CN102307999A - 包含小麦醇溶蛋白序列的多核苷酸及其在RNAi沉默中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过干扰RNA(iRNA)对硬小麦和面粉α、β、γ、ω醇溶蛋白的特异性沉默，其通过使用能转录成hpRNA(发夹RNA)的多核苷酸进行。此外，本发明还涉及包含所述多核苷酸的载体、细胞、植物或种子，其通过基因表达调控序列，例如γ醇溶蛋白基因的启动子或编码D-大麦蛋白基因的启动子在小麦种子的特定组织中进行表达。

Description

包含小麦醇溶蛋白序列的多核苷酸及其在RNAi沉默中的用途
本发明涉及通过干扰RNA(iRNA)对硬小麦和面粉α、β、γ、ω醇溶蛋白的特异性沉默，其通过使用能转录成hpRNA(发夹RNA)的多核苷酸进行。此外，本发明还涉及包含所述多核苷酸的载体、细胞、植物或种子，其通过基因表达调控序列，例如γ醇溶蛋白基因的启动子或编码D-大麦蛋白基因的启动子在小麦种子的特定组织中进行表达。
现有技术
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的信使RNA降解系统，其允许特定基因的特异性沉默。该技术的发现使得可以设计包含启动子和终止信号的载体，其包含希望沉默的基因序列，并具有由不同长度间隔序列分隔的正义和反义序列。
SiRNA(小干扰RNA或短干扰RNA的英文缩写)是21-25个核苷酸(nt)的双链RNA(dsRNA，双链RNA的英文缩写)，其来源于较长的前体dsRNA。前体dsRNA可以是内源性的，此时为miRNA(机体基因组中编码)，或外源性的(例如病毒或转基因)。siRNA和miRNA均是iRNA(干扰RNA)的类型。iRNA抑制由所述iRNA识别的特定mRNA(信使RNA的英文缩写)的转录后表达。
当由外源性转基因、病毒剂或内源性遗传元件产生的dsRNA前体(单链RNA不具有该效应)进入细胞时，其通过酶作用片段化成siRNA，所述酶是指Dicer，一种RNAse III家族的细胞质酶。Dicer将dsRNA裂解成约21-25个核苷酸的双链片段(siRNA)，5’端磷酸化，3’端有两个未配对的核苷酸。在siRNA的两条链中，只有一条被称为引导链的被整合到酶复合物RISC(RNA-诱导沉默复合物)中，而另一条链被降解。siRNA5’端的热力学性质决定两条链中哪条被整合到RISC复合物中。通常在5’端稳定性较差的那条链被整合为引导链，可能由于其具有较高的AU碱基含量或由于不完整配对。引导链必需与要沉默的mRNA互补，以进行转录后沉默。随后，RISC复合物与复合物中siRNA引导链互补的mRNA结合，mRNA裂解。随后，获得片段被降解。通过这种方式，siRNA引起靶核苷酸序列的转录后沉默，从而避免获得所述序列表达产生的蛋白质。
小麦中的谷物蛋白(7-18％)尽管含量低于碳水化合物(60-75％)，其对于面粉的功能性质也是必需的。主要谷物蛋白为麦谷蛋白和醇溶蛋白，其构成麸质。已发现醇溶蛋白与乳糜泻的发展有关，因为在α和γ醇溶蛋白的区域中已鉴定了由肠T细胞识别的表位(抗原决定簇)(Arentz-Hansen，5 etal.，2002.Gastroenterology 123：03-809)。乳糜泻患者对麸质是不耐受的。麸质不耐受的特征是小肠近端的慢性炎症，其由醇溶蛋白引起。通过生产醇溶蛋白成分显著降低的小麦，可获得适合乳糜泻患者的食物。
已知有4种类型的醇溶蛋白：α、β、γ、ω。近年来使用RNAi技术对小麦醇溶蛋白进行了抑制。迄今为止，只能抑制特定的醇溶蛋白。例如，通过使用遗传构建体产生RNAi类型的发夹可几乎完全消除α型的醇溶蛋白(Folck et al.，2005.XII International Conference on Plant Embryology.Oralpresentation)或γ型醇溶蛋白(Gil-Humanes等.2008.Journal of CerealScience 48(3)：565-568)，所述发夹具有启动子-正义序列-间隔物-反义序列-终止子的结构，但不能有效消除所有类型的醇溶蛋白。
获得具有醇溶蛋白成分显著下降种子的植物具有技术上的困难，例如，首先，编码醇溶蛋白的基因的数目的增加，第二，小麦植物是六倍体。相对于其他基因组拷贝数较低的植物来说，小麦植物中要获得稳定的转化困难更多。
发明详述
本发明涉及包含两条序列对的多核苷酸，每个子序列以特定的顺序合并，产生当转录到RNA時能产生hpRNA(发夹RNA)的序列，例如发夹形状的RNA，能被现有技术中所述的核糖核酸内切酶加工的双链RNA，其被用于产生引起编码所有类型的小麦醇溶蛋白的mRNA(信使RNA)转录后沉默的siRNA。为此，所述四条子序列为：ω醇溶蛋白的有义序列，α、β、γ醇溶蛋白的有义序列，以及两条前反义序列。
通过基因表达调控序列，例如γ醇溶蛋白基因的启动子或编码D-大麦蛋白基因的启动子在小麦种子的特定组织中进行表达的多核苷酸，可以以有效且协同的方式获得软小麦和硬小麦所有基因的转录后沉默，其相对于现有技术中所述hpRNA沉默α和γ醇溶蛋白的结果而言，能够沉默更多的醇溶蛋白基因。这主要是由于有义和反义子序列的特定设计，其产生与小麦α、β、γ和ω醇溶蛋白mRNA杂交的siRNA，以及具有能在小麦种子特定组织中诱导的更高的表达水平的醇溶蛋白启动子。该设计在鉴定含有人T细胞识别的表位的醇溶蛋白群体后得以完成，这样对含有这些表位的蛋白的沉默可以产生小麦种子，其可用于获得适于对麸质过敏的人群的产品。
在本发明中，术语DNA和RNA分别指脱氧核糖核酸和核糖核酸。
因此，本发明的一个方面是与包含由间隔序列隔开的两条序列对(a1-a2)和(b2-b1)的序列具有至少90％同一性的多核苷酸，其中：
a.序列a1、a2、b1和b2各不相同，以下列形式选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4：
b.如果a1是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4，b1是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：1，以及a2是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，并且
c.如果a1是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，b1是SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：2，以及a2是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4。
本发明的另一个方面是包含由间隔序列隔开的两条序列对(a1-a2)和(b2-b1)的多核苷酸，其中序列a1、a2、b1和b2如上一方面中(a)-(c)段所述。
序列a1-a2和b2-b1(下文中指本发明的序列对)相连形成线性和连续的核苷酸序列，其中两条序列对通过至少一个核苷酸的间隔序列连接。优选地，所述间隔序列是非编码序列，其在形成dsRNA后被清除。间隔序列可以是基因内含子序列的一部分。间隔序列的功能是作为所述序列对的铰链，这样可编码多核苷酸的RNA序列可配对或杂交。
所述多核苷酸与包含本发明序列对的序列具有至少90％的同一性。这里考虑了组成所述序列对的任意核苷酸的变化，与本方面中所述核苷酸组成原始序列具有90％同一性。
SEQ ID NO：1是包含部分编码由人T细胞识别的ω醇溶蛋白表位的片段的有义序列，所述识别导致乳糜泻患者的免疫应答。SEQ ID NO：2是包含部分编码α、β、γ醇溶蛋白表位的片段的有义序列。SEQ ID NO：3是SEQ ID NO：2的反义序列，SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：1的反义序列。
本发明的多核苷酸产生RNA，其中两条序列对互相杂交形成发夹。因此，根据本发明的这两个方面，可获得RNA发夹的序列组合如1和表2所示：
表1.序列组合，其中a1-a2和b2-b1对是有义或反义序列。
  组合   a1   a2   b2   b1
  1   SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：4
  2   SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：4   SEQ ID NO：3
  3   SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：4   SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：2
  4   SEQ ID NO：4   SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：1
表2.序列组合，其中a1-a2和b2-b1对含有有义或反义序列。
  组合   a1   a2   b2   b1
  1   SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：4
  2   SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：4   SEQ ID NO：2
  3   SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：4   SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：3
  4   SEQ ID NO：4   SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：1
在本发明一个优选的实施方案中，所述多核苷酸包含间隔序列隔开的两条序列对(a1-a2)和(b2-b1)，其中a1是SEQ ID NO：1，a2是SEQ ID NO：2，b2是SEQ ID NO：3，b1是SEQ ID NO：4。
根据另一个优选的实施方案，所述多核苷酸包含两条序列对(a1-a2)和(b2-b1)，其中间隔序列是SEQ ID NO：5，序列SEQ ID NO：5是编码玉米泛素的基因Ubil的内含子片段，内含子是通过剪接从原始的RNA转录物中消除的DNA区域，即，内含子不编码蛋白质的任何序列。泛素是具有标记其他蛋白质降解的功能的蛋白质。
另一个优选的实施方案是还包含与5’端功能性连接的基因表达调控序列的多核苷酸。在本发明中，术语基因表达调控序列是指在DNA序列的转录起始或RNA序列或其他未描述序列翻译起始影响基因功能性的核酸序列。例如，本发明覆盖的基因调控序列是启动子和其他较少见的序列，例如某些内含子。调控序列以功能性的模式结合本发明多核苷酸的5’端，即可以根据自身的调控序列检测多核苷酸表达的强度和位置。
在一个更优选的实施方案中，所述基因表达调控序列是SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7。序列SEQ ID NO：6相应于γ醇溶蛋白基因的启动子序列，其在脯氨酸盒中具有副本。SEQ ID NO：7相应于D-大麦蛋白基因的启动子序列(该基因的第二核苷酸具有登陆号AY998009，属于Hordeum chilense种)。两种启动子均在种子的胚乳中表达。
还包括的是与本发明任一多核苷酸互补的序列。
在下文中，术语“发明的多核苷酸”或“本发明的多核苷酸”是指任何上述多核苷酸。
本发明的另一方面是本发明任何多核苷酸编码的RNA序列，其能够形成hpRNA，其中对a1-a2编码的序列与对b2-b1编码的序列完全杂交。
hpRNA(发夹RNA的英文缩写)是通过转录序列的杂交形成的发夹形式。在本发明中，序列对a1-a2和b2-b1与自身完全杂交的本发明的多核苷酸被用作合成转录序列的模板，如图1B所示。hpRNA是双链RNA(dsRNA)，其可以被核糖核酸内切酶(例如核糖核酸内切酶Dicer)切割，产生约21-25nt的片段。这些片段称为siRNA。如前所述，siRNA引起靶核酸序列的转录后沉默，从而避免获得所述序列表达产生的蛋白质。
本发明的另一方面是至少一种由前述方面的hpRNA序列产生的siRNA。siRNA也称为RNAi。siRNA是21-25个核苷酸的双链RNA，但不限于该数目的核苷酸，其由本发明的hpRNA序列产生。在本发明中，在定义siRNA的大致核苷酸数目时(约21-25个核苷酸)，应当理解还有另一条与该序列互补的链，即术语核苷酸或碱基对(bp)可交换使用。
如前所述，Dicer酶将dsRNA切割成约21-25个核苷酸的双链片段(siRNA)，5’端磷酸化，3’端有两个未配对的核苷酸。在siRNA的两条链中，只有一条被称为引导链的被整合到酶复合物RISC中，而另一条链被降解。siRNA5’端的热力学性质决定两条链中哪条被整合到RISC复合物中。通常在5’端稳定性较差的那条链被整合为引导链。引导链必需与要沉默的mRNA互补，以进行转录后沉默。随后，RISC复合物结合与复合物中siRNA引导链互补的mRNA，发生mRNA裂解。
本发明的另一个方面是包含本发明任何多核苷酸的表达载体。在下文中，称为“发明的载体”或“本发明的载体”。
术语“载体”是指能在特定的宿主中自主复制的DNA片段。并且，如该术语所表示，载体可用于复制另一与之融合的DNA片段(插入片段)。“插入片段”是指与载体融合的DNA片段；在本发明中，载体包含本发明的多核苷酸，当其融合后，可在相应的宿主中自主复制。载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，也不排除满足本发明载体定义的其他类型的载体。
本发明的另一方面是用本发明载体转染的分离的细胞。在下文中称为“本发明的细胞”，术语“细胞”在本发明中是指原核或真核细胞。该细胞可以是能复制通过转化来的外源DNA的细菌，例如大肠杆菌的任何菌株或能将感兴趣的DNA转移至植物内部的细菌，例如根瘤农杆菌。优选地，所述细胞是指真核植物细胞，在该类细胞中，更优选属于植物界的细胞。因此，在细胞是植物细胞的情况下，术语“细胞”包括薄壁细胞、分生组织细胞，或任意类型的细胞，分化或未分化的细胞的至少一种。因此，该定义同样包括原生质(无细胞壁的植物细胞)。
术语“转染”表示通过质粒、病毒载体(此时也可使用术语“转导”)或其他转移方法将外源性遗传材料引入细胞内。术语“非病毒方法的转染”参照哺乳动物真核细胞使用，而术语“转化”优选指将遗传材料非病毒转移至细菌和非动物真核细胞如酵母、藻类和植物中。在本发明的情况下，术语“转染”等价于术语“转化”。
本发明的另一方面是包含本发明细胞的遗传修饰植物。术语“植物”包括植物的每一部分和种质，其可以单独或组合保存或培养。种质包括具有种间遗传变异性的生物材料，或能够使机体种群或人口(参见下文种子、繁殖体或子代)永久保存的遗传材料。植物必需包含在特定组织(在植物发育的特定阶段或依赖于其发育的环境条件)中表达的形式或组成型或异位形式(在不同于通常或预期的那些细胞或组织中表达)的本发明细胞。
本发明的植物可包含纯合、杂合或半合状态的本发明的多核苷酸。
根据一个优选的实施方案，所述植物属于小麦属。所述植物选自但不限于，普通小麦(Triticum aestivum)、T.aethiopicum，阿拉拉特小麦(T.araraticum)，一粒小麦(T.boeoticum)，T.carthlicum，密穗小麦(T.compactum)，二粒小麦(T.dicoccoides)，T.dicoccum，硬粒小麦(T.durum)，T.ispahanicum，T.karamyschevii，T.macha，T.militinae，单粒小麦(T.Monococcum)，多粒小麦(T.Polonicum)，T.repens，斯佩而特小麦(T.spelta)，T.sphaerococcum，T.timopheevii，T.turanicum，波斯小麦(T.turgidum)，T.urartu，T.vavilovii和T.zhukovskyi。
根据另一个优选的实施方案，所述植物是普通小麦或波斯小麦。根据另一个优选的实施方案，所述植物属于Bobwhite栽培变种或Don pedro栽培变种。更优选地，选择栽培变种BW208和BW2003(Bobwhite)，其属于普通小麦Triticum aestivum L.ssp aestivum，以及变种Don pedro，其属于波斯小麦硬粒小麦亚种(Triticum turgidum L.ssp durum)。
Bobwhite是从国际玉米和小麦改良中心(CIMMYT)获得的栽培变种。BW208和BW2003是不同的Bobwhite株系。Don Pedro是硬小麦变种，也来自CIMMYT。Bobwhite和Don Pedro是公开的变种。
本发明的植物可采用基因枪、根瘤农杆菌或任何其他使得本发明的多核苷酸整合到植物DNA(所述DNA可以是基因组、叶绿体或线粒体DNA)上的技术，通过遗传转化植物细胞获得，随后可通过适合所述植物特征和需要的体外再生程序进行再生，尽管这不是必需的。此外，所述植物亦可通过杂交转移本发明的任何序列获得，例如使用本发明植物的花粉对任何不含本发明多核苷酸的其他植物授粉，或使用其他不含本发明多核苷酸的花粉对含有本发明多核苷酸的植物雌器官授粉。获得本发明植物的方法不限于本段中描述的那些；例如，可从来自小麦麦穗的生殖细胞进行遗传转化，但之后不必使植物再生(见下文)。此外，还包括包含本发明稳定或过度形式细胞的植物。
本发明的另一方面是来自本发明任意植物的种子。这在下文中称为“发明的种子”或“本发明的种子”。
本发明的另一方面是来自本发明任意植物的花粉粒、繁殖体、子代或植物部分。
在本发明中，花粉被用作遗传和表型特征的传递者，其表型特征为任何与所述花粉相容的植物变体的授粉所得。此时，获得包含本发明的多核苷酸的植物后，经过分别杂交和/或选择，可以获得序列以稳定形式(尽管也可以表达为过渡形式)整合的植物和足够多的拷贝数，以在子代中获得同样的特征。
繁殖体是可以允許无性繁殖或生殖的植物部分，其中获得新的个体化植物或器官。分离部分的组织必需回复到分生组织的状态，以产生所述植物的整组器官。繁殖体选自但不限于，匍匐茎，根茎，根茎类和球茎。
术语“子代”是指生殖的结果，即由一种或多种亲本个体产生的个体。例如，有性生殖产生的子代为种子，但是植物的子代可以是任何细胞成分、质粒、细胞腔隙、DNA或其组合的融合产生的细胞。在细胞分裂的过程中(例如体外培养)，子代是分裂产生的细胞。
本发明的另一方面是本发明的多核苷酸、载体或细胞在沉默小麦α、β、γ、ω醇溶蛋白中的用途。
如本发明实施例2中所述，本发明多核苷酸整合到两种面粉小麦基因型的小麦植物(普通小麦，Bobwhite变种BW208和BW2003)，以及一种硬小麦(波斯小麦，Don Pedro变种)的基因组中后，引起了转化体植物种子的α、β、γ、ω醇溶蛋白沉默(图3，图4和图5)。
本发明的另一方面是本发明的种子在制备食物组合物(下文中指“发明的组合物”或“本发明的组合物”)中的用途。所述食物组合物从不限于下列成分制备：本发明种子的面粉和/或粗面粉，与其他面粉和/或粗面粉的组合，或其他化合物。
术语“面粉”在本发明中应理解为通过碾磨小麦属任何种子或植物获得的产品，种子的麸糠或外壳去除至较高或较低的水平。
术语“粗面粉”是指粗制面粉(轻度碾磨的小麦种子)，即具有可变种子外壳量的胚乳片段。
制备的食物选自但不限于面包、烘焙制品、糕饼、糕点制品、面团、生面团、谷物、饮料或日常用品。
本发明的另一方面是本发明的组合物在制备功能性食品、维他命补充剂或营养补充剂中的用途。本发明中应当理解，食品具有特定的功能，例如改善消费者的饮食。因此可在功能性食品中加入维他命和/或营养补充剂。
包含本发明食物组合物的食品可给对麸质过敏的人员服用，例如乳糜泻患者。
本发明的另一方面是获得本发明植物的方法，包括下列步骤：
a.选择植物的一部分，
b.将根据权利要求9的载体转染到a的植物部分的细胞中，
c.选择b的转染的细胞，其包括根据权利要求1-6任一项的多核苷酸，
d.从c中选择的细胞再生至少一种植物，
e.选择一种或多种根据d再生的植物，其中多核苷酸被转录成hpRNA，并且
f.选择一种或多种根据e获得的植物，其种子显示α、β、γ、ω醇溶蛋白的沉默。
在小麦植物的情况下，优选使用盾片部分被本发明的载体转染。本发明的多核苷酸插入到载体中可通过本领域已知的克隆方法进行，通过用限制性酶切割(消化)所述多核苷酸和载体，随后连接，这样载体的序列包括了本发明的多核苷酸。所述载体如前文所述。
包含本发明特定序列的载体的选择可通过下列技术进行：
-通过向培养基中加入抗生素选择含有本发明载体的细胞。这些细胞对抗生素类物质的抗性通过合成所述载体中序列编码的分子产生。
-用限制性酶消化，获得插入到载体中的本发明序列的片段。
所述细胞通过任何类型的微生物培养物(例如大肠杆菌或根瘤农杆菌)或植物培养物获得。
细胞的遗传转化使用本领域已知的技术进行，例如电穿孔，基因枪、根瘤农杆菌或其他能使本发明的任何序列整合到细胞DNA中的技术进行的遗传转化。优选的，转化通过基因枪进行。通过这些技术，可以稳定的方式获得包含本发明任意序列的载体，这样在经过连续细胞分裂后，整合的序列依然能够进行自身表达。包含过渡形式的本发明任意序列的细胞也包括在内。
用包含本发明任意多核苷酸的载体转化的细胞可在任何类型的细胞内DNA中整合所述序列：核、线粒体和/或叶绿体，此时，通常插入包含除其他序列外的本发明多核苷酸的DNA。整合了本发明任意序列的细胞的选择通过向添加了营养成分的培养基中加入抗生素进行。这些细胞对诸如抗生素和除草剂类物质的抗性通过合成所述载体中DNA序列所含序列编码的分子产生。可以通过其他能区分其存在或不存在和/或表达的技术选择包含本发明多核苷酸的细胞。
所选择的植物细胞可进行器官发生或躯干胚胎发生程序，以获得包含原始细胞的遗传材料的完整植物。因为植物细胞是全能的，即通过适当的激素组合，它们可以被去分化，由此产生能再生完整新植物的胚胎(因为其含有所属植物遗传材料的完整拷贝)。同时需要提供适合每种植物的光照和温度条件。一旦从原始的植物细胞中再生，即可对编码本发明多核苷酸或本发明任何其他序列(启动子序列等)的核苷酸序列的存在和/或表达进行分析。
所述方法还包括选择种子显示α、β、γ、ω醇溶蛋白基本沉默的植物。优选地，应选择所述种子的所有醇溶蛋白基本完全或完全沉默的植物。对照植物(不包含本发明多核苷酸的植物)总醇溶蛋白含量下降大于等于90％。对照植物优选在植物细胞中不含有本发明的多核苷酸。在转化前，对照植物可以是与本发明的植物经历同样的体外培养步骤的野生型植物，或未经历这些培养步骤。
转染的细胞可以是来自植物穗的生殖细胞，此时，将再生至少一种来自由所述植物穗产生的种子的植物，并且将选择至少一种其种子显示α、β、γ、ω醇溶蛋白沉默的植物。
在整个说明书和权利要求书中，用语“包含”及其变体不意味着排除其他技术特征、添加剂、成分或步骤。对本领域技术人员而言，根据说明书和本发明的实践，本发明的其他对象、优点和特征是显而易见的。提供下列附图和实施例进一步说明，它们不意味着限制本发明的范围。
附图简述
图1显示了本发明多核苷酸的结构
图A显示了包含由间隔序列(E)隔开的序列对a1-a2和b2-b1的多核苷酸，其表达通过基因表达调控序列(R)定向。
图B显示了图A中的多核苷酸转录产生的hpRNA，其中序列a1、a2、b2和b1如前文所述杂交，随后，该RNA经处理产生新的双链RNA(dsRNA)序列。所示的最终步骤是前述序列的分段分离，通过酶，例如Dicer酶进行，由此形成约21-25个核苷酸的双链RNA序列，称为siRNA(小干扰RNA)。
图2显示了本发明多核苷酸的特定实例
在本例中，序列R是伽马醇溶蛋白(γ醇溶蛋白)或D-大麦蛋白基因的启动子序列。序列E是玉米泛素基因的内含子片段。NOSt是转录终止序列。该实施例中所述多核苷酸被插入到pUC18载体中，其含有氨苄西林抗性基因。
图3显示了用本发明的多核苷酸转化的小麦BW208变种植物种子醇溶蛋白的分离和鉴定，其通过A-PAGE和MALDI-TOF技术进行。
图A显示了面粉小麦对照系(Triticum aestivum L.ssp.aestivum)、BW208变种和用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的相同基因型面粉小麦系(B377-2-3)种子样品醇溶蛋白的A-PAGE分离。显示了分离所得的醇溶蛋白组。
图B显示了面粉小麦对照系(Triticum aestivum L.ssp.aestivum)、BW208变种和用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的相同基因型面粉小麦系种子样品醇溶蛋白的MALDI-TOF分析。在对应于对照系的图中，显示了α、β、γ、ω醇溶蛋白的不同组分。X轴表示给定离子质量数(m)和其含有质子数(z)的比值(m/z)。
图4显示了用本发明的多核苷酸转化的小麦变种BW2003的植物种子醇溶蛋白的A-PAGE分离和鉴定。
面粉小麦对照系(Triticum aestivum L.ssp.aestivum)、BW208变种和用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的相同基因型面粉小麦系)种子样品醇溶蛋白的A-PAGE分离。显示了分离所得的醇溶蛋白组。
图5显示了用本发明的多核苷酸转化的硬小麦变种Don Pedro的植物种子醇溶蛋白的A-PAGE分离和鉴定。
波斯小麦硬粒小麦对照系(Triticum turgidum L.ssp.Durum)、DonPedro变种和用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的相同基因型面粉小麦系)种子样品醇溶蛋白的A-PAGE凝胶分离。显示了分离所得的醇溶蛋白组。
图6显示了用本发明的多核苷酸转化的小麦变种BW208的植物种子醇溶蛋白的A-PAGE分离和鉴定。
对照系BW208和三个用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的相同基因型的小麦系种子(B382-4-1)的醇溶蛋白的A-PAGE凝胶分离。显示了分离所得的醇溶蛋白组。注意包含该载体的启动子是D-大麦蛋白启动子(SEQ ID NO：7)。
图7显示了用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的两个面粉小麦系(Triticumaestivum L.)的蛋白质印迹分析。
A：基因型BW208的三个B328-4-1系谷物(称为l1，l2和l3)的醇溶蛋白进行SDS凝胶分离，并与谷蛋白特异性的单克隆抗体R5杂交。
B：基因型BW2003的两个B374-6-2系谷物(称为O2和O3)的醇溶蛋白进行SDS凝胶分离，并与谷蛋白特异性的单克隆抗体R5杂交。
A中左侧的数字表示A和B的分子量(kDa)。
图8显示了用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的BW208变体的两个面粉小麦系(Triticum aestivum L.)的蛋白质印迹分析。
基因型BW208的三个B375-3-1转基因系谷物(称为A1，A2和A3)的醇溶蛋白，以及两个B377-2-3转基因系小麦谷物(称为C1，C2)进行SDS凝胶分离，并与谷蛋白特异性的单克隆抗体R5杂交。
图中左侧的数字表示分子量(kDa)。
实施例
下文中，本发明将通过发明人进行的若干试验进行说明，所述试验描述了本发明的多核苷酸的构建，用本发明载体转化的3种不同变种小麦植物的产生以及使用A-PAGE和MALDI-TOF技术的醇溶蛋白分析。
实施例1.载体pGhp-ω/α/β/γ和pDhp-ω/α/β/γ的构建
1.1α/β/γ和ω醇溶蛋白序列的合成
将Genbank中属于α/β/γ和ω醇溶蛋白的DNA序列单独比对，鉴定了显示最高同源性的区域。基于这些比对，我们选择了170bp的α/β/γ醇溶蛋白序列和191bp的ω醇溶蛋白序列，设计引物Alpha-hp-F(SEQ ID NO：8)和Alpha-hp-R(SEQ ID NO：9)用于扩增α/β/γ片段，以及设计引物Omega-III-F(SEQ ID NO：10)和Omega-III-R(SEQ ID NO：11)用于扩增ω片段(表1)。两条片段的PCR条件如下：由50ng从未成熟谷物中提取的总RNA合成T.aestivum cv Bobwhite的cDNA，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2μM引物，1×缓冲液，以及0.625单位的聚合酶混合物，Tth(Thermusthermophilus)和Pfu(Pyrococcus furiosus)(BIOTOOLS，Madrid，西班牙)的比例为100∶1，最终反应物为25μl。PCR循环条件如下：94℃5分钟；35个循环的94℃30秒；55℃30秒；72℃30秒；最后在72℃延伸4分钟，反应在GeneAmp PCR系统9700热循环仪(Applied Biosystems)內进行。各PCR的产物使用GFX PCR DNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，Amersham，UK)纯化，并通过firm Secugen SL测序。为获得α/β和ω片段的重叠，ω醇溶蛋白片段再次使用重叠引物(重叠Omega III R(SEQ IDNO：12)和直接引物SEQ ID NO：10)扩增，并α/β醇溶蛋白片段再次使用另一条重叠引物，重叠引物Alpha F(SEQ ID NO：13)和反向引物SEQ ID NO：9)扩增，其向各片段添加了12个与另一片段互补的碱基对。通过后一扩增，我们获得了两条在ω醇溶蛋白片段3’端和α/β/γ醇溶蛋白片段5’端之间互补的片段。PCR条件如上文所述。这些反应的产物在1％琼脂糖凝胶上分离，相应于各片段的条带使用QUIAquick Gel Extraction Kit(QUIAGEN公司，Valencia，CA)纯化。最终重叠PCR使用10ng α/β/γ纯化的重叠片段，10ng纯化的ω片段，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2μM引物alpha_hp-F，0.2μM引物omega_III-R，1×缓冲液，以及0.625单位的聚合酶混合物，Tth/Pfu的比例为100∶1，最终反应物为50μl。PCR循环的条件如下：94℃2分钟；35个循环的94℃30秒；57℃30秒；72℃30秒；最后在72℃延伸4分钟，反应在GeneAmp PCR系统9700热循环仪(AppliedBiosystems)內进行。这些反应的产物在1％琼脂糖凝胶上分离，相应于ω/α/β(361bp)片段的条带使用QUIAquick Gel Extraction Kit(QUIAGEN公司，Valencia，CA)纯化并克隆到TOPO质粒中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。该质粒包含位点attL1和attL2，其可以通过将感兴趣的基因重组到任何包含位点attR1和attR2的
Figure BDA0000080832800000161
载体中进行转移。
1.2获得转化载体pGhp-ω/α/β/γ和pDhp-ω/α/β/γ
转化载体使用载体puc18(2616bp)合成。将包含转化载体pGhp-ω/α/β/γ的不同片段依次引入载体puc18的多克隆位点。通过EcoRI酶切从载体pANDA-β提取片段Nost(272bp)并导入puc18，产生puc18_Nost.随后，通过Sacl  和Kpnl  组合酶切提取载体pANDA  的片段attRsense_GUS_attRantisense(4.4kb)，引入载体puc18_Nost，产生puc18_attR_GUS_Nost。该片段含有位点attR1和attR2，有义和反义序列被1kb的连接片段(gus接头)分开。该gus接头序列用于替换之前在我们实验室中通过EcoRV限制性酶切克隆的Ubi内含子片段(1019bp)，产生质粒puc18_attR_Ubi_Nost。最后醇溶蛋白启动子(885bp)通过Sphl和Xhol双酶切导入，产生质粒puc18_Gli_attR_Ubi_Nost。
D-大麦蛋白基因启动子(836bp)同样通过Sphl和Xhol双酶切导入，产生载体puc18_D_attR_Ubi_Nost。载体pGhp-ω/α/β/γ和pDhp-ω/α/β/γ的区别在于前者含有小麦γ醇溶蛋白的启动子，后者含有小麦H-大麦蛋白的启动子。
下一步是将片段ω/α/β导入质粒puc18_Gli_attR_Ubi_Nost和puc18_D_attR_Ubi_Nost。质粒TOPO+ω/α/β含有位点attL1和attL2，而质粒puc18_Gli_attR_Ubi_Nost和puc18_D_attR_Ubi_Nost含有位点attL1和attL2，有义和反义序列被内含子Ubi隔开。这使得可以根据厂商说明使用试剂盒
Figure BDA0000080832800000171
LR Clonase TM Enzyme Mix(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行LR重组反应。结果在质粒puc18_Gli_attR_Ubi_Nost和puc18_D_attR_Ubi_Nost的结构中引入具有被内含子Ubi隔开的有义和反义序列的片段ω/α/β/γ。所得载体称为pGhp-ω/α/β/γ和pDhp-ω/α/β/γ(图2)。通过转化导入感受态E.coli细胞(DH5α)中进行增殖。
实施例2.获得转基因小麦系
遗传转化通过基因枪进行，使用通过高压氦加速粒子的系统(PDS1000/HeTM.BIORAD，Hercules，CA)。我们使用两种面粉小麦(Triticumaestivum L.)栽培变种Bobwhite(BW208和BW2003)以及一种硬小麦(Triticum turgidum ssp durum)栽培变种Don Peto来分离未成熟胚的角质鳞片。分离在无菌环境下进行，使用开花后12-16天收集的未成熟小麦谷物，其之前通过下列方式灭菌：在70％的乙醇溶液中浸泡3分钟，在20％的次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，用无菌蒸馏水洗涤2次。为进行遗传转化，我们使用直径为0.6μm的金颗粒，以1.5pmol/mg金和载体pGhp-ω/α/β/γ和pDhp-ω/α/β/γ，以及0.5pmol/mg金和载体pAH25的量混合(Christensen et al.，1996.Transgenic Research 5，213-30218)。每次射击的条件如下：91.4kPa(27inHg)真空压，7.584Mpa(1100PSI)射击压，6cm射击距，以及每次射击60μg金-质粒混合物。
含有bar选择基因(对草胺磷抗性)和uidA基因(β葡糖苷酸酶的合成)的质粒pAHC25的共转化使得可以选择在含4mg/l的草胺磷(PPT)的培养基中转化的组织，以及通过β葡糖苷酸酶分析(GUS)鉴定转基因组织，如Jefferson描述的方案(1987，Plant Mol Biol Rep 5：387-405)。培养基、体外培养过程以及植物的再生根据Barro等人所描述的进行(Barro et al.，1998.Theoretical and Applied Genetics 97，684-695)。
将体外培养再生的植物放置在土壤中，随后进行GUS分析，如前文所述。在GUS分析中呈阳性反应的植物中，DNA提取使用DNAzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照厂商说明进行，进行PCR验证成年植物基因组中质粒pGhp-ω/α/β/γ和pDhp-ω/α/β/γ以及pAHC25的存在与否。PCR条件如下：100ng从嫩叶中提取的DNA，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2μM每种引物，1×缓冲液，以及0.625单位的聚合酶Tth(BIOTOOLS，Madrid，西班牙)。使用的引物为：质粒pGhp-ω/α/β/γ：prGliF(SEQ ID NO：14)和重叠Omega_III_R(SEQ ID NO：12)，质粒pDhp-ω/α/β/γ：prHorDF(SEQ IDNO：15)和重叠Omega_III_R(SEQ ID NO：12)，pAHC25：BAR_F(SEQ IDNO：16)和BAR_R(SEQ ID NO：17)(表3)。PCR循环条件如下：起始94℃5分钟；35个循环的94℃30秒；55℃30秒；72℃2秒；最后在72℃延伸7分钟，反应在GeneAmp PCR系统9700热循环仪(Applied Biosystems)內进行。这些反应的产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，随后选择阳性系以进行进一步的分析。
表3.使用的引物和序列
  引物  5′-3′序列
  Alpha_hp_F  (SEQ ID NO：8)
  Alpha_hp_R  (SEQ ID NO：9)
  Omega_III_F  (SEQ ID NO：10)
  Omega_III_R  (SEQ ID NO：11)
  重叠Omega_III_R  (SEQ ID NO：12)
  重叠Alpha_F_  (SEQ ID NO：13)
  prGli_F  (SEQ ID NO：14)
  prHorDF  (SEQ ID NO：15)
  BAR_F  (SEQ ID NO：16)
  BAR_R  (SEQ ID NO：17)
实施例2.醇溶蛋白的提取和MALDI/TOF和A-PAGE分析
将阳性系的种子在研钵中磨碎获得面粉。随后，所述面粉用1ml 0.5M的氯化钠溶液在室温下(RT)在搅拌器中洗涤15分钟，在13000rpm离心10分钟。弃去上清液，沉淀同样在搅拌情况下用蒸馏水在室温下洗涤15分钟。随后，将样品在13000rpm离心10分钟，弃去上清液。使用60％(v/v)的乙醇水溶液按5∶1的比例(μl乙醇∶mg面粉)从沉淀提取醇溶蛋白，在室温下搅拌45分钟。随后，将样品在13000rpm离心，在新试管中收集含有醇溶蛋白的上清液。提取物组分被用于通过MALDI-TOF质谱鉴定醇溶蛋白，另一组分通过酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)分离。对于MALDI分析，我们取5μl提取的醇溶蛋白，加入2μl 50mM的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(ODGP)溶液和25μl含有0.1％(v/v)三氟醋酸(TFA)的30％(v/v)的乙腈水溶液中饱和的芥子酸，该溶液用作基质溶液。混合物在Speed-Vac离心机中干燥15分钟，残余物溶于6μl含有0.1％TFA的60％(v/v)的乙醇水溶液中。将混合物放置在不锈钢样品容器中，在室温下干燥5分钟。在MALDI-TOF Voyager DE-PRO(PE Biosystems)中分析样品，使用标准配置。以线性阳性模式记录光谱，电压加速为25kV，电压网格为93％，延迟700纳秒。累积200激光光谱构建醇溶蛋白图谱。
醇溶蛋白的A-PAGE凝胶分离按照Khan等人所描述的标准方法进行(1985.Cereal Chemistry 62：310-313)。
经SDS-PAGE凝胶分离后醇溶蛋白的杂交(蛋白质印迹)使用抗体R5进行(Valdez et al.2003，Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.15：465-474)，这是由Codex Alimentarius承认的用于检测食物中麸质的法定方法。
A-PAGE和MALDI-TOF凝胶分析显示，该杂交序列的组合在沉默小麦醇溶蛋白方面非常有效。
图3显示了使用A-PAGE和MALDI-TOF技术，用本发明的多核苷酸转化的小麦栽培变种BW208的植物种子醇溶蛋白的分离和鉴定。在图3A中，可观察到与原始的小麦栽培变种BW208(Triticumaestivum L.ssp.aestivum)相比，用载体pGhp-ω/α/β/γ(B377-2-3)转化的面粉小麦系种子中相应于α、β、γ、ω醇溶蛋白的条带的衰减。在图3B中，可观察到相应于α、β、γ、ω醇溶蛋白的光谱表达特征，每个峰相应于不同的蛋白质。在该图中，标明了相应于各类型醇溶蛋白的峰。从相应于对照植物和用本发明多核苷酸转化的植物的表达图谱中可以发现，相对于对照植物中各醇溶蛋白的峰的抑制非常明显，从而表明本发明的多核苷酸和方法在该栽培变种的小麦谷物中的醇溶蛋白转录后沉默中的效果。
图4和5显示了用本发明的多核苷酸转化的小麦变种BW2003(Triticum aestivum L.ssp.aestivum)和小麦变种Don Pedro(Triticumturgidum L.ssp.Durum)的植物种子醇溶蛋白的A-PAGE分离和鉴定结果。可以发现，在两张图中，相对于各自的对照，用载体pGhp-ω/α/β/γ(B377-2-3)转化的小麦系种子醇溶蛋白α、β、γ、ω的条带均衰减。
图6显示了对照系BW208和三个用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的相同基因型的小麦系种子(B382-4-1)的醇溶蛋白的A-PAGE凝胶分离。包含于该载体的启动子是D-大麦蛋白启动子(SEQ ID NO：7)。可以发现在这些转基因系的种子中，相应于小麦α、β、γ、ω醇溶蛋白的条带的衰减。
图7显示了用载体pGhp-ω/α/β/γ转化的两个面粉小麦系(Triticumaestivum L.ssp.aestivum)的蛋白质印迹分析。所述载体含有序列SEQ IDNO：7编码的启动子。
在胶A中，可以发现三个转基因系B382-4-1的小麦谷物醇溶蛋白(l1，l2和l3)的SDS-PAGE凝胶分离：在胶B中，可以发现两个转基因系B374-6-2的小麦谷物醇溶蛋白(O2和O3)的SDS-PAGE凝胶分离。随后，凝胶与单克隆抗体R5杂交，其识别对乳糜泻患者有毒的肽类。单克隆抗体R5是Codex Alimentarius承认的用于检测食物中麸质的法定方法。
在图7A中，未观察到用于抗体R5检测的可见水平的表达本发明的肽的BW208小麦系的醇溶蛋白，在图7B中，可观察到其他转基因小麦变种BW2003中醇溶蛋白的显著下降。
在图8中，可观察到当与R5麸质特异性抗体在SDS-PAGE凝胶上基因型BW208的三个B375-3-1转基因系谷物(称为A1，A2和A3)和两个B377-2-3转基因系小麦谷物的醇溶蛋白的衰减。转基因系含有γ醇溶蛋白启动子，即它们被载体pGhp-ω/α/β/γ所转化。
Figure IDA0000080832840000011
Figure IDA0000080832840000021
Figure IDA0000080832840000031
Figure IDA0000080832840000041

Claims (22)

1.与包含由间隔序列隔开的两条序列对(a1-a2)和(b2-b1)的序列具有至少90％同一性的多核苷酸，其中：
a.序列a1、a2、b1和b2各不相同，以下列形式选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4：
b.如果a1是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4，b1是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：1，以及a2是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，并且
c.如果a1是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，b1是SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：2，以及a2是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4。
2.包含由间隔序列隔开的两条序列对(a1-a2)和(b2-b1)的多核苷酸，其中序列a1、a2、b1和b2如权利要求1中(a)-(c)段所述。
3.权利要求1或2所述的多核苷酸，其中a1是SEQ ID NO：1，a2是SEQ ID NO：2，b2是SEQ ID NO：3，并且b1是SEQ ID NO：4。
4.权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，其中间隔序列是SEQ IDNO：5。
5.权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，还包含与其5’端功能性连接的基因表达调控序列。
6.权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述基因表达调控序列是SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7。
7.由权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸编码的RNA序列，其能够形成hpRNA，其中对a1-a2编码的序列与对b2-b1编码的序列完全杂交。
8.权利要求7的hpRNA序列产生的siRNA。
9.包含权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸的表达载体。
10.用权利要求9的表达载体转染的分离的细胞。
11.包含权利要求10的转染细胞的遗传修饰的植物。
12.权利要求11的植物，其属于小麦属。
13.权利要求12的植物，其属于普通小麦(Triticum aestivum)或波斯小麦(Triticum turgidum)。
14.权利要求13的植物，其中所述植物是Bobwhite栽培变种或DonPedro栽培变种。
15.权利要求11-14任一项的植物产生的种子。
16.权利要求11-14任一项的植物产生的花粉、繁殖体、子代或植物部分。
17.权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸在沉默小麦属α、β、γ、ω醇溶蛋白中的用途。
18.权利要求9的载体在沉默小麦属α、β、γ、ω醇溶蛋白中的用途。
19.权利要求10的细胞在沉默小麦属α、β、γ、ω醇溶蛋白中的用途。
20.权利要求15的种子在制备食物组合物中的用途。
21.权利要求20的组合物在制备功能性食品、维他命补充剂或营养补充剂中的用途。
22.获得权利要求11-14任一项所述的遗传修饰的植物的方法，包括下列步骤：
a.选择植物的一部分，
b.将根据权利要求9的载体转染到a的植物部分的细胞中，
c.选择b的转染的细胞，其包括根据权利要求1-6任一项的多核苷酸，
d.从c中选择的细胞再生至少一种植物，
e.选择一种或多种根据d再生的植物，其中多核苷酸被转录成hpRNA，并且
f.选择一种或多种根据e获得的植物，其种子显示α、β、γ、ω醇溶蛋白的沉默。
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