配列は、 同一種はもとより、 イネ科 種子、 例えばコムギ、 ォォムギ、 トウモロコシの貯蔵タンパク質でもホモロジ 一が高いことから、 これらの配列を用いてプロテインボディ 1にタンパク質を 集積させることができる可能性がある。
し力 し、 機能性作物の創出をめざして種子に外来タンパク質を発現させた既 存の成果（特開 2002— 17187号公報；特開平 7— 213185号公報； および特表 2001— 518305号公報、 育種学研究 5 (別 2 ) 294 (2 003)) においては、 多くの場合は通常の品種が発現に用いられている。 その 場合、 種子内のアミノ酸プールの大部分がイネの貯蔵タンパク質合成に消費さ れ、 有用タンパク質生産のために使える量は非常に限定されてしまう。 結果と して、 有用タンパク質発現レベルが限定され、 機能改変の効率は良くない。 ま た、 貯蔵タンパク質変異イネを外来タンパク質発現に使った例 （特開 2 0 0 2 - 5 8 4 9 2号公報）.においても、 ダルテリン低減イネは種子タンパク質総量 としてはオリジナルとほぼ同等のため、 やはり有用タンパク質と貯蔵タンパク 質で種子内のアミノ酸プールの競合の問題は解決されていない。 このように既 存の技術においては、 外来タンパク質の効率的な発現系を用いているとは言え ない。
低タンパク質イネがあれば、 何らかの形で米のタンパク質を除去して用いる 場合にも、 少ない労力でタンパク質を除けることから有用である。 一般的な食 用米や米加工食品原料としても、 低タンパク質であることが好ましい （「種子の バイオサイエンス」 種子生理生化学研究会編 学会出版センタ一 2 . イネ 2 5 1 - 2 5 7 ( 1 9 9 5 ) ； 「種子のバイオサイエンス」 種子生理生化学研究会 編 学会出版センタ一 4 . コメの加工製品 3 5 9— 3 6 5 ( 1 9 9 5 ) およ び「種子のパイォサイェンス」種子生理生化学研究会編 学会出版センタ一 5 . 日本酒 ·清酒 3 6 6 - 3 7 1 ( 1 9 9 5 ) ) 力 近年ニーズが増している領域 には、アレルゲン低減米の材料が考えられる。なんらかのアレルギーを持つ人々 は日本人の約 1 / 3にのぼるといわれ、 その中で従来はあまりアレルギーが問 題となっていなかった米についても、 アレルギー患者が増大しつつある。 この ような場合、 栄養的には代替食品を摂取することですむものの、 食べ慣れた米 が突然食べられなくなることは、 精神的な苦痛がはるかに大きい。 そこで、 米 アレルギー患者向けに、 アレルゲンを低減化した加工米のニーズが高まってい る。 米においてアレルゲンとなっているのはグロブリンタンパク質が主であり、 例えば特開平 2 _ 1 6 7 0 4 0号公報ではアレルゲン除去に米にタンパク質分 解酵素を作用させ、 グロブリンタンパク質の分解除去を試みている。 また、 特 許第 3 0 5 5 7 2 9号公報では、 低タンパク質米を原材料にアルカリ洗浄でァ レルゲンを溶解除去する方法が述べられている。 いずれもタンパク質を除去す ることに主眼があることから、 低タンパク質米のほうがタンパク質抽出除去効 率がよくなるはずであるが、 実際に用いているイネ系統は通常の系統か、 貯蔵 タンパクの組成が変化しているが低タンパクにはなっていない系統であり、 効 率的ではない。 また特許第 3 0 5 5 7 2 9号公報では、 既存のいろいろな変異 イネを試しているだけで、 戦略的に機能性作物を開発しているわけではない。 さらに、 その結果好ましいとされた低グルテリンまたは低プロラミンの特性は、 現在の品種では両立しておらず、 単独品種で広い分子量の範囲に分布するァレ ルゲンの包括的な除去には成功していない。
以上のことから、 米および米加工品の高度利用、 機能性植物 ·種子の作出な どの分野において、 低タンパク質の種子の提供、 および種子における外来タン パク質の発現を向上させることに対する需要は高い。
本発明は、 種子のタンパク質含量を減少させる方法およびそのために必要な 技術の開発、 そのような方法によって開発された植物およびその種子、 ならび にそのような植物および種子の利用法を提供することを課題とする。 発明の開示
本発明者らは、 ある種のプロラミンをコードする遺伝子配列の少なくとも一 部 （少なくとも 1 5塩基あれば十分） に対して相補的なアンチセンス分子が、 プロラミン多重遺伝子群の発現全体を顕著に減少させその結果として、 種子の タンパク質含量を減少させ得ることを見出したことによって、 上記課題を解決 した。
従って、 本発明は、 以下を提供する。
1 . プロラミンポリぺプチドをコ一ドする核酸配列に相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相補的な少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む、 核酸分子。
2 . 上記プロラミンポリべプチドをコ一ドする遺伝子配列に相補的な少な くとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列を含む、 項目 1に記载 の核酸分子。
3 . 上記プロラミンは、 イネのものである、 項目 1に記載の核酸分子。
4 . 上記プロラミンは、 ジャポニカ種のイネのものである、 項目 1に記載 の核酸分子。 ' .
5 . 上記相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 少なくと も 5 0の違続するヌクレオチド長である、 項目 1に記載の核酸分子。
6 . 上記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸 配列は、 上記プロラミンポリぺプチドをコ一ドする全長配列の相補配列を含む、 項目 1に記載の核酸分子。
7 . 上記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド; Sを有する核酸 配列は、 上記プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列の 5 ' 末端のもの である、 項目 1に記載の核酸分子。
8 . 上記相^ I的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 5 0ヌク レオチド以下のヌクレオチド長である、 項目 1に記載の核酸分子。
9 . 上記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 3 0ヌク レオチド以下のヌクレオチド長である、 項目 1に記載の核酸分子。
1 0 . 上記相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 配列番号 9 8〜1 0 1からなる群より選択される 1つのアミノ酸をコードする核酸配列 のうち少なくとも 1 5ヌクレオチド長を有する配列を含む、 項目 1に記載の核 酸分子。
1 1 . 上記プロラミンは、 1 3 k D aプロラミンである、 項目 1に記載の 核酸分子。 1 2. (a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、
1 9、 2 1、 23、 25、 27、 29、 3 1、 3 3、 35、 3 7、 3 9、 4 1、 43および 45からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列または そのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 2
2、 24、 26、 28、 30、 3 2、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44お よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるァミノ配列を有するポ リぺプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
(c ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 2 2、 24、 26、 28、 30、 3 2、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44お よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が、 置換、 付加おょぴ欠失からなる群より選択され る少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリべプチドであって、 生物学的活性 を有する改変体ポリペプチドをコードする、 ポリヌクレオチド；
(d) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、
23、 2 5、 27、 2 9、 3 1、 3 3、 3 5、 3 7、 3 9、 4 1、 43および 45からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列からなる DNAの 対立遺伝子変異体である、 ポリヌクレオチド；
( e ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 2 2、 24、 26、 28、 30、 3 2、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44*3 よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列からなる ポリペプチドの種相同体またはオルソログをコードする、 ポリヌクレオチド；
(f ) (a) 〜 (e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条 件下でハイブリダィズし、 かつ生物学的活性を有するポリべプチドをコ一ドす るポリヌクレオチド；または
(g) (a) 〜 （e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に 対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、 かつ生物学的活性 を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、
に相補的な、 少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長の核酸配列を含む、 項 目 1に記載の核酸分子。
1 3 . アンチセンス活性を有する、 項目 1に記載の核酸分子。
1 4 . 上記アンチセンス活性は、 上記プロラミンポリペプチドの発現を減 少させるものである、 項目 1 3に記載の核酸分子。
1 5 . プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に由来する少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相補的な少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む、 核酸分子
1 6 .
(A) プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に由来する少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相捕的な少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 A；および
(B ) プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相補的な少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 B、
を含む、 核酸分子。
1 7 . 上記核酸配列 Aと上記核酸配列 Bとは、 互いに実質的に相補的である 部分を含む、 項目 1 6に記載の核酸分子。
1 8 .上記核酸配列 Aと上記核酸配列 Bとは、互いに実質的に相補的である、 項目 1 6に記載の核酸分子。
1 9 . さらに、 スぺーサー配列を含む、 項目 1 6に記載の核酸分子。 2 0 . 上記スぺーサー配列は、 イントロン配列を含む、 項目 1 9に記載の核 酸分子。
2 1 . 上記スぺーサー配列は、 上記核酸配列 Aと上記核酸配列 Bとの間に含 まれる、 項目 1 9に記載の核酸分子。
2 2 . プロラミンポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して R NA iを 引き起こす、 因子。
2 3 . プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相捕的な少なく とも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列 Bを含む、 核酸力セット。
2 4 . 外来遺伝子をコードする核酸配列をさらに含む、 項目 2 3に記載の 核酸カセット。
2 5 . プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に由来する少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相捕的な少なく とも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 Aをさらに含む、 項目 2 3に記載の核酸力 セット。
2 6 . さらに、 スぺーサー配列を含む、 項目 2 5に記載の核酸カセット。 2 7 . 上記スぺーサー配列は、 イントロン配列を含む、 項目 2 6に記載の 核酸カセット。
2 8 . 上記スぺーサー配列は、 上記核酸配列 Aと、 上記核酸配列: Bとの間 に含まれる、 項目 2 6に記載の核酸カセット。
2 9 . さらに、 シグナル配列を含む、 項目 2 5に記載の核酸カセット。
3 0 . 上記シグナル配列は、 上記外来遺伝子の上流に配置される、 項目 2 9に記載の核酸カセット。
3 1 . 上記シグナル配列は、 貯蔵タンパク質のシグナノレ配列である、 項目 2 9に記載の核酸カセット。
3 2 . 上記シグナル配列は、 プロラミンシグナル配列である、 項目 2 9に 記載の核酸カセット。
3 3 . さらに、 プロモーター配列を含む、項目 2 4に記載の核酸カセット。 3 4. 上記プロモーター配列は、 上記外来遺伝子および上記核酸配列 Bの両 方に作動可能に連結される、 項目 3 3に記載の核酸カセット。
3 5 . 上記外来遺伝子おょぴ上記核酸配列 Bの両方に、 独立して別個のプロ モーター配列が作動可能に連結される、 項目 2 4に記載の核酸カセット。
3 6 . 上記外来遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列 （プロモー ター配列 A) と、上記核酸配列 Bに作動可能に連結されるプロモーター配列（プ 口モーター配列 B ) とは互いに異なる、 項目 3 5に記載の核酸カセット。
3 7 . 上記プロモーター配列 Bは、 種子に遺伝子を発現させうるプロモータ 一配列である、 項目 3 6に記載の核酸カセット。
3 8 .上記プロモーター配列 Bは、貯蔵タンパク質プロモーターに由来する、 項目 3 6に記載の核酸カセット。
3 9 . 上記プロモーター配列 Bは、 貯蔵タンパク質プロモーターに由来し、 上記プロモーター配列 Aとは異なる、 項目 3 6に記載の核酸カセット。
4 0 . 上記プロモーター配列 Bは、 ポリュビキチンプロモーター、 2 6 kグ ロブリンプロモーター、 グノレテリン Aプロモーター、 グノレテリン Bプロモータ 一、 1 6 k D aプロラミンプロモーター、 1 3 k D aプロラミンプロモーター および 1 0 k D aプロラミンプロモーターからなる群より選択されるプロモー ターに由来する、 項目 3 6に記載の核酸カセット。
4 1 .上記プロモーター配列 Aは、貯蔵タンパク質プロモーターに由来する、 項目 3 6に記載の核酸カセット。
4 2 . 上記プロモーター配列 Aは、 上記核酸配列 Bに天然に付随するプロモ 一ター配列である、 項目 3 6に記載の核酸カセット。 4 3 . 上記プロモーター配列 Aは、 2 6 k D aグロブリンプロモーター、 グ テリン Aプロモーター、 グ^/テリン Bプロモーター、 1 6 k D aプロラミン プロモーター、 l O k D aプロラミンプロモーターおよび 1 3 k D aプロラミ ンプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに由来する、 項目 3 6 に記載の核酸カセット。
4 4 . ±記プロモーター配列 Aは、 プロラミンプロモーターである、 項目 3 6に記載の核酸カセット。
4 5.. 上記プロモーター配列 Aは、 プロラミンプロモーターに由来し、 上記 プロモーター配列 Bは、 上記プロラミンプロモーター以外のプロモーターに由 来する、 項目 3 6に記載の核酸カセット。
4 6 . 上記外来遺伝子と上記プロモーター配列との間にィンフレームでシ グナル配列を含む、 項目 3 3に記載の核酸カセット。
4 7 . さらに、 ターミネータ一配列を含む、 項目 2 5に記載の核酸カセッ 卜。 '
4 8 . 上記ターミネータ一配列は、 1 0 k D aプロラミンのターミネータ 一配列である、 項目 4 7に記載の核酸カセット。
4 9 . さらに外来遺伝子を含み、 そして上記外来遺伝子は、 上記核酸配列 Aおよび上記核酸配列 Bよりも上流に存在する、 項目 2 5に記載の核酸カセッ 5 0 . 上記核酸配列 Aと上記核酸配列 Bとの間にスぺーサー配列を含む、 項目 4 9に記載の核酸カセット。
5 1 . 上記核酸配列 Aと上記核酸配列 Bとの間にイントロン配列を含む、 項目 4 9に記載の核酸カセット。
5 2 . 核酸カセットを製造するための方法であって、
A) プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 % 相同な核酸配列 Bと、 プロラミンポリべプチドをコ一ドする核酸配列に由来す る少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または上記相補 的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少な くとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 Aと含むセットの上流に作動可 能にプロモーター酉己列 Bを有し、
外来遺伝子が上記プロモーター配列 Bよりも上流または下流に配置され、 上記外来遺伝子には作動可能にプロモーター配列 Aが連結されている、 核酸 カセットを提供する工程、
B ) 上記核酸カセットを用いて植物を形質転換する工程；および
C) 上記形質転換された植物について、 プロラミンの発現量が一部減少して いるものを選択する工程、
を包含する、 方法。
5 3 . 項目 1に記載の核酸分子を含む、 ベタター。
5 4 . プロモーター活性を有する配列をさらに含む、 項目 5 3に記载のべ クタ一。
5 5 . 上記プロモーター活性を有する配列は、 貯蔵タンパク質のプロモー ターである、 項目 5 4に記載のベクター。
5 6 . 上記プロモーター活性を有する配列は、 上記プロラミンのプロモー ターである、 項目 5 3に記載のベクター。
5 7. ターミネータ一をさらに含む、 項目 5 3に記載のベクター。
5 8 . 選択マーカーをコードする配列をさらに含む、 項目 5 3に記載のベ クタ一。
5 9 . 項目 1に記載の核酸分子とは異なる外来遺伝子をコードする配列を さらに含む、 項目 5 3に記載のベクター。
6 0 . 項目 1に記載の核酸分子を含む、 植物細胞。 6 1 . 項目 1に記載の核酸分子とは異なる外来遺伝子をコードする核酸分 子をさらに含む、 項目 6 0に記載の植物細胞。
6 2 . 上記プロラミンが由来する植物種と、 上記植物の種とは、 同種のも のである、 項目 6 0に記載の植物細胞。
6 3 . 上記プロラミンが由来する植物種と、 上記植物の種とは、 同一品種 のものである、 項目 6 0に記載の植物細胞。
6 4 . 上記プロラミンが由来する植物種おょぴ上記植物の種は、 イネであ る、 項目 6 0に記載の植物細胞。
6 5 . 上記プロラミンが由来する植物種おょぴ上記植物の種は、 ジャポ二 力種のイネである、 項目 6 0に記載の植物細胞。
6 6 . 2対の染色体の両方に、項目 1に記載の上記核酸分子が導入された、 項目 6 0に記載の植物細胞。
6 7 . 項目 6 0に記載の植物細胞を含む、 植物組織。
6 8 . 項目 1に記載の核酸分子を含む、 植物体。
6 9 . 項目 1に記載の核酸分子とは異なる外来遺伝子をコードする核酸分 子をさらに含む、 項目 6 8に記載の植物体。
7 0 . 上記プロラミンが由来する植物種と、 上記植物の種とは、 同種のも のである、 項目 6 8に記載の植物体。
7 1 . 上記プロラミンが由来する植物種と、 上記植物の種とは、 同一品種 のものである、 項目 6 8に記載の植物体。
7 2 . 上記プロラミンが由来する植物種おょぴ上記植物の種は、 イネであ る、 項目 6 8に記載の植物体。
7 3 . 上記プロラミンが由来する植物種および上記植物の種は、 ジャポ二 力種のイネである、 項目 6 8に記載の植物体。
7 4 . 2対の染色体の両方に、項目 1に記載の上記核酸分子が導入された、 項目 6 8に記載の植物体。 7 5 . 項目 6 8に記載の植物体から生産された、 種子。
7 6 . 項目 6 9に記載の植物体から生産された、 種子。
7 7 . 項目 6 8に記载の植物体、 または項目 7 5に記載の種子から生産さ れた、 デンプン調製物。
7 8 . 項目 6 9に記載の植物体、 または項目 7 6に記載の種子から生産さ れた、 上記外来遺伝子の遺伝子産物を含む、 組成物。
7 9 . 植物において種子中のタンパク質の癸現量を減少させる方法であつ て、
A) 項目 1に記載の核酸分子を提供する工程；
B ) 上記核酸分子を上記植物の細胞に導入する工程；
C) 上記細胞を再分化させてトランスジ ニック植物を作出する工程；およ び
D) 上記トランスジエニック植物から種子を得る工程、
を包含する、 方法。
8 0 . 上記導入する工程は、 ァグロパクテリゥム法による、 項目 7 9に記 載の方法。
8 1 . さらに、
E ) 上記核酸分子が導入された植物の細胞を選択する工程、
を包含する、 項目 7 9に記載の方法。
8 2 . 上記選択する工程は、 抗生物質に対する耐性を判定することによつ て行われる、 項目 8 1に記載の方法。
8 3 . 植物種子中で外来遺伝子を発現させる方法であって、
A) 項目 1に記載の核酸分子を提供する工程；
B ) 上記外来遺伝子をコードする核酸分子を提供する工程；
C) 上記項目 1に記載の核酸分子および上記外来遺伝子をコードする核酸分 子を上記植物の細胞に導入する工程； D) 上記細胞を再分化させてトランスジエニック植物を作出する工程；なら びに
E) 上記トランスジエニック植物から種子を得る工程、
を包含する、 方法。
8 4 . 上記導入する工程は、 ァグロパクテリゥム法による、 項目 8 3に記 載の方法。
8 5 . さらに、
F ) 上記核酸分子が導入された植物の細胞を選択する工程、
を包含する、 項目 8 3に記載の方法。
8 6 . 上記選択する工程は、 抗生物質に対する耐性を判定することによつ て行われる、 項目 8 5に記載の方法。
8 7 . さらに
G ) 上記種子から上記外来遺伝子の遺伝子産物を分離する工程、
を包含する、 項目 8 3に記載の方法。
8 8 . 項目 8 3に記載の方法によって生産された、 上記外来遺伝子の遺伝 子産物を含む、 組成物。
8 9 . 植物において種子中のタンパク質の発現量を減少させるための、 項 目 1に記載の核酸分子の使用。
9 0 . 植物の種子中で外来遺伝子を発現させるための、 項目 1に記載の核 酸分子の使用。
9 1 . 上記種子中における上記植物の天然のタンパク質発現が低減してい る、 項'目 9 0に記載の使用。 以下に、 本発明の好ましい実施形態を示すが、 当業者は本発明の説明および 当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することがで き、 本発明が奏する作用およぴ効果を容易に理解することが認識されるべきで ある 図面の簡単な説明
図 1は、 本癸明におけるプロラミンアンチセンス遺伝子カセット、 有用遺伝 子発現カセットおよびそれらを用いたベクターの構築を容易ならしめるための、 既存のベクターおよびプロモーターの改変バージョンを示したものである。 こ れらを利用することにより、 迅速な発現カセット、 発現ベクターの構築が可能 となる。 さらに複数の発現カセットを同時に導入するような、 複雑な構造の構 築遺伝子も迅速かつ容易に構築できる。
図 2は、 実際に構築して導入した、 プロラミンアンチセンス遺伝子ベクター の構造の概略を示した図である。
図 3は本発明の種子である L P 13 K系統（13 kD aプロラミンアンチセ ンス遺伝子カセットを導入した系統）における種子タンパク質を SDS- PA GEによる電気泳動法により分析した結果である。 タンパク質の検出はクマシ ーブリ リアントプルー染色により行った。 電気泳動写真の横には、 主要な貯蔵 タンパク質に相当するバンドとして， A : 10kDaプロラミン、 B : 13 k Daプロラミン、 C : 16 kDaプロラミン、 D :グルテリン塩基性サブュニ ット、 E： 26 k D aグロプリン、 F：グルテリン酸性サブュニットを表記し、 また縦に示した数字は分子量の目安である。 これらの表記は以降の図にも共通 してもちいる。 LP 13K系統であるレーン 4、 5、 6においては、 他のレー ンと比較して、 13 kD aプロラミンに相当する Bのバンドの濃度が著しく低 下しており、 13 kDaプロラミン含量が減少していることが明示されている。 図 4は様々な構造の 13 kDaプロラミンアンチセンス遺伝子カセットを導 入した種子のタンパク質を SDS— PAGEにより分析した結果である。 ハイ グロマイシン抵抗性 （図中に Rで表記） のレーンでは例外なく 13 kDaプロ ラミンに相当する Bのバンドの濃度が著しく低下している。 図 5は、 様々な構造のプロラミンアンチセンス遺伝子発現カセットを導入し たイネのうち、 抑制効果が顕著である系統について、 種子をランダムに選ぴ、 プロラミン低減形質を抗 13 kDaプロラミン （日本晴） 抗体を用いたウェス タンプロット解析により調査したものである。 図中 a) では、 SDS— PAG E後にクマシ一ブリリアントブル一染色を行った （種子抽出タンパク質 15 μ 1を使用した）。 ) では、 SDS— PAGE後に PVDF膜に転写し、 抗 13 kDaプロラミン（日本晴） ポリクローナル抗体でゥエスタン解析を行つた（種 子抽出タンパク質 0. 5 μ 1を使用した）。 レーン下にバンドの吸光度の相対比 率を示した。
図 6 (aおよび b) は LP 13Kの胚乳表層細胞を透過電顕で観察した映像 を示す。 aでは観察像そのままを提示しており、 bではそれにプロテインボデ ィのタイプを重ねて表示している。 プロテインボディ 1は、 グレーの球形をし た顆粒である （プロラミンが蓄積する）。 b) では、 黒三角で示す。 プロテイン ボディ 2は、 色が黒く （濃く） 見えるやや大きめの顆粒である （ダルテリンお ょぴグロブリンが蓄積する）。 b) では、 白三角で示す。
通常品種における観察像 (b 2) と比較して、 LP 13K ( 1) ではプロ ラミンが蓄積するはずのプロテインボディ 1の数が大きく減少している。 LG C一 1 (b 3) においては逆にプロテインボディ 2の数が大きく減少する一方 でプロテインボディ 1の数は大きく増加している。 このように、 プロラミンを 制御することでプロテインボディ形成を制御し得ること、 かつ表層細胞の内部 の状態を大きく変えることができることが示された。
図 7は、 様々な品種の種子タンパク質の SDS- PAGEの結果と、 抗 13 kD aプロラミンポリクローナル抗体によるウェスタン解析の結果を示す。 ジ ャポニ力、 インディ力いずれの品種においても、 抗体に良く反応する 13 kD aプロラミンが検出されており、 構造が高度に保存されていることを示してい る。 図 8は、 本発明を有用タンパク質発現システムとしての応用の可能性を検証 するために用いた発現ベクター構造の例を示したものである。
図 9 (A - B ) は、 代表的なプロラミンの配列の比較図である。
図 1 0は実施例 8における実験例および電気泳動の結果を示す。
図 1 1は、 実施例 1 1の、 G F Pをモデルタンパク質としたイネ種子での外 来遺伝子発現実験に用いた構築遺伝子の構造を示す。 1 3 k D aプロラミン発 現抑制カセットを同時に導入すること、 すなわち貯蔵タンパク質を低減させる ことが G F Pの発現を増強することが示された。
図 1 2は、 実施例 1 1の結果を踏まえて、 実施例 1 2で用いた構築遺伝子の 構造を示す。
図 1 3は、 図 1 2における遺伝子 5および 6を導入したイネ種子のタンパク 質の電気泳動の結果おょぴ G F P量の定量結果を示す。 本発明の技術を用いる ことで、 従来の予想を大きく上回るレベルでの G F Pの発現に成功し、 種子タ ンパク質の電気泳動パターンが一般品種のものと大きく異なる、 新規なイネ種 子の創出に成功したことを明示している。
図 1 4は、 図 1 2の構築遺伝子において、 予想した通りにシグナル配列が切 除され、 設計通りに正しい G F Pタンパク質が発現されていることを、 タンパ ク質の N末端シーケンスにより直接確認した結果である。 本発明の構築遺伝子 の構造の優秀性を証明している。
図 1 5は、 実施例 1 3において、 本発明の技術を用いて実際の有用タンパク 質であるシスタチンの生産を行った例である。 予想通り、 既存の成果を大きく 上回るレベルでのシスタチン発現が達成された。
図 1 6は、 本発明の過程で解明された、 イネ種子における貯蔵タンパク質組 成の調節様式をまとめたものである。 これにより、 本発明の基礎理論となる、 貯蔵タンパク質に使われるァミノ酸を効率的に外来タンパク質に転用する方法 が明らかになった。 図 17は、 全ての結果を総括し、 種子における効率的な外来タンパク質発現 に、 普遍的に有用な構築遺伝子の概念を提示したものである。 配列表の説明
配列番号 1 ： 13 kDaプロラミン （RM9) の核酸配列
配列番号 2 ： 13 kDaプロラミン （RM9) のアミノ酸配列
配列番号 3 ： 13 kDaプロラミン （RM 1 ) の核酸配列
配列番号 4 ： 13 kDaプロラミン （RM 1 ) のァミノ酸配列
配列番号 5〜 30 ：代表的な 13 kDaプロラミンの配列
配列番号 31〜 32 ：代表的な 16 kDaプロラミンの配列
配列番号 33〜 46 ：代表的な l O kDaプロラミンの配列
配列番号 47 ：イネ 10 kD aプロラミン遺伝子に由来するプロモーター配列 配列番号 48 ：イネグルテリン B 1遺伝子に由来するプロモーター配列 配列番号 49 ： C aMV35 S遺伝子に由来するプロモーター配列
配列番号 50 ： 13 kDaプロラミンをコードする cDNA全長 （配列番号 1 ) のアンチセンス
配列番号 51 ： 13 kDaプロラミンをコ一ドする c DNAの N末端の 67 b pのアンチセンス配列
配列番号 52 ： 13 kDaプロラミンをコ一ドする c DNAの N末端の 15 b pのアンチセンス配列
配列番号 53 ：ネガティブコント口ール配列
配列番号 54 ：ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ
配列番号 55 ： N o sターミネータ一
配列番号 56 ：改変遺伝子 mH P Tァミノ酸配列
配列番号 57 ： C aMV 35 Sプロモーターおよび n o sターミネータ一と制 限酵素で切断されないように連結した選抜マーカー発現カセット 配列番号 58 ： mRUb i Pプロモーターの配列
配列番号 59 ： GUS遺伝子断片
配列番号 60 ： 13 kDaプロラミンプロモーター配列
配列番号 61 ： 10 kD aプロラミンターミネータ一配列
配列番号 62 ：グルテリン A 3プロモーター配列
配列番号 63〜72 ：アンチセンスの他の例示配列
配列番号 73〜 84 ：ァンチセンスの例示配列の対応ァミノ酸配列
配列番号 85〜88 ：プロラミンの特徴モチーフ
配列番号 89 ： RM4ァミノ酸配列
配列番号 90 ： RM5ァミノ酸配列
配列番号 91 ： RM7アミノ酸配列
配列番号 92 : RM10ァミノ酸配列
配列番号 93 ： RM16ァミノ酸配列
配列番号 94 ： RM4核酸配列
配列番号 95 ： RM5核酸配列
配列番号 96 ： RM7核酸配列
配列番号 97 ：イネァスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子ィントロン配列 配列番号 98 ： 13kDaプロラミンのコンセンサス配列例 1
配列番号 99 ： 13 kDaプロラミンのコンセンサス配列例 2
酉己列番号 100 ： 13 kDaプロラミンのコンセンサス配列例 3
配列番号 101 ： 13 kDaプロラミンのコンセンサス配列例 4
配列番号 102 : 13 kD aプロラミンのコンセンサス配列例 1のコード核酸 配列
配列番号 103 ： 13 kDaプロラミンのコンセンサス配列例 2のコード核酸 配列
配列番号 104 ： 13 kDaプロラミンのコンセンサス配列例 3のコード核酸 配列
配列番号 105 13 kD aプロラミンのコンセンサス配列例 4のコード核酸 配列
配列番号 106 16 kD aプロラミンプロモーター配列
配列番号 107 26 k D aグロプリンプロモーター酉 S列
配列番号 108 l O kDaプロラミンシグナル配列 （核酸）
配列番号 109 l O kDaプロラミンシグナル配列 （アミノ酸）
配列番号 1 10 13 kDaプロラミンシグナル配列 （核酸）
配列番号 1 1 1 13 kDaプロラミンシグナル配列 （アミノ酸）
配列番号 1 12 16 kDaプロラミンシグナル配列 （核酸）
配列番号 1 13 16 kDaプロラミンシグナル配列 （アミノ酸）
配列番号 1 14 グルテリン B 1シグナル配列 （核酸）
配列番号 1 15 グルテリン B 1シグナル配列 （アミノ酸）
配列番号 1 16 26 k D aグロブリンシグナル配列 （核酸）
配列番号 1 17 26 kDaグロブリンシグナル配列 （アミノ酸）
配列番号 118 実施例 11における決定配列。 発明の実施の形態
以下に本発明の好ましい形態を説明する。 本明細書の全体にわたり、 単数形 の表現は、 特に言及しない限り、 その複数形の概念をも含むことが理解される べきである。 従って、 単数形の冠詞 （例えば、 英語の場合は 「a」、 「a nj、 「t e」 など、 独語の場合の 「e i n」、 「d e r」、 「d a s」、 「d i e」 などお よびその格変化形、 仏語の場合の 「un」、 「un e」、 「 1 e」、 「1 a」 など、 スペイン語における 「unj、 「un a」、 「e 1」、 「1 a」 など、 他の言語にお ける対応する冠詞、 形容詞など） は、 特に言及しない限り、 その複数形の概念 をも含むことが理解されるべきである。 また、 本明細書において使用される用 語は、 特に言及しない限り、 当該分野で通常用いられる意味で用いられること が理解されるべきである。 したがって、 他に定義されない限り、 本明細書中で 使用される全ての専門用語および科学技術用語は、 本発明の属する分野の当業 者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。 矛盾する場合、 本明細 書 （定義を含めて） が優先する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(用語）
本明細書において 「種子タンパク質」 は、 作物の種子に蓄積するタンパク質 をさす。 溶媒に対する溶解性の違いで呼び分けることが多く、 水溶性のアルブ ミン、 塩水溶液可溶性のグロブリン、 含水アルコールに可溶のプロラミン、 希 酸または希アル力リに可溶なグルテリンに大別される。
本明細書において 「プロラミン」 は 50〜 90%程度の含水アルコールに可 溶であるタンパク質の総称であり、 穀類種子は、 このプロラミンタイプのタン パク質が主要な貯蔵タンパク質であることに特徴がある。 穀類ごとに独特の呼 ぴ名があり、代表的なものとしては、 コムギグルテニン、ォォムギホルディン、 トウモロコシゼィン、 オートムギアべ-ンなどがあげられるが、 イネの場合は 単にプロラミンと呼ばれる。 ただしイネの場合は、 グルテリンが種子タンパク 質の 60〜70%をしめる主要タンパク質で、 プロラミンはそれに次いで含有 量が 20〜30%、 グロプリンが数％とされている。 プロラミンの分子量は植 物種ごとに異なっていることが多いが、 共通する特徴としては、 それらのアミ ノ酸配列がグルタミンに富み、 それが連続する （例えば G 1 n— G 1 n、 G 1 n— G i n— G i nなど） 領域または一定アミノ酸ごとに出現する （例えば G 1 n-X a a -G 1 n— Xa a -G 1 n))領域があることがあげられる。また、 グルタミン以外にプロリンおよびシスティンなどを含めた数アミノ酸以上より なるモチーフ （例えば G 1 u-P h e -V a 1— Ar g— G l n— G l n— C y s— S e r— P r o (配列番号 85)、 あるいは Cy s—G 1 n— Va 1—M e t一 G i n— G i n— G i n— Cy s— Cy s— G i n— G i n (配列番号 86) およびその 1または数個の置換、 付加もしくは欠失を含む配列） 力 プ ロラミン遺伝子のアミノ酸配列に共通的に保存されていることも特徴である。 S S結合に関与する Cy s残基の位置もよく保存されている。 さらに、 これら のモチーフは同一植物内のプロラミン遺伝子に限らず、 異なる植物種間でも保 存されている場合が多いことから、 進化的には共通祖先を持つプロラミン遺伝 子スーパーファミリ一を形成するとされている（S h e w r y， PE e t a 1 ·， P l a n t Ce l l 7, 945— 956, 1995)。 他の貯蔵タン パク質の場合と同様に、 プロラミン遺伝子はゲノム中に多コピー存在し、 多重 遺伝子族 （マルチジーン） であることが知られている。 それぞれの遺伝子から 作られた、 ァミノ酸配列が少しずつ異なるタンパク質が混合して種子に存在し ている。
イネプロラミンは、 55〜60%の 1—プロパノールにより効率良く抽出さ れる (Su g imo t o, T. e t a l.， A g r i c . B i o l . Ch em. 50， 2409— 2410， 1986)。 また、 ゲノミックサザン分析、 c DN Aクローニングゃ等電点電気泳動により、 遺伝子の数は 25〜100と推定さ れている。 これらはいくつかのサブファミリ一に分類することができ、 研究者 によって、 また実験に使われた品種によつて分類方法とタンパクの呼称は様々 にあるが、 もっとも一般的な分類としては、 1次元の SDS電気泳動における 分子量によるものがあげられる。 その場合は、 10KDa、 13 KD a (イン ディ力種では 14KD aと記述される場合があり、 本明細書において 13KD aプロラミンというときはこの 14KDaも含む）、 16 KD a' (インディ力種 では 18KDaと記述される場合がある。 本明細書において 16KDaプロラ ミンというときはこの 18 KD aも含む） などのものが存在する。 それぞれの プロラミンのバンドは、 1次元の SDS電気泳動では 1本であっても、 その中 には多数の種類のタンパク質が混合しており、 1 OKD aについては 1種以上、 16 KD aについては 3種以上、 もっとも多重度の高い 13 KD aについては 確認されただけで 1 2種類、 実際はそれ以上あることがわかっている。 13K D aプロラミンについて、 タンパク質スポットと c DNAの対応関係から詳細 に分類した研究 （Mi t s uk awa， N e t a 1., P l a n t B i o t e c h. 16， 103— 1 13， 1 999) では、 S S結合を還元するかし ないかで溶解性が変化する性質、 ァミノ酸配列の相同性とシスティン残基の数 によりタイプを 4つに分類した例がある。 このほか、 コムギの分類例にならつ て、 ィォゥ含有量 （主にシスティン残基の含有量） により s u 1 p h u r— r i c hタイプ、 s u 1 p h u r— p o o rタイプとレヽぅ分類の例もあり、 s u 1 p h u r— p o o rタイプにはシスティンが含まれていない。 プロラミンは いずれもタンパク質の N末端がブロックされているため、 プロテイン配列によ る解析が困難であることから、 タンパク質 ' c DNAいずれのレベルでも未同 定であるプロラミンゃ、 c DNAとの対応関係が不明確であるプロラミンが、 依然として多数存在すると考えられる。 しかし、 どのような分類法 ·呼称をと るとしても、 そのタンパク質がプロラミンに属するものかどうかは、 1) 含水 アルコールに溶解する、 2 ) グルタミンに富むァミノ酸配列（少なくとも 10 % 以上） または、 リジンが極めて少ない （3%以下） 力 \ 1つもない、 3) 1〜 数アミノ酸ごとにグルタミン残基が出現する、 またはグルタミンが 2個以上連 続して出現する場所が複数存在する 4) グルタミンを核として、 プロリン、 シ スティンなどのアミノ酸を含む配列モチーフ （G 1 u— Ph e— Va 1—Ar g— G i n— G i n— Cy s—S e r— P r o (配列番号 85)、 あるいは Cy s— G 1 n -V a 1—Me t -G 1 n— G l n— G l n— Cy s -C y s— G 1 n— G 1 n (配列番号 86) またはそれと 50 %以上の相同性を有するモチ ーフ） 力 保存されているといった共通事項があり、 当業者には容易に判別し 得る。 4) について例をあげるなら、 G l n-G l n-Cy s -Cy s -G l n— G i n (配列番号 87) というモチーフは、 イネプロラミンにもコムギグ ルテニンにも高度に保存されているし、 また G 1 u-P h e -Va 1— Ar g 一 G i n— G i n (配列番号 88) はイネプロラミンとトウモロコシグリアジ ン、 ォ一トムギアべニンなどに保存されている。 このように、 分子量の違いや タンパク質全体の相同性が低い場合があても、 穀物プロラミンは祖先遺伝子を 同じくするプロラミン遺伝子スーパーファミリ一として認識されている （S h ew r y, PE e t a 1 P l a n t C e l l 7, 94 5— 9 56， 1 9 9 5)。 イネプロラミンこれまでに論文として報告されたものでは、 cDN Aレべノレでは L RM1、 ； LRM2、 X RM4N λ RM 7 , Ι Μ9、 1 S 1 8、 p S 2 3、 ρ X 24, ρ Ρ r ο 1 7, p P r o l l 4、 ρ Ρ r ο 1 1 7Ν ； LRP 1 6、 RP 1 0といったものがあるが、 それに限定されない。 そのよ うなプロラミンとしては、 例えば、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3、 2 5、 2 7、 29 ( 1 3 k D aプロラミン）、 3 1 (1 6 kD aプロラミン）、 3 3、 3 5、 3 7、 3 9、 4 1、 43および 4 5 (l O kD aプロラミン） からなる群より選択される配列番号に示される核 酸配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド、 ならびに配列 番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 22、 24、 2 6、 28、 3 0 (1 3 kD aプロラミン）、 3 2 ( 1 6 k D aプロラミン）、 3 4、 3 6、 3 8、 40、 42、 44および 4 6 (l O kD aプロラミン） から なる群より選択される配列番号に示されるァミノ配列を有するポリぺプチドま たはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが挙げられるがそれに限 定されない。 そのようなプロラミンの遺伝子は、 G e n b a n k：、 NCB I、 EBML、 DDB Jなどのような遺伝子パンクにおいて登録されているプロラ ミン遺伝子であれば、 上記以外のものでも使用することができる。
本明細書において 「1 3KD aプロラミン」 は、 一般にジャポニカイネにお いて SD S電気泳動法において分子量が 1 3 KD a付近にくるプロラミンを示 し、 イネに最も多く含まれるプロラミンである。 その遺伝子もゲノムにもっと も多数存在し、 c D NAク口一ユングや等電点電気泳動などで解析された結果、 '少しずつァミノ酸配列の異なる遺伝子が最低でも 1 2以上あることが確認され ており、 実際はさらに数が多いと推定されている。 代表的なものとして配列番 号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3、 2 5、 2 7または 2 9に示される核酸配列おょぴ配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 2 2、 2 4、 2 6、 2 8または 3 0に示される ァミノ酸配列を含むプロラミン、 ならびにそれに対応した他植物のプロラミン 遺伝子スーパ一フアミリーのものもあげられるが、 それに限定されない。
本明細書において 「貯蔵タンパク質」 とは、 植物の種子において特に高度に 蓄積し、 酵素活性など植物内で他の生理機能を有さないタンパク質をいい、 通 常はプロティンボディに集積される。
本明細書において 「プロテインボディ」 は、 貯蔵タンパク質を集積する顆粒 状の細胞内構造をいう。 通常は 1つの植物に 1種類存在することが多いが、 ィ ネとオートムギでは、 外観、 形態が明確に異なる 2種類のプロテインボディが 形成される。 イネの場合は、 プロラミンが蓄積するプロテインボディタイプ 1 と、 グノレテリンおよびグロプリンが蓄積するプロテインボディタイプ 2がある。 両者は外観、 形態、 サイズ、 由来などがはっきりと異なっており、 プロテイン ボディと貯蔵タンパク質の対応関係は厳密に制御されている。
本発明において有用なプロラミン保存配列としては、 以下のようなものが挙 げられる。 本発明では、 このような保存配列をコードするアンチセンス配列が 好ましい配列として例示され得る。 配歹 U 1 ： Gin Val Met Gin Gin Gin Cys Cys Gin Gin Leu Arg Leu Val Ala Gin Gin Ser His Tyr Gin Ala lie Ser Ser Val Gin Ala lie Val Gin Gin Leu Gin Leu Gin Gin (配列番号 9 8 )
配列 2 ： Met Lys lie lie Phe Val Phe Ala Leu Leu Ala lie Val Ala Cys Asn Ala Ser Ala Arg Phe Asp Ala Leu Ser Gin Ser Tyr Arg Gin Tyr Gin Leu Gin (配列番号 9 9 )
配列 3 ： Glu Phe Val Arg Gin Gin His Ser lie Val Ala Thr Pro Phe Trp Gin Pro Ala Thr Phe Gin Leu lie Asn Asn Gin (配列番号 1 0 0 )
配列 4 ： Tyr Phe Asp Gin Thr Gin Ala Gin Ala Gin Ala Leu Leu Ala Leu Asn Leu Pro Ser lie Cys Gly lie Tyr Pro Asn Tyr Tyr lie Ala Pro (配列番号 1 0 1 ) 本発明では、 上記配列のうち、 少なくとも 5アミノ酸をコードする配列に対 してアンチセンスである配列を実際のプロラミン遺伝子発現の抑制に用いるこ とができることが示されている。
本明細書において使用される用語 「タンパク質」、 「ポリペプチド」、 「オリゴ ペプチド」 および 「ペプチド」 は、 本明細書において同じ意味で使用され、 任 意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。 このポリマーは、 直鎖であっても分岐 していてもよく、 環状であってもよい。 アミノ酸は、 天然のものであっても非 天然のものであってもよく、 改変されたアミノ酸であってもよい。 この用語は また、 複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。 この用語はま た、 天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。 そのような 改変としては、 例えば、 ジスルフィド結合形成、 グリコシル化、 脂質化、 ァセ チル化、 リン酸化または任意の他の操作もしくは改変 （例えば、 標識成分との 結合体化)。 この定義にはまた、 例えば、 アミノ酸の 1または 2以上のアナログ を含むポリペプチド （例えば、 非天然のアミノ酸などを含む）、 ペプチド様化合 物 （例えば、 ぺプトイド） および当該分野において公知の他の改変が包含され る。
本明細書において使用される用語 「ポリヌクレオチド」、 「オリゴヌクレオチ ド」 および 「核酸」 は、 本明細書において同じ意味で使用され、 任意の長さの ヌクレオチドのポリマ一をいう。 この用語はまた、 「誘導体オリゴヌクレオチ ド」 または 「誘導体ポリヌクレオチド」 を含む。 「誘導体オリゴヌクレオチド」 または 「誘導体ポリヌクレオチド」 とは、 ヌクレオチドの誘導体を含むか、 ま たはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌ クレオチドをいい、 互換的に使用される。 そのようなオリゴヌクレオチドとし て具体的には、 例えば、 2' —O—メチルーリポヌクレオチド、 オリゴヌクレ ォチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘導 体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチ 、中のリン酸ジエステル結合が N 3，
-P 5' ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 ォ リゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがぺプチド核酸結合 に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが ' C _ 5プロピニルゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、 ォリゴヌ クレオチド中のゥラシルが C— 5チアゾ一ルゥラシルで置換された誘導体ォリ ゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C一 5プロピエルシトシ ンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のシトシン がフエノキサジン修飾シトシン （p h e n o x a z i n e一 mo d i f i e d c y t o s i n e) で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 DNA中のリポ —スが 2， 一 O—プロピルリポースで置換された誘導体ォリゴヌクレオチドぉ ょぴオリゴヌクレオチド中のリボースが 2， ーメ トキシエトキシリポースで置 換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。 他にそうではないと示 されなければ、 特定の核酸配列はまた、 明示的に示された配列と同様に、 その 保存的に改変された改変体 （例えば、 縮重コドン置換体） および相補配列を包 含することが企図される。 具体的には、 縮重コドン置換体は、 1またはそれ以 上の選択された （または、 すべての） コドンの 3番目の位置が混合塩基および /またはデォキシィノシン残基で置換された配列を作成することにより達成さ れ得る （B a t z e rら、 Nu c l e i c Ac i d Re s . 1 9 : 508 1 (1991) ; Oh t s uk aら、 J. B i o l . Ch em. 260 : 260 5- 2608 (1985) ; Ro s s o l i n iら、 Mo l . Ce l l . P r o b e s 8 : 91— 98 (1994))。
用語 「核酸分子」 はまた、 本明細書において、 核酸、 オリゴヌクレオチド、 およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、 cDNA、 mRNA、 ゲノム DNAなどを含む。 本明細書では、 核酸および核酸分子は、 用語 「遺伝子」 の 概念に含まれ得る。 ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、 「スプライス 変異体 （改変体)」 を包含する。 同様に、 核酸によりコードされた特定のタンパ ク質は、 その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を 包含する。 その名が示唆するように 「スプライス変異体」 は、 遺伝子のオルタ ナティブスプライシングの産物である。 転写後、 最初の核酸転写物は、 異なる (別の） 核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプラ イスされ得る。 スプライス変異体の産生機構は変化するが、 ェキソンのオルタ ナティブスプライシングを含む。 読み過し転写により同じ核酸に由来する別の ポリペプチドもまた、 この定義に包含される。 スプライシング反応の任意の産 物 （組換え形態のスプライス産物を含む） がこの定義に含まれる。
本明細書において 「単離された」 生物学的因子 （例えば、 核酸またはタンパ ク質など） とは、 その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生 物学的因子 （例えば、 核酸である場合、 核酸以外の因子および目的とする核酸 以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、 タンパク質以外の因子お よび目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など） から実 質的に分離または精製されたものをいう。 「単離された」核酸およびタンパク質 には、 標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。 したがって、 単離された核酸おょぴタンパク質は、 化学的に合成した核酸およ ぴタンパク質を包含する。
本明細書において 「精製された」 生物学的因子 （例えば、 核酸またはタンパ ク質など） とは、 その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が 除去されたものをいう。 したがって、 通常、 精製された生物学的因子における その生物学的因子の純度は、 その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い (すなわち濃縮されている）。
本明細書において、 「遺伝子」 とは、 遺伝形質を規定する因子をいう。 通常染 色体上に一定の順序に配列しているが染色体外のものも遺伝形質を規定する限 り遺伝子の範疇に入る。 タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、 その発現を左右する調節遺伝子という。
本明細書では、 「遺伝子」 は、 「ポリヌクレオチド」、 「オリゴヌクレオチド」 および 「核酸」 ならびに /または 「タンパク質」 「ポリペプチド」、 「オリゴぺプ チド」 および 「ペプチド」 をさすことがある。 本明細書においてはまた、 「遺伝 子産物」 とは、 遺伝子によって発現された 「ポリヌクレオチド」、 「オリゴヌク レオチド」および「核酸」ならびに Zまたは「タンパク質」 「ポリペプチド」、 「ォ リゴペプチド」 および 「ペプチド」 をさす。 当業者であれば、 遺伝子産物が何 たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において遺伝子 （例えば、 核酸配列、 アミノ酸配列など） の 「相同
Ί
性」 とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、 ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、 それらの配列の同一性または類似性は 高い。 2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、 配列の直接の比較、 または 核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイプリダイゼ一シヨン法によって 調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、 その遺伝子配列間で D NA配列が、 代表的には少なくとも 5 0 %同一である場合、 好ましくは少なく とも 7 0 %同一である場合、より好ましくは少なくとも 8 0 %、 9 0 %、 9 5 %、 9 6 %、 9 7 %、 9 8 %または 9 9 %同一である場合、 それらの遺伝子は相同 性を有する。 本明細書において、 遺伝子 （例えば、 核酸配列、 アミノ酸配列な ど） の 「類似性」 とは、 上記相同性において、 保存的置換をポジティブ （同一） とみなした場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。 従って、 保存的置換がある場合は、 その保存的置換の存在に応じて同一性と類 似性とは異なる。 また、 保存的置換がない場合は、 同一性と類似性とは同じ数 値を示す。
本明細書では塩基配列の類似性、 同一性おょぴ相同性の比較は、 配列分析用 ツールである B L AS Tを用いてデフオルトパラメータを用いて算出される。 本明細書において 「外来遺伝子」 とは、 ある植物において、 その植物には天 然には存在しない遺伝子をいう。 そのような外来遺伝子は、 そ 植物に天然に 存在する遺伝子を改変したものであってもよく、 天然において他の植物に存在 する遺伝子であってもよく、 人工的に合成した遺伝子であってもよく、 それら の複合体 （例えば、 融合体） であってもよい。 そのような外来遺伝子を含む植 物は、 天然では発現 ない遺伝子産物を発現し得る。
人工的に合成した遺伝子を作製するための D N A合成技術およぴ核酸化学に ついては、 例えば、 Ga i t， M. J . (1985). O l i g o nu c l e o t i d e Syn t h e s ι s ： A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, I RLP r e s s ; Ga i t, M. J. (1990). O l i g o nu c l e o t i d e Syn t h e s i s ： A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, I R L P r e s s ! E c k s t e i n, F. (1 991). O l i g o nu c l e o t i d e s a n d An a 丄 o g u e s : A P r a c t i c a l Ap p r o a c , I R L P r e s s ; Ad ams, R. L. e t a 1. (19 92). Th e B i o c h em i s t r y o f t h e Nu c l e i c Ac i d s, Ch a pma n&Ha l 1 ； S h a b a r o v a, Z . e t a 1. (1 994). Ad v a n c e d O r g a n i c Ch em i s t r y o f Nu c l e i c Ac i d s, We i n e im; B l a c k b u r n, G. M. e t a l . (1996). Nu c l e i c Ac i d s i n C h em i s t r y a n d B i o l o g y, Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s ； He rma n s o n, G. T. (1.996). B i o c o n j u g a t e Te c hn i qu e s, Ac a d emi c P r e s sなどに 記載されており、 これらは本明細書において関連する部分が参考として援用さ れる。
本明細書において「外来遺伝子」は、植物において発現し得るものであれば、 どのようなものでもよい。従って、 1つの実施形態において 「外来遺伝子」 は、 大量に発現されることが企図される有用なタンパク質をコードするものであれ ば、 どのようなものでもよく、 そのようなものもまた、 本発明の範囲内に含ま れる。 そのような外来遺伝子としては、 例えば、 医薬活性のあるペプチド （例 えば、 サイトカイン類 （インターロイキン類、 ケモカイン類、 顆粒球マクロフ ァ一ジコロニ一刺激因子（GM—CSF)、マクロファージコロニー刺激因子（M _CSF)、 顆粒球コロニー刺激因子 （G— CSF)、 mu 1 t i— CSF (I L_3)、 エリスロポエチン （EPO)、 白血病抑制因子 （L I F)、 c -k i t リガンド （SCF) のような造血因子、 腫瘍壌死因子、 インターフェロン類、 血小板由来増殖因子 （PDGF)、 上皮増殖因子 （EGF)、 線維芽細胞増殖因 子 （FGF)、 肝実質細胞増殖因子 （HGF)、 血管内皮増殖因子 （VEGF) など）、 ホルモン類 （インスリン、 成長ホルモン、 甲状腺ホルモンなど））、 ワク チン抗原、 血液製剤、 農業生産上有用なペプチド、 例えば抗菌タンパク質、 生 理作用 ·薬理作用を持つ二次代謝産物を合成する様々な酵素や加水分解酵素、 ' 酵素反応を調節するインヒビター、 血圧効果作用を持つとされるダイズグリシ ニン、 あるいは消化管内で酵素分解を受けることで生理活性ぺプチドが切り出 されるようにデザインされた人工タンパク質といったものがあげられるがそれ らに限定されない。 また栄養学的に意義のある物質としては、 カゼイン、 マメ 類のアルプミンゃグロブリン、 あるいはビタミン類 ·糖 ·脂質の合成酵素など があげられるがそれらに限定されない。 さらに様々な加工食品の原料として加 ェ特性に関与するタンパク質として、 例えばコムギグルテニン （製パン）、 ダイ ズグロブリン群 （豆腐）、 ミルクカゼィン群 (チーズ） など、 また食品の嗜好性 や機能性を強化するタンパク質、 例えばシクロデキストリンゃォリゴ糖、 γァ ミノ酢酸などの特殊な糖 ·アミノ酸類の合成酵素群、 外観を良くする色素合成 酵素や味覚成分合成に関与するタンパク質群、 あるいは、 消化管内で酵素消化 を受けることにより、 生理作用をもつペプチド （例えば血圧効果作用をもつ、 アンジォテンシン変換酵素阻害べプチドなど） が切り出されるようにデザィン された人工タンパク質などがあげられるがこれらに限定されない。
本明細書において 「糖鎖」 とは、 単位糖 （単糖および/またはその誘導体） が 1つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が 2つ以上連なる場合は、各々 の単位糖同士の間は、通常、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。 このような糖鎖としては、 例えば、 生体中に含有される多糖類 （グルコース、 ガラクトース、 マンノース、 フコース、 キシロース、 Ν—ァセチノレグノレコサミ ン、 Ν—ァセチルガラクトサミン、 シアル酸ならぴにそれらの複合体おょぴ誘 導体） の他、 分解された多糖、 糖タンパク質、 プロテオダリカン、 グリコサミ ノグリカン、 糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広 範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。 したがって、本明細書では、 糖鎖は、 「多糖 （ポリサッカリ ド)」、 「糖質」、 「炭水化物」 と互換可能に使用さ れ得る。 また、 特に言及しない場合、 本明細書において 「糖鎖」 は、 糖鎖およ ぴ糖鎖含有物質の両方を包含することがある。
本明細書において 「単糖」 とは、 これより簡単な分子に加水分解されず、 少 なくとも 1つの水酸基おょぴ少なくとも 1つのアルデヒド基またはケトン基を 含む、 ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンならぴにその誘 導体をいう。通常単糖は、一般式 C η Η 2 η Ο ηで表されるがそれらに限定されず、 フコース (デォキシへキソース）、 Ν—ァセチルダルコサミンなども含まれる。 ここで、 上の式において、 η = 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 1 0で あるものを、 それぞれジオース、 トリオース、 テトロース、 ペントース、 へキ ソース、 ヘプトース、 オタ トース、 ノノースおよびデコースという。 一般に鎖 式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、 前者をアルド ース， 後者をケトースという。 本明細書において特に言及するときは、 単糖の 誘導体は、 置換されていない単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換さ れ、 結果生じる物質をいう。 そのような単糖の誘導体としては、 カルボキシル 基を有する糖 （例えば、 C一 1位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸 (例えば、 D—グルコースが酸化された D—ダルコン酸）、 末端の C原子がカル ボン酸となったゥロン酸 （D—グルコースが酸化された D—グルクロン酸）、 ァ ミノ基またはァミノ基の誘導体 （例えば、 ァセチル化されたアミノ基） を有す る糖 (例えば、 N—ァセチルー D—ダルコサミン、 N—ァセチルー D—ガラク トサミンなど）、 ァミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖 （例えば、 N—ァセチルノイラミン酸 （シアル酸）、 N—ァセチルムラミン酸など）、 デォ キシ化された糖 （例えば、 2—デォキシー D—リポース）、 硫酸基を含む硫酸化 糖、 リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。 本明細書 では、 単糖という場合は、 上記誘導体も包含する。 あるいは、 へミアセタール 構造を形成した糖において、 アルコールと反応してァセタール構造のダリコシ ドもまた、 単糖の範囲内にある。
本明細書においてァスパラギン結合型糖鎖構造の表示は、 高橋らの命名法 (http : //w . gak. co. jp； 本明細書においてァスパラギン結合型糖鎖構造の 表示は、 高橋らの命名法 （http:〃ww. gak. C0. jp ; 高撟禮子編著、 生化学実 験法 23、 糖蛋白質糖鎖研究法、 学会出版センター、 1989年； Takahashi N, i'omiya Ν'· Analysis of N—丄 inked oligosaccharides '· Application of glycoamidase A : in Handbook of endoglycosidases and g丄 ycoamidases (Takahashi N, Muraraatsu T eds. ) . pp. 209-241, CRC Press, Boca Raton, FL， 1992 に準ずる。 これは、 1)N -ァセチルラクトサミン型 （コンプレックス型） 糖 鎖の場合には、 （A) 分岐の数を 3桁の数字の最初の数で示す。 ( B ) 還元末端 の N-ァセチルダルコサミンに a l， 6結合にてフコースが結合しているときは 1 を、 結合していないときには 0を 3桁の数字の真ん中に入れる。 （C ) コア構造 5糖の マンノースに N -ァセチルダルコサミンが 1， 4で結合しているときは 1 を、結合していないときには 0を 3桁の数字の最後に入れる。 3桁の数字の後に. を置きその右側には固有番号をつける。 2)高マンノース型 （ハイマンノース型） 糖鎖は最初に Μを、 次にマンノース残基の数を入れる。 その後に.を置きその右 側には固有記号をつける。 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンに α 1, 6結合に てフコースが結合しているときは Μの後に Fを入れる。 3)混成型 （ハイブリツ ド型） 糖鎖は最初に Ηを、 次にマンノース残基数を入れる。 その後に.を置きそ の右側には固有記号をつける。 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンに α 1, 6結 合にてフコースが結合しているときは Ηの後に Fを入れる。 4) 還元末端の Ν- ァセチルダルコサミンに α ΐ, 3結合にてフコースが結合しているときは Fを、コ ァ構造 5糖の )3マンノースにキシロースが 1, 2で結合しているときは Xを全体 の後に入れる。 その両方を有するときには FXの順に入れる。 5) N -ァセチルガラ クトサミンをガラクトースの代わりに有する場合は、 ガラクトースとして記号 をつけた後に、 N -ァセチルがラタトサミンの数が 1なら a、 2なら b、 3なら（5 · · · と'数に対応した小文字アルファべットを最後につける。 6)コア構造 5糖のよう に N -ァセチルラクトサミン型と高マンノース型若しくは混合型の何れにも分類 できる場合は N -ァセチルラクトサミン型の命名を優先する。 7)シアル酸を有す る場合には、 シアル酸の残基数を書き、 次にシアル酸の分子種が N-ァセチルノ イラミンサンの場合には A を、 さらに固有番号のセットを、 上記糖鎖構造の前 につけて-で結ぶ。 そのような表示方法の例としては、 ガラクトース β 1, 4 - Ν -ァ セチルダルコサミン β 1， 2-マンノース α ΐ, 3- (マンノース a l，3— (マンノース a 1, 6-)マンノース α 1, 6-)マンノース β 1, 4- Ν-ァセチルダルコサミン] 3 1, 4 - Ν- ァセチルダルコサミンを Η 5 . 1 2などと呼ぶ方式が挙げられるがそれらに限 定されない。 本明細書において本発明によって作製されたタンパク質は、 植物における翻 訳後修飾を受け特定の糖鎖が結合する。 このような糖鎖は、 動物への利用が目 的の場合、 同一であることが好ましく、 植物における修飾が同一であれば、 問 題なく使用することができ、 実質的に同一であれば問題はない。 また、 糖鎖の 修飾様式が異なっている場合であっても、 動物において有効に作用し、 好まし くは副作用がなければ問題なく利用することができる。修飾様式を変更したい 場合は、 酵素学的などの手法を用いて修飾を変更することができる。
発現されるべき外来遺伝子はまた、 上述の天然型の外来遣伝子と相同性のあ るものが使用され得る。 そのような相同性を有する外来遺伝子としては、 例え ば、 B i a s tのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、 比較対照の 外来遺伝子に対して、 少なくとも約 3 0 %、 約 3 5 %、 約 4 0 %、 約 4 5 %、 約 5 0 %、 約 5 5 %、 約 6 0 %、 約 6 5 %、 約 7 0 %、 約 7 5 %、 約 8 0 %、 約 8 5 %、 約 9 0 %、 約 9 5 %、 約 9 9 %の同一性または類似性を有する核酸 配列を含む核酸分子または少なくとも約 3 0 °/0、約 3 5 %、約 4 0 %、約 4 5 %、 約 5 0 %、 約 5 5 %、 約 6 0 %、 約 6 5 %、 約 7 0 %、 約 7 5 %、 約 8 0 %、 約 8 5 %、 約 9 0 %、 約 9 5 %、 約 9 9 %の同一性または類似性を有するアミ ノ酸配列を有するポリペプチド分子が挙げられるが挙げられるがそれらに限定 されない。
本明細書において遺伝子、 ポリヌクレオチド、 ポリペプチドなどの 「発現」 とは、 その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、 別の形態になること をいう。 好ましくは、 遺伝子、 ポリヌクレオチドなどが、 転写および翻訳され て、 ポリペプチドの形態になることをいうが、 転写されて mR NAが作製され ることもまた発現の一形態であり得る。 より好ましくは、 そのようなポリぺプ チドの形態は、 翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
従って、 本明細書において遺伝子、 ポリヌクレオチド、 ポリペプチドなどの 「発現」 の 「減少」 とは、 本発明の因子を作用させたときに、 作用させないと きよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、 ポリペプチドの発現量の減少を含む。 より特定すると、 発現の量が減少すると は、 因子の作用前に比べて作用後の発現量が少なくとも約 1 0 %減少している ことをいい、 より好ましくは少なくとも約 2 0 %、 さらに好ましくは少なくと も約 3 0 %、 さらに好ましくは少なくとも約 4 0 %、 さらに好ましくは少なく とも約 5 0 %、 さらに好ましくは少なくとも約 7 5 %、 さらに好ましくは少な くとも約 9 0 %、 さらに好ましくはほぼ 1 0 0 %減少していることをいう。 本 明細書において遺伝子、 ポリヌクレオチド、 ポリペプチドなどの 「発現」 の 「増 加」 とは、 本発明の因子を作用させたときに、 作用させないときよりも、 発現 の量が有意に増加することをいう。 好ましくは、 発現の増加は、 ポリペプチド の発現量の増加を含む。 より特定すると、 発現の量が増加するとは、 因子の作 用前に比べて作用後の発現量が少なくとも約 1 0 %増加していることをいい、 より好ましくは少なくとも約 2 0 °/0、 さらに好ましくは少なくとも約 3 0 %、 さらに好ましくは少なくとも約 4 0 %、 さらに好ましくは少なくとも約 5 0 %、 さらに好ましくは少なくとも約 7 5 %、 さらに好ましくは少なくとも約 9 0 %、 さらに好ましくは約 1 0 0 %以上、 さらに好ましくは約 2 0 0 %増加している こと、 あるいは、 作用前には発現していなかったものが発現するようになるこ とをいう。
本明細書において、 「アミノ酸」 は、 天然のものでも非天然のものでもよい。 「誘導体アミノ酸」 または 「アミノ酸アナログ」 とは、 天然に存在するァミノ 酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。 そのような 誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、 当該分野において周知である。 用 語 「天然のアミノ酸」 とは、 天然のアミノ酸の L一異性体を意味する。 天然の アミノ酸は、 グリシン、 ァラニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 セリン、 メチォニン、 トレオニン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 トリプトファン、 シ スティン、 プロリン、 ヒスチジン、 ァスパラギン酸、 ァスパラギン、 グノレタミ ン酸、 グルタミン、 γ—カルボキシグルタミン酸、 アルギニン、 オル二チン、 およびリジンである。 特に示されない限り、 本明細書でいう全てのアミノ酸は
L体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。 用 語 「非天然アミノ酸」 とは、 タンパク質中で通常は天然に見出されないァミノ 酸を意味する。 非天然アミノ酸の例として、 ノルロイシン、 パラ一ニトロフエ ニノレアラニン、 ホモフエニノレアラニン、 パラーフノレオロフェ二/レアラニン、 3 —アミノー 2 _ベンジルプロピオン酸、 ホモアルギニンの D体または L体およ び D—フエ二ルァラニンが挙げられる。 「アミノ酸アナログ」 とは、 アミノ酸で はないが、 アミノ酸の物性および/または機能に類似する分子をいう。 ァミノ 酸アナログとしては、 例えば、 ェチォニン、 カナバニン、 2—メチルダルタミ ンなどが挙げられる。 アミノ酸模倣物とは、 アミノ酸の一般的な化学構造とは 異なる構造を有するが、 天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合 物をレヽっ 0 .
アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号力 または I UP AC— I UB B l o c h em i c a l Nome n c l a t u r e Co mm ι s s l o nに より推奨される 1文字記号のいずれかにより、 本明細書中で言及され得る。 ヌ クレオチドも同様に、 一般に認知された 1文字コードにより言及され得る。 本明細書において 「対応する」 アミノ酸または核酸とは、 あるポリペプチド 分子またはポリヌクレオチド分子において、 比較の基準となるポリべプチドま たはポリヌクレオチドにおける所定のァミノ酸またはヌクレオチドと同様の作 用を有する力、 または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドを レ、い、 特に酵素分子にあっては、 活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に 同様の寄与をするアミノ酸をいう。 例えば、 アンチセンス分子であれば、 その アンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であ り得る。 このような 「対応する」 アミノ酸または核酸は、 一定範囲にわたる領 域またはドメインであってもよい。 従って、 そのような場合、 本明細書におい て 「対応する」 領域またはドメインと称される。
本明細書において、 「対応する」 遺伝子 （例えば、 ポリペプチド分子またはポ リヌクレオチド分子） とは、 ある種において比較の基準となる種における所定 の遺伝子と同様の作用を有するか、 または有することが予想される、 別の種に おける遺伝子をいい、 しばしば特定のアミノ酸配列が高度に保存されている領 域が共通して見られる。 このような特徴は、 それらが進化的には同一祖先を有 するものであり、 ある遺伝子の対応する遺伝子は、 その遺伝子のオルソログで あり得る。 対応する遺伝子は、 同族遺伝子を包含する。 例えば、 イネプロラミ ンに対応するコムギ遺伝子は、 コムギグルテニンであり得る。 そのような対応 する遺伝子は、 当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。 したがって、 例えば、 ある生物における対応する遺伝子は、 対応する遺伝子の 基準となる遺伝子 （例えば、 イネのプロラミンなどの遺伝子） の配列をクエリ 配列として用いてその生物 （例えばコムギ、 トウモロコシなど） の配列データ ベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において 「ヌクレオチド」 は、 天然のものでも非天然のものでもよ レ、。 「誘導体ヌクレオチド」 または 「ヌクレオチドアナログ」 とは、 天然に存在 するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するもの をいう。 そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、 当該 分野において周知である。 そのような誘導体ヌクレオチドおよぴヌクレオチド アナログの例としては、 ホスホロチォエート、 ホスホルアミデート、 メチルホ スホネート、 キラルメチルホスホネート、 2— O—メチルリポヌクレオチド、 ペプチド一核酸 （P NA) が含まれるが、 これらに限定されない。
本明細書において、 「フラグメント」 とは、 全長のポリペプチドまたはポリヌ クレオチド （長さが n ) に対して、 l 〜 n— 1までの配列長さを有するポリべ プチドまたはポリヌクレオチドをいう。 フラグメントの長さは、 その目的に応 じて、 適宜変更することができ、 例えば、 その長さの下限としては、 ポリぺプ チドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、 ここの具体的に列挙してい ない整数で表される長さ （例えば、 1 1など） もまた、 下限として適切であり 得る。 また、 ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0、 7 5、 1 0 0およびそれ以上のヌクレオチドが 挙げられ、 ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ （例えば、 1 1 など） もまた、 下限として適切であり得る。 本明細書において、 ポリペプチド およびポリヌクレオチドの長さは、 上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸 の個数で表すことができるが、 上述の個数は絶対的なものではなく、 同じ機能 を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（ま たは例えば上下 1 0 %) のものも含むことが意図される。 そのような意図を表 現するために、本明細書では、個数の前に「約」 を付けて表現することがある。 しかし、 本明細書では、 「約」 のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないこ とが理解されるべきである。
本明細書において 「生物学的活性」 とは、 ある因子 （例えば、 ポリペプチド またはタンパク質） 力 生体内において有し得る活性のことをいい、 種々の機 能を発揮する活性が包含される。 例えば、 ある因子がアンチセンス分子である 場合、 その生物学的活性は、 対象となる核酸分子への結合、 それによる発現抑 制などを包含する。例えば、 ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、 その酵素活性を包含する。 別の例では、 ある因子がリガンドである場合、 その リガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。 そのような生物学的活性 は、 当該分野において周知の技術によって測定することができる。
本明細書において 「アンチセンス活性」 とは、 標的となる遺伝子の発現を特 異的に抑制または減少させることができる活性をいう。 より具体的には細胞内 に導入したあるヌクレオチド配列に依存して、 その配列と相捕的なヌクレオチ ド配列領域をもつ遺伝子の mR NA量を特異的に低下させることで、 タンパク 発現量を減少させ得る活性をいう。 手法としては、 標的となる遺伝子からつく られる mRN Aに相補的な RN A分子を直接的に細胞に導入する方法と、 細胞 内に目的遺伝子と相捕的な RNAを発現させ得る構築ベクターを導入する方法 に大別されるが、 植物においては、 後者のほうが一般的である。
アンチセンス活性は、 通常、 目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、 少な くとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。 そのよう な核酸配列は、 好ましくは、 少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、 より 好ましく 10の連続するヌクレオチド長の、 さらに好ましくは 11の連続する ヌクレオチド長の、 12の連続するヌクレオチド長の、 13の連続するヌクレ ォチド長の、 14の連続するヌクレオチド長の、 15の連続するヌクレオチド 長の、 20の連続するヌクレオチド長の、 25の連続するヌクレオチド長の、 30の連続するヌクレオチド長の、 40の連続するヌクレオチド長の、 50の 連続するヌクレオチド長の、 核酸配列であり得る。 そのような核酸配列には、 上述の配列に対して、 少なくとも 70 %相同な、 より好ましくは、 少なくとも 80 %相同な、 さらに好ましくは、 90 %相同な、 95 %相同な核酸配列が含 まれる。 そのようなアンチセンス活性は、 目的とする遺伝子の核酸配列の 5' 末端の配列に対して相補的であることが好ましい。 そのようなアンチセンスの 核酸配列には、 上述の配列に対して、 1つまたは数個あるいは 1つ以上のヌク レオチドの置換、 付加および/または欠失を有するものもまた含まれる。 した がって、 本明細書において、 「アンチセンス活性」 には、 遺伝子の発現量の減少 が含まれるがそれらに限定されない。
一般的なアンチセン^技術については、 教科書に記載されている （Mu r r a y, J AH e d s., An t i s e n s e RNA a nd DNA, W i l e y— L i s s I n c， 1992)。 さらに最新の研究で RNA i n t e r f e r e n c e (RNA i) と呼ばれる現象が明らかになり、 アンチセンス 技術の発展をもたらした。 RNA iは、 標的遺伝子に相同な配列をもつ短い長 さの 2本鎖 RNA (20ベース程度） を細胞内に導入すると、 その RNA配列 に相同な標的遺伝子の m RNAが特異的に分解されて発現レベルが低下する現 象である。 当'初線虫において発見されたこの現象は、 植物を含めて生物に普遍 的な現象であることがわかってきて、 アンチセンス技術で標的遺伝子の発現が 抑制される分子レベルのメカニズムは、 この RNA iと同様のプロセスを経る ことが解明された。 従来は、 標的遺伝子のヌクレオチド配列に相捕的である 1 つの DN A配列を適当なプロモーターに連結して、 その制御下に人工 mRN A を発現させるような発現ベクターを構築して、 細胞内に導入することが行われ た。 最近の知見においては、 細胞内に 2本鎖 RNAを構成できるようにデザィ ンされた発現ベクターが用いられる。 基本構造はある標的遺伝子に相捕的な 1 種の DNA配列をプロモーター下に 1つを連結し、 それと同じ物をさらに逆向 きにもう 1つ連結してつくられる。 この構築遺伝子から転写された 1本鎖の m RNAでは、 逆向きにつながれた 1種類のヌクレオチド配列部分が相補的な関 係にあるため対合してヘアピン様の二次構造を持つ 2本鎖 R N A状態をとり、 これが RNA iのメカニズムに従って標的遺伝子の mRNA分解を引き起こす わけである。 植物においてはシロイヌナズナで用いられた例が報告されている (Sm i t h, NA e t a 1. , Na t u r e 407. 319— 320， 2000)。 また RNA i全般については、 最近の総説にまとめられている （森 田と吉田、 蛋白質 ·核酸 ·酵素 47、 1939— 1945、 2002)。 これら の文献に記載された内容は、 本明細書おいてその全体を参考として援用する。 本明細書において 「RNA i」 とは、 RNA i n t e r f e r e n c eの 略称で、 二本鎖 RNA (d sRNAともいう） のような RNA iを引き起こす 因子を細胞に導入することにより、 相同な mRNAが特異的に分解され、 遣伝 子産物の合成が抑制される現象おょぴそれに用いられる技術をいう。 本明細書 において RNA iはまた、 場合によっては、 RNA iを引き起こす因子と同義 に用いられ得る。 本明細書において 「R NA iを引き起こす因子」 とは、 R NA iを引き起こ すことができるような任意の因子をいう。 本明細書において 「遺伝子」 に対し て 「R NA iを引き起こす因子」 とは、 その遺伝子に関する R NA iを引き起 こし、 R NA iがもたらす効果 （例えば、 その遺伝子の発現抑制など） が達成 されることをいう。 そのような R NA iを引き起こす因子としては、 例えば、 標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約 7 0 %の相同性を有する配 列またはストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、 少なく とも 1 0ヌクレオチド長の二本鎖部分を含む R NAまたはその改変体が挙げら れるがそれに限定されない。 ここで、 この因子は、 好ましくは、 3 ' 突出末端 を含み、 より好ましくは、 3， 突出末端は、 2ヌクレオチド長以上の D N A (例 えば、 2〜4ヌクレオチド長の D NAであり得る。
あるいは、 本発明において用いられる R NA iとしては、 例えば、 短い逆向 きの相補的配列 （例えば、 1 5 b p以上であり、 例えば、 2 3 b pなど） のぺ ァが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、 「アンチセンス遺伝子」 とは、 アンチセンス活性をもたら しうる遺伝子ないしは構築物 （発現カセット） を示す。 同様に 「R NA i遺伝 子」 は、 R NA iを引き起こす遺伝子ないしは構築物 （発現カセット） を示す。
「発現抑制遺伝子」 は、 「アンチセンス遺伝子」 と 「RNA i遺伝子」 両者の総 称として用いる。
本明細書において、 外来遺伝子のポリペプチドを生産する方法としては、 例 えば、 遺伝子操作手法を利用して、 そのポリペプチドをコードする遺伝子を適 切な発現ベクターに組み込み、 これを用いて発現宿主を形質転換し、 この形質 転換細胞の培養上清から組換えポリぺプチドを得ることができる。 上記宿主細 胞は、 外来遺伝子の少なくとも 1つの生理活性を保持するポリぺプチドを発現 するものであれば、 特に限定されず、 従来から遺伝子操作において利用される 各種の宿主細胞 （例えば、 植物細胞のほか、 大腸菌、 酵母、 動物細胞など） を 用いることが可能である。 このようにして得られた細胞に由来するポリべプチ ドは、 天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、 アミノ酸配 列中の 1以上のアミノ酸が置換、 付加おょぴ Zまたは欠失していてもよく、 糖 鎖が置換、 付加および/または欠失していてもよレ、。
あるアミノ酸は、 相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、 例え ば、 カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造におい て他のアミノ酸に置換され得る。 あるタンパク質の生物学的機能を規定するの は、 タンパク質の相互作用能力おょぴ性質である。 従って、 特定のアミノ酸の 置換がアミノ酸配列において、 またはその DN Aコード配列のレベルにおいて 行われ得、 置換後もなお、 もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。 従つ て、 生物学的有用性の明らかな損失なしに、 種々の改変が、 本明細書において 開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する D N Aにおいて 行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、 アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。 タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指 数の重要性は、 一般に当該分野で認められている （Ky t e. Jおよび Do o 1 i t t 1 e, R. F. J . Mo 1. B i o l . 157 (1) ： 105-132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、 次いでそのタンパク質と他の分子 （例えば、酵素、基質、 レセプター、 DNA、 抗体、 抗原など） との相互作用を規定する。 各アミノ酸は、 それらの疎水性お よび電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。 それらは：ィソロイシ ン （+4. 5) ;パリン （+4. 2) ； ロイシン （+3. 8) ； フエ二ルァラニン (+2. 8) ； システィン/シスチン （+2. 5) ；メチォニン （+ 1 · 9) ;ァ ラニン （+1. 8) ;グリシン （一 0. 4) ;スレオニン （一0. 7) ;セリン （一 0. 8)； トリプトファン （一0. 9)；チロシン （一 1 · 3)；プロリン （一 1 , 6) ; ヒスチジン （一3. 2) ;グルタミン酸 （一 3. 5) ;グルタミン （一3. 5) ;ァスパラギン酸 （一3. 5) ;ァスパラギン （一 3. 5) ; リジン （一 3. 9) ;およびアルギニン （一4. 5)) である。
ある'アミノ酸を、 同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、 そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 （例えば、 酵素活性 において等価なタンパク質） を生じさせ得ることが当該分野で周知である。 こ のようなアミノ酸置換において、 疎水性指数が ± 2以内であることが好ましく、 ± 1以内である.ことがより好ましく、 およぴ土 0. 5以内であることがさらに より好ましい。 疎水性に基づくこのようなァミノ酸の置換は効率的であること が当該分野において理解される。
タンパク質の改変においては、 親水性指数もまた、 考慮され得る。 米国特許 第 4， 554， 101号に記載されるように、 以下の親水性指数がアミノ酸残 基に割り当てられている ：アルギニン （+ 3. 0) ; リジン （+3. 0) ;ァス パラギン酸 （+3. 0 ± 1) ； グルタミン酸 （+ 3. 0土 1) ;セリン （+0. 3) ； ァスパラギン （+ 0. 2) ； グルタミン （+0. 2) ； グリシン （0) ;ス レオニン （一 0. 4) ;プロリン （一 0. 5± 1) ；ァラニン （一 0. 5) ； ヒス チジン （一 0. 5) ； システィン （一 1. 0) ;メチォニン （一 1. 3) ; /《リン (一 1. 5) ； ロイシン （一 1. 8)；イソロイシン （一 1 · 8) ； チロシン （一 2. 3) ； フエ二ルァラニン （一 2. 5) ；およびトリブトファン （_ 3. 4)。 ァミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る 別のものに置換され得ることが理解される。 このようなアミノ酸置換において、 親水性指数が ± 2以内であることが好ましく、 ±1以内であることがより好ま しく、 および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。
本発明において、 「保存的置換」 とは、 アミノ酸置換において、 元のアミノ酸 と置換されるアミノ酸との親水性指数または Zおよぴ疎水性指数が上記のよう に類似している置換をいう。 保存的置換の例としては、 例えば、 親水性指数ま たは疎水性指数が、 士 2以内のもの同士、 好ましくは ± 1以内のもの同士、 よ り好ましくは ±0. 5以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定され ない。 従って、 保存的置換の例は、 当業者に周知であり、 例えば、 次の各グル ープ内での置換：アルギニンおょぴリジン；グルタミン酸およぴァスパラギン 酸；セリンおょぴスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにノ リ ン、 ロイシン、 およびイソロイシン、 などが挙げられるがこれらに限定されな い。
本明細書において、 「改変体」 とは、 もとのポリペプチドまたはポリヌクレオ チドなどの物質に対して、 一部が変更されているものをいう。 そのような改変 体としては、 置換改変体、 付加改変体、 欠失改変体、 短縮 （t r un c a t e d) 改変体、 対立遺伝子変異体などが挙げられる。 対立遺伝子 （a l l e l e) とは、 同一遺伝子座に属し、 互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。 従 つて、 「対立遺伝子変異体」 とは、 ある遺伝子に対して、 対立遺伝子の関係にあ る改変体をいう。 そのような対立遺伝子変異体は、 通常その対応する対立遺伝 子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、 通常はほぼ同一の生物学的活 性を有するが、 まれに異なる生物学的活性を有することもある。 「種相同体また はホモログ （h omo l o g)J とは、 ある種の中で、 ある遺伝子とアミノ酸レ ベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60%以上の相同性、 より好ましくは、 80 %以上、 8 5 %以上、 90 %以上、 9 5 %以上の相同性） を有するものをいう。 そのような種相同体を取得する方法は、 本明細書の記載 から明らかである。 「オルソログ （o r t h o 1 o g)」 とは、 オルソロガス遣 伝子 (o r t h o l o g o u s g e n e) ともいい、 二つの遺伝子がある共 通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。 例えば、 多重遺伝子構造をもつ へモグロビン遺伝子フアミリ一を例にとると、 ヒトおよびマウスの αへモグロ ビン遺伝子はオルソログであるが， ヒトの ο:へモグ口ビン遣伝子および へモ グロビン遺伝子はパラログ （遺伝子重複で生じた遺伝子） である。 また、 シス ティンプロテアーゼインヒビターである、 ヒ トのシスタチン Αと、 イネのオリ ザシスタチンとを比較すると、 標的となるプロテアーゼとの相互作用に重要と 考えられる 3箇所の短いアミノ酸モチーフが保存されているだけで、 他の部分 のアミノ酸の共通性は非常に低い。 しかし、 両者はともにシスタチン遺伝子ス 一パーファミリーに属し、 共通祖先遺伝子を持つとされていることから、 単に 全体的なアミノ酸の相同性に限らず、 局所的に高い相同性を持つアミノ酸配列 が共通して存在する場合も、オルソログたり得る。 このように、オルソログは、 通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ること から、 本発明のオルソログちまた、 本発明において有用であり得る。 本発明に おいてターゲットとなるプロラミンは、 数多くのメンバーを有するフアミリー を形成し、そのようなものは、保存的に改変された改変体ということもできる。
「保存的 （に改変された） 改変体」 は、 アミノ酸配列および核酸配列の両方 に適用される。 特定の核酸配列に関して、 保存的に改変された改変体とは、 同 一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、 核酸がアミ ノ酸配列をコードしない場合には、 本質的に同一な配列をいう。 遺伝コードの 縮重のため、 多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードす る。 例えば、 コドン G C A、 G C C、 G C G、 および G C Uはすべて、 ァミノ 酸ァラニンをコードする。 したがって、 ァラニンがコドンにより特定される全 ての位置で、 そのコドンは、 コードされたポリペプチドを変更することなく、 記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。 このような核酸の変 動は、 保存的に改変された変異の 1つの種である 「サイレント改変 （変異）」 で ある。 ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、 その 核酸の可能なすべてのサイレント変異を記载する。 当該分野において、 核酸中 の各コドン （通常メチォニンのための唯一のコドンである AU G、 および通常 トリブトファンのための唯一のコドンである T G Gを除く） が、 機能的に同一 な分子を産生するために改変され得ることが理解される。 したがって、 ポリべ プチドをコ一ドする核酸の各サイレント変異は、 記載された各配列において暗 黙に含まれる。 好ましくは、 そのような改変は、 ポリペプチドの高次構造に多 大な影響を与えるアミノ酸であるシスティンの置換を回避するようになされ得 る。 このような塩基配列の改変法としては、 制限酵素などによる切断、 DNA ポリメラーゼ、 K l e n owフラグメント、 D N Aリガーゼなどによる処理等 による連結等の処理、 合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置 換法 （特定部位指向突然変異法； Ma r k Z o l l e r a n d Mi c h a e 1 Sm i t n, Me t h o d s i n En z ymo l o g y, 100, 468-500 (1 983)) が挙げられるが、 この他にも通常分子生物学の分 野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書中において、 機能的に等価なポリペプチドを作製するために、 アミ ノ酸の置換のほかに、 アミノ酸の付加、 欠失、 または修飾もまた行うことがで きる。 アミノ酸の置換とは、 もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1〜10個、 好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個のアミノ酸で置換することをい う。 ァミノ酸の付加とは、 もとのぺプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1〜 10個、 好ましくは 1〜 5個、 より好ましくは 1〜 3個のァミノ酸を付加することをい う。 アミノ酸の欠失とは、 もとのペプチドから 1つ以上、 例えば、 1〜10個、 好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることを いう。 アミノ酸修飾は、 アミ ド化、 カルボキシル化、 硫酸化、 ハロゲン化、 ァ ルキル化、 グリコシル化、 リン酸化、 水酸化、 ァシル化 （例えば、 ァセチル化） などを含むが、 これらに限定されない。 置換、 または付加されるアミノ酸は、 天然のアミノ酸であってもよく、 非天然のアミノ酸、 またはアミノ酸アナログ でもよレ、。 天然のアミノ酸が好ましい。
本明細書において使用される用語 「ペプチドアナログ」 または 「ペプチド誘 導体」 とは、 ペプチドとは異なる化合物であるが、 ペプチドと少なくとも 1つ の化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。 したがって、 ぺプ チドアナログには、 もとのペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナログま たはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。 ペプチドァ ナログは、 その機能が、 もとのペプチドの機能 （例えば、 p K a値が類似して いること、 官能基が類似していること、 他の分子との結合様式が類似している こと、 水溶性が類似していることなど） と実質的に同様であるように、 このよ うな付加または置換がされている。 そのようなペプチドアナログは、 当該分野 において周知の技術を用いて作製することができる。 したがって、 ペプチドァ ナログは、 アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
本明細書において、 「ポリヌクレオチドアナログ」、 「核酸アナログ」 は、 交換 可能に用いられ、 ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、 ポ リヌクレオチドまたは核酸と少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能 が等価であるものをいう。 したがって、 ポリヌクレオチドアナログまたは核酸 アナログには、 もとのペプチドに対して、 1つ以上のヌクレオチドアナログま たはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
本明細書において使用される核酸分子は、 発現されるポリぺプチドが天然型 のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、 上述のようにその核酸の 配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、 あるいは他の 核酸配列が一部挿入されていてもよい。 あるいは、 5 ' 末端および/または 3， 末端に他の核酸が結合していてもよい。 また、 ポリペプチドをコードする遺伝 子をストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 そのポリペプチドと実質 的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。 このよ うな遺伝子は、 当該分野において公知であり、 本発明において利用することが できる。
このような核酸は、 周知の P C R法により得ることができ、 化学的に合成す ることもできる。 これらの方法に、 例えば、 部位特異的変位誘発法、 ハイプリ ダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、 ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの 「置換、 付加お よび/または欠失」 とは、 もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対し て、 それぞれアミノ酸もしくはその代替物、 またはヌクレオチドもしくはその 代替物が、 置き換わること、 付け加わることまたは取り除かれることをいう。 このような置換、 付加または欠失の技術は、 当該分野において周知であり、 そ のような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、 付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよく、 そのような数は、 その 置換、 付加または欠失を有する改変体において目的とする機能 （例えば、 ホル モン、 サイト力インの情報伝達機能など） が保持される限り、 多くすることが できる。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、 全体の長さの 2 0 %以内、 1 0 %以内、 または 1 0 0個以下、 5 0個以下、 2 5個以下などであり得る。
本明細書において、 遺伝子が 「特異的に発現する」 とは、 その遺伝子が、 植 物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる （好ましく は高い） レベルで癸現されることをいう。特異的に発現するとは、 ある部位（特 異的部位） にのみ発現してもよく、 それ以外の部位においても発現していても よレ、。 好ましくは特異的に発現するとは、 ある部位においてのみ発現すること をいう。
本明細書において、 遺伝子が 「特異的に抑制される」 とは、 その遺伝子が、 植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる （好まし くは高い） レベルで抑制されることをいう。 特異的に発現するとは、 ある部位 (特異的部位） にのみ抑制されてもよく、 それ以外の部位においても抑制され ていてもよい。 好ましくは特異的に抑制されるとは、 ある部位においてのみ抑 制されることをいう。
本明細書において遺伝子について言及する場合、 「ベクター」 とは、 目的のポ リヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。 そ のようなベクターとしては、 原核生物細胞、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫 細胞、 動物個体および植物個体等の宿主細胞において自律複製が可能であるか、 または染色体中への 込みが可能で、 本発明のポリヌクレオチドの転写に適し た位置にプロモーターを含有しているものが例示される。 本明細書においてべ クタ一は、 発 ベクター、 糸且換えベクターなどであり得る。
本明細書においてベクターとしては、 遺伝子実験に用いられる一般的なパク テリア （代表的なものとして大腸菌 K12株由来の大腸菌株） で複製可能かつ 単離精製可能な物があげられる。 これは植物に導入する目的遺伝子を構築する ために必要である。 具体的には、 例えば大腸菌の pBR322プラスミドや p
UC 18、 pUC 19、 p B l u e s c r i p t、 pGEM— Tといった巿販 構築プラスミドがある。 エレクトロボレ一シヨン法、 ポリエチレングリコール 法、 パーティクルガン法といった直接的に遺伝子断片を植物細胞に導入して形 質転換する場合には、 このような市販されている一般的なプラスミドを用いて 導入する遺伝子の構築を行えばよい。 また、 ベクターの特殊な例として、 ァグ ロバクテリゥムを介した遺伝子導入法を用いて植物細胞を形質転換する場合は、 大腸菌とァグロバタテリゥム双方の複製開始点、 および植物に導入され得る境 界領域を示す T— DN Α由来の境界配列 （L e f t b o r d e rおよび R i g h t B o r d e r) に相当するヌクレオチド配列を有する 「バイナリー ベクター」 と呼ばれるプラスミドを用いる必要がある。例えば pB 1 101 (C 1 o n t e c h社より市販）、 B IN (B e v a n, N., Nu c l e i c A c i d Re s e a r c h 12, 871 1-8721, 1 984) 、 ： B I NP l u s (v a n E n g e 1 e n, FA e t a 1. , Tr a n e g e n i c Re s e a r c h 4， 288— 290、 1995)、 pTNまたは p TH (F u k u o k a H e t. a l " P l a n t C e l l R e p o r t s 19, 2000)s p PZP (Ha j duk i ew i c z P e t a 1·， P l a n t Mo l e c u l a r B i o l o g y 25, 989— 99 4， 1994) などがあげられるがそれらに限定されない。 このほか、 植物に 利用され得るベクターとしては、 タバコモザイクウィルスベクターも例示され るが、 このタイプのベクターは目的遺伝子を植物染色体に導入するわけではな いので、 遺伝子導入した植物を種子を介して増殖させること必要がない場合に 用途が限定されるが、 本 明に使用し得る。
本明細書において 「発現カセット」 は、 ある構造遺伝子、 およびその発現を 調節するプロモーター配列や種々の調節エレメント、 および mR NA転写を終 結させるターミネータ一配列を、 宿主の細胞中で構造遺伝子が動作し得る状 で連結してある人工構築遺伝子の 1単位を示す。 代表的なものとしては、 遺伝 子導入された宿主細胞のみを選択するための選択マーカー （例えばハイグロマ イシン耐性遺伝子） 発現カセット、 あるいは宿主細胞内に発現させたい有用タ ンパク質遺伝子の発現カセットといったものが例示される。 準備するべき発現 カセットの種類 ·構造と数については、 生物 ·宿主細胞 · 目的に応じて使い分 けられるべきであり、 その組み合わせは当業者には周知である。
本明細書において 「発現ベクター」 は、 上記の 「発現カセット」 を 1つ以上 含み得る 「ベクター」 として定義される。 植物に導入を行うべき目的遺伝子発 現カセットごとに別々のベクター上に配置しても良いし、 1つのベクター上に 全ての発現カセットを連結しても良い。 本発明に用いる植物用の発現ベクター は、 バイナリーベクタータイプであり得る。 さらにはこのベクタ一には導入す る目的遺伝子発現カセットと同時に、 宿主植物に適した選択マーカー （例えば ハイグロマイシン耐性遺伝子） 発現力セットを含み得る。
本明細書において使用される選択マーカーとしては、 例えばハイグロマイシ ンホスホトランスフェラーゼ、 変異型ァセト酪酸シンターゼなどがあげられる がそれらに限定されない。 選択マーカー発現カセットに利用し得るプロモータ 一としては、 C a MV 3 5 Sプロモーターおよびその改変プロモーター、 ュビ キチンプロモーターなど、 ターミネータ一としては N o sターミネータ一、 T m lターミネータ一、 1 0 k D aプロラミンターミネータ一、 1 3 k D aプロ ラミンターミネータ一、 16 kDaプロラミンターミネータ一が挙げられるが それらに限定されない。
本明細書において 「ターミネータ一」 とは、 遺伝子のタンパク質をコードす る領域の下流に位置し、 DN Aが mRN Aに転写される際の転写の終結、 ポリ A配列の付加に関与する配列である。 ターミネータ一としては、 C aMV35 Sターミネータ一、 ノパリン合成酵素遺伝子のターミネータ一 （Tno s)、 タ パコ PR1 a遺伝子のターミネータ一が挙げられるが、 これに限定されない。 本発明では、 植物においてターミネータ一の活性を示すものであれば、 どのよ うな配列でも使用することができる。
本明細書において「プロモーター」 とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、 またその頻度を直接的に調節する DNA上の領域をいい、 RNAポリメラーゼ が結合して転写を始める塩基配列である。 プロモーターの領域は、 通常、 推定 タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2 k b p以内の領域に見出さ れることが多いので、 DNA解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中の タンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。 推定プロモーター領域は、 構造遺伝子ごとに変動するが、 通常構造遺伝子の上 流にある力 S、これらに限定されず、構造遺伝子の中または下流にも存在し得る。 好ましくは、 推定プロモーター領域は、 第一ェキソン翻訳開始点から上流約 2 k p以内に存在するがそれに限定されず、それ以外にもプロモーターは存在 する。 好ましくは、 本発明では、 特異的に発現させるプロモーターが使用され 得る。 そのような特異的プロモーターとしては、 貯蔵タンパク質における特異 的な発現を駆動するプロモーターが好ましいがそれに限定されない。 より好ま しくは、本発明では、 プロモーターは、貯蔵タンパク質（例えば、 プロラミン） に由来するものが使用され得るが、 それに限定されない。 1つの好ましい実施 形態では、 16 kD aプロラミンに由来するプロモーター、 13 kDaプロラ ミンに由来するプロモーター、 l O kDaプロラミンに由来するプロモーター が使用され得る。 ターミネータ一の選択は発現強度に影響を及ぼす場合がある 力 一般にはこれまでの使用実績を踏まえて、 用いるプロモーターが異なって も、 N O Sターミネータ一を使う場合がほとんどであった。 しかし、 1つの好 ましい実施形態では、 本発明はプロラミン （特に 1 O k D aプロラミン） に由 来するターミネータ一を用いている。 このターミネータ一は塩基配列の長さが 短く、 マルチクローニング部位に存在するような制限酵素サイトがなく、 様々 な貯蔵タンパク質プロモーター、 ュビキチンプロモーター、 ァクチンプロモー ター、 C a MV 3 5 Sプロモーターと組み合わせて用いることができることが 示されており、 N O Sターミネータ一に代替しうる新たな植物 （イネ） 由来の 汎用的ターミネータ一が得られた点に留意すベきである。
本明細書において、 遺伝子の発現について用いられる場合、 一般に、 「部位特 異性」 とは、 生物 （例えば、 植物） の部位 （例えば、 植物の場合、 プロテイン ボディ—、 根、 茎、 幹、 葉、 花、 種子、 胚乳、 胚芽、 胚、 果実など） における その遺伝子の発現の特異性をいう。 「時期特異性」 とは、生物（たとえば、植物） の発達段階 （例えば、 植物であれば生長段階 （例えば、 プロテインボディの形 成の特定の時期、 発芽後の芽生えの日数)） に応じたその遺伝子の発現の特異性 をいう。 そのような特異性は、 適切なプロモーターを選択することによって、 所望の生物に導入することができる。
本明細書において、 本発明のプロモーターの発現が 「構成的」 であるとは、 生物のすべての組織において、 その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれ にあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。 具体的には、 本明細書の実 施例と同様の条件でノーザンプロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例 えば、 2点以上 （例えば、 5日目および 1 5日目）） の同一または対応する部位 のいずれにおいても発現がみられるとき、 本発明の定義上、 発現が構成的であ るという。 構成的プロモーターは、 通常の生育環境にある生物の恒常性維持に 役割を果たしていると考えられる。 本癸明のプロモーターの発現が 「ス トレス (または刺激） 応答性」 であるとは、 少なくとも 1つのス トレス （または刺激） が生物体に与えられたとき、 その発現量が変化する性質をいう。 特に、 発現量 が増加する性質を 「ス トレス （または刺激） 誘導性」 といい、 発現量が減少す る性質を 「ス トレス （または刺激） 減少性」 という。 「ス トレス （または刺激） 減少性」 の発現は、 正常時において、 発現が見られることを前提としているの で、 「構成的」 な発現と重複する概念である。 これらの性質は、 生物の任意の部 分から RNAを抽出してノーザンプロット分析で発現量を分析することまたは 発現されたタンパク質をウェスタンプロットにより定量することにより決定す ることができる。 ス トレス （または刺激） 誘導性のプロモーターを本発明のポ リぺプチドをコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された植 物または植物の部分 （特定の細胞、 組織など） は、 そのプロモーターの誘導活 性をもつ刺激因子を用いることにより、 ある条件下でのみ貯蔵タンパク質の低 減およびそれに伴う目的のタンパク質の発現を行うことができる。
本明細書において 「ェンハンサー」 とは、 目的遺伝子の発現効率を高めるた めに用いられ得る。 植物において使用する場合、 ェンハンサ一としては、 例え ば、 C a MV 3 5 Sプロモーター内の上流側の配列を含むェンハンサー領域が 好ましい。 ェンハンサ一は複数個用いられ得るが 1個用いられてもよいし、 用 いなくともよい。
本明細書において 「サイレンサー」 とは、 遺伝子発現を抑制し静止する機能 を有する配列をいう。 本発明では、 サイレンサーとしてはその機能を有する限 り、 どのようなものを用いてもよく、 サイレンサーを用いなくてもよい。
本明細書において 「作動可能に連結された （る）」 とは、 所望の配列の発現 （ 作動） がある転写翻訳調節配列 （例えば、 プロモーター、 ェンハンサーなど) または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。 プロモーターが遺伝子 に作動可能に連結されるためには、 通常、 その遺伝子のすぐ上流にプロモータ 一が配置されるが、 必ずしも隣接して配置される必要はない。 本明細書において、 核酸分子を細胞に導入する技術は、 どのような技術でも よく、例えば、 形質転換、形質導入、 トランスフエクシヨンなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、 当該分野において周知であり、 かつ、 慣用 されるものであり、 例えば、 Au s u b e 1 F. A. ら編 （1988)、 C r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y、 Wi l e y、 New Y o r k、 N Y ; S a m b r o o k Jら （198 7) Mo l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a 1 , 2n d E d. ぉょぴその 3 r d e d., Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, C o l d S p r i n g Ha r b o r, NY、 別冊実験医学 「遺伝子導入 &発現解析実験法」 羊土社、 1997などに記載される。 遺伝子の導入は、 ノーザンプロット、 ウェスタン プロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用 いて確認することができる。
また、 ベクターの導入方法としては、 細胞に DNAを導入する上述のような 方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 トランスフエクシヨン、 形 質導入、 形質転換など （例えば、 リン酸カルシウム法、 リボソーム法、 DEA Eデキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法など）、 リポフエクシヨン法、 スフエロプラスト法 [P r o c. N a t 1. Ac a d. S c i . USA, 84， 1929 (1 978)]、 酢酸リチ ゥム法 [J. B a c t e r i o l ., 153， 163 (1 983)]、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 75， 1929 (1978) 記載の方 法が挙げられる。
本明細書において 「遺伝子導入試薬」 とは、 遺伝子導入方法において、 導入 効率を促進するために用いられる試薬をいう。 そのような遺伝子導入試薬とし ては、 例えば、 カチオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリアミン系試薬、 ポリ イミン系試薬、 リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。 トランスフエクションの際に利用される試薬の具体例としては、 種々なソース から市販されている試薬が挙げられ、 例えば、 E f f e c t e n e T r a n s f e c t i o n Re a g e n t (c a t . n o. 301425， Q i a g e n, C A), Tr a n s F a s t TM T r a n s f e c t i o n Re a g e n t (E 2431 , P r ome g a, WI), T f x TM- 20 R e a g e n t (E 2391 , P r ome g a, WI), S up e r F e c t Tr a n s f e e t i o n Re a g e n t (301305， Q i a g e n, CA)， P o 1 y F e c t T r a n s f e c t i o n Re a g e n t (301 105, Q i a g e n, CA)， L i p o f e c t AMI NE 2000 Re a g e n t (1 1668— 01 9， I nv i t r o g e n c o r p o r a t i o n, CA)， J e t PE I (X 4) c o n e. (101— 30, P o 1 y 1 u s - t r a n s f e c t i o n, F r a n c e) および ExGe n 500 (R 0 51 1， F e rme n t a s I n c ·， MD) などが挙げられるがそれらに限 定されない。
本発明を植物において利用する場合、 植物細胞への植物発現ベクターの導入 には、 当業者に周知の方法、 例えば、 ァグロパクテリゥムを介する方法および 直接細胞に導入する方法、 が用いられ得る。 ァグロパクテリゥムを介する方法 としては、 例えば、 Na g e 1 らの方法 （Na g e l ら （1990)、 Mi c r o b i o l . L e t t ., 67， 325) が用いられ得る。 この方法は、 まず、 例えば植物に適切な発現ベクターでエレク トロポレーシヨンによってァグロバ クテリゥムを形質転換し、 次いで、 形質転換されたァグロパクテリゥムを G e 1 V i nら （G e 1 v i nら編 （1994)、 P l a n t Mo l e c u l a r B i o l o g y Ma nu a l (K 1 u w e r Ac a d em i c P r e s s Pu b l i s h e r s)) に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。 植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、 エレク ト口ポレーショ ン法 （Sh imamo t oら （1989)、 Na t u r e、 338 ： 274-2 76 ；および Rh o d e sら （1989)、 S c i e n c e、 240 ： 204 -207を参照のこと）、 パーティクルガン法 （Ch r i s t o uら （1991 )、 B i o/Te c h n o 1 o g y 9 : 957— 962を参照のこと） ならび にポリエチレングリコール （PEG) 法 （Da t t aら （1990)、 B i o/ T e c hn o l o g y 8 : 736— 740を参照のこと） が挙げられる。 こ れらの方法は、 当該分野において周知であり、 形質転換する植物に適した方法 当業者により適宜選択され得る。 ..
植物発現ベクターを導入された細胞は、 まずハイグロマイシン耐性、 カナマ イシン耐性などの薬剤耐性で選択される。 次いで、 当該分野で周知の方法によ り、 植物組織、 植物器官および Zまたは植物体に再分化され得る。 さらに、 植 物体から種子が取得され得る。 導入した遺伝子の発現は、 ノーザンプロット法 または PC R法により、 検出し得る。 必要に応じて、 遺伝子産物たるタンパク 質の発現を、 例えば、 ゥヱスタンプロット法により確認し得る。
本発明は、 植物において特に有用であることが示されているが、 他の生物に おいても利用することができる。 本発明において使用される分子生物学技術は、 当該分野において周知であり、 かつ、 慣用されるものであり、 例えば、 Au s u b e 1 F. A. ら編（1988)、 C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y Wi l e y New Yo r k、 NY； S amb r o o k Jら （1 987) Mo l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma nu a l , 2 n d E d. およぴ その第 3版， C o l d S p r i n g Ha r o r L a b o r a t o r y P r e s s, Co l d S p r i n g Ha r b o r, N Y、別冊実験医学「遣 伝子導入 &発現解析実験法」 羊土社、 1997などに記載される。
本明細書において 「形質転換体」 とは、 形質転換によって作製された細胞な どの生命体の全部または一部をいう。 形質転換体としては、 原核細胞、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞等が例示される。 形質転換体は、 その対象に依 存して、 形質転換細胞、 形質転換組織、 形質転換宿主などともいわれ、 本明細 書においてそれらの形態をすベて包含するが、 特定の文脈において特定の形態 を指し得る。
形質転換を行う方法において、 物理的手法には、 ポリエチレングリコール法 ( P E G法）、 電子穿孔 （エレクト口ポレーシヨン） 法、 マイクロインジェクシ ヨン法、 パーティクルガン法がある。 これらの方法は、 単子葉、 双子葉の両植 物体に適用できる点で有用性が高い。 し力 し、 ポリエチレングリコール法とェ レクトロボレ一シヨン法では、 細胞壁が障害となるため、 プロトプラストを用 いなければならない上、 導入された遺伝子の植物細胞の染色体 D N Aへの糸且込 み頻度が低いことが問題である。 また、 プロトプラストを用いずに、 カルスや 組織を用いたマイクロインジェクション法では、 針の太さや組織の固定等に関 して困難が多い。 組織を用いたパーティクルガン法でも、 変異がキメラの形で 出現してくる等の問題がある。 また、 これら物理的手法では、 一般に、 導入さ れた外来遺伝子が核ゲノムに不完全な状態で多コピーの遺伝子として組込まれ やすい。 外来遺伝子が多コピー導入されると、 その遺伝子が不活化されやすい ことが知られている。
他方、 生物を利用して単離遺伝子を導入する方法には、 ァグロパクテリゥム 法、 ウィルスベクター法、 および近年開発されている、 花粉をベクターとして 用いる方法がある。 これらの方法は、 プロトプラストを用いず植物のカルス、 組織または植物体を用いて遺伝子導入を行うため、 培養が長期間に及ぶことが なく、 またソマクローナル変異等の障害を受けにくいという長所を有している。 これらのうち花粉をベクターとして用いる方法は、 まだ実験例も少なく、 植物 の形質転換法としては未知数の部分が多い。 ウィルスベクター法は、 ウィルス に感染した植物体全体に導入すべき遺伝子が広がるという利点はあるものの、 各細胞内で增幅されて発現されるだけで、 次世代に伝えられるという保証がな いという点、 および長い D NA断片を導入できないという点に問題がある。 ァ グロパクテリゥム法は、 約 2 0 k b p以上の D N Aを大きな再編成なしに染色 体に導入できること、導入される遺伝子のコピー数が、数コピーと少ないこと、 および再現性が高いこと等、 多くの利点がある。 イネ科植物等の単子葉植物に とってァグロバタテリゥムは宿主範囲外であるため、 イネ科植物への外来 伝 子導入は、 従来は、 先に述べたような物理的手法により行われてきた。 しかし ながら、 近年、 単子葉植物でもイネ等、 培養系が確立されている植物において は、 ァグロパクテリゥム法が適用されるようになっており、 むしろ現在ではァ グロパクテリゥム法が好んで用いられている。
ァグロパクテリゥム法による外来遺伝子の導入では、 T iプラスミド V i r 領域に植物が合成するァセトシリンゴン等の低分子フエノール化合物が作用す ると、 T iプラスミドから T一 D NA領域が切り出され、 幾つかの過程を経て 植物細胞の核染色体 D N Aに組み込まれる。 双子葉植物では、 植物自身がその ようなフヱノール化合物の合成機構を備えているため、 リーフディスク法等に より容易に外来遺伝子を導入することができ、 再現性も高い。 これに対し、 単 子葉植物では、 そのようなフ-ノール化合物を植物自身が合成しないため、 ァ グロパクテリゥムによる形質転換植物の作出は困難であった。 しかし、 ァグロ パクテリゥムの感染時にァセトシリンゴンを添加することで、 単子葉植物への 外来遺伝子導入も現在では可能となっている。
本発明において、 形質転換体では、 目的とする核酸分子 （導入遺伝子） は、 染色体に導入されていても導入されていなくてもよい。 好ましくは、 目的とす る核酸分子 （導入遺伝子） は、 染色体に導入されており、 より好ましくは、 2 つの染色体の両方に導入されている。
植物細胞としては、 本明細書において以下に記載されるものが挙げられ、 ィ ネ、 ポテト、 タバコ、 トウモロコシ、 アブラナ、 大豆、 トマト、 ニンジン、 小 麦、 大麦、 ライ麦、 アルフアルファ、 亜麻のほか、 木本植物 （例えば、 ポプラ） の細胞などを挙げることができる。 より好ましくは、 植物細胞は、 イネであり 得る。 イネとしては、 ジャポニカ種、 インディ力種のものが挙げられるがそれ らに限定されない。 一つの好ましい実施形態では、 イネは、 ジャポニカ種のも のであり得る。 本明細書において、 イネの品種としては、 例えば日本晴、 ニホ ンマサリ、 金南風、 農林 22号、 中生旭、 コシヒカリ、 あきたこまち、 どんと こい、 ヒノヒカリ、 マンゲツモチ、 力グラモチ、ハクチョウモチ、 LGC— 1、 春陽、 豊雪わい性、 T e t e p、 B a s ma t i、 I R 8、 ヒョクモチ、 ヒメ ノモチ、 こがねもち、 風の子もちなどが挙げられるがそれらに限定されない。 別の好ましい実施形態では、 イネは、 インディ力種のものであり得る。 インデ イカ種の品種としては、 T e t e p、 B a s ma t i、 I R8、 湖南早などが 挙げられるがそれらに限定されない。 植物細胞への組換えベクターの導入方法 としては、 植物細胞に DNAを導入する方法であれば、 本明細書において他の 場所で詳述したように、 いずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリ ゥム （Ag r o b a c t e r i um) (特開昭 5 9— 140885、 特開昭 60 — 700 80、 WO 94/00 9 77)、 エレクトロポレーシヨン法 （特開昭 6 0— 25 1 8 8 7)、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許第 26 068 5 6、 特許第 25 1 78 1 3) 等が例示される。
本明細書において 「植物」 とは、 植物界に属する生物の総称であり、 クロ口 フィル、 かたい細胞壁、 豊富な永繚性の胚的糸且織の存在， および運動する能力 がない生物により特徴付けられる。 代表的には、 植物は、 細胞壁の形成 ·クロ 口フィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。 「植物」 は、 単子葉植物および 双子葉植物のいずれも含む。 好ましい植物としては、 例えば、 イネ、 コムギ、 トウモロコシ、 ォォムギ、 ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げら れる。 より好ましくは、 植物は、 イネであり得る。 イネとしては、 ジャポニカ 種、 インディ力種のものが挙げられるがそれらに限定されない。 より好ましく は、 イネは、 ジャポニカ種のものであり得る。 本明細書において、 イネの品種 としては、 例えば日本晴、 二ホンマサリ、 金南風、 農林 2 2号、 中生旭、 コシ ヒカリ、 あきたこまち、 どんとこい、 ヒノヒカリ、 マングツモチ、 力グラモチ、 ハクチヨゥモチ、 LGC— 1、 春陽、 豊雪わい性、 Te t e p、 B a s m a t i、 I R8、 ヒョクモチ、 ヒメノモチ、 こがねもち、 風の子もちなどが挙げら れるがそれらに限定されない。 インディ力種の品種としては、 Te t e p、 B a sma t i、 I R 8、 湖南早、 K a s a 1 a t hなどが挙げられるがそれら に限定されない。 もっとも好ましくは、 例えば LGC— 1のような他の貯蔵タ ンパク質 （例えば、 グルテリン、 グロプリンなど） の発現が低減されるように 改変されたイネが本発明において使用される。 好ましい植物は作物に限られず、 花、 樹木、 芝生、 雑草なども含まれる。 特に他で示さない限り、 植物は、 植物 体、 植物器官、 植物組織、 植物細胞、 および種子のいずれをも意味する。 植物 器官の例としては、 根、 葉、 茎、 および花などが挙げられる。 植物細胞の例と しては、 カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
イネ科の植物の例としては、 Or y z a、 Ho r d e num、 S e c a l e、 S c c c h a r um, E c i n o c h l o a, または Z e aに属する植物が 挙げられ、 例えば、 イネ、 才ォムギ、 ライムギ、 ヒェ、 モロコシ、 トウモロコ シなどを含む。
本発明の生産方法に用いられる植物は、 好ましくは単子葉植物であり、 より 好ましくは、 イネ科植物である。 さらに好ましくは、 イネであり得る。 さらに より好ましくは、本発明の生産方法に用いられる植物は、 日本晴、 どんとこい、 L G C _ 1、 豊雪わい性品種、 Te t e p、 B a sma t i、 コシヒカリ、 五 百万石、 コガネモチ、 Ka s a 1 a t hであり得る。 日本晴はゲノム配列が公 開されているので、 遺伝子が導入されている染色体位置を容易に把握できるこ とから好ましい。 どんとこいは食味がよくコシヒカリより背が低くて作りやす いことから好ましい。 LGC— 1はプロラミンアンチセンスがより効果的にで ることから好ましい。 豊雪わい性は植物体が非常に小さい （20 cmくらレ、） ものの種子は正常な大きさなのでィンキュベーター内で生産できることから好 ましい。 コシヒカリは、 日本の主力品種で低タンパク化により食味等の品質が 上昇するから好ましい。 五百万石は酒米として低タンパクなものが求められる ため好ましい。 コガネモチはモチ菓子などの米加工品用として低タンパクなも のが求められるため好ましい。 T e t e p、 B a s m a t i、 K a s a 1 a t hは、 本州北陸地方以南の温帯地域において普通に栽培して種子を得ることが できることから、 ある実施形態において好ましい。
本明細書において、 生物の 「組織」 とは、 細胞の集団であって、 その集団に おいて一定の同様の作用を有するものをいう。 従って、 組織は、 器官の一部で あり得る。 器官内では、 同じ働きを有する細胞を有することが多いが、 微妙に 異なる働きを有するものが混在することもあることから、 本明細書において組 織は、 一定の特4を共有する限り、 種々の細胞を混在して有していてもよい。 本明細書において、 「器官」 とは、 1つ独立した形態をもち、 1種以上の組織 が組み合わさつて特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。 植物では、 カルス、 根、 茎、 幹、 葉、 花、 種子、 胚芽、 胚、 果実、 胚乳などが挙げられる がそれらに限定されない。
本明細書において 「生物体」 （または、 植物の場合 「植物体」） とは、 当該分 野における最も広義に用いられ、 生命現象を営むもの （または植物） をいい、 代表的には、 細胞構造、 増殖 （自己再生産)、 成長、 調節性、 物質代謝、 修復能 力など種々の特性を有し、 通常、 核酸のつかさどる遺伝と、 タンパク質のっか さどる代謝の関与する増殖を基本的な属性として有する。生物には、原核生物、 真核生物 （植物、 動物など） などが包含される。 好ましくは、 本発明では、 生 物は、 植物であり得る。 本明細書では、 好ましくは、 そのような植物体は稳性 であり得る。 より好ましくは、 そのような植物体は、 種子を生産し得る。
本発明の遺伝子構築物、 因子 （a g e n t )、 組成物および方法は、 単子葉植 物だけでなく双子葉植物および動物を含む他の生物において機能することが企 図される。 本明細書において、 「トランスジエニック」 とは、 特定の遺伝子がある生物に 組み込むことまたは組み込まれた生物 （例えば、 植物 （イネなど） を含む） を レヽう。
本明細書では、 植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行う ことができる。 植物の栽培方法は、 例えば、 モデル植物の実験プロトコ一ルー イネ ·シロイヌナズナ編一」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ 4 ；イネの栽 培法 （奥野員敏） p p. 28-32, およぴァラビドプシスの栽培法 （丹羽康 夫） p p. 33-40 (監修 島本功、 岡田清孝） に例示されており、 当業者 であれば容易に実施することができることから本明細書では詳述する必要はな い。 例えば、 シロイヌナズナの栽培は土耕、 ロックウール耕、 水耕いずれでも 行うことができる。 白色蛍光灯 （6000ルクス程度） の下、 恒明条件で栽培 すれば播種後 4週間程度で最初の花が咲き、 開花後 1 6日程度で種子が完熟す る。 1さやで 40〜50粒の種子が得られ、 播種後 2〜 3ヶ月で枯死するまで の間に 10000粒程度の種子が得られる。 種子の休眠期間は短く、 完熟種子 は 1週間程度乾燥させれば吸水後 2〜 3日で発芽する。 ただし、 吸水 ·播種後 2〜4日間 4°Cで低温処理を行うと発芽が斉一化される。 イネの栽培は主に土 耕で行い、 10000ルクス以上の光条件下で生育させる。 播種後 40日程度 以後に短日条件とすることで出穂が誘導され、 出穂誘導後 30日程度で開花し、 開花後 40日程度で完熟種子が得られる。
植物細胞、 植物組織および植物体の培養、 分化および再生のためには、 当該 分野で公知の手法おょぴ培地が用いられる。 このような培地には、 例えば、 M u r a s h i g e -S k o o g (MS) 培地、 G aMb o r g B 5 (B) 培 地、 Wh i t e培地、 N i t s c h&N i t s c h (N i t s c h) 培地など が含まれるが、 これらに限定されるわけではない。 これらの培地は、 通常、 植 物生長調節物質 （植物ホルモン） などが適当量添加されて用いられる。
本明細書において、 植物の場合、 その植物を 「再分化」 するとは、 個体の一 部分から個体全体が復元される現象を意味する。 例えば、 再分化により、 細胞 (葉、 根など） のような組織片から器官または植物体が形成される。
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。 そ のような方法としては、 Ro g e r s e t a l ., Me t h o d s i n En z ymo l o g y 1 18 : 627— 640 (1986) ;Ta b a t a e t a 1., P l a t Ce l l Phy s i o l ., 28 ： 73-82 (1 987) ; Sh aw, P l a n t Mo l e c u l a r B i o 1 o g y： A p r a c t i c a l a p p r o a c h. I R L r e s s ( 1988 ) ； S h imamo t o e t a 1. , Na t u r e 338 : 274 (1989) ; Ma l i g a e t a 1., Me t h o d s i n P l a n t Mo l e c u 1 a r B i o l o g y : A l a b o r a t o r y c o u r s e. C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s (1995) などに記載されるものが挙げられるがそれらに限定されない。 従 つて、 当業者は、 上記周知方法を目的とするトランスジヱニック植物に応じて 適宜使用して、 再分化させることができる。 このようにして得られたトランス ジヱニック植物には、 目的の遺伝子が導入されており、 そのような遺伝子の導 入は、 ノーザンプロット、 ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載さ れる方法または他の周知慣用技術を用 、て確認することができる。
本発明による貯蔵タンパク質などの発現調節の解析は、 DN Aアレイを用い た遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイについては、 （秀潤社編、 細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PC R法」）に広く概説されている。 また、 DNAアレイを用いた植物の解析についても最近行われるようになって いる （S c h e n k PMら （2000) P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . (USA) 97 ： 1 1655- 1 1660)o
DNAアレイ技術において利用される微細加工については、 例えば、 Cam p b e 1 1 , S. A. (1996). Th e S c i e n c e a n d En g i n e e r i n g o f Mi c r o e l e c t r o n i c F a b r i c a t i o n, Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s ! Z a u t, P. V. (1 996). M i c r om i c r o a r r a y F a b r i c a t i o n ： a P r a c t i c a l Gu i d e t o S em i c o n d u c t o r P r o c e s s i n g, S em i c o n du c t o r S e r v i c e s ; M a d o u, M. J . (1997). Fun d ame n t a l s o f Mi c r o f a b r i c a t i o n, CRC 1 5 P r e s s ； Ra i— Ch o u d u r y, P. (1997). Ha n d b o o k o f Mi c r o l i t h o g r a p h y , M i c r oma c i n i n g, &M i c r o f a b r i c a t i o n : M i c r o l i t h o g r a p h yなどに記載されており、 これら は本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本発明による貯蔵タンパク質遺伝子およびその下流遺伝子などの発現の調節 はまた、 ディファレンシャルディスプレイ （d i f f e r e n t i a l d i s p l a y) 技術を用いた遺伝子解析でも解析することができる。 '
本明細書において 「ディファレンシャノレディスプレイ （技術)」 とは、 発現変 動する遺伝子を検出または同定するための方法である。 この方法では、 2っ以 上のサンプルから c DN Aをそれぞれ作製し、 任意のプライマーセットを用い て PC Rにより増幅し、 その後、 生成された複数の PC R産物をゲル電気泳動 により分離し、 パターン化した後、 各バンドの相対的なシグナル強度変化をも とに、 発現変動遺伝子がクロ一ニングされる。
本努明では、 本発明の開示をもとに、 コンピュータモデリングによる薬物が 提供されることも企図される。
本発明は、 他の実施形態において、 本発明のアンチセンス構築物に対する調 節活性についての有効性のスクリ一ユングの道具として、 コンピュータによる 定量的構造活性相関 （q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c t i v i t y r e 1 a t i o n s h i D =Q S AR) モデル化技術を使用し て得られる化合物を包含する。 ここで、 コンピューター技術は、 いくつかのコ ンピュータによって作成した基質铸型、 ファーマコフォア、 ならびに本発明の 活性部位の相同モデルの作製などを包含する。 一般に、 インビトロで得られた データから、 ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化するこ とに対する方法は、 最近 CATALYST"™ファーマコフォア法 （Ek i n s e t a l .、 Ph a rma c o g e n e t i c s, 9 : 477〜 489, 19 99 ； E k i n s e t a l .、 J. Ph a rma c o l . &Exp. Th e r .， 2.88 : 21〜29， 1999 ; Ek i n s e t a l .、 J. P h a rma c o l . & Ex p. Th e r . , 290 : 429〜 438， 1999 ; Ek i n s e t a l .、 J. Ph a rma c o l . & E . T h e r . , 291 : 424〜433， 1999) および比較分子電界分析 （c omp a r a t l v e mo l e c u l a r f i e l d a n a l y s i s ； CoMF A) (J o n e s e t a 1. ^ D r u g Me t a b o l i sm. & D i s p o s i t i o n, 24 : 1〜6， 1996) などを使用して示されている。 本発明において、 コンピュータモデリングは、 分子モデル化ソフトウェア （例 えば、 CATALYSTTM —ジョン 4 (Mo 1 e c u 1 a r S i mu l a t i o n s, I n c., S a n D i e g o, C A) など） を使用して行われ得 る。
他の局面において、 本発明は、 本発明のアンチセンス構築物を含む組成物を 提供する。 そのような組成物は、 農業用組成物であり得る。 そのような農業用 組成物は、 日本の農林水産省または他の国における監督官庁が規定した規則に のっとった形式で提供される。 そのような農業用組成物はまた、 倫理的な問題 も解決した形で提供される。
本発明が農業用組成物として処方される場合、 そのような組成物には、 農学 的に受容可能なキャリアが含有され得る。 そのようなキャリアとしては、 当該 分野において公知の任意の物質が挙げられる。 そのような適切な農学的に受容可能な因子としては、 以下が挙げられるがそ れらに限定されない：抗酸化剤、 保存剤、 着色料、 風味料、 希釈剤、 乳化剤、 懸濁化剤、 溶媒、 フィラー、 増量剤、 緩衝剤、 送達ビヒクル、 希釈剤、 賦形剤 および/または農学的アジュパント。 代表的には、 本発明の農薬組成物は、 本 発明の因子を、 1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、 賦形剤または希釈剤 とともに組成物の形態で投与され得る。 農薬組成物の場合は、 そのようなキヤ リアは農薬投与に適切な水などであり得る。
例示の適切なキャリアとしては、 中性緩衝化生理食塩水、 または血清アルブ ミンと混合された生理食塩水が挙げられる。 好ましくは、 その生成物は、 適切 な賦形剤 （例えば、 スクロース） を用いて凍結乾燥剤として処方される。 他の 標準的なキャリア、 希釈剤およぴ賦形剤は所望に応じて含まれ得る。 他の例示 的な組成物は、 p H 7 . 0 - 8 . 5の T r i s緩衝剤または p H 4 . 0— 5 .
5の酢酸緩衝剤を含み、 これらは、 さらに、 ソルビトールまたはその適切な代 替物を含み得る。 その溶液の p Hはまた、 種々の p Hにおいて、 本発明の因子 の相対的溶解度に基づいて選択されるべきである。
組成物における溶媒は、 水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。 さ らに、 そのビヒクルは、 処方物の、 p H、 容量ォスモル濃度、 粘性、 明澄性、 色、 滅菌性、 安定性、 等張性、 崩壊速度、 または臭いを改変または維持するた めの他の処方物材料を含み得る。 同様に、 本発明の組成物は、 有効成分の放出 速度を改変または維持するため、 または有効成分の吸収もしくは透過を促進す るための他の処方物材料を含み得る。 本発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。 以下に提供される実施形態は、 本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、 本発明の範囲は以下の 記載に限定されるべきでないことが理解される。 従って、 当業者は、 本明細書 中の記载を参酌して、 本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明 らかである。
1つの局面において、 本発明は、 プロラミンポリペプチドをコードする核酸 配列のアンチセンス分子を提供する。 詳細には、 本発明は、 プロラミンポリべ プチドをコードする核酸配列のに相捕的な少なくとも 1 0ヌクレオチド長、 よ り好ましくは 1 5ヌクレオチド長の連続する核酸配列または該核酸配列に対し て少なくとも約 7 0 %、 好ましくは少なくとも約 8 0 %、 さらに好ましくは約 9 0 %相同な核酸配列を含む、 核酸分子を提供する。 そのような配列は、 1つ 以上のヌクレオチドの置換、 付加または欠失を含んでいてもよい。 このような 改変型配列は、 アンチセンス活性を発揮できる限り、 これらの数値よりも低い ものであってもよい。 そのような核酸分子を提供することによって、 植物の種 子において貯蔵する貯蔵タンパク質を含む、 多重遺伝子族であるプロラミン遺 伝子群全体の発現を抑制し、 かつ他の貯蔵タンパク質の発現に中立であったこ とにより、 種子タンパク質の低減化を実現し得ることが予想外に発見された。 理論に束縛されることを希望しないが、 一般には、 ある種子タンパク質の発現 が減少した場合には、 ホメォスタシスの維持機構により他のタンパク質の発現 が増大してその分を補うことで、 種子タンパク質総量は変化しないというのが 定説であり、 事実グルテリン発現が抑制された系統では、 その分がプロラミン に配分されて発現が著しく増大し、 結果として種子タンパク質総量はほとんど 変化していないことが確かめられている。 しかし、 本発明においては、 低グル テリンである系統でプロラミンの発現抑制を行っても、 やはり低グルテリンの 特徴は保持され、 かつグロプリンが著しく増大することもなかったことから、 予想外の驚くべき成果と言える。
別の実施形態において、 アンチセンス分子は、 単純に逆向きの部分配列を持 つものであってもよいが、 R NA iの現象を利用して同一の逆向きの部分配列 を 2つ利用したヘアピン様 R N A構造を用いてもよい。 このような配列は、 完 全同一であってもよく、 一部が一致しないものであってもよい。 好ましくは、 アンチセンス分子の発現を促進するために、 1 0 k D aプロラミンプロモータ 一、 1 3 k D aプロラミンプロモーター、 グルテリン B 1プロモーター、 ュビ キチンプロモーターなどが使用される。 また、 アンチセンス分子の発現の制御 を行うために、 N o sターミネータ一、 1 3 k D aプロラミンターミネータ一、 1 0 k D aプロラミンターミネータ一などが使用され得る。
上記核酸分子は、 1つの実施形態において、 アンチセンス活性を有する。 具 体的には、 そのようなアンチセンス活性は、 例えば、 プロラミンの mRNAの 発現量の減少、 プロラミンポリぺプチドの発現量の減少などが挙げられるがそ れらに限定されない。 本発明では、 本発明の核酸分子を植物に提供することに よって、 プロラミンのポリペプチドの発現量が減ったのみならず、 種子中に発 現されるタンパク質の量も減少することが予想外に発見された。 そのような事 象は従来見出されておらず、 しかも示唆さえされていなかったことであり、 本 発明は顕著な効果を奏するといえる。
1つの実施形態において、 上記プロラミンポリペプチドをコードする核酸配 列に相捕的な少なくとも 1 5ヌクレオチド長の連続的な核酸配列を含む。 より 好ましくは、 そのような核酸配列は、 少なくとも 2 0ヌクレオチド長の連続的 な、 少なくとも 2 5ヌクレオチド長の連続的な、 少なくとも 3 0ヌクレオチド 長の連続的な、 少なくとも 4 0ヌクレオチド長の連続的な、 少なくとも 5 0ヌ クレオチド長の連続的な、 少なくとも 6 0ヌクレオチド長の連続的な、 少なく とも 7 0ヌクレオチド長の連続的な、 少なくとも 8 0ヌクレオチド長の連続的 な、 少なくとも 9 0ヌクレオチド長の連続的な、 少なくとも 1 0 0ヌクレオチ ド長の連続的な、 核酸配列であってもよい。 より好ましくは、 そのような核酸 配列は、 プロラミンポリぺプチドをコ一ドする全長配列の相捕配列を含むであ つてもよい。 アンチセンス活性を発揮するには、 通常 1 5ヌクレオチド長の連 続的な相補核酸配列を提供することで十分であり得るが、 より確実にアンチセ ンス活性を発揮させるためには、 より長い配列、 例えば、 少なくとも 20ヌク レオチド長の、 または少なくとも 30ヌクレオチド長の連続的な核酸配列を提 供することが好ましい。
本発明の核酸分子に含まれる上記核酸配列は、 別の実施形態において、 プロ ラミンポリべプチドをコ一ドする核酸配列の 5， 末端に相捕的な核酸配列であ り得る。 プロラミンは、 5'末端に相同性の高い配列が多いからである。 また、 そのような 5' 末端の配列に相補的な核酸配列を提供することによって、 遺伝 子の転写および Zまたは翻訳が反応初期から阻害されることから、 そうでない 配列を提供するよりも効率よく遺伝子の発現を阻害することができるが、 本発 明では、 アンチセンス効果を有する限り、 目的とするポリペプチドをコードす る核酸配列の 5 ' 末端の配列に相補的な核酸配列以外の配列を使用してもよレ、。 本発明の核酸分子に含まれる上記核酸配列は、 プロラミンに由来するもので あればどのようなものでも使用することができるが、 イネ 13 kD aプロラミ ンまたはそれに対応する他の種のオルソログに由来するものを使用することが 好ましい。 本発明において使用されるプロラミンは、 イネのものであり得る。 好ましくは、 上記プロラミンは、 ジャポニカ種のイネのものであり得る。 さら により好ましくは、 上記プロラミンは、 ジャポニカ種のイネ 13 kD aプロラ ミンである。 最も好ましくは、 上記プロラミンは RM9または RM1のプロラ ミンである。 なお、 13 kD aプロラミンが好ましい理由としては、 イネ種子 に含まれるプロラミンのうち、 13 kD aプロラミンに相当するタンパク質の 含量が最も多いため、 発現を低減できた場合の効果がより高いからである。 別の好ましい実施形態において、 本発明の核酸分子は、
( a ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43および 45からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列またはそのフラグ メント配列を有するポリヌクレオチド； ( b ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 2 2、 24、 26、 28、 30、 3 2、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44お ょぴ 46からなる群より選択される配列番号に示されるァミノ配列を有するポ リぺプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
( c ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 2
2、 24、 26、 28、 3 0、 3 2、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44お よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が、 置換、 付加および欠失からなる群より選択され る少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、 生物学的活性 を有する改変体ポリペプチドをコードする、 ポリヌクレオチド；
( d ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 2 7、 2 9、 3 1、 3 3、 3 5、 3 7、 3 9、 4 1、 43および 45からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列からなる DNAの 対立遺伝子変異体である、 ポリヌクレオチド；
( e ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 2
2、 24、 26、 28、 3 0、 3 2、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44お よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列からなる ポリぺプチドの種相同体またはオルソログをコードする、 ポリヌクレオチド； . (f ) (a) 〜 （e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント 条件下でハイブリダィズし、 かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコード するポリヌクレオチド；または
(g) (a) 〜 （e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列 に対する同一性が少なくとも 70 %である塩基配列からなり、 かつ生物学的活 性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、
に相捕的な、 少なくとも 1 5ヌクレオチド長の連続する核酸配列を含み得る。 より好ましくは、 この核酸配列は、 少なくとも 20ヌクレオチド長、 より好ま しくは、 少なくとも 3 0ヌクレオチド長、 最も好ましくは少なくとも 5 Qヌク レオチド長の連続する相補部分を含み得る。
好ましい実施形態では、 上記配列は、 配列番号 1または 3、 ならびに配列番 号 2または 4であり得る （それぞれ RM 9および RM 1に対応する）。
別の局面において、 本発明は、 プロラミンポリペプチドをコードする核酸配 列に由来する少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列また は該相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対 して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む、 核酸分子を提供する。 このよ うな配列は.、 センス配列であり、 R NA iの一部を担う因子としても有用であ る。 'そのような配列は、 1 5ヌクレオチド長もの短さで発現抑制効果を発揮す ることができる。
別の局面において、 本発明は、 （A) プロラミンポリペプチドをコードする核 酸配列に由来する少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列 または該相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列 に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 A；および （B ) プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な少なくとも 1 5の連 続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相補的な少なくとも 1 5の連 続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核 酸配列を含む核酸配列 B、 を含む、 核酸分子を提供する。 このような核酸分子 は、 本明細書では、 R N A i核酸分子とも称する。 ここで、 核酸配列 Aおよび 核酸配列 Bは、 それぞれセンス配列およびアンチセンス配列と呼ぶことができ る。 このような二種類の配列を有する核酸分子は、 R NA iを引き起こす因子 として作用し、 その結果、 ターゲットとなるプロラミンの発現を全般的に抑制 し、 ひいては、 種子タンパク質の発現量を減少させた。 このようなことは、 他 の種子タンパク質では起こらなかったことから、 プロラミンの発現を抑えるこ とによる効果は予想外であるということができる。 なぜなら、 従来されている グルテリンでは、 発現を抑えたとしても他の種子タンパク質または他のタンパ ク質の種子中での発現が増加し、 総タンパク質量としては変化がないからであ る。 従って、 本発明がもたらす効果は、 当業者に予想外の効果であったといえ る。本発明の RNA i核酸分子は、アンチセンスおよびセンスにあたる配列が、 ターゲットとなるプロラミン配列に対して 1 5 b ρ、 好ましくは 2 3 b pほど の短さであっても効果が奏される。
好ましい実施形態では、 本発明の R N A i核酸分子に含まれる核酸配列 Aと 核酸配列 Bとは、 互いに実質的に相補的である部分を含む。 このように相補的 である部分を Aと Bとが含むことによって、 R NA iの効果が発揮されやすく なるからである。 より好ましくは、 この核酸配列 Aと核酸配列 Bとは、 互いに 実質的に相捕的であり、 さらに好ましくは完全に相補的である。 理論に束縛さ れることは望まないが、 R NA iの効果は相補性が実質的に完全であることに よってより高まるからである。
1つの実施形態において、 本発明の R NA i核酸分子は、 スぺーサー配列を 含み、 好ましくは、 本発明の R NA i核酸分子において、 核酸配列 Aと核酸配 列 Bとの間には、 スぺーサー配列が揷入されていることが好ましい。 理論に束 縛されることは望まないが、 R NA iの効果はスぺーサー配列の適切な配置に よってより高まるからである。
好ましい実施形態では、 このスぺーサー配列は、 イントロン配列であること が好ましい。 イントロン配列としては、 例えば、 γグロビン、 βァクチンのィ ントロン配列が挙げられるがそれらに限定されない。 理論に束縛されることを 好まないが、 植物においては遺伝子のコード領域中にイントロンを挿入するこ とにで発現が増強されることが知られており、 またプレ m R N Αのイントロン 部分が切り出される際に、 立体構造的に 2本鎖 R N Aの形成が促進されると考 えられているからである。
別の局面において、 本癸明は、 プロラミンポリペプチドをコードする遺伝子 配列に対して RNA iを引き起こす、 因子を提供する。 本発明のプロラミンに 対する RNA iは、 他の RNAiに比較して、 種子タンパク質の顕著な減少お よび/または外来タンパク質の顕著な強制発現といった効果を奏する。 RNA i因子としては、 s i RNA、 s h RNAといった形式も可能であるが、 本発 明では、 核酸構築物中に相補鎖が含まれている形式が好ましい。 理論に束縛さ れることを望まないが、 s i RNA、 s h RNAよりも核酸構築物中に相補鎖 を含んでいる形式のほうが、 植物においては汎用的とされているからである。 別の局面において、 本発明は、 プロラミンポリべプチ'ドをコードする核酸配 列に相補的な少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列また は該相捕的な少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対 して少なくとも約 70%相同な核酸配列 Bを含む、 核酸カセットを提供する。 このような核酸カセットは、 アンチセンスカセットとして利用可能である。
1つの好ましい実施形態において、 本発明の核酸カセットは、 外来遺伝子を コードする核酸配列をさらに含む。
外来遺伝子は、 本発明の核酸カセットを用いて植物などを改変する場合にプ ロラミンまたは種子タンパク質に代わって発現されることが企図される遺伝子 であれば、 どのようなものであっても使用することができる。
そのような外来遺伝子としては、 例えば、 マーカー （蛍光物質、 燐光物質な ど）、医薬活性のあるペプチド（例えば、サイト力イン類（インターロイキン類、 ケモカイン類、 GM— CSF、 M— CSF、 G— CSF、 mu 1 t i—CSF (I L一 3)、 EPOs L I F、 SCFのような造血因子、 TNF、 インタ一フ エロン類、 PDGF、 EGF、 FGF、 HGF、 VEGFなど）、 ホルモン類（ィ ンスリン、 成長ホルモン、 甲状腺ホルモンなど)）、 ワクチン抗原、 血液製剤、 農業生産上有用なペプチド（例えば抗細菌、防虫、抗菌タンパク質)、生理作用 · 薬理作用を持つ二次代謝産物を合成する酵素、 酵素反応を調節するインヒビタ 一、 レセプター、 レセプターリガンド、 人工タンパク質、 栄養学的に意義のあ る物質 （例えば、 カゼイン、 マメ類のアルブミン、 グロプリン、 ビタミン類. 糖 ·脂質の合成酵素）、 加工特性に関与するタンパク質 （例えば、 コムギグルテ ニン （製パン）、 ダイズグロプリン群 （豆腐）、 ミルクカゼイン群 （チーズ） な ど、 また食品の嗜好性や機能性を強化するタンパク質 （例えばシクロデキス ト リン、 オリゴ糖、 γァミノ酢酸などの特殊な糖 ·アミノ酸類の合成酵素群、 外 観を良くする色素合成酵素群、 呈味タンパク質群および味覚成分合成に関与す るタンパク質群、 または他の人工タンパク質など） があげられるがこれらに限 定されない。
好ましい実施形態において、 本発明の核酸カセットは、 プロラミンポリぺプ チドをコードする核酸配列に由来する少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド 長を有する核酸配列または該相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド 長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配 列 Αをさらに含む。 このような 2種類の核酸配列 Aおよぴ核酸配列 Bを有する ことによって、 本発明の核酸カセットは、 R NA i作用を発揮することができ る。
本発明の核酸カセットは、 核酸配列 Aおよび核酸配列 Bに加えて、 スぺーサ 一配列を含んでいてもよい。 理論に束縛きれることを望まないが、 スぺーサー 配列を含ませることによって、 R NA i作用は増強されるからである。 そのよ うなスぺーサー配列の選定は、 当業者が、 適宜選択することができるが、 好ま しくは、 イントロン配列を用いることができる。 このようなスぺーサー配列、 好ましくはイントロン配列は、 核酸配列 Aと、 核酸配列 Bとの間に含まれるこ とが有利である。 理論に束縛されることを望まないが、 イントロン配列の適切 な配置は、 細胞内でプレ mR NAのイントロン部分が切り出される際に、 R N A i作用をもたらす分子構造へより効率的に変換されると考えられているから である。
別の好ましい実施形態において、 本発明の核酸カセットは、 シグナル配列を 含んでいてもよい。 このようなシグナル配列は、外来遺伝子の上流に配置され、 好ましくはインフレームに配置される。 このような配置は、 さらに好ましくは 外来遺伝子の翻訳開始部位の直前であることが有利である。 シグナル配列を含 ませることによって、 所望の部位での外来遺伝子の発現をより効率的に実現す ることができるからである。
好ましい実施形態において、 本発明において用いられるシグナル配列は、 貯 蔵タンパク質のシグナル配列であることが有利である。 貯蔵タンパク質は、 シ グナル配列の効果により小胞体內に輸送され、 そこから適宜プロティンポディ に運ばれて安定かつ大量に集積する。 よってこのプロセスを模倣することによ り、 貯蔵タンパク質シグナル配列の下流に配置される外来遺伝子がコードする タンパク質は、 種子により効率的に集積されるからである。
より好ましくは、 このシグナル配列は、 プロラミンシグナル配列であること が有利である。 本明細書の実施例を通して、 外来遺伝子の発現にはプロラミン プロモーターを用いることがより効果的であることがわかったため、 それと組 み合わせて用いるにはプロラミンシグナル配列がよりふさわしい。 プロラミン シグナノレ配列としては、例えば l O k D aプロラミン、 1 3 k D aプロラミン、 1 6 k D aプロラミンの.シグナル配列があげられるが、 それらに限定されない。 このようなシグナル配列の配置は、 当該分野において周知の技術を用いて実 現することができる。 例えば、 シグナル配列の配列が公知の場合には、 そのよ うな配列が含まれるように P C R反応を行ったり、 すでにそのシグナル配列を 含む核酸分子を有している場合には、 目的となる配列を切り出し、 所望の位置 に接続することによって所望の位置への配置を行うことができることが理解さ れる。
別の実施形態において、 本発明の核酸ベクターは、 プロモーター配列をさら に含む。 このようなプロモーター配列を有することによって、 本発明のプロラ ミン抑制効果をより効率よくすることができ、 および/または外来遺伝子の発 現をより効率よくあるいは所望の特異性をもって実現することができる。 プロ モーターの配置もまた、 当該芬野において周知の技術を用いて当業者が任意に 行うことができる。
好ましくは、 プロモーター配列は、 外来遺伝子および前記核酸配列 Bの両方 に作動可能に連結される。 両方の遺伝子 （外来遺伝子おょぴアンチセンス遺伝 子） の発現を駆動するまたは誘導 ·増強することができるからである。 好まし くは、 外来遺伝子および核酸配列 Bの両方に、 独立して別個のプロモーター配 列が作動可能に連結されることが有利である。 このような独立の別個のプロモ 一ターを含ませることによって、 別々の発現制御を行うことができるからであ る。
より好ましい実施形態では、 本発明の核酸カセットにおいて使用される外来 遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列 （プロモーター配列 A) と、 核酸配列 Bに作動可能に連結されるプロモータ一配列 （プロモータ一配列 B ) とは互いに異なることが有利である。 このような構成にすることによって、 1 つのプロモーターの遺伝子発現能力が、 プロラミンの発現抑制と外来遺伝子の 高発現に分散されて効率が落ちるリスクを回避することができる。 さらに、 プ ロラミンの発現制御を行いそれを確認した後に外来遺伝子の発現を駆動するこ とが可能になるなど、 制御のやり方のバリエーションを増やし、 より効率的な 外来遺伝子発現系を構築できるからである。
別の実施形態において、 本発明において用いられるプロモーター配列 Bは、 種子に発現されるプロモーター配列であり、 より好ましくは種子に高いレベル で発現されるプロモーター配列である。 発現レベルが高いプロモーターのほう 力 より効率的 '効果的にプロラミンの発現を抑制できると考えられる。 この ような種子で高いレベルで発現されるプロモーターとしては、 例えば貯蔵タン パク質群 （例えばグルテリン、 グロブリン、 プロラミン） プロモーターや、 細 胞の生命活動に必須な遺伝子 （ポリュビキチン、 ァクチンなど) プロモーター に由来する。 貯蔵タンパク質の 1種であるプロラミンの効率的な抑制を実現す るには、 プロラミン自身のプロモーターの利用は必須の条件ではなく、 上記の ような特定のプロモーターを用いることによつても達成できることが、 本発明 において初めて予想外に示されたからである。
より好ましい実施形態では、 本発明のプロモーター配列 Bは、 貯蔵タンパク 質プロモーターに由来し、 前記プロモーター配列 Aとは異なることがさらに有 利である。 理論に束縛されることを望まないが、 このような構成をとることに よって、 本発明の核酸カセットは、 外来遺伝子とプロラミン抑制を効率よく制 御することができ、 発現を最大にすることが可能となる。
本発明において用いられ得るプロモーター配列 Bとしては、 ポリュビキチン プロモーター、 2 6 k D aグロブリンプロモーター、 グノレテリン Aプロモータ 一、 グノレテリン: Bプロモーター、 1 6 k D aプロラミンプロモーター、 1 3 k D aプロラミンプロモーターおよび 1 0 k D aプロラミンプロモーターならび にこれらの改変体または融合物などが挙げられるがそれらに限定されない。 別の実施形態において、 本発明において用いられるプロモーター配列 Aは、 貯蔵タンパク質プロモーターに由来する。 貯蔵タンパク質プロモーターは発現 の特異性が種子に限定され、 かつ発現レベルは高い。 よって、 外来遺伝子に接 続されるプロモーターとして、 特定の貯蔵タンパク質プロモーター （例えば、 グルテリン、 グロブリン、 プロラミン） を用いることによって、 植物体の他の 部位に外来タンパク質が無駄に発現されてエネルギーを消耗させるリスクを回 避しつつ、 種子内で効率的かつ高度に発現させることができる。 さらには、 外 来遺伝子に接続されるプロモーターとしては、 抑制の標的となる貯蔵タンパク 質 （例えば 1 3 k D aプロラミン） と同じ種類の貯蔵タンパク質に由来するプ 口モーター （例えば、 配列番号 6 0 ) を使用することが好ましい。 理由として は、 発現抑制を打破するために標的となる貯蔵タンパク質の mRN Aレベルを 上昇させる場合があり、 その波及効果を外来遺伝子の発現に利用できるからで ある。 従ってプロモーター配列 Aは核酸配列 Bに天然に附随するプロモーター でありうる。 好ましくは、 プロモーターとしては、 13 kD aプロラミンない しは 10 kD aプロラミンに由来するプロモーターを用いることができる。 理 論に束縛されることを望まないが、 13 kD aプロラミンは多重遺伝子族であ るもののプロラミンの中で最も含有量が多いこと、 また低グルテリン系統など のタンパク質変異イネにおいて、最も顕著に発現が上昇する特徴がある。一方、 l O kDaプロラミンは単一遺伝子で電気泳動パターンで存在が確認できるほ ど、 定常状態での高い発現量が保証されており、 また低グルテリン系統などの タンパク質変異イネにおいて、発現が上昇する特徴がある。これらのこと力 ら、 いずれもプロモーター活性は非常に高いと考えられ、 より有用である。 13 k Daプロラミンと 10 kD aプロラミンのいずれのプロモーターが有利である かについては、 導入する原品種の特徴おょぴ発現させる外来遺伝子の特徴によ り判断するべきである。
本発明において用いられる外来遺伝子に接続されるプロモーター配列 Aとし ては、 26 Kグロブリンプロモーター、 ダルテリン Aプロモーター、 グルテリ ン Bプロモーター、 16 kD aプロラミンプロモーター、 l O kD aプロラミ ンプロモーターおよび 13 kD aプロラミンプロモーターなどが挙げられるが それらに限定されない。 好ましくは、 プロモーター配列 Aとして、 プロラミン プロモーター、 より好ましくは、 13 kD aプロラミンプロモーターないしは 10 kD aプロラミンプロモーターを用いることができる。
1つの実施形態において、 本発明の核酸カセットにおいて、 プロモーター配 列 Aは、 プロラミンプロモーターに由来し、 プロモーター配列 Bは、 該プロラ ミンプロモーター以外のプロモーターに由来する。 このような組み合わせの例 示としては、 13 kD aプロモーターと 10 kD aプロモーターとが挙げられ るがそれらに限定されない。
1つの好ましい実施形態において、 本発明の核酸カセットでは、 外来遺伝子 とプロモーター配列との間にィンフレームでシグナル配列を含む。
別の好ましい実施形態において、 本発明の核酸カセットは、 ターミネータ一 配列を含む。 ターミネータ一の適切な配置によって発現を適切に制御すること ができる。 ターミネータ一配列は、 1 0 k D aプロラミンのターミネータ一配 列であることが好ましい。 1 0 k D aプロラミンのターミネータ一配列は、 こ れまで利用された実績はなかったが、 様々なプロモーターとの組み合わせで遣 伝子発現制御に汎用的に利用できることが、 本発明により初めて示されたこと は格別の成果である。 植物 （イネ） 由来の配列で、 本発明を適用する主な対象 器官である種子に発現している遺伝子由来であることから、 パクテリア由来の N O Sターミネータ一よりもより好ましいと言える。
1つの実施形態において、 本発明の核酸カセットに含まれる外来遺伝子を含 み、 そしてこの外来遺伝子は、 核酸配列 Aおよび核酸配列 Bよりも上流に存在 することが好ましい。 理論に束縛されることを望まないが、 このような配置を 採ることによって、 プロラミンの抑制を確認した後に外来遺伝子の発現を行う ことができることなどの利点が考えられるがそれらに限定されない。
従って、 本発明において好ましい実施形態では、 本発明の核酸カセットは、 核酸配列 Aと核酸配列 Bとの間にスぺーサー配列、 好ましくはイントロン配列 を含むことが有利である。 R N A i効果が促進されるからである。
1つの局面において、 本発明は、 核酸カセットを製造するための方法を提供 する。 この方法は、 A) プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相捕 的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相捕 的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少な くとも約 7 0 %相同な核酸配列 Bと、 プロラミンポリべプチドをコ一ドする核 酸配列に由来する少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列 または該相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列 に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 Aと含むセットの 上流に作動可能にプロモーター配列 Bを有し、 外来遺伝子が該プロモーター配 列 Bよりも上流または下流 （好ましくは、 上流であるがそれに限定されない） に配置され、 該外来遺伝子には作動可能にプロモーター配列 Aが連結されてい る、 核酸カセットを提供する工程； B ) 該核酸カセットを用いて植物を形質転 換する工程；および C) 該形質転換された植物について、 プロラミンの発現 量が一部減少しているものを選択する工程、 を包含する。 .
このような製造法では、 プロラミンの発現量をより効率的に減少させる活性 を持つものを優先的に選択していることから、 本発明の核酸カセットの製造効 率と本発明を利用する利便性が格段に上がる。
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。 従って、 本発明のベクターは、 上述の核酸カセットを含むベクター形態として 提供され得る。
好ましくは、 このベクターは、 プロモーター配列などの調節配列 （エレメン ト） を含み得る。 調節配列としては、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーター、 転写終止配列、 翻訳終止配列、 転写起点、 イントロン配列などが挙げられるが それらに限定されない。 好ましくは、 このベクターは、 プロモーター活性を有 する配列をさらに含む。
このプロモーター活性を有する配列は、 好ましくは貯蔵タンパク質のプロモ 一ターであり得る。 貯蔵タンパク質のプロモーターであれば、 種子中での転写 促進活性が期待されるからである。 本発明では、 貯蔵タンパク質のタイプによ らず、 どの貯蔵タンパク質にプロモーター由来の配列であっても、 プロラミン のアンチセンス配列の活性発現に有用であることが判明した。 同時に、 プロラ ミンのプロモーター由来の配列は、 他の貯蔵タンパク質由来のものよりも、 ァ ンチセンス配列の活性発現により有用であることも示された。 このようなこと は本発明において初めて証明された格別の成果である。
より好ましくは、 上記プロモーター活性を有する配列は、 作動可能に連結さ れるアンチセンス配列が由来する構造遺伝子のプロモーターであり得る。
好ましい実施形態では、 プロモーターは、 アンチセンス配列が由来する植物 と同じ植物種起源であり得る。 同じ植物種起源のものを使用する方が、 より良 好に機能することが期待されるからである。
本発明のベクターは、 好ましくは、 ターミネータ一をさらに含み得る。 本発 明のベクターは別の実施形態において、 選択マーカーをさらに含み得る。 この ような選択マーカーは、 どのようなものでもよいが、 簡便を考えると、 抗生物 質 Hi生付与遺伝子 （例えば、 ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼなど） が好ましい。 選択マーカーを含むベクターを使用する場合、 本発明のアンチセ ンス構築物を用いて形質転換した植物細胞を選択することが極めて容易になる が、 この選択マ一力一は必ずしも必要というわけではない。
別の実施形態において、 本発明のベクターは、 アンチセンス配列とは異なる 外来遺伝子 (例えば、 GFP遺伝子のようなマーカー遺伝子または有用遺伝子） をコードする配列を含み得る。 このような外来遺伝子は、 構造遺伝子であり得 る。 このような外来遺伝子は、 大量に発現することが望まれるタンパク質であ り得る。 そのようなタンパク質としては、例えば、 医薬活性のあるペプチド （例 えば、 サイトカイン類 （インターロイキン類、 ケモカイン類、 顆粒球マクロフ ァージコロニ一刺激因子 (GM- CSF)、マクロファージコロニー刺激因子（M — C S F)、 顆粒球コロニー刺激因子 （G— C S F)、 mu 1 t i _CSF (I L— 3)、 エリスロポエチン （E PO)、 白血病抑制因子 （L I F)、 c -k i t リガンド （SCF) のような造血因子、 腫瘍壌死因子 （TNF)、 インタ一フエ ロン類、 血小板由来増殖因子 （PDGF)、 上皮増殖因子 （EGF)、 線維芽細 胞増殖因子 （FGF)、 肝実質細胞増殖因子 （HGF)、 血管内皮増殖因子 （V EGF)など）、ホルモン類（インスリン、成長ホルモン、甲状腺ホルモンなど））、 ワクチン抗原、血液製剤、農業生産上有用なペプチド、例えば抗菌タンパク質、 生理作用 ·薬理作用を持つ二次代霞す産物を合成する様々な酵素や加水分解酵素、 酵素反応を調節するインヒビター、 血圧効果作用を持つとされるダイズグリシ ニン、 あるいは消化管内で酵素分解を受けることで生理活性べプチドが切り出 されるようにデザインされた人工タンパク質といったものがあげられるがそれ らに限定されない。 また栄養学的に意義のある物質としては、 カゼイン、 マメ 類のアルブミンやグロブリン、 あるいはビタミン類.糖.脂質の合成酵素など があげられるがそれらに限定されない。 さらに様々な加工食品の原料として加 ェ特性に関与するタンパク質として、 例えばコムギグルテニン （製パン）、 ダイ ズグロブリン群 （豆腐）、 ミルクカゼイン群 （チーズ） など、 また食品の嗜好性 や機能性を強化するタンパク質、 例えばシクロデキストリンやオリゴ糖、 τ/ァ ミノ酢酸などの特殊な糖 ·アミノ酸類の合成酵素群、 外観を良くする色素合成 酵素や味覚成分合成に関与するタンパク質群、 あるいは、 消化管内で酵素消化 を受けることにより、 生理作用をもつペプチド （例えば血圧効果作用をもつ、 アンジォテンシン変換酵素阻害べプチドなど） が切り出されるようにデザィン された人工タンパク質などがあげられるがこれらに限定されない。
このような外来遺伝子は、 プロモーターに作動可能に連結されていることが 好ましい。 この場合、 そのようなプロモーターは、 どのようなものでも使用す ることができるが、 好ましくは、 貯蔵タンパク質に由来するものが好ましい。 より好ましくは、 そのようなプロモーターとしては、 プロラミンに由来するも の （l O k D aプロラミンプロモーター、 1 3 k D aプロラミンプロモーター、 1 6 k D aプロラミンプロモーターなど） が用いられる。
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含む植物細胞を提供する。 ， あるいは、 本発明はまた、 本発明のベクターで形質転換した植物細胞を提供す る。 このような植物細胞は、 本発明のベクターで一過的に形質導入されていて もよく、 恒久的に形質転換されていてもよい。 本発明の植物細胞はまた、 本発 明のアンチセンス構築物とは異なる外来遺伝子をコードする核酸分子を含み得 る。 そのような外来遺伝子の例示は、 上述したとおりである。 好ましくは、 本発明において利用されるプロラミンが由来する植物種と、 本 発明の植物細胞の植物種とは、 同種であっても異種であってもよい。 好ましく は、 両者の植物種は同種であり得る。 この両者の植物の品種は、 同一品種であ つても異なる品種であってもよい。 好ましくは、 両者の植物品種は、 同一品種 であり得る。 好ましくは、 本発明のプロラミンが由来する植物種おょぴ Zまた は植物細胞の植物種は、 イネであり得る。 より好ましくは本発明のプロラミン が由来する植物種および/または植物細胞の植物種は、 ジャポニカ種またはィ ンデイカ種のイネであり得る。
好ましい実施形態において、 本発明の植物細胞には、 本発明の核酸分子は、 両側の染色体に導入され得るが、 一対のみに導; されたものもまた有用であり 得る。
別の局面において、本発明は、本努明の植物細胞を含む植物組織を提供する。 本発明はまた、 本発明の核酸分子を含む、 植物組織も提供する。 そのような植 物細胞または核酸分子は、 上述の好ましい形態であり得る。
したがって、 本発明は、 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む植 物組織 （または生体の部分、 部位など） を提供する。 そのような植物の組織と しては、 例えば、 種子またはそれに由来する部分が挙げられる。 従って、 プロ ティンボディを形成しうる組織であればどのような組織でも使用され得る。 好 ましくは、 本発明の糸且織は、 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質 されたものであり得る。 本発明の組織は、 本発明のポリヌクレオチドまたはべ クタ一で一過的に形質転換されていても恒常的に形質転換されていてもよい。 そのような形質転換によって導入された本発明のポリヌクレオチドは、 構成的 にまたは特異的に発現され得る。
別の局面において、 本発明は、 本発明の核酸分子を含む植物体を提供する。 このような植物体を提供することによって、 低タンパク質含有種子を生産する ■ ことができる。 この植物体は、 好ましくはイネであり得る。 この植物体は、 本 発明のアンチセンス構築物とは異なる外来遺伝子をコードする核酸分子をさら に含み得る。 そのような植物は、 本明細書においてトランスジエニック植物と もいい、 本発明の植物細胞または組織から当該分野において周知の技術を用い て再分化 （再生） させることによって得ることができる。
一旦所望のポリヌクレオチド （例えば、 本発明のポリヌクレオチドまたはべ クタ一） で形質転換された細胞 （例えば、 植物細胞） が得られたなら、 一定の 割合以上でそのような形質転換細胞から所望のポリヌクレオチドを含むトラン スジェニック生物 （例えば、 植物） が得られることは、 当該分野において周知 である。 従って、 形質転換することができる生物の細胞が利用可能な生物であ れば、 どのような生物でも本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むト ランスジヱニック生物を生産することができる。
そのようなトランスジエニック生物を作製する方法は、 当該分野において周 知である。 本発明の生物が植物である場合、 トランスジヱニック植物は、 例え ば、 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された細胞を増殖さ せ、 組織または器官とし、 それを再分化させることによって植物体とすること ができる。 そのような組織または器官は、 どのようなものでもよく、 例えば、 カルス、 根、 茎などが挙げられるがそれらに限定されない。 植物はどのような 器官であっても、 基本的に全能性を有していることから、 本発明のポリヌクレ ォチドまたはべクターを含む器官または組織であれば、 どのような組織または 器官であっても植物体の再分化に利用することができる。 本発明が木本植物の 場合、 本明細書において記載されるもののようなプロトコルを利用してトラン スジエニック植物を作出することができる。
本発明の植物体において、 プロラミンが由来する植物の種と、 その植物体の 種とは同種であっても異種であってもよい。 好ましくは、 その両方の種は同種 であり得る。 この場合、 その両方の種は、 同一品種であっても異なる品種であ つてもよい。 好ましくは、 両方の種は、 同一品種であり得る。 好ましい実施形態では、 本発明の植物体の植物種および zまたはプロラミン が由来する植物種は、イネであり得る。 より好ましくは、 この両方の植物種は、 ジャポニカ種のイネであり得る。 このイネは、 好ましくは、 L G C— 1であつ てもよい。
好ましい実施形態において、 本発明の植物体には、 本発明の核酸分子は、 両 側の染色体に導入され得るが、 一対のみに導入されたものもまた有用であり得 る。
別の局面において、 本発明は、 本発明の植物体から生産された種子を提供す る。 この場合、 本発明の植物体が本発明のアンチセンス構築物を含む場合、 そ の種子におけるタンパク質含有量（特に、プロラミン） は顕著に低減している。 したがって、 そのような種子を食用に用いる場合、 低タンパク質が好ましい用 途において特に本努明の種子が有用であることが理解される。 本発明の植物体 がさらに外来遺伝子をコードする核酸分子を含む場合、 そのような外来遺伝子 がコードするポリぺプチドの発現が顕著であることが認められる。 したがって、 本発明の種子は、 有用タンパク質の生産装置 (バイオリアクター) として利用 され得る。
本発明はまた、 本発明の種子から調製されたデンプン調製物を提供する。 こ のようなデ プン調製物は、 プロラミンなどの貯蔵タンパク質を含むタンパク 質含有量が顕著に減少している。 したがって、 そのようなデンプン調製物は、 低タンパク質が好ましい用途において利用され得る。
また、 本発明のデンプン調製物は、 本発明の種子を生産する植物が外来遺伝 子をコードする核酸分子を含む場合、 その外来遺伝子がコードするポリべプチ ドを含む。 そのようなポリべプチドは有用タンパク質であり得ることから、 こ のようなデンプン調製物は、そのような有用タンパク質の原料として、または、 そのような有用タンパク質ないしは有用タンパク質の機能に由来する 2次代謝 産物が添加された食品を提供するために好ましい。 本発明は、 本発明の植物体または本発明の種子から生産された外来遺伝子の 遺伝子産物を含む組成物を提供する。 そのような外来遺伝子の遺伝子産物は、 本発明のシステムを用いることによって効率よく食用部分の中に生産されるこ とから、 食用として、 栄養補助物、 農薬、 化粧品、 医薬としてまたは他の用途 として用いるのに非常に好ましい。
別の局面において、 本発明は、 植物において種子中のタンパク質の発現量を 減少させる方法を提供する。 この方法は、 A) 本発明の核酸分子を提供するェ 程； B ) 上記核酸分子を上記植物の細胞に導入する工程； C ) 上記細胞を再分 化させてトランスジエニック植物を作出する工程；および D) 上記トランスジ エニック植物から種子を得る工程、 を包含する。 ここで、 本発明の核酸分子を 提供する技術は、 当該分野において周知であり、 どのような技術を用いても本 発明の核酸分子を提供することができることが理解される。 核酸分子を植物の 細胞に導入する技術もまた、当該分野において周知であり、そのような技術は、 本発明において引用した文献などに十分記载されている。 核酸分子の植物の細 胞への導入は、 一過的であっても恒常的であってもよい。 一過性または恒常性 の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知である。 本発明において 用いられる細胞を分化させてトランスジエニック植物を作出する技術もまた当 該分野において周知であり、 そのような技術は、 本発明において引用した文献 などに十分記載されていることが理解される。 トランスジエニック植物から種 子を得る技術もまた、 当該分野において周知であり、 そのような技術は、 本発 明において引用した文献などに記载されている。
したがって、 このように、 本発明の種子中のタンパク質の発現量を減少させ る方法は周知の技術を用いて実施することができる。
本発明において用いる遺伝子導入技術は、 当該分野において公知の技術であ ればどのような技術であっても使用することができる。 好ましい実施形態にお いて、 本発明において用いる遺伝子導入工程は、 ァグロパクテリゥム法を用い る。
好ましい実施形態において、 本発明の植物において種子中のタンパク質の発 現量を減少させる方法はさらに、 E) 本発明の核酸分子が導入された植物の細 胞を選択する工程、 を包含する。 この工程を包含することにより、 より効率よ く、 遺伝子導入植物を生育することができるが、 本発明の実施においては必ず しも選択することが必要というわけではない。 そのような選択方法は、 導入さ れた核酸分子の特性によって変動し、 例えば、 抗生物質 （例えば、 ハイグロマ イシン、 カナマイシンなど） に対する耐性遺伝子が導入された場合は、 その特 定の抗生物質を用いて目的の細胞を選択することができる。 あるいは、 標識遺 伝子 （例えば、 緑色蛍光遺伝子など） を用いれば、 そのような標識を目安に目 的の細胞を選択することができる。
別の局面において、 本発明は、 植物種子中で外来遺伝子を発現させる方法を 提供する。 この方法は、 A) 本発明の核酸分子を提供する工程； B ) 上記外来 遺伝子をコードする核酸分子を提供する工程； C) 上記請求項 1に記載の核酸 分子および上記外来遺伝子をコードする核酸分子を上記植物の細胞に導入する 工程； D) 上記細胞を再分化させてトランスジエニック植物を作出する工程； ならびに E ) 上記トランスジエニック植物から種子を得る工程、 を包含する。 ここで、 本発明の核酸分子おょぴ外来遺伝子をコードする核酸分子を提供する 技術は、 当該分野において周知であり、 どのような技術を用いても本発明の核 酸分子を提供することができることが理解される。 これらの 2つの核酸分子は、 一緒に提供されてもよく、 別々に提供されてもよい。 好ましくは、 同一のべク ター中に両者が提供され得る。 同一のベクター中に両者が提供されることによ り、 一度にその核酸分子を植物の細胞に導入することができる。
核酸分子を植物の細胞に導入する技術もまた、 当該分野において周知であり、 そのような技術は、 本発明に:^いて引用した文献などに十分記載されている。 核酸分子の植物の細胞への導入は、 一過的であっても恒常的であってもよい。 一過性または恒常性の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知であ る。 本発明において用いられる細胞を分化させてトランスジエニック植物を作 出する技術もまた当該分野において周知であり、 そのような技術は、 本発明に おいて引用した文献などに十分記載されていることが理解される。 トランスジ ヱニック植物から種子を得る技術もまた、 当該分野において周知であり、 その ような技術は、 本発明において引用した文献などに記載されている。
本発明の外来遺伝子の発現方法において用いる遺伝子導入技術は、 当該分野 にお 1/、て公知の技術であればどのような技術であっても使用することができる。 好ましい実施形態において、 本発明において用いる遺伝子導入工程は、 ァグロ パクテリゥム法を用いる。 本発明のアンチセンス構築物と、 外来遺伝子をコー ドする核酸分子とが別々に提供され細胞に導入される場合、 細胞への導入は、 それぞれ同一の方法で行われてもよく、 異なる方法で行われてもよい。
好ましい実施形態において、 本発明の植物において種子中のタンパク質の発 現量を減少させる方法はさらに、 F ) 本発明の核酸分子が導入された植物の細 胞を選択する工程、 を包含する。 この工程を包含することにより、 より効率よ く、 遺伝子導入植物を生育することができるが、 本発明の実施においては必ず しも選択することが必要というわけではない。 そのような選択方法は、 導入さ れた核酸分子の特性によって変動し、 例えば、 抗生物質 （例えば、 ハイグロマ イシン、 カナマイシンなど） に対する耐性遺伝子が導入された場合は、 その特 定の抗生物質を用いて目的の細胞を選択することができる。 あるいは、 標識遺 伝子 （例えば、 緑色蛍光遺伝子など） を用いれば、 そのような標識を目安に目 的の細胞を選択することができる。 あるいは、 外来遺伝子そのものが表現型に 識別可能な差異を生じさせる場合は、 そのような差異を目安に遺伝子導入細胞 を選択してもよい。 そのような識別可能な差異としては、 例えば、 色素の発現 の有無などがあるがそれに限定されない。
本発明の外来遺伝子の発現方法はまた、 好ましくはさらに、 G) 上記種子か ら上記外来遺伝子の遺伝子産物を分離する工程、 を包含する。
そのような遺伝子産物の分離技術は当該分野において周知であり、 遺伝子産 物 （例えば、 タンパク質または mRNAなど） を分離することができる技術で あれば、 どのような技術を用いてもよい。 したがって、 本発明の形質転換体の 培養物から、 本発明の外来遺伝子の遺伝子産物のようなポリペプチドを単離ま たは精製するためには、 当該分野で周知慣用の通常のタンパク質の単離または 精製法を用いることができる。 例えば、 本発明のポリペプチドが本発明の形質 転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、 その培養物を 遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法脱塩法、 有機溶媒による沈澱法、 ジェチルァ ミノェチル （DEAE) —セファロース、 D IAI ON HPA—75 (三菱 化学） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— S e p h a r o s e FF (Ph a rma c i a) 等のレジンを用いた陽イオン交換ク口 マトグラフィ一法、 プチルセファロ一ス、 フエ二 セファロ一ス等のレジンを 用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィニテ ィ—クロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の 電気泳動法等の手法を用い、 精製標品を得ることができる。
本発明の外来遺伝子の遺伝子産物のようなポリべプチドが本発明の形質転換 体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、 培養物を遠心分離することにより、 培養物中の細胞を集め、 その細胞を洗浄した後に、 超音波破碎機、 フレンチプ レス、 マントンガウリンホモジナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上 清から、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法脱塩法、 有機溶媒による沈澱法、 ジ ェチルアミノエチル （DEAE) —セファロース （S e p h a r o s e)、 D I A I ON HPA—75 (三菱化学） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマト グラフィ一法、 S— S e p h a r o s e FF (Ph a rma c i a) 等のレ ジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 プチルセファロ一ス、 フエ 二ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を 用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法、' クロマトフォー力 シング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、 精 製標品を得ることができる。
また、 本発明の外来遺伝子の遺伝子産物のようなポリべプチドが細胞内に不 溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を回収後破枠し、 遠心分離を行う ことにより得られた沈澱画分より、 通常の方法によりそのポリべプチドを回収 後、 そのポリぺプチドの不溶体をポリぺプチド変性剤で可溶化する。 この可溶 化液を、 ポリぺプチド変性剤を含まないあるいはポリぺプチド変性剤の濃度が ポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 本発明 のポリべプチドを正常な立体構造に構成させた後、 上記と同様の単離精製法に より精製標品を得ることができる。 また、細胞内の特定のオルガネラ、例えば、 プロテインボディに蓄積され得る場合には、 そのオルガネラを分離後、 タンパ ク質を精製することもできる。
通常のタンパク質の精製方法 （J. Ev a n. S a d l e rら： Me t h o d s i n En z y m o l o g y, 83， 458) に準じて精製できる。 例 えば、 本発明の外来遺伝子の遺伝子産物のようなポリべプチドを他のタンパク 質との融合タンパク質として生産し、 融合したタンパク質に親和性をもつ物質 を用いたアブイ二ティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる [山川彰夫，実験医学（Ex p e r i me n t a l Me d i c i n e), 13， 469-474 (1995)]。 例えば、 L oweらの方法 （L a r s e n e t a 1., P r o c. Na t l . Ac a d. S c i " USA, 86， 822 7 (1989), Kuk o s k a-L a t a l l o J F、 Ge n e s D e v., 4， 1 288 (1 990)) に記載の方法に準じて、 本発明のポリべプチ ドをプロテイン Aとの融合タンパク質として生産し、 ィムノグロブリン Gを用 いるァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより精製することができる。
また、 本発明のポリペプチドを FLAGペプチドとの融合タンパク質として 生産し、 抗 FLAG抗体を用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより精 製することができる （L a r s e n e t a l ., P r o c. Na t l . Ac a d. S c i .， USA, 86， 8227 (1989)、 Kuk ow s k a-L a t a 1 1 o J F、 Ge n e s D e v., 4， 1288 (1990))。 さらに、 本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアブイ二ティーク 口マトグラフィ一で精製することもできる。 本発明のポリペプチドは、 公知の 方法 [J. B i omo l e c u l a r NMR， 6， 1 29— 134、 S c i e n c e, 242, 1162— 1164、 J . B i o c h em., 1 10， 16 6- 168 (1991)] に準じて、 i n v i t r o転写'翻訳系を用いてを 生産することができる。
本癸明は、 本発明の方法によって生産された、 外来遺伝子の遺伝子産物を含 む組成物を提供する。 そのような組成物が含む遺伝子産物は、 使用される外来 遺伝子に応じて変動するが、 好ましくはタンパク質であり得る。
別の局面において、 本発明は、 植物において種子中のタンパク質の発現量を 減少させるための、 本発明の核酸分子の使用に関する。
他の局面において、 本発明は、 植物の種子中で外来遺伝子を発現させるため の、 本発明の核酸分子の使用に関する。 ここで、 外来遺伝子が発現される植物 の種子において、植物の天然のタンパク質発現が低減していることが好ましい。 天然のタンパク質発現が低減するこどによって、 目的とする外来遺伝子の遺伝 子産物 （特に、 タンパク質） の発現は、 顕著に効率的となる。
これらの各々の使用において、 その各要素について本明細書において詳細に 説明した好ましい実施形態は、 そのまま適用することができることが理解され る。
以下に、 実施例に基づいて本発明を説明するが、 以下の実施例は、 例示の目 的のみに提供される。 従って、 本発明の範囲は、 上記発明の詳細な説明にも下 記実施例にも限定されるものではなく、 特許請求の範囲によってのみ限定され る。 実施例
(実施例 1 ： アンチセンス構築物の作製）
本実施例では、 本発明の例示として以下に示すアンチセンス配列を以下に示 すプロモーター配列と組み合わせたアンチセンス構築物を構築した。 以後、 特 に断わりのない限り、プロラミンを低減させる目的のアンチセンス構築物を「LP 遺伝子ないしは LPカセット」、 それを導入した組換えイネ系統を 「LP系統」、 も つとも含有量の多い 13kDaプロラミンが低下した系統を「LP13K系統」 と総称す る。 導入する品種については、 日本晴を H、 LGC- 1を LG、 その他の品種はそのま ま表記する。例えば、 「H-LP13K」 とは、 「LP遺伝子を導入してプロラミンが低減 した日本晴」 を示す。
プロモーター配列：
A) イネ 10 k D aプロラミン遺伝子に由来する配列 （配列番号 47 )
B) イネグルテリン B 1遺伝子に由来する配列 （配列番号 48)
C) C aMV35 S遺伝子に由来する配列 （配列番号 49)
アンチセンス配列：
A) 13 kD aプロラミンをコードする c DNA全長 （配列番号 1 ) のアン チセンス （配列番号 50)
B) 13 kD aプロラミンをコードする cDN Aの N末端の 67 b pのアン チセンス （配列番号 51)
C) 13 kDaプロラミンをコードする c DNAのN末端の 15 b pのアン チセンス （配列番号 52)
D) コント口ール配列 （配列番号 53 ) 了ンチセンス構築物の構築は以下のようにして行つた。
上述の組み合わせの配列おょぴ形質転換のイネの選抜用として、 ハイグロマ イシンに対する抵抗性を付与するカセットとして、 C aMV35 Sプロモータ 一 （配列番号 49)、 ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ （配列番号 5 4) および No sターミネータ一 （配列番号 55) を含むものを使用した。 以後の発現ベクター構築には、 大腸菌 JM109を用いて、 分子生物学実験 における常法に従って行った。
一連の遺伝子構築操作に先立って、 構築過程の効率化のために、 構築過程の 効率化のための改変ベクターの作製をおこなった。 図 1に示したものは、 バイ ナリーベクター p P Z P 202 (P l a n t Mo l e c u l a r B i o l o g y 25, 989— 994， 1994 )、 構築用サポートプラスミドとして pUC l 9を用いた例であるが、 他のバイナリーベクターやプラスミドを同様 に改変しても良い。 過程を概説すると、 オリジナルである 2つのベクター pU C 19およびバイナリーベクター p P Z P 202 (P l a n t Mo l e c u 1 a r B i o l o g y 25， 989— 994， 1994) をベースに、 当 該分野において公知の （Tr a n s g e n i c Re s e a r c h 4, p 2 88— 290， 1995) の方法を参考にして 8塩基認識部位 A s c Iおよび P a c Iを導入した改変ベクター pUC 198 AP、 pUC 198AA、 pU C 198 P Pおよび！ P Z P 2028を構築した。 同様の手法で、 A s c Iお よびそれと連結可能な 6塩基認識酵素である Ml u Iのサイトを 1つずつ持つ pUC 198 AMも作製した。 また、 選抜マーカー遺伝子である HP T遺伝子 は、 内部にある E c oR I、 P s t I、 Nc o I部位を部位指定変換で消去し た改変遺伝子 mH P Tを作製し （ァミノ酸配列番号 56)、 それを C a M V 35 Sプロモーターおよび n o sターミネータ一と制限酵素で切断されないように 連結した選抜マーカー発現カセット （塩基配列番号 57) として構築した。 こ れを、 やはり制限酵素で切断されないように: P P Z P 20 28に組み込んで p ZH2 Bを構築した。また、イネポリュビキチンプロモーター断片についても、 配列中に存在する Xb a l、 E c o R I、 P a c l、 P s t l、 Xh o lを、 やはり部位指定変換で消去した改変ィネポリュビキチンプロモーター （mRU b i P、 配列番号 58) を構築しておいた。 以降の実施例は、 これらのプラス ミドを用いて行った。
具体的な発現ベクターの構造の例を図 2に示した。 まず p ZH2 Bベクター の S a c I— E c o R Iにターミネータ一を連結し、 次に H i n d I I I - X b a Iにプロモーターを連結した。 アンチセンス用遺伝子フラグメントは、 X b a I一 S a c I部位の間に連結した。 RN A iタイプの 2本鎖 RN A発 現ベクターについては、 S a c I -E c o R Iに n o sターミネータ一、 H i n d I I I一 Xb a Iに改変イネポリュビキチンプロモーターを連結した後、 図 2に示した制限酵素部位 （5， 側に X b a lと B g l I I、 3 ' に S p e l と B a mH I ) を両側に付加した GU S遺伝子断片 （配列番号 5 9) またはィ ネアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子イントロン配列 （配列番号 9 7) を Xb a I -B amH I に連結することで、 基本となる RNA i発現ベクターを構 築した。 あとは、 抑制をかける適当なプロラミン遺伝子断片を 1種類選び、 X b a Iまたは: B g 1 I Iに 1つ、 S p e Iまたは B a mH Iに 1つ、 向きが逆 になるように連結して完成させた。
目的としたアンチセンス発現ベクターが構築されているかどうかは、 各断片 を増幅する PCRプライマーを用いた PCR、 および Zまたは DNA配列決定 を行うことで確認した。
ベクターは、 以下の実施例において使用するまで、 一 20°Cで保存した。 (実施例 2 ： アンチセンス構築物を用いたイネの形質転換）
実施例 1において生産したアンチセンス構築物を含むベクターを用いて、 ィ ネ 2品種 （日本晴おょぴ LGC— 1) を形質転換し、 トランスジエニックイネ を生産した。 日本晴は、 イネとして代表的な品種として使用した。 LGC— 1 は、 二ホンマサリの放射線変異によるイネで、 種子中のグルテリン量が大きく 低下し、 プロラミンが増加していることから、 本発明のプロラミンへの影響を より明確に確認するために使用した。
その具体的な手順は以下のとおりである。
図 2に示したそれぞれのアンチセンスプロラミン遺伝子発現べクターは、 ま ずァグロバタテリゥム EHA101にエレクトロポレ一シヨンで導入し、 べク ターを保持した菌を 10 Omg/Lのスぺクチノマイシンを含む LB寒天培地 で選抜した。 ァグロパクテリゥム感染までは、 Ra i n e r iらの方法 （R a i n e r i DM.， B i o/T e c hn o l o g y 8， 33— 38, 1 99 0) を一部改変して実施し、 感染以降の培養操作と培地については、 To k i らの方法 (To k i . S., P l a n t Mo l e c u l a r B i o l o g y Re o r t e r 15， 159— 164， 1997) に従つて行つた。 T o k iらの方法で形質転換イネが得られない品種については、 Fu k u o k aら の方法 (F u k u o k a H. e t a 1 P l a n t Ce l l R e p o r t s 1 9， 815-820, 2000) に記された培地組成に従って行つ た。
手順を簡単に記述するが、 特に断りがないかぎり、 イネ細胞は 28°Cにて培 養した。 また、 培地の支持体は 0. 4%濃度のゲルライト （和光純薬） を用い た。 籾をはずしたイネの種子を 70%エタノールにつけ、 続いて有効塩素濃度 2 %程度の次亜塩素酸に浸せきすることで殺菌し、 十分な滅菌水で洗浄の後、 2mgZLの 2. 4— Dを含むカルス誘導培地 （KN03 2830mg/L, (NH4) 2 S 04 46 Omg, C a C 12 · 2H2 O 166mg/L, Mg S04 - 7H20 185mg/L, KH2P04 40 Omg/L, F e S 04 · 7H20 27. 8mg/L, EDTA- 2N a 37. 3mg/L, Mn SO 4· 4Η20 4. 4mg/L, Z n S04- 7H20 1. 5mg/L, K I 0. 8mg/L, H3BO3 1. 6mg/L, ニコチン酸 0. 5mg/L、 チアミ ン塩酸 1. 0mg/L、 ピリ ドキシン塩酸 0. 5mgZL、 グリシン 2 m g/ L、 ミオイノシトール 10 Omg/L、 プロリン 2. 88 g/L, カザミノ酸 300mg/L、 ショ糖 30 g/L、 pH= 5. 8) に置床し培養した。 5日 後、 置床した種子をそのまま回収し、 導入目的遺伝子を保持したァグロバクテ リウムを AAM培地 （Mn S04 · 4H20 1 Omg/L, H3B03 3mg /L, Z n S04 · 7H20 2mg/L， N a 2Mo 04 · 5H20 0. 25m g/L, Cu S04 · 5H20 0. 025mg/L, CoC l 2- 6H20 0. 025mg/L， C a C 12 · 2H20 15 Omg/L , Mg S04 · 7H2 O 25 Omg/L, F e— EDTA 4 Omg/L, N a H2P04 · 2H2 O 15 Omg/L, ニコチン酸 lmg/L、 チアミン塩酸 10 m g /L、 ピ リ ドキシン塩酸 lmg/L、 ミオイノシトール 10 OmgZL、 L—アルギニ ン 174mg/L、 グリシン 7. 5mg/L、 pH= 5. 2) にけん濁した菌 液 （濃度は OD 600 = 0. 03程度にあわせる） に 2分間つけこみ、 滅菌べ 一パータオル上で水気をきつて、 2mgZLの 2. 4— Dを含む共存培養培地 (KN03 283 Omg/L, (NH4) 2SO4 46 Omg, C a C 12 · 2 H20 166mg/L, Mg S04 - 7H20 185mg/L, KH2P04 40 Omg/L, F e S04 · 7H20 27. 8mg/L, EDTA— 2Na 37. 3mg/L, Mn S04 · 4H20 4. 4mg/L， Z n S04 · 7H2 O 1. 5mg/L， K I 0. 8mg/L, H3B03 1. 6mg/L, 二 コチン酸 0. 5mg/L、 チアミン塩酸 1. Omg/L, ピリ ドキシン塩酸 0. 5mgZL、 グリシン 2mg/L、 ミオイノシトール 100 m g/L、 ダルコ —ス 10 gZL、 カザミノ酸 30 Omg/L、 ショ糖 30 gZL、 pH= 5. 2) へならベた。 25 °C喑所で 3日間培養した後、 十分な滅菌水で種子を洗浄 し、 最後に 50 Omg/Lのカルペニシリンを含む滅菌水に 5分間つけた。 こ のようにしてァグロパクテリゥムを完全に除去した種子は、 ハイグロマイシン
5 Omg/Lの濃度で含む選抜培地 （KNO 3 283 Omg/L, (NH4) 2 S04 46 Omg, C a C 12 · 2H20 166mg/L, Mg SO4 · 7H2 O 185mg/L, KH2P04 40 Omg/L, F e S04 · 7H20 2 7. 8mg/L, ,EDTA— 2Na 37. 3mg/L， Mn S04 · 4H2O 4. 4mg/L, Z n S04 · 7H20 1. 5mg/L, K I 0. 8mg/ L， H3BO3 1. 6mg/L， ニコチン酸 0. 5mg/L、チアミン塩酸 1. Omg/L, ピリ ドキシン塩酸 0. 5mg/L、 グリシン 2mg/L、 ミオイ ノシトール 10 Omg/L、 プロリン 2. 88 gZL、 カザミノ酸 300mg /L、 ショ糖 30 g/L、 pH= 5. 8) で 2週間培養した。 その後、 胚乳と 芽をはずした細胞塊を、 やはりハイグロマイシン 5 Omg/Lの濃度で含み、 かつホルモンとして力イネチン 2mg/L， NAA 0. 02mg/Lを含む 再分化培地（NH4N03 165 Omg/L, KN03 190 Omg/L, C a C 12 · 2H20 44 Omg/L， Mg S 04 · 7H20 37 Omg/L, KH2P04 170 Omg/L, F e S04 · 7H20 27. 8mg/L， E DTA- 2N a 37. 3 m g/L, Mn S O 4 · 4 H20 22. 3mg/L, Z n S04 · 7H20 8. 6mg/L, Cu S04 · 5H20 0. 025mg /L， Na2Mo04 - 2H20 0. 25mg/L, C o C 12 · 6 H 2 O 0. 025mg/L, K I 0. 83mg/L, H3B03 6. 2mg/L, ニコ チン酸 0. 5 m g/L、 チアミン塩酸 0. lmg/L、 ピリ ドキシン塩酸 0. 5mg/L、 グリシン 2mg/L、 ミオイノシトール 100 m g /L， カザミ ノ酸 2 g/L、 ショ糖 30 g/L、 ソルビトール 30 g/L、 pH=5. 8) におきかえ、 同じ培地に 1週間ごとに 3回うえつぎを行った。 途中、 緑化して シュートを生じた細胞集団 1つにつき、 生長の旺盛なシユートを 2本選んでハ イダロマイシン 5 Omg/Lを含むホルモンフリー培地 （NH4N03 165 Omg/L, KNO3 190 Omg/L， C a C 12 · 2H20 44 Omg/ L， g S04 · 7H20 37 Omg/L, KH2P04 17 Omg/L, F e S04 · 7H20 27. 8mg/L, EDTA— 2Na 37. 3mg/L, Mn S 04 · 4H20 22. 3mg/L, Z n S04 · 7H20 8. 6mg/ L， Cu S04 · 5H20 0. 025mg/L, Na 2Mo 04 - 2H20 0. 25mg/L, C o C 12 · 6H20 0. 025mg/L, K I 0. 83m g/L, H3BO3 6. 2mg/L， ニコチン酸 0. 5mgZL、 チアミン塩 酸 0.
Figure imgf000103_0001
ピリ ドキシン塩酸 0. 5mg/L、 グリシン 2mg/L、 ショ糖 30 g//L、 pH=5. 8) にうつしかえた。 約 1ヶ月後、 2本のうち 十分に育ったほうのシュートを鉢に植え、 隔離温室または陽光定温器内で育成 して種子を収穫した。 別々の細胞集団より再分化したシュートは、 独立の耝換 え系統として扱った。
このようにして得た形質転換体は、 このベクター中にコードされるハイグロ マイシン遺伝子によりハイグロマイシンに対する抵抗性を付与されていた。 (実施例 3 ：形質転換体の生育）
市販の培養土（微意量栄養素入りのホーネンス培養土） をビニールポット （直 径 15 cm) に入れ、 ホルモンフリー培地にうつして 1ヶ月経過したイネ植物 体を移植した。通常は、それを隔離温室で天然光の下でおいて種子を実らせた。 場合によっては、 人工気象器'（日本医化 FH301など） 内で、 16時間明期 (15000ルクス以上、 30°C) — 8時間喑期 （25°C) のサイクルで 2ケ 月、 続いて 12時間明期 （15000ルクス以上、 30°C) — 12時間喑期 2 5 °C) のサイクルで 2ヶ月〜 3ヶ月おいて種子を実らせた。
(実施例 4 ：組換え当代の種子タンパク質の電気泳動による分析）
実施例 3において収穫した種子を用いて、 種子内に存在するタンパク質の状 態について解析した。 その詳細な手順を以下に示す。 当該分野において周知の技法である、 SDS— PAGE方を用いて、 18% 濃度のァクリルァミドゲルにより種子タンパク質の組成を解析した。 独立な 1 つの組換えイネ系統あたり、 種子を任意に 12粒選んで 1粒ずつ番号をつけ、 対応関係がわかるように 2分割し、 胚のついた半分をハイグロマイシン 5 Om g/Lを含むホルモンフリー培地に播種した。 のこり半粒は、 折りたたんだァ ルミホイルにはさんでハンマーでたたいて良く粉砕し、 種子タンパク質抽出バ ッファー （25mMトリス、 pH6. 8、 8M尿素、 5 %の 2 _メルカプトェ タノール、 4%SDSを含む） を 200マイクロリットル入れてボルテックス を 1分かけてタンパク質を抽出した。 遠心操作後の上清を 8マイクロリツトル とりわけ、 色素溶液 （25 mMトリス、 pH6. 8で 10%グリセロール、 0. 025%ブロムフヱノルブル一、 5 % 2—メルカプトェタノールを含む) 2マ イク口リツトルと混合した後にゲルで電気泳動し、 クマシ一プリリアントブル 一で検出した。 タンパク質量の簡易的定量としては、 上記ゲルのバンドの濃度 を On eD/ Z e r oD S c a n (An a l y s i s t i c s I n c.) に より測定した。
(系統選抜）
上記の分析で 1 3 KD aプロラミンがおおむね 50%以下になっている系統 を選抜した。 種子を次世代の種子を収穫し、 再びハイグロマイシンを含むホル モンフリー培地（NH4N03 165 Omg/L, KN03 1 900mg/L, C a C 12 · 2H20 440mg/L, Mg SO4- 7H2O 37 Omg/L, KH2P04 17 Omg/L, F e S04 · 7H20 27. 8mg/L， ED TA-2Na 37. 3mg/L, Mn S04 · 4H20 22. 3mg/L, Z n S04 · 7H20 8. 6mg/L, Cu S04 · 5H20 0. 025mg /L, N a 2Mo 04 - 2H20 0. 25mg/L, C o C 12 · 6H2O 0. 025mg/L, K I 0. 83mg/L, H3B03 6. 2mg/L, ニコ チン酸 0. 5mgZL、 チアミン塩酸 0. lmgZL、 ピリ ドキシン塩酸 0. 5mg/LN グリシン 2mg/L、 ショ糖 30 gZL、 p H= 5. 8) への播 種と電気泳動による確認を行った。 これを 3世代分繰り返し、 ランダムに選ん だ 10粒すベての種子が同じように 13 KD aプロラミンが 50%以下になつ た系銃を詳細に調べた。 種子 5粒を乳鉢で粉碎して 15mlのチューブに入れ、 5m 1のジェチルエーテルを加えて激しく攪拌して脱脂を行い、 遠心後にエー テルを除去し、 残った種子粉末をドラフト内で乾燥させた。 次に、 5m 1の 2 5 mMトリス緩衝液 (pH6. 8) を加えて激しく攪拌して水溶性タンパク質 を抽出し、 再度遠心して種子粉末を回収した。 ここに種子タンパク質抽出パッ ファーを 2. 5m 1を加えて激しく攪拌して、 遠心処理後の液層を種子タンパ ク質抽出液とした。
以上の結果を図 3に示す。 主要な貯蔵タンパク質は、 ゲル写真右に提示して ある。 レーン 1、 2および 7にあるような一般品種 （日本晴、 二ホンマサリ） ではグルテリン （Dと F) がもっとも多く、 次いで 13 KD aプロラミン （B) が多い。 これらにプロラミンアンチセンス遺伝子を導入すると、 レーン 4、 5 にあるように 13KDaプロラミン （B) が著しく減少し、 また l OKDaや 16 KD aプロラミンもやや減少した。 グルテリンゃグロブリンの発現に変化 はなかった。
また、 レーン 3、 8にあるように、 二ホンマサリの放射線突然変異で低ダル テリン含量イネ （LGC—1) では、 その反動としてプロラミン （A〜C) お よびグロブリン （E) が著しく増大して、 グルテリン含量の低下の大部分を相 殺している。 しカ し、 これにプロラミンアンチセンス遺伝子を導入すると、 レ —ン 6にあるように、 プロラミン （A〜C) の含量は著しく減退し、 一方で低 グルテリン含量の特徴が保持され、 かつグロブリンも增えていなかった。 この ようにして、 本発明の遺伝子はいずれの品種に導入しても、 プロラミンを低下 させ、 おおむねその分だけ種子タンパク質が減少することがわかり、 低タンパ ク質米の作出に非常に有効であることがわかった。 また、 図 4においていろいろな構築遺伝子を導入した系銃の種子を分析した 結果を示したが、 ハイグロマイシン耐性の形質を持った種子では、 プロラミン 低減がおきていることがわかり、 プロラミン低減の効果は導入遺伝子に由来す ることを確認した。
(デンシトメータによる測定）
次に、 タンパク質量を相対的に数値化して比較するために、 SDS— PAG Eのゲルをデンシトメータにより測定した。 上記の抽出液を適量 （例えば 5μ 1、 15μ 1、 30 μ 1) 用いて SDS— PAGEを行い、 同様にパンドの濃 度を定量してタンパク量を推定した。また、電気泳動後に PVDF膜に転写し、 それにウェスタンブロットキット （B i oRa d社など） に従って、 抗 13 K D aポリクローナル抗体を用いて 13 KD aプロラミンを検出した。 検出した バンドについては、 SDS— PAGEと同様に濃度を定量してタンパク量を推 定した。 デンシドメ一タの結果を下の表に示したが、 貯蔵タンパク質の吸光値 の合計は、 プロラミンアンチセンス遺伝子を導入した系統が明らかに少なく。 低タンパク化が達成できていることを示している。 また、 図 5にウェスタンプ 口ットの結果を示すが、 原品種に比較して、 13 KD aプロラミンを認識する バンドの吸光値は 10%〜28%まで低下しており、 SDS— PAGEでの測 定結果より、 さらにプロラミンが低減している可能性も示唆された。
デンシトメ一タで測定した主要な貯蔵タンパク質のパンド濃度結果を以下の 表に示す。
(表 1 )
Figure imgf000107_0001
上記表からも明らかなように、 本発明のアンチセンス構築物は、 プロラミン の癸現を減少させたのみならず、 他の貯蔵タンパク質に対しても抑制または中 立の効果をもっていた。 この結果は、 低グルテリン植物においてプロラミンが 増加し、 結果として種子タンパク質の総量がほとんど変化していなかつたこと とは全く異なるものである。 このようなことは予想外の結果である。
(窒素量測定）
粗タンパク質含量がどのように変化しているかを、 玄米窒素含有量を測定し て検証した。 簡潔に述べると以下のとおりである。 方法は、 窒素量の化学分析 の常法であるケルダール法を用いた。 種子 1 0粒を専用試験管に入れ、 そこに 分解促進剤と水 2 m L、 硫酸 5 m Lを加えて 3 7 0 °Cで加熱分解し、 手で持て るくらいに冷えた後に試験管標線まで静かに蒸留水を注いで希釈した。 この状 態で、 種子の窒素はアンモニア一アンモニゥムとなって硫酸の中に保持されて いる。 この分解液 1 0 m Lに、 等量の 3 0 %水酸化ナトリウムを添カ卩し、 水蒸 気蒸留して発生したアンモニアを、 飽和ホウ酸溶液にトラップした。 このホウ 酸溶液に p H指示薬を入れ、 塩酸で滴定して中和点より、 アンモニア量を定量 し、 そこから窒素量を算出した。 その結果を以下の表に示す。
(表 2 )
Figure imgf000108_0001
2つの隔離温室でィネを栽培して分析を行った。 温室ごとの環境の差が窒素 含有量に影響することは広く知られており、 日本晴の窒素含有量も 2つの温室 で違う値を示している。 しかし、 LP遺伝子を導入した系統では、 いずれにおい ても原品種より低い窒素含有量を示しており、 粗タンパク質含量が減少してい ることがわかる。 それが貯蔵タンパク質の減少に由来することは明白である。 上述の表からも明らかなように、 本発明のアンチセンス構築物は、 種子タン パク質の窒素含有量すなわち、 種子タンパク質量を有意に減少させたことが分 力 り、 すなわち、 低タンパク質化を達成しているといえる。
(結果）
以上をまとめると、 本発明の上記構築物を用いると、 1 3 kプロラミンの癸 現量は顕著に減少した。 他のプロラミン （1 0 k、 1 6 k ) もまた、 同等であ るか若干の減少を示した。 グルテリンおょぴグロブリンの発現は、 本発明の上 記構築物を導入する前の原品種と同等であった。 従って、 この結果から、 本発 明の構築物は、 種子タンパク質の総発現量を顕著に減少させるといえる。
(実施例 5 ：独立な系統より得られた種子の電気泳動パターン）
次に、 1穂に実った種子について、 複数の種子を抽出し、 実施例 4に記載の ように電気泳動により解析した。 結果を図 4に示したが、 これによれば、 ハイ クロマイシン耐性の形質を示す種子では、 プロラミン低下の形質が見られたこ とから、 本発明のアンチセンス構築物が片方の染色体にさえ挿入されていれば、 プロラミン抑制に充分であることが示されたことになる。
(実施例 6 ： アンチセンス効果）
次に、 本発明のアンチセンス構築物のアンチセンス効果を確認するために、 独立して組換えイネを锋数作出し、 分析を行った。 その手順および結果を以下 に示す。
本発明のプロラミンアンチセンス遺伝子の構造と、 それがもたらすプロラミ ン低減効果の関係について、 いろいろな種類の構築遺伝子について組換えイネ を作出した。 それぞれについて 10以上の独立な系統の種子を、 系統選抜の方 法に従って 10粒ずつ分析して以下のように結果をまとめた。
(表 3)
番
Figure imgf000109_0001
G LGC1 10kDaプロラミン 配列 1 (13kDaプロラミン）
H LGC1 グルテリン B 1 配列 1 (13kDaプロラミン）
これらの形質転換イネを、 1) 13 kD aプロラミン量が低下した種子を 1 粒以上つけた系統数、 2) 13 kDaプロラミン量が非形質転換体の 50 %以 下になつた種子をつけた系統の数、 3) ハイグロマイシン抵抗性を示した種子 のすべてにおいて 13 kD aプロラミン量が低下していたものについて解析し た。
1) 13 kD aプロラミン量が低下した種子を 1粒以上つけた系統数は、 1 3 k D aプロラミンの発現量が 20 %減少した種子を計数した。
2) 13 kDaプロラミン量が非形質転換体の 50 %以下になった種子につ いては、 非形質転換体の種子抽出物と比較対照の種子抽出物とを電気泳動のゲ ル上での比較によって行った。
3) ハイグロマイシン抵抗性については、 ハイグロマイシン含有培地におい て生存する個体を選択した。 プロラミン量の低下については、 1) と同様の判 断基準を採用した。
実際の比較は、 電気泳動後のゲルをゲルリーダーで読み取り、 その指数の絶 対値に関して、 非形質転換体を 100%とすることによって比較対照のものの 値を算出した。
以下に結果を示す。
(表 4)
Figure imgf000110_0001
* 13 k D aプロラミン量が低下した種子を 1粒以上つけた系統数；
** 13 k D aプロラミン量が非形質転換体の 50 %以下になった種子をつけた 系統数；
***ハイグロマイシン抵抗性を示した種子のすべてにおいて 13 kD aプロラ ミン量が低下していた系統数 上記項目 1および 2の結果は、 構築物に 1 3 KD aプロラミンの発現を抑制 する力がどのくらいあるかをはかる指標であり、 それぞれの項目で数字が大き い程、 効率的であることを示す。 本発明のアンチセンス構築物は、 対象となる 1 3 KD aプロラミンの発現を効率良く抑制している様子がうかがえるが、 構 築物の構造（特にプロモーター） によって、効率に差が有ることも示している。 項目 3の結果では、 ハイグロマイシン抵抗性とアンチセンスの表現形が完全に は一致しないケースが出ていることをしめす。 このことは、 2対ある染色体の いずれか一つに導入遺伝子が入っただけでは 1 3 k D aプロラミンの抑制効果 を十分に発揮できない場合があることを示す。 従って、 本発明では、 2ついあ る染色体の両方に導入遺伝子が入ることが好ましくあり得る。 一般に組換えィ ネにおいては、 導入された遺伝子はランダムに染色体に組みこまれ、 その入つ た位置などによって発現の程度に差が出てくることがよく知られている。 同じ 遺伝子を導入した 1 0 0の個体を作っても、'導入遺伝子が良く発現する個体か ら全く発現しない個体まで、 発現程度がばらつくことは、 当業者においては常 識のことである。 また、 遺伝子の発現があまりない個体においては、 片方の染 色体に組み込まれた個体と両方の染色体に組み込まれた個体と、 また導入遺伝 子が 1つ入った個体と 2つ入った個体で表現型に差が出る場合があることもし られている。 本来は、 図 4にのせたように片方の染色体に 1つのアンチセンス 構築物が挿入されていれば、 アンチセンス効果を発揮し得るのであるが、 例え ば、 染色体上の揷入位置が悪い場合には、 アンチセンス構築物の個数により表 現型にばらつきがでてくることは十分にあり得るのである。
以上のように、 1、 2およびこの項目 3で示された数字が大きい程、 高い確 率で安定してアンチセンス効果を発揮し得る優れた構築物ということができる。 その意味では、 1 O K D aプロラミンプロモーターが、 他のプロモーターと比 較してアンチセンス効果が強く出ている系統が得られやすく、 またアンチセン スに使う遺伝子断片を短くした場合 （6 7〜1 5 b p ) にも効果を発揮するこ とがわかった。 従って本発明は非常に有用性が高いことを示す。
(実施例 7 酉： RNA iタイプ宪現カセットを用いたアンチセンス） アンチセンス遺伝 5 555
8子の別の形態として、 標的遺伝子に相補的な 2つのフラグ メントを用いた RNA iタイプの LP遺伝子を導入して、 効果を同様に検証し た。 既存の文献である N a t u r e 407 : 319— 320 (2000) を 参考にし、 構築した遺伝子の構造は図 2に示した。 それらのうち、 表 3、 4で は用いていなかったイネポリュビキチンプロモーターを用いて構築した表 5に 示した分を比較した。 表 6にその結果を示したが、 方法については表 4に準じ ている。
(表 5)
番
号 品種 プロモーター スぺ一サ一 アンチセンス抑制用配列
I 日本晴 GUS断片 （配列 59) 配列 1 (13kDaプロラミン） J 日本晴 イントロン（配列 97) 配列 1 (13kDaプロラミン） LGC1
Figure imgf000112_0001
6US断片 （配列 59) 配列 1 (13kDaプロラミン）
L LGC1 イントロン（配列 97) 配列 1 (13kDaプロラミン） 配列 65 (プロラミンの一部
M 日本晴 配列 58 ロン（配列 97) 45bp)
配列 72 (プロラミンの一部
N 日本晴 配列 58 イントロン（配列 97) 23bp)
(表 6)
1)プロラミ 2) 50%J 以 3) ハイグロマイシン
az.口
奋 解析した ン低下系統 下の種子の 抵抗性およびプロラミン イネ系統数 数 * 系統数 ** 低下系統数 ***
1 11 11 9 11
J 11 11 11 11 κ 4 4 2 4 し 4 4 4 4
Μ 4 4 2 4
Ν 4 4 1 4
* 13 kD aプロラミン量が低下した種子を 1粒以上つけた系統数；
**13 kD aプロラミン量が非形質転換体の 50 %以下になった種子をつけた 系統数；
***ハイグロマイシン抵抗性を示した種子のすべてにおいて 13 kD aプロラ ミン量が低下していた系統数
結果をみると、 R Aiタイプの LP遺伝子は、 解析した系統数と 1) と 3) の数 字が一致しており、 遺伝子が導入されていれば確実にプロラミンを低減できる ことを示している。 スぺーサー配列として GUS 断片とァスパラギン酸プロテア ーゼィントロンを比較すると、 ァスパラギン酸プロテアーゼィントロンのほう が 2) の数字が高く、 アンチセンス効果が顕著に現れる確率がより高いことを示 している。 また 45bp、 23bpといった短いフラグメントを用いた場合も、 アンチ センス効果が顕著に現れる系統が得られることがわかる。 フラグメントさらに 短くした場合 （15bp) でもアンチセンス効果が発揮された。
また、 プロラミン抑制用フラグメントとして、 16kDaプロラミンに由来する配 列 （配列番号 31、 32) 用いた場合、 出現する確率が低いものの、 16kDa プロラ ミンと 13kDaプロラミンが同時に抑制された系銃が得られた。 16kDaプロラミン と 13kDa プロラミンは局部的にはァミノ酸配列の共通性が高い部分があり、 そ の部分が双方にアンチセンス作用をおこしたものと考えられる。 このことと前 章の結果も考えあわせると、 多重遺伝子族の発現を包括的に抑制する際には、 ァミノ酸配列の局所的な共通性が重要であることを示しており、 本発明の構築 物は他の作物の貯蔵タンパク質抑制にも有効でありうることを示唆している。 なお、 実際の SDS- PAGEの結果のいくつかは図 10に示した。
一般に、 R Ai タイプのアンチセンス遺伝子は、 1つの逆向きフラグメントを 用いたアンチセンス遺伝子よりも、 標的遺伝子の発現を効率良くかつ強力に抑 制することが良く知られている。 表 4および 6を比較すると、 プロラミン抑制 においても同様の傾向が見られており、 特にプロラミンが顕著に低下した系統 を得られる確率は RNAiタイプのアンチセンス遺伝子の場合のほうが明らかに高 い。 しかし、 1つの逆向きフラグメントでも顕著にプロラミンが低下した系統 を得ることは十分に可能であることも示されており、 いずれの構造のアンチセ ンス遺伝子も有用性が高い点に変わりはないと結論できる。 (実施例 8 ：透過電顕写真によるプロテインボディでの観察）
次に、 実施例 6で作出された種子におけるプロテインボディを観察した。 プ 口ティンボディの観察は、 以下の手順で行った。
開花した籾にマーキングし、 7日、 1 0日、 1 4日、 2 1日後にサンプリ.ン グした。 すぐに種子の上下に力ミソリで切れ目を入れた後、 3 %ダルタルアル デヒド溶液に入れ、 氷上、 減圧条件下で 1 5分、 その後 4 °Cで 1 2時間以上お いて、 固定処理を行った。 種子を 3分割し、 L R— Wh i t e樹脂 （応研商事 より販売） に包埋し固化させた後に、 ダイヤモンドナイフを用いて 9 0 n mの 切片を切り出した。 以下、 通常の透過型電顕サンプル処理方法に従って切片を 処理し、 胚乳表層の細胞について日本電子の透過型電顕を用いて観察した。 開花後 1 4日目の種子の観察結果を図 6に示す。 6 aにおいては、 観察写真 をそのままのせた。 やや薄いグレーで滑らかな球形をしているのは、 プロラミ ンが蓄積するプロテインボディ 1、 それより濃い色で大型でややいびつな形を したのがグルテリンとグロブリンが蓄積するプロテインボディ 2である。 タン パク質顆粒がぎっしりつまっている様子がよく見える。 6 bには、 6 aと同じ 写真にプロティンボディのタイプをマーキングして表示した。 同一面積の視野 で観察すると、 L P 1 3 K系統 （6 b— 1 ) では、 一般品種 （6 b— 2 ) と比 較して、 明らかにプロテインボディ 1の数が少ないことが見て取れる。 このこ とは、 プロティンボディ 1の形成には 1 3 K D aプロラミンが重要な役割を果 たしており、 その発現を制御することでプロティンボディ形成数を制御できる ことを示している。 一方、 低グルテリンかつ高プロラミンの特徴を持つ L G C - 1 ( 6 b - 3 ) においては、 プロテインボディ 2の数とサイズは大きく減少 する一方で、 プロティンボディ 1の数は大きく増加しており、 グルテリンの減 少分がプロラミンに分配されている様子がよく見て取れる。 L G— L P 1 3 K ( L G C— 1にプロラミンアンチセンス遺伝子を導入） した系銃では、 2つの プロテインボディが共に減少している様子が観察された。 糠層ほどではないと しても、 胚乳細胞の表層はタンパク質に非常に富み、 食用 ·加工用いずれにお いてもできるだけ除去する方が好ましいことが知られているが、 プロラミンァ ンチセンス遺伝子の効果で表層のタンパク質がを大きく減少させていれば、 そ のような過程を簡略化しても同等の品質の製品が得られるメリットがある。 ま た、 種子のホメォスタシスの仕組みにより、 低下したタンパク質を別のもので 補おうとするはずであり、 そこに有用タンパク質の遺伝子を強制発現させてや れば、 優先的にアミノ酸が分配されて、 おそらくはこの表層細胞内に蓄積する と期待される。
(実施例 9 ：他のアンチセンス構築物の作製）
次に、 他のプロラミン遺伝子のアンチセンスおょぴプロモーターならびに 必要に応じてシグナル配列でも同様の効果が出ることを確認した。 この実施例 で作製したプロモーター配列おょぴアンチセンスの配列は、 配列番号 63〜7 2 (アンチセンス）、 102〜105 (アンチセンス）、 47および 58 (プロ モーター）、 106〜107 (プロモーター）、 108〜113 (シグナル配歹 U) に示されている。
この配列を用いて、 実施例 1〜8に示される手順にしたがって、 効果の解析 を行ったところ、 これらのアンチセンス配列についても同様のプロラミンおよ び種子タンパク質抑制効果があることが観察された。
このことは、 アンチセンス効果が、 そのプロラミンのみならず、 他にもある ことを示す。
次に、 実施例 6および 7に記載のように、 アンチセンス効果についてさらな る分析を行ったところ、 同様に、 アンチセンス効果があったこと、 および特に RNA i型で試みた場合は 15 b pのペアまたは 20 b pのペアのような短い 配列でも効果があったことが実証された。 (実施例 10 ：他の品種における効果）
この実施例では、 本発明のアンチセンス構築物を用いて、 他の品種でも同様 の効果が得られるかを検証した。 対象にはこれまでの実施例で使用していない ジャポニカ （一般飯用米、 モチ米、 酒米、 わい性などの形態変異イネ）、 または インディ力種である、 Te Te p, B a sma t i I R8、 湖南早、 およ びカサラスを選んだ。 形質転換以降の操作は、 すべて実施例 2〜4と同様に行 つた。 図 7はこれらの品種のうちのいくつかについて、 種子タンパク質の電気 泳動パターンと、 日本晴のプロラミンをゥサギに免疫して得られた抗 13KD aプロラミンポリクローナル抗体を用いてウェスタン解析を行った結果である c 一見してわかるとおり、 どの品種においても電気泳動パターンは極めて類似し ており、 抗体とも非常によく反応していることから、 プロラミン遺伝子が品種 間でも高度に保存されていることを明示している。 本発明のアンチセンスプロラミン （LP) 遺伝子を導入したところ、 全ての品 種においてプロラミン発現の顕著な低下が観察された。 いくつかの SDS- PAGEの 結果を図 10に示したが、 いずれにおいても LP遺伝子を導入したイネでは、 現 品種より著しくプロラミンに相当するタンパク質パンドが薄くなっており、 プ 口ラミンタンパク質含量の低下を反映している。 このような結果から、 交配' 遺伝子導入を問わず、 本発明の構築物を含むイネは、 プロラミンが低減し、 低 タンパク化すると結論され、 イネ全般において本発明の有用性が証明された。 なお、 図 7においてモチ品種のパンドが他の品種と比較して薄くなつているの は、 これらのデンプンが抽出操作中に著しく膨張して、 タンパク質の回収効率 を大きく低下させるためであり、 含まれるタンパク質が少ないわけではない。
(実施例 1 1 ：低プロラミンイネを用いた外来遺伝子の発現例）
上記実施例で得られた一連の LP13Kの種子および原品種の双方に、 有用タン パク質発現カセットを導入して比較するやり方もできるが、 いろいろな品種で 効果を検証したい場合は、 いちいちその品種で LP13K タイプを作っておく必要 があり、 効率が良くない。 本実施例のように、 事前に構築しておいた図 1のプ ラスミドの特性を最大限に生かすほうが効率的で優れている。
本実施例では、図 8に例示したとおり、 pUC198AMまたは pUC198AAで導入する 有用タンパク質発現カセットを構築し、 それをバイナリーベクターの Asclサイ トに挿入する方法を用いた。 これにより、 同一プラスミド上に連結された有用 タンパク質発現カセットとプロラミンアンチセンスカセットが、 確実に同時に イネに導入される。 特に PUC198AMで構築した有用タンパク質発現カセットを揷 入した場合は、 揷入力セットのターミネータ一側の Mlul とベクターの Asclが 連結されて部位が消滅する一方で、 プロモーター側の Asclは生き残るため、 そ の Asclにさらに追加して発現カセットを揷入することができる。
以下、 有用タンパク質発現用の構築遺伝子のシリーズを作製して、 プロラミ ン低減種子 （低タンパク質種子） のパイオリアクターとしての有用性を検証し た。
図 11に示したような遺伝子 1〜4を構築して日本晴に導入し、 GFPの発光を 観察するとともに、 実施例 2〜4および 7と同様にして、 SDS- PAGEおよぴゥェ スタン解析を行った。 発光強度は、 ライカ製顕微鏡の蛍光観察システムを用い て、 輝度を比較して行った。 遺伝子 1と 2を比較した場合、 L Pカセットが入 つている 2のほう力 明らかに強い発光が観察された。また遺伝子 3のように、 遺伝子 2の L Pカセットの部分を G U Sと入れ換えてみたところ、 遺伝子 1と 同レベルの発光強度であったことから、 発光の増強効果は L Pカセットに由来 すると判断された。また、遺伝子 2の G F P部分を GU Sと入れ換えた 4では、 全く蛍光は観察されず、 発光はあくまで G F Pに由来するものと判断された。 抗 G F P抗体を用いたゥエスタン解析では、 G F P発現量は遺伝子 2の場合は 1の場合の 2倍以上と見積もられた。 以上の結果から、 プロラミン低減種子で は外来タンパク質の発現が増大することが明示された。 しかし、 いずれの遺伝 子を導入した場合も、 SDS-PAGE上で GFPタンパク質を判別するのは困難であり、 バイオリアクターとしてのポテンシャルは十分に発揮されていない。
そこで、 図 12のように lOkDaプロラミンのシグナル配列を GFPの前に挿入し た構造を持つ遺伝子 5、 6を構築して同様の解析を行った。 その結果、 それら の種子の GFP発光強度は、それによる発現量比較が困難なレベルまで増大した。 図 13Aの SDS- PAGEに示したように、遺伝子 5を導入したィネ（レーン 2 )では、 GFPと推定される原品種にない明確なパンドが検出されるレベルに達した。また 遺伝子 5の場合に比較して、 LPカセットが入っている遺伝子 6 (レーン 3 ) の 場合は、 さらに発現量が 1. 2倍以上に上昇し、 1粒当たり 50 // g以上蓄積して いると見積もられた。 このように、 シグナル配列を併用することで、 プロラミ ン低減種子のパイオリアクターとしての有用性は一層明確に示されたと言える。 図 13で見られた原品種にない明確なパンドが、 確かに GFPであることは、 抗 GFP抗体によるウェスタン解析で確認した。また正しい構造のタンパク質ができ ているかどうかを、 アミノ酸配列で検証した。 図 14Aにおいて、 導入した GFP 遺伝子の構造は、 lOkDaプロラミンシグナル配列の後に連結配列を挟んで GFP遺 伝子本体があり、推定されるアミノ酸配列は塩基配列に下に示してある。 図 14B において、 原品種（レーン 1 )と比較して、 遺伝子 6を導入した糸且換えイネ（レー ン 2 )ではプロラミンの位置のバンド濃度（*)が減少し、 ボックスでかこった位 置に明確なバンドが出現している。 このバンドを PVDF膜に写し取り、 N末端配 列を決定したところ、 SerArgAlaMetValSerLysGly (配列番号 1 1 8 ) の配列が 得られ、推定アミノ酸配列のうち、連結部分以降の配列と 100%—致する。 この ように、 lOkDaプロラミンシグナル配列だけが計画通り切除されて、 正常に GFP タンパク質が発現されており、 本発明における導入遺伝子の構造が目的に極め て合致していることが証明された。
より有用性を高めるために、 遺伝子 6を LGC-1 に導入して効果を検証した。 その結果図 13Bのように、 日本晴に導入した場合 （レーン 3 ) よりも LGC- 1に 導入した場合 （レーン 5 ) のほうが GFP の発現量の増大が観察され、 しかもよ りプロラミンがより減少している系統 （レーン 6 ) のほうがさらに GFP の発現 量が高くなつた。
レーン 3の場合において、 GFPは 1粒当たり 150 g以上蓄積していると見積 もられ、 外来タンパク質が種子胚乳にもつとも多量に存在するタンパク質とな つた。 レーン 1の曰本晴の SDS-PAGEパターンと比較して、 別の植物のものと見 まごうほど隔絶しており、 従来の予想を遥かに超える画期的な発明であること が十分に理解される。 本発明の使用により、 既存の米とは全く違う特性をもつ 組換えイネ品種の創出研究が大きく加速されることが理解される。
(実施例 1 2 ：低プロラミンイネを用いた有用外来遺伝子の発現例—シスタ チンの場合） この実施例では、 シスタチンを用いて外来遺伝子の発現を試みた。
これまで GFP を用いて検討してきた系を、 実際の有用タンパク質生産に適用 したのが図 15の例である。 ここで使われたシスタチンは、 システィンプロテア ーゼを特異的に阻害する機能がある。 システィンプロテアーゼは、 鞘翅目 ·半 翅目害虫の消化酵素や、 あるいは様々なウィルスの増殖に必須の因子として重 要な働きをしている。 よって作物中のシスタチンを増強してそれらのシスティ ンプロテアーゼの働きを抑えれば、 害虫抵抗性やウィルス抵抗性が付与出来る ことになる。
シスタチンは、 もともと作物の食べる部分に含まれているので長い食経験が あり、 利用するリスクが極めて低いと考えられる。 よって薬剤処理が困難な食 ベる部分に発現させる利用法も十分にありうる。 例えば米で発現させた場合は、 貯穀害虫であるコクゾゥや登熟中の籾に被害を与えるカメムシの防除に役立ち、 同時に消化管から感染するウィルスを抑える機能性米としての利用もできるの である。
このように有効利用が非常に期待されるシスタチン遺伝子であるが、 従来実 用化の目処はたっていなかった。 その最大の原因は、 作物に高いレベルで蓄積 させることができていないことにある。 作物本来のシスタチン含有量は非常に 低いレベルであることが知られており、 発現を低く抑えるなんらかの調節機構 があるか、 またはタンパク質の安定性が低い （分解されやすい） 可能性が指摘 されている。 米に発現させてコクゾゥ抵抗性を付与できたとの報告もあるが、 発現レベルは低くわずかな発育遅延を達成できたのみで、 到底実用に耐えるレ ベノレではない。
そこで本発明をトウモロコシシスタチンに応用し、 シスタチン蓄積米の作出 と評価を試みた。 遺伝子 5および 6の GFP部分をそれぞれトウモロコシシスタ チン遺伝子に交換した遺伝子 7および 8を構築して日本晴に導入した。 本実施 例は、 種子からのタンパク質の抽出法の部分を除いて、 実施例 2〜4に準じて 行った。 変更点としては、 評価に用いる種子タンパク質抽出液は、 種子を粉碎 後に 200mMの塩化ナトリゥムを含む pH6. 0のリン酸バッファーで抽出後、 上清 を沸騰水中で 1分処理して調製した。
その結果を図 15に示した。 発現量の大小については、 GFPで観察されたもの と全く同じパターンを示し、 プロラミンプロモーター +シグナル配列 +シスタチ ン遺伝子をプロラミンアンチセンスカセットと連結して （遺伝子 8 ) 同時に導 入した系統が、 もっとも多くシスタチンを蓄積していた。 特に、 プロラミンァ ンチセンスカセットをつけた場合の増強効果は、 GFPの場合よりもずっと大きく 出ている。 シスタチンを植物種子に導入して、 SDS- PAGEでタンパク質を検出し た例は初めてであり、 本発明の有用性をより明確に示した例と言える。
(実施例 1 3 ：本発明の遺伝子構築物の他の貯蔵タンパク質への適用） 本発明で用いた R N A iタイプの発現抑制カセットを用いて、 実施例 7およ ぴ 9に従ってグルテリンおょぴグロブリンに対する R N A i遺伝子を構築して 導入し、 実施例 2〜4に従って分析評価した。 その結果、 グルテリン、 グロブ リンいずれも顕著に発現が抑制された。 この結果と図 1に示したベクターシス テムを組み合わせ、 グルテリン、 グロプリン、 プロラミンぞれぞれの発現抑制 カセットと外来遺伝子発現カセットを全て連結したベクターを構築して導入た ところ、 様々な品種においても全ての貯蔵タンパク質を抑制しつつ、 外来タン パク質を効率的に発現させることができた。 同様に、 グルテリン、 グロプリン、 プロラミンの 3つの遺伝子フラグメントをあらかじめ連結した人工フラグメン トを R NA iタイプの発現抑制カセットに用いた場合も （図 1 7に例示）、 全て の貯蔵タンパク質を抑制しつつ、 外来タンパク質を効率的に発現させることが できた。
また、 有用タンパク質をイネ種子に発現させるプロモーターとして、 グルテ リン B 1プロモーターやグロブリンプロモーターがしばしば用いられ、またこれ らのシグナル配列が発現を増大させるのに有効であることが報告されている。 遺伝子 5および 6の有用タンパク質カセット部分について、 プロモーター （配 列番号 4 7、 4 8、 6 0、 6 2、 1 0 6、 1 0 7 ) やシグナル配列 （配列番号 1 0 8〜1 1 7 ) をいろいろな糸且み合わせで置き換えて検討したところ、 やは り遺伝子 6タイプのほうが 5タイプより発現が増強された。 この場合はプロラ ミンが減少して生じた細胞内の空間がうまく利用された結果と考えられた。 以上のように、 本発明の遺伝子構築物とその構造は、 種子のバイオリアクタ 一化を図る目的に汎用的に用いることができることが示され、 従来にはない格 別の成果が得られたと言える。
本発明の過程において明らかになった、 イネ種子における貯蔵タンパク質組 成の調節様式では'（図 1 6 )、 ホメォスタシスにより種子タンパク生産力の余剰 分の大部分は、 最終的にプロラミンの生産に振り向けられる。 また、 プロラミ ンは種子登熟の後半でも良く発現される特性は良く知られている。 以上のこと を考慮すると、 有用タンパク質をプロラミンプロモーターで発現させる本発明 の構造物は、 全てのイネ種子貯蔵タンパク質量をできるだけ抑えつつ、 余剰生 産力を効率的に有用タンパク質発現に転用する目的に、 より一層合致している ことが理解される。 しかも本実施例においては、 図 1 4のように実際に発現さ れたタンパク質の N末端シーケンスの確認までしており、 そこまで検証した例 は既報にはない。 これらの結果を総括するなら、 遺伝子 6の構造は、 現在ある 中で最も優れているイネ種子用の有用タンパク質発現カセットの 1つである。 本発明の技術的思想は、 他の作物種子、 とりわけ単子葉作物種子において、 十分な普遍性および敷衍性を持つものであることは、 当該業者であれば容易に 理解できる。 すなわち、 遺伝子組換えないしは突然変異によってある種子貯蔵 タンパク質 Aを抑制しつつ、 その貯蔵タンパク質 Aの遺伝子プロモーターない しはその代用となるプロモーター +シグナル配列 +有用タンパク質という構築 遺伝子を導入することで、 有用タンパク質を大量に蓄積した、 画期的新作物を 創出しうるのである。 以下の表おょぴ図 1 7に総括したように、 本発明は、 こ れまで漠然と想像されていた作物種子のバイオリアクター化技術について、 具 体的な導入遺伝子の構造にまで実証例を示した格別の成果である。
ターミネータ,— F タ一ミネ一タ"[-6
プロモーター A C 有用タンパク質 E プロモータ一 B D
的
1 抑制標的となる貯
造 / シグナル配列 / 蔵タンパク質、
種子に発現される遺伝子のプ
貯蔵タンパク質プロモ一 一般的なシグナル 口モータ—、 望ましくは貯蔵 種子に高いレベル タ一、 望ましくは Dで標 で発現される貯蔵
配列、 望ましくは タンパク質プロモーターない
的とする貯蔵タンパク質 貯蔵タンパク質の タンパク質
則 しは種子に高いレベルで発現
と同じ貯蔵タンパク質の シグナル配列 される遺伝子プロモータ一、
よ y望ましくは Aとは異なる貯
蔵タンパク質プロモーター
t 貯蔵タンパク質プロモ一 一般的なシグナル 種子に発現される遺伝子のプロ
ィ 種子に高いレベル
ター、 望ましくは Dで標的 配列、 望ましくは モータ一、 望ましくは貯蔵タン
Figure imgf000124_0001
ネ で発現される貯蔵
とする貯蔵タンパク質と同 貯蔵タンパク質の パク質プロモータ一ないしは種
の タンパク質
じ貯蔵タンパク質のプロ シグナル配列、 さ 子に高いレベルで発現される遺
モータ—ないしはプロラミ らに望ましくはプ 伝子プロモータ一、 ょリ望まし
ンプロモータ一、 より望ま ロラミンシグナレ くはプロラミンプロモーター、
しくは 13KDaないし lOkDaプ 配列 さらに望ましくは Aとは異なる
ロラミンプロモータ一 プロラミンプロモーター
最合 A： 13kDa プロラミンプロモータ一
B :ポリュビキチンプロモータ一など
なせ
組例 C： 10kDa プロラミンシグナル配列
D :グル亍リン、 グロブリン、 13kDaプロラミン 全てを抑制
F： G： 10kDaプロラミンターミネータ一
Figure imgf000124_0002
) (¾7 (実施例 1 4 ：米を用いた調理 ·加工食品への本発明の利用） 米の加工食品製造において重要な作業過程は、 精米後 （ないしは粉枠して米 穀粉にした後） に水に十分に浸漬して吸水させ、 加熱によりデンプンを十分に 糊化させるところにある。 一般に、 タンパク質 （とりわけプロラミン） の多い 米では、 吸水が悪くでんぷんの糊化が不十分となり、 加熱後の米の膨ィ匕やねば り、 餅生地の膨潤性 ·伸展性が劣り、 製品の品質低下を招くことが知られてい る。 そこで上記の点について、 これまでの実施例で得られた低タンパク米 （日 本晴およぴコガネモチにプロラミンアンチセンス遺伝子を導入したもの） と原 品種と比較したところ、 低プロラミン米では浸漬時間を短縮しても、 ねばりや 膨潤性が原品種と同等ないしは勝る炊飯米、 蒸し米、 生地が得られた。 この結 果から、 レトルト米飯などの外食産業向け大 炊飯の場合や、 せんぺい .あら れ ·だんごといった加工食品に、 本発明が有用であることが示された。
(実施例 1 5 ： 日本酒醸造における本発明の利用）
米の別の利用場面としては、 日本酒の醸造があげられる。 そこで、 これまで の実施例で得られた低タンパク米の中から L G- L P 1 3 K ( L G C- 1にプ 口ラミンアンチセンス遺伝子を導入したもの） を用いて、 日本酒の醸造試験を 試みた。 L G C—1は酒造用の米ではないが、 一般食用品種でも日本酒製造は 十分可能であり、 L G C— 1自体は醸造米としては、 通常の品種と同等である ことが確かめられている。
日本酒醸造においては、 原料米のタンパク質は、 様々な雑味や好ましくない においのもとになるため、 できるだけ低い方が望ましいとされている。 粒の外 側の糠層は油脂、 ミネラル、 タンパク質に極めて富んでおり、 ここを削り落と す操作をとう精（あるいは精米） と呼ぶ。 どのくらいとう精したかを示すのに、 とう精前と後の重量比によるとう精歩合という指標が用いられるが、 白米を炊 飯して食する場合のとう精歩合は 9 0 %程度である。 し力 し、 図 6の電顕写真 で分かる通り、 白米表層細胞はタンパク質に富むため、 日本酒醸造の場合はさ らに表面を削ってとう精歩合 7 0 °/0以下のものを使うのが一般的であり、 品評 会用の最高級のものでは 3 0 %以下までというレベルで削り込みを行う。 本発明の種子を用いると、 原料のとう精歩合が高いままでも低タンパク質で あり得るので、 そのような過程を簡略化できる原料米として有用である。 また 洗米においても、 もともとのタンパク質が少ないため、'この過程も簡略化でき る。 タンパク質が少ないほうが、 デンプンの膨潤糊化が良いため、 この部分で も利用するメリットがある。
精米過程を簡略化した L G— L P' 1 3 Kと、 通常のように精米した L G C— 1で比較したところ、 風味に顕著な差は見られなかったことから、 本発明の低 タンパク質植物は、 食品産業においても有用性が示された。 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本宪明は、 この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。 本発明は、 特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解され る。 当業者は、 本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、 本発明の記載 および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解され る。 本明細書において引用した特許、 特許出願および文献は、 その内容自体が 具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参 考として援用されるべきであることが理解される。
(発明の効果）
本努明におけるプロラミン発現抑制遺伝子により、 種子中の総タンパク質含 量が減少したイネおよびその種子が得られた。 一義的な効果としては、 栄養価 に乏しいプロラミンが減少した分だけ、 相対的にアミノ酸栄養価は高まり、 タ ンパク源としての米の機能を強化し得る。 また特に日本においては、 低タンパ ク質な米が求められる場面が多いことから、一般食用、米加工品， 日本酒醸造、 腎臓病等アミノ酸摂取の絶対量が制限される疾病の治療食といった用途に有用 である。 さらには、 外来有用タンパク質を効率的に発現できるバイオリアクタ 一としても高いポテンシャルを持つ。 このように、 本発明は従来の技術では達 成できなかった、 多方面にインパクトをもたらす格別の成果である。 産業上の利用可能性
栄養価に乏しいプロラミンが減少した分だけ、 相対的にァミ 'ノ酸栄養価は高 まり、 タンパク源としての機能が強化された米を提供出来るという利点がある。 あるいは、低タンパク質な米が求められる場面において、一般食用、米加工品、 日本酒醸造、 腎臓病等ァミノ酸摂取の絶対量が制限される疾病の治療食といつ た用途に有用である。 さらには、 外来有用タンパク質を効率的に発現できるバ ィォリアクターとしても高いポテンシャルをもち、 外来有用タンパク質の機能 に由来する新規作物 （新規な形質を持つ米） の創出を通して、 米の産業的用途 の拡大に大きく貢献できる。 このように、 本発明は従来の技術では達成できな かった、 多方面にインパクトをもたらす格別の成果である。

Claims

請求の範囲
1 . プロラミンポリぺプチドをコ一ドする核酸配列に相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 % 相同な核酸配列を含む、 核酸分子。
2 . 前記プロラミンポリぺプチドをコ一ドする遺伝子配列に相補的な少な くとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列を含む、 請求項 1に記 載の核酸分子。
3 . 前記プロラミンは、 イネのものである、 請求項 1に記載の核酸分子。
4 . 前記プロラミンは、 ジャポニカ種のイネのものである、 請求項 1に記 載の核酸分子。
5 . 前記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 少なくと も 5 0の連続するヌクレオチド長である、 請求項 1に記載の核酸分子。
6 . 前記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸 配列は、 前記プロラミンポリべプチドをコ一ドする全長配列の相補配列を含む、 請求項 1に記載の核酸分子。
7 . 前記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸 配列は、 前記プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列の 5， 末端のもの である、 請求項 1に記載の核酸分子。
8 . 前記相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 5 0ヌク レオチド以下のヌクレオチド長である、 請求項 1に記載の核酸分子。
9 . 前記相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 3 0ヌク レオチド以下のヌクレオチド長である、 請求項 1に記載の核酸分子。
1 0 . 前記相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長は、 配列番号 9 8〜1 0 1からなる群より選択される 1つのアミノ酸をコードする核酸配列 のうち少なくとも 15ヌクレオチド長を有する配列を含む、 請求項 1に記載の 核酸分子。
11. 前記プロラミンは、 13 kD aプロラミンである、 請求項 1に記載 の核酸分子。
12. (a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、
19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43および 45からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列または そのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 2 2、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44お よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるァミノ配列を有するポ リぺプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
( c ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 2 2、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44お よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるァミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が、 置換、 付加および欠失からなる群より選択され る少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、 生物学的活性 を有する改変体ポリペプチドをコードする、 ポリヌクレオチド；
( d ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43および
45からなる群より選択される配列番号に示される核酸配列からなる DN Aの 対立遺伝子変異体である、 ポリヌクレオチド；
( e ) 配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 2 2、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44お よび 46からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列からなる ポリペプチドの種相同体または； レソログをコードする、 ポリヌクレオチド； (f ) (a) 〜 （e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条 件下でハイブリダイズし、 かつ生物学的活性を有するポリぺプチドをコ一ドす るポリヌクレオチド；または
(g) (a) 〜 （e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に 対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、 かつ生物学的活性 を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
に相補的な、 少なくとも 15の連続するヌクレオチド長の核酸配列を含む、 請 求項 1に記載の核酸分子。 ·
13. アンチセンス活性を有する、 請求項 1に記載の核酸分子。
14. 前記アンチセンス活性は、 前記プロラミンポリペプチドの発現を減 少させるものである、 請求項 13に記載の核酸分子。
15. プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に由来する少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相補的な少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 70% 相同な核酸配列を含む、 核酸分子
16.
(A) プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に由来する少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相補的な少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 70% 相同な核酸配列を含む核酸配列 A；および
(B) プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相捕的な少なくとも 15の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 70% 相同な核酸配列を含む核酸配列 B、
を含む、 核酸分子。 '
17. 前記核酸配列 Aと前記核酸配列 Bとは、 互いに実質的に相捕的である 部分を含む、 請求項 1 6に記載の核酸分子。
1 8 .前記核酸配列 Aと前記核酸配列 Bとは、互いに実質的に相捕的である、 請求項 1 6に記載の核酸分子。
1 9 . さらに、 スぺーサー配列を含む、 請求項 1 6に記載の核酸分子。
2 0 . 前記スぺーサー配列は、 イントロン配列を含む、 請求項 1 9に記載の 核酸分子。
2 1 . 前記スぺーサー配列は、 前記核酸配列 Aと前記核酸配列 Bとの間に含 まれる、 請求項 1 9に記載の核酸分子。
2 2 . プロラミンポリペプチドをコードする遣伝子配列に対して R N A iを 引き起こす、 因子。
2 3 . プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相捕的な少なくと も 1 5の違続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列 Bを含む、 核酸カセット。
2 4 . 外来遺伝子をコードする核酸配列をさらに含む、 請求項 2 3に記載 の核酸カセット。
2 5 . プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に由来する少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相捕的な少なくと も 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 Aをさらに含む、 請求項 2 3に記載の核酸 カセット。
2 6 . さら,に、 スぺーサー配列を含む、 請求項 2 5に記載の核酸カセット。 2 7 . 前記スぺーサー配列は、 イントロン配列を含む、 請求項 2 6に記載 の核酸カセット。
2 8 . 前記スぺーサー配列は、 前記核酸配列 Aと、 前記核酸配列 Bとの間 に含まれる、 請求項 2 6に記載の核酸カセット。
2 9 . さらに、 シグナル配列を含む、 請求項 2 5に記載の核酸カセット。
3 0 . 前記シグナル配列は 、 前記外来遺伝子の上流に配置される、 請求項 2 9に記載の核酸カセット。
3 1 . 前記シグナル配列は、 貯蔵タンパク質のシグナル配列である、 請求 項 2 9に記載の核酸カセット。
3 2 . 前記シグナル配列は、 プロラミンシグナル配列である、 請求項 2 9 に記載の核酸カセット。
3 3 . さらに、 プロモータ一配列を含む、 請求項 2 4に記載の核酸カセッ 卜。
3 4 . 前記プロモーター配列は、 前記外来遺伝子および前記核酸配列 Bの両 方に作動可能に連結される、 請求項 3 3に記載の核酸カセット。
3 5 . 前記外来遺伝子おょぴ前記核酸配列 Bの両方に、 独立して別個のプロ モーター配列が作動可能に連結される、 請求項 2 4に記載の核酸カセット。
3 6 . 前記外来遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列 （プロモー ター配列 A) と、前記核酸配列 Bに作動可能に連結されるプロモーター配列 （プ 口モーター配列 B ) とは互いに異なる、 請求項 3 5に記載の核酸カセット。
3 7 . 前記プロモーター配列 Bは、 種子に高いレベルで発現されるプロモー ター配列である、 請求項 3 6に記載の核酸カセット。
3 8 .前記プロモーター配列 Bは、貯蔵タンパク質プロモーターに由来する、 請求項 3 6に記載の核酸力セット。
3 9 . 前記プロモーター配列 Bは、 貯蔵タンパク質プロモーターに由来し、 前記プロモーター配列 Aとは異なる、 請求項 3 6に記載の核酸カセット。
4 0 . 前記プロモーター配列 Bは、 ポリュビキチンプロモーター、 2 6 kグ ロブリンプロモーター、 グノレテリン Aプロモーター、 グノレテリン Bプロモータ 一、 1 6 k D aプロラミンプロモーター、 1 3 k D aプロラミンプロモーター および 1 0 k D aプロラミンプロモーターからなる群より選択されるプロモー ターに由来する、 請求項 3 6に記載の核酸カセット。
4 1 .前記プロモーター配列 Aは、貯蔵タンパク質プロモーターに由来する、 請求項 3 6に記載の核酸カセット。
4 2 . 前記プロモーター配列 Aは、 前記核酸配列 Bに天然に付随するプロモ 一タ一配列である、 請求項 3 6に記載の核酸力セット。
4 3 . 前記プロモーター配列 Aは、 2 6 Kグロブリンプロモーター、 グルテ リン Aプロモーター、 グルテリン Bプロモーター、 1 6 k D aプロラミンプロ モーター、 1 0 k D a.プロラミンプロモーターおよび 1 3 k D aプロラミンプ 口モーターからなる群より選択されるプロモーターに由来する、 請求項 3 6に 記載の核酸カセット。
4 4 . 前記プロモーター配列 Aは、 プロラミンプロモーターである、 請求項 3 6に記載の核酸カセット。
4 5 . 前記プロモーター配列 Aは、 プロラミンプロモーターに由来し、 前記 プロモーター配列 Bは、 該プロラミンプロモーター以外のプロモーターに由来 する、 請求項 3 6に記載の核酸カセット。
4 6 . 前記外来遺伝子と前記プ口モータ一配列との間にインフレームでシ グナル配列を含む、 請求項 3 3に記載の核酸カセット。
4 7 . さらに、 ターミネータ一配列を含む、 請求項 2 5に記載の核酸カセ グ卜。
4 8 . 前記ターミネータ一配列は、 1 0 k D aプロラミンのターミネータ 一配列である、 請求項 4 7に記載の核酸カセット。
4 9 . さらに外来遺伝子を含み、 そして該外来遺伝子は、 前記核酸配列 A および前記核酸配列 Bよりも上流に存在する、 請求項 2 5に記載の核酸カセッ 卜。
5 0 . 前記核酸配列 Aと前記核酸配列 Bとの間にスぺーサー配列を含む、 請求項 4 9に記載の核酸カセット。
5 1 . 前記核酸配列 Aと前記核酸配列 Bとの間にイントロン配列を含む、 請求項 4 9に記載め核酸カセット。
5 2 . 核酸カセットを製造するための方法であって、
A) プロラミンポリべプチドをコ一ドする核酸配列に相捕的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相補的な少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくとも約 7 0 %相 同な核酸配列 Bと、 プロラミンポリペプチドをコードする核酸配列に由来する 少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列または該相捕的な 少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長を有する核酸配列に対して少なくと も約 7 0 %相同な核酸配列を含む核酸配列 Aと含むセットの上流に作動可能に プロモーター配列 Bを有し、
外来遺伝子が該プロモーター配列 Bよりも上流または下流に配置され、 該外来遺伝子には作動可能にプロモータ一配列 Aが連結されている、 核酸力 セットを提供する工程、
B ) 該核酸カセットを用いて植物を形質転換する工程；および
C) 該形質転換された植物について、 プロラミンの発現量が一部減少してい るものを選択する工程、
を包含する、 方法。
5 3 . 請求項 1に記載の核酸分子を含む、 ベクター。
5 4 . プロモーター活性を有する配列をさらに含む、 請求項 5 3に記載の ベクタ1 ~
5 5 . 前記プロモーター活性を有する配列は、 貯蔵タンパク質のプロモー ターである、 請求項 5 4に記載のベクター。
5 6 . 前記プロモーター活性を有する配列は、 前記プロラミンのプロモー ターである、 請求項 5 3に記載のベクター。
5 7 . ターミネータ一をさらに含む、 請求項 5 3に記載のベクター。
5 8 . 選択マーカーをコードする配列をさらに含む、 請求項 5 3に記載の べク々 ' ~
5 9 . 請求項 1に記載の核酸分子とは異なる外来遺伝子をコードする配列 をさらに含む、 請求項 5 3に記載のべクタ一。
6 0 . 請求項 1に記載の核酸分子を含む、 植物細胞。
6 1 . 請求項 1に記載の核酸分子とは異なる外来遺伝子をコードする核酸 分子をさらに含む、 請求項 6 0に記載の植物細胞。
6 2 . 前記プロラミンが由来する植物種と、 前記植物の種とは、 同種のも のである、 請求項 6 0に記載の植物細胞。
6 3 . 前記プロラミンが由来する植物種と、 前記植物の種とは、 同一品種 のものである、 請求項 6 0に記載の植物細胞。
6 4 . 前記プロラミンが由来する植物種および前記植物の種は、 イネであ る、 請求項 6 0に記載の植物細胞。
6 5 . 前記プロラミンが由来する植物種および前記植物の種は、 ジャポ二 力種のイネである、 請求項 6 0に記載の植物細胞。
6 6 . 2対の染色体の両方に、 請求項 1に記載の前記核酸分子が導入され た、 請求項 6 0に記載の植物細胞。
6 7 . 請求項 6 0に記載の植物細胞を含む、 植物組織。
6 8 . 請求項 1に記載の核酸分子を含む、 植物体。
6 9 . 請求項 1に記載の核酸分子とは異なる外来遺伝子をコードする核酸 分子をさらに含む、 請求項 6 8に記載の植物体。
7 0 . 前記プロラミンが由来する植物種と、 前記植物の種とは、 同種のも のである、 請求項 6 8に記載の植物体。
7 1 . 前記プロラミンが由来する植物種と、 前記植物の種とは、 同一品種 のものである、 請求項 6 8に記載の植物体。
7 2 . 前記プロラミンが由来する植物種および前記植物の種は、 イネであ る、 請求項 6 8に記載の植物体。
7 3 . 前記プロラミンが由来する植物種および前記植物の種は、 ジャポ二 力種のイネである、 請求項 6 8に記載の植物体。
7 4 . 2対の染色体の両方に、 請求項 1に記載の前記核酸分子が導入され た、 請求項 6 8に記載の植物体。
7 5 . 請求項 6 8に記載の植物体から生産された、 種子。
7 6 . 請求項 6 9に記載の植物体から生産された、 種子。
7 7 . 請求項 6 8に記載の植物体、 または請求項 7 5に記載の種子から生 産された、 デンプン調製物。
7 8 . 請求項 6 9に記載の植物体、 または請求項 7 6に記載の種子から生 産された、 前記外来遺伝子の遺伝子産物を含む、 組成物。
7 9 . 植物において種子中のタンパク質の発現量を減少させる方法であつ て、
A) 請求項 1に記載の核酸分子を提供する工程； .
B ) 該核酸分子を該植物の細胞に導入する工程；
C) 該細胞を再分化させてトランスジエニック植物を作出する工程；および
D) 該トランスジヱニック植物から種子を得る工程、
を包含する、 方法。
8 0 . 前記導入する工程は、 ァグロパクテリゥム法による、 請求項 7 9に 記載の方法。
8 1 . さらに、
E ) 前記核酸分子が導入された植物の細胞を選択する工程、
を包含する、 請求項 7 9に記載の方法。
8 2 . 前記選択する工程は、 抗生物質に対する耐性を判定することによつ て行われる、 請求項 8 1に記載の方法。
8 3 . 植物種子中で外来遺伝子を発現させる方法であって、 A) 請求項 1に記載の核酸分子を提供する工程；
B ) 該外来遺伝子をコードする核酸分子を提供する工程；
C) 該請求項 1に記載の核酸分子おょぴ該外来遺伝子をコードする核酸分子 を該植物の細胞に導入する工程；
D) 該細胞を再分化させてトランスジエニック植物を作出する工程；ならび
E) 該トランスジヱニック植物から種子を得る工程、
を包含する、 方法。
8 4 . 前記導入する工程は、 ァグロパクテリゥム法による、 請求項 8 3に 記載の方法。
8 5 . さらに、
F) 前記核酸分子が導入された植物の細胞を選択する工程、
を包含する、 請求項 8 3に記載の方法。
8 6 . 前記選択する工程は、 抗生物質に対する耐性を判定することによつ て行われる、 請求項 8 5に記載の方法。
8 7 . さらに
G ) 前記種子から前記外来遺伝子の遺伝子産物を分離する工程、
を包含する、 請求項 8 3に記載の方法。
8 8 . 請求項 8 3に記載の方法によって生産された、 前記外来遺伝子の遺 伝子産物を含む、 組成物。
8 9 . 植物において種子中のタンパク質の発現量を減少させるための、 請 求項 1に記載の核酸分子の使用。
9 0 . 植物の種子中で外来遺伝子を発現させるための、 請求項 1に記載の 核酸分子の使用。
9 1 . 前記種子中における前記植物の天然のタンパク質発現が低減してい る、 請求項 9 0に記載の使用。
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