ES2903085T3

ES2903085T3 - Gen de resistencia a la roya

Info

Publication number: ES2903085T3
Application number: ES14837281T
Authority: ES
Inventors: Evans Lagudah; John Moore
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2022-03-31
Anticipated expiration: 2034-08-21
Also published as: US20200354740A1; AU2014308558A1; CA2921784C; AU2014308558B2; US10557147B2; DK3036328T3; CN105612255A; US10647992B2; US20190271002A1; US11421246B2; AU2021200933A1; EP4001300A1; CA2921784A1; MX2021008341A; US12037595B2; US20160208279A1; BR112016003671B1; US20230203526A1; BR112016003671A2; US9994864B2

Abstract

Una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, y en donde el polinucleótido se une operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen de resistencia a la roya

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con nuevos polipéptidos transportadores y genes que los codifican, que pueden usarse para conferir a una planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos.

Antecedentes de la invención

Se han identificado y usado en el fitomejoramiento, numerosos genes que confieren resistencia a patógenos. Sin embargo, la resistencia a patógenos de un solo gen en las plantas a menudo se vuelve ineficaz debido a la aparición de nuevas razas virulentas del agente de la enfermedad. Por el contrario, se cree que la resistencia duradera de las plantas a las enfermedades se controla generalmente por múltiples genes. Se han aislado y clonado algunos genes de resistencia a la roya del trigo (Feuillet y otros, 2003; Huang y otros, 2003; Cloutier y otros, 2007) y otros cereales (Collins y otros, 1999; Brueggeman y otros, 2002) y son predominantemente de la clase de genes de resistencia principal (R) de sitio de unión a nucleótidos y de la repetición rica en leucina (NB-LRR). Por ejemplo, tres genes R de trigo (Lr1, Lr10 y Lr21) que brindan protección contra el hongo de la roya de la hoja del trigo, Puccinia triticina, han sido clonados (Somers y otros, 2004; Hayden y otros, 2008; Manly y otros, 2001). Una excepción es el gen de resistencia a la roya de la cebada Rpg1 que codifica una proteína quinasa. Estos genes codifican la resistencia genpor-gen contra patógenos individuales y generalmente conducen a respuestas fuertes e hipersensibles en los tejidos de la planta tras la infección.

Por el contrario, los genes de resistencia a la roya en el trigo (Triticum aestivum L.) tal como el Lr34, ubicados en el brazo del cromosoma 7DS, confieren una resistencia de amplio espectro y duradera a las plantas adultas contra varios patógenos biotróficos obligados, incluidos los hongos de los Ascomicetos y Basidiomicetos. Estos incluyen la roya de la hoja, la roya rayada, la roya del tallo y el oídio y, por lo tanto, el gen Lr34 se ha empleado ampliamente en el fitomejoramiento del trigo a pesar de su fenotipo de respuesta más débil y no hipersensible (Dyck, 1977 y 1987; German y Kolmer, 1992; Bossolini y otros, 2006; Spielmeyer y otros, 2008). Cultivares con el locus de resistencia Lr34 tal como Frontana han tenido una resistencia duradera eficaz al hongo de la roya de la hoja Puccinia triticina Eriks (Dyck y otros, 1966; Singh y Rajaram, 1994). Hasta la fecha, los aislamientos de P. triticina con virulencia completa a Lr34 no se han detectado (Kolmer y otros, 2003). El gen Lr34 se clonó recientemente y se mostró que codifica una proteína de la familia de transportadores ABC (Krattinger y otros, 2009), aunque no se mostró su función como transportador. La resistencia Lr34 ha permanecido genéticamente inseparable del gen designado Yr18 que confiere resistencia a la roya rayada (P. Striiformis) (Singh, 1992; McIntosh, 1992). La cosegregación de Lr34/Yr18 con otros rasgos tales como la necrosis de la punta de la hoja (Ltn1) en la fase de planta adulta, el oídio (recientemente designado comoPm38), la tolerancia al virus del enanismo amarillo de la cebada (Bdv1) y a la mancha borrosa (Bipolaris sorokiniana) se han documentado (Singh, 1992a,b; McIntosh, 1992; Joshi y otros, 2004; Spielmeyer y otros, 2005; Liang y otros, 2006), y se cree que todos estos fenotipos se confieren por el polipéptido de resistencia Lr34.

Un segundo gen que confiere resistencia a plantas adultas de amplio espectro contra varios patógenos biotróficos obligados es elLr67, que se ubica en el cromosoma 4DL en trigo, y se encuentra en algunas accesiones de trigo tal como RL6077 (Herrera-Foessel y otros, 2011). Por el contrario, con el Lr34, el gen Lr67 no se ha usado ampliamente para producir cultivares resistentes para la producción comercial de trigo. Aunque un informe inicial (Dyck y otros, (1994) basado en fenotipos de plantas sugirió que el gen de resistencia en RL6077 podría ser una translocación delLr34, subsecuentemente se mostró que este no era el caso (Herrera-Foessel y otros, 2011). Después de mapear el gen en dos poblaciones segregantes, Hiebert y otros, (2010) designaron el gen en RL6077 como Lr67. A pesar de que Lr67 también conduce a la necrosis de la punta de la hoja y proporciona una resistencia parcial, de amplio espectro, de plantas adultas a la roya de la hoja y la roya rayada igual que Lr34, estos genes son claramente diferentes.

Es necesario determinar la base molecular de genes tales como el Lr67 que proporcionan resistencia cuantitativa a patógenos de plantas adultas no específicas de raza o resistencia parcial a un amplio espectro de patógenos.

El documento WO 2006/076423 describe células vegetales transgénicas con ADN recombinante para la expresión de proteínas que son útiles para impartir rasgos agronómicos mejorados a plantas de cultivo transgénicas.

El documento WO 2000/012736 describe un método para aislar genes de resistencia a enfermedades en plantas. Resumen de la invención

La invención proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que, cuando se expresa en una planta, confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia tal como se indica en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, y en donde el polinucleótido se une operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

La invención proporciona además una planta transgénica que comprende células de la invención, en donde la planta transgénica es transgénica para el polinucleótido exógeno, y en donde la planta tiene una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos en comparación con una planta isogénica que carece del polinucleótido exógeno.

La invención proporciona además una planta transgénica que contiene un ácido nucleico introducido en el genoma de una célula mediante manipulación experimental, en donde el ácido nucleico es un alelo o variante de un gen Lr67 que confiere resistencia a la planta a uno o más hongos patógenos biotróficos y codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO:1, y el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO: 1, en donde además la planta se selecciona del grupo que consiste en cebada, centeno, avena, arroz, maíz, sorgo, uvas, remolacha azucarera, remolacha forrajera, manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas, moras, frijoles, lentejas, guisantes, soja, colza u otras Brassicas, mostaza, amapola, aceitunas, girasoles, cártamo, lino, coco, plantas de aceite de ricino, cacao en grano y cacahuetes.

La invención proporciona además un proceso para determinar si un polipéptido confiere resistencia o susceptibilidad a uno o más hongos patógenos biotróficos, que comprende:

i) obtener un polinucleótido unido operativamente a un promotor, el polinucleótido codifica el polipéptido, en donde el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a una SEQ ID NO:1, y en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1,

ii) introducir por transformación el polinucleótido en una planta,

iii) determinar si el nivel de resistencia o susceptibilidad al uno o más hongos patógenos biotróficos aumenta o disminuye con relación a una planta isogénica que carece del polinucleótido, y

iv) opcionalmente, si aumenta el nivel de resistencia o susceptibilidad, seleccionar un polinucleótido que codifica el polipéptido que, cuando se expresa, confiere resistencia o susceptibilidad al uno o más hongos patógenos biotróficos.

La invención proporciona además un vector quimérico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, o una secuencia que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos biotróficos patógenos y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO:1, donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO: 1, y en donde el polinucleótido se une operativamente a un promotor.

La invención proporciona además un método para producir una planta transgénica de la invención, el método comprende las etapas de

i) introducir mediante la transformación del vector de la invención en una célula de una planta, y

ii) regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

La invención proporciona además un método para identificar una planta que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que, cuando se expresa en una planta, confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en SEQ ID.NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID nO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto a la glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, el método que comprende las etapas de

i) obtener una muestra de ácido nucleico de una planta, y

ii) cribar la muestra para detectar la presencia o ausencia del polinucleótido.

La invención proporciona además una parte de la planta de una planta de la invención, en donde la parte de la planta comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, y en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona además una parte de la planta de una planta de la invención, en donde la parte de la planta comprende un ácido nucleico que es un alelo o variante de un gen Lr67 que confiere resistencia a la planta a uno o más hongos patógenos biotróficos y codifica un polipéptido que comprende un amino secuencia de ácido como se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona además un método para producir un ingrediente alimenticio, un alimento o un producto no alimenticio, el método comprende el procesamiento de una semilla de la invención.

La invención proporciona además un método para preparar malta, que comprende la etapa de germinar una semilla de la invención.

La invención proporciona además el uso de una planta de la invención, o parte de la planta de la invención, como pienso para animales, o para producir pienso para consumo animal o alimento para consumo humano.

La invención proporciona además un método para producir un producto a partir de una planta de la invención y/o una parte de la planta de la invención, en donde el producto es un producto alimenticio o producto de bebida que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que cuando se expresa en un planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO:1, y en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona además un método para producir un producto a partir de una planta de la invención y/o una parte de la planta de la invención, en donde el producto es un producto alimenticio o producto de bebida que comprende un ácido nucleico que es un alelo o variante de un gen Lr67 que confiere resistencia a la planta a uno o más hongos patógenos biotróficos y codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se proporciona en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO: 1.

Los presentes inventores han identificado nuevos polipéptidos transportadores y genes que los codifican, que pueden usarse para conferir a una planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos.

En un primer aspecto como se define adicionalmente en las reivindicaciones, la presente invención proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que se caracteriza por uno o más o todos de:

i) cuando se expresa en una planta, el polipéptido confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas: roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio,

ii) cuando se expresa en una célula, el polipéptido no es tan activo en el transporte de glucosa a través de una membrana de la célula como un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:4,

iii) cuando se expresa en una célula, el polipéptido es activo como transportador de azúcar,

iv) el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o un fragmento biológicamente activo de este y

v) el polipéptido no comprende una glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, preferentemente el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en la posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO: 1,

en donde el polinucleótido se une operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

En una modalidad preferida como se define adicionalmente en las reivindicaciones, el polipéptido tiene al menos las características i) y iv), i), ii) y iv), ii) y iv), o iv) y v), con mayor preferencia las características i), iv) y v), i), ii), iv) y v), o i), iv) y v).

En una modalidad, el uno o más hongos patógenos biotróficos es una roya o un oídio o tanto una roya como un oídio. Los ejemplos de hongos biotróficos incluyen, pero no se limitan a, Blumeria graminis f. sp. tritici, Fusarium graminearum, Bipolaris sorokiniana, Erysiphe graminis f. sp. tritici, Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia Striiformis, Puccinia hordei y Puccinia recondita f. sp. tritici.

En una modalidad, la célula es una célula vegetal o de levadura. Con mayor preferencia, la célula es una célula vegetal. En una modalidad, la célula vegetal es una célula vegetal de cereal tal como una célula vegetal de trigo. En otra modalidad, la célula vegetal es una célula de uva.

En una modalidad, el promotor dirige la expresión génica en una célula de la hoja y/o el tallo.

Como se define en las reivindicaciones, el polipéptido no comprende una glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1 y, por ejemplo, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a uno o más o todas las SEQ ID NO 1, 4 o 7 a 9, o un fragmento biológicamente activo de una o más de estas.

En una modalidad preferida, el polipéptido comprende un aminoácido en la posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, en donde el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en arginina, lisina e histidina.

En una modalidad preferida adicional, el polipéptido no comprende una valina en una posición correspondiente al aminoácido número 387 de la SEQ ID nO:1, preferentemente el polipéptido comprende un aminoácido distinto de valina en la posición correspondiente al aminoácido número 387 de la SEQ ID NO:1. Con mayor preferencia, el polipéptido comprende un aminoácido en la posición correspondiente al aminoácido número 387 de la SEQ ID NO:1, en donde el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en leucina, isoleucina, metionina, alanina y fenilalanina.

En una modalidad, el polinucleótido exógeno se integra en el genoma de la célula.

En una modalidad adicional, el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica, al menos 90 % idéntica o al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO:1, o un fragmento biológicamente activo de este.

En una modalidad, el polipéptido comprende 12 dominios transmembrana.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende células de la invención, en donde la planta transgénica es transgénica para el polinucleótido exógeno como se define en las reivindicaciones.

En una modalidad preferida, cada una de las células somáticas de la planta comprende el polinucleótido exógeno. Como se define en las reivindicaciones, la planta tiene una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, la roya del tallo y al oídio, en comparación con una planta isogénica que carece del polinucleótido exógeno.

En una modalidad adicional, la planta tiene una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos en la etapa de crecimiento de la plántula.

En otra modalidad, la planta comprende uno o más polinucleótidos exógenos adicionales que codifican un polipéptido de resistencia a patógenos de plantas distinto de un polipéptido Lr67, preferentemente un polipéptido Lr34, un polipéptido Sr33 o un polipéptido Sr35. Además, los polipéptidos de resistencia a patógenos de plantas incluyen, pero no se limitan a, Lr1, Lr3, Lr2a, Lr3ka, Lr11, Lr13, Lr16, Lr17, Lr18, Lr21 y LrB.

Preferentemente, la planta es una planta de cereales. Los ejemplos de plantas de cereales transgénicas de la invención incluyen, pero no se limitan a, trigo, cebada, maíz, arroz, avena y triticale. En una modalidad particularmente preferida, la planta es trigo. En otra modalidad, la planta es una vid.

En una modalidad, el promotor dirige la expresión génica en una parte aérea de la planta, como las hojas y/o los tallos.

Preferentemente, la planta es homocigótica para los polinucleótidos exógenos.

En una modalidad adicional, la planta crece en un campo.

También se proporciona una población de al menos 100 plantas de la invención que crecen en un campo.

En otro aspecto, como se define en las reivindicaciones, la presente invención proporciona un proceso para determinar si un polipéptido confiere resistencia o susceptibilidad a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, que comprende:

i) obtener un polinucleótido unido operativamente a un promotor, el polinucleótido que codifica el polipéptido, en donde el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a una SEQ ID NO: 1, o un fragmento biológicamente activo de este,

ii) introducir el polinucleótido en una planta,

iii) determinar si el nivel de resistencia o susceptibilidad al uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, aumenta o disminuye en relación con una planta isogénica que carece del polinucleótido, y

iv) opcionalmente, si se aumenta el nivel de resistencia o susceptibilidad, seleccionar un polinucleótido que codifica el polipéptido que, cuando se expresa, confiere resistencia o susceptibilidad al uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio.

En una modalidad, uno o más de los siguientes se aplican al proceso,

a) el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, una secuencia que es al menos 40 % idéntica a una o ambas de la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3, o una secuencia que hibrida con una o ambas la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3,

b) la planta es una planta de cereal, como una planta de trigo o una planta de vid,

c) el polipéptido es un polipéptido de planta o mutante de este, y

d) la etapa ii) comprende además la integración estable del polinucleótido unido operativamente a un promotor en el genoma de la planta

e) el polipéptido se caracteriza por una o más de las características definidas anteriormente en relación con una célula de la invención.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un polipéptido sustancialmente purificado y/o recombinante que se caracteriza por uno o más o todos de:

i) cuando se expresa en una planta, el polipéptido confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio,

iv) el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, o un fragmento biológicamente activo de este, y

v) el polipéptido no comprende una glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, preferentemente el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en la posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1.

En una modalidad preferida, el polipéptido se caracteriza por una o más de las características definidas anteriormente en relación con una célula de la invención.

En otro aspecto, el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID nO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica, al menos 90 % idéntica, o al menos 95 % idéntica, a la SEQ ID NO:1, o un fragmento biológicamente activo de este.

En una modalidad, un polipéptido al que se refiere la invención es una proteína de fusión que comprende además al menos otra secuencia polipeptídica. El al menos otro polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que mejora la estabilidad de un polipéptido de la presente invención, o un polipéptido que ayuda en la purificación o detección de la proteína de fusión.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un polinucleótido aislado y/o exógeno que comprende nucleótidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, una secuencia que es al menos 40 % idéntica a uno o ambos de la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3, una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, o una secuencia que hibrida con una o ambas de la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector quimérico que comprende un polinucleótido al que se refiere la invención.

Preferentemente, el polinucleótido se une operativamente a un promotor.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno al que se refiere la invención y/o un vector de la invención.

La célula puede ser cualquier tipo de célula tal como, pero sin limitarse a, una célula vegetal, una célula bacteriana, una célula animal o una célula de levadura.

Preferentemente, la célula es una célula vegetal. Con mayor preferencia, la célula vegetal es una célula vegetal de cereal. Aún con mayor preferencia, la célula vegetal de cereal es una célula de trigo. En otra modalidad, la célula vegetal es una célula de uva.

En un caso adicional, la presente descripción se ocupa de un método para producir el polipéptido al que se refiere la invención, el método comprende expresar en una célula o sistema de expresión libre de células el polinucleótido de la invención.

Preferentemente, el método comprende además aislar el polipéptido.

En otro caso, la presente descripción se ocupa de un método para producir la célula de la invención, el método comprende la etapa de introducir el polinucleótido de la invención, o un vector de la invención, en una célula.

Preferentemente, la célula es una célula vegetal.

En otro aspecto definido en las reivindicaciones, la presente invención proporciona un método para producir una planta transgénica de la invención, el método comprende las etapas de

i) introducir por transformación un polinucleótido al que se refiere la invención y/o un vector de la invención en una célula de una planta,

ii) regenerar una planta transgénica a partir de la célula, y

iii) opcionalmente cosechar semillas de la planta, y/o

iv) producir opcionalmente una o más plantas progenitoras a partir de la planta transgénica, de esta manera se produce la planta transgénica.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para producir una planta que ha integrado en su genoma un polinucleótido que codifica un polipéptido al que se refiere la invención, el método comprende las etapas de

i) i) cruzar dos plantas parentales, en donde al menos una planta comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido,

ii) cribar una o más plantas progenitoras del cruce para detectar la presencia o ausencia del polinucleótido, y iii) seleccionar una planta progenitora que comprende el polinucleótido,

de esta manera se produce la planta.

En una modalidad, el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a la SEQ ID NO:1, o un fragmento biológicamente activo de esta, y en donde cuando se expresa en la planta, el polipéptido confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio.

En una modalidad, al menos una de las plantas parentales es una planta de trigo tetraploide o hexaploide. En otra modalidad, la planta parental es una vid.

En otra modalidad, la etapa ii) comprende analizar una muestra que comprende ADN de la planta para el polinucleótido.

En modalidad adicional, la etapa iii) comprende

i) seleccionar plantas de la progenie que son homocigotas para el polinucleótido, y/o

ii) analizar la planta o una o más plantas de la progenie de estas para determinar su resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio.

En otra modalidad, el método comprende además

iv) retrocruzar la progenie del cruce de la etapa i) con plantas del mismo genotipo que una primera planta parental que carece de un polinucleótido que codifica el polipéptido durante un número suficiente de veces para producir una planta con una mayoría del genotipo de la primera planta parental pero que comprende el polinucleótido, y

v) seleccionar una planta de progenie que tenga resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio.

En una modalidad, el método comprende además la etapa de analizar la planta en busca de al menos otro marcador genético.

También se proporciona una planta producida mediante el uso del método de la invención, como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso del polinucleótido al que se refiere la invención, o un vector de la invención, para producir una célula recombinante y/o una planta transgénica, como se define en las reivindicaciones.

En una modalidad, la planta transgénica tiene una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, en comparación con una planta isogénica que carece del polinucleótido y/o vector exógeno.

En un aspecto adicional, como se define en las reivindicaciones, la presente invención proporciona un método para identificar una planta que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido al que se refiere la invención, el método comprende las etapas de

i) obtener una muestra de ácido nucleico de una planta, y

En una modalidad, la presencia del polinucleótido indica que la planta tiene una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, con mayor preferencia a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, en comparación con una planta isogénica que carece del polinucleótido exógeno.

En una modalidad, se amplifica una región genómica que abarca el polinucleótido y se secuencia el producto de amplificación para determinar si codifica el polipéptido. Los expertos en la técnica pueden diseñar fácilmente cebadores útiles para la amplificación y útiles para la secuenciación.

En una modalidad adicional, el método identifica una planta transgénica de la invención.

En una modalidad, el método comprende además producir una planta a partir de una semilla antes de la etapa i). También se proporciona una parte de la planta de la planta de la invención, como se define en las reivindicaciones. En una modalidad, la parte de la planta es una semilla que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido al que se refiere la invención.

En un caso, la presente descripción se ocupa de un método para producir una parte de la planta, el método comprende,

a) cultivar una planta de la invención, y

b) cosecha de la parte de la planta.

En otro aspecto, como se define en las reivindicaciones, la presente invención proporciona un método para producir harina, harina integral, almidón u otro producto obtenido a partir de semillas, el método comprende;

a) obtención de semilla de la invención, y

b) extracción de la harina, harina integral, almidón u otro producto.

En un caso, la presente invención se relaciona con un producto elaborado a partir de una planta de la invención y/o una planta que forma parte de la invención.

En una modalidad, la parte es una semilla.

En una modalidad, el producto es un producto alimenticio o un producto de bebida. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a;

i) el producto alimenticio seleccionado del grupo que consiste en: harina, almidón, panes con levadura o sin levadura, pastas alimenticias, fideos, forrajes para animales, cereales para el desayuno, aperitivos, pasteles, malta, cerveza, pasteles y alimentos que contienen salsas a base de harina, o

ii) el producto de bebida es cerveza o malta.

En una modalidad alternativa, el producto es un producto no alimenticio. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, películas, revestimientos, adhesivos, materiales de construcción y materiales de embalaje.

En un aspecto adicional, como se define en las reivindicaciones, la presente invención proporciona un método para preparar un producto alimenticio de la invención, el método comprende mezclar semilla o harina, harina integral o almidón de la semilla, con otro ingrediente alimenticio.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar malta, que comprende la etapa de germinar la semilla de la invención.

También se proporciona el uso de una planta de la invención, o parte de esta, como pienso para animales, o para producir pienso para consumo animal o alimento para consumo humano.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende uno o más de un polipéptido al que se refiere la invención, un polinucleótido al que se refiere la invención, un vector de la invención o una célula recombinante de la invención, y uno o más portadores aceptables.

En un caso, la presente descripción se ocupa de un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a la SEQ ID NO:1, un fragmento biológicamente activo de este, el método comprende:

i) poner en contacto el polipéptido con un compuesto candidato, y

ii) determinar si el compuesto se une al polipéptido.

En un caso, el polipéptido se integra en una membrana celular, preferentemente la membrana de una célula vegetal. En un caso adicional, la presente descripción se ocupa de un método para identificar un compuesto que se transporta a través de una membrana celular por un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:4 o una secuencia de aminoácidos. que es al menos 40 % idéntica a una o ambas la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:4, o un fragmento biológicamente activo de estos, el método comprende:

i) poner en contacto el polipéptido integrado en una membrana celular, preferentemente la membrana de una célula vegetal, con un compuesto candidato,

ii) determinar si el compuesto se transporta de un lado de la membrana al otro por el polipéptido.

Cualquier modalidad en la presente descripción se considerará aplicable mutatis mutandis a cualquier otra modalidad a menos que se indique específicamente lo contrario.

La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente descripción, las cuales se destinan para el propósito de la ejemplificación solamente. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la invención, como se describe en la presente descripción.

A lo largo de esta descripción, a menos que se indique específicamente lo contrario o que el contexto requiera otra cosa, la referencia a una sola etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia se considerará que abarca una y una pluralidad (es decir, una o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.

La invención se describe a continuación mediante los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las Figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos adjuntos

Figura 1 - Genómica comparativa y análisis de mutantes.

Figura 2 - El gen Hsp70 eliminado se une completamente al Lr67.

Figura 3 - Genómica comparativa y análisis de mutantes que incluyen SUT y PIP.

Figura 4 - Cambios de nucleótidos encontrados en variantes del Lr67.

Figura 5 - Secuencia de aminoácidos (514 aminoácidos, SEQ ID NO:1) del polipéptido SUT codificado por el alelo Lr67 (resistente) del trigo. La arginina en la posición 144 en el cuarto dominio transmembrana predicho y la leucina en la posición 387 distinguen el polipéptido resistente Lr67 del susceptible Lr67.

Figura 6 - secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:3) del ADNc correspondiente al alelo resistente Lr67. Dos posiciones SNP que distinguen /- Lr67 están en las posiciones 514 y 1243; estos dan como resultado sustituciones de aminoácidos en los polipéptidos codificados. El codón de inicio de la traducción está en la posición 85-87 y el codón de parada de la traducción está en la posición 1627-1629.

Figura 7 - Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:4) del polipéptido susceptible Lr67 (SUT).

Figura 8 - Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:6) del ADNc correspondiente al alelo SUT susceptible Lr67. Figura 9 - Alineación de las secuencias de aminoácidos del polipéptido Lr67 (resistente) de trigo (SEQ ID NO:1) con el homólogo Arabidopsis thaliana polipéptido (Arath; Número de acceso de Genebank NP_198006, 526 aminoácidos) (SEQ ID NO:7). Las estrellas indican un residuo de aminoácido idéntico en esa posición, mientras que "+" indica un aminoácido similar en esa posición.

Figura 10 - Alineación de las secuencias de aminoácidos del polipéptido Lr67 (resistente) de trigo (SEQ ID NO:1) con el arroz homólogo (Oryza sativa) polipéptido (Número de acceso de Genbank AAQ24871, 515 aminoácidos) (SEQ ID NO:8). Las estrellas indican un residuo de aminoácido idéntico en esa posición, un "+" indica un aminoácido similar en esa posición.

Figura 11 - Absorción de glucosa de células de levadura que expresan proteínas Lr67 (resistente) y Lr67 (susceptible).

Figura 12 - Cinética de la absorción de glucosa en levaduras que expresan Lr67 (susceptible).

Figura 13 - Efecto de los aminoácidos variantes sobre el transporte de glucosa por las proteínas Lr67.

Figura 14 - Secuencia de nucleótidos de un fragmento genómico correspondiente a la región codificante de proteína de un gen Lr67 (susceptible). La secuencia comienza con el codón de inicio de traducción ATG y termina con la parada de traducción TGA. Los dos intrones en la región codificante de la proteína son los nucleótidos 137-876 (Intrón 1, 740 nt) y 1197-3154 (Intrón 2, 1958 nt).

Clave para el listado de las secuencias

SEQ ID NO:1 - Proteína de trigo Lr67 (resistente).

SEQ ID NO: 2 - Marco de lectura abierto que codifica la proteína Lr67 (resistente) de trigo.

SEQ ID NO: 3 - ADNc que codifica la proteína Lr67 (resistente) de trigo.

SEQ ID NO:4 - Proteína de trigo Lr67 (susceptible).

SEQ ID NO: 5 - Marco de lectura abierto que codifica la proteína Lr67 (susceptible) de trigo.

SEQ ID NO: 6 - ADNc que codifica la proteína Lr67 (susceptible) de trigo.

SEQ ID NO:7 - Arabidopsis thaliana proteína Lr67.

SEQ ID NO:8 - Arroz (Oryza sativa) proteína Lr67.

SEQ ID NO:9 - Vid (Vitis vinifera) proteína Lr67.

SEQ ID NO:10 - Gen que codifica la proteína Lr67 (susceptible) de trigo.

Descripción detallada de la invención

Técnicas generales y definiciones

A menos que se defina específicamente de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción se considerará que tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, biología molecular de plantas, química de proteínas y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican a lo largo de la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel y otros (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988) y J.E. Coligan y otros (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluidas todas las actualizaciones hasta el presente).

El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" se entenderá como "X e Y" o "X o Y" y se considerará que proporciona apoyo explícito para ambos significados o para cualquiera de ellos.

A través de toda esta descripción la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entiende que implica la inclusión de un elemento declarado, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otros elemente, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.

Polipéptidos

La presente invención se relaciona con polipéptidos que, cuando se expresan en una planta, confieren a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio. La presente invención también se relaciona con polipéptidos que, cuando se expresan en una célula, no son tan activos en el transporte de glucosa a través de una membrana de la célula como un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:4. Adicionalmente, la presente invención también se relaciona con polipéptidos que, cuando se expresan en una célula, actúan como transportadores de azúcar. En una modalidad preferida como se define en las reivindicaciones, el polipéptido se codifica por un alelo o variante de un gen Lr67 que confiere resistencia a la planta a uno o más hongos patógenos biotróficos. Ejemplos de dichos polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que comprenden una secuencia de aminoácidos como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1. El polipéptido de la invención confiere una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos en comparación con una planta isogénica que carece de un polinucleótido que codifica el polipéptido.

Como se usa en la presente, el término "Lr67" se relaciona con una familia de proteínas que comparte una identidad de secuencia de aminoácidos primaria alta, por ejemplo, al menos el 40 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de identidad con uno o más de las secuencias de aminoácidos que se proporcionas como la SEQ ID NO:1, 4 o 7 a 9, preferentemente la SEQ ID NO:1. Los presentes inventores han determinado que algunas variantes de la familia de proteínas Lr67, cuando se expresan en una planta, confieren a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio. Un ejemplo de dicha variante comprende una secuencia de aminoácidos que se proporciona como la SEQ ID NO:1. Por tanto, las variantes que confieren resistencia se refieren en la presente descripción como polipéptidos Lr67 (resistentes), mientras que aquellas que no lo hacen (como las que comprenden la secuencia de aminoácidos que se proporciona como la SEQ ID NO:4) se refieren en la presente descripción como polipéptidos Lr67 (susceptibles). En una modalidad preferida, las proteínas Lr67 (resistentes) no comprenden una glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, preferentemente el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en la posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1. El aminoácido en la posición 144 es preferentemente un aminoácido cargado como arginina, lisina o histidina.

Como se usa en la presente, "resistencia" es un término relativo en el sentido de que la presencia de un polipéptido de la invención (i) reduce los síntomas de la enfermedad de una planta que comprende el gen (gen R (resistente)) que confiere resistencia, en relación con una planta que carece el gen R y/o (ii) reduce la reproducción o propagación de patógenos en una planta o dentro de una población de plantas que comprenden el gen R. La resistencia, como se usa en la presente, es relativa a la respuesta "susceptible" de una planta al mismo patógeno. Típicamente, la presencia del gen R mejora al menos un rasgo de producción de una planta que comprende el gen R cuando se infecta con el patógeno, como el rendimiento de grano, en comparación con una planta isogénica infectada con el patógeno pero que carece del gen R. La planta isogénica puede tener cierto nivel de resistencia al patógeno o puede clasificarse como susceptible. Por tanto, los términos "resistencia" y "resistencia mejorada" se usan, generalmente, indistintamente en la presente descripción. Además, un polipéptido al que se refiere la invención no confiere necesariamente una resistencia completa a los patógenos, por ejemplo, cuando todavía se producen algunos síntomas o hay alguna reproducción de patógenos en la infección, pero en una cantidad reducida dentro de una planta o una población de plantas. La resistencia puede ocurrir solo en algunas etapas de crecimiento de la planta, por ejemplo, en plantas adultas (completamente desarrolladas en tamaño) y menos, o nada en absoluto, en plántulas o en todas las etapas de crecimiento de la planta. Mediante el uso de una estrategia transgénica para expresar un polipéptido Lr67 en una planta, puede proporcionarse resistencia a la planta de la invención durante todo su crecimiento y desarrollo. La resistencia mejorada puede determinarse mediante varios métodos conocidos en la técnica, como analizar las plantas para determinar la cantidad de patógeno y/o analizar el crecimiento de la planta o la cantidad de daño o síntomas de enfermedad en una planta en presencia del patógeno, y comparar uno o más de estos parámetros para una planta isogénica que carece de un gen exógeno que codifica un polipéptido de la invención.

Como se usa en la presente, un "transportador de azúcar" es una proteína unida a la membrana que facilita el movimiento de un azúcar a través de una membrana, por ejemplo, desde el exterior de una célula a la célula, o en la dirección opuesta desde el interior de una célula hacia el exterior, o a través de una membrana de un orgánulo subcelular dentro de la célula. La facilitación puede ser activa, mediante el uso de una fuente de energía, como un gradiente iónico a través de la membrana, o pasiva. Para las proteínas Lr67 (susceptibles), el azúcar puede ser glucosa. En una modalidad, el azúcar es un monosacárido, preferentemente un monosacárido de hexosa o un polisacárido de pentosa. En una modalidad, el azúcar puede modificarse tal como un alcohol de azúcar o azúcar fosforilado.

Como se usa en la presente, la frase "no es tan activo en el transporte de glucosa a través de una membrana de la célula como un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:4" significa que el polipéptido al que se refiere la invención tiene menos de 50 %, o menos del 25 %, o menos del 10 %, de la capacidad de un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:4 para transportar glucosa a una célula tal como una levadura o una célula vegetal. Esto puede determinarse fácilmente como se describe en la presente descripción (véase, por ejemplo, la Figura 11 y los detalles experimentales asociados).

Por "polipéptido sustancialmente purificado" o "polipéptido purificado" se entiende un polipéptido que generalmente se ha separado de los lípidos, ácidos nucleicos, otros péptidos y otras moléculas contaminantes con las que se asocia en su estado nativo. Preferentemente, el polipéptido sustancialmente purificado está al menos en un 90 % libre de otros componentes con los que se asocia naturalmente. En una modalidad, el polipéptido al que se refiere la invención tiene una secuencia de aminoácidos que es diferente a un polipéptido Lr67 de origen natural, es decir, es una variante de secuencia de aminoácidos.

Las plantas transgénicas y las células hospederas de la invención pueden comprender un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido al que se refiere la invención. En estos casos, las plantas y las células producen un polipéptido recombinante. El término "recombinante" en el contexto de un polipéptido se refiere al polipéptido codificado por un polinucleótido exógeno cuando se produce por una célula, polinucleótido que ha sido introducido en la célula o una célula progenitora mediante las técnicas de ADN o ARN recombinante tales como, por ejemplo, la transformación. Típicamente, la célula comprende un gen no endógeno que provoca la producción de una cantidad alterada del polipéptido. En una modalidad, un "polipéptido recombinante" es un polipéptido elaborado mediante la expresión de un polinucleótido exógeno (recombinante) en una célula vegetal.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan, generalmente, indistintamente.

El % de identidad de un polipéptido se determina mediante análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de huecos=5 y una penalización por extensión de huecos=0,3. La secuencia de consulta tiene al menos 400 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 400 aminoácidos. Con mayor preferencia, la secuencia de consulta tiene al menos 500 aminoácidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 500 aminoácidos. Aún con mayor preferencia, el análisis GAP alinea dos secuencias en toda su longitud, que para un polipéptido Lr67 es de aproximadamente 514 residuos de aminoácidos.

Como se usa en la presente, un "fragmento biológicamente activo" es una porción de un polipéptido al que se refiere la invención que mantiene una actividad definida del polipéptido de longitud completa tal como uno o ambos de i) cuando se expresa en una planta, tal como trigo, confiere (mejorada) resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, y ii) cuando se expresa en una célula, el polipéptido es activo como un transportador de azúcar, preferentemente no tan activo para transportar glucosa a través de una membrana de la célula como un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:4. Los fragmentos biológicamente activos pueden tener cualquier tamaño siempre que mantengan la actividad definida, pero preferentemente tienen una longitud de al menos 400 o al menos 500 residuos de aminoácidos. Preferentemente, el fragmento biológicamente activo mantiene al menos el 50 %, al menos el 75 % o al menos el 90 % de la actividad de la proteína de longitud completa. En una modalidad, el fragmento biológicamente activo comprende 12 dominios transmembrana.

Con respecto a un polipéptido definido, se apreciará que las cifras de % de identidad superiores a las que se proporcionas anteriormente abarcarán modalidades preferidas. Por tanto, cuando sea aplicable, a la luz del % mínimo de cifras de identidad, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos 60 %, con mayor preferencia al menos 65 %, con mayor preferencia al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 75 %, con mayor preferencia al menos 76 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 %, con mayor preferencia al menos 91 %, con mayor preferencia al menos 92 %, con mayor preferencia al menos 93 %, con mayor preferencia al menos 94 %, con mayor preferencia al menos 95 %, con mayor preferencia al menos 96 %, con mayor preferencia al menos 97 %, con mayor preferencia al menos 98 %, con mayor preferencia al menos 99 %, con mayor preferencia al menos 99,1 %, con mayor preferencia al menos 99,2 %, con mayor preferencia al menos 99,3 %, con mayor preferencia al menos 99,4 %, con mayor preferencia al menos 99,5 %, con mayor preferencia al menos 99,6 %, con mayor al menos 99,7 %, con mayor preferencia al menos 99,8 %, y aún con mayor preferencia al menos 99,9 % idéntico a la SEQ ID NO. de interés. En una modalidad, un polipéptido al que se refiere la invención no es un polipéptido de origen natural que consiste en una secuencia de aminoácidos que se proporciona como la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:4.

Como se usa en la presente, la frase "en una posición correspondiente al número de aminoácidos" o variaciones de estos se refiere a la posición relativa del aminoácido en comparación con los aminoácidos circundantes. A este respecto, en algunas modalidades, un polipéptido al que se refiere la invención puede tener una mutación de sustitución o eliminación que altera la posición relativa del aminoácido cuando se alinea contra, por ejemplo, la SEQ ID NO:1. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 9, el aminoácido número 178 del Lr67 del trigo (resistente) corresponde al aminoácido número 179 de la proteína Lr67 homóloga de Arabidopsis.

Los mutantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos a los que se relaciona con la presente invención pueden prepararse mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en un ácido nucleico de la presente invención, o mediante in vitro síntesis del polipéptido deseado. Dichos mutantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Puede realizarse una combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar al constructo final, siempre y cuando el producto peptídico final posea las características deseadas. Los mutantes de secuencia de aminoácidos preferidos tienen solo uno, dos, tres, cuatro o menos de 10 cambios de aminoácidos con respecto al polipéptido de tipo salvaje de referencia.

Pueden prepararse polipéptidos mutantes (alterados) mediante el uso de cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de la evolución dirigida o estrategias de diseño racional (véase más abajo). Los productos obtenidos de ADN mutado/alterado pueden cribarse fácilmente mediante el uso de las técnicas descritas en la presente para determinar si tienen uno o más de los siguientes características i) cuando se expresan en una planta, como el trigo, confieren (mejoran) resistencia a uno o más hongos biotróficos patógenos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, ii) cuando se expresa en una célula, el polipéptido codificado no es tan activo en el transporte de glucosa a través de una membrana de la célula como un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:4, y iii) cuando se expresa en una célula, el polipéptido es activo como transportador de azúcar. Por ejemplo, con respecto a i), el método puede comprender la producción de una planta transgénica que exprese el ADN mutado/alterado y la determinación del efecto del patógeno sobre el crecimiento de la planta.

Al diseñar mutantes de secuencia de aminoácidos, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la(s) característica(s) que se modificarán. Los sitios para la mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, mediante (1) la sustitución primero con elecciones conservadoras de aminoácidos y después con selecciones más radicales en dependencia de los resultados obtenidos, (2) la eliminación del residuo objetivo o (3) la inserción de otros residuos adyacentes al sitio ubicado.

Las eliminaciones de la secuencia de aminoácidos varían generalmente de aproximadamente 1 a 15 residuos, con mayor preferencia de aproximadamente 1 a 10 residuos y típicamente de aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos.

Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de polipéptido eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Cuando puede mantenerse una determinada actividad, se prefiere no hacer sustituciones, o sólo hacer sustituciones conservadoras, en posiciones de aminoácidos altamente conservadas en la familia de proteínas de interés. En la Tabla 1, bajo el epígrafe "sustituciones ilustrativas", se muestran Ejemplos de sustituciones conservadoras.

En una modalidad preferida, un polipéptido mutante/variante tiene uno, dos, tres o cuatro cambios de aminoácidos conservadores en comparación con un polipéptido de origen natural. Los detalles de los cambios conservadores de aminoácidos se proporcionan en la Tabla 1. En una modalidad preferida, los cambios no están en uno o más de los residuos que están altamente conservados entre los diferentes polipéptidos proporcionados en la presente descripción, y/o no en las 12 hélices transmembrana de los polipéptidos Lr67. Como el experto sabrá, puede predecirse razonablemente que dichos cambios menores no alterarán la actividad del polipéptido cuando se exprese en una célula recombinante.

La secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido al que se refiere la invención puede usarse para diseñar variantes/mutantes de estos que se basan en comparaciones con polipéptidos transportadores de azúcar estrechamente relacionados (por ejemplo, como se muestra en la Figura 9 y 10). Como apreciará el destinatario experto, es menos probable que los residuos muy conservados entre proteínas estrechamente relacionadas puedan ser alterados, especialmente con sustituciones no conservadoras, y que se mantenga la actividad que los residuos menos conservados (véase más arriba).

También se relacionan con la invención los polipéptidos a los que se relacionan con la presente invención que se modifican diferencialmente durante o después de la síntesis, por ejemplo, mediante biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Los polipéptidos pueden modificarse postraduccionalmente en una célula, por ejemplo, mediante fosforilación, que puede modular su actividad. Estas modificaciones pueden servir para incrementar la estabilidad y/o bioactividad del polipéptido de la invención.

Tabla 1. Sustituciones ilustrativas.

Evolución dirigida

En la evolución dirigida, se aplica mutagénesis aleatoria a una proteína y se usa un régimen de selección para seleccionar variantes que tienen las cualidades deseadas, por ejemplo, mayor actividad. Después se aplican rondas adicionales de mutación y selección. Una estrategia típica de evolución dirigida implica tres etapas:

1) Diversificación: El gen que codifica la proteína de interés se muta y/o se recombina al azar para crear una gran biblioteca de variantes de genes. Pueden construirse bibliotecas de variantes de genes mediante la PCR propensa a errores (véase, por ejemplo, Leung, 1989; Cadwell y Joyce, 1992), a partir de grupos de fragmentos digeridos con DNasaI preparados a partir de plantillas parentales (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b; Crameri y otros, 1998; Coco y otros, 2001) a partir de oligonucleótidos degenerados (Ness y otros, 2002, Coco, 2002) o de mezclas de ambos, o incluso de plantillas parentales no digeridas (Zhao y otros, 1998; Eggert y otros, 2005; Jézéquek y otros, 2008) y generalmente se ensamblan mediante la PCR. También pueden prepararse bibliotecas a partir de secuencias parentales recombinadas in vivo o in vitro por recombinación homóloga o no homóloga (Ostermeier y otros, 1999; Volkov y otros, 1999; Sieber y otros, 2001). También pueden construirse bibliotecas de variantes de genes subclonando un gen de interés en un vector adecuado, que transforma el vector en una cepa "mutadora" como E. coli XL-1 rojo (Stratagene) y propaga las bacterias transformadas durante un número adecuado de generaciones. También pueden construirse bibliotecas de variantes de genes que someten al gen de interés a la mezcla de ADN (es decir, recombinación homóloga in vitro de grupos de genes mutantes seleccionados por fragmentación aleatoria y reensamblaje) como describe ampliamente Harayama (1998). 2) Selección: La biblioteca se evalúa para determinar la presencia de mutantes (variantes) que poseen la propiedad deseada mediante el uso de un cribado o selección. Los cribados permiten identificar y aislar manualmente los mutantes de alto rendimiento, mientras que las selecciones eliminan automáticamente todos los mutantes no funcionales. Un cribado puede implicar la búsqueda de la presencia de residuos de aminoácidos conservados conocidos. Alternativamente, o adicionalmente, un cribado puede implicar la expresión del polinucleótido mutado en un organismo hospedero o parte de este y ensayar el nivel de actividad.

3) Amplificación; Las variantes identificadas en la selección o cribado se replican muchas veces, lo que permite a los investigadores secuenciar su ADN para comprender qué mutaciones han ocurrido.

En conjunto, estas tres etapas se denominan "ronda" de evolución dirigida. La mayoría de los experimentos conllevarán a más de una ronda. En estos experimentos, los "ganadores" de la ronda anterior se diversifican en la ronda siguiente para crear una nueva biblioteca. Al final del experimento, todas las proteínas o polinucleótidos mutantes evolucionados se caracterizan mediante el uso de métodos bioquímicos.

Diseño racional

Una proteína puede diseñarse racionalmente, sobre la base de información conocida acerca de la estructura y el plegamiento de la proteína. Esto puede lograrse mediante el diseño desde cero (de novo) o mediante el rediseño basado en las conformaciones nativas (véase, por ejemplo, Hellinga, 1997; y Lu y Berry, Protein Structure Design and Engineering, Handbook of Proteins 2, 1153-1157 (2007)). El diseño de proteínas implica típicamente la identificación de secuencias que se pliegan en una estructura dada o de objetivo, y puede lograrse mediante el uso de modelos informáticos. Los algoritmos de diseño computacional de proteínas buscan en el espacio entre secuencias y conformaciones, secuencias de baja energía cuando se pliegan en la estructura objetivo. Los algoritmos de diseño computacional de proteínas usan modelos de energía proteica para evaluar cómo las mutaciones afectarían la estructura y función de una proteína. Estas funciones energéticas típicamente incluyen una combinación de mecánica molecular, estadística (es decir, basada en el conocimiento) y otros términos empíricos. El software disponible adecuado incluye IPRO (Rediseño y optimización de proteínas intensivas), EGAD (Un algoritmo genético para el diseño de proteínas), Rosetta Design, Sharpen y Abalone.

Polinucleótidos y genes

La presente invención se refiere a varios polinucleótidos. Como se usa en la presente, un "polinucleótido" o "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" significa un polímero de nucleótidos, que puede ser ADN o ARN o una combinación de estos, e incluye ADN genómico, ARNm, ARNc y ADNc. Los polinucleótidos menos preferidos incluyen el ARNt, el ARNip, el ARNhc y el ARNhp. Puede ser ADN o ARN de origen celular, genómico o sintético, por ejemplo, elaborado en un sintetizador automático, y puede combinarse con carbohidratos, lípidos, proteínas u otros materiales, marcarse con grupos fluorescentes u otros, o unirse a un soporte sólido para realizar una actividad particular definida en la presente descripción, o comprender uno o más nucleótidos modificados que no se encuentran en la naturaleza, bien conocidos por los expertos en la técnica. El polímero puede ser monocatenario, esencialmente bicatenario o parcialmente bicatenario. El emparejamiento de bases, como se usa en la presente, se refiere al emparejamiento de bases estándares entre nucleótidos, incluidos los pares de bases G:U. "Complementario" significa que dos polinucleótidos son capaces de aparearse (hibridarse) a lo largo de parte de sus longitudes, o a lo largo de la longitud completa de uno o ambos. Un "polinucleótido hibridado" significa que el polinucleótido está realmente emparejado con su complemento. El término "polinucleótido" se usa indistintamente en la presente descripción con el término "ácido nucleico". Los polinucleótidos preferidos a los que se relaciona con la invención codifican un polipéptido al que se refiere la invención.

Por "polinucleótido aislado" se entiende un polinucleótido que generalmente se ha separado de las secuencias de polinucleótidos con las que se asocia o une en su estado nativo, si el polinucleótido se encuentra en la naturaleza. Preferentemente, el polinucleótido aislado está al menos en un 90 % libre de otros componentes con los que se asocia naturalmente, si se encuentra en la naturaleza. Preferentemente, el polinucleótido no es de origen natural, por ejemplo, mediante la unión covalente de dos secuencias polinucleotídicas más cortas de una manera que no se encuentra en la naturaleza (polinucleótido quimérico).

La presente invención implica la modificación de la actividad génica y la construcción y uso de genes quiméricos. Como se usa en la presente, el término "gen" incluye cualquier secuencia de desoxirribonucleótidos que incluye una región codificante de proteína o que se transcribe en una célula, pero no se traduce, así como también regiones reguladoras y no codificantes asociadas. Dichas regiones asociadas se ubican típicamente adyacentes a la región de codificación o la región transcrita en los extremos 5'y 3' a una distancia de aproximadamente 2 kb en cada lado. A este respecto, el gen puede incluir señales de control tales como promotores, potenciadores, señales de terminación y/o poliadenilación que se asocian naturalmente con un gen dado, o señales de control heterólogas, en cuyo caso el gen se denomina "gen quimérico". Las secuencias que se ubican en 5' de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias que están ubicadas 3' o aguas abajo de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El término "gen" abarca tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen.

Al "gen Lr67", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de nucleótidos que es homóloga a un ADNc de Lr67 aislado (tal como se proporciona en la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO:6). Como se describe en la presente descripción, algunos alelos y variantes de familia de genes Lr67 codifican una proteína que confiere resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO:3). Los genes Lr67 incluyen los alelos o variantes de orígenes naturales que existen en cereales como el trigo, así como también variantes que se producen artificialmente.

Una forma genómica o clon de un gen que contiene la región transcrita puede interrumpirse con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o "secuencias intermedias", que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a los "exones" de el gen. Un "intrón", como se usa en la presente, es un segmento de un gen que se transcribe como parte de una transcripción de ARN primaria pero que no está presente en la molécula de ARNm madura. Los intrones se eliminan o "empalman" de la transcripción nuclear o primaria; por lo tanto, los intrones están ausentes en el ARN mensajero (ARNm). Los intrones pueden contener elementos reguladores como potenciadores. Como se describe en la presente descripción, los genes del trigo Lr67 (tanto alelos resistentes como susceptibles) contienen dos intrones en sus regiones codificantes de proteínas. "Exones", como se usa en la presente, se refiere a las regiones de ADN correspondientes a las secuencias de ARN que están presentes en el ARNm maduro o en la molécula de ARN madura en los casos en los que la molécula de ARN no se traduce. Un ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente. El término "gen" incluye una molécula sintética o de fusión que codifica todas o parte de las proteínas de la invención descritas en la presente descripción y una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las anteriores. Puede introducirse un gen en un vector apropiado para el mantenimiento extracromosómico en una célula o, preferentemente, para la integración en el genoma del hospedero.

Como se usa en la presente, un "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que comprende secuencias unidas covalentemente que no se encuentran unidas en la naturaleza. Típicamente, un gen quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o codificantes de proteínas que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se obtienen de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes obtenidas de esta fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. En una modalidad, la región codificante de proteínas de un gen Lr67 se une operativamente a un promotor o región de poliadenilación/terminador que es heteróloga al gen Lr67, de esta manera se forma un gen quimérico. El término "endógeno" se usa en la presente descripción para referirse a una sustancia que típicamente está presente o se produce en una planta no modificada en la misma etapa de desarrollo que la planta bajo investigación. Un "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Como se usa en la presente, "molécula de ácido nucleico recombinante", "polinucleótido recombinante" o variaciones de estos se refieren a una molécula de ácido nucleico que se ha construido o modificado mediante tecnología de ADN recombinante. Los términos "polinucleótido extraño" o "polinucleótido exógeno" o "polinucleótido heterólogo" y similares se refieren a cualquier ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula mediante manipulaciones experimentales.

Los genes extraños o exógenos pueden ser genes que se insertan en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva ubicación dentro del hospedero nativo o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. El término "modificado genéticamente" incluye la introducción de genes en las células mediante transformación o transducción, la mutación de genes en las células y la alteración o modulación de la regulación de un gen en una célula u organismos a los que se han realizado estos actos o su progenie.

Además, el término "exógeno" en el contexto de un polinucleótido (ácido nucleico) se refiere al polinucleótido cuando está presente en una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido. La célula puede ser una célula que comprende un polinucleótido no endógeno que da como resultado una cantidad alterada de producción del polipéptido codificado, por ejemplo, un polinucleótido exógeno que aumenta la expresión de un polipéptido endógeno, o una célula que en su estado nativo no produce el polipéptido. El aumento de la producción de un polipéptido al que se refiere la invención también se refiere en la presente descripción como "sobreexpresión". Un polinucleótido exógeno al que se refiere la invención incluye polinucleótidos que no se han separado de otros componentes de la célula transgénica (recombinante) o del sistema de expresión libre de células, en donde está presente, y polinucleótidos que se producen en dichas células o sistemas libres de células. que posteriormente se purifican de al menos algunos otros componentes. El polinucleótido exógeno (ácido nucleico) puede ser un tramo contiguo de nucleótidos existentes en la naturaleza, o comprender dos o más tramos contiguos de nucleótidos de diferentes fuentes (orígenes naturales y/o sintéticos) que se unen para formar un único polinucleótido. Típicamente, dichos polinucleótidos quiméricos comprenden al menos un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la invención que se une operativamente a un promotor adecuado para impulsar la transcripción del marco de lectura abierto en una célula de interés.

El % de identidad de un polinucleótido se determina mediante análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de huecos=5 y una penalización por extensión de huecos=0,3. La secuencia de consulta es de al menos 1200 residuos de longitud, y el análisis gAp alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 1200 residuos. Aún con mayor preferencia, la secuencia de consulta tiene al menos 1500 residuos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 1500 residuos. Aún con mayor preferencia, el análisis GAP alinea dos secuencias en toda su longitud.

Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que las cifras de % de identidad superiores a las que se proporcionas anteriormente abarcarán modalidades preferidas. Por lo tanto, cuando sea aplicable, a la luz del % mínimo de cifras de identidad, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia de polinucleótidos que sea al menos 60 %, con mayor preferencia al menos 65 %, con mayor preferencia al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 75 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 %, con mayor preferencia al menos 91 %, con mayor preferencia al menos 92 %, con mayor preferencia al menos 93 %, con mayor preferencia al menos 94 %, con mayor preferencia al menos 95 %, con mayor preferencia al menos 96 %, con mayor preferencia al menos 97 %, con mayor preferencia al menos 98 %, con mayor preferencia al menos 99 %, con mayor preferencia al menos 99,1 %, con mayor preferencia al menos 99,2 %, con mayor preferencia al menos 99,3 %, con mayor preferencia al menos 99,4 %, con mayor preferencia al menos 99,5 %, con mayor preferencia al menos 99,6 %, con mayor preferencia al menos 99,7 %, con mayor preferencia al menos 99,8 % y aún con mayor preferencia al menos 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO de interés.

En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los descritos específicamente en la presente descripción. Como se usa en la presente, con referencia a un polinucleótido, el término "sustancialmente idéntico" significa la sustitución de uno o algunos (por ejemplo 2, 3 o 4) nucleótidos mientras se mantiene al menos una actividad de la proteína nativa codificada por el polinucleótido. Adicionalmente, este término incluye la adición o eliminación de nucleótidos que da como resultado el aumento o disminución del tamaño de la proteína nativa codificada en uno o unos pocos (por ejemplo, 2, 3 o 4) aminoácidos mientras se mantiene al menos una actividad de la proteína nativa codificada por el polinucleótido.

La presente invención también se relaciona con el uso de oligonucleótidos, por ejemplo, en métodos de cribado de un polinucleótido, o que codifica un polipéptido, al que se refiere la invención. Como se usa en la presente, "oligonucleótidos" son polinucleótidos de hasta 50 nucleótidos de longitud. El tamaño mínimo de dichos oligonucleótidos es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre un oligonucleótido y una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Pueden ser ARN, ADN o combinaciones u obtenidos de cualquiera de ellos. Los oligonucleótidos son típicamente moléculas monocatenarias relativamente cortas de 10 a 30 nucleótidos, comúnmente de 15-25 nucleótidos de longitud. Cuando se usa como sonda o como cebador en una reacción de amplificación, el tamaño mínimo de tal oligonucleótido es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre el oligonucleótido y una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico objetivo. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen al menos 15 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 18 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 19 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 20 nucleótidos, aún con mayor preferencia al menos 25 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos de la presente descripción usados como sonda se conjugan típicamente con un marcador tal como un radioisótopo, una enzima, biotina, una molécula fluorescente o una molécula quimioluminiscente.

La presente descripción incluye oligonucleótidos que pueden usarse como, por ejemplo, sondas para identificar moléculas de ácido nucleico o cebadores para producir moléculas de ácido nucleico. Pueden usarse sondas y/o cebadores para clonar homólogos de los polinucleótidos a los que se relacionan con la invención a partir de otras especies. Además, las técnicas de hibridación conocidas en la técnica también pueden usarse para cribar bibliotecas genómicas o de ADNc para dichos homólogos.

Los polinucleótidos y oligonucleótidos de la presente invención incluyen aquellos que se hibridan en condiciones rigurosas con una o más de las secuencias que se proporcionas como la SEQ ID NO: 2, 3, 5 o 6. Como se usa en la presente, las condiciones estrictas son aquellas que (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/NaDodSO4 al 0,1 %, a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante como formamida, por ejemplo, 50 % (v/v) de formamida con 0,1 % de albúmina de suero bovino, 0,1 % de Ficoll, 0,1 % de polivinilpirrolidona, tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con 750 mM NaCl, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), S^dS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C en 0,2 x SSC y SDS al 0,1 %.

Los polinucleótidos a los que se refiere la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con moléculas de orígenes naturales, una o más mutaciones que son eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos de nucleótidos. Los mutantes pueden ser de origen natural (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, mediante la realización de mutagénesis dirigida al sitio en el ácido nucleico). Una variante de un polinucleótido o un oligonucleótido al que se refiere la invención incluye moléculas de diferentes tamaños y/o que son capaces de hibridar con el genoma del trigo cercano al del polinucleótido de referencia o las moléculas de oligonucleótido definidas en la presente descripción. Por ejemplo, las variantes pueden comprender nucleótidos adicionales (tales como 1, 2, 3, 4 o más) o menos nucleótidos siempre que aún se hibriden con la región objetivo. Además, pueden sustituirse algunos nucleótidos sin influir en la capacidad del oligonucleótido para hibridar con la región objetivo. Adicionalmente, pueden diseñarse fácilmente variantes que se hibriden cerca, por ejemplo, dentro de 50 nucleótidos, de la región del genoma de la planta donde se hibridan los oligonucleótidos específicos definidos en la presente descripción. En particular, esto incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido o secuencia de aminoácidos pero que varían en secuencia de nucleótidos por redundancia del código genético. Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" también incluyen variantes alélicas de origen natural.

Constructos de ácido nucleico

La presente invención incluye constructos de ácido nucleico que comprenden los polinucleótidos a los que se relaciona con la invención, y vectores y células hospederas que los contienen, métodos para su producción y uso, y usos de estos. La presente invención se refiere a elementos que se conectan o se une operativamente. "Conectado operativamente" o "unido operativamente" y similares se refieren a un vínculo de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Típicamente, las secuencias de ácido nucleico conectadas operativamente se unen contiguamente y, cuando es necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en marco de lectura. Una secuencia codificante está "conectada operativamente" a otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcribirá las dos secuencias codificantes en un solo ARN, que si se traduce se traduce en un único polipéptido que tiene aminoácidos obtenidos de ambas secuencias codificantes. No es necesario que las secuencias codificantes sean contiguas entre sí siempre que las secuencias expresadas se procesen finalmente para producir la proteína deseada.

Como se usa en la presente, el término "secuencia que actúa en cis", "elemento que actúa en cis" o "región reguladora en cis" o "región reguladora" o un término similar se tomará para significar cualquier secuencia de nucleótidos, que cuando se coloca de manera apropiada y se conecta con relación a una secuencia genética expresable, es capaz de regular, al menos en parte, la expresión de la secuencia genética. Los expertos en la técnica sabrán que una región reguladora cis puede ser capaz de activar, silenciar, potenciar, reprimir o alterar de otro modo el nivel de expresión y/o la especificidad del tipo celular y/o la especificidad del desarrollo de una secuencia génica en el nivel transcripcional o postranscripcional. En modalidades preferidas de la presente invención, la secuencia que actúa en cis es una secuencia activadora que potencia o estimula expresión de una secuencia genética expresable.

"Conectar operativamente" un promotor o elemento potenciador a un polinucleótido a transcribir significa colocar el polinucleótido a transcribir (por ejemplo, un polinucleótido codificador de proteínas u otro transcrito) bajo el control regulador de un promotor, que entonces controla transcripción de ese polinucleótido. En la construcción de combinaciones de promotor heterólogo/gen estructural, generalmente se prefiere posicionar un promotor o una variante de este a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del polinucleótido a transcribir que sea aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y la región de codificación de la proteína que controla en su entorno natural; es decir, el gen del que se obtiene el promotor. Como se conoce en la técnica, puede acomodarse alguna variación en esta distancia sin la pérdida de la función. De manera similar, el posicionamiento preferido de un elemento de secuencia reguladora (por ejemplo, un operador, potenciador, etc.) con respecto a un polinucleótido a transcribir que se colocará bajo su control se define por el posicionamiento del elemento en su entorno natural; es decir, los genes del que se obtiene.

"Promotor" o "secuencia promotora", como se usa en la presente, se refiere a una región de un gen, generalmente aguas arriba (5') de la región que codifica el ARN, que controla el inicio y el nivel de transcripción en la célula de interés. Un "promotor" incluye las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen genómico clásico, como una caja TATA y secuencias de caja CCAAT, así como también elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación aguas arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo. y/o estímulos ambientales, o de una manera específica de tejido o de tipo celular. Un promotor se posiciona usualmente, pero no necesariamente (por ejemplo, algunos promotores PolIII), aguas arriba de un gen estructural, cuya expresión regula. Además, los elementos reguladores que comprenden un promotor se posicionan usualmente dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripción del gen. Los promotores pueden contener elementos reguladores específicos adicionales, ubicados más distal al sitio de inicio para mejorar aún más la expresión en una célula y/o para alterar el tiempo o la inducibilidad de la expresión de un gen estructural al que está conectado operativamente.

"Promotor constitutivo" se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia transcrita unida operativamente en muchos o todos los tejidos de un organismo tal como una planta. El término constitutivo, como se usa en la presente, no indica necesariamente que un gen se exprese al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en una amplia gama de tipos de células, aunque a menudo se detecta alguna variación en el nivel. "Expresión selectiva", como se usa en la presente, se refiere a la expresión casi exclusivamente en órganos específicos de, por ejemplo, la planta, como, por ejemplo, endospermo, embrión, hojas, frutos, tubérculos o raíz. En una modalidad preferida, un promotor se expresa selectivamente o preferencialmente en hojas y/o tallos de una planta, preferentemente una planta de cereal. Por tanto, la expresión selectiva puede contrastarse con la expresión constitutiva, que se refiere a la expresión en muchos o todos los tejidos de una planta en la mayoría o en todas las condiciones experimentadas por la planta.

La expresión selectiva también puede dar como resultado la compartimentación de los productos de la expresión génica en tejidos, órganos o etapas de desarrollo específicos de las plantas. La compartimentación en ubicaciones subcelulares específicas tales como el plástido, el citosol, la vacuola o el espacio apoplásico puede lograrse mediante la inclusión en la estructura del producto génico de señales apropiadas, por ejemplo un péptido señal, para el transporte al compartimento celular requerido, o en el caso de los orgánulos semiautónomos (plástidos y mitocondrias) mediante la integración del transgén con secuencias reguladoras apropiadas directamente en el genoma del orgánulo.

Un "promotor específico de tejido" o "promotor específico de órgano" es un promotor que se expresa preferentemente en un tejido u órgano con relación a muchos otros tejidos u órganos, preferentemente la mayoría, si no todos los demás tejidos u órganos en, por ejemplo, una planta. Típicamente, el promotor se expresa a un nivel 10 veces mayor en el tejido u órgano específico que en otros tejidos u órganos.

En una modalidad, el promotor es un promotor específico de tallo, un promotor específico de hoja o un promotor que dirige la expresión génica en una parte aérea de la planta (al menos tallos y hojas) (promotor específico de tejido verde) como un promotor de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RUBISCO).

Los ejemplos de promotores específicos del tallo incluyen, pero no se limitan a los descritos en US 5.625.136 y Bam y otros. (2008).

Los promotores contemplados por la presente invención pueden ser nativos de la planta hospedera a transformar o pueden obtenerse de una fuente alternativa, donde la región es funcional en la planta hospedera. Otras fuentes incluyen los genes de ADN-T Agrobacterium, tales como los promotores de genes para la biosíntesis de nopalina, octapina, manopina u otros promotores de opina, promotores específicos de tejido (véase, por ejemplo, los documentos US 5,459,252 y WO 91/13992); promotores de virus (incluidos virus específicos del hospedero) o promotores parcial o totalmente sintéticos. Numerosos promotores que son funcionales en plantas mono y dicotiledóneas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Greve, 1983; Salomon y otros, 1984; Garfinkel y otros, 1983; Barker y otros, 1983); que incluyen varios promotores aislados de plantas y virus tales como el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S, 19S). Métodos no limitantes para evaluar la actividad del promotor se describieron por Medberry et al. (1992, 1993), Sambrook y otros (1989, supra) y US 5,164,316.

Alternativa o adicionalmente, el promotor puede ser un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo que sea capaz de dirigir la expresión del polinucleótido introducido en una etapa de desarrollo apropiada de la planta, por ejemplo. Otras secuencias de acción cis que pueden emplearse incluyen potenciadores transcripcionales y/o traduccionales. Las regiones potenciadoras son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden incluir un codón de iniciación de la traducción ATG y secuencias adyacentes. Cuando se incluye, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante con relación al polinucleótido extraño o exógeno para asegurar la traducción de la secuencia completa si se va a traducir. Las regiones de iniciación de la traducción pueden proporcionarse a partir de la fuente de la región de iniciación de la transcripción, o de un polinucleótido extraño o exógeno. La secuencia también puede obtenerse de la fuente del promotor seleccionado para impulsar la transcripción, y puede modificarse específicamente para aumentar la traducción del ARNm.

El constructo de ácido nucleico de la presente invención puede comprender una secuencia 3' no traducida de aproximadamente 50 a 1000 pares de bases de nucleótidos que puede incluir una secuencia de terminación de la transcripción. Una secuencia 3' no traducida puede contener una señal de terminación de la transcripción que puede incluir o no una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARNm. Una señal de poliadenilación funciona para la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' de un precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología con la forma canónica 5' AATAAA-3', aunque las variaciones no son infrecuentes. Las secuencias de terminación de la transcripción que no incluyen una señal de poliadenilación incluyen terminadores para polimerasa de ARN Poll o PolIII que comprenden una serie de cuatro o más timidinas. Ejemplos de secuencias 3' no traducidas adecuadas son las regiones 3' transcritas no traducidas que contienen una señal de poliadenilación de un gen de octopina sintasa (ocs) o gen de nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan y otros, 1983). Las secuencias 3' no traducidas adecuadas también pueden obtenerse de genes vegetales tales como el gen de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO), aunque también pueden emplearse otros elementos 3' conocidos por los expertos en la técnica.

Dado que la secuencia de ADN insertada entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia líder 5' no traducida (5'UTR), puede influir en la expresión génica si se traduce y transcribe, también puede emplearse una secuencia de líder particular. Las secuencias líder adecuadas incluyen aquellas que comprenden secuencias seleccionadas para dirigir la expresión óptima de la secuencia de ADN externa o endógena. Por ejemplo, dichas secuencias líderes incluyen una secuencia de consenso preferida que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm y prevenir el inicio inadecuado de la traducción como, por ejemplo, lo describió Joshi (1987).

Vectores

La presente invención incluye el uso de vectores para la manipulación o transferencia de constructos genéticos. Por "vector quimérico" se entiende una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN obtenida, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago o virus vegetal, en donde puede insertarse o clonarse una secuencia de ácido nucleico. Un vector es preferentemente ADN de doble hebra y contiene uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en una célula hospedera definida que incluye una célula o tejido objetivo o una célula progenitora o tejido de esta, o capaz de integrarse en el genoma del hospedero definido de manera que la secuencia clonada sea reproducible. En consecuencia, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido lineal o circular cerrado, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula, se integra en el genoma de la célula receptora y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado. El sistema de vectores puede comprender un solo vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que se introducirá dentro del genoma de una célula hospedera, o un transposón. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula en la que se va a introducir el vector. El vector también puede incluir un marcador de selección, tal como un gen de resistencia a antibióticos, un gen de resistencia a herbicidas u otro gen que pueda usarse para la selección de transformantes adecuados. Los ejemplos de estos genes se conocen bien por los expertos en la técnica.

El constructo de ácido nucleico de la invención puede introducirse en un vector, tal como un plásmido. Los vectores plasmídicos incluyen típicamente secuencias de ácido nucleico adicionales que facilitan la selección, amplificación y transformación del casete de expresión en células procariotas y eucariotas, por ejemplo, vectores obtenidos de pUC, vectores obtenidos de pSK, vectores obtenidos de pGEM, vectores obtenidos de pSP, vectores obtenidos de pBS o vectores binarios que contienen una o más regiones de ADN-T. Las secuencias de ácido nucleico adicionales incluyen orígenes de replicación para proporcionar la replicación autónoma del vector, genes marcadores seleccionables, preferentemente que codifiquen resistencia a antibióticos o herbicidas, sitios de clonación múltiples únicos que proporcionan sitios múltiples para insertar secuencias de ácido nucleico o genes codificados en el constructo de ácido nucleico, y secuencias que mejoran la transformación de células procariotas y eucariotas (especialmente vegetales).

Por "gen marcador" se entiende un gen que imparte un fenotipo distinto a las células que expresan el gen marcador y, por tanto, permite que dichas células transformadas se distingan de las células que no tienen el marcador. Un gen marcador seleccionable confiere un rasgo que puede "seleccionarse" en función de la resistencia a un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, radiación, calor u otro tratamiento que dañe las células no transformadas). Un gen marcador (o gen indicador) que puede cribarse confiere un rasgo que puede identificarse a través de la observación o los análisis, es decir, mediante el "cribado" (por ejemplo, p-glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática que no está presente en las células no transformadas). El gen marcador y la secuencia de nucleótidos de interés no tienen que estar unidos.

Para facilitar la identificación de transformantes, el constructo de ácido nucleico comprende convenientemente un gen marcador que puede seleccionarse o cribarse como, o adicionalmente, al polinucleótido extraño o exógeno. La elección real de un marcador no es crucial siempre que sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células vegetales de elección. El gen marcador y el polinucleótido extraño o exógeno de interés no tienen que estar unidos, ya que la cotransformación de genes no unidos como, por ejemplo, se describe en el documento US 4,399,216 también es un proceso eficiente en la transformación de plantas.

Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, eritromicina, cloranfenicol o tetraciclina, preferentemente resistencia a kanamicina. Los marcadores ilustrativos seleccionables para la selección de transformantes de plantas incluyen, pero no se limitan a, un gen hyg que codifica la resistencia a higromicina B; un gen de neomicina fosfotransferasa (nptIl) que confiere resistencia a kanamicina, paromomicina, G418; un gen de glutatión-S-transferasa de hígado de rata que confiere resistencia a herbicidas obtenidos del glutatión como, por ejemplo, se describe en el documento EP 256223; un gen de la glutamina sintetasa que confiere, tras la sobreexpresión, resistencia a los inhibidores de la glutamina sintetasa como la fosfinotricina como, por ejemplo, se describe en el documentoWO 87/05327, un gen de la acetiltransferasa de Streptomyces viridochromogenes que confiere resistencia al agente selectivo fosfinotricina como, por ejemplo, se describe en el documento EP 275957, un gen que codifica una 5-enolshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia a la N-fosfonometilglicina como, por ejemplo, se describe por Hinchee y otros (1988), un gen bar que confiere resistencia contra bialafos como, por ejemplo, se describe en el documento WO91/02071; un gen de la nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia al bromoxinilo (Stalker y otros, 1988); un gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) que confiere resistencia al metotrexato (Thillet y otros, 1988); un gen mutante de la acetolactato sintasa (ALS), que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otras sustancias químicas inhibidoras de ALS (documento EP 154,204); un gen de antranilato sintasa mutado que confiere resistencia al 5-metil triptófano; o un gen dalapon deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida.

Los marcadores preferidos que pueden cribarse incluyen, pero no se limitan a, un gen uidA que codifica una enzima p-glucuronidasa (GUS) para la que se conocen varios sustratos cromogénicos, un gen de p-galactosidasa que codifica una enzima para la que se conocen sustratos cromogénicos, un gen aequorina (Prasher y otros, 1985), que puede emplearse en detección de bioluminiscencia sensible al calcio; un gen de proteína verde fluorescente (Niedz y otros, 1995) u obtenidos de este; un gen de luciferasa (luc) (Ow y otros, 1986), que permite la detección de bioluminiscencia, y otros conocidos en la técnica. Por "molécula indicadora", como se usa en la presente descripción, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal que puede identificarse analíticamente que facilita la determinación de la actividad promotora por referencia al producto proteico.

Preferentemente, el constructo de ácido nucleico se incorpora establemente en el genoma de, por ejemplo, la planta. Por consiguiente, el ácido nucleico comprende elementos apropiados que permiten que la molécula se incorpore al genoma, o el constructo se coloca en un vector apropiado que puede incorporarse en un cromosoma de una célula vegetal.

Una modalidad de la presente invención incluye un vector recombinante, que incluye al menos una molécula de polinucleótido a la que se relaciona con la presente invención, que se inserta en cualquier vector capaz de suministrar la molécula de ácido nucleico a una célula hospedera. Dicho vector contiene secuencias de ácido nucleico heterólogas, es decir, secuencias de ácido nucleico que no se encuentran naturalmente adyacentes a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención y que preferentemente se obtienen de una especie distinta de la especie de la cual la(s) molécula(s) de ácido nucleico se obtienen. El vector puede ser ARN o ADN, procariota o eucariota, y típicamente es un virus o un plásmido.

Se han descrito varios vectores adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas en, por ejemplo, Pouwels y otros, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supl. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Gelvin y otros, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores de expresión de plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes de plantas clonados bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador dominante seleccionable. Dichos vectores de expresión vegetal también pueden contener una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla expresión inducible o constitutiva, regulada por el entorno o el desarrollo, o específica de la célula o del tejido), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

El nivel de una proteína a la que se relaciona con la invención puede modularse mediante el aumento del nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína en una célula vegetal, o la disminución del nivel de expresión de un gen que codifica la proteína en la planta, lo que lleva a la resistencia modificada de patógenos. El nivel de expresión de un gen puede modularse alterando el número de copias per célula, por ejemplo, mediante la introducción de un constructo genético sintético que comprende la secuencia codificante y un elemento de control de la transcripción que está conectado operativamente a este y que es funcional en la célula. Una pluralidad de transformantes puede seleccionarse y cribarse en busca de aquellos con un nivel favorable y/o especificidad de expresión del transgén que surja de las influencias de las secuencias endógenas en la cercanía del sitio de integración del transgén. Un nivel y un patrón de expresión transgénica favorables son los que dan lugar a una modificación sustancial de la resistencia a los patógenos u otro fenotipo. Alternativamente, una población de semillas mutagenizadas o una población de plantas de un programa de fitomejoramiento puede cribarse en cuanto a líneas individuales con resistencia a patógenos alterada u otro fenotipo asociado con resistencia a patógenos.

Células recombinantes

Como se define en las reivindicaciones, otra modalidad de la presente invención incluye una célula recombinante que comprende una célula hospedera transformada con una o más moléculas recombinantes a las que se relación con la presente invención, o células de la progenie de estas. La transformación de una molécula de ácido nucleico en una célula puede realizarse mediante cualquier método mediante el cual se pueda insertar una molécula de ácido nucleico en la célula. Las técnicas de transformación incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción y fusión de protoplastos. Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede convertirse en tejido, órgano u organismo multicelular. Las moléculas de ácido nucleico transformadas a las que se relaciona con la presente invención pueden permanecer extracromosómicas o pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante) de tal manera que se conserva su capacidad para expresarse. Las células hospederas preferidas son células vegetales, con mayor preferencia células de una planta de cereal, con mayor preferencia células de cebada o trigo, y aún con mayor preferencia una célula de trigo.

Plantas transgénicas

El término "planta", como se usa en la presente, en forma sustantiva, se refiere a plantas enteras y se refiere a cualquier miembro del Reino Plantae, pero cuando se usa en forma de adjetivo se refiere a cualquier sustancia que esté presente en, obtenida de, obtenida o relacionada con una planta, como por ejemplo órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores), células individuales (por ejemplo, polen), semillas, células de plantas y similares. Las plántulas y semillas germinadas de las que han surgido raíces y brotes también se incluyen dentro del significado de "planta". El término "partes de la planta", como se usa en la presente, se refiere a uno o más tejidos u órganos vegetales que se obtienen de una planta y que comprenden ADN genómico de la planta. Las partes de la planta incluyen estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos), raíces, órganos/estructuras florales, semillas (incluidos embriones, cotiledones y cubierta de semillas), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido del suelo y similares), células y progenie de las mismas. El término "célula vegetal" como se usa en la presente se refiere a una célula obtenida de una planta o en una planta e incluye protoplastos u otras células obtenidas de plantas, células productoras de gametos y células que se regeneran en plantas completas. Las células vegetales pueden ser células en cultivo. Por "tejido vegetal" se entiende tejido diferenciado en una planta u obtenido de una planta ("explante") o tejido indiferenciado obtenido de embriones inmaduros o maduros, semillas, raíces, brotes, frutos, tubérculos, polen, tejido tumoral, como corona. agallas y diversas formas de agregaciones de células vegetales en cultivo, tales como callos. Los tejidos vegetales ilustrativos en o a partir de semillas son el cotiledón, el embrión y el eje del embrión. En consecuencia, la invención incluye plantas y partes de plantas y productos que las comprenden, como se define en las reivindicaciones.

Como se usa en la presente, el término "semilla" se refiere a "semilla madura" de una planta, que está lista para cosechar o ha sido recolectada de la planta, tal como se recolecta típicamente comercialmente en el campo, o como "semilla en desarrollo" que ocurre en una planta después de la fertilización y antes de que se establezca la dormancia de la semilla y antes de la cosecha.

Una "planta transgénica", como se usa en la presente, se refiere a una planta que contiene un constructo de ácido nucleico que no se encuentra en una planta de tipo salvaje de la especie, variedad o cultivar. Es decir, las plantas transgénicas (plantas transformadas) contienen material genético (un transgén) que no contenían antes de la transformación. El transgén puede incluir secuencias genéticas obtenidas u obtenidas de una célula vegetal u otra célula vegetal, una fuente no vegetal o una secuencia sintética. Típicamente, el transgén se ha introducido en la planta mediante manipulación humana tal como, por ejemplo, mediante transformación, pero puede usarse cualquier método como reconoce un experto en la técnica. El material genético se integra preferentemente estable en el genoma de la planta. El material genético introducido puede comprender secuencias de origen natural en la misma especie, pero en un orden reordenado o en una disposición diferente de elementos, por ejemplo, una secuencia antisentido. Las plantas que contienen dichas secuencias se incluyen en la presente descripción en "plantas transgénicas".

Una "planta no transgénica" es aquella que no ha sido modificada genéticamente mediante la introducción de material genético mediante técnicas de ADN recombinante. En una modalidad preferida, las plantas transgénicas son homocigotas para todos y cada uno de los genes que se han introducido (transgén) de modo que su progenie no se segrega para el fenotipo deseado.

Como se usa en la presente, el término "comparado con una planta isogénica", o frases similares, se refiere a una planta que es isogénica en relación con la planta transgénica, pero sin el transgén de interés. Preferentemente, la planta no transgénica correspondiente es del mismo cultivar o variedad que el progenitor de la planta transgénica de interés, o una línea de plantas hermanas que carece del constructo, a menudo denominada "segregante", o una planta del mismo cultivar o variedad transformada con un constructor de "vector vacío", y puede ser una planta no transgénica. "Natural", como se usa en la presente, se refiere a una célula, tejido o planta que no se ha modificado de acuerdo con la invención. Pueden usarse células, tejidos o plantas de tipo salvaje como controles para comparar los niveles de expresión de un ácido nucleico exógeno o la extensión y naturaleza de la modificación del rasgo con células, tejidos o plantas modificadas como se describe en la presente descripción.

Las plantas transgénicas, como se definen en el contexto de la presente invención, incluyen la progenie de las plantas que han sido modificadas genéticamente mediante el uso de técnicas recombinantes, en donde la progenie comprende el transgén de interés. Dicha progenie puede obtenerse por autofertilización de la planta transgénica primaria o mediante el cruce de dichas plantas con otra planta de la misma especie. Generalmente, esto sería para modular la producción de al menos una proteína definida en la presente descripción en la planta o el órgano de la planta deseado. Las partes de plantas transgénicas incluyen todas las partes y células de dichas plantas que comprenden el transgén como, por ejemplo, tejidos cultivados, callos y protoplastos.

Las plantas contempladas para su uso en la práctica de la presente invención incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las plantas objetivos incluyen, entre otras, las siguientes: cereales (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, maíz, sorgo y cultivos relacionados); uvas; remolacha (remolacha azucarera y remolacha forrajera); pepitas, frutas de hueso y frutos rojos (manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas y moras); plantas leguminosas (frijoles, lentejas, guisantes, soja); plantas oleaginosas (colza u otras Brassicas, mostaza, amapola, aceitunas, girasoles, cártamo, lino, coco, ricino, cacao en grano, cacahuetes); plantas de pepino (calabacines, pepinos, melones); plantas de fibra (algodón, lino, cáñamo, yute); cítricos (naranjas, limones, pomelos, mandarinas); verduras (espinacas, lechugas, espárragos, coles, zanahorias, cebollas, tomates, patatas, pimentón); lauráceas (aguacates, canela, alcanfor); o plantas como maíz, tabaco, nueces, café, caña de azúcar, té, enredaderas, lúpulos, césped, plátanos y plantas de caucho natural, así como ornamentales (flores, arbustos, frondosos y perennes, como coníferas). Preferentemente, la planta es una planta de cereales, con mayor preferencia trigo, arroz, maíz, triticale, avena o cebada, aún con mayor preferencia trigo.

Como se usa en la presente, el término "trigo" se refiere a cualquier especie del género Triticum, incluidos los progenitores de estos, así como también la progenie de estos que se produce mediante los cruces con otras especies. El trigo incluye "trigo hexaploide" que tiene una organización genómica de AABBDD, que comprende 42 cromosomas, y "trigo tetraploide" que tiene una organización genómica de AABB, que comprende 28 cromosomas. El trigo hexaploide incluye T. aestivum, T. spelta, T. macha, T. compactum, T. sphaerococcum, T. vavilovii, y sus cruces interespecies. Una especie preferida de trigo hexaploide es T. aestivum ssp aestivum (también denominado "trigo de pan"). El trigo tetraploide incluye T. durum (también se refiere en la presente descripción como trigo duro o Triticum turgidum ssp. durum), T. dicoccoides, T. dicoccum, T. polonicum, y sus cruces interespecies. Adicionalmente, el término "trigo" incluye progenitores potenciales de hexaploides o tetraploides Triticum sp. tales como T. uartu, T. monococcum o T. boeoticum para el genoma A, Aegilops speltoides para el genoma B, y T. tauschii (también conocido como Aegilops squarrosa o Aegilops tauschii) para el genoma D. Los progenitores particularmente preferidos son los del genoma A, aún con mayor preferencia el progenitor del genoma A es T. monococcum. Un cultivar de trigo para su uso en la presente invención puede pertenecer, pero no se limita a, cualquiera de las especies enumeradas anteriormente. También se incluyen las plantas que se producen mediante técnicas convencionales mediante el uso de Triticum sp. como progenitor en un cruce sexual con una especie que no sea Triticum (como el centeno [Secale cereale]), que incluye, pero no se limita a Triticale.

Como se usa en la presente, el término "cebada" se refiere a cualquier especie del género Hordeum, incluidos sus progenitores, así como también su progenie que se produce mediante los cruces con otras especies. Se prefiere que la planta sea de una especie de Hordeum que se cultivan comercialmente como, por ejemplo, una cepa o cultivar o variedad de Hordeum vulgare o adecuado para la producción comercial de cereales.

Las plantas transgénicas, según se definen en el contexto de la presente invención, incluyen plantas (así como también partes y células de dichas plantas) y su progenie que han sido modificadas genéticamente mediante el uso de técnicas recombinantes para producir la producción de al menos un polipéptido al que se refiere la invención la presente invención en la planta u órgano vegetal deseado. Las plantas transgénicas pueden producirse mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas generalmente en A. Slater y otros, Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), y P. Christou y H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

En una modalidad preferida, las plantas transgénicas son homocigotas para todos y cada uno de los genes que se han introducido (transgén) de modo que su progenie no se segrega para el fenotipo deseado. Las plantas transgénicas también pueden ser heterocigotas para el transgén o los transgén introducidos, tal como, por ejemplo, en la progenie F1 que se ha cultivado a partir de semillas híbridas. Dichas plantas pueden proporcionar ventajas tales como vigor híbrido, bien conocido en la técnica.

Como se usa en la presente, los "otros marcadores genéticos" pueden ser cualquier molécula que se unan a un rasgo deseado de una planta. Dichos marcadores son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen marcadores moleculares unidos a genes que determinan rasgos tales como resistencia a enfermedades, rendimiento, morfología de la planta, calidad del grano, rasgos de dormancia, color del grano, contenido de ácido giberélico en la semilla, altura de la planta, color de la harina y similares. Ejemplos de dichos genes son los genes de resistencia a la roya rayada Yr10 o Yr17, los genes de resistencia a nematodos como Crel y Cre3, alelos en los loci de glutenina que determinan la fuerza de la masa, tales como los alelos Ax, Bx, Dx, Ay, By y Dy, los genes de Rht que determinan un hábito de crecimiento semienano y, por tanto, resistencia al alojamiento.

Se han descrito cuatro métodos generales para el suministro directo de un gen a las células: (1) métodos químicos (Graham y otros, 1973); (2) métodos físicos tales como la microinyección (Capecchi, 1980); electroporación (véase, por ejemplo, los documentos WO 87/06614, 5,472,869, 5,384,253, WO 92/09696 y WO 93/21335); y la pistola de genes (véase, por ejemplo, los documentos4,945,050 y US 5,141,131); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Lu y otros, 1993; Eglitis y otros, 1988); y (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel y otros, 1992; Wagner y otros, 1992).

Los métodos de aceleración que pueden usarse incluyen, por ejemplo, bombardeo con microproyectiles y similares. Un ejemplo de un método para suministrar moléculas transformadoras de ácido nucleico a células vegetales es el bombardeo con microproyectiles. Este método ha sido revisado por Yang y otros, Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas no biológicas (microproyectiles) que pueden recubrirse con ácidos nucleicos y suministrarse en las células mediante una fuerza propulsora. Las partículas ilustrativas incluyen aquellas compuestas por tungsteno, oro, platino y similares. Una ventaja particular del bombardeo con microproyectiles, además de ser un medio eficaz para transformar monocotiledóneas con reproducibilidad, es que no se requiere el aislamiento de protoplastos, ni la susceptibilidad de infección de Agrobacterium. Un sistema de suministro de partículas adecuado para su uso con la presente invención es la pistola de aceleración de helio PDS-1000/He, disponible en Bio-Rad Laboratories. Para el bombardeo, pueden disponerse embriones inmaduros o células objetivas obtenidas tales como escutelas o callos de embriones inmaduros en un medio de cultivo sólido.

En otra modalidad alternativa, los plástidos pueden transformarse establemente. El método descrito para la transformación de plástidos en plantas superiores incluye el suministro de partículas con pistola de ^aDⁿque contienen un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma del plástido mediante recombinación homóloga (documentos US 5,451,513, US 5,545,818, US 5,877,402, US 5,932479, y WO 99/05265.

La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente válido para la introducción de genes en células vegetales porque el ADN puede introducirse en tejidos vegetales completos, de esta manera se evita la necesidad de regenerar una planta intacta a partir de un protoplasto. El uso de vectores integradores de plantas mediadas por Agrobacterium- para introducir ADN en las células vegetales es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos 5,177,010, US 5,104,310, 5,004,863 de Estados Unidos, 5,159,135). Además, la integración del ADNT es un proceso relativamente preciso que da como resultado pocos reordenamientos. La región de ADN que se va a transferir se define mediante las secuencias de fronteras, y el ADN que interviene se inserta usualmente en el genoma de la planta.

Los vectores de transformación de Agrobacterium son capaces de replicarse en E. coli, así como también en Agrobacterium, lo que permite realizar manipulaciones convenientes como se describió (Klee y otros, Plant DNA Infectious Agents, Hohn y Schell, (editores), Springer-verlag, Nueva York, (1985):179-203). Además, los avances tecnológicos en vectores para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium han mejorado el arreglo de genes y sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar varios genes codificantes de polipéptidos. Los vectores descritos tienen regiones multivínculos convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de genes codificantes de polipéptidos insertados y son adecuados para los presentes propósitos. Adicionalmente, para las transformaciones pueden usarse Agrobacterium que contienen genes Ti armados y desarmados. En aquellas variedades de plantas en las que la transformación mediada por Agrobacterium es eficiente, es el método de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia de genes.

Una planta transgénica formada mediante el uso de métodos de transformación Agrobacterium típicamente contiene un único locus genético en un cromosoma. Puede hacerse referencia a dichas plantas transgénicas como hemicigotas para el gen añadido. Es más preferida una planta transgénica que sea homocigótica para el gen estructural añadido; es decir, una planta transgénica que contiene dos genes agregados, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Puede obtenerse una planta transgénica homocigótica mediante el apareamiento sexual (autofecundación) de una planta transgénica segregante independiente que contiene un solo gen agregado, germinando parte de la semilla producida y analizando las plantas resultantes para el gen de interés. También debe entenderse que también pueden aparearse dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contenga dos genes exógenos segregantes independientemente. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes exógenos. También se contemplan el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. Pueden encontrarse descripciones de otros métodos de fitomejoramiento que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos en Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, J. Wilcox (editor) American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

La transformación de protoplastos de plantas puede lograrse mediante el uso de métodos basados en precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol, electroporación y combinaciones de estos tratamientos. La solicitud de estos sistemas a diferentes variedades de plantas depende de la capacidad de regenerar esa cepa de planta en particular a partir de protoplastos. Se describen métodos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (Fujimura y otros, 1985; Toriyama y otros, 1986; Abdullah y otros, 1986).

También pueden usarse otros métodos de transformación celular que incluyen, entre otros, la introducción de ADN en plantas mediante transferencia directa de ADN al polen, mediante inyección directa de ADN en los órganos reproductores de una planta o mediante inyección directa de ADN en las células de embriones inmaduros seguida de la rehidratación de los embriones desecados.

La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto de una sola planta o de varios explantes transformados es bien conocido en la técnica (Weissbach y otros, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, (1988)). Este proceso de regeneración y crecimiento típicamente incluye las etapas de selección de células transformadas, y el cultivo de esas células individualizadas a través de las etapas habituales de desarrollo embrionario a través de la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos se regeneran de manera similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan después en un medio de crecimiento vegetal apropiado, tal como el suelo.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen exógeno extraño es bien conocido en la técnica. Preferentemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. De cualquier otra manera, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas cultivadas con semillas de líneas agronómicamente importantes. Por el contrario, el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un ácido nucleico exógeno deseado se cultiva mediante el uso de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Se han publicado métodos para transformar dicotiledóneas, primariamente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens, y obtener plantas transgénicas para el algodón (documentos US 5,004,863, US 5,159,135, US 5,518,908); la soja (documentos US 5,569,834, 5,416,011); Brassica (documento US 5,463,174); maní (Cheng y otros, 1996); y guisante (Grant y otros, 1995).

Los métodos para la transformación de plantas de cereales tales como el trigo y la cebada para introducir variación genética en la planta mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno y para la regeneración de plantas a partir de protoplastos o embriones de plantas inmaduras son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo, documentos CA 2,092,588, AU 61781/94, AU 667939, US 6,100,447, WO 97/048814, US 5,589,617, US 6,541,257, y otros métodos se establecen en el documento WO 99/14314. Preferentemente, las plantas transgénicas de trigo o cebada se producen mediante procedimientos de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Los vectores que portan el constructo de ácido nucleico deseado pueden introducirse en células de trigo regenerables de cultivo de tejidos de plantas o explantes, o en sistemas vegetales adecuados, tal como los protoplastos. Las células de trigo que pueden regenerarse proceden preferentemente del escutelo de embriones inmaduros, de embriones maduros, de callos obtenidos de éstos o del tejido meristemático.

Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, puede realizarse una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un análisis de transferencia Southern mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los productos de expresión de los transgenes pueden detectarse de una variedad de formas, en dependencia de la naturaleza del producto, e incluyen transferencia Western y ensayo enzimático. Una forma particularmente útil de cuantificar la expresión de proteínas y detectar la replicación en diferentes tejidos vegetales es usar un gen indicador, tal como GUS. Una vez que se han obtenido las plantas transgénicas, pueden cultivarse para producir tejidos o partes de plantas que tengan el fenotipo deseado. El tejido vegetal o las partes de la planta pueden cosecharse y/o recolectarse la semilla. La semilla puede servir como fuente para cultivar plantas adicionales con tejidos o partes que tengan las características deseadas.

Selección asistida por marcadores

La selección asistida por marcadores es un método bien reconocido de selección de plantas heterocigotas que se requiere cuando se retrocruza con un progenitor recurrente en un programa de fitomejoramiento clásico. La población de plantas en cada generación de retrocruzamiento será heterocigótica para el gen de interés normalmente presente en una relación 1:1 en una población de retrocruzamiento, y el marcador molecular puede usarse para distinguir los dos alelos del gen. Al extraer el ADN de, por ejemplo, los brotes jóvenes y evaluar con un marcador específico para el rasgo deseable introgresado, se realiza una selección temprana de plantas para posteriores retrocruzamientos, mientras que la energía y los recursos se concentran en menos plantas. Para acelerar aún más el programa de retrocruzamiento, el embrión de semillas inmaduras (25 días después de la antesis) puede escindirse y crecerse en medios nutritivos en condiciones estériles, en lugar de permitir la madurez completa de la semilla. Este proceso, denominado "rescate de embriones", se usa en combinación con la extracción de ADN en la etapa de tres hojas y el análisis de al menos un alelo o variante Lr67 que confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, permite una rápida selección de plantas que portan el rasgo deseado, que puede cultivarse hasta la madurez en el invernadero o en el campo para un subsecuente retrocruzamiento adicional con el progenitor recurrente.

En los métodos de la presente invención puede usarse cualquier técnica de biología molecular conocida en la técnica. Dichos métodos incluyen, entre otros, el uso de amplificación de ácidos nucleicos, secuenciación de ácidos nucleicos, hibridación de ácidos nucleicos con sondas marcadas adecuadamente, análisis conformacional de una sola hebra (SSCA), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), análisis de heterodúplex (HET), análisis de escisión química (CCM), escisión catalítica de ácidos nucleicos o una combinación de estos (véase, por ejemplo, Lemieux, 2000; Langridge y otros, 2001). La invención también incluye el uso de técnicas de marcadores moleculares para detectar polimorfismos unidos a alelos del gen (por ejemplo) Lr67 que confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio. Dichos métodos incluyen la detección o análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), RAPD, polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y polimorfismos de microsatélites (repetición de secuencia simple, SSR). Los marcadores estrechamente unidos pueden obtenerse fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como Bulked Segregant Analysis, revisado por Langridge y otros, (2001).

En una modalidad, un loci unido a la selección asistida por marcadores está al menos dentro de 1cM, o 0,5cM, o 0,1cM, o 0,01cM de un gen que codifica un polipéptido al que se refiere la invención.

La "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") es una reacción en donde se hacen copias replicadas de un polinucleótido objetivo mediante el uso de un "par de cebadores" o un "conjunto de cebadores" que consiste en un cebador "aguas arriba" y un cebador "aguas abajo", y un catalizador de polimerización, tal como una ADN polimerasa, y típicamente una enzima polimerasa térmicamente estable. Los métodos para la PCR son conocidos en la técnica y se enseñan, por ejemplo, en "PCR" (MJ McPherson y SG Moller (editores), BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, (2000)). La PCR puede realizarse en ADNc obtenido a partir de la transcripción inversa de ARNm aislado de células vegetales que expresan un gen o alelo Lr67 que confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, preferentemente a una o más o a todas las royas, roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio. Sin embargo, generalmente será más fácil si la PCR se realiza en ADN genómico aislado de una planta.

Un cebador es una secuencia de oligonucleótidos que es capaz de hibridar de una manera específica de secuencia con la secuencia objetivo y extenderse durante la PCR. Los amplicones o productos de PCR o fragmentos de PCR o productos de amplificación son productos de extensión que comprenden el cebador y las copias recién sintetizadas de las secuencias objetivos. Los sistemas de PCR multiplex contienen múltiples conjuntos de cebadores que dan como resultado la producción simultánea de más de un amplicón. Los cebadores pueden coincidir perfectamente con la secuencia objetivo o pueden contener bases internas no emparejadas que pueden dar como resultado la introducción de sitios de escisión/reconocimiento de ácidos nucleicos catalíticos o enzimas de restricción en secuencias objetivos específicas. Los cebadores también pueden contener secuencias adicionales y/o contener nucleótidos modificados o marcados para facilitar la captura o detección de amplicones. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del ADN, la hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias y la extensión de los cebadores hibridados con polimerasa dan como resultado una amplificación exponencial de la secuencia objetivo. Los términos objetivo o secuencia objetivo o plantilla se refieren a secuencias de ácido nucleico que se amplifican.

Los métodos para la secuenciación directa de secuencias de nucleótidos son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel y otros, (supra) y Sambrook y otros, (supra). La secuenciación puede realizarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, secuenciación didesoxi, secuenciación química o variaciones de estas. La secuenciación directa tiene la ventaja de determinar la variación en cualquier par de bases de una secuencia particular.

TILLING

Las plantas de la invención pueden producirse mediante el uso del proceso conocido como TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes). En una primera etapa, se inducen mutaciones introducidas, tal como cambios novedosos de un solo par de bases, en una población de plantas mediante el tratamiento de semillas (o polen) con un mutágeno químico, y después las plantas avanzan a una generación donde las mutaciones se heredarán establemente. Se extrae el ADN y se almacenan semillas de todos los miembros de la población para crear un recurso al que puede accederse repetidamente a lo largo del tiempo.

Para un ensayo TILLING, los cebadores de PCR se diseñan para amplificar específicamente un solo gen objetivo de interés. La especificidad es especialmente importante si un objetivo es miembro de una familia de genes o parte de un genoma poliploide. A continuación, pueden usarse cebadores marcados con colorante para amplificar productos de PCR a partir de ADN combinado de múltiples individuos. Estos productos de PCR se desnaturalizan y se vuelven a recortar para permitir la formación de pares de bases no emparejados. Los desajustes, o heterodúplex, representan tanto polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de origen natural (es decir, es probable que varias plantas de la población tengan el mismo polimorfismo) y SNP inducidos (es decir, es probable que solo las plantas individuales raras exhiben la mutación). Después de la formación de heterodúplex, el uso de una endonucleasa, como Cel I, que reconoce y escinde el ADN no emparejado es la clave para descubrir nuevos SNP dentro de una población TILLING.

Mediante el uso de este enfoque, pueden cribarse muchos miles de plantas para identificar a cualquier individuo con un solo cambio de base, así como pequeñas inserciones o eliminaciones (1-30 pb) en cualquier gen o región específica del genoma. Los fragmentos genómicos que se ensayan pueden variar en tamaño entre 0,3 y 1,6 kb. Con un agrupamiento de 8 veces, fragmentos de 1,4 kb (descontando los extremos de los fragmentos donde la detección de SNP es problemática debido al ruido) y 96 carriles por ensayo, esta combinación permite cribar hasta un millón de pares de bases de ADN genómico por ensayo único, lo que hace TILLING una técnica de alto rendimiento.

TILLING se describe con más detalle en Slade y Knauf (2005), y Henikoff y otros (2004).

Además de permitir la detección eficiente de mutaciones, la tecnología TILLING de alto rendimiento es ideal para la detección de polimorfismos naturales. Por lo tanto, la exploración de un ADN homólogo desconocido mediante heterodúplex a una secuencia conocida revela el número y la posición de los sitios polimórficos. Se identifican tanto los cambios de nucleótidos como las pequeñas inserciones y eliminaciones, incluidos al menos algunos polimorfismos de números repetidos. A esto se le ha llamado Ecotilling (Comai y otros, 2004).

Cada SNP se registra por su posición aproximada dentro de unos pocos nucleótidos. Por lo tanto, cada haplotipo puede archivarse en función de su movilidad. Los datos de la secuencia pueden obtenerse con un esfuerzo incremental relativamente pequeño mediante el uso de alícuotas del mismo ADN amplificado que se usa para el ensayo de escisión de emparejamientos erróneos. El cebador de secuenciación izquierdo o derecho para una sola reacción se elige por su proximidad al polimorfismo. El software Sequencher realiza una alineación múltiple y descubre el cambio de base, que en cada caso confirma la banda de gel.

El ecotilling puede realizarse más económicamente que la secuenciación completa, el método que se usa actualmente para la mayoría de los descubrimientos de SNP. Las placas que contienen ADN ecotípico en matriz pueden cribarse en lugar de grupos de ADN de plantas mutagenizadas. Dado que la detección se realiza en geles con una resolución de casi un par de bases y que los patrones de fondo son uniformes en todos los carriles, pueden emparejarse las bandas que tienen un tamaño idéntico, lo que permite descubrir y determinar el genotipo de los SNP en una sola etapa. De esta manera, la secuenciación final del SNP es simple y eficiente, más aún por el hecho de que las alícuotas de los mismos productos de PCR usados para el cribado pueden someterse a secuenciación de ADN.

Procesamiento de plantas/granos

El grano/semilla de la invención, preferentemente el grano de cereal y con mayor preferencia el grano de trigo, u otras partes de la planta de la invención, pueden procesarse para producir un ingrediente alimenticio, un producto alimenticio o no alimenticio mediante el uso de cualquier técnica conocida en la técnica.

En una modalidad, el producto es harina de grano entero tales como, por ejemplo, una harina de grano entero molida ultrafina, o una harina hecha de aproximadamente el 100 % del grano. La harina de grano entero incluye un constituyente de harina refinada (harina refinada o harina refinada) y una fracción gruesa (una fracción gruesa de molienda ultrafina).

La harina refinada puede ser una harina preparada, por ejemplo, mediante la molienda y el atornillado de granos limpios, como los de trigo o cebada. El tamaño de las partículas de la harina de trigo refinada se describe como harina en donde no menos de 98 % pasa a través de una tela que tiene aberturas no mayores que las de una tela de malla tejida designada "212 micrómetros (U.S. Wire 70)". La fracción gruesa incluye al menos una de las siguientes: salvado y germen. Por ejemplo, el germen es una planta embrionaria que se encuentra dentro centro del grano. El germen incluye lípidos, fibra, vitaminas, proteína, minerales y fitonutrientes, tales como flavonoides. El salvado incluye varias capas celulares y tiene una cantidad importante de lípidos, fibra, vitaminas, proteínas, minerales y fitonutrientes, tales como los flavonoides. Además, la fracción gruesa puede incluir una capa de aleurona que también incluye lípidos, fibra, vitaminas, proteínas, minerales y fitonutrientes, tales como flavonoides. La capa de aleurona, aunque técnicamente se considera parte del endospermo, exhibe muchas de las mismas características que el salvado y, por lo tanto, típicamente se elimina con el salvado y el germen durante el proceso de molienda. La capa de aleurona contiene proteínas, vitaminas y fitonutrientes, tal como el ácido ferúlico.

Además, la fracción gruesa puede mezclarse con el constituyente de harina refinada. La fracción gruesa puede mezclarse con el constituyente de harina refinada para formar la harina integral, que proporciona así una harina integral con mayor valor nutricional, contenido de fibra y capacidad antioxidante en comparación con la harina refinada. Por ejemplo, la fracción gruesa o la harina de grano entero pueden usarse en varias cantidades para reemplazar la harina refinada o la harina de grano entero en productos de panadería, productos de aperitivo y productos alimenticios. La harina de grano entero de la presente invención (es decir, la harina de grano entero molida ultrafina) también puede comercializarse directamente a los consumidores para su uso en sus productos horneados caseros. En una modalidad ilustrativa, un perfil de granulación de la harina integral es tal que 98 % de las partículas en peso de la harina integral son menores que 212 micrómetros.

En modalidades adicionales, las enzimas que se encuentran dentro del salvado y el germen de la harina integral y/o la fracción gruesa se inactivan para estabilizar la harina integral y/o la fracción gruesa. La estabilización es un proceso que usa vapor, calor, radiación u otros tratamientos para inactivar las enzimas que se encuentran en el salvado y la capa germinal. La harina estabilizada conserva sus características de cocción y tiene una vida útil más larga.

En modalidades adicionales, la harina integral, la fracción gruesa o la harina refinada pueden ser un componente (ingrediente) de un producto alimenticio y pueden usarse para producir un producto alimenticio. Por ejemplo, el producto alimenticio puede ser un panecillo, una galleta, un pan, un bollo, un croissant, una bola de masa, un panecillo inglés, una magdalena, un pan de pita, un pan rápido, un producto de masa refrigerado/congelado, una masa, frijoles horneados, un burrito, chile, un taco, un tamal, una tortilla, un pastel de carne, un cereal listo para comer, una comida lista para comer, un relleno, una comida para microondas, un brownie, un pastel, una tarta de queso, una tarta de café, una galleta, un postre, una pastelería, un bollo dulce, una barra de caramelo, una corteza de pastel, un relleno de pastel, comida para bebés, una mezcla para hornear, una masa, un empanado, una mezcla para salsa, un extensor de carne, un sustituto de la carne, una mezcla de condimentos, una mezcla para sopa, una salsa, un roux, un aderezo para ensaladas, una sopa, crema agria, un fideo, una pasta, fideos ramen, fideos chow mein, fideos lo mein, una inclusión de helado, una barra de helado, un cono de helado, un sándwich de helado, una galleta, un crouton, un donut, un rollo de huevo, un snack extrusionado, una barra de frutas y cereales, un producto de aperitivo para microondas, una barra nutricional, una tortita, un producto de panadería precocido, un pretzel, un pudin, un producto a base de granola, un chip de aperitivo, un snack, una mezcla de aperitivos, un gofre, una corteza de pizza, comida para animales o comida para mascotas.

En modalidades alternativas, la harina integral, la harina refinada o la fracción gruesa puede ser un componente de un suplemento nutricional. Por ejemplo, el suplemento nutricional puede ser un producto que se añade a la dieta y que contiene uno o más ingredientes adicionales, que típicamente incluyen: vitaminas, minerales, hierbas, aminoácidos, enzimas, antioxidantes, hierbas, especias, probióticos, extractos, prebióticos y fibra. La harina integral, la harina refinada o la fracción gruesa de la presente invención incluye vitaminas, minerales, aminoácidos, enzimas y fibra. Por ejemplo, la fracción gruesa contiene una cantidad concentrada de fibra dietética, así como también otros nutrientes esenciales, como vitaminas B, selenio, cromo, manganeso, magnesio y antioxidantes, que son esenciales para una dieta saludable. Por ejemplo, 22 gramos de la fracción gruesa de la presente invención suministran el 33 % del consumo diario recomendado de fibra de un individuo. El suplemento nutricional puede incluir cualquier ingrediente nutricional conocido que ayude a la salud general de un individuo, los ejemplos incluyen, pero no se limitan a las vitaminas, minerales, otros componentes de fibra, ácidos grasos, antioxidantes, aminoácidos, péptidos, proteínas, luteína, ribosa, ácidos grasos omega 3, y/u otros ingredientes nutricionales. El suplemento puede suministrarse, pero no se limita a las siguientes formas: mezclas de bebidas instantáneas, bebidas listas para beber, barritas nutricionales, barquillos, galletas, galletas saladas, chupitos de gel, cápsulas, masticables, tabletas masticables y píldoras. Una modalidad suministra el suplemento de fibra en forma de batido aromatizado o bebida de tipo malta, esta modalidad puede ser particularmente atractiva como suplemento de fibra para niños.

En una modalidad adicional, puede usarse un proceso de molienda para hacer una harina multigrano o una fracción gruesa multigrano. Por ejemplo, el salvado y el germen de un tipo de grano pueden molerse y mezclarse con el endospermo triturado o la harina de cereal integral de otro tipo de cereal. Alternativamente el salvado y el germen de un tipo de grano pueden triturarse y mezclarse con endospermo triturado o harina integral de otro tipo de cereal. Se contempla que la presente invención abarca la mezcla de cualquier combinación de uno o más de salvado, germen, endospermo y harina de grano entero de uno o más granos. Este enfoque multigrano puede usarse para hacer harina a medida y aprovechar las cualidades y el contenido nutricional de varios tipos de granos de cereal para hacer una harina.

Se contempla que la harina de grano entero, la fracción gruesa y/o los productos de grano de la presente invención pueden producirse mediante cualquier proceso de molienda conocido en la técnica. Una modalidad ilustrativa implica moler el grano en una sola corriente sin separar el endospermo, el salvado y el germen del grano en corrientes separadas. El cereal limpio y suavizado se transporta hasta un primer molino de conducto, tal como un molino triturador, molino de rodillos, molino de pines, molino de percusión, molino de discos, molino de frotamiento por aire, molino de ranura, o similares. Tras la molienda, el grano se descarga y se transporta a un tamiz. Además, se contempla que la harina de grano entero, la fracción gruesa y/o los productos de grano de la presente invención pueden modificarse o mejorarse mediante otros numerosos procesos como: fermentación, instanciación, extrusión, encapsulación, tostado, torrefacción o similares.

Malteado

Una bebida a base de malta que se proporciona por la presente invención implica bebidas alcohólicas (incluidas bebidas destiladas) y bebidas no alcohólicas que se producen mediante el uso de la malta como parte o la totalidad de su material de partida. Los Ejemplos incluyen cerveza, happoshu (bebida de cerveza con bajo contenido de malta), whisky, bebidas a base de malta con bajo contenido de alcohol (por ejemplo, bebidas a base de malta que contienen menos del 1 % de alcoholes) y bebidas sin alcohol.

El malteado es un proceso de remojo y germinación controlados seguido del secado del grano tales como el grano de cebada y trigo. Esta secuencia de eventos es importante para la síntesis de numerosas enzimas que causan la modificación del grano, un proceso que principalmente despolimeriza las paredes celulares del endospermo muerto y moviliza los nutrientes del grano. En el proceso de secado posterior, se producen sabor y color debido a reacciones químicas de pardeamiento. Aunque el uso principal de la malta es para la producción de bebidas, también puede utilizarse en otros procesos industriales, por ejemplo, como fuente de enzimas en la industria de la panificación, o como agente saborizante y colorante en la industria alimenticia, por ejemplo, como malta o como una harina de malta, o indirectamente como un jarabe de malta, etc.

En una modalidad, la presente invención se relaciona con métodos para producir una composición de malta. El método comprende preferentemente las etapas de:

(i) proporcionar grano, como cebada o trigo, de la invención,

(ii) remojar dicho grano,

(iii) germinar los granos macerados en condiciones predeterminadas y

(iv) secar dichos granos germinados.

Por ejemplo, la malta puede producirse mediante cualquiera de los métodos descritos en Hoseney (Principles of Cereal Science and Technology, Segunda Edición, 1994: American Association of Cereal Chemists, St. Paul, Minn.). Sin embargo, también puede usarse con la presente invención cualquier otro método adecuado para producir malta, tales como métodos para la producción de maltas especiales, que incluyen, pero se limitan a, métodos para tostar la malta.

La malta se usa principalmente para la elaboración de cerveza, pero también para la producción de bebidas espirituosas destiladas. La elaboración de la cerveza comprende la producción de mosto, las fermentaciones principal y secundaria y el postratamiento. Primero se muele la malta, se agita en agua y se calienta. Durante este "macerado", las enzimas activadas en el malteado degradan el almidón del grano en azúcares que pueden fermentarse. Se clarifica el mosto producido, se le añade levadura, se fermenta la mezcla y se realiza un postratamiento.

Ejemplos

Ejemplo 1. El gen Lr67/Yr46 es un gen de resistencia de plantas adultas distinto de Lr34/Yr18 y Lr46/Yr29 Introducción

Los genes de resistencia a la roya en el trigo se clasifican en dos amplias categorías que se refieren a genes de resistencia de plántulas y plantas adultas (APR). Los genes de resistencia de las plántulas se detectan fenotípicamente después del desafío de la planta con el patógeno de la roya y se observan durante las etapas de plántula y planta adulta; tal como, confieren un fenotipo de resistencia durante todas las etapas del crecimiento de la planta. Por el contrario, el APR generalmente no se observa en la etapa de plántula, sino que se detecta en la etapa de crecimiento posterior a la plántula y, a menudo, como resistencia al patógeno en plantas que crecen en el campo. En unas pocas excepciones, puede inducirse la expresión de algunos genes APR en plántulas mediante la variación de la temperatura de crecimiento y las condiciones de luz, pero no se expresan en plántulas con todas las condiciones de crecimiento. Adicionalmente, los genes de resistencia de las plántulas exponen típicamente fenotipos de efecto principal y con diferentes tipos de infección, mientras que la mayoría de los genes APR tienen un efecto parcial con diferentes niveles de gravedad de la enfermedad. La especificidad de la raza es más común con los genes de resistencia de las plántulas. De los pocos genes APR que se han estudiado en el trigo, la mayoría parecen no ser específicos de la raza y un número limitado son claramente específicos de la raza. Los de la clase no específica de la raza con resistencia parcial se asocian con un fenotipo de desarrollo lento de la roya descrito por primera vez por Caldwell (1968). Típicamente, la resistencia al desarrollo lento de la roya muestra períodos de latencia más largos, menos uredinios y tamaños de uredinios más pequeños dentro de las dos primeras semanas posteriores a la inoculación en comparación con las plantas susceptibles.

Uno de los genes de resistencia no específicos de la raza bien caracterizados es el gen de resistencia a la roya de la hoja de la planta adultaLr34 (documentoWO2010/022443). Anteriormente referido como LrT2 (Dyck 1977, 1987) está presente en cultivares de trigo más antiguos de América del Sur como Frontana y sus derivados, algunos de los cultivares de trigo cruzados tempranos a principios del siglo pasado y algunas variedades locales de trigo (variedades no cultivadas aisladas de trigos silvestres) en particular los de origen chino (Borghi 2001; Kolmer y otros, 2008) . Una característica importante de Lr34 fue que la virulencia en el patógeno de la roya de la hoja del trigo no se ha informado hasta la fecha, y el efecto mejorado de la resistencia a la roya cuando el gen Lr34 se combinó en cultivares de trigo con otros genes de resistencia a la roya de la hoja específicos de la raza ha contribuido a la durabilidad de los cultivares de trigo con combinaciones de genesLr34 (Kolmer, 1996). Sin embargo, se ha reportado variabilidad en el grado de desarrollo de las colonias de roya entre los aislamientos de roya de la hoja en Lr34 (Bender y Pretorius, 2000). La cosegregación del Lr34 con el gen de resistencia a la roya rayada de la planta adulta Yr18 (McIntosh 1992; Singh 1992) al exponer una doble resistencia a la roya en numerosos cultivos de trigo puede haber contribuido al uso generalizado continuo del germoplasma Lr34/Yr18 en el fitomejoramiento de trigo. Observaciones subsecuentes de que el locus Lr34/Yr18 también contribuía a la resistencia parcial contra el oídio de las plantas adultas (Pm38) destacó la naturaleza multipatógena del locus Lr34/Yr18/Pm38 en el brazo corto del cromosoma 7D del trigo (Spielmeyer y otros, 2005; Lillemo y otros, 2008).

Se usó la mutagénesis química y física para investigar el locus de resistencia a múltiples patógenos que contiene Lr34 en el cromosoma 7DS del trigo (Spielmeyer y otros, 2008). Se recuperaron mutantes susceptibles para los que no hubo pérdida de marcadores de ADN en el integral QTL en 7DS. Subsecuentemente se mostró que estos mutantes eran mutaciones puntuales en las que el mutágeno químico había creado sustituciones de una sola base. Los mutantes adicionales generados por irradiación gamma tenían eliminaciones de una sola base dentro de un gen que codifica un transportador de casete de unión a ATP (ABC) en el locus de resistencia a múltiples patógenos (Krattinger y otros, 2009). Adicionalmente al transportador ABC, otros seis genes se cosegregaron con el locus de resistencia y estaban estrechamente unidos genética y físicamente. Sin embargo, ninguno de los mutantes (ocho mutantes independientes) presentó cambios en los genes adicionales. Por lo tanto, los cambios mutagénicos en el transportador ABC solo fueron adecuados para conferir la pérdida de las tres resistencias a la roya de la hoja, la roya rayada y el oídio codificadas por Lr34/Yr18/Pm38. Junto con el análisis de haplotipos y el mapeo de alta resolución, se estableció que un único gen, un transportador ABC, confería las tres resistencias (Krattinger y otros, 2009) .

Lr67/Yr46 es distinto de Lr34/Yr18 y Lr46/Yr29

Durante el desarrollo de líneas casi isogénicas para la resistencia a la roya de la hoja en el cultivar Thatcher, Dyck (1987) se observó un espectro fenotípico en la línea RL6077 (Thatcher*6/PI250413), que era similar a RL6058, una línea casi isogénica portadora Lr34/Yr18. En estudios subsiguientes, la APR en RL6077 se segregó independientemente de Lr34/Yr18 y hubo evidencia de una diferencia de translocación entre las líneas. Como resultado, Dyck y otros (1994) infirió que RL6077 era un portador del gen Lr34/Yr18, pero en un cromosoma diferente al 7DS. Con el desarrollo de marcadores genéticos estrechamente unidos y, en última instancia, la clonación de Lr34/Yr18, quedó claro que RL6077 carecía del haplotipo de resistencia Lr34/Yr18a presente en RL6058 y, por lo tanto, contenía un gen APR diferente (Kolmer y otros, 2008; Lagudah y otros, 2009).

Estudios sobre el mapeo de poblaciones de cruces que involucran RL6077 mediante el uso de P. triticina y P. striiformis aislados de múltiples localidades en Canadá, México y Australia, establecieron la cosegregación de los APR respectivos en el cromosoma 4DL (brazo largo del cromosoma 4D, en el genoma D del trigo de pan) (Herrera-Foessel y otros, 2011; Hiebert y otros, 2010). Estos genes APR en el locus de resistencia en 4DL se han designado Lr67/Yr46.

Ejemplo 2. Clonación del gen (syn=Yr46=Sr55=Pm46) Lr67

Adicionalmente del genotipo de trigo RL6077, se ha postulado que otros dos genotipos de trigo, NP876 y Sujata son portadores del Lr67. Esto se basó en la presencia del fenotipo de necrosis de la punta de la hoja (Ltn), el desarrollo lento de la infección con la roya de la hoja y el alelo marcador de repetición de secuencia simple (SSR) unido a Lr67 en RL6077 (Hererra y otros, 2011). Como parte de la estrategia para la identificación de marcadores cosegregantes y la clonación del gen Lr67, los presentes inventores desarrollaron familias consanguíneas recombinantes (RI) a partir de cruces que implican la hoja de la planta adulta y el progenitor susceptible a la roya rayada, Avocet. Estas familias RI se obtuvieron de los cruces Avocet x RL6077, Avocet x Sujata y Avocet x NP876. Una familia F2 de la cruz Thatcher x Thatcher+Lr67 (RL6077) también se hizo. Estas familias RI se usaron después en estudios de mapeo genético y experimentos mutacionales como sigue.

En primer lugar, una población mutagenizada de una línea obtenida de Avocet x RL6077 fijada para el gen Lr67 se realizó mediante irradiación gamma con una dosis de 20 krad de una fuente 60Co. En segundo lugar, se usó la mutagénesis química mediante el uso de metanosulfonato de etilo (EMS) en condiciones estándares de mutagénesis para generar una población mutante mediante el uso el genotipo de trigo RL6077. Las líneas progenitoras M2 se produjeron a partir de las poblaciones mutagenizadas y cada una de ellas se evaluó la pérdida del fenotipo de resistencia. Se llevó a cabo una evaluación de campo de la progenie mutante M2 para identificar la pérdida de resistencia a la roya de la hoja y rayada resultante de la inactivación del gen Lr67. Los mutantes putativos se evaluaron adicionalmente en la etapa M3 y M4 para seleccionar líneas susceptibles homocigotas. Las plantas de cinco líneas irradiadas con rayos gamma (designadas ^y318, ^y676, ^y1183, ^y1239 y ^y1656) y dos líneas EMS (designadas emsSu1 y emsSu2) fueron identificadas como mutantes susceptibles. Todos mostraron pérdida de los fenotipos de resistencia a la roya de la hoja y de la roya rayada, así como también del fenotipo de necrosis de la punta de la hoja, lo que sugiere que un único gen fue responsable de los tres fenotipos. El fondo del genotipo de trigo de los mutantes EMS facilitó la evaluación de la roya del tallo y el oídio, y cada uno de los mutantes mostró susceptibilidad a ambas enfermedades en contraste con la resistencia observada en sus hermanos y en el progenitor original.

En un esfuerzo por identificar secuencias de ADN en el locus Lr67 o estrechamente unidos a él, se seleccionaron quince líneas endógamas recombinantes (RlLs) homocigóticas de fenotipos resistentes (Lr67R) y susceptibles (Lr67S) y se sometieron a extensos análisis AFLP y SSR. Se evaluó una biblioteca de reducción de la complejidad del genoma basada en una biblioteca genómica restringida por la endonucleasa PstI a partir del ADN agrupado de las 15 líneas resistentes y homocigóticas para los marcadores basados en SNP. También se llevó a cabo un enfoque de genómica comparativa mediante el uso de secuencias de un clon BAC de trigo que contiene el SSR estrechamente unido a Lr67 (Hererra y otros, 2011) como punto de anclaje para identificar genes ortólogos del arroz y genomas Brachypodium (Figura 1). A continuación, se usó una región colineal entre el cromosoma de 1 de Brachypodium y el cromosoma 3 del arroz para desarrollar marcadores de ADN que amplificaran las secuencias correspondientes del trigo y de Aegilops tauschii, estrechamente relacionado con el genoma D progenitor del cromosoma 4DL del trigo (Figura 1).

Los marcadores de ADN generados a partir de AFLP y SNP de las bibliotecas de reducción de la complejidad del genoma produjeron marcadores unidos a Lr67, pero ninguno cosegregó con las quince líneas endógamas recombinantes homocigóticas resistentes y susceptibles. Sin embargo, los fragmentos de ADN aislados de diferentes partes de un gen que codifica la chaperonina que contenía un dominio Hsp70 (proteína de choque térmico, véase Figura 1) aislado del enfoque de genómica comparativa estaba completamente unido a las quince líneas endógamas recombinantes susceptibles y estaban ausentes en las quince líneas resistentes (Figura 2). La extensión del enlace de la chaperonina Hsp70 se verificó en 500 líneas endógamas recombinantes y se confirmó que muestra una asociación completa con el locus Lr67. El análisis de transferencia de ADN genómico proporcionó evidencia adicional de que el gen que codifica la chaperonina Hsp70 se eliminó en las líneas parentales resistentes Lr67, RL6077, Sujata y NP876. Dado que se habían aislado mutantes susceptibles con pérdida de función para el Lr67, era poco probable que el gen de la chaperonina Hsp70 eliminado en las plantas resistentes fuera suficiente para el fenotipo de resistencia Lr67. Consecuentemente, se realizó una búsqueda de todas las secuencias de genes predichas en las proximidades cercanas (dentro de 21 kb) de Hsp70 y se identificaron otros tres genes mediante genómica comparativa. Se trata de genes con dominios proteicos anotados en los mapas del genoma del arroz o de Brachypodium como codificadores de una proteína de la familia del factor citosólico Sec14B, un transportador de monosacáridos (MST estrechamente relacionado con los transportadores de azúcares-SUT) y una proteína de interacción/unión (PIP).

Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los genes correspondientes en varias variedades de trigo y en mutantes Lr67. El análisis de secuencia de las líneas parentales Thatcher (Lr67 susceptible), Avocet (Lr67 susceptible) y Thatcher +Lr67 (RL6077) no mostró diferencias en el gen Sec14B mientras que los genes MST y PIP revelaron polimorfismos de secuencia. Dos SNP (C/G y T/G) encontrados en el gen SUT fueron únicos para los trigos que contienen Lr67 (Figura 4), mientras que un polimorfismo de inserción/eliminación en PIP no fue diagnóstico para Lr67. Se estableció la cosegregación de los SNP en el gen SUT y la roya de la planta adulta Lr67 en 520 líneas endógamas recombinantes. Para asegurarse de que no se hayan perdido secuencias de genes adicionales o reordenamientos desconocidos en la región del cromosoma 4DL del trigo que alberga Lr67 con relación a las regiones sinténicas correspondientes de Brachypodium (cromosoma 1) y arroz (cromosoma 3), las regiones equivalentes de Aegilops tauschii (progenitor del genoma D) se analizaron. Una secuencia cóntigo de 70 kb mostró la presencia de los genes Hsp70, SUT y PIP ubicados dentro de un fragmento de 21 kb sin otros genes predichos en el cóntigo. No se detectaron recombinantes entre estos tres genes cuando se analizaron 1152 plantas de una población progenitoras F2 de Thatcher x Thatcher +Lr67 cruzar.

El análisis de los mutantes que fueron inactivados para el fenotipoLr67, reveló que tres de los mutantes gamma fueron eliminados para el SUT, PIP y algunos de los marcadores identificados de genómica comparativa en la región Lr67 (Figura 3, eliminaciones mostradas como líneas discontinuas). Sin embargo, cuatro de los mutantes (dos mutantes EMS y dos de la irradiación gamma, específicamente, ^y318 y ^y1239) conservaron los genes Lr67 cosegregados SUT y PIP. El análisis de secuencia del gen SUT en estos mutantes encontró cambios de un solo nucleótido y pequeñas eliminaciones en sólo el gen SUT y no en PIP. Cada uno de los cambios mutacionales en los cuatro mutantes ocurrió en los aminoácidos que se encuentran en las regiones conservadas de los transportadores de azúcar hexosa (Figura 4). Cuatro mutantes adicionales, obtenidos por mutagénesis de azida sódica de RL6077, también mostraron cambios de un solo nucleótido que alteraron la composición de aminoácidos del gen SUT. Sobre la base de la cosegregación y el análisis mutacional, los inventores infirieron que el gen SUT fue suficiente para conferir el fenotipo de resistencia Lr67. Cuando se evaluaron contra la gama completa de enfermedades de la roya y el oídio, los mutantes EMS del trigo mostraron susceptibilidad a la roya de la hoja, la roya rayada, la roya del tallo y el oídio. Por lo tanto, la inactivación de un solo gen, SUT, tiene un efecto sobre múltiples enfermedades. El gen SUT, por lo tanto, se identificó de manera concluyente como el genLr67.

El genLr67codifica una proteína con 514 aminoácidos (Figura 5) que se prevé que contenga 12 dominios transmembrana. Cuando se predijo mediante el uso del TMHMM Server v2.0 y el programa PSIPRED v3.3, se predijo que los dominios transmembrana serían para aminoácidos: TMhelix1, 20-42; TMhelix2, 81-100; TMhelix3, 107-126; TMhelix4, 136-158; TMhelix5, 170-192; TMhelix6; 202-221; TMhelix7, 282-304; TMhelix8, 319-341; TMhelix9, 348-370; TMhelix10, 380-402; TMhelix11, 423-445; y TMhelix12, 450-472. Cada una de las siguientes regiones de aminoácidos: los 19 aminoácidos N-terminales, los aminoácidos entre las hélices TM 2 y 3, los aminoácidos entre las hélices TM 4 y 5, los aminoácidos entre las hélices TM 6 y 7, los aminoácidos entre las hélices TMA 8 y 9, y los 42 aminoácidos C terminales se predijeron con el mismo programa para que estuvieran localizados en el interior de la membrana, y los otros aminoácidos fuera de la membrana. La proteína es un miembro de la superfamilia facilitadora mayor (MFS), que es un grupo grande y diverso de transportadores secundarios que incluyen proteínas de uniporte, simporte y antiporte que facilitan el transporte a través de las membranas celulares internas o citoplasmáticas de una variedad de compuestos, incluidos los azúcares. Se identificaron polipéptidos homólogos mediante la consulta de la base de datos de proteínas NCBI con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, y se identificaron numerosos homólogos. La secuencia de aminoácidos de Lr67 es aproximadamente 89 93 % idéntica a los polipéptidos homólogos en varios cereales, incluido el arroz, y aproximadamente un 80 % idéntica a un homólogo en Arabidopsis, Proteína 13 de transporte de azúcar (número de acceso NP_198006).

Un fragmento de ADN correspondiente al gen Lr67 se clonó a partir de trigo y sus secuencias de nucleótidos se compararon con la secuencia de ADNc (la SEQ ID NO:10). Esto reveló la presencia de dos intrones en la región codificadora de proteínas del gen (Figura 14).

El análisis RT-PCR mostró que los tres genes homólogos Lr67 de los genomas A, B y D del trigo hexaploide se expresaban en las plantas. El polipéptido codificado por el homólogo del genoma A del gen Lr67 era 507/514 (98,6 %) idéntico en la secuencia de aminoácidos con relación a la SEQ ID NO: 1, que incluye tener una glicina en la posición 144 y una valina en la posición 387 que eran típicas de los polipéptidos Lr67 susceptibles. Este resultado indicó a los inventores que el polipéptido resistente Lr67 podría actuar como un polipéptido negativo dominante, que reduce la actividad de los polipéptidos Lr67 susceptibles codificados por los genomas A y B en trigo hexaploide.

La base molecular de las diferencias entre los polipéptidos codificados por los alelos Lr67 resistentes y susceptibles se delimitaron a los dos cambios de nucleótidos que dieron lugar a los SNP usados en los marcadores de diagnóstico de Lr67. Estos dos cambios de nucleótidos dan como resultado un cambio de aminoácidos de una glicina conservada a arginina (posición 144) en el cuarto dominio transmembrana predicho y de una valina a leucina (posición 387) en el décimo dominio transmembrana (Figuras 6, 7 y 8) con referencia a la SEQ ID NO:1. Estos dos cambios de nucleótidos fueron raros en el trigo y no se encontraron en el progenitor del genoma D o en la mayoría de los cultivares comerciales de trigo con la excepción de los pocos que portanLr67. Por lo tanto, la resistencia Lr67 puede haberse originado subsecuentemente a la formación de trigo hexaploide por hibridación de sus trigos ancestrales diploides. Cuando se analizaron más de 1000 variedades locales de trigo y accesiones de una amplia gama de fuentes geográficas para los dos marcadores de diagnóstico Lr67, la mutación que dio lugar a Lr67 fue muy rara y se localizó en un subconjunto de variedades locales procedentes de las llanuras indogangéticas.

Los homólogos en otras especies de plantas como la proteína transportadora de azúcar 13 en Arabidopsis y en cereales, sin excepción, no tienen arginina en la posición correspondiente a la posición del aminoácido 144 de la SEQ ID NO: 1 o la leucina correspondiente al aminoácido en la posición 387. Invariablemente, los homólogos tenían una glicina en la posición correspondiente al aminoácido 144 y casi siempre una valina en la posición 387 (véanse, por ejemplo, las alineaciones que se proporcionas en las Figuras 9 y 10). Por lo tanto, estos dos aminoácidos estaban altamente conservados en los polipéptidos SUT, y la mutación en uno o ambos aminoácidos indicaba una función alterada que es la causa del fenotipo de resistencia a los patógenos de la roya y el oídio.

Ejemplo 3. Estudios de absorción de glucosa en Lr67 (SUT) expresada en levadura: variación en la secuencia de polipéptidos

La demostración de que el gen Lr67 codificaba una proteína que mostraba homología con transportadores de azúcar conocidos llevó a los inventores a evaluar la función de los polipéptidos Lr67 para el transporte de azúcar en células de levadura.

Procedimiento experimental

Los siguientes experimentos se completaron mediante el uso de las regiones codificantes de proteínas para los polipéptidos Lr67 (alelos resistentes y susceptibles) clonados en el vector de expresión de levadura pRS416. Este vector contenía el promotor ADH1 constitutivo y el terminador CYC1 para la expresión de las regiones codificantes insertadas. La cepa de levadura empleada fue una variante deficiente en transporte de hexosa de Saccharomyces cerevisiae llamado EBY.VW4000. La absorción se determinó mediante el uso de glucosa marcada con radio [14C] con incorporación radioanalizada mediante recuento de centelleo líquido.

Resultados

Absorción de glucosa a lo largo del tiempo

Las células de levadura transformadas con los constructos genéticos para la expresión de los alelos resistentes (Lr67 (res)) o susceptibles (Lr67 (sus)) de Lr67 se incubaron con 100|^j M de glucosa[14C] durante 10 minutos. La absorción de glucosa se evaluó a intervalos de 2 minutos. Se mostró que las células de levadura que expresan el alelo susceptible a Lr67 son capaces de transportar glucosa a una velocidad mayor que las células de levadura que expresan el alelo resistente a Lr67 o el vector vacío (Figura 11). De hecho, las células que expresan el alelo resistente a Lr67 no mostraron actividad de transporte de glucosa detectable por encima del control, aunque este ensayo se llevó a cabo durante solo 10 minutos y no fue sensible.

Cinética de absorción de glucosa Lr67 (sus)

Absorción dependiente de la concentración de glucosa[14C] por Lr67 (sus) mostró una cinética de saturación clásica de Michaelis-Menten. Se usó la ecuación de Lineweaver-Burk para convertir los datos para el análisis de regresión lineal. Se mostró que Lr67 (sus) exhibe una alta afinidad por la glucosa, con un valor de Km de 73/j M y Vmáx de 3,02 nmol min-1 g FW-1 para este sustrato (Figura 12).

Análisis de conversión de aminoácidos

Como se describió anteriormente, hubo dos diferencias de SNP en el nivel de la secuencia de nucleótidos entre los alelos susceptibles y resistentes de Lr67. Esto creó las dos sustituciones de aminoácidos en el producto proteico que incluyen una sustitución de glicina por arginina en la posición 144 (G144R) y una sustitución de valina por leucina en la posición 387 (V387L). Para evaluar si estas sustituciones de aminoácidos, solas o juntas, podrían afectar las tasas de absorción de glucosa de LR67, los aminoácidos en las posiciones 144 y 387 en el alelo resistente a Lr67 se convirtieron individualmente en el aminoácido equivalente presente en el alelo susceptible a Lr67 (es decir, R144G y L387V) mediante mutagénesis del gen clonado.

Las células de levadura transformadas con Lr67 (sus), Lr67 (res), Lr67 (res) R144G y Lr67 (res) L387V se incubaron con 100j M de glucosa [14C] durante 10 minutos. Se mostró que las células de levadura que expresan Lr67 (res) R144G son capaces de transportar glucosa a una velocidad mayor que las células de levadura que expresan Lr67 (res) o Lr67 (res) L387V (Figura 13), pero no en toda la extensión de Lr67 (sus). Esto indicó que la posición 144 era el aminoácido más importante de los dos aminoácidos sustituidos para la función de resistencia a la roya y que la conversión de glicina en arginina (G144R) o viceversa (R144G) alteraba la velocidad de transporte de glucosa del polipéptido Lr67. Sin embargo, la adición de la segunda sustitución de aminoácidos (L387V) también contribuyó a la velocidad de transporte de glucosa.

Dado que las mutaciones por eliminación en Avocet x RL6077 creadas por irradiación gamma que eliminó el gen Lr67 resultó en un alelo susceptible a la infección por roya y oídio, los inventores concluyeron que el polipéptido Lr67 (resistente) debe tener una función positiva en las células de trigo, ciertamente para ser transporte de un sacárido distinto de glucosa, lo más probable es que sea transporte de una azúcar hexosa. Es decir, la conversión del alelo susceptible a Lr67 en plantas de trigo tal como Avocet en el alelo de resistencia requirió la arginina en la posición 144 y se mejoró por la presencia de la leucina en la posición 387.

Ejemplo 4. Producción de plantas transgénicas

Se llevan a cabo experimentos con los genes clonados y las variantes de aminoácidos para introducir los constructos genéticos en trigo transgénico, que transforman plantas de trigo del cultivar Fielder mediante el uso de técnicas estándar mediadas por Agrobacterium, y otras plantas como los cereales, para aumentar la resistencia a patógenos de hongos tales como la roya y el oídio. También se llevan a cabo experimentos para modificar los genes que codifican los homólogos Arabidopsis thaliana y Vitis vinifera de Lr67 para codificar polipéptidos mutantes que tienen la arginina en la posición 144 y la leucina en la posición 387, y convertirlos en polipéptidos resistentes, con el fin de proporcionar genes de resistencia para estas especies de plantas y otras plantas.

Materiales y Métodos

El gen que codifica Lr67 se usó para transformar plantas de cebada como sigue. Se aisló un fragmento genómico de 7133pb del genotipo de trigo Thatcher+Lr67. El fragmento contenía la secuencia genómica de longitud completa para el gen Lr67 e incluía 1318pb de la región promotora nativa y 1512pb de la secuencia del terminador nativo, incluida la región no traducida 3'. El fragmento Lr67 se insertó en el vector de transformación binaria pWBVec8. El vector binario Lr67 se transformó en una cepa AGL-1 de A. tumefaciens y se usó para producir plantas de cebada transformadas establemente (cv. Golden Promise) como se describe en Tingay y otros (1997).

Resultados

Se identificaron ocho plantas transgénicas independientes que se transformaron con el transgén Lr67. Las ocho plantas y las plantas de control de tipo salvaje que se habían sometido a las etapas de cultivo de tejidos implicadas en la transformación pero que carecían del transgén Lr67 se infectaron con roya de la hoja de cebada, que infectaron plantas de la generación T0. Una de las líneas transgénicas avanzadas de Lr67 se evaluó adicionalmente en la etapa T1. Las infecciones por roya y subsecuentes cultivos se realizaron en plántulas y plantas maduras de cebada transgénica cultivadas en cámara de humedad mediante el uso de Puccinia hordei patotipo 4653P+ (número de cultivo PBIC de la Universidad de Sydney 990492), que es avirulento en plantas con genes de resistencia Rph3, 5, 7, 10, 11, 14 y 15 y virulento en líneas con genes de resistencia Rph1, 2, 4, 6, 8, 9, 12, 13 y 19.

Se observó la esporulación de la roya en las hojas de las plantas de control, pero no en las plantas transgénicas Lr67 positivas de la generación T0. Todas las plantas transgénicas Lr67 mostraron una senescencia foliar más temprana en comparación con las plantas de control, similar al fenotipo de senescencia foliar descrito como necrosis de la punta de la hoja que es un rasgo característico de la resistencia mediada por Lr67 en el trigo. Cuando se evaluó la generación T1 de plantas, todas las plantas que contenían Lr67 mostraron el fenotipo de resistencia a la roya de la hoja cuando se evaluaron en plántulas, mientras que todas las plantas que carecen del gen Lr67 mostraron susceptibilidad a la roya de la hoja. Estos resultados confirmaron que el gen aislado Lr67 era funcionalmente activo y suficiente para conferir resistencia a la roya en la cebada. Estos experimentos también extendieron la gama de especies patógenas para las que Lr67 confería resistencia que incluyera a P. hordeii además de Puccinia striiformis, P. triticina, P. graminis, y Blumeria vulgaris.

La presente solicitud reivindica la prioridad del documento AU 2013903161 presentada el 21 de agosto de 2013. Cualquier discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se haya incluido en la presente descripción es solamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. Esto no debe considerarse como una admisión de que alguno o todos estos asuntos forman parte de la técnica anterior o eran de conocimiento general en el campo de interés de la presente invención tal como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

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Claims

REIVINDICACIONES

i. Una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, y en donde el polinucleótido se une operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

2. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se aplica uno o ambos de los siguientes,

i) cuando se expresa en una planta, el polipéptido confiere a la planta resistencia a una o más o a todas de roya de la hoja, roya rayada, roya del tallo y al oídio, y

ii) la célula es una célula vegetal o de levadura.

3. La célula de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el uno o más hongos patógenos biotróficos es uno o más de Blumeria graminis f. sp. tritici, Fusarium graminearum, Bipolaris sorokiniana, Erysiphe graminis f. sp. tritici, Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia Striiformis, Puccinia hordei y Puccinia recóndita f. sp. tritici. 4. La célula de acuerdo con la reivindicación 3, en donde,

i) la célula vegetal es una célula vegetal de cereal, tal como una célula vegetal de trigo, y/o

ii) el promotor dirige la expresión génica en una célula de la hoja y/o el tallo.

5. La célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde se aplica uno o más de los siguientes,

i) el polipéptido comprende un aminoácido en la posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, y en donde el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en arginina, lisina e histidina,

ii) el polipéptido no comprende una valina en una posición correspondiente al aminoácido número 387 de la SEQ ID NO: 1,

iii) el polinucleótido exógeno se integra en el genoma de la célula,

iv) el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica, al menos 90 % idéntica o al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO:1, y

v) el polipéptido comprende 12 dominios transmembrana.

6. Una planta transgénica que comprende células de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la planta transgénica es transgénica para el polinucleótido exógeno, y en donde la planta tiene una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos en comparación con una planta isogénica que carece del polinucleótido exógeno.

7. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde se aplican uno o más de los siguientes, i) la planta tiene una resistencia mejorada a una roya, un oídio o tanto una roya como un oídio, en comparación con una planta isogénica que carece del polinucleótido exógeno,

ii) la planta tiene una resistencia mejorada a uno o más hongos patógenos biotróficos en la etapa de crecimiento de la plántula,

iii) la planta comprende uno o más polinucleótidos exógenos adicionales que codifican un polipéptido de resistencia a patógenos de plantas distinto de un polipéptido Lr67,

iv) la planta es una planta de cereal, como una planta de trigo,

v) la planta es homocigótica para el(los) polinucleótido(s) exógeno(s), y

vi) la planta crece en un campo.

8. Una planta transgénica que contiene un ácido nucleico introducido en el genoma de una célula mediante manipulación experimental, en donde el ácido nucleico es un alelo o variante de un gen Lr67 que confiere resistencia a la planta a uno o más hongos patógenos biotróficos y codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO:1, y el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, en donde además la planta se selecciona del grupo que consiste en cebada, centeno, avena, arroz, maíz, sorgo, uvas, remolacha azucarera, remolacha forrajera, manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas, moras, frijoles, lentejas, guisantes, soja, colza u otras Brassicas, mostaza, amapola, aceitunas, girasoles, cártamo, lino, coco, plantas de aceite de ricino, cacao en grano y cacahuetes.

9. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que es cebada, centeno, avena, arroz, maíz o sorgo.

10. Un proceso para determinar si un polipéptido confiere resistencia o susceptibilidad a uno o más hongos patógenos biotróficos, que comprende:

i) obtener un polinucleótido unido operativamente a un promotor, el polinucleótido codifica el polipéptido, en donde el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a una SEQ ID NO:1, y en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1,

ii) introducir por transformación el polinucleótido en una planta,

iii) determinar si el nivel de resistencia o susceptibilidad al uno o más hongos patógenos biotróficos aumenta o disminuye con relación a una planta isogénica que carece del polinucleótido, y iv) opcionalmente, si aumenta el nivel de resistencia o susceptibilidad, seleccionar un polinucleótido que codifica el polipéptido que, cuando se expresa, confiere resistencia o susceptibilidad al uno o más hongos patógenos biotróficos.

11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde se aplican uno o más de los siguientes,

a) el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, o una secuencia que es al menos 40 % idéntica a una o ambas de las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3,

b) la planta es una planta de cereal como una planta de trigo,

c) el polipéptido es un polipéptido de planta o mutante de este,

d) la etapa ii) comprende además la integración estable del polinucleótido unido operativamente a un promotor en el genoma de la planta, y

e) el polipéptido se caracteriza por una o más de las características definidas en las reivindicaciones 2 a 5.

12. Un vector quimérico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, o una secuencia que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ⁱD NO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1, y en donde el polinucleótido se une operativamente a un promotor.

13. Un método para producir una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 6, la reivindicación 7 o la reivindicación 9, el método comprende las etapas de

i) introducir por transformación el vector de acuerdo con la reivindicación 12 en una célula de una planta, y

ii) regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

14. Un método para identificar una planta que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto a la glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la ^sE^qID NO:1, el método comprende las etapas de

i) obtener una muestra de ácido nucleico de una planta, y

ii) cribar la muestra para detectar la presencia o ausencia del polinucleótido.

15. Una parte de planta de la planta de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde la parte de la planta comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO:1, y en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1.

16. Una parte de la planta de la planta de acuerdo con reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde la parte de la planta comprende un ácido nucleico que es un alelo o variante de un gen Lr67 que confiere resistencia a la planta a uno o más hongos patógenos biotróficos y codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1.

17. La parte de la planta de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, que es una semilla.

18. Un método para producir un ingrediente alimenticio, alimento o producto no alimenticio, el método comprende el procesamiento de la semilla de acuerdo con la reivindicación 17.

19. Un método para preparar malta, que comprende la etapa de germinar una semilla de acuerdo con la reivindicación 17.

20. Uso de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o parte de la planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, como pienso para animales, o para producir pienso para consumo animal o alimento para consumo humano.

21. Un método para producir un producto a partir de una planta de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 y/o una parte de la planta de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 17, en donde el producto es un producto alimenticio o producto de bebida que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que cuando se expresa en una planta confiere a la planta resistencia a uno o más hongos patógenos biotróficos, y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO:1, y en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la S^eQ ID NO:1.

22. Un método para producir un producto a partir de una planta de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9 y/o una parte de la planta de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en donde el producto es un producto alimenticio o producto de bebida que comprende un ácido nucleico que es un alelo o variante de un gen Lr67 que confiere resistencia a la planta a uno o más hongos patógenos biotróficos y codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO:1, en donde el polipéptido comprende un aminoácido distinto de glicina en una posición correspondiente al aminoácido número 144 de la SEQ ID NO:1.