CN102517314B - 一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体。所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P，GUS基因内含子和终止子poly(A)。还提供了另一个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD，该载体含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P，GUS基因内含子和终止子poly(A)。该载体导入玉米品种能成功获得高赖氨酸含量的玉米转基因植株，赖氨酸含量提高15-60%，转育周期只需1-2年。

Description

一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种适合单子叶植物遗传转化的含植物GUS基因内含子的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体。 

背景技术

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是研究生物发育和基因功能的一种重要工具，是通过引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（有义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，进而抑制其相应的基因表达。RNAi具有特异性、稳定性、效率高、速度快及不改变基因组的遗传组成等优点，为植物功能基因组学研究以及植物遗传改良提供了一个强有力的手段。目前，RNA干扰技术已应用于油脂和淀粉品质改良、营养成分增加与有害物质降低及抗褐化、果实耐贮性等作物品质改良研究，其中构建一种能成功转化并能达到改良目的靶基因的RNAi载体是其核心技术。

我国是一个农业大国，粮食安全始终是关系我国国民经济发展、社会稳定和国家自立的全局性重大战略问题。玉米作为我国第二大作物，不仅是重要的粮食来源，而且还是重要的饲料、工业原料，玉米生产状况在粮食安全体系中具有举足轻重的作用。在我国以玉米为支柱产业的饲料工业中，由于玉米籽粒的赖氨酸含量低，在配、混合饲料中必须添加饲料添加剂赖氨酸，才能满足畜禽生长发育的需要，但这些饲料添加剂目前主要依靠进口，因此饲料品质不高特别是赖氨酸含量偏低是目前我国畜牧业发展的主要限制因素之一。另一方面，我国部分省份特别是贫困山区的人群仍以玉米为主食，其营养物质主要依赖于玉米，但目前生产上种植的玉米大多是普通玉米，营养品质较差，缺乏人体及单胃动物生长发育必需的赖氨酸、色氨酸等。

玉米籽粒的蛋白质含量为10%左右，其中50-60％为人畜不能吸收利用的醇溶蛋白。国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）在20世纪70年代开始利用隐性突变基因Opaque-2（o2）及其修饰基因将醇溶蛋白含量由55.1%降至22.9%，使赖氨酸含量水平达普通玉米的2倍，进而选育了大批高赖氨酸玉米即优质蛋白玉米并在全世界广泛应用（谭静等.优质蛋白玉米育种研究进展.玉米科学 2006, 14(5):15-19），但该方法转育周期长(7-10年)、效率低、预见性差，加之选育出的高赖氨酸玉米胚乳呈软质及抗病性差等问题，已越来越不适应现代育种目标的需要。研究表明，由于醇溶蛋白特别是22-kD和19-kD醇溶蛋白基因的表达对赖氨酸含量有显著的负面效应，然而传统的育种方法难于找到理想的优质种质，获得赖氨酸含量高而醇溶蛋白低表达的玉米品种难度很大，主要原因在于其表型鉴定即赖氨酸含量测定需要使用高压液相色谱（HPLC）进行分析，由于HPLC运行成本很高，很难在大规模种质筛选及新品种选育过程中的大批量后代选择中广泛应用。因此，如果能通过RNA干扰技术，构建RNAi载体并转化获得赖氨酸含量高而醇溶蛋白低表达的转基因玉米，将是一种简便，快捷和有效的途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术（利用o2基因及其修饰基因转育获得醇溶蛋白含量低而赖氨酸含量高的玉米品种）转育周期长、效率低、预见性差，以及用现有技术选育出的高赖氨酸玉米品种由于o2基因的连锁效应导致其籽粒呈软质胚乳及抗病性差等缺陷和不足，其目的是提供一种能抑制玉米醇溶蛋白的表达，提高赖氨酸含量水平的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体。

本发明提供了两个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD和pUC19-RNAi-19KD，将两个载体分别导入玉米品种中，成功获得了高赖氨酸含量的玉米转基因植株，在所有转基因植株中，有40-50%的植株其赖氨酸含量得到了提高，与非转基因玉米植株相比，转基因玉米的籽粒赖氨酸含量提高了15-60%，与现有常规育种技术培育的高赖氨酸玉米品种相比，赖氨酸含量有同等水平的提高或稍高于常规育种技术培育的高赖氨酸玉米，并且与常规育种（5-7年）相比，转育周期显著缩短，只需1-2年。此外本发明通过RNA干扰技术调节玉米醇溶蛋白的合成，解决了常规育种中利用o2基因选育的高赖氨酸玉米品种胚乳呈软质及抗病性差等关键问题。本发明实现了利用RNA干扰原理创制高赖氨酸含量玉米新材料的目的，对玉米品质改良具有重要意义。本发明RNAi载体的获得一方面，通过在构建的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体上加入GUS基因内含子，提高了RNAi载体的沉默效率；另一方面，比常规RNAi载体的获得缩短了载体构建的时间，提高了效率。常规RNAi载体的构建方法是按启动子、正向目的片段、一段不表达序列、反向目的片段、终止子poly(A)的顺序逐一连接到骨架载体上，本发明RNAi载体的构建将启动子和正向目的片段、反向目的片段和终止子poly(A)分别连接在骨架载体pUC19上，然后再将两个载体进行酶切和连接，进而将反向目的片段和终止子poly(A)插入到含有启动子和正向目的片段的重组载体上。由于两个中间载体可同时构建，因此缩短了载体构建的时间，提高了效率。

本发明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD是在骨架载体pUC19上含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，胚乳特异表达启动子P-zp22/6位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的酶切位点SacⅠ和SmaⅠ间；正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的酶切位点SmaⅠ和XbaⅠ间；反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的酶切位点XbaⅠ和XhoⅠ间；在正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P之间含有GUS基因内含子， GUS基因内含子位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的XbaⅠ酶切位点间；终止子poly(A)位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD酶切位点HindⅢ和XhoⅠ间；所述的胚乳特异表达启动子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P 的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述GUS基因内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述终止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。所构建的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的图谱如图8所示。

上述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD还可以按以下方法构建获得：

（1）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6 

①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得

以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的特异启动子p引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:3所示序列的胚乳特异性表达启动子P-zp22/6；

②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6

用SacⅠ和XbaⅠ酶切步骤（1）①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子，然后与同样经SacⅠ和XbaⅠ酶切的骨架载体pUC19连接，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6；

（2）构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-22KD1

①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的获得

以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的R22-6引物对，进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的R22-7引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID NO:8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P；

②构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-22KD1

用SmaⅠ和XbaⅠ双酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切的步骤（1）②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-22KD1；

（3）构建插入反向目的片段22-KD-P的重组载体pUC19-22KD2

用HindⅢ和XbaⅠ酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重组载体pUC19-22KD2；

（4）构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)

以表达载体p3301 DNA为模板，用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列的终止子poly(A)的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:11所示序列的终止子poly(A)；进一步用XhoⅠ和HindⅢ双酶切带有相应酶切位点的终止子poly(A)，然后与同样经XhoⅠ和HindⅢ双酶切的步骤（3）得到的重组载体pUC19-22KD2连接，得到含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)； 

（5）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)

将步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-22KD1和步骤（4）构建的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，然后将含有反向目的片段22-KD-P和终止子poly(A)的酶切产物22KD2-poly(A)连接到步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-22KD1上，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)； 

（6）GUS基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的构建

以质粒载体pGreen-0229 Backbone DNA为模板，用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的GUS基因内含子的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:14所示的GUS基因内含子；进一步用XbaⅠ单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经XbaⅠ单酶切后磷酸化处理的步骤（5）构建的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

本发明所提供的另一个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD是在骨架载体pUC19上含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，胚乳特异表达启动子P-zp22/6位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的酶切位点SacⅠ和SmaⅠ间；正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的酶切位点SmaⅠ和XbaⅠ间；反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的酶切位点XbaⅠ和XhoⅠ间；在正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P之间含有GUS基因内含子，GUS基因内含子位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的XbaⅠ酶切位点间；终止子poly(A)位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD酶切位点HindⅢ和XhoⅠ间；所述胚乳特异表达启动子zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P 的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述GUS基因内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述终止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。所构建的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的图谱如图9所示。

本发明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD还可以按以下方法构建获得：

（1）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6 

①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得

以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的特异启动子p引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:3所示序列的胚乳特异性表达启动子P-zp22/6；

②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6序列的重组载体pUC19-p22/6

用SacⅠ和XbaⅠ酶切步骤（1）①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子，然后与同样经SacⅠ和XbaⅠ酶切的骨架载体pUC19连接，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6；

（2）构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-19KD1

①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的获得

以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示序列的R19-4引物对，进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示序列的R19-5引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID NO:20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P；

②构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-19KD1

用SmaⅠ和XbaⅠ双酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切的步骤（1）②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-19KD1；

（3）构建插入反向目的片段19-KD-P的重组载体pUC19-19KD2

用HindⅢ和XbaⅠ酶切步骤（2）①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重组载体pUC19-19KD2；

（4）构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)

以表达载体p3301 DNA为模板，用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的终止子poly(A)的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:11所示的终止子poly(A)；进一步用XhoⅠ和HindⅢ双酶切带有相应酶切位点的终止子poly(A)，然后与同样经XhoⅠ和HindⅢ双酶切的步骤（3）得到的重组载体pUC19-19KD2连接，得到含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)； 

（5）构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)

将步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-19KD和步骤（4）构建的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，然后将含有反向目的片段19-KD-P和终止子poly(A)的酶切产物19KD2-poly(A)连接到步骤（2）构建的重组载体pUC19-p22/6-19KD1上，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)； 

（6）GUS基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的构建

以质粒载体pGreen-0229 Backbone DNA为模板，用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列的GUS基因内含子的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO:14所示序列的GUS基因内含子；进一步用XbaⅠ单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经XbaⅠ单酶切后磷酸化处理的步骤（5）构建的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:21所示。

序列表中SEQ ID NO:1所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD或RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的特异启动子p引物的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:2所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD或RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的特异启动子p引物的下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:3所示的是胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:4所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-6引物的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:5所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-6引物的下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:6所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-7引物的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:7所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-7引物的下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:8所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:9所示的是终止子poly(A)的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:10所示的是终止子poly(A)下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:11所示的是终止子poly(A)的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:12所示的是GUS基因内含子的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:13所示的是GUS基因内含子的下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:14所示的是GUS基因内含子的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:15所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:16所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-4引物的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:17所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-4引物的下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:18所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-5引物的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:19所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-5引物的下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:20所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:21所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:22所示的是RNAi载体pUC19-RNAi-22KD转化T₀代再生植株的PCR检测22Y3引物的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:23所示的是RNAi载体pUC19-RNAi-22KD转化T₀代再生植株的PCR检测22Y3引物的下游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:24所示的是RNAi载体pUC19-RNAi-19KD转化T₀代再生植株的PCR检测19Y5引物的上游引物序列。

序列表中SEQ ID NO:25所示的是RNAi载体pUC19-RNAi-19KD转化T₀代再生植株的PCR检测19Y5引物的下游引物序列。

附图说明

图1是RNAi载体pUC19-RNAi-22KD或pUC19-RNAi-19KD的构建示意图。

图2是胚乳特异表达的启动子P-zp22/6的PCR鉴定结果，

泳道M. DNA marker，1. 胚乳特异表达的启动子P-zp22/6的PCR产物。

图3是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的PCR鉴定结果，

泳道M. DNA Marker，1. 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的PCR产物。

图4是终止子poly(A)的PCR鉴定结果，泳道M. DNA Marker，1. 终止子poly(A)的PCR产物。

图5是GUS基因内含子的PCR鉴定结果，

泳道M. DNA marker，1. GUS基因内含子的PCR产物。

图6是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的PCR鉴定结果，

泳道M. DNA Marker，1. 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的PCR产物。

图7是RNAi载体pUC19-RNAi-22KD和pUC19-RNAi-19KD的酶切检测，

A是pUC19-RNAi-22KD酶切分析，B是pUC19-RNAi-19KD酶切分析；泳道M. DNA Marker，1和5: XbaⅠ和HindⅢ双酶切，2和6: XbaⅠ单酶切，3和7: SacⅠ和XbaⅠ双酶切，4和8: SacⅠ和HindⅢ双酶切。

图8是pUC19-RNAi-22KD载体图谱。

图9是pUC19-RNAi-19KD载体图谱。

图10是玉米胚性愈伤组织。

图11是以pUC19-RNAi-19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体基因枪转化后的愈伤组织。

图12是以pUC19-RNAi-19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体基因枪转化后愈伤组织的再生。

图13是以pUC19-RNAi-19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体转化后分化小苗的壮苗培养。

图14是以pUC19-RNAi-19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体转化得到的T₀代转基因植株的田间表现。

图15是以pUC19-RNAi-19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体转化得到的T₀代转基因植株的结实情况。

图16是pUC19-RNAi-22KD载体转化的T₀代转基因植株的PCR鉴定，

泳道M. DNA Marker，CK+：阳性对照（pUC19-RNAi-22KD干扰载体扩增），CK-：阴性对照（B73非转基因植株扩增），CK：空白对照（水为模板），1-9：T₀代转基因植株扩增。

图17是pUC19-RNAi-19KD载体转化的T₀代转基因植株的PCR鉴定，

泳道M. DNA Marker，CK+：阳性对照（pUC19-RNAi-19KD干扰载体扩增），CK-：阴性对照（B73非转基因植株扩增），CK：空白对照（水为模板），1-7：T₀代转基因植株扩增。

具体实施方式

实验中所用的各种试剂均可从商业渠道购买，实验中使用的骨架载体pUC19、质粒载体pGreen-0229 Backbone、表达载体P3301、T载体及质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、Marker、高保真DNA聚合酶、dNTPs、大肠杆菌DH5α感受态细胞和bar基因均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶、T4-DNA连接酶购自美国NEB公司；氨苄青霉素、IPTG、X-gal等试剂均购自大连宝生物工程有限公司；RQ DNA酶、逆转录酶、5×反应缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂购自Promega公司；其他化学试剂为国产分析纯；基因枪PDS-1000/He及其消耗品购自Bio-Rad公司。核苷酸测序均由华大基因公司完成。所用的引物序列均由北京奥科生物技术公司合成。实验中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1  玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的构建

一、供试材料：玉米（Zea mays L.）自交系B73，是目前广泛应用于玉米遗传研究及育种实践的玉米种质，能够从种子公司（如云南田瑞种业有限公司，地址：云南省昆明市北郊龙头街）直接购买。

二、实验方法：

1、B73玉米基因组DNA的提取

1）取玉米叶片300 mg，加液氮充分研磨；

2）加入700 μl 65℃预热的2%CTAB提取液，轻轻混匀；

3）置于65℃水浴30-60 min；

4）室温放置2 min，加入300 μl氯仿-异戊醇（24:1），充分震荡1-2 h；

5）10,000 rpm离心10 min； 

6）取上层水相至新的离心管中，加入600 μl异丙醇，室温放置10 min；

7）10,000 rpm离心1 min，弃上清； 

8）加入75%的乙醇500 μl，室温放置30 min； 

9）重复步骤7和8； 

10）10,000 rpm离心30 s，弃上清，自然干燥DNA； 

11）加入100 μl TE缓冲液溶解DNA；

12）检测后分装，-70℃保存。

2）反应条件：95℃预变性5 min，（95℃变性50 s，57℃退火50 s，72℃延伸1 min）35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

3、B73玉米籽粒总RNA的提取

1）取自交授粉后18天的玉米籽粒50-100 mg，用液氮充分研磨；

2）加入1 ml Trizol试剂，剧烈震荡混匀；

3）12,000 rpm离心10 min，取上清；

4）加入200 μl氯仿，剧烈震荡混匀，冰浴3 min；

5）12,000 rpm离心15 min（4℃）；

6）取上层水相至新的离心管中，加入等量体积的异丙醇，-20℃放置10 min；

7）12,000 rpm离心15 min（4℃），弃上清，加入700μl 70%乙醇洗涤沉淀；

8）8,000 rpm离心10 min（4℃），弃上清；

9）沉淀用30 μl DEPC-H₂O溶解；

10）1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA。

4、RNA反转录体系

反应体系：玉米籽粒总RNA 8 μl，加入1 μl RQ DNA酶和1 μl RQ缓冲液，37℃水浴30 min，取出后置于冰上，加入1 μl RQ 终止缓冲液， 65℃水浴10 min；然后取出9 μl 作为RNA模板，加入OligodT 1 μl，混匀后置于70℃水浴5 min，然后冰上冷却2 min；再加入5倍RT MLV缓冲液4 μl，10 mM dNTP 4 μl，RNA酶抑制剂1 μl（20U），M-MLV反转录酶1 μl（200U），42℃水浴1 h；72℃灭活10 min，冰浴10 min，于-20℃保存。

反应条件：94℃预变性5 min，（94℃变性40 s，59℃退火45 s，72℃延伸1 min）35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

7、连接产物向大肠杆菌的转化

1）取感受态细胞DH5α100 μl，加入T载体连接物2 μl，冰浴30 min；

2）42℃水浴热激90 s，立即置于冰上2 min；

3）加入500 μl LB培养基，在37℃条件下200×g摇1 h；

4）3500×g离心1 min，静置1 h后弃部分上清；

5）加入5 μl ZPTG和50 μl X-Gal；

6）涂板、封口；

7）37℃培养16 h；

8）挑白色单菌落，37℃进行摇菌。

8、重组载体DNA的提取

用北京全式金生物技术有限公司质粒提取试剂盒提取，步骤如下：

 1）取4 ml过夜培养的细菌10,000×g离心1 min；

2）加入250 μl无色RB（含RNase A），震荡悬浮细菌沉淀；

3）加入250 μl蓝色LB，不超过5 min；

4）加入350 μl黄色NB，室温静置2 min；

5）15,000×g离心5 min，取上清加入吸附柱中；

6）15,000×g离心1 min，弃流出液；

7）加入650 μl溶液WB，15,000×g离心1 min，弃流出液；

8）15,000×g离心2 min，彻底去除残留的WB；

9）将吸附柱置于干净的离心管中，在柱中加入50 μl 70℃预热的EB或去离子水（pH>7.0）室温静置1 min；

10）10,000×g离心1 min，洗脱DNA，于-20℃保存。

9、重组载体DNA的酶切

10、酶切片段回收与连接

用胶回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）回收酶切片段，具体操作步骤如下： 

1）切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，称重；

2）加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴10 min；

3）待凝胶溶液降至室温，加入吸附柱中静置1 min，10,000×g离心1 min，弃流出液；

4）加入650 μl溶液WB，10,000×g离心1 min，弃流出液；

5）10,000×g离心2 min，去除残留的WB；

6）将吸附柱置于离心管中，在柱中加入50 μl 70℃预热EB或去离子水，室温静置1 min；

7）10,000×g离心1 min，洗脱DNA；

 8）酶切回收产物与pUC19载体片段的连接，反应体系及条件如下：

反应条件：轻轻混合后65℃水浴反应5 min，立即置于冰上1 min，然后加入1.5 μl连接缓冲液和0.5 μl T4连接酶，16℃过夜连接。

11、 重组载体的鉴定

1）PCR鉴定

反应体系和条件见二、2；根据PCR检测结果，取阳性克隆加入含有抗生素的LB液体培养基，在37℃条件下200×g摇1 h；然后取1 ml菌液送北京华大基因生物技术有限责任公司测序，测序结果用seqMan软件进行序列分析；在NCBI数据库中对转化大肠杆菌的目标片段分别与玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD或pUC19-RNAi-19KD的序列进行同源性比对。

2）酶切鉴定

方法同实施例1二步骤9。

以下各步骤涉及对玉米品种B73的基因组及重组载体DNA进行PCR扩增，对B73玉米籽粒总RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物的T载体连接，构建各载体的连接反应体系和反应条件均按上述操作步骤进行。

三、胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得

1、设计胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的p引物

据Segal等（A new opaque variant of maize by a single dominant RNA-interference-inducing transgene. Genetics 2003, 165: 387-397）报道，P-zp22/6是胚乳特异性表达基因zp22/6的启动子。本实验首先在MaizeGDB数据库（http://www.maizegdb.org/）中找到zp22/6基因的mRNA，以此mRNA为基序在Genbank（登录号为AC144719.1）中找到对应的zp22/6基因组DNA序列及相应的编码区，编码区前1.3 kb的序列即为该基因的启动子。为找到完整的启动子选择编码区前1.5 kb长的序列作为靶序列，并根据pUC19载体上存在的多克隆位点分析，利用SacⅠ和XbaⅠ可以将胚乳特异性表达启动子P-zp22/6连接到pUC19载体，因此用Primer5软件设计了下列带酶切位点的P-zp22/6的引物序列（简称特异启动子p引物）：

 

 2、胚乳特异表达启动子P-zp22/6序列的获得

以B73玉米基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1（上游引物）和SEQ ID NO:2（下游引物）为引物对，进行PCR扩增（扩增结果见图2），得到5'端引入SacⅠ酶切位点、3'端引入XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点的胚乳特异性表达启动子P-zp22/6片段；然后将此P-zp22/6片段与T载体连接并对其测序，测序结果表明5'端和3'端所引入酶切位点确为SacⅠ酶切位点、XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点；

3、验证：在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BALST上，登录号为AC144719.1）对步骤三、2的测序结果进行比对验证，发现除5'端、3'端引入酶切位点外，测序结果与GeneBank中相应序列的相似性达100%，表明所克隆片段确为胚乳特异表达启动子P-zp22/6序列。所述胚乳特异表达启动子P-zp22/6序列如SEQ ID NO:3所示。

四、构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6 

将步骤三P-zp22/6片段与T载体连接得到的测序质粒用SacⅠ和XbaⅠ酶切，然后与同样经SacⅠ和XbaⅠ酶切的载体pUC19连接，得到含有胚乳特异性表达启动子zp22/6的重组载体pUC19-p22/6。

五、22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的获得

1、设计22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的引物

根据Segal等（A new opaque variant of maize by a single dominant RNA-interference-inducing transgene. Genetics 2003, 165: 387-397）发表的22-KD醇溶蛋白基因的22-KD引物序列及重组载体pUC19-p22/6和骨架载体pUC19的多克隆位点分析，利用SmaⅠ和XbaⅠ可以将目的基因的正向片段连接到pUC19-p22/6载体，而利用HindⅢ和XbaⅠ可以将目的基因的反向片段连接到pUC19载体，因此设计了下列带酶切位点的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的引物序列（简称R22-6引物和R22-7引物）：

 

 2、22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的获得

以B73玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO:4（上游引物）和SEQ ID NO:5（下游引物）为引物对，进行RT-PCR扩增，得到在5'端和3'端分别引入SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的22-KD-P片段；以此片段为模板，以SEQ ID NO:6（上游引物）和SEQ ID NO:7（下游引物）为引物对，进行RT-PCR扩增（扩增结果见图3），得到在3'端进一步引入了HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的300 bp左右的22-KD-P片段；将此引入酶切位点的22-KD-P片段连接至T载体并测序，测序结果表明已成功地在22-KD-P片段3'端引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，在其5'端引入SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点；

3、验证：在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BALST上，登录号为FL392908.1）对此22-KD-P片段的测序结果进行比对，发现除5'端、3'端引入上述酶切位点外，测序结果与GeneBank中相应序列的相似性达99%，证明该序列确为22-KD醇溶蛋白基因的22-KD-P片段，可用于RNAi载体构建。所述22-KD醇溶蛋白基因的22-KD-P片段序列如SEQ ID NO:8所示。

六、在含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6中正向插入22-KD-P片段

将步骤五22-KD-P片段与T载体连接得到的测序质粒用SmaⅠ和XbaⅠ酶切，然后与同样经SmaⅠ和XbaⅠ酶切的步骤四得到的pUC19-p22/6重组载体连接，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6并正向插入22-KD-P片段的重组载体pUC19-p22/6-22KD1。

七、构建反向插入22-KD-P片段的重组载体pUC19-22KD2

将步骤五22-KD-P片段与T载体连接得到的测序质粒用HindⅢ和XbaⅠ酶切，然后与同样经HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19载体连接，得到反向插入22-KD-P片段的重组载体pUC19-22KD2。

八、构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)

1、设计终止子poly(A)的引物

根据表达载体p3301的终止序列（http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html）和重组载体pUC19-22KD2上存在的多克隆位点分析，利用XhoⅠ和HindⅢ可以将终止子poly(A)连接到pUC19-22KD2载体，因此用Primer5软件设计了下列带酶切位点的终止子poly(A)引物序列：

 

2、终止子poly(A)的获得

以p3301表达载体DNA为模板，以SEQ ID NO:9（上游引物）和SEQ ID NO:10（下游引物）为引物对，进行PCR扩增（扩增结果见图4），得到5'端引入XhoⅠ酶切位点、3'端引入HindⅢ酶切位点的终止子poly(A)；将此片段连接至T载体并测序，测序结果表明5'端和3'端所引入酶切位点确为XhoⅠ和HindⅢ酶切位点；

3、验证：对终止子poly(A)的测序结果与p3301中相应序列进行比对，二者相似性达100%，证明所得序列为p3301表达载体中的终止子序列。所述终止子poly(A)序列如SEQ ID NO:11所示。

4、将步骤八2终止子poly(A)与T载体连接得到的测序质粒用XhoⅠ和HindⅢ酶切，然后与同样经XhoⅠ和HindⅢ酶切的步骤七得到的重组载体pUC19-22KD2连接，得到插入反向插入22-KD-P片段并含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)。

九、构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正向22-KD-P片段、反向22-KD-P片段和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)

将步骤六得到的重组载体pUC19-p22/6-22KD1和步骤八得到的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，然后将含有反向22-KD-P片段和终止子poly(A)的酶切产物22KD2-poly(A)连接到重组载体pUC19-p22/6-22KD1，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6、正向22-KD-P片段、反向22-KD-P片段和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)。

十、GUS基因内含子的获得

1、设计GUS基因内含子的引物

根据pGreen-0229 Backbone载体的GUS基因序列（http://www.pgreen.ac.uk/JIT/pG0229.ht）和重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A) 上存在的多克隆位点分析，利用XbaⅠ酶切位点可以将GUS基因内含子连接到pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)载体，因此用Primer5软件设计了下列带酶切位点的GUS基因内含子的引物序列：

2、GUS基因内含子的获得

以pGreen-0229 Backbone载体DNA为模板，以SEQ ID NO:12（上游引物）和SEQ ID NO:13（下游引物）为引物对，进行PCR扩增（扩增结果见图5），得到5'和3'均端引入XbaⅠ酶切位点的GUS基因内含子；将此片段连接至T载体并测序，测序结果表明5'端和3'端所引入酶切位点确为XbaⅠ酶切位点；

3、验证：对GUS基因内含子的测序结果与http://www.pgreen.ac.uk/JIT/pG0229.htm网站上pGreen-0229 Backbone载体的相应序列进行比对，发现二者相似性达100%，证明所得序列为GUS基因内含子序列。所述GUS基因内含子序列如SEQ ID NO:14所示；

十一、构建本发明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD

1、构建玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD

将步骤十GUS基因内含子与T载体连接得到的测序质粒用XbaⅠ单酶切，然后与同样经XbaⅠ单酶切后磷酸化处理的重组载体pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)连接，得到本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD； 

2、玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的验证

将含有玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的菌液送到华大基因公司进行核苷酸序列测序，测序结果表明已成功地构建了玉米醇溶蛋白基因RNAi载体，命名为pUC19-RNAi-22KD；同时根据载体构建流程，用酶切位点相应的酶进行酶切检测（如图7A所示）结果表明pUC19-RNAi-22KD载体构建完毕。所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、结构如图8所示。

通过在骨架载体pUC19的酶切位点SacⅠ和SmaⅠ间插入胚乳特异表达启动子P-zp22/6，在SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点间正向插入目的片段22-KD-P，在酶切位点XbaⅠ和XhoⅠ间反向插入目的片段22-KD-P，同时在正向22-KD-P片段与反向22-KD-P片段之间插入GUS基因内含子、在酶切位点HindⅢ和XhoⅠ间插入终止子poly(A)，成功构建了本实施例所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD；所述的胚乳特异表达启动子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P 的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述的GUS基因内含子的核苷酸序列SEQ ID NO:14所示，所述的终止子poly(A)的核苷酸序列SEQ ID NO:11所示；所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、图谱如图8所示。

实施例2、玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的构建

所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的构建除以下步骤不同外，其余步骤与实施例1相同，不再赘述。

一、胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得，方法与实施例1相同。

二、构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6，方法与实施例1相同。

三、19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的获得

1、设计19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的引物

在数据库MaizeGDB中找到19-KD基因的mRNA序列，以此mRNA为基序在Genebank（登录号为AC196717.3）上比对找到对应的19-KD基因组DNA序列，对此序列及重组载体pUC19-p22/6和骨架载体pUC19的多克隆位点分析，利用SmaⅠ和XbaⅠ可以将目的基因的正向片段连接到pUC19-p22/6载体，而利用HindⅢ和XbaⅠ可以将目的基因的反向片段连接到pUC19载体，因此设计了下列带酶切位点的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的引物（简称R19-4引物和R19-5引物）： 

2、19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的获得

以B73玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO:16（上游引物）和SEQ ID NO:17（下游引物）为引物对，进行RT-PCR扩增，得到在5'端和3'端分别引入SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的19-KD-P片段；以此片段为模板，以SEQ ID NO:18（上游引物）和SEQ ID NO:19（下游引物）为引物对，进行RT-PCR扩增（扩增结果见图6），得到在3'端进一步引入了HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的300 bp左右的19-KD-P片段；将此引入酶切位点的19-KD-P片段连接至T载体并测序，测序结果表明已成功地在19-KD-P片段3'端引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，在5'端引入SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点；

3、验证：在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BALST上，登录号为FM187060.1）对此19-KD-P片段的测序结果进行比对，发现除5'端、3'端引入酶切位点外，测序结果与GeneBank中相应序列的相似性达99%，证明该序列确为19-KD醇溶蛋白基因的19-KD-P片段，可用于RNAi载体构建。所述19-KD醇溶蛋白基因的19-KD-P片段序列如SEQ ID NO:20所示。

四、在含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6中正向插入19-KD-P片段

将本实施例步骤三19-KD-P片段与T载体连接得到的测序质粒用SmaⅠ和XbaⅠ酶切，然后与同样经SmaⅠ和XbaⅠ酶切的本实施例步骤二得到的pUC19-p22/6重组载体连接，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6并正向插入19-KD-P片段的重组载体pUC19-p22/6-19KD1。

五、构建反向插入19-KD-P片段的重组载体pUC19-19KD2

将本实施例步骤三19-KD-P片段与T载体连接得到的测序质粒用HindⅢ和XbaⅠ酶切，然后与同样经HindⅢ和XbaⅠ酶切的pUC19载体连接，得到反向插入19-KD-P片段的重组载体pUC19-19KD2。

六、构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)

1、终止子poly(A)的引物设计，终止子poly(A)的获得及验证，方法均与实施例1相同；

2、将本实施例步骤六1获得的终止子poly(A)与T载体连接得到的测序质粒用XhoⅠ和HindⅢ酶切，然后与同样经XhoⅠ和HindⅢ酶切的本实施例步骤五得到的重组载体pUC19-19KD2连接，得到反向插入19-KD-P片段并含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)。

七、构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正向19-KD-P片段、反向19-KD-P片段和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)

将本实施例步骤四得到的重组载体pUC19-p22/6-19KD1和步骤六得到的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，然后将含有反向19-KD-P片段和终止子poly(A)的酶切产物19KD2-poly(A)连接到重组载体pUC19-p22/6-19KD1，得到含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6、正向19-KD-P片段、反向19-KD-P片段和终止子poly(A)的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)。

八、GUS基因内含子的获得，方法与实施例1相同。

九、构建本发明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD

1、构建玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD

将本实施例步骤八GUS基因内含子与T载体连接得到的测序质粒用XbaⅠ单酶切，然后与同样经XbaⅠ单酶切后磷酸化处理的重组载体pUC19-p22/6-19KD1-19KD2-poly(A)连接，得到本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD； 

2、玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的验证

将含有玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的菌液送到华大基因公司进行核苷酸序列测序，测序结果表明已成功地构建了玉米醇溶蛋白基因RNAi载体，命名为pUC19-RNAi-19KD；同时根据载体构建流程，用酶切位点相应的酶进行酶切检测（如图7B所示）结果表明pUC19-RNAi-19KD载体构建完毕。所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示、结构如图9所示。

通过在骨架载体pUC19的酶切位点SacⅠ和SmaⅠ间插入胚乳特异表达启动子P-zp22/6，在SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点间正向插入目的片段19-KD-P，在酶切位点XbaⅠ和XhoⅠ间反向插入目的片段19-KD-P，同时在正向19-KD-P片段与反向19-KD-P片段之间插入GUS基因内含子、在酶切位点HindⅢ和XhoⅠ间插入终止子poly(A)，成功构建了本实施例所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD；所述的胚乳特异表达启动子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P 的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述的GUS基因内含子的核苷酸序列SEQ ID NO:14所示，所述的终止子poly(A)的核苷酸序列SEQ ID NO:11所示；所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示、图谱如图9所示。

用上述方法构建获得的本发明RNAi载体是以对玉米赖氨酸含量具有重要决定作用的醇溶蛋白为对象，采用先分段构建中间载体，再将各中间载体连接，最后插入内含子的方式，即将特异性启动子和正向目的片段构建到同一个骨架载体pUC19上；同时在另一个pUC19上插入反向目的片段和终止子poly(A)；再将反向目的片段和终止子poly(A)插入到含有启动子和正向目的片段的重组载体上；最后插入GUS基因内含子构成本发明所述的RNAi载体；由于22-KD和19-KD醇溶蛋白基因均是胚乳特异性表达，因此本发明中克隆了一个特异性启动子，然后插入RNAi载体上。用该方法构建的RNAi载体其优点主要包括：1）通过加入GUS基因内含子，提高RNAi载体的沉默效率；2）常规RNAi载体的构建方法是按启动子、正向目的片段、一段不表达序列、反向目的片段、终止子poly(A)的顺序逐一连接到骨架载体上，本RNAi载体的构建将启动子和正向目的片段、反向目的片段和终止子poly(A)分别连接在骨架载体pUC19上，然后再将两个载体进行酶切和连接，进而将反向目的片段和终止子poly(A)插入到含有启动子和正向目的片段的重组载体上。由于两个中间载体可同时构建，因此缩短了载体构建的时间，提高了效率。

实施例3  本发明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体在提高玉米品种赖氨酸含量中的应用

应用本发明的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD或pUC19-RNAi-19KD分别转化玉米品种，均使其籽粒赖氨酸含量水平得到较大提高，达到了改良玉米品质的目的。

一、供试材料

玉米（Zea mays L.）杂交种H99×HiⅡB（购于北京中农大康科技开发有限公司）。在人工自交授粉后18 d，取果穗依次用70%的乙醇、2.5%次氯酸钠和灭菌水消毒，在无菌条件下挑取长度约10-1.2 mm的幼胚。

二、培养基

玉米胚性愈伤组织的诱导、继代、基因枪转化、转化后愈伤的筛选和再生植株分化等所用培养基如表1所示，于121℃高压灭菌20 min。

注：大量元素、微量元素、铁盐、有机物的配方按N6基本配方配制（朱至清等.通过氮源比较试验建立一种较好的水稻花药培养基．中国科学 1975, (5):484-490），PH调至5.8。

三、幼胚培养

1、将幼胚置于培养基A（表1）上，于27-28℃条件下暗培养3-4周，形成愈伤组织，如图10所示；

2、取长势好、组织疏松、淡黄色、胚性好的愈伤组织，于27-28℃条件下继代培养，每2-3周继代一次，所得愈伤组织作为基因枪转化的受体材料；

3、在基因枪轰击前4 h，将愈伤组织切成2 mm大小并转移到培养基B（表1）上待用。

四、基因枪转化

1、基因枪微弹的准备和转化

1）按照 Klein 等（High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 1987, 327: 70-73）的方法制备金粉悬浮液（金粉直径1.0 μm）；

2）取4℃保存的金粉悬浮液（60 mg/ml）33 μl，依次加入4 μl质粒 DNA（1 μg/μl），50 μl CaCl₂（2.5 mol/L），20 μl亚精胺（0.1 mol/L），振荡5 min，室温静置10 min，使DNA沉淀到微粒载体上；

3）12,000 rpm 离心 3 s，弃上清，加 入200 μl 100%乙醇漂洗沉淀，12,000 rpm 离心 3 s，弃上清，加入 50 μl 100%乙醇，低速震荡保持悬浮状态，每枪取 12.5 μl 制备好的 DNA 金粉悬浮液均匀涂在微弹载体上，晾干备用；

4）利用SacⅠ和HindⅢ把构建的干扰目的基因从pUC19-RNAi-22KD或pUC19-RNAi-19KD载体上酶切下来后收集，然后和bar基因按3:1的比例混合，采用基因枪轰击的方法把目的基因转入到受体中，转基因事件统计见表2。

2、愈伤组织的筛选和植株再生

1）基因枪轰击后，将基因枪转化的愈伤组织置于培养基B上，于28℃条件下暗培养过夜，然后转移到培养基A上28℃恢复培养5-7天；

2）将愈伤组织转移培养基C上，于28℃条件下继代培养，2周继代一次，选择色泽正常、分化良好的愈伤组织（如图11所示）继代培养，继代3-4次；

3）将愈伤组织转移到分化培养基D上，在16 h光照/8 h黑暗条件下，于28℃条件下培养培养2周，有绿点出现；

4）当愈伤组织分化的芽长至约1-2 cm时（如图12所示），转移至培养基E中继续培养；

5）在3-4叶期选择根系发达的小苗（如图13所示），用温水洗去培养基，在温室移栽入土，2周后移栽到田间种植，如直至开花结实（如图14所示）。

五、T₀代再生植株的PCR检测

1、设计T₀代植株PCR检测引物

分别以SEQ ID NO:15所示的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD和SEQ ID NO:21所示的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列为靶序列，利用Primer5软件分别设计了SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示序列的T₀代植株PCR检测22Y3引物对和19Y5引物对；

2、pUC19-RNAi-22KD载体T₀代再生植株的PCR检测

提取pUC19-RNAi-22KD载体转化得到的T₀代再生植株（90个）的基因组DNA（方法同实施例1、二、1），提取pUC19-RNAi-22KD载体的DNA（方法同实施例1、二、9），分别以转基因植株籽粒DNA、pUC19-RNAi-22KD载体的DNA（CK+）、玉米品种B73非转基因植株籽粒DNA（CK-）、空白水（CK）作为模板，以SEQ ID NO:22（22Y3上游引物）和SEQ ID NO:23（22Y3下游引物）所示序列的22Y3引物对进行PCR扩增（如图16所示），结果表明由pUC19-RNAi-22KD载体得到的90个T₀代植株中，有10株扩增出1 kb的目的条带（包括目的基因和内含子序列），阳性率为11.1%，说明22KD醇溶蛋白基因整合进入了玉米基因组。

3、pUC19-RNAi-19KD载体T₀代再生植株的PCR检测

提取pUC19-RNAi-19KD载体转化得到的T₀代再生植株（120个）的基因组DNA（方法同实施例1、二、1），提取pUC19-RNAi-19KD载体的DNA（方法同实施例1、二、9），分别以转基因植株籽粒DNA、pUC19-RNAi-19KD载体的DNA（CK+）、玉米品种B73非转基因植株籽粒DNA（CK-）、空白水（CK）作为模板，以SEQ ID NO:24（19Y5上游引物）和SEQ ID NO:25（19Y5下游引物）所示序列的19Y5引物对进行PCR扩增（如图17所示），结果表明由pUC19-RNAi-19KD载体得到的120个T₀代植株中，有12株扩增出800 bp左右的目的条带（包括目的基因和内含子序列），阳性率为10.0%，说明19KD醇溶蛋白基因整合进入了玉米基因组。

六、转基因植株的赖氨酸酸含量测定

收获转基因T₀代植株的籽粒（如图15所示），送农业部农产品质量监督检验测试中心(昆明)进行分析，根据国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）的标准方法，用Perten-DA7200近红外谷物品质分析仪分析了T₀代植株的T₁代籽粒的赖氨酸含量，结果表明：

用本发明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD转化得到的10个转基因玉米材料中，有1株较非转基因植株的赖氨酸含量提高了52%左右，有3株赖氨酸含量提高了15-20%，其他6株无明显变化。

本发明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD转化玉米品种得到的12个转基因材料中，有2株较非转基因植株的赖氨酸含量提高了50-60%，有4株赖氨酸含量提高了15-20%，其他7株无明显变化。

上述实验表明，用本发明的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD或pUC19-RNAi-19KD转化玉米品种，得到了高赖氨酸含量转基因植株，与非转基因植株相比，转基因玉米的籽粒赖氨酸含量提高了15-60%，与现有常规育种技术培育的高赖氨酸玉米品种相比，赖氨酸含量有同等水平的提高或稍高于常规育种技术培育的高赖氨酸玉米品种。同时，平行实验说明基于此RNAi载体的玉米转基因技术具有较好的重复性与稳定性。此外本发明通过RNA干扰技术调节玉米醇溶蛋白的合成进而提高赖氨酸的含量水平，解决了常规育种中利用o2基因选育的高赖氨酸玉米品种胚乳呈软质及抗病性差等关键问题。      

                             序列表

 

<110>  云南省农业科学院粮食作物研究所

          云南田瑞种业有限公司

 

<120>  一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体

 

<130>  -

 

<160>  25   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  特异启动子p引物的上游引物

 

<400>  1

gagctcggca aagggactgg caaagg                                          26

 

<210>  2

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  特异启动子p引物的下游引物

 

<400>  2

tctagactag cccgggcgct tcgcttggtg tgtttct                              37

 

<210>  3

<211>  1367

<212>  DNA

<213>  玉米(Zea mays L.)

 

<400>  3

ggcaaaggga ctggcaaagg ggcccactag agggttcttt gccgagtgcc agttcaccag     60

 

acactcggca aataaacctc ctttgccgag tgtcgccgtg ggcactcggc gaaggatccg    120

tcaccgtcac ttggcgccgt gacggtgact tttctttgcc gagtgccaaa tggcactcgg    180

caaagtcttt gccgagtgcc cgacaaaaag tactcggcaa agatgctgtt gccgatgtac    240

agttcgccga gcgttctttg ccgagtgtta cactcggcaa agcatttgcc gagtgtaaaa    300

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tggatccatc ctctactatg aaaagtcatg aattcacaag acgttttcga aaacaatttc    480

agcttcactt gtaaagttgc ttgtgcggct gaagccaaga aaacattaga ggacaaacaa    540

taacttacta tgcttttcgt gaactgtttc agaccagcag taataattat tggtcctaca    600

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gaggcagcca ctctaggatg ttgcctctat taattactca tagatgcagc catccaactc    840

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tgtttaacca tcagaacata actacaacaa catccattta taaaggcttc gatagcaaac   1020

tttacatatt catatcatgt taaggttgtc acatgtgtaa aggtgaagag atcatgcatg   1080

tcattccacg tagataaaaa gaatgcctat ataaaaatgg cacattttct tgtaggtagt   1140

ggaaagtatc tttccagcaa agaccatata atccgataaa gctgataact aaatgtcgaa   1200

atcgagtaga tgccatatca tctatacctt atctgttgtt tggaaaaaaa aaagacaaaa   1260

tccaaaaaaa aatataagag atctcaccta tataaatagc tctgaaatca gtagttaatc   1320

catcacccat aatattttga gcattcagaa acacaccaag cgaagcg                 1367

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-6引物的上游引物

 

<400>  4

cccgggggcg agcgtctaca acaacc                                          26

 

<210>  5

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-6引物的下游引物

 

<400>  5

tctagacaca acgagagggc tagatgaaag                                      30

 

<210>  6

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-7引物的上游引物

 

<400>  6

aagcttctag ctcgagggcg agcgtctaca acaacc                               36

 

<210>  7

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-7引物的下游引物

 

<400>  7

tctagacaca acgagagggc tagatgaaag                                      30

 

<210>  8

<211>  312

<212>  DNA

<213>  玉米(Zea mays L.)

 

<400>  8

cacaacgaga gggctagatg aaagcagttg ttgttgttgt acgtaggcgg cagggttcac     60

catggctagt tgactgagcg ttggcagaaa ctgttgtagc tgttgttgtt gctggtttgc    120

aactacgttc gccagagcaa gtgggttgga tgcaagcagc tgctcttgca agtaggcggc    180

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gatggcttgt attgttagat gtggcaagga ttgttgttgc aattgggcaa ttggttgttg    300

tagacgctcg cc                                                        312

 

<210>  9

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  终止子poly(A)的上游引物

 

<400>  9

ctcgagcgag tttctccata ataatgtgtg ag                                   32

 

<210>  10

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  终止子poly(A)下游引物

 

<400>  10

aagctttcgg gggatctgga ttttagt                                         27

 

<210>  11

<211>  185

<212>  DNA

<213>  Plasmid p3301

 

<400>  11

tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg aattagaaat tttattgata     60

gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt atatgctcaa cacatgagcg    120

aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac tcacacatta ttatggagaa    180

actcg                                                                185

 

<210>  12

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  GUS基因内含子的上游引物

 

<400>  12

tctagagttg cctccctgct gcgg                                            24

 

<210>  13

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  GUS基因内含子的下游引物

 

<400>  13

tctagacggt cagtggcagt gaaggg                                          26

 

<210>  14

<211>  1023

<212>  DNA

<213>  Plasmid pGreen-0229 Backbone

 

<400>  14

cattgttgcc tccctgctgc ggtttttcac cgaagttcat gccagtccag cgtttttgca     60

gcagaaaagc cgccgacttc ggtttgcggt cgcgagtgaa gatccctttc ttgttaccgc    120

caacgcgcaa tatgccttgc gaggtcgcaa aatcggcgaa attccatacc tgttcaccga    180

cgacggcgct gacgcgatca aagacgcggt gatacatatc cagccatgca cactgatact    240

cttcactcca catgtcggtg tacattgagt gcagcccggc taacgtatcc acgccgtatt    300

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acagcacatc aaagagatcg ctgatggtat cggtgtgagc gtcgcagaac attacattga    480

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caatgcctaa agagaggtta aagccgacag cagcagtttc atcaatcacc acgatgccat    780

gttcatctgc ccagtcgagc atctcttcag cgtaagggta atgcgaggta cggtaggagt    840

tggccccaat ccagtccatt aatgcgtggt cgtgcaccat cagcacgtta tcgaatcctt    900

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taatcaggaa ctgttcgccc ttcactgcca ctgaccggat gccgacgcga agcgggtaga   1020

tat                                                                 1023

 

<210>  15

<211>  5870

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD

 

<400>  15

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180

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tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    360

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gcgccgtgac ggtgactttt ctttgccgag tgccaaatgg cactcggcaa agtctttgcc    600

gagtgcccga caaaaagtac tcggcaaaga tgctgttgcc gatgtacagt tcgccgagcg    660

ttctttgccg agtgttacac tcggcaaagc atttgccgag tgtaaaatag cctttgccgt    720

gtgtctcaga cacacggcaa agaagctgat tccggtagtg tttggggggc gactaacaca    780

aatcgatgac ctttgatgaa gatggatgta tttctcccac aaaatcttgg atccatcctc    840

tactatgaaa agtcatgaat tcacaagacg ttttcgaaaa caatttcagc ttcacttgta    900

aagttgcttg tgcggctgaa gccaagaaaa cattagagga caaacaataa cttactatgc    960

ttttcgtgaa ctgtttcaga ccagcagtaa taattattgg tcctacatgc attaatggat   1020

aagcggctag catgccaaga cggagcatta gttaggagat aagacctagc gtttcattgc   1080

atccccatga aaggaatact atcactactg catgaataat tttcaaatgt attaaaaact   1140

gatattgaaa tgtaggtaat ctgtccgcct atgtgaaatg tttaacagag gcagccactc   1200

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tatttgttcc ttccttgtca aatcacttct catctaacta ctatgcttgt ttaaccatca   1380

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ataagagatc tcacctatat aaatagctct gaaatcagta gttaatccat cacccataat   1740

attttgagca ttcagaaaca caccaagcga agcgcccggg ggcgagcgtc tacaacaacc   1800

aattgcccaa ttgcaacaac aatccttgcc acatctaaca atacaagcca tcacaacgca   1860

acagcaacaa cagttcctac cagcactgag ccacctagcc atggtgaacc ctgccgccta   1920

cttgcaagag cagctgcttg catccaaccc acttgctctg gcgaacgtag ttgcaaacca   1980

gcaacaacaa cagctacaac agtttctgcc aacgctcagt caactagcca tggtgaaccc   2040

tgccgcctac gtacaacaac aacaactgct ttcatctagc cctctcgttg tgtctagaat   2100

atctacccgc ttcgcgtcgg catccggtca gtggcagtga agggcgaaca gttcctgatt   2160

aaccacaaac cgttctactt tactggcttt ggtcgtcatg aagatgcgga cttgcgtggc   2220

aaaggattcg ataacgtgct gatggtgcac gaccacgcat taatggactg gattggggcc   2280

aactcctacc gtacctcgca ttacccttac gctgaagaga tgctcgactg ggcagatgaa   2340

catggcatcg tggtgattga tgaaactgct gctgtcggct ttaacctctc tttaggcatt   2400

ggtttcgaag cgggcaacaa gccgaaagaa ctgtacagcg aagaggcagt caacggggaa   2460

actcagcaag cgcacttaca ggcgattaaa gagctgatag cgcgtgacaa aaaccaccca   2520

agcgtggtga tgtggagtat tgccaacgaa ccggataccc gtccgcaagg tgcacgggaa   2580

tatttcgcgc cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc cgacgcgtcc gatcacctgc   2640

gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc gataccatca gcgatctctt tgatgtgctg   2700

tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc caaagcggcg atttggaaac ggcagagaag   2760

gtactggaaa aagaacttct ggcctggcag gagaaactgc atcagccgat tatcatcacc   2820

gaatacggcg tggatacgtt agccgggctg cactcaatgt acaccgacat gtggagtgaa   2880

gagtatcagt gtgcatggct ggatatgtat caccgcgtct ttgatcgcgt cagcgccgtc   2940

gtcggtgaac aggtatggaa tttcgccgat tttgcgacct cgcaaggcat attgcgcgtt   3000

ggcggtaaca agaaagggat cttcactcgc gaccgcaaac cgaagtcggc ggcttttctg   3060

ctgcaaaaac gctggactgg catgaacttc ggtgaaaaac cgcagcaggg aggcaacaat   3120

gtctagacac aacgagaggg ctagatgaaa gcagttgttg ttgttgtacg taggcggcag   3180

ggttcaccat ggctagttga ctgagcgttg gcagaaactg ttgtagctgt tgttgttgct   3240

ggtttgcaac tacgttcgcc agagcaagtg ggttggatgc aagcagctgc tcttgcaagt   3300

aggcggcagg gttcaccatg gctaggtggc tcagtgctgg taggaactgt tgttgctgtt   3360

gcgttgtgat ggcttgtatt gttagatgtg gcaaggattg ttgttgcaat tgggcaattg   3420

gttgttgtag acgctcgccc tcgagcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca   3480

gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct   3540

tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca   3600

aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga aagcttggcg taatcatggt catagctgtt   3660

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa   3720

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact   3780

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc   3840

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg   3900

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc   3960

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag   4020

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca   4080

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca   4140

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg   4200

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag   4260

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt   4320

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca   4380

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg   4440

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt   4500

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc   4560

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg   4620

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg   4680

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta   4740

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg   4800

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg   4860

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc   4920

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc   4980

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc   5040

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag   5100

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat   5160

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg   5220

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt   5280

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag   5340

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg   5400

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt   5460

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct   5520

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac   5580

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat   5640

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat   5700

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca   5760

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat   5820

tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc              5870

 

<210>  16

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-4引物的上游引物

 

<400>  16

cccgggccat ccaagcaagc atcttacgg                                       29

 

<210>  17

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-4引物的下游引物

 

<400>  17

tctagaggca taagggctcc cgacaa                                          26

 

<210>  18

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-5引物的上游引物

 

<400>  18

aagcttctag ctcgagccat ccaagcaagc atcttacgg                            39

 

<210>  19

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的R19-5引物的下游引物

 

<400>  19

tctagaggca taagggctcc cgacaa                                          26

 

<210>  20

<211>  286

<212>  DNA

<213>  玉米(Zea mays L.)

 

<400>  20

ccatccaagc aagcatttac ggtcattagc attaaccctc caacaaccat atgctctatt     60

gcaacagcca tccttagtgc atctgtatct ccaaagaatc gcggcacaac aactacaaca    120

acagttgcta ccaacaatca atcaagtagt tgcagcgaac cttgctgctt acctccagca    180

acaacagttt cttccattca atcaactagc tggggtgaac cctgctatct acttgcaggc    240

acaacagcta ctaccattta accaacttgt cgggagccct tatgcc                   286

 

<210>  21

<211>  5819

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD

 

<400>  21

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc    240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggc aaagggactg    420

gcaaaggggc ccactagagg gttctttgcc gagtgccagt tcaccagaca ctcggcaaat    480

aaacctcctt tgccgagtgt cgccgtgggc actcggcgaa ggatccgtca ccgtcacttg    540

gcgccgtgac ggtgactttt ctttgccgag tgccaaatgg cactcggcaa agtctttgcc    600

gagtgcccga caaaaagtac tcggcaaaga tgctgttgcc gatgtacagt tcgccgagcg    660

ttctttgccg agtgttacac tcggcaaagc atttgccgag tgtaaaatag cctttgccgt    720

gtgtctcaga cacacggcaa agaagctgat tccggtagtg tttggggggc gactaacaca    780

aatcgatgac ctttgatgaa gatggatgta tttctcccac aaaatcttgg atccatcctc    840

tactatgaaa agtcatgaat tcacaagacg ttttcgaaaa caatttcagc ttcacttgta    900

aagttgcttg tgcggctgaa gccaagaaaa cattagagga caaacaataa cttactatgc    960

ttttcgtgaa ctgtttcaga ccagcagtaa taattattgg tcctacatgc attaatggat   1020

aagcggctag catgccaaga cggagcatta gttaggagat aagacctagc gtttcattgc   1080

atccccatga aaggaatact atcactactg catgaataat tttcaaatgt attaaaaact   1140

gatattgaaa tgtaggtaat ctgtccgcct atgtgaaatg tttaacagag gcagccactc   1200

taggatgttg cctctattaa ttactcatag atgcagccat ccaactctag gatttcaatt   1260

agtctcaatc tatgcattcg tctatgcatt ctaggattac aattagtctc aatcttgtag   1320

tatttgttcc ttccttgtca aatcacttct catctaacta ctatgcttgt ttaaccatca   1380

gaacataact acaacaacat ccatttataa aggcttcgat agcaaacttt acatattcat   1440

atcatgttaa ggttgtcaca tgtgtaaagg tgaagagatc atgcatgtca ttccacgtag   1500

ataaaaagaa tgcctatata aaaatggcac attttcttgt aggtagtgga aagtatcttt   1560

ccagcaaaga ccatataatc cgataaagct gataactaaa tgtcgaaatc gagtagatgc   1620

catatcatct ataccttatc tgttgtttgg aaaaaaaaaa gacaaaatcc aaaaaaaaat   1680

ataagagatc tcacctatat aaatagctct gaaatcagta gttaatccat cacccataat   1740

attttgagca ttcagaaaca caccaagcga agcgcccggg ccatccaagc aagcatttac   1800

ggtcattagc attaaccctc caacaaccat atgctctatt gcaacagcca tccttagtgc   1860

atctgtatct ccaaagaatc gcggcacaac aactacaaca acagttgcta ccaacaatca   1920

atcaagtagt tgcagcgaac cttgctgctt acctccagca acaacagttt cttccattca   1980

atcaactagc tggggtgaac cctgctatct acttgcaggc acaacagcta ctaccattta   2040

accaacttgt cgggagccct tatgcctcta gaatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg   2100

gtcagtggca gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct actttactgg   2160

ctttggtcgt catgaagatg cggacttgcg tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt   2220

gcacgaccac gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc   2280

ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac   2340

tgctgctgtc ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa   2400

agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat   2460

taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa   2520

cgaaccggat acccgtccgc aaggtgcacg ggaatatttc gcgccactgg cggaagcaac   2580

gcgtaaactc gacccgacgc gtccgatcac ctgcgtcaat gtaatgttct gcgacgctca   2640

caccgatacc atcagcgatc tctttgatgt gctgtgcctg aaccgttatt acggatggta   2700

tgtccaaagc ggcgatttgg aaacggcaga gaaggtactg gaaaaagaac ttctggcctg   2760

gcaggagaaa ctgcatcagc cgattatcat caccgaatac ggcgtggata cgttagccgg   2820

gctgcactca atgtacaccg acatgtggag tgaagagtat cagtgtgcat ggctggatat   2880

gtatcaccgc gtctttgatc gcgtcagcgc cgtcgtcggt gaacaggtat ggaatttcgc   2940

cgattttgcg acctcgcaag gcatattgcg cgttggcggt aacaagaaag ggatcttcac   3000

tcgcgaccgc aaaccgaagt cggcggcttt tctgctgcaa aaacgctgga ctggcatgaa   3060

cttcggtgaa aaaccgcagc agggaggcaa caatgtctag aggcataagg gctcccgaca   3120

agttggttaa atggtagtag ctgttgtgcc tgcaagtaga tagcagggtt caccccagct   3180

agttgattga atggaagaaa ctgttgttgc tggaggtaag cagcaaggtt cgctgcaact   3240

acttgattga ttgttggtag caactgttgt tgtagttgtt gtgccgcgat tctttggaga   3300

tacagatgca ctaaggatgg ctgttgcaat agagcatatg gttgttggag ggttaatgct   3360

aatgaccgta agatgcttgc ttggatggct cgagcgagtt tctccataat aatgtgtgag   3420

tagttcccag ataagggaat tagggttcct atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata   3480

agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa tttctaattc   3540

ctaaaaccaa aatccagtac taaaatccag atcccccgaa agcttggcgt aatcatggtc   3600

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg   3660

aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt   3720

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg   3780

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga   3840

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat   3900

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca   3960

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc   4020

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata   4080

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc   4140

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc   4200

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga   4260

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc   4320

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag   4380

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag   4440

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag   4500

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca   4560

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga   4620

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat   4680

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga   4740

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg   4800

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga   4860

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc   4920

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac   4980

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc   5040

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc   5100

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc   5160

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt   5220

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc   5280

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg   5340

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag   5400

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat   5460

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc   5520

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa   5580

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta   5640

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa   5700

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga   5760

aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc    5819

 

<210>  22

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  RNAi载体pUC19-RNAi-22KD转化T0代再生植株的PCR检测22Y3引物的上游引物

      

<400>  22

caagccatca caacgcaac                                                  19

 

<210>  23

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  RNAi载体pUC19-RNAi-22KD转化T0代再生植株的PCR检测22Y3引物的下游引物

 

<400>  23

cgtatccacg ccgtattcg                                                  19

 

<210>  24

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  RNAi载体pUC19-RNAi-19KD转化T0代再生植株的PCR检测19Y5引物的上游引物

      

<400>  24

cagcgaagag gcagtcaac                                                  19

 

<210>  25

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  RNAi载体pUC19-RNAi-19KD转化T0代再生植株的PCR检测19Y5引物的下游引物

      

<400>  25

cgaaccttgc tgcttacct                                                  19

 

 

Claims (2)

1.一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

2.一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD，其核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。

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