ES2893830T3

ES2893830T3 - Gen de resistencia a la roya del tallo del trigo

Info

Publication number: ES2893830T3
Application number: ES14807302T
Authority: ES
Inventors: Evans Lagudah; Sambasivam Kuppusamy Periyannan
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2022-02-10
Anticipated expiration: 2034-06-06
Also published as: CN105408482A; US20160138042A1; AU2014277626A1; CA2914502A1; MX2021003113A; CN105408482B; EP3004356B1; CA2914502C; AU2014277626B2; ZA201508918B; MX2015016777A; EP3004356A1; EP3004356A4; WO2014194371A1; US10113180B2

Abstract

Un proceso para identificar un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis que comprende: i) obtener un polinucleótido aislado unido operativamente a un promotor, comprendiendo el polinucleótido que codifica un polipéptido aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, ii) introducir el polinucleótido en una planta, iii) determinar si el nivel de resistencia a Puccinia graminis está modificado con respecto a una planta isogénica que carece del polinucleótido, y iv) opcionalmente, seleccionar un polinucleótido que cuando se expresa confiere resistencia a Puccinia graminis.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen de resistencia a la roya del tallo del trigo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una planta transgénica que ha integrado en su genoma un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis, tal como el grupo Ug99 de razas de Puccinia graminis f. sp. tritici.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La roya del tallo (Puccinia graminis f. sp. tritici) del trigo es una amenaza importante para la seguridad alimentaria mundial y requiere el desarrollo continuo de nuevas variedades resistentes a la roya del tallo. Una raza de roya del tallo, Ug99 o Tt KSK, confirmada por primera vez en Uganda en 1999, es virulenta en muchas variedades comerciales, incluyendo las portadoras del gen de resistencia Sr31, que hasta ahora se había demostrado que era duradero y ampliamente cultivado (Jones et al., 1991; Bariana y Mcintosh, 1993). Ug99 y sus razas derivadas de mutantes se han extendido a otras regiones africanas y a Oriente Medio. Las preocupaciones sobre una posible epidemia que pudiera alcanzar las áreas agrícolas de Asia ha sido un impulsor clave de una iniciativa global para combatir la amenaza a la seguridad alimentaria planteada por Ug99 y su linaje. Más de un 90 % de variedades de trigo en la ruta propuesta de migración del patógeno son susceptibles (Bariana y Mcintosh, 1993). Los esfuerzos mundiales para cultivar trigo para aumentar la resistencia a la roya se basan en gran medida en el repertorio de especificidades de reconocimiento inmunitario frente al arsenal de efectores patogénicos de la roya del trigo que están incorporados en los principales genes de resistencia (R) encontrados en el acervo génico del trigo y sus parientes. La combinación de diferentes genes R específicos capaces de detectar una amplia gama de efectores se considera una estrategia eficaz para contener las epidemias de roya en la agricultura comercial.

En el trigo se han catalogado más de 50 genes R de la roya del tallo que confieren resistencia en todas las etapas de crecimiento, incluyendo los introgresados de parientes naturales. Hasta la fecha, ninguno de estos genes R de la roya del tallo del trigo se ha clonado. Por el contrario, se han clonado tres genes R del trigo (Lr1, Lr10 y Lr21) que proporcionan protección frente al hongo de la roya de la hoja del trigo, Puccinia triticina (Somers et al., 2004; Hayden et al., 2008; Manly et al., 2001). El gen R de la roya del tallo del trigo, Sr33, derivado del progenitor del genoma diploide D, Aegilops tauschii, (Kosambi, 1944) del trigo común (Triticum aestivum) exhibe una serie de características interesantes; proporciona una respuesta de infección de resistencia intermedia frente a la raza Ug99 y su linaje, así como todos los aislados de roya disponibles comúnmente de diversas regiones geográficas (Kota et al., 2006). Se están realizando esfuerzos para secuenciar completamente los genomas y caracterizar efectores de patógenos de la roya del tallo del trigo, Incluyendo Ug99 (Akhunov et al., 2010).

Existe una necesidad urgente de identificar genes que confieran al menos cierto nivel de resistencia en plantas, especialmente trigo, frente a Puccinia graminis, tal como el grupo Ug99 de razas de Puccinia graminis f. sp. tritici.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han identificado polipéptidos que confieren al menos cierto nivel de resistencia en plantas, especialmente trigo, frente a Puccinia graminis, tal como el grupo Ug99 de razas de Puccinia graminis f. sp. tritici.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una planta transgénica que ha integrado en su genoma un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis, en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un célula de la planta, y en donde además el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en s Eq ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y/o el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

En una realización, la Puccinia graminis es Puccinia graminis f. sp. tritici. En una realización adicional, la Puccinia graminis f. sp. tritici es una raza del grupo Ug99.

En otra realización, la planta transgénica tiene resistencia mejorada a Puccinia graminis cuando se compara con una planta isogénica que carece del polinucleótido exógeno.

En una realización, el polipéptido es un polipéptido Sr33.

En una realización, el polipéptido comprende uno o más, preferentemente todos, de un dominio superenrollado (CC), un dominio de unión a nucleótidos (NB) y un dominio de repetición rico en leucina (LRR).

En una realización adicional, el polipéptido comprende uno o más, preferentemente todos, de un motivo de bucle p, un motivo de quinasa 2 y un motivo de quinasa 3a en el dominio NB.

En una realización, el motivo de bucle p comprende la secuencia GxxGxGK(T/S)T (SEQ ID NO: 110), más preferentemente la secuencia GFGGLGKt T (SEQ ID NO: 111).

En una realización, el motivo de quinasa 2 comprende la secuencia LxxxDDVW (SEQ ID NO: 112), más preferentemente la secuencia LVIIDDVW (SEQ ID NO: 113).

En una realización, el motivo de quinasa 3a comprende la secuencia GxxxxxTxR (SEQ ID NO: 114), más preferentemente la secuencia GSRLIiTt R (SEQ ID NO: 115).

En una realización adicional, el dominio LRR comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 repeticiones imperfectas de la secuencia xxLxLxxxx (SEQ ID NO: 116).

Preferentemente, la planta es una planta de cereal. Algunos ejemplos de plantas de cereal transgénicas de la invención incluyen, pero no se limitan a, trigo, cebada, maíz, arroz, avena y triticale. En una realización particularmente preferente, la planta es trigo.

En una realización adicional, la planta comprende uno o más polinucleótidos exógenos adicionales que codifican otro polipéptido de resistencia a patógenos de plantas. Algunos ejemplos de tales otros polipéptidos de resistencia a patógenos de plantas incluyen, pero no se limitan a, Lr34, Lr1, Lr3, Lr2a, Lr3ka, Lr11, Lr13, Lr16, Lr17, Lr18, Lr21, LrB y Sr35.

Preferentemente, la planta es homocigótica para el polinucleótido exógeno.

En una realización, la planta está creciendo en un campo.

T ambién se proporciona una población de al menos 100 plantas transgénicas de la invención que crecen en un campo.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para identificar un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis que comprende:

i) obtener un polinucleótido aislado unido operativamente a un promotor, codificando el polinucleótido un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, un fragmento biológicamente activo del mismo, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2,

ii) introducir el polinucleótido en una planta,

iii) determinar si el nivel de resistencia a Puccinia graminis está modificado con respecto a una planta isogénica que carece del polinucleótido, y

iv) opcionalmente, seleccionar un polinucleótido que cuando se expresa confiere resistencia a Puccinia graminis.

En una realización el proceso tiene uno o más de los siguientes,

a) el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 3 o SEQ Id NO: 4, una secuencia que es al menos un 40 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o una secuencia que se hibrida con una o ambas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4,

b) la planta es una planta de cereal tal como una planta de trigo,

c) el polipéptido es un polipéptido vegetal o mutante del mismo, y

d) la etapa ii) comprende además la integración estable del polinucleótido unido operativamente a un promotor en el genoma de la planta.

La divulgación proporciona un polipéptido de resistencia vegetal a Puccinia graminis básicamente purificado y/o recombinante.

En una realización, el polipéptido es un polipéptido Sr33.

En otra realización, el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, un fragmento biológicamente activo del mismo, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica, al menos un 90 % idéntica, o al menos un 95 % idéntica, a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un polipéptido básicamente purificado y/o recombinante que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica, al menos un 90 % idéntica, o al menos un 95 % idéntica, a una o ambas de SEQ ID No : 1 y SEQ ID NO: 2.

En una realización, un polipéptido de la divulgación es una proteína de fusión que comprende además al menos otra secuencia polipeptídica. El al menos otro polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que potencia la estabilidad de un polipéptido de la presente invención, o un polipéptido que ayuda en la purificación o detección de la proteína de fusión.

Además en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado y/o exógeno que comprende nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, una secuencia que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, o una secuencia que se hibrida con una o ambas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector quimérico que comprende el polinucleótido de la invención.

Preferentemente, el polinucleótido está unido operativamente a un promotor.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno de la invención y/o un vector de la divulgación.

La célula puede ser cualquier tipo de célula tal como, pero sin limitarse a, una célula vegetal, una célula bacteriana, una célula animal o una célula de levadura.

Preferentemente, la célula es una célula vegetal. Más preferentemente, la célula vegetal es una célula de planta de cereal. Incluso más preferentemente, la célula de la planta de cereal es una célula de trigo.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para producir el polipéptido de la invención, comprendiendo el método expresar en un sistema de expresión celular o sin células el polinucleótido de la invención. Preferentemente, el método comprende además aislar el polipéptido.

Además en un otro aspecto, la presente divulgación proporciona un organismo no humano transgénico que comprende un polinucleótido exógeno de la invención, un vector de la divulgación y/o una célula recombinante de la divulgación. Preferentemente, el organismo no humano transgénico es una planta. Preferentemente, la planta es una planta de cereal. Más preferentemente, la planta de cereal es una planta de trigo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir la célula de la divulgación, comprendiendo el método la etapa de introducir el polinucleótido de la divulgación, o un vector de la divulgación, en una célula. Preferentemente, la célula es una célula vegetal.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir una planta transgénica de la invención, comprendiendo el método las etapas de

i) introducir un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de resistencia a Puccinia graminis en una célula de una planta, y

ii) regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para producir una planta que ha integrado en su genoma un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis, comprendiendo el método las etapas de

i) cruzar dos plantas parentales, en donde al menos una planta comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis,

ii) cribar una o más plantas de progenie del cruce para detectar la presencia o ausencia del polinucleótido, y iii) seleccionar una planta de progenie que comprenda el polinucleótido,

produciendo de ese modo la planta.

En una realización, al menos una de las plantas parentales es una planta transgénica de la invención, y la planta de progenie seleccionada comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis.

En una realización adicional, al menos una de las plantas parentales es una planta de trigo tetraploide o hexaploide. Además en otra realización, la etapa ii) comprende analizar una muestra que comprende ADN de la planta para el polinucleótido.

En otra realización, la etapa iii) comprende

i) seleccionar plantas de progenie que sean homocigóticas para el polinucleótido, y/o

ii) analizar la planta o una o más plantas de progenie de la misma para resistencia a Puccinia graminis.

En una realización, el método comprende además

iv) retrocruzar la progenie del cruce de la etapa i) con plantas del mismo genotipo que una primera planta parental que carecía de un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis un número de veces suficiente para producir una planta con una mayoría del genotipo del primer progenitor pero que comprende el polinucleótido, y

iv) seleccionar una planta de progenie que tenga resistencia a Puccinia graminis.

Además en un otro aspecto, un método de la divulgación comprende además la etapa de analizar la planta para al menos otro marcador genético.

También se proporciona una planta producida usando un método de la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso del polinucleótido de la invención, o un vector de la divulgación, para producir una célula recombinante y/o una planta transgénica.

En una realización, la planta transgénica tiene resistencia mejorada a Puccinia graminis cuando se compara con una planta isogénica que carece del polinucleótido exógeno y/o vector.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para identificar una planta que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis, comprendiendo el método las etapas de

i) obtener una muestra de ácido nucleico de una planta, y

ii) cribar la muestra para la presencia o ausencia del polinucleótido, en donde la presencia del polinucleótido indica que la planta es resistente a Puccinia graminis en donde además el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y/o el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

En una realización adicional, el método identifica una planta transgénica de la invención.

En otra realización, el método comprende además producir una planta a partir de una semilla antes de la etapa i).

También se proporciona una parte de planta de la planta transgénica de la invención, que ha integrado en su genoma un transgén que comprende el polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis, en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un célula de la planta, y en donde además el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y/o el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o, una secuencia que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de s Eq ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir una parte de planta, comprendiendo el método,

a) cultivar una planta de la invención, y

b) recolectar la parte de planta.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir harina, harina integral, almidón u otro producto obtenido a partir de semillas, comprendiendo el método;

a) obtener semillas de la invención, y

b) extraer la harina, harina integral, almidón u otro producto.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un producto producido a partir de una planta de la invención y/o una parte de planta de la invención.

En una realización, la parte es una semilla.

En una realización, el producto es un producto alimentario o producto de bebida. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a;

i) el producto alimentario seleccionado entre el grupo que consiste en: harina, almidón, panes con levadura o sin levadura, pasta, fideos, forraje para animales, cereales de desayuno, aperitivos, pasteles, malta, cerveza, bollería y alimentos que contienen salsas basadas en harina, o

ii) el producto de bebida es cerveza o malta.

En una realización alternativa, el producto es un producto no alimentario. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, películas, revestimientos, adhesivos, materiales de construcción y materiales de embalaje.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para preparar un producto alimentario de la invención, comprendiendo el método mezclar semillas, o harina, harina integral o almidón de la semilla, con otro ingrediente alimentario.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar malta, que comprende la etapa de germinar la semilla de la invención.

También se proporciona el uso de una planta de la invención, o parte de la misma, como alimento para animales, o para producir alimento para consumo animal o alimento para consumo humano.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona una composición que comprende uno o más de un polipéptido de la invención, un polinucleótido de la divulgación, un vector de la divulgación, o una célula recombinante de la divulgación, y uno o más vehículos aceptables.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, un fragmento biológicamente activo del mismo, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, comprendiendo el método:

i) poner en contacto el polipéptido con un compuesto candidato, y

ii) determinar si el compuesto se une al polipéptido.

En el presente documento se considerará que cualquier realización se aplica mutatis mutandis a cualquier otra realización a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la invención, como se describe en el presente documento.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, se considerará que la referencia a una sola etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia incluye una y una pluralidad (es decir, una o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.

La invención se describe a continuación en el presente documento mediante los siguientes ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ADJUNTOS

Figura 1. Diagrama esquemático de la sintenia entre (c) región IDS de trigo portadora de Sr33 con (a) cóntigos de BAC (AL8/78) de Ae. tauschii (b) BAC de Ae. tauschii (AUS18913), (d) cebada, (e) Brachypodium y (f) arroz. Los óvalos representan los genes usados para el estudio. Los números en (c) indican el número de recombinantes por 2850 gametos. Los números en (d) a (f) muestran la distancia física en kilobases entre los marcadores. Los números en (a) y (b) indican los Ba C de Ae. tauschii como sigue: 1. HI134N19, 2. HD512N18, 3. RI353E24, 4. HI328O18, 5. HD071G23, 6. HD147M18, 7. HD036N08, 8. RI074M08, 9. HI085F18, 10. 69I06, 11. 172J10 y 12.86D17.

Figura 2. Diagrama esquemático de los tipos de mutantes susceptibles generados mediante tratamiento con EMS. Las barras de puntos indican la longitud del segmento cromosómico perdido debido a mutación, mientras que "Sr33" representa el cambio de SNP en el gen AeRGAIe.

Figura 3. Diagrama esquemático de la estructura del polipéptido AetRGA2b. Secuencia de aminoácidos predicha mediante análisis de r T-PCR comprendida por los dominios CC, NB y LRR relacionados con la clase RGA2 del locus MIa de cebada y un dominio inusual relacionado con una subunidad de Exocisto 70.

Figura 4. (A) Diagrama esquemático de la estructura de Sr33 (AetRGAle). Las barras rectangulares representan exones y UTR, mientras que las líneas negras intermedias indican los intrones. (B) Detalles del nucleótido y los correspondientes cambios de aminoácido en los cuatro mutantes puntuales. E9 y E7 tienen las sustituciones en el bucle P (Walker A) mientras que E6 y E8 tienen sustituciones en los motivos RNBS-B y GLPL de dominio NB, respectivamente.

Figura 5. Análisis de árbol de unión próxima de polipéptidos RGA de Ae. tauschii (AetRGA), MIa funcional de cebada (HvMla) y T. monococcum (TmMla) y resistencia a la roya de la hoja de tipo CC-NB-LRR (Lr1, Lr10 y Lr21) de trigo.

Figura 6. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos del polipéptido para los haplotipos identificados para los alelos del gen Sr33 en Ae. tauschii Los cambios polimórficos se indican mediante sombreado y las líneas de puntos representan variaciones de deleción.

Figura 7. Esquema gráfico y denominación numérica de constructos de Sr33 truncados descritos en el Ejemplo 7.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido de resistencia a la roya del tallo (del haplotipo I). SEQ ID NO: 2 - Secuencia de aminoácidos de la variante alélica del polipéptido de resistencia a la roya del tallo proporcionada como SEQ ID NO: 1 (del haplotipo II).

SEQ ID NO: 3 - Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de resistencia a la roya del tallo (del haplotipo I) de SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 4 - Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de resistencia a la roya del tallo (del haplotipo II) de SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 5 - Secuencia de nucleótidos del gen que codifica el polipéptido de resistencia a la roya del tallo (del haplotipo I) de SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 6 - Secuencia de aminoácidos del haplotipo III de variante polipeptídica de Sr33.

SEQ ID NO: 7 - Secuencia de aminoácidos del haplotipo IV de variante polipeptídica de Sr33.

SEQ ID NO: 8 - Secuencia de aminoácidos del haplotipo V de variante polipeptídica de Sr33.

SEQ ID NO: 9 - Secuencia de nucleótidos que codifica el haplotipo III de variante polipeptídica de Sr33.

SEQ ID NO: 10 - Secuencia de nucleótidos que codifica el haplotipo IV de variante polipeptídica de Sr33.

SEQ ID NO: 11 - Secuencia de nucleótidos que codifica el haplotipo V de variante polipeptídica de Sr33.

SEQ ID NO: 12 - Secuencia de nucleótidos del gen que codifica el polipéptido de resistencia a la roya del tallo (del haplotipo ll) de SEQ ID NO: 2.

SEQ iD n Os 13 a 109 - Cebadores oligonucleotídicos.

SEQ ID NO: 110 - Motivo de bucle p consenso.

SEQ ID NO: 111 - Motivo de bucle p de polipéptido proporcionado como SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 112 - Motivo de quinasa 2 consenso.

SEQ ID NO: 113 - Motivo de quinasa 2 de polipéptido proporcionado como SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 114 - Motivo de

quinasa 3a consenso.

SEQ ID NO: 115 - Motivo de quinasa 3a de polipéptido proporcionado como SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 116 - Repetición consenso del dominio LRR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Técnicas generales y definiciones

A menos que se defina específicamente lo contrario, se considerará que todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, biología molecular vegetal, química de proteínas y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, cultivo celular y técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la materia. Tales técnicas se describen y explican en la bibliografía en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wileylnterscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad), Ed Harlow y David Carril (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad).

Se entenderá que el término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" significa "X e Y" o "X o Y" y se considerará que proporciona un apoyo explícito para ambos significados o para cualquier significado.

Como se usa en el presente documento, el término aproximadamente, a menos que se indique lo contrario, se refiere a /- 10 %, más preferentemente /- 5 %, más preferentemente /-1 %, más preferentemente /- 0,5 %, del valor designado.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, se entenderá que el término "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Roya del tallo

Como se usa en el presente documento, "roya del tallo" se refiere a la enfermedad de las plantas causada por Puccinia graminis o al patógeno fúngico causante, Puccinia graminis, según lo determine el contexto. Como se usa en el presente documento, "roya del tallo del trigo" se refiere a la enfermedad de las plantas causada por Puccinia graminis f. sp. tritici o al hongo patógeno causante, Puccinia graminis f. sp. tritici, según lo determine el contexto.

El grupo Ug99 de razas de roya del tallo del trigo (Puccinia graminis f. sp. tritici) (también conocida como "TTKSK" en el sistema de nomenclatura de norteamericano) es un patógeno fúngico del trigo bien conocido y está comúnmente presente en los campos de trigo en países como África y Oriente Medio (Singh et al., 2011; Hodson et al., 2012). Ug99 puede causar pérdidas importantes en las cosechas y es virulento frente a genes de resistencia que anteriormente protegían al trigo frente a la roya del tallo. Actualmente hay ocho variantes conocidas del grupo Ug99 que están estrechamente relacionadas basándose en análisis de marcadores de ADN. Cada variante del patógeno que difiere en su perfil de virulencia/avirulencia en un panel de plantas de trigo, comprendiendo cada una un gen R de resistencia diferente, se conoce como una "raza" del patógeno. En el grupo de aislados Ug99 todos están estrechamente relacionados y se cree que han evolucionado a partir de un ancestro común, pero pueden diferir en sus perfiles de virulencia/avirulencia, en cuyo caso se consideran razas diferentes. Siete de estas ocho variantes se resumen en la Tabla 2 de Singh et al. (2011). En una realización, el grupo Ug99 de razas de roya del tallo exhibe virulencia en plantas de trigo que comprenden uno o más de los genes de resistencia Sr31, Sr21, Sr24 y Sr36 (Singh et al., 2011). En una realización, el grupo Ug99 de razas de roya del tallo de Puccinia graminis f. sp. tritici tiene virulencia al menos para plantas de trigo que comprenden el gen de resistencia Sr31 (Pretorius et al., 2000).

Polipéptidos/Péptidos

La presente invención se refiere a polipéptidos que confieren resistencia a una planta, por ejemplo una planta de trigo, a roya del tallo, preferentemente a la roya del tallo del trigo, tal como el grupo de razas Ug99. El polipéptido está codificado por un alelo o variante de un gen Sr33 que confiere resistencia a la roya del tallo del trigo. Algunos ejemplos de tales polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los que comprenden una secuencia de aminoácidos como la proporcionada en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. El polipéptido de la invención confiere resistencia mejorada a la roya del tallo, preferentemente roya del tallo del trigo tal como el grupo Ug99 de razas de Puccinia graminis f. sp. tritici cuando se compara con una planta isogénica que carece de un gen que codifica el polipéptido. Este término también se refiere a la proteína producida naturalmente (o proteína de tipo natural de la que se deriva una proteína mutante) codificada por un gen que confiere a una planta (por ejemplo, trigo), cuando se cultiva en condiciones normales de campo, resistencia mejorada a la roya del tallo tal como el grupo Ug99 de razas de Puccinia graminis f. sp. tritici. En una realización preferente, el polipéptido de la invención confiere resistencia específicamente a la roya del tallo, preferentemente a la roya del tallo del trigo específicamente, más preferentemente no confiere resistencia a la roya de la hoja del trigo causada por el patógeno fúngico Puccinia triticina y/o a mildiú polvoriento. En este contexto, "específicamente a la roya del tallo" y "específicamente a la roya del tallo del trigo" significa que la resistencia conferida es preferentemente a la roya del tallo o la roya del tallo del trigo en comparación con otro patógeno fúngico de la misma especie vegetal, preferentemente a muchas o la mayoría de otros patógenos fúngicos de la misma especie. En una realización más preferente, el polipéptido de la invención confiere resistencia a la roya del tallo y al menos dos, o los tres, de roya de la hoja, roya rayada y mildiú polvoriento, preferentemente en trigo. En una realización, los polipéptidos de la invención no están codificados por el gen Sr35 de una planta de trigo. En una realización, los polipéptidos de la invención no están codificados por el gen Sr35 de una planta de trigo o sus homólogos, tales como aquellos que son al menos un 50 % idénticos en la secuencia de aminoácidos al polipéptido Sr35.

En una realización, un polipéptido de la invención de la invención no se une a uno o más o todos de RAR1, SGT1 o HSP90. En una realización adicional, un polipéptido de la invención no se une a WRKY1/2 tal como una proteína WRKY de cebada o Ae. tauschii. En otra realización, un polipéptido de la invención sí forma homodímeros.

En una realización adicional, cuando se expresa en una planta transgénica infectada con roya del tallo, tal como con una raza Ug99 de Puccinia graminis f. sp. tritici, las células de la planta presentan pocos, si los hubiera, signos de muerte celular (autofluorescencia), por ejemplo, cuando se comparan con una planta isogénica que expresa Sr45.

Los polipéptidos de la invención comprenden generalmente un dominio superenrollado (CC) hacia el extremo Nterminal, seguido de un dominio de unión a nucleótidos (NB) y un dominio de repetición rico en leucina (LRR) hacia el extremo C-terminal (véase la Figura 4) . Cada uno de estos tres tipos de dominios es común en polipéptidos que confieren resistencia a patógenos vegetales. Además, los polipéptidos que contienen CC-NB-LRR son una gran clase conocida de polipéptidos que, como clase, confieren resistencia a una amplia diversidad de patógenos vegetales diferentes (véase, por ejemplo, Bulgarelli et al., 2010; McHale et al., 2006; Takken et al., 2006; Wang et al., 2011; Gennaro et al., 2009; y Dilbirligi et al., 2003), aunque cada polipéptido CC-NB-LRR es específico para una especie o subespecie de patógenos. Por tanto, alineando los polipéptidos de la invención con otros polipéptidos CC-NB-LRR, combinados con el gran número de estudios sobre estos tipos de proteínas, así como dominios CC, dominios NB y dominios LRR, el experto en la materia tiene una cantidad considerable de orientación para diseñar variantes funcionales de los polipéptidos específicos proporcionados en el presente documento.

Un dominio o motivo superenrollado es un motivo estructural que es una de las estructuras terciarias más comunes de proteínas donde las hélices a se enrollan juntas como las hebras de una cuerda. Se han diseñado programas informáticos para detectar héptadas y dan como resultado estructuras de espirales superenrolladas (véase, por ejemplo, Delorenzi y Speed, 2002). Las bobinas superenrolladas comprenden generalmente un patrón repetido, hxxhcxc, de restos de aminoácido hidrofóbicos (h) y cargados (c), denominados repeticiones de héptada. Las posiciones en la repetición de la héptada se denominan habitualmente abcdefg, donde a y d son las posiciones hidrofóbicas, que a menudo están ocupadas por isoleucina, alanina, leucina o valina. El plegamiento de una proteína con estas héptadas en una estructura secundaria a-helicoidal hace que los restos hidrofóbicos se presenten como una "franja" que se enrolla suavemente alrededor de la hélice hacia la izquierda, formando una estructura anfipática.

El dominio NB está presente en genes de resistencia, así como en varias quinasas tales como proteínas de unión a ATP/GTP. Este dominio contiene generalmente tres motivos: quinasa-la (bucle p), una quinasa-2 y una quinasa-3a supuesta (Traut 1994; Tameling et al., 2002). La secuencia consenso de GxxGxGK(T/S)T (SEQ ID NO: 110) (GFGGLGKTT (SEQ ID NO: 111) en el polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis proporcionado como SEQ ID NO: 1), LxxxDDVW (SEQ ID NO: 112) (LVIIDDVW (SEQ ID NO: 113) en el polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis proporcionado como s Eq ID NO: 1) y GxxxxxTxR (Se Q ID NO: 114) (GSRLIITTR (SEQ ID NO: 115) en el polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis proporcionado como SEQ ID NO: 1) para los motivos génicos de resistencia de bucle p, quinasa-2 y la quinasa-3a supuesta, respectivamente, son diferentes de los presentes en otras proteínas que codifican NB. Otros motivos presentes en el dominio NB de genes de resistencia de tipo NB/LRR son GLPL, RNBS-D y MHD (Meyers et al., 1999). Las secuencias que intercalan estos motivos y dominios pueden ser muy diferentes incluso entre homólogos de un gen de resistencia (Michelmore y Meyers, 1998; Pan et al., 2000).

Un dominio rico en leucina es un motivo estructural de proteína que forma un plegamiento de herradura a/p (Enkhbayar et al., 2004). El dominio LRR contiene 9-41 repeticiones imperfectas, cada una de aproximadamente 25 aminoácidos de longitud con una secuencia de aminoácidos consenso de xxLxLxxxx (SEQ ID NO: 16) (Cooley et al., 2000). En una realización, un polipéptido de la invención comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, más preferentemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 18, más preferentemente aproximadamente 15 repeticiones ricas en leucina. Estas repeticiones se pliegan comúnmente juntas para formar un dominio de proteína solenoide. Generalmente, cada unidad de repetición tiene una estructura de hebra beta-giro-hélice alfa, y el dominio ensamblado, compuesto por muchas de estas repeticiones, tiene forma de herradura con una lámina beta paralela interior y una matriz exterior de hélices.

En una realización adicional, el polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis tiene una fenilalanina en una posición correspondiente al aminoácido número 99 de SEQ ID NO: 1 y/o un ácido aspártico en una posición correspondiente al aminoácido número 501 de SEQ ID NO: 1.

Como se usa en el presente documento, "resistencia" es un término relativo en el sentido de que la presencia de un polipéptido de la invención (i) reduce los síntomas de la enfermedad de una planta que comprende el gen (gen R) que confiere resistencia, con respecto a una planta que carece del gen R, y/o (ii) reduce la reproducción o propagación de patógenos en una planta que comprende el gen R. La resistencia, como se usa en el presente documento, es relativa a la respuesta "susceptible" de una planta al mismo patógeno. Generalmente, la presencia del gen R mejora al menos un rasgo de producción de una planta que comprende el gen R cuando se infecta con el patógeno, tal como rendimiento de grano, en comparación con una planta isogénica infectada con el patógeno pero que carece del gen R. La planta isogénica puede tener algún nivel de resistencia al patógeno o puede clasificarse como susceptible. Por tanto, los términos "resistencia" y "resistencia mejorada" se usan generalmente en el presente documento de forma intercambiable. Además, un polipéptido de la invención no confiere necesariamente resistencia completa a patógenos, por ejemplo, cuando todavía se presentan algunos síntomas o hay alguna reproducción de patógenos en la infección pero en una cantidad reducida. La resistencia mejorada puede determinarse mediante una serie de métodos conocidos en la técnica, tales como analizar las plantas para determinar la cantidad de patógeno y/ analizar el crecimiento de la planta o la cantidad de daño o síntomas de enfermedad en una planta en presencia del patógeno, y comparar uno o más de estos parámetros con una planta isogénica que carece de un gen exógeno que codifica un polipéptido de la invención.

Por "polipéptido básicamente purificado" o "polipéptido purificado" se hace referencia a un polipéptido que generalmente se ha separado de los lípidos, ácidos nucleicos, otros péptidos y otras moléculas contaminantes con los que está asociado en su estado nativo. Preferentemente, el polipéptido básicamente purificado está al menos un 90 % exento de otros componentes con los que está asociado naturalmente.

Las plantas transgénicas y células hospedadoras de la invención pueden comprender un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de la invención. En estos casos, las plantas y las células producen un polipéptido recombinante.

El término "recombinante" en el contexto de un polipéptido se refiere al polipéptido codificado por un polinucleótido exógeno cuando lo produce una célula, polinucleótido que se ha introducido en la célula o una célula progenitora mediante técnicas de ADN o ARN recombinante tales como, por ejemplo, transformación. Generalmente, la célula comprende un gen no endógeno que causó una alteración de la cantidad del polipéptido. En una realización, un "polipéptido recombinante" es un polipéptido preparado mediante la expresión de un polinucleótido exógeno (recombinante) en una célula vegetal.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan generalmente de manera intercambiable.

El % de identidad de un polipéptido se determina mediante análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de huecos = 5 y una penalización por extensión de huecos = 0,3. La secuencia de consulta tiene al menos 150 aminoácidos de longitud y el análisis g A p alinea las dos secuencias en una región de al menos 150 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia de consulta tiene al menos 500 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 500 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia de consulta tiene al menos 750 aminoácidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 750 aminoácidos. Incluso más preferentemente, la secuencia de consulta tiene al menos 900 aminoácidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos

900 aminoácidos. Incluso más preferentemente, el análisis GAP alinea dos secuencias en toda su longitud.

Como se usa en el presente documento, un fragmento "biológicamente activo" es una parte de un polipéptido de la invención que mantiene una actividad definida del polipéptido de longitud completa tal como cuando se expresa en una planta, tal como trigo, confiere resistencia (mejorada) a la roya del tallo, preferentemente roya del tallo del trigo tal como el grupo de razas Ug99 de Puccinia graminis f. sp. tritici cuando se compara con una planta isogénica que no expresa el polipéptido. Los fragmentos biológicamente activos pueden tener cualquier tamaño siempre que mantengan la actividad definida, pero tienen preferentemente al menos 750 o al menos 900 restos de aminoácido de longitud.

Preferentemente, el fragmento biológicamente activo mantiene al menos un 10 %, al menos un 50 %, al menos un

75 % o al menos un 90 %, de la actividad de la proteína de longitud completa.

Con respecto a un polipéptido definido, se apreciará que las cifras de % de identidad superiores a las proporcionadas anteriormente incluirán realizaciones preferentes. Por tanto, cuando corresponda, en vista de las cifras de % de identidad mínimas, es preferente que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un

60 %, más preferentemente al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente menos un 75 %, más preferentemente al menos un 76 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 91 %, más preferentemente al menos un 92 %, más preferentemente al menos un 93 %, más preferentemente al menos un

94 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 96 %, más preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 98 %, más preferentemente al menos un 99 %, más preferentemente al menos un 99,1 %, más preferentemente al menos un 99,2 %, más preferentemente al menos un

99,3 %, más preferentemente al menos un 99,4 %, más preferentemente al menos un 99,5 %, más preferentemente al menos un 99,6 %, más preferentemente al menos un 99,7 %, más preferentemente al menos un 99,8 %, e incluso más preferentemente al menos un 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO nombrada relevante.

Pueden prepararse mutantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en un ácido nucleico de la presente invención, o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Tales mutantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de restos dentro de la secuencia de aminoácidos. Puede realizarse una combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar al constructo final, siempre que el producto peptídico final posea las características deseadas. Los mutantes de secuencia de aminoácidos preferentes tienen solo uno, dos, tres, cuatro o menos de 10 cambios de aminoácidos con respecto al polipéptido de tipo natural de referencia.

Los polipéptidos mutantes (alterados) pueden prepararse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, usando evolución dirigida o estrategias de diseño racional (véase a continuación). Los productos derivados de ADN mutado/alterado pueden cribarse fácilmente usando técnicas descritas en el presente documento para determinar si confieren resistencia a Puccinia graminis (por ejemplo, una raza del grupo Ug99 de Puccinia graminis f sp. tritici), tal como produciendo una planta transgénica que exprese el ADN mutado/alterado y determinando la capacidad de la planta para producir grano en presencia del patógeno.

Al diseñar mutantes de secuencia de aminoácidos, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la característica o características a modificar. Los sitios para mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, (1) sustituyéndolos primero con elecciones de aminoácidos conservativas y a continuación con selecciones más radicales dependiendo de los resultados obtenidos, (2) haciendo deleción del resto diana o (3) insertando otros restos adyacentes al sitio localizado.

Las deleciones de secuencia de aminoácidos varían generalmente de aproximadamente 1 a 15 restos, más preferentemente de aproximadamente 1 a 10 restos y generalmente de aproximadamente 1 a 5 restos contiguos.

Los mutantes de sustitución tienen al menos un resto de aminoácido en la molécula polipeptídica retirada y un resto diferente insertado en su lugar. Para mantener la actividad, los sitios de interés incluyen aquellos que no están en un sitio activo, tal como un dominio CC, BD o LRR, y aquellos que no están altamente conservados entre diferentes especies. Estos sitios, especialmente aquellos que se encuentran dentro de una secuencia de al menos otros tres sitios no conservados, pueden sustituirse generalmente de una manera relativamente conservativa o no conservativa. Algunos ejemplos de sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 con el título "sustituciones a modo de ejemplo".

T l 1. i i n m m l

En una realización preferente, un polipéptido mutante/variante tiene uno o dos o tres o cuatro cambios de aminoácidos conservativos en comparación con un polipéptido de origen natural. En la Tabla 1 se proporcionan detalles de cambios de aminoácidos conservativos. En una realización preferente, los cambios no están en uno o más de los motivos que están altamente conservados entre los diferentes polipéptidos proporcionados con la presente. Como sabrá el experto en la materia, puede predecirse razonablemente que tales cambios menores no alteran la actividad del polipéptido cuando se expresa en una célula recombinante.

En una realización, la proteína de la invención es un gen de resistencia a patógenos vegetales CC-NB-LRR que comprende dominios configurados como se muestra en la Figura 4.

La secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido de la invención puede usarse para diseñar variantes/mutantes del mismo basándose en comparaciones con polipéptidos de resistencia estrechamente relacionados que comprenden dominios NB y LRR, más preferentemente dominios CC, NB y LRR. Como apreciará el destinatario experto, es menos probable que los restos altamente conservados entre proteínas CC-NB-LRR estrechamente relacionadas puedan alterarse, especialmente con sustituciones no conservativas, y mantener la actividad que los restos menos conservados (véase anteriormente).

Dentro del alcance de la invención también se incluyen polipéptidos de la presente invención que se modifican diferencialmente durante o tras la síntesis, por ejemplo, mediante biotinación, bencilación, glicosilato, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Los polipéptidos pueden modificarse después de la traducción en una célula, por ejemplo mediante fosforilación, que puede modular su actividad. Estas modificaciones pueden servir para aumentar la estabilidad y/o bioactividad del polipéptido de la invención.

Evolución dirigida

En la evolución dirigida, se aplica mutagénesis aleatoria a una proteína y se usa un régimen de selección para seleccionar variantes que tienen las cualidades deseadas, por ejemplo, mayor actividad. A continuación se aplican más rondas de mutación y selección. Una estrategia de evolución dirigida implica tres etapas:

Diversificación: el gen que codifica la proteína de interés se muta y/o recombina aleatoriamente para crear una gran colección de variantes génicas. Pueden construirse colecciones génicas variantes mediante PCR propensa a errores (véase, por ejemplo, Leung, 1989; Cadwell y Joyce, 1992), a partir de grupos de fragmentos digeridos con DNasa l preparados a partir de moldes parentales (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b; Crameri et al., 1998; Coco et al., 2001) a partir de oligonucleótidos degenerados (Ness et al., 2002, Coco, 2002) o a partir de mezclas de ambos, o incluso a partir de moldes parentales no digeridos (Zhao et al., 1998; Eggert et al., 2005; Jézéquek et al., 2008) y normalmente se ensamblan mediante PCR. También pueden prepararse colecciones a partir de secuencias parentales recombinadas in vivo o in vitro mediante recombinación homóloga o no homóloga (Ostermeier et al., 1999; Volkov et al., 1999; Sieber et al., 2001). También pueden construirse colecciones de génicas variantes subclonando un gen de interés en un vector adecuado, transformando el vector en una cepa "mutadora" tal como roja XL-1 de E. coli (Stratagene) y propagar las bacterias transformadas durante un número de generaciones adecuado. Las colecciones de genes variantes también pueden construirse sometiendo el gen de interés a barajado de ADN (es decir, recombinación homóloga in vitro de grupos de genes mutantes seleccionados mediante fragmentación aleatoria y reensamblaje) como describe ampliamente Harayama (1998). Selección: la colección se somete a ensayo para detectar la presencia de mutantes (variantes) que poseen la propiedad deseada usando un cribado o selección. Los cribados permiten la identificación y aislamiento de mutantes de alto rendimiento manualmente, mientras que las selecciones eliminan automáticamente todos los mutantes no funcionales. Un cribado puede implicar cribado de la presencia de motivos de aminoácido conservados conocidos. Alternativamente, o además, un cribado puede implicar la expresión del polinucleótido mutado en un órgano hospedador o parte del mismo y evaluar el nivel de actividad.

Amplificación: las variantes identificadas en la selección o cribado se replican muchas veces, permitiendo a los investigadores secuenciar su ADN para comprender qué mutaciones se han producido.

Juntas, estas tres etapas se denominan "ronda" de evolución dirigida. La mayoría de los experimentos implicarán más de una ronda. En estos experimentos, los "ganadores" de la ronda anterior se diversifican en la siguiente ronda para crear una nueva colección. Al final del experimento, todas las proteínas o polinucleótidos mutantes evolucionados se caracterizan usando métodos bioquímicos.

Diseño racional

Una proteína puede diseñarse racionalmente, basándose en información conocida sobre la estructura y el plegamiento de la proteína. Esto puede lograrse mediante diseño desde cero (diseño de novo) o mediante rediseño basado en armazones nativos (véase, por ejemplo, Hellinga, 1997; y Lu y Berry, Protein Structure Design and Engineering, Handbook of Proteins 2, 1153-1157 (2007)). El diseño de proteínas implica generalmente identificar secuencias que se pliegan en una estructura determinada o diana y puede lograrse usando modelos informáticos. Los algoritmos de diseño de proteínas informáticos buscan el espacio de secuencia-conformación para secuencias que tengan baja energía cuando se pliegan con respecto al la estructura diana. Algunos algoritmos de diseño de proteínas informáticos usan modelos de energía proteica para evaluar cómo afectarían las mutaciones a la estructura y función de una proteína. Estas funciones de energía incluyen generalmente una combinación de mecánica molecular, estadística (es decir, basada en conocimiento) y otros términos empíricos. El software disponible adecuado incluye IPRO (Interative Protein Redesign and Optimization), EGAD (un algoritmo genético para diseño de proteínas), diseño Rosetta, Sharpen y Abalone.

Polinucleótidos y genes

La presente invención se refiere a diversos polinucleótidos. Como se usa en el presente documento, un "polinucleótido" o "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" significa un polímero de nucleótidos, que puede ser ADN o ARN o una combinación de los mismos, e incluye ADN genómico, ARNm, ARNc y ADNc. Los polinucleótidos menos preferentes incluyen ARNt, ARNsi, ARNsh y ARNhp. Puede ser ADN o ARN de origen celular, genómico o sintético, por ejemplo elaborado en un sintetizador automático, y puede combinarse con carbohidratos, lípidos, proteínas u otros materiales, marcado con grupos fluorescentes u otros, o unirse a un soporte sólido para realizar una actividad particular definida en el presente documento, o comprender uno o más nucleótidos modificados no se encontrados en la naturaleza, bien conocidos por los expertos en la materia. El polímero puede ser monocatenario, esencialmente bicatenario o parcialmente bicatenario. Emparejamiento de bases, como se usa en el presente documento, se refiere emparejamiento de bases estándar entre nucleótidos, incluyendo los pares de bases G:U. "Complementario" significa que dos polinucleótidos son capaces de emparejarse (hibridarse) a lo largo de parte de sus longitudes, o a lo largo de uno o ambos. Un "polinucleótido hibridado" significa que el polinucleótido está realmente emparejado con su complemento. El término "polinucleótido" se usa indistintamente en el presente documento con el término "ácido nucleico". Los polinucleótidos de la invención preferentes codifican un polipéptido de la invención.

Por "polinucleótido aislado" se hace referencia a un polinucleótido que generalmente se ha separado de las secuencias polinucleotídicas con las que está asociado o unido en su estado nativo, si el polinucleótido se encuentra en la naturaleza. Preferentemente, el polinucleótido aislado está al menos un 90 % exento de otros componentes con los que está asociado naturalmente, si se encuentra en la naturaleza. Preferentemente el polinucleótido no es de origen natural, por ejemplo, uniendo covalentemente dos secuencias polinucleotídicas más cortas de modo no he encontrado en la naturaleza (polinucleótido quimérico).

La presente invención implica modificación de la actividad génica y la construcción y uso de genes quiméricos. Como se usa en el presente documento, el término "gen" incluye cualquier secuencia de desoxirribonucleótidos que incluya una región codificante de proteína o que se transcriba en una célula pero que no se traduce, así como regiones reguladoras y no codificantes asociadas. Tales regiones asociadas se ubican generalmente adyacentes a la región codificante o la región transcrita en ambos extremos 5' y 3' a una distancia de aproximadamente 2 kb en cada lado. En este sentido, el gen puede incluir señales de control tales como promotores, potenciadores, señales de terminación y/o poliadenilación que están asociadas naturalmente con un gen dado, o señales de control heterólogas, en cuyo caso el gen se denomina "gen quimérico". Las secuencias que están ubicadas en 5' de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias que están ubicadas en 3' o hacia abajo de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias en 3' no traducidas. El término "gen" incluye tanto ADNc como formas genómicas de un gen.

Un "gen Sr33" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que es homóloga al gen Sr33 aislado (SEQ ID NO: 5) o ADNc de Sr33 (SEQ ID NO: 3) descrito en el presente documento. Como se describe en el presente documento, algunos alelos y variantes de la familia de genes Sr33 codifican una proteína que confiere resistencia a la roya del tallo (por ejemplo, causada por el grupo Ug99 de razas de Puccinia graminis f. sp. tritici), los genes Sr33 incluyen los alelos de origen natural o variantes existentes en cereales tales como trigo. Las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos mostrada en el presente documento como SEQ ID NO: 3 (ADNc) o SEQ ID NO: 5 (secuencia genómica), que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, son ejemplos de un gen Sr33 que confiere resistencia a la roya del tallo.

Una forma genómica o clon de un gen que contiene la región transcrita puede interrumpirse con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o "secuencias intermedias", que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a los "exones" del gen. Un "intrón", como se usa en el presente documento, es un segmento de un gen que se transcribe como parte de un transcrito de ARN primario pero que no está presente en la molécula de ARNm maduro. Los intrones se retiran o "empalman" del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones están ausentes en el ARN mensajero (ARNm). Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. "Exones", como se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de ADN correspondientes a las secuencias de ARN que están presentes en el ARNm maduro o la molécula de ARN madura en casos donde la molécula de ARN no se traduce. Un ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia u orden de aminoácidos en un polipéptido emergente. El término "gen" incluye una molécula de fusión o sintética que codifica la totalidad o parte de las proteínas de la invención descritas en el presente documento y una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las anteriores. Puede introducirse un gen en un vector apropiado para mantenimiento extracromosómico en una célula o, preferentemente, para integración en el genoma del hospedador.

Como se usa en el presente documento, un "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que comprende secuencias unidas covalentemente que no se encuentran unidas en la naturaleza. Generalmente, un gen quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o codificantes de proteínas que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por tanto, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. El término "endógeno" se usa en el presente documento para referirse a una sustancia que normalmente está presente o producida en una planta no modificada en la misma etapa de desarrollo que la planta en investigación. Un "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Como se usa en el presente documento, "molécula de ácido nucleico recombinante", "polinucleótido recombinante" o variaciones de los mismos se refieren a una molécula de ácido nucleico que se ha construido o modificado mediante tecnología de ADN recombinante. Las expresiones "polinucleótido extraño" o "polinucleótido exógeno" o "polinucleótido heterólogo" y similares se refieren a cualquier ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula mediante manipulaciones experimentales.

Los genes extraños o exógenos pueden ser genes que se insertan en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva ubicación dentro del hospedador nativo o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. La expresión "modificado genéticamente" incluye introducción de genes en células mediante transformación o transducción, mutación de genes en células y alteración o modulación de la regulación de un gen en una célula u organismos a los que se han realizado estos actos o su progenie.

Además, el término "exógeno" en el contexto de un polinucleótido (ácido nucleico) se refiere al polinucleótido cuando está presente en una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido. La célula puede ser una célula que comprende un polinucleótido no endógeno que da como resultado una cantidad alterada de producción del polipéptido codificado, por ejemplo un polinucleótido exógeno que aumenta la expresión de un polipéptido endógeno, o una célula que en su estado nativo no produce el polipéptido. En el presente documento el aumento de la producción de un polipéptido de la invención también se denomina "sobreexpresión". Un polinucleótido exógeno de la invención incluye polinucleótidos que no se han separado de otros componentes de la célula transgénica (recombinante), o sistema de expresión exento de células, en el que está presente, y polinucleótidos producidos en tales células o sistemas exentos de células que posteriormente se purifican a partir de al menos algunos otros componentes. El polinucleótido exógeno (ácido nucleico) puede ser un tramo contiguo de nucleótidos existentes en la naturaleza, o puede comprender dos o más tramos contiguos de nucleótidos de diferentes fuentes (naturales y/o sintéticas) unidos para formar un único polinucleótido. Generalmente tales polinucleótidos quiméricos comprenden al menos un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la invención unido operativamente a un promotor adecuado para conducir la transcripción del marco de lectura abierto en una célula de interés.

En una realización, si está presente en una planta de trigo, o parte (tal como un grano de trigo) o célula de la misma, el polinucleótido no está presente en el cromosoma 1D y/o cromosoma 7D del genoma.

El % de identidad de un polinucleótido se determina mediante análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de huecos = 5 y una penalización por extensión de huecos = 0,3. La secuencia de consulta tiene al menos 450 nucleótidos de longitud, y el análisis g Ap alinea las dos secuencias en una región de al menos 450 nucleótidos. Preferentemente, la secuencia de consulta tiene al menos 1.500 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 1.500 nucleótidos. Incluso más preferentemente, la secuencia de consulta tiene al menos 2.700 nucleótidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 2.700 nucleótidos. Incluso más preferentemente, el análisis GAP alinea dos secuencias en toda su longitud.

Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que las cifras de % de identidad superiores a las proporcionadas anteriormente incluirán realizaciones preferentes. Por tanto, cuando corresponda, en vista de las cifras de % de identidad mínimas, es preferente que el polipéptido comprenda una secuencia de polinucleótidos Que sea al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 91 %, más preferentemente al menos un 92 %, más preferentemente al menos un 93 %, más preferentemente al menos un 94 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 96 %, más preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 98 %, más preferentemente al menos un 99 %, más preferentemente al menos un 99,1 %, más preferentemente al menos un 99,2 %, más preferentemente al menos un 99,3 %, más preferentemente al menos un 99,4 %, más preferentemente al menos un 99,5 %, más preferentemente al menos un 99,6 %, más preferentemente al menos un 99,7 %, más preferentemente al menos un 99,8 %, e incluso más preferentemente al menos un 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO nombrada relevante.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a polinucleótidos que son básicamente idénticos a los descritos específicamente en el presente documento. Como se usa en el presente documento, con referencia a un polinucleótido, la expresión "básicamente idéntico" significa la sustitución de uno o algunos (por ejemplo, 2, 3 o 4) nucleótidos mientras se mantiene al menos una actividad de la proteína nativa codificada por el polinucleótido. Además, esta expresión incluye la adición o deleción de nucleótidos que da como resultado el aumento o disminución del tamaño de la proteína nativa codificada en uno o unos pocos (por ejemplo, 2, 3 o 4) aminoácidos mientras se mantiene al menos una actividad de la proteína nativa codificada por el polinucleótido.

La presente invención también se refiere al uso de oligonucleótidos, por ejemplo, en métodos de cribado de un polinucleótido de, o que codifica un polipéptido de, la invención. Como se usa en el presente documento, "oligonucleótidos" son polinucleótidos de hasta 50 nucleótidos de longitud. El tamaño mínimo de tales oligonucleótidos es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre un oligonucleótido y una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Pueden ser ARN, ADN o combinaciones o derivados de cualquiera de ellos. Los oligonucleótidos son generalmente moléculas monocatenarias relativamente cortas de 10 a 30 nucleótidos, comúnmente 15-25 nucleótidos de longitud. Cuando se usa como sonda o como cebador en una reacción de amplificación, el tamaño mínimo de tal oligonucleótido es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre el oligonucleótido y una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico diana. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen al menos 15 nucleótidos, más preferentemente al menos 18 nucleótidos, más preferentemente al menos 19 nucleótidos, más preferentemente al menos 20 nucleótidos, incluso más preferentemente al menos 25 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos de la presente invención usados como sonda se conjugan generalmente con una etiqueta tal como un radioisótopo, una enzima, biotina, una molécula fluorescente o una molécula quimioluminiscente.

La presente invención incluye oligonucleótidos que pueden usarse como, por ejemplo, sondas para identificar moléculas de ácido nucleico, o cebadores para producir moléculas de ácido nucleico. Pueden usarse sondas y/o cebadores para clonar homólogos de los polinucleótidos de la invención de otras especies. Además, también pueden usarse técnicas de hibridación conocidas en la técnica para seleccionar colecciones genómicas o de ADNc para tales homólogos.

Los polinucleótidos y oligonucleótidos de la presente invención incluyen aquellos que se hibridan en condiciones rigurosas con una o más de las secuencias proporcionadas como SEQ ID NOs: 3 a 5 o 12. Como se usa en el presente documento, las condiciones rigurosas son aquellas que (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo, NaCI 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/NaDodSO4 al 0,1 % a 50 °C; (2) durante la hibridación emplean un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0,1 %, Ficoll al 0,1 %, polivinilpirrolidona al 0,1 %, tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCI 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1 %, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos (50 g/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C en 0,2 x SSC y SDS al 0,1 %.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con moléculas de origen natural, una o más mutaciones que son deleciones, inserciones o sustituciones de restos de nucleótido. Los mutantes pueden ser de origen natural (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, realizando mutagénesis dirigida al sitio en el ácido nucleico). Una variante de un polinucleótido o un oligonucleótido de la invención incluye moléculas de diferentes tamaños y/o que pueden hibridarse con el genoma del trigo cercano al del polinucleótido de referencia u oligonucleótido definido en el presente documento. Por ejemplo, algunas variantes pueden comprender nucleótidos adicionales (tales como 1, 2, 3, 4 o más) o menos nucleótidos siempre y cuando se hibriden con la región diana. Además, algunos nucleótidos pueden sustituirse sin influir en la capacidad del oligonucleótido para hibridarse con la región diana. Además, pueden diseñarse fácilmente variantes que se hibridan cerca, por ejemplo, dentro de 50 nucleótidos, de la región del genoma de la planta donde se hibridan los oligonucleótidos específicos definidos en el presente documento. En particular, esto incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido o secuencia de aminoácidos pero que varían en la secuencia de nucleótidos por redundancia del código genético. Las expresiones "variante polinucleotídica" y "variante" también incluyen variantes alélicas de origen natural.

Constructos de ácido nucleico

La presente divulgación incluye constructos de ácido nucleico que comprenden los polinucleótidos de la invención, y vectores y células hospedadoras que los contienen, métodos de su producción y uso, y usos de los mismos. La presente invención se refiere a elementos que están conectados o unidos operativamente. "Conectado operativamente" o "unido operativamente" y similares se refieren a una unión de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Generalmente, las secuencias de ácidos nucleicos conectadas operativamente están unidas contiguamente y, cuando sea necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y en marco de lectura. Una secuencia codificante está "conectada operativamente a" otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcriba las dos secuencias codificantes en un solo ARN, que, si se traduce, a continuación se traduce en un solo polipéptido que tiene aminoácidos derivados de ambas secuencias codificantes. No es necesario que las secuencias codificantes sean contiguas entre sí siempre que las secuencias expresadas se procesen finalmente para producir la proteína deseada.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia que actúa en cis", "elemento que actúa en cis" o "región reguladora en cis" o "región reguladora" o término similar se tomará para significar cualquier secuencia de nucleótidos, que cuando se coloca de manera apropiada y se conecta con respecto a una secuencia genética expresable, puede regular, al menos en parte, la expresión de la secuencia genética. Los expertos en la materia sabrán que una región reguladora en cis puede activar, silenciar, potenciar, reprimir o alterar de otro modo el nivel de expresión y/o especificidad del tipo celular y/o especificidad del desarrollo de una secuencia génica al nivel transcripcional o postranscripcional. En realizaciones preferentes de la presente invención, la secuencia que actúa en cis es una secuencia activadora que potencia o estimula la expresión de una secuencia genética expresable.

"Conectar operativamente" un promotor o elemento potenciador a un polinucleótido transcribible significa colocar el polinucleótido transcribible (por ejemplo, polinucleótido que codifica proteínas u otro transcrito) bajo el control regulador de un promotor, que a continuación controla la transcripción de ese polinucleótido. En la construcción de combinaciones de promotor/gen estructural heterólogo, generalmente se prefiere situar un promotor o una variante del mismo a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del polinucleótido transcribible que sea aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y la región codificante de proteína que controla en su entorno natural; es decir, el gen del que se deriva el promotor. Como se conoce en la técnica, puede adaptarse alguna variación en esta distancia sin pérdida de función. Igualmente, el posicionamiento preferente de un elemento de secuencia reguladora (por ejemplo, un operador, potenciador, etc.) con respecto a un polinucleótido transcribible que se colocará bajo su control se define por el posicionamiento del elemento en su entorno natural; es decir, los genes de los que se deriva.

"Promotor" o "secuencia promotora", como se usa en del presente documento, se refiere a una región de un gen, generalmente corriente arriba (5') de la región que codifica el ARN, que controla el inicio y el nivel de transcripción en la célula de interés. Un "promotor" incluye las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen genómico clásico, tales como las secuencias de una caja TATA y una caja CCAAT, así como elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica como respuesta al desarrollo y/o estímulos ambientales, o de una manera específica del tejido o específica del tipo celular. Un promotor está normalmente, pero no necesariamente (por ejemplo, algunos promotores Pollll), situado corriente arriba de un gen estructural, cuya expresión regula. Además, los elementos reguladores que comprenden un promotor se sitúan habitualmente a 2 kb del sitio de inicio de la transcripción del gen. Los promotores pueden contener elementos reguladores específicos adicionales, ubicados más distales al sitio de inicio para mejorar aún más la expresión en una célula y/o para alterar el tiempo o la inducibilidad de expresión de un gen estructural al que está conectado operativamente.

"Promotor constitutivo" se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia transcrita unida operativamente en muchos o todos los tejidos de un organismo tal como una planta. El término constitutivo, como se usa en el presente documento, no indica necesariamente que un gen se exprese al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en una amplia gama de tipos celulares, aunque a menudo se detecta alguna variación en el nivel. "Expresión selectiva", como se usa en el presente documento, se refiere a expresión casi exclusivamente en órganos específicos de, por ejemplo, la planta, tales como, por ejemplo, endospermo, embrión, hojas, frutos, tubérculos o raíz. En una realización preferente, un promotor se expresa selectivamente o preferentemente en hojas y/o tallos de una planta, preferentemente una planta de cereal. Por tanto, la expresión selectiva puede contrastarse con la expresión constitutiva, que se refiere a la expresión en muchos o todos los tejidos de una planta en la mayoría o en todas las condiciones experimentadas por la planta.

La expresión selectiva también puede dar como resultado la compartimentación de los productos de expresión génica en tejidos, órganos o etapas de desarrollo específicos de plantas. La compartimentación en ubicaciones subcelulares específicas tales como el plástido, citosol, vacuola o espacio apoplásico puede lograrse mediante la inclusión en la estructura del producto génico de señales apropiadas, por ejemplo, un péptido señal, para transporte al compartimento celular requerido, o en el caso de los orgánulos semiautónomos (plástidos y mitocondrias) mediante la integración del transgén con secuencias reguladoras apropiadas directamente en el genoma del orgánulo.

Un "promotor específico de tejido" o "promotor específico de órgano" es un promotor que se expresa preferentemente en un tejido u órgano con respecto a otros muchos tejidos u órganos, preferentemente la mayoría, si no todos los demás tejidos u órganos en, por ejemplo, una planta. Generalmente, el promotor se expresa a un nivel 10 veces mayor en el tejido u órgano específico que en otros tejidos u órganos.

En una realización, el promotor es un promotor específico de tallo o un promotor que dirige la expresión génica en una parte aérea de la planta (promotor específico de tejido verde) tal como un promotor de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RUBISCO).

Algunos ejemplos de promotores específicos de tallo incluyen, pero no se limitan a, los descritos en el documento de patente US 5.625.136 y Bam et al. (2008).

Los promotores contemplados por la presente invención pueden ser nativos para la planta hospedadora a transformar o pueden derivarse de una fuente alternativa, donde la región es funcional en la planta hospedadora. Otras fuentes incluyen los genes ADN-T de Agrobacterium, tales como los promotores de genes para la biosíntesis de nopalina, octapina, manopina u otros promotores de opina, promotores específicos de tejido (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.459.252 y WO 91/13992); promotores de virus (incluyendo virus específicos de hospedador) o promotores parcial o totalmente sintéticos. En la técnica se conocen bien numerosos promotores que son funcionales en plantas mono y dicotiledóneas (véase, por ejemplo, Greve, 1983; Salomon et al., 1984; Garfinkel et al., 1983; Barker et al., 1983); incluyendo diversos promotores aislados de plantas y virus tales como el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S, 19S). En Medberry et al. (1992, 1993), Sambrook et al. (1989, mencionado anteriormente) y documento de patente US 5.164.316 se desvelan métodos no limitantes para evaluar la actividad promotora.

Alternativa o adicionalmente, el promotor puede ser un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo que sea capaz de dirigir la expresión del polinucleótido introducido en una etapa de desarrollo apropiada de la planta, por ejemplo. Otras secuencias que actúan en cis que pueden emplearse incluyen potenciadores transcripcionales y/o traduccionales. Los expertos en la materia conocen bien regiones potenciadoras y pueden incluir un codón de inicio de la traducción ATG y secuencias adyacentes. Cuando se incluye, el codón de inicio debería estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante relacionada con el polinucleótido extraño o exógeno para asegurar la traducción de la secuencia completa si se va a traducir. Las regiones de inicio de la traducción pueden proporcionarse a partir de la fuente de la región de inicio de la transcripción, o de un polinucleótido extraño o exógeno. La secuencia también puede derivarse de la fuente del promotor seleccionado para impulsar la transcripción, y puede modificarse específicamente para aumentar la traducción del ARNm.

El constructo de ácido nucleico de la presente invención puede comprender una secuencia en 3' no traducida de aproximadamente 50 a 1000 pares de bases nucleotídicas que pueden incluir una secuencia de terminación de la transcripción. Una secuencia en 3' no traducida puede contener una señal de terminación de la transcripción que puede incluir o no una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARNm. Una señal de poliadenilación funciona para adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' de un precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología con la forma canónica 5' AATAAA-3' aunque algunas variaciones no son infrecuentes. Algunas secuencias de terminación de la transcripción que no incluyen una señal de poliadenilación incluyen terminadores para Poll o Pollll ARN polimerasa que comprenden una serie de cuatro o más timidinas. Algunos ejemplos de secuencias en 3' no traducidas adecuadas son las regiones en 3' transcritas no traducidas que contienen una señal de poliadenilación de un gen de octopina sintasa (ocs) o gen de nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983). Las secuencias en 3' no traducidas adecuadas también pueden derivarse de genes vegetales tales como el gen de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO), aunque también pueden emplearse otros elementos en 3' conocidos por los expertos en la materia.

Como la secuencia de ADN insertada entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia líder en 5' no traducida (5'UTR), puede influir en la expresión génica tanto si se traduce como si se transcribe, también puede emplearse una secuencia líder particular. Algunas secuencias líder adecuadas incluyen aquellas que comprenden secuencias seleccionadas para dirigir la expresión óptima de la secuencia de ADN endógena o extraña. Por ejemplo, tales secuencias líder incluyen una secuencia consenso preferente que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm y prevenir el inicio inadecuado de la traducción como se describe, por ejemplo, en Joshi (1987).

Vectores

La presente divulgación incluye el uso de vectores para manipulación o transferencia de constructos genéticos. Por "vector quimérico" se entiende una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago o virus vegetal, en el que puede insertarse o clonarse una secuencia de ácidos nucleicos. Un vector es preferentemente ADN bicatenario y contiene uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en una célula hospedadora definida que incluye una célula o tejido diana o una célula progenitora o tejido del mismo, o capaz de integrarse en el genoma del hospedador definido de modo que la secuencia clonada sea reproducible. Por tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido lineal o circular cerrado, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula, se integra en el genoma de la célula receptora y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. Un sistema de vector puede comprender un solo vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón. La elección del vector dependerá generalmente de la compatibilidad del vector con la celda en la que va a introducirse el vector. El vector también puede incluir un marcador de selección tal como un gen de resistencia a antibióticos, un gen de resistencia a herbicidas u otro gen que pueda usarse para selección de transformantes adecuados. Los expertos en la materia conocen ejemplos de tales genes.

El constructo de ácido nucleico de la divulgación puede introducirse en un vector, tal como un plásmido. Los vectores plasmídicos incluyen generalmente secuencias de ácidos nucleicos adicionales que facilitan la selección, amplificación y transformación del casete de expresión en células procariotas y eucariotas, por ejemplo, vectores derivados de pUC, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados de pSP, vectores derivados de pBS o vectores binarios que contienen una o más regiones de ADN-T. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales incluyen orígenes de replicación para proporcionar replicación autónoma del vector, genes marcadores seleccionables, preferentemente que codifiquen resistencia a antibióticos o herbicidas, sitios de clonación múltiples únicos que proporcionan sitios múltiples para insertar secuencias de ácidos nucleicos o genes codificados en el constructo de ácido nucleico, y secuencias que potencian la transformación de células procariotas y eucariotas (especialmente vegetales).

Por "gen marcador" se entiende un gen que imparte un fenotipo distinto a células que expresan el gen marcador y, por tanto, permite que dichas células transformadas se distingan de las células que no tienen el marcador. Un gen marcador seleccionable confiere un rasgo mediante el que puede "seleccionarse" basándose en la resistencia a un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, radiación, calor u otro tratamiento que dañe las células no transformadas). Un gen marcador detectable (o gen indicador) confiere un rasgo que puede identificarse mediante observación o ensayo, es decir, mediante "cribado" (por ejemplo, p-glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática no presente en células no transformadas). El gen marcador y la secuencia de nucleótidos de interés no tienen que estar unidos.

Para facilitar la identificación de transformantes, el constructo de ácido nucleico comprende deseablemente un gen marcador seleccionable o cribable tal como, o además de, el polinucleótido extraño o exógeno. La elección real de un marcador no es crucial siempre que sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células vegetales de elección. El gen marcador y el polinucleótido extraño o exógeno de interés no tienen que estar unidos, ya que la cotransformación de genes no unidos como, por ejemplo, se describe en el documento US 4.399.216 también es un proceso eficaz en la transformación de plantas.

Algunos ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son marcadores que confieren resistencia a antibióticos tal como resistencia a ampicilina, eritromicina, cloranfenicol o tetraciclina, preferentemente resistencia a kanamicina. Algunos marcadores seleccionables a modo de ejemplo para selección de transformantes de plantas incluyen, pero no se limitan a, un gen hyg que codifica resistencia a higromicina B; un gen de neomicina fosfotransferasa (nptll) que confiere resistencia a kanamicina, paromomicina, G418; un gen de glutatión-S-transferasa de hígado de rata que confiere resistencia a herbicidas derivados de glutatión como, por ejemplo, se describe en el documento EP 256223; un gen de glutamina sintetasa que confiere, tras sobreexpresión, resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa tales como fosfinotricina como, por ejemplo, se describe en el documento WO 87/05327, un gen de acetiltransferasa de Streptomyces viridochromogenes que confiere resistencia al agente selectivo fosfinotricina como, por ejemplo, se describe en el documento EP 275957, un gen que codifica una 5-enolshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia a N-fosfonometilglicina como, por ejemplo, se describe en Hinchee et al. (1988), un gen bar que confiere resistencia frente a bialafós como, por ejemplo, se describe en el documento WO91/02071; un gen de nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker et al., 1988); un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) que confiere resistencia a metotrexato (Thillet et al., 1988); un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS), que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otras sustancias químicas inhibidoras de ALS (EP 154.204); un gen de antranilato sintasa mutado que confiere resistencia a 5-metiltriptófano; o un gen de dalapón deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida.

Algunos marcadores de cribado referentes incluyen, pero no se limitan a, un gen uidA que codifica una enzima pglucuronidasa (GUS) para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos, un gen de p-galactosidasa que codifica una enzima para la que se conocen sustratos cromogénicos, un gen de aequorina (Prasher et al., 1985), que puede emplearse en la detección de bioluminiscencia sensible al calcio; un gen de proteína fluorescente verde (Niedz et al., 1995) o derivados del mismo; un gen de luciferasa (luc) (Ow et al., 1986), que permite la detección de bioluminiscencia, y otros conocidos en la técnica. Por "molécula indicadora", como se usa en la presente memoria descriptiva, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable analíticamente que facilita la determinación de la actividad promotora en referencia a producto proteico.

Preferentemente, el constructo de ácido nucleico se incorpora de forma establemente al genoma de, por ejemplo, la planta. Por tanto, el ácido nucleico comprende elementos apropiados que permiten que la molécula se incorpore al genoma, o el constructo se coloca en un vector apropiado que puede incorporarse en un cromosoma de una célula vegetal.

Una realización de la presente divulgación incluye un vector recombinante, que incluye al menos una molécula polinucleotídica de la presente divulgación, insertada en cualquier vector capaz de administrar la molécula de ácido nucleico a una célula hospedadora. Tal vector contiene secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran de forma natural adyacentes a las moléculas de ácidos nucleicos de la presente divulgación y que preferentemente se derivan de una especie distinta de la especie de la cual se derivan la molécula o moléculas de ácido nucleico. El vector puede ser ARN o ADN, procariota o eucariota, y generalmente es un virus o un plásmido.

Una serie de vectores adecuados para transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas se han descrito en, por ejemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Generalmente, los vectores de expresión de plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes de plantas clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras en 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión de plantas también pueden contener una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada por el entorno o el desarrollo, o específica de tejido o célula), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

El nivel de una proteína de la divulgación puede modularse aumentando el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína en una célula vegetal, o disminuyendo el nivel de expresión de un gen que codifica la proteína en la planta, conduciendo a resistencia a patógenos. El nivel de expresión de un gen puede modularse alterando el número de copias por célula, por ejemplo introduciendo un constructo genético sintético que comprende la secuencia codificante y un elemento de control transcripcional que está unido operativamente a la misma y que es funcional en la célula. Una pluralidad de transformantes pueden seleccionarse y cribarse para aquellos con un nivel y/o especificidad de expresión transgénica favorables que surja de influencias de secuencias endógenas en las proximidades del sitio de integración transgénica. Un nivel y patrón favorables de expresión transgénica es uno que da como resultado una modificación sustancial de la resistencia a patógenos u otro fenotipo. Alternativamente, puede cribarse una población de semillas mutagenizadas o una población de plantas de un programa de reproducción buscando líneas individuales con resistencia a patógenos alterada u otro fenotipo asociado con resistencia a patógenos.

Células recombinantes

Otra realización de la presente invención incluye una célula recombinante que comprende una célula hospedadora transformada con una o más moléculas recombinantes de la presente invención, o células progenitoras de la misma. La transformación de una molécula de ácido nucleico en una célula puede realizarse mediante cualquier método mediante el cual una molécula de ácido nucleico pueda insertarse en la célula. Las técnicas de transformación incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción y fusión de protoplastos. Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede convertirse en un tejido, órgano u organismo multicelular. Las moléculas de ácido nucleico transformadas de la presente invención pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante) de modo que se retenga su capacidad para expresarse. Las células hospedadoras son células vegetales, más preferentemente células de una planta de cereal, más preferentemente células de cebada o trigo, e incluso más preferentemente una célula de trigo.

Plantas transgénicas

El término "planta" como se usa en el presente documento como sustantivo se refiere a plantas enteras y se refiere a cualquier miembro del Reino Plantae, pero como se usa como adjetivo se refiere a cualquier sustancia que está presente, obtenida de, derivada de, o relacionada con una planta, tal como por ejemplo órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores), células individuales (por ejemplo, polen), semillas, células vegetales y similares. Plántulas y semillas germinadas de las que han surgido raíces y brotes también están incluidas dentro del significado de "planta". La expresión "partes de planta", como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más tejidos u órganos vegetales que se obtienen de una planta y que comprende el ADN genómico de la planta. Partes de planta incluyen estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos), raíces, órganos/estructuras florales, semillas (incluyendo embriones, cotiledones y cubierta de semillas), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido primario y similares), células y progenie de las mismas. La expresión "célula vegetal", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula obtenida de una planta o en una planta e incluye protoplastos u otras células derivadas de plantas, células productoras de gametos y células que se regeneran en plantas completas. Las células vegetales pueden ser células en cultivo. Por "tejido vegetal" se entiende tejido diferenciado en una planta u obtenido de una planta ("explante") o tejido indiferenciado derivado de embriones inmaduros o maduros, semillas, raíces, brotes, frutos, tubérculos, polen, tejido tumoral, tales como agallas de corona, y diversas formas de agregaciones de células vegetales en cultivo, tales como callos. Algunos tejidos vegetales a modo de ejemplo en o a partir de semillas son cotiledón, embrión y eje embrionario. Por tanto, la invención incluye plantas y partes de plantas y productos que las comprenden.

Como se usa en el presente documento, el término "semilla" se refiere a "semilla madura" de una planta, que está lista para recolección o se ha recolectado de la planta, tal como generalmente se recolecta comercialmente en el campo, o como "semilla en desarrollo" que ocurre en una planta después de la fertilización y antes de que se establezca la latencia de la semilla y antes de la recolección.

Una "planta transgénica" como se usa en el presente documento se refiere a una planta que contiene un constructo de ácido nucleico que no se encuentra en una planta de tipo natural de la misma especie, variedad o variedad cultivada. Es decir, las plantas transgénicas (plantas transformadas) contienen material genético (un transgén) que no contenía antes de la transformación. El transgén puede incluir secuencias genéticas obtenidas o derivadas de una célula vegetal, u otra célula vegetal, o una fuente no vegetal, o una secuencia sintética. Generalmente, el transgén se ha introducido en la planta mediante manipulación humana tal como, por ejemplo, mediante transformación, pero puede usarse cualquier método como reconoce un experto en la materia. El material genético preferentemente se integra establemente en el genoma de la planta. El material genético introducido puede comprender secuencias que ocurren naturalmente en la misma especie pero en un orden reordenado o en una disposición diferente de elementos, por ejemplo una secuencia antisentido. En el presente documento las plantas que contienen tales secuencias están incluidas en "plantas transgénicas".

Una "planta no transgénica" es aquella que no se ha modificado genéticamente mediante la introducción de material genético mediante técnicas de ADN recombinante. En una realización preferente, las plantas transgénicas son homocigóticas para todos y cada uno de los genes que se han introducido (transgén) para que su progenie no se segregue para el fenotipo deseado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "en comparación con una planta isogénica", o expresiones similares, se refiere a una planta que es isogénica con respecto a la planta transgénica pero sin el transgén de interés. Preferentemente, la planta no transgénica correspondiente es de la misma variedad cultivada o variedad que el progenitor de la planta transgénica de interés, o una línea de plantas hermanas que carece del constructo, a menudo denominada "segregante", o una planta de la misma variedad cultivada o variedad transformada con un "constructo de vector vacío, y puede ser una planta no transgénica. "Tipo natural", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula, tejido o planta que no se ha modificado de acuerdo con la invención. Células de tipo natural, tejidos o plantas pueden usarse como controles para comparar los niveles de expresión de un ácido nucleico exógeno o el alcance y naturaleza de la modificación del rasgo con células, tejidos o plantas modificados como se describe en el presente documento.

Las plantas transgénicas, como se definen en el contexto de la presente invención, incluyen progenie de las plantas que se han modificado genéticamente usando técnicas recombinantes, en donde la progenie comprende el transgén de interés. Tal progenie puede obtenerse mediante autofertilización de la planta transgénica primaria o cruzando tales plantas con otra planta de la misma especie. Generalmente, esto sería para modular la producción de al menos una proteína definida en el presente documento en la planta u órgano vegetal deseados. Las partes de plantas transgénicas incluyen todas las partes y células de dichas plantas que comprenden el transgén tales como, por ejemplo, tejidos cultivados, callos y protoplastos.

Las plantas contempladas para uso en la práctica de la presente invención incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las plantas objetivo incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: cereales (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, maíz, sorgo y cultivos relacionados); remolacha (remolacha azucarera y remolacha forrajera); pomos, frutas de hueso y frutas blandas (manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas y moras); plantas leguminosas (judías, lentejas, guisantes, soja); plantas oleaginosas (colza u otras Brassicas, mostaza, amapola, aceitunas, girasoles, cártamo, lino, coco, plantas de ricino, cacao en grano, cacahuetes); plantas de pepino (calabacines, pepinos, melones); plantas de fibra (algodón, lino, cáñamo, yute); cítricos (naranjas, limones, pomelos, mandarinas); verduras (espinaca, lechuga, espárrago, coles, zanahorias, cebollas, tomates, patatas, pimentón); lauráceas (aguacates, canela, alcanfor); o plantas tales como maíz, tabaco, nueces, café, caña de azúcar, té, vides, lúpulos, césped, plátanos y plantas de caucho natural, así como ornamentales (flores, arbustos, árboles frondosos y perennes, tales como coníferas). Preferentemente, la planta es una planta de cereal, más preferentemente trigo, arroz, maíz, triticale, avena o cebada, incluso más preferentemente trigo.

Como se usa en el presente documento, el término "trigo" se refiere a cualquier especie del género Triticum, incluyendo progenitores del mismo, así como progenie del mismo producida mediante cruces con otras especies. Trigo incluye "trigo hexaploide" que tiene organización genómica AABBDD, comprendido por 42 cromosomas, y "trigo tetraploide" que tiene organización genómica AABB, comprendido por 28 cromosomas. El trigo hexaploide incluye T. aestivum, T. spelta, T. macha, T. compactum, T. sphaerococcum, T. vavilovii, y cruces de interespecies del mismo. Una especie preferente de trigo hexaploide es T. aestivum ssp aestivum (también denominado "trigo panificable"). El trigo tetraploide incluye T. durum (también denominado en el presente documento trigo túrgido o Triticum turgidum ssp. durum), T. dicoccoides, T. dicoccum, T. polonicum, y cruces de interespecies del mismo. Además, el término "trigo" incluye progenitores potenciales de Triticum sp. hexaploide o tetraploide tal como T. uartu, T. monococcum o T. boeoticum para el genoma A, Aegilops speltoides para el genoma B, y T. tauschii (también conocido como Aegilops squarrosa o Aegilops tauschii) para el genoma D. Los progenitores particularmente preferentes son los del genoma A, incluso más preferentemente el progenitor del genoma A es T. monococcum. Una variedad cultivada para uso en la presente invención puede pertenecer a, pero no se limita a, cualquiera de las especies enumeradas anteriormente. También se incluyen plantas que se produce mediante técnicas convencionales usando Triticum sp. como un precursor en un cruce sexual con una especie que no es Triticum (tal como centeno [Secale cereale]), incluyendo, pero sin limitarse a, Triticale.

Como se usa en el presente documento, el término "cebada" se refiere a cualquier especie del género Hordeum, incluyendo sus progenitores, así como progenie de la misma producida mediante cruces con otras especies. Es preferente que la planta sea de una especie de Hordeum que se cultive comercialmente tal como, por ejemplo, una cepa o variedad cultivada o variedad de Hordeum vulgare o adecuada para producción comercial de grano.

Las plantas transgénicas, como se definen en el contexto de la presente invención, incluyen plantas (así como partes y células de dichas plantas) y su progenie que se han modificado genéticamente usando técnicas recombinantes para causar la producción de al menos un polipéptido de la presente invención en la planta u órgano de planta deseados. Algunas plantas transgénicas pueden producirse usando técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas generalmente en A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), y P. Christou y H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

En una realización preferente, las plantas transgénicas son homocigóticas para todos y cada uno de los genes que se han introducido (transgén) de modo que su progenie no se segregue para el fenotipo deseado. Las plantas transgénicas también pueden ser heterocigóticas para el transgén o transgenes introducidos, tal como, por ejemplo, en la progenie F1 que ha crecido a partir de semillas híbridas. Tales plantas pueden proporcionar ventajas tales como vigor híbrido, bien conocido en la técnica.

Como se usa en el presente documento, los "otros marcadores genéticos" pueden ser cualquier molécula que esté unida a un rasgo deseado de una planta. Los expertos en la materia conocen bien tales marcadores e incluyen marcadores moleculares unidos a genes que determinan rasgos tales como resistencia a enfermedades, rendimiento, morfología de la planta, calidad del grano, rasgos de latencia, color del grano, contenido de ácido giberélico en la semilla, altura de la planta, color de la harina. y similares. Algunos ejemplos de tales genes son los genes de resistencia a la roya rayada Yr10 o Yr17, los genes de resistencia a nemátodos tales como Cre1 y Cre3, alelos en loci de glutenina que determinan la fuerza de la masa tales como los alelos Ax, Bx, Dx, Ay, By y Dy, los genes Rht que determinan un hábito de crecimiento semienano y, por tanto, resistencia al encamado.

Para suministro directo de un gen a las células se han descrito cuatro métodos generales: (1) métodos químicos (Graham et al., 1973); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, 1980); electroporación (véanse, por ejemplo, los documentos WO 87/06614, US 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 y WO 93/21335); y la pistola génica (véanse, por ejemplo, los documentos US 4.945.050 y US 5.141.131); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis et al., 1988); y (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel et al., 1992; Wagner et al., 1992).

Los métodos de aceleración que pueden usarse incluyen, por ejemplo, bombardeo de microproyectiles y similares. Un ejemplo de un método para suministrar moléculas de ácido nucleico transformantes a células vegetales es el bombardeo de microproyectiles. Este método ha sido revisado por Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas no biológicas (microproyectiles) que pueden revestirse con ácidos nucleicos e introducirse en células mediante una fuerza propulsora. Algunas partículas a modo de ejemplo incluyen aquellas compuestas por tungsteno, oro, platino y similares. Una ventaja particular del bombardeo de microproyectiles, además de ser un medio eficaz para transformar reproduciblemente monocotiledóneas, es que no se requieren el aislamiento de protoplastos ni la susceptibilidad de infección por Agrobacterium. Un sistema de suministro de partículas adecuado para uso con la presente invención es la pistola de aceleración de helio PDS-1000/He disponible en Bio-Rad Laboratories. Para el bombardeo, pueden colocarse embriones inmaduros o células diana derivadas tales como escutelas o callos de embriones inmaduros en un medio de cultivo sólido.

En otra realización alternativa, los plastos pueden transformarse establemente. El método desvelado para transformación de plastos en plantas superiores incluye suministro con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y direccionamiento del ADN al genoma del plasto mediante recombinación homóloga (US 5.451.513, US 5.545.818, US 5.877.402, US 5.932.479, y WO 99/05265.

La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales porque el ADN puede introducirse en tejidos vegetales completos, evitando así la necesidad de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. El uso de vectores de integración vegetal mediados por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales se conoce bien en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.177.010, US 5.104.310, US 5.004.863, US 5.159.135). Además, la integración del ADN-T es un proceso relativamente preciso que da como resultado pocas transposiciones. La región de ADN a transferir está definida por las secuencias fronterizas, y el ADN de intervención se inserta generalmente en el genoma de la planta.

Los vectores de transformación de Agrobacterium pueden replicarse en E. coli así como en Agrobacterium, permitiendo manipulaciones convenientes como se describió (Klee et al., Plant DNA Infectious Agents, Hohn y Schell, (editores), Springer-Verlag, Nueva York, (1985): 179-203). Además, los avances tecnológicos en vectores para transferencia génica mediada por Agrobacterium han mejorado la disposición de genes y sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar diversos genes que codifican polipéptidos. Los vectores descritos tienen regiones de multiconector convenientes planteadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para expresión directa de genes que codifican polipéptidos insertados y son adecuados para los presentes fines. Además, para las transformaciones puede usarse Agrobacterium que contiene genes Ti tanto con brazos como sin brazos. En esas variedades de plantas donde la transformación mediada por Agrobacterium es eficaz, es el método de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia génica.

Una planta transgénica formada usando métodos de transformación de Agrobacterium contiene generalmente un solo lugar genético en un cromosoma. Estas plantas transgénicas pueden denominarse hemicigóticas para el gen añadido. Es más preferente una planta transgénica que sea homocigótica para el gen estructural añadido; es decir, una planta transgénica que contenga dos genes añadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigótica puede obtenerse mediante cruce sexual (autofecundación) de una planta transgénica segregante independiente que contiene un solo gen añadido, germinando parte de la semilla producida y analizando las plantas resultantes para el gen de interés.

También debe entenderse que dos plantas transgénicas diferentes también pueden cruzarse para producir descendencia que contenga dos genes exógenos segregantes independientemente. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos. También se contemplan el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. En Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, J. Wilcox (editor) American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987) pueden encontrarse descripciones de otros métodos de reproducción que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos.

La transformación de protoplastos vegetales puede lograrse usando métodos basados en precipitación con fosfato cálcico, tratamiento con polietilenglicol, electroporación y combinaciones de estos tratamientos. La aplicación de estos sistemas a diferentes variedades de plantas depende de la capacidad de regenerar esa cepa vegetal particular a partir de protoplastos. Se describen métodos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

T ambién pueden usarse otros métodos de transformación celular e incluyen, pero no se limitan a, introducción de ADN en plantas por transferencia directa de ADN en polen, por inyección directa de ADN en órganos reproductores de una planta o por inyección directa de ADN en las células de embriones inmaduros seguido de la rehidratación de embriones desecados.

La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de una sola planta o de diversos explantes transformados se conoce bien en la técnica (Weissbach et al., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, (1988)). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye generalmente las etapas de selección de células transformadas, cultivo de esas células individualizadas a través de las etapas habituales de desarrollo embrionario a través de la etapa de plántula enraizada. De manera similar se regeneran embriones y semillas transgénicos. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan a continuación en un medio de crecimiento vegetal apropiado, tal como suelo.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen exógeno extraño se conoce bien en la técnica. Preferentemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas. De otro modo, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas cultivadas con semillas de líneas agronómicamente importantes. Por el contrario, el polen de plantas de estas importantes líneas se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un ácido nucleico exógeno deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Se han publicado métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens, y obtener plantas transgénicas para algodón (US 5.004.863, US 5.159.135, US 5.518.908); soja (US 5.569.834, US 5.416.011); Brassica (US 5.463.174); cacahuete (Cheng et al., 1996); y guisante (Grant et al., 1995).

Los métodos para la transformación de plantas de cereales tales como trigo y cebada para introducir variación genética en la planta por introducción de un ácido nucleico exógeno y para regeneración de plantas a partir de protoplastos o embriones de plantas inmaduras se conocen bien en la técnica, véanse, por ejemplo, los documentos CA 2.092.588, AU 61781/94, AU 667939, US 6.100.447, WO 97/048814, US 5.589.617, US 6.541.257 y otros métodos se establecen en el documento WO 99/14314. Preferentemente, las plantas transgénicas de trigo o cebada se producen mediante procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium tumefaciens. Pueden introducirse vectores que portan el constructo de ácido nucleico deseado en células de trigo regeneradas de plantas o explantes de tejidos cultivados, o sistemas de plantas adecuados tales como protoplastos. Las células de trigo regeneradas proceden preferentemente del escutelo de embriones inmaduros, embriones maduros, callos derivados de éstos o del tejido meristemático.

Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, puede realizarse una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o análisis de transferencia de Southern usando métodos conocidos por los expertos en la materia. Los productos de expresión de los transgenes pueden detectarse en una diversidad de formas, dependiendo de la naturaleza del producto, e incluyen transferencia de Western y ensayo enzimático. Una forma particularmente útil de cuantificar la expresión proteica y de detectar replicación en diferentes tejidos vegetales es usar un gen indicador, tal como GUS. Una vez que se han obtenido las plantas transgénicas, pueden cultivarse para producir tejidos o partes vegetales que tengan el fenotipo deseado. El tejido vegetal o las partes de la planta pueden recolectarse y/o recoger la semilla. La semilla puede servir como fuente para cultivar plantas adicionales con tejidos o partes que tengan las características deseadas.

Selección asistida por marcador

La selección asistida por marcador es un método bien reconocido de selección de plantas heterocigóticas que se requiere cuando se retrocruza con un progenitor recurrente en un programa de reproducción clásico. La población de plantas en cada generación de retrocruzamiento será heterocigótica para el gen de interés presente normalmente en una proporción 1:1 en una población de retrocruzamiento, y el marcador molecular puede usarse para distinguir los dos alelos del gen. Extrayendo ADN de, por ejemplo, brotes jóvenes y sometiendo a ensayo con un marcador específico para el rasgo deseable introgresado, se realiza una selección temprana de plantas para un mayor retrocruzamiento mientras que la energía y los recursos se concentran en menos plantas. Para acelerar además el programa de retrocruzamiento, el embrión de semillas inmaduras (25 días después de la antesis) puede escindirse y crecer en medios nutritivos en condiciones estériles, en lugar de permitir la madurez completa de la semilla. Este proceso, denominado "rescate embrionario", usado en combinación con extracción de ADN en la etapa de tres hojas y análisis de al menos un alelo o variante Sr33 que confiere resistencia mejorada a la roya del tallo a la planta, permite una rápida selección de plantas que portan el rasgo deseado, que puede cultivarse hasta la madurez en el invernadero o campo para un posterior retrocruzamiento con el progenitor recurrente.

En los métodos de la presente invención puede usarse cualquier técnica de biología molecular conocida en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de amplificación de ácidos nucleicos, secuenciación de ácidos nucleicos, hibridación de ácidos nucleicos con sondas debidamente marcadas, análisis conformacional de monocatenario (SSCA), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), análisis de heterodúplex (HET), análisis de escisión química (CCM), escisión catalítica de ácidos nucleicos o una combinación de los mismos (véase, por ejemplo, Lemieux, 2000; Langridge et al., 2001). La invención también incluye el uso de técnicas de marcadores moleculares para detectar polimorfismos unidos a alelos del (por ejemplo) gen Sr33 que confiere resistencia mejorada a la roya del tallo. Tales métodos incluyen la detección o análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), RAPD, polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y polimorfismos de microsatélites (repetición de secuencia simple, SSR). Los marcadores estrechamente unidos pueden obtenerse fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como Bulked Segregant Analysis, revisado por Langridge et al. (2001).

En una realización, un loci unido para selección asistida por marcador está al menos dentro de 1 cM, o 0,5 cM, o 0,1 cM, o 0,01 cM de un gen que codifica un polipéptido de la invención.

La "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") es una reacción en la que se hacen copias replicadas de un polinucleótido diana usando un "par de cebadores" o un "conjunto de cebadores" que consta de un cebador "corriente arriba" y un cebador "corriente abajo", y un catalizador de polimerización, tal como una ADN polimerasa, y generalmente una enzima polimerasa térmicamente estable. En la técnica se conoce métodos para PCR y se enseñan, por ejemplo, en "PCR" (M.J. McPherson y S.G Moller (editores), BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, (2000)). La PCR puede realizarse en ADNc obtenido a partir de ARNm de transcripción inversa aislado de células vegetales que expresan un gen Sr33 o alelo que confiere resistencia mejorada a la roya del tallo. Sin embargo, generalmente será más fácil si la PCR se realiza en ADN genómico aislado de una planta.

Un cebador es una secuencia oligonucleotídica que es capaz de hibridarse en una secuencia específica con la secuencia diana y extenderse durante la PCR. Los amplicones o productos de PCR o fragmentos de PCR o productos de amplificación son productos de extensión que comprenden el cebador y las copias recién sintetizadas de las secuencias diana. Los sistemas de PCR múltiple contienen múltiples conjuntos de cebadores que dan como resultado la producción simultánea de más de un amplicón. Los cebadores pueden coincidir perfectamente con la secuencia diana o pueden contener bases internas no coincidentes que pueden dar como resultado la introducción de enzima de restricción o sitios de reconocimiento de ácido nucleico/escisión catalíticos en secuencias diana específicas. Los cebadores también pueden contener secuencias adicionales y/o contener nucleótidos modificados o marcados para facilitar la captura o detección de amplicones. Los ciclos repetidos de desnaturalización térmica del ADN, hibridación de cebadores con sus secuencias complementarias y extensión de los cebadores hibridados con polimerasa dan como resultado una amplificación exponencial de la secuencia diana. Los términos diana o secuencia diana o molde se refieren a secuencias de ácidos nucleicos que se amplifican.

Los expertos en la materia conocen bien algunos métodos para secuenciación directa de secuencias nucleotídicas y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel et al., (mencionado anteriormente) y Sambrook et al., (mencionado anteriormente). La secuenciación puede realizarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, secuenciación didesoxi, secuenciación química o variaciones de las mismas. La secuenciación directa tiene la ventaja de determinar variación en cualquier par de bases de una secuencia particular.

TILLING

Las plantas de la divulgación pueden producirse usando el proceso conocido como TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (lesiones locales inducidas dirigidas en genomas)). En una primera etapa, se inducen mutaciones introducidas, tales como cambios novedosos de un solo par de bases, en una población de plantas mediante tratamiento de semillas (o polen) con un mutágeno químico, y a continuación avanzando las plantas a una generación donde las mutaciones se heredarán establemente. El ADN se extrae y se almacenan semillas de todos los miembros de la población para crear un recurso al que puede accederse repetidamente a lo largo del tiempo.

Para un ensayo TILLING, se diseñan cebadores de PCR para amplificar específicamente una vía de gen individual de interés. La especificidad es especialmente importante si una diana es miembro de una familia génica o parte de un genoma poliploide. A continuación, para amplificar productos de PCR pueden usarse cebadores marcados con colorante a partir de ADN combinado de múltiples individuos. Estos productos de PCR se desnaturalizan y se vuelven a hibridar para permitir la formación de pares de bases no coincidentes. Las faltas de coincidencia, o heterodúplex, representan tanto polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de origen natural (es decir, es probable que varias plantas de la población tengan el mismo polimorfismo) y SNP inducidos (es decir, es probable que solo las plantas individuales raras presenten la mutación). Tras la formación de heterodúplex, el uso de una endonucleasa, tal como Cel I, que reconoce y escinde el ADN no coincidente es la clave para descubrir nuevos SNP dentro de una población de TILLING.

Usando este enfoque, pueden cribarse muchos miles de plantas para identificar cualquier individuo con un solo cambio de base, así como pequeñas inserciones o deleciones (1-30 pb) en cualquier gen o región específica del genoma. El tamaño de los fragmentos genómicos que se analizan pueden variar entre 0,3 y 1,6 kb. Con un combinación de 8 veces, fragmentos de 1,4 kb (descontando los extremos de los fragmentos donde la detección de SNP es problemática debido al ruido) y 96 carriles por ensayo, esta combinación permite analizar hasta un millón de pares de bases de ADN genómico por ensayo único, haciendo que TILLING sea una técnica de alto rendimiento.

TILLING se describe además en Slade y Knauf (2005), y Henikoff et al. (2004).

Además de permitir la detección eficaz de mutaciones, la tecnología TILLING de alto rendimiento es ideal para detectar polimorfismos naturales. Por tanto, interrogar un ADN homólogo desconocido mediante heterodúplex con respecto a una secuencia conocida revela el número y posición de sitios polimórficos. Se identifican tanto cambios de nucleótidos como pequeñas inserciones y deleciones, incluyendo al menos algunos polimorfismos de números repetidos. A esto se le ha llamado Ecotilling (Comai et al., 2004).

Cada SNP se registra por su posición aproximada en unos pocos nucleótidos. Por tanto, cada haplotipo puede archivarse en función de su movilidad. Los datos de la secuencia pueden obtenerse con un esfuerzo incremental relativamente pequeño usando alícuotas del mismo ADN amplificado que se usa para el ensayo de escisión por falta de coincidencia. El cebador de secuenciación izquierdo o derecho para una sola reacción se elige por su proximidad al polimorfismo. El software Sequencher realiza un alineamiento múltiple y descubre el cambio de base, que en cada caso confirma la banda de gel.

El ecotilling puede realizarse más económicamente que la secuenciación completa, el método usado actualmente para la mayoría de los descubrimientos de SNP. Pueden cribarse placas que contienen ADN ecotípico en matriz en lugar de conjuntos de ADN de plantas mutagenizadas. Dado que la detección se realiza en geles con una resolución casi de pares de bases y los patrones de fondo son uniformes en los carriles, pueden emparejarse bandas que son de tamaño idéntico, descubriendo y genotipando SNP en una sola etapa. De este modo, la secuenciación final del SNP es simple y eficaz, más aún por el hecho de que las alícuotas de los mismos productos de PCR usados para el cribado pueden someterse a secuenciación de ADN.

Procesamiento de planta/grano

El grano/semilla de la invención, preferentemente grano de cereal y más preferentemente grano de trigo, u otras partes de la planta de la invención, pueden procesarse para producir un ingrediente alimentario, producto alimentario o no alimentario usando cualquier técnica conocida en la técnica.

En una realización, el producto es harina de grano integral tal como, por ejemplo, una harina de grano integral molida ultrafina, o una harina preparada con aproximadamente un 100 % del grano. La harina de grano integral incluye un componente de harina refinada (harina refinada o harina refinada) y una fracción gruesa (una fracción gruesa molida ultrafina).

La harina refinada puede ser harina que se prepara, por ejemplo, moliendo y tamizando grano limpio, tal como trigo o cebada. El tamaño de partícula de harina refinada se describe como harina en la que no menos de un 98 % pasa a través de una tela que tiene aberturas no mayores que las de la tela metálica tejida denominada "212 micrómetros (U.S. Wire 70)". La fracción gruesa incluye al menos uno de: salvado y germen. Por ejemplo, el germen es una planta embrionaria que se encuentra dentro del grano. El germen incluye lípidos, fibra, vitaminas, proteínas, minerales y fitonutrientes, tales como flavonoides. El salvado incluye varias capas de células y tiene una cantidad significativa de lípidos, fibra, vitaminas, proteínas, minerales y fitonutrientes, tales como flavonoides. Además, la fracción gruesa puede incluir una capa de aleurona que también incluye lípidos, fibra, vitaminas, proteínas, minerales y fitonutrientes, tales como flavonoides. La capa de aleurona, aunque técnicamente se considera parte del endospermo, exhibe muchas de las mismas características que el salvado y, por tanto, generalmente se elimina con el salvado y el germen durante el proceso de molienda. La capa de aleurona contiene proteínas, vitaminas y fitonutrientes, tales como ácido ferúlico.

Además, la fracción gruesa puede mezclarse con el componente de harina refinada. La fracción gruesa puede mezclarse con el componente de harina refinada para formar la harina integral, proporcionando de ese modo una harina integral con mayor valor nutricional, contenido de fibra y capacidad antioxidante en comparación con la harina refinada. Por ejemplo, la fracción gruesa o harina integral puede usarse en diversas cantidades para reemplazar harina refinada o integral en productos horneados, productos de aperitivo y productos alimentarios. La harina integral de la presente invención (es decir, harina integral ultrafina molida) también puede comercializarse directamente a los consumidores para uso en sus productos horneados caseros. En una realización a modo de ejemplo, un perfil de granulación de la harina integral es tal que un 98 % de las partículas en peso de la harina integral son menores que 212 micrómetros.

En realizaciones adicionales, las enzimas que se encuentran dentro del salvado y el germen de la harina integral y/o fracción gruesa se inactivan para estabilizar la harina integral y/o la fracción gruesa. La estabilización es un proceso que usa vapor, calor, radiación u otros tratamientos para inactivar las enzimas que se encuentran en el salvado y la capa germinal. La harina estabilizada conserva sus características de cocción y tiene una vida útil más larga.

En realizaciones adicionales, la harina integral, la fracción gruesa o la harina refinada pueden ser un componente (ingrediente) de un producto alimentario y pueden usarse para elaborar un producto alimentario. Por ejemplo, el producto alimentario puede ser un bagel, una galleta, un pan, un bollo, un croissant, una bola de masa, una magdalena inglesa, una magdalena, un pan de pita, un pan rápido, un producto de masa refrigerada/congelada, masa, judías horneadas, un burrito, chile, un taco, un tamal, una tortilla, una empanada, un cereal listo para comer, una comida lista para comer, relleno, una comida para microondas, un brownie, un pastel, una tarta de queso, una tarta de café, una galleta, un postre, una pasta, un panecillo dulce, una barra de caramelo, una masa de tarta, Un relleno de pastel, comida para bebés, una mezcla para hornear, un rebozado, un empanizado, una mezcla de salsa, un diluyente de carne, un sustituto de carne, una mezcla de condimentos, una mezcla de sopa, una salsa, un espesante, un aderezo para ensaladas, una sopa, crema agria, un fideo, una pasta, fideos ramen, fideos chow mein, fideos lo mein, una inclusión de helado, una barra de helado, un cono de helado, un sándwich de helado, una galleta, un crutón, una rosquilla, un rollo de huevo, un aperitivo extruido, una barra de frutas y granos, un bocadillo apto para microondas, una barra nutricional, una tortita, un producto de panadería precocido, un pretzel, un pudín, un producto a base de granola, un chip de aperitivo, una comida de aperitivo, una mezcla de aperitivos, un gofre, una base de pizza, comida para animales o comida para mascotas.

En realizaciones alternativas, la harina integral, harina refinada o fracción gruesa puede ser un componente de un suplemento nutricional. Por ejemplo, el suplemento nutricional puede ser un producto que se añade a la dieta que contiene uno o más ingredientes adicionales, que generalmente incluyen: vitaminas, minerales, hierbas, aminoácidos, enzimas, antioxidantes, hierbas, especias, probióticos, extractos, prebióticos y fibra. La harina integral, harina refinada o fracción gruesa de la presente invención incluye vitaminas, minerales, aminoácidos, enzimas y fibra. Por ejemplo, la fracción gruesa contiene una cantidad concentrada de fibra dietética, así como otros nutrientes esenciales, como vitaminas B, selenio, cromo, manganeso, magnesio y antioxidantes, que son esenciales para una dieta saludable. Por ejemplo, 22 gramos de la fracción gruesa de la presente invención proporcionan un 33 % del consumo diario recomendado de fibra de un individuo. El suplemento nutricional puede incluir cualquier ingrediente nutricional conocido que ayude a la salud general de un individuo, los ejemplos incluyen, entre otros, vitaminas, minerales, otros componentes de fibra, ácidos grasos, antioxidantes, aminoácidos, péptidos, proteínas, luteína, ribosa, ácidos grasos omega-3 y/u otros ingredientes nutricionales. El suplemento puede suministrarse en las siguientes formas, entre otras: mezclas de bebidas instantáneas, bebidas listas para beber, barras nutricionales, obleas, galletas, galletas saladas, inyecciones de gel, cápsulas, chicles, comprimidos masticables y píldoras. Una realización suministra el suplemento de fibra en forma de batido aromatizado o bebida de malta, esta realización puede ser particularmente atractiva como suplemento de fibra para niños.

En una realización adicional, puede usarse un proceso de molienda para hacer una harina de granos múltiples o una fracción gruesa de granos múltiples. Por ejemplo, el salvado y el germen de un tipo de grano pueden molerse y mezclar con endospermo molido o harina de cereal integral de otro tipo de cereal. Alternativamente, el salvado y el germen de un tipo de grano pueden molerse y mezclar con endospermo molido o harina integral de otro tipo de grano. Se contempla que la presente invención incluya la mezcla de cualquier combinación de uno o más de salvado, germen, endospermo y harina integral de uno o más granos. Este enfoque de granos múltiples puede usarse para hacer harina adaptada y capitalizar las cualidades y el contenido nutricional de múltiples tipos de granos de cereales para hacer una harina.

Se contempla que la harina integral, fracción gruesa y/o productos en grano de la presente invención puedan producirse mediante cualquier proceso de molienda conocido en la técnica. Una realización a modo de ejemplo implica moler el grano en una sola corriente sin separar el endospermo, salvado y germen del grano en corrientes separadas. El grano limpio y templado se transporta a un molino de primer paso, tal como un molino de martillos. molino de rodillos, molino de púas, molino de impacto, molino de disco, molino de desgaste por aire, molino de hueco o similar. Después de la molienda, el grano se descarga y se transporta a un tamiz. Además, se contempla que la harina integral, fracción gruesa y/o productos en grano de la presente invención puedan modificarse o mejorarse mediante otros numerosos procesos tales como: fermentación, instantización, extrusión, encapsulación, tostado, torrefacción o similares.

Malteado

Una bebida a base de malta proporcionada por la presente invención incluye bebidas alcohólicas (incluyendo bebidas destiladas) y bebidas no alcohólicas que se producen usando malta como parte o la totalidad de su material de partida. Algunos ejemplos incluyen cerveza, happoshu (bebida de cerveza con bajo contenido de malta), whisky, bebidas a base de malta con bajo contenido de alcohol (por ejemplo, bebidas a base de malta que contienen menos de un 1 % de alcoholes) y bebidas sin alcohol.

El malteado es un proceso de remojo y germinación controlados seguido del secado del grano tal como grano de cebada y trigo. Esta secuencia de acontecimientos es importante para la síntesis de numerosas enzimas que causan la modificación del grano, un proceso que principalmente despolimeriza las paredes celulares del endospermo muerto y moviliza los nutrientes del grano. En el proceso de secado posterior, se producen sabor y color debido a reacciones químicas de oscurecimiento. Aunque el uso principal de la malta es para la producción de bebidas, también puede usarse en otros procesos industriales, por ejemplo, como fuente enzimática en la industria de la panificación, o como agente aromatizante y colorante en la industria alimentaria, por ejemplo, como malta o como harina de malta, o indirectamente como jarabe de malta, etc.

En una realización, la presente invención se refiere a métodos para producir una composición de malta. El método comprende preferentemente las etapas de:

(i) proporcionar grano, tal como cebada o trigo, de la invención,

(ii) remojar dicho grano,

(iii) germinar los granos remojados en condiciones predeterminadas y

(iv) secar dichos granos germinados.

Por ejemplo, la malta puede producirse mediante cualquiera de los métodos descritos en (Principles of Cereal Science and Technology, segunda edición, 1994: American Association of Cereal Chemists, St. Paul, Minn.). Sin embargo, también puede usarse cualquier otro método adecuado para producir malta con la presente invención, tal como métodos para la producción de maltas especiales, que incluyen, pero se limitan a, métodos para tostar la malta.

La malta se usa principalmente para la elaboración de cerveza, pero también para la producción de bebidas espirituosas destiladas. La elaboración de cerveza comprende la producción de mosto, fermentaciones principales y secundarias y postratamiento. Primero se muele la malta, se agita en agua y se calienta. Durante este "macerado", las enzimas activadas en el malteado degradan el almidón del grano en azúcares fermentables. Se clarifica el mosto producido, se le añade levadura, se fermenta la mezcla y se realiza un postratamiento.

Ejemplos

Ejemplo 1. Mapeo genético de Sr33

Se obtuvo una accesión de trigo CS1D5405 que contiene el gen Sr33 - CS1D5405 es una reserva genética de sustitución de cromosoma único que tiene una ID de cromosoma del genotipo de trigo de referencia Chinese Spring (CS) reemplazada por el cromosoma correspondiente de una accesión de Aegilops tauschii (RL5288), el donante de Sr33. Las hojas de trigo se infectaron con roya del tallo Puccinia graminis f. sp. tritici patotipo 34-1,2,3,4,5,6,7,11 (cultivo n.° 171 de Plant Breeding Institute, Cobbity, New South Wales, Australia) y se examinó histológicamente para comparar la respuesta de resistencia a Sr33 con la conferida por un gen de respuesta fuerte, Sr45, también procedente de Ae. tauschii e introgresó en trigo hexaploide. En las hojas de trigo hexaploide recogidas 5 días después de la inoculación (dpi), se observaron sitios de infección mayores en las plantas que contenían Sr33 en comparación con las plantas infectadas que contenían el gen Sr45.

Para investigar el modo de acción potencial de estos dos genes de resistencia diferentes, se limpió adicionalmente el tejido foliar teñido e infectado con roya y se identificó la muerte celular mediante autofluorescencia. Los tejidos de las hojas infectadas con roya se limpiaron y se tiñeron con aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugada con FITC como se describe en Ayliffe et al. (2011). Para visualizar células autofluorescentes, las mismas muestras de hojas se aclararon en una solución saturada de hidrato de cloral y se observaron bajo luz ultravioleta. Los trigos hexaploides que contenían Sr33 mostraron poca autofluorescencia debido a la muerte de las células vegetales en los sitios de infección por roya en comparación con Sr45 que mostró una fuerte muerte celular hipersensible. Pruebas adicionales con un aislado de roya del tallo Ug99 y razas derivadas, así como con aislamientos de roya del tallo de América del Norte (Rouse et al., 2011) y Australia, mostraron que la presencia de Sr33 en CS1D5405 confería un fenotipo de resistencia intermedia en comparación con el gen Sr45 en el fondo genético de Chinese Spring.

Se realizó un enfoque de mapeo genético para localizar el gen Sr33, como sigue. Se generó una población de mapeo a partir de un cruce entre una planta resistente CS1D5405 que contenía Sr33 (Jones et al., 1991) y una planta de la variedad susceptible Chinese Spring que carece de Sr33. La población de mapeo incluyó 85 líneas endogámicas recombinantes (RIL) y 1150 líneas F2 derivadas del cruce entre CS1D5405 y Chinese Spring. El cribado de roya de estos materiales vegetales se realizó usando Puccinia graminis f. sp. tritici patotipo 34-1,2,3,4,5,6,7,11 (cultivo n.° 171 del Plant Breeding Institute, Cobbity, New South Wales, Australia) y el método de Bariana y Mcintosh (1993). Junto con CS1D5405, también se usó Ae. tauschii accesión CPI110799 (el donante original de Sr33) como control positivo. La resistencia a la roya del tallo se agregó como un único gen codominante en el lugar Sr33 en la familia endogámica recombinante.

Se cribaron marcadores de repetición de secuencia simple (SSR) específicos de ID de cromosoma (Somers et al., 2004) en los 85 RIL usando el método de Hayden et al. (2008) y 11 marcadores polimórficos identificados fueron mapeados en las poblaciones de RIL usando MAP MAnAg ER Versión QTXb20 (Manly et al., 2001) y función de mapas Kosambi (1944). Se identificaron dos marcadores flanqueantes estrechamente vinculados, a saber, BE405778 y BE499711, a partir de este cribado y se usaron para identificar recombinantes de la gran población F2 en esta estrategia de mapeo posicional usando el método descrito en Kota et al. (2006). Aproximadamente 2850 gametos en la población de mapeo genético de CS1D5405 x CS se analizaron usando marcadores derivados de EST flanqueantes BE405778 y BE499711 en la región que contenía Sr33. Esto identificó 30 líneas recombinantes independientes que tenían cada una recombinación entre los dos marcadores.

Para identificar marcadores adicionales en la región Sr33, se cribaron etiquetas de secuencia expresadas en trigo (wEST) específicas del grupo de cromosomas 1 (Akhunov et al., 2010) siguiendo el método de Lagudah et al. (2006). Además, el análisis de AFLP se realizó usando 408 combinaciones de cebadores derivadas de cebadores de amplificación selectiva 17 PstI y 24 MseI y métodos como se describe en Mago et al. (2002).

Para iniciar el mapeo físico de la región Sr33, las colecciones de BAC específicas del genoma D elaboradas a partir de Ae. tauschii, las accesiones AL8/78 (Luo et al., 2003) y AUS18913 (Moullet et al., 1999) se cribaron de acuerdo con Lagudah et al. (2006). Un marcador derivado de AFLP estrechamente ligado ubicado dentro de 0,04 cM de Sr33 que contenía secuencias de un gen de deshidrina se usó como sonda en la colección de BAC del genoma D preparada a partir de Ae. tauschii accesión AL8/78, y se identificaron clones positivos. Los BAC identificados se mapearon usando las secuencias de copias bajas aisladas como se describe en Lagudah et al. (2006). Los clones BAC positivos se secuenciaron en el Beijing Genomic Institute, China y en las instalaciones de Integrated Genomics, Kansas State University, EUA. Se identificaron cóntigos de los clones positivos a partir de Ae. Tauschii Physical Mapping Project, UC Davis, EUA. Las secuencias repetidas presentes en los cóntigos cortos ensamblados dentro de los BAC se enmascararon usando la base de datos de repeticiones de trigo (http://wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/blastrepeats3.html) y las secuencias no repetidas se analizaron en busca de genes usando el software de predicción génica del Instituto de Tecnología de Massachusetts (http://genes.mit.edu). Se identificó un cóntigo BAC, ctg4713, que portaba secuencias adicionales que codificaban un gen similar a Pum/Mpt5/FBF (denominado Bpm) y un gen análogo de resistencia (RGA) con dominios de repetición rica en leucina de unión a nucleótidos superenrollados (CC-NB-LRR) denominados AetRGA1a (véase la Figura 4).

Las secuencias de deshidrina, Bpm y AetRGA1a tenían cada una miembros de genes ortólogos en cebada y Triticum monococcum (Wei et al., 2002; Jordan et al., 2011) asociado a grupos de genes relacionados con la defensa y mapeados en las posiciones homólogas correspondientes en los cromosomas 1H y 1A, respectivamente. En el mapa genético de alta resolución, AetRGA1a se mapeó proximalmente en la misma posición que las secuencias de deshidrina y Bpm (Figura 1).

El nuevo cribado de la colección de BAC con AetRGA1a como sonda identificó además el cóntigo 5455 de secuencia que contenía tres miembros adicionales de RGA estrechamente relacionados (denominados AetRGA1b, AetRGA1c y AetRGA1d) que se mapearon genéticamente como cosegregantes con Sr33 (Figura 1). El cribado posterior de una segunda colección de BAC de Ae. tauschii accesión AUS18913 (Moullet et al., 1999), que estaba geográficamente más cerca y ubicada dentro del mismo grupo génico que la fuente original del donante Sr33, reveló cuatro secuencias RGA más cosegregantes (Figura 1). Se denominaron AetRGAle, AetRGA1f y otros dos tipos de RGA diferentes, AetRGA2a y AetRGA3a (Figura 1). AetRGA1f y AetRGA3a tenían cada uno codones de parada en marco y se consideró que no eran funcionales y, por tanto, pseudogenes que también estaban presentes en plantas portadoras de Sr33.

Las tres clases de RGA, RGA1, RGA2 y RGA3 en el locus Sr33 mostraron una gran semejanza con los tres genes NB-LRR de hibridación no cruzada, RGH1, RGH2 y RGH3 respectivamente en el locus de cebada MIa (Wei et al., 2002). AetRGA2a muestra una fusión génica única con una región C-terminal que contiene un dominio de subunidad del exocisto 70 (Figura 3) que está ausente en cebada. El locus MIa de cebada también contiene miembros de una familia de genes inhibidores de quimotripsina (CI), cuyas secuencias relacionadas con el miembro del gen CI2e encontrado en Ae. tauschii se mapeó distal a Sr33 a una distancia de 0,3 cM (Figura 1). Las secuencias de marcadores de trigo también se compararon con las secuencias genómicas de arroz y Brachypodium usando la plataforma Phytozome (www.phytozome.net), para identificar secuencias ortólogas. Este análisis usando las secuencias Bpm y CI identificó regiones ortólogas en los cromosomas 2 y 5 de los genomas de Brachypodium y de arroz, respectivamente. Sin embargo, estos genomas carecían de cualquiera de las tres clases de RGA que se encuentran en Ae. tauschii, trigo y cebada (Figura 1).

Los inventores concluyeron que había al menos 8 genes candidatos de tipo LRR-NBS en la región mapeada, cualquiera de los cuales podría ser Sr33, si de hecho el fenotipo resistente a Sr33 estuviera conferido por un solo gen y si el gen Sr33 codificara un polipéptido tipo LRR-NBS.

Ejemplo 2. Mutagénesis y aislamiento de mutantes Sr33

Para identificar cuál de los genes candidatos era Sr33, si es que alguno de ellos lo era, se realizó un enfoque mutacional. Se generaron líneas mutantes a partir del tratamiento con etil metil sulfonato (EMS) de 2000 semillas de CS1D5405 (Mago et al., 2005). Se estimularon 850 plantas M2 de las líneas mutagenizadas con la cepa de roya del patotipo 34-1,2,3,4,5,6,7,11 para cribar su fenotipo Sr33. Se identificaron nueve mutantes susceptibles de la población tratada con EMS y se usaron para identificar el miembro del gen responsable de la función de resistencia a la roya del tallo del siguiente modo.

De acuerdo con los marcadores específicos de identificación cromosómica, se identificó que cuatro de los mutantes (El a E4; Grupo I) portaban deleciones mayores en la identificación del cromosoma, mientras que un mutante (E5; Grupo II) tenía una deleción corta con la pérdida de los genes AetRGA1b, AetRGA1c, AetRGA1e, AetRGA2a y AetRGA3a (Figura 2). Estos cinco mutantes no fueron útiles para identificar el gen Sr33. Por el contrario, las 4 plantas mutantes restantes (E6 a E9; Grupo III) se identificaron como mutantes puntuales putativos ya que no se detectó pérdida de marcadores de ADN. Se utilizaron pares de cebadores superpuestos (Tabla 2) diseñados a lo largo de toda la longitud de los genes predichos para amplificar las secuencias de CPI110799 (línea donante Sr33) y los mutantes susceptibles del Grupo III siguiendo el método de PCR descrito por Lagudah et al. (2009).

Las secuencias amplificadas se compararon para las variaciones nucleotídicas usando alineamiento múltiple de secuencia (CLUSTAL-European Bioinformatics lnstitute-http://www.edi.ac.uk/Tools/sequence.html). Las comparaciones de secuencias nucleotídicas de las partes amplificadas de los genes AetRGAIa, AetRGAlb, AetRGAIc, AetRGAId, AetRGAIf, AetRGA2a y AetRGA3a con las secuencias correspondientes parentales resistente CS1D5405 mostraron que eran un 100 % idénticas, mientras que la secuencia nucleotídica de AetRGAle mostró cambios de nucleótidos independientes en los mutantes susceptibles. Los inventores concluyeron que AetRGAle era el gen Sr33. Dos de las plantas mutantes comprendían cambios nucleotídicos que dieron como resultado cambios de aminoácidos en el bucle P de los polipéptidos codificados, mientras que las otras dos tenían mutaciones en las secuencias que codifican los motivos RNBS-B y GLPL del dominio NBS, respectivamente (Figura 4).

Análisis de complementación de Sr33

Para validar adicionalmente AetRGAle como suficiente para resistencia a Sr33, se realizó un ensayo de complementación genética usando una longitud de 8 kb de ADN genómico que comprende todos los exones e intrones y las regiones de 2,4 kb corriente arriba y 1,5 kb corriente abajo de AetRGAle. Los inventores esperaban que este fragmento incluyera la longitud completa del gen, incluyendo su promotor. El fragmento de 8 kb se amplificó usando cebadores (5'-TTCAAGATGTCAAATTTTAAAAGGGC-3') (SEQ ID NO: 13), (5-CTACT CATTAGGAACTCGAGCGG-3') (SEQ ID NO: 14) y ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs Inc.) en las condiciones recomendadas por el fabricante. El fragmento del gen Sr33 se insertó en el vector binario pVecNeo, un derivado de pWBvecS (Wang et al., 1998) en el que el gen de higromicina 35S se ha reemplazado con un gen marcador seleccionable NPTII 35S derivado de pCMneoSTL2 (Maas et al., 1997). El constructo genético que comprende la secuencia del gen AetRGAle se introdujo en la variedad de trigo susceptible a la roya del tallo Fielder mediante transformación usando la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens (pMP90). Se sometieron a ensayo más de veinte transformantes T⁰para determinar la respuesta de resistencia a roya. Los ensayos de infección mostraron que veinte plantas transgénicas independientes AetRGA1e exhibieron una respuesta a la infección por roya del tallo típica de la resistencia a Sr33, mientras que las líneas hermanas que carecían del transgén eran altamente susceptibles, lo que confirma que AetRGA1e confería resistencia a Sr33. Los inventores concluyeron que el gen AetRGA1e era necesario y suficiente para conferir el fenotipo Sr33.

Ejemplo 3. Estructura del gen y polipéptido Sr33 y su expresión

La secuencia genómica de Sr33 tiene 6 exones y 5 intrones como se predijo mediante RT-PCR y reacciones RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) en 5' y 3'. La estructura del gen se muestra esquemáticamente en la Figura 4 y la secuencia génica se proporciona como SEQ ID NO: 5. El exón 1 abarca los nucleótidos 1226 a 1299, el exón 2 abarca los nucleótidos 1389 a 1511, el exón 3 abarca los nucleótidos 2238 a 3080, el exón 4 abarca los nucleótidos 4155 a 6157, el exón 5 abarca los nucleótidos 6266 a 6344 y el exón 6 abarca los nucleótidos 6824 a 7233, de SEQ ID NO: 5.

El polipéptido Sr33 resistente a patógenos (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) es un polipéptido que contiene CC-NB-LRR que tiene los siguientes motivos; superenrollado, Ed V iD, hhGRExe, Walker A, Walker B, RNBS-B, RNBS-C, GLPL, RNBS-D, MHD y LRR. La región superenrollada se extiende generalmente desde los restos de aminoácido 1 a 160 de SEQ ID NO: 1. El dominio NB generalmente se extiende desde los restos de aminoácido 161 a 550 de SEQ ID NO: 1, mientras que el dominio LRR generalmente se extiende desde los restos de aminoácido 551 a 961 de SEQ ID NO: 1.

El análisis filogenético por análisis de árbol de unión próxima mostró que los grupos de polipéptidos Sr33 codificados con las proteínas MIa de la especie del genoma diploide A, Triticum monococcum (TmMla) y cebada (HvMla); la mayor similitud de un 86 % fue con TmMla mientras que HvMlal fue el ortólogo de cebada oculto (Figura 5). Ninguno de los genes aislados de resistencia a la roya de la hoja del trigo que codifican las proteínas CC-NB-LRR (Lr1, Lr10 y Lr21) estaban relacionados con Sr33, exhibiendo identidades de secuencia de aminoácidos que variaban de un 25% a un 34 %, o miembros de MIa de cebada. AetRGA1e (Sr33) tiene 82, 81, 80, 78 y 30 % de identidad con AetRGA1a, AetRGAId, AetRGA1b, AetRGAlc y AetRGA2a respectivamente (Tabla 3).

Tabla 3. Porcentaje de identidad de aminoácido de Sr33 de trigo con respecto a homólogos de Sr33

de otras es ecies ve etales

Ejemplo 4. Homólogos de Sr33 en otras plantas

Para determinar la presencia o ausencia de alelos del gen Sr33 en plantas de trigo diploide y para identificar alelos variantes, se cribaron plantas de cada uno de 368 accesiones de Ae. tauschii recolectadas de diferentes ubicaciones geográficas y mantenidas en la Australian Winter Cereals Collection in Tamworth, Australia, the Commonwealth Plant Introduction collection (CPI) en CSIRO Plant Industry, Australia y UC Davis, EUA.

Las secuencias de longitud completa para los alelos de Sr33 se obtuvieron mediante PCR en plantas de 36 accesiones sin producto de amplificación en las 332 líneas restantes, lo que indica que las últimas accesiones portaban secuencias muy divergentes o carecían del gen. Los haplotipos (Figura 6, Tabla 4) basados en la secuencia Sr33 se agruparon como sigue basándose en las secuencias de aminoácidos, donde el gen estaba presente. Siete accesiones poseían secuencias idénticas (SEQ ID NO: 1) a la fuente original de Sr33 y se clasifican como haplotipo I. Un segundo haplotipo (haplotipo II, SEQ ID NO: 2) difería en un solo aminoácido de la SEQ ID NO: 1 en posición 588 (asparagina en lugar de ácido aspártico), encontrado en la accesión PI603225. Las secuencias de otras 20 accesiones con 5 sustituciones de aminoácidos en el extremo C terminal (región LRR) constituyen el haplotipo III (SEQ ID NO: 6). Se encontró un cuarto haplotipo (SEQ ID NO: 7) con varios cambios de aminoácidos en las regiones NBS y LRR en tres accesiones rusas, mientras que un quinto haplotipo (SEQ ID NO: 8) que codifica una proteína truncada se encontró en cinco accesiones de origen iraní. Se encontró que los haplotipos I, II y III se originaron en las regiones costeras del sur del Mar Caspio. Las plantas de cada uno de los haplotipos se cribaron para el fenotipo Sr33. Plantas de los haplotipos I y II que muestran resistencia contra múltiples razas de roya del tallo (Tabla 4).

Tabla 4. Haplotipos de Sr33 y los detalles de accesiones de Ae. Tauschii en cada tipo dado con puntuaciones de res uesta a ro a del tallo

Ejemplo 5. El análisis VIGS de la función de Sr33 indica que la resistencia es independiente de RAR1, SGT1 y HSP90

La resistencia a enfermedades mediada por un subconjunto de proteínas tipo R de NB-LRR requiere la función de tres proteínas chaperonas, concretamente, RAR1, SGT1 y HSP90, que se cree que mantienen y estabilizan proteínas compatibles en un estado autoinactivo y promueven la función inmunitaria adecuada (Shirasu et al., 2009). El silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) es una herramienta útil para el silenciamiento dirigido de genes específicos y, a menudo, se emplea para delinear la función proteica. De hecho, Scofield et al. (2005) demostraron que la atenuación de la expresión de los genes RAR1, SGT1, y HSP90 en trigo hexaploide era suficiente para comprometer la capacidad inmunitaria del gen Lr21. Para determinar si la resistencia mediada por Sr33 dependía de RAR1, SGT1 y HSP90, se realizaron experimentos para silenciar transitoriamente los genes que codifican estas chaperonas en la línea de trigo hexaploide CS1D5405 que expresa Sr33, y el fenotipo Sr33 se analizó mediante ensayos de resistencia.

El silenciamiento usó vectores virales derivados de un vector del virus del mosaico de la raya de la cebada (BSMV) obtenido del Dr. Andrew O. Jackson en UC Berkeley (Petty et al., 1989). El vector y de BSMV se reconstruyó para incluir un sitio de clonación listo para PCR. Para hacer esto, el vector y se digirió con dos enzimas de restricción Notl y PacI, y se ligó con una secuencia GGCCCCACTCATGACATGGCGTTAGCCATGGGAAGCTTGGAT (SEQ ID NO: 67), que incluye dos sitios de restricción Xcml. El vector y modificado (denominado vector yPCR) se linealizó con la enzima de restricción Xcml para producir un sitio de clonación TA para clonación directa de productos de PCR. Por simplicidad, el constructo derivado de BSMV sin inserto se denominó y00, y cada constructo de silenciamiento de BSMV se denominó diana y. Por ejemplo, un constructo de silenciamiento de BSMV que portaba un fragmento de 185 pb del gen PDS de trigo se denominó yPDS.

El constructo BSMV utilizado para silenciar el gen Sr33 portaba un fragmento específico del gen Sr33 de 190 pb. Se prepararon dos constructos para silenciar el gen Exo70; cada constructo portaba un fragmento específico del gen de 190 pb de los extremos N o C terminales del gen, denominado YExo70N y YExo70C. Por el contrario, Rar1, Sgt1 y Hsp90 tenían cada uno tres homólogos en los genomas A, B y D de trigo. Para silenciar los tres homólogos en el genoma, se diseñaron constructos para portar un fragmento de aproximadamente 190 pb cuya secuencia de nucleótidos se conservó en los tres homólogos de cada gen.

Los transcritos de ARN infeccioso se sintetizaron mediante transcripción in vitro usando ARN polimerasa T7 (New England Biolabs, Ipswich, MA) a partir de plásmidos a, p, y y linealizados (Scofield et al., 2005). El inóculo de BSMV se preparó con una proporción equimolar de transcritos a, p, y y más tampón de inoculación que contenía un agente lacerante. El inóculo se inoculó mediante frotamiento sobre la segunda hoja de cada plántula de trigo de nueve días.

Las evaluaciones de la roya del tallo se realizaron en condiciones de invernadero con roya del tallo de raza QFCSC. Las ureodinioesporas se suspendieron en isoparafina Soltrol 170 (Chempoint, Bellevue, WA). La densidad de esporasinóculo se calculó en 227.500 esporas/ml usando un hemocitómetro Brightline según las recomendaciones del fabricante (Hausser Scientific, Horsham, PA). El inóculo se aplicó a una tasa de 0,05 mg de esporas/10 ml de Soltrol/planta usando una pistola de aerógrafo Badger 350-3 (Badger Air-Brush Co., Franklin Park, IL). La tasa de germinación de esporas se evaluó en un portaobjetos de microscopio inoculado usando un microscopio óptico. Se acondicionó previamente una cámara de rocío con iluminación a una temperatura del aire de 19-22 °C y se incubó durante 24 h, seguido de incubación en condiciones de alta humedad e intensidad de luz durante al menos 3 h antes de transferencia a un invernadero. Las evaluaciones se realizaron cuando Chinese Spring mostró una susceptibilidad total a los 14 días después de la inoculación siguiendo la escala descrita en Bariana y Mcintosh (1993).

La expresión de los genes dirigidos para silenciamiento se cuantificó mediante PCR comparativa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). La abundancia de transcritos se cuantificó mediante el kit iScript One-Step RT-PCR con PCR en tiempo real con SYBR Green y se cuantificó usando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 operado con el software CFX Manager (Bio-Rad, Hercules, CA). La abundancia de transcritos se normalizó a 18s y la abundancia de transcrito de actina y la abundancia relativa de transcritos se calculó usando el método AACt como se describe en el manual CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA), donde el factor de cambio = 2'ññCt y el porcentaje de abundancia de transcritos = factor de cambio x 100. Cada reacción se realizó por triplicado y los datos se usaron solo si Ct < 30 y la desviación estándar de Ct entre replicados era <0,3. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 10 min a 50 °C, 5 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 °C, 30 s a 55 °C y 1 min a 95 °C, 1 min a 55 °C, curva de fusión de 55 °C a 95 °C, incremento 0,5 °C. En todos los casos, la expresión relativa del gen diana se presentó como el nivel de expresión de este gen en plantas silenciadas con respecto a la del mismo gen en plantas infectadas con y00, y los valores de expresión génica fueron los promedios de tres plantas. Para cada PCR, se validó la especificidad de las amplificaciones y se calculó el ciclo umbral por encima del fondo usando el software iCycler de Bio-Rad. La eficacia de la PCR fue aproximadamente un 100 %. Se calculó la cuantificación relativa de la abundancia de transcritos génicos como se describe en Scofield et al. (2005). Las barras de error en todas las figuras que muestran datos de qRT-PCR indicaron las desviaciones estándar calculadas a partir de los valores originales de CT (umbral de ciclo).

Las secuencias de cebadores usadas para detectar cada gen fueron las siguientes:

SR33-F: 5' GCAGGAGGACGTGGAAATC 3' (SEQ ID NO: 68)

SR33-R: 5' AAAGTCTACCATACAGCGGAAC 3' (SEQ ID NO: 69)

Exo70-F: 5' ATGGAGCAATGCCCAAAGT 3' (SEQ ID NO: 70)

Exo70-R: 5' GGCATCAGCAAACACCAACT 3' (SEQ ID NO: 71)

HSP90-F: 5' CGACCAGCACGCTCACGAT 3' (SEQ ID NO: 72)

HSP90-R: 5' GCGATGGTCCCGAGGTTGT3' (SEQ ID NO: 73)

SGT1-F: 5' CAAGCTGGGCAGTTAC 3' (SEQ ID NO: 74)

SGT1-R: 5'TCCTTCGATGCATAAAGC 3' (SEQ ID NO: 75)

RAR1-F: 5'ATGCGGTGCCAGCGAATA 3' (SEQ ID NO: 76)

RAR1-R: 5'GGGTTGTCGTCGTCGGTG 3' (SEQ ID NO: 77)

Actina-F: 5' AAATCTGGCATCACACTTTCTAC 3' (SEQ ID NO: 78)

Actina-R: 5' GTCTCAAACATAATCTGGGTCATC 3' (SEQ ID NO: 79)

18SF: 5' GTGACGGGTGACGGAGAATT 3' (SEQ ID NO: 80)

18SR: 5' GACACTAATGCGCCCGGTAT 3' (SEQ ID NO: 81)

PDS-F: 5' TGTCTTTAGCGTGCAAG 3' (SEQ ID NO: 82)

PDS-R: 5' GATGATTTCGGTGTCACT 3' (SEQ ID NO: 83).

El silenciamiento se confirmó mediante análisis qRT-PCR con datos que indican una reducción de la expresión relativa de cada gen (AetRGAle, RAR1, SGT1 y HSP90) en una cantidad entre 50-84 % (Tabla 5). Las plantas silenciadas y de control presentaron una capacidad de resistencia inmune idéntica, indicando que la resistencia mediada por Sr33 era independiente de RAR1, SGT1 y HSP90 en estos experimentos en trigo. Además, como las plantas tratadas con BSMV:AetRGA1e presentaron una mayor susceptibilidad de infección por roya del tallo, estos datos validaron aún más la noción de que este gen proporcionaba al trigo resistencia a la roya del tallo dependiente de Sr33. El silenciamiento del miembro AetRGA2b adyacente portador de la subunidad del exocisto 70 no comprometió la resistencia, indicando que ese gen no era necesario para resistencia mediada por Sr33.

Tabla 5. Análisis qRT-PCR de expresión de Sr33, RGA2a Exocisto 70, RAR1, SGT1 y HSP90 durante el silenciamiento mediante BSMV:VIGS

(continuación)

Ejemplo 6. Análisis de dos híbridos de levadura

Los experimentos descritos en el Ejemplo 5 indicaron que el polipéptido Sr33 funcionaba independientemente del complejo chaperona RAR1-SGT1-HSP90. Sin embargo, una advertencia fue que el silenciamiento génico rara vez se completa. Es decir, es posible que la cantidad de proteína RAR1, SGT1 y HSP90 durante el experimento VIGS no se haya reducido lo suficiente por debajo de un umbral para alterar la resistencia a enfermedades. Para evaluar si Sr33 era capaz de interactuar con cualquiera de los polipéptidos HSP90, SGT1 y RAR1 en un segundo tipo de experimento, se realizó un análisis dirigido de dos híbridos de levadura. Se realizaron experimentos similares usando el polipéptido WRKY1/2.

Los experimentos de dos híbridos de levadura se realizaron en la cepa Hf7c indicadora de Saccharomyces cerevisiae como sigue. Se hizo el escrutinio de bases de datos públicas usando secuencias de aminoácidos de HSP90, RAR1, SGT1, WRKY1/2 de H. vulgare como consultas para aislar etiquetas de secuencias expresadas (EST) relacionadas derivadas de trigo. Usando bibliografía y datos de secuencias disponible, se seleccionaron las EST CK208966.1 y CJ619316.1 para SGT1, CJ684577.1 para RAR1, GQ240780.1 para HSP90, DR741433.1, BQ578389.1 para WRKY1 y DR740124.1, DR741886.1 para WRKY2 (Tai, 2008; Wang et al., 2011) y se desarrollaron pares de cebadores (Tabla 6) para el aislamiento del ADNc de longitud completa de HSP90, RAR1, SGT1 y WRKY1/2 de la línea CPI110799 de Ae. tauschii.

Los ADNc de HSP90, SGT1, RAR1, WRKY1 y WRKY2 se amplificaron de plantas de la línea CPI110799 de trigo y la variedad Golden Promise de cebada (H. vulgare). El ADNc diana se obtuvo mediante amplificación por PCR usando cebadores diseñados con sitios de enzimas de restricción específicos (Tabla 6) y se clonaron en pGADT7 (Clontech) en los sitios correspondientes. La transformación de levadura se realizó mediante el método de Gietz y Woods (2002) con cotransformantes seleccionados en medios SD que carecen de leucina y triptófano. El análisis de interacción se realizó en medios que carecían de leucina, triptófano e histidina con levadura cultivada a 30 °C durante 3-4 días. Como control positivo, se usaron el dominio L6 TIR de lino, que se ha mostrado que homodimeriza en levadura o la combinación MLA10 CC1-46-HvWRKY1260-353 (Bernoux et al., 2011; Jordan et al., 2011). La proteína de levadura total se extrajo de acuerdo con Kushnirov (2000). Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Pall). Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5 % y se sondaron con anticuerpos monoclonales de ratón anti-HA o anti-Myc (Roche), seguido de anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante (Pierce). El marcado se detectó usando el kit de quimioluminiscencia SuperSignal West Pico o Femto (Pierce). Las membranas se tiñeron con Ponceau S para confirmar una carga igual.

La coexpresión de Sr33 de longitud completa como cebo con equivalentes de longitud completa de polipéptidos HSP90, SGT1 y RAR1 de H. vulgare o Ae. tauschii no pudieron detectar una interacción con Sr33. La evidencia estructural indicó que SGT1 puede proporcionar una interfaz de acoplamiento mediante la cual las proteínas NB-LRR compatibles se asocian con el complejo chaperona (Zhang et al., 2010). Tal interacción se había validado experimentalmente con la observación de que el dominio LRR de dos proteínas de tipo R NB-LRR diferentes podía interactuar directamente con SGT1 (Bieri et al., 2004; Leister et al., 2005). Para descartar la posibilidad de que el impedimento estérico pudiera ser un factor limitante en este estudio, el dominio LRR de Sr33 se expresó como proteína truncada. La coexpresión de LRR551-961 como cebo con AetSGT1 como presa volvió a producir una interacción negativa. Junto con el análisis VIGS, estos datos proporcionaron una fuerte evidencia genética y bioquímica de que Sr33 funcionaba independientemente de las chaperonas HSP90, RAR1 y SGT1.

Análisis de 2 híbridos de levadura con WRKY1/2

El análisis de unión próxima indicó que la secuencia de aminoácidos del polipéptido Sr33 se agrupaba con una cohorte de polipéptidos MIa de cebada. Dado el grado de similitud entre múltiples genes MIa y TmMla1 de cebada con Sr33, se realizó un análisis de 2 híbridos de levadura para evaluar si Sr33 podía interactuar con equivalentes de H. vulgare o Ae. tauschii de WRKY1/2.

Se ha mostrado que el dominio superenrollado N-terminal (CC1-46) de HvMLA10 y TmMLA1 es necesario y suficiente para mediar la interacción con el C-terminal.

Tabla 6. Listado de cebadores usados para aislar ADNc de Sr33 de CPI110799 (Ae. tauschii) y ADNc de HSP90, RAR1 T1 WRKY12 PI117 l n Pr mi H. V l r L.

(continuación)

El dominio CC de Sr33 no se autoasocia en levadura

El dominio MLA10 CC5-120 pudo autoasociarse en solución para formar un dímero. Además, el dominio MLA10 CC-NB1-225 también autointeractuó en ensayos de dos híbridos de levadura (Maekawa et al., 2011). Para evaluar si el dominio CC de Sr33 podía autointeractuar, se realizó un análisis dirigido de dos híbridos de levadura. La coexpresión de tres variantes de dominio CC de Sr33 truncadas (equivalente a una parte truncada del dominio CC (CC1-125), el dominio CC completo (CC1-160) y el dominio CC-NB (CC1-225)) ya que tanto el cebo como la presa no pudieron detectar autoasociación del dominio CC de Sr33.

Ejemplo 7. Análisis de estructura-función de SR33

Como se describe en el Ejemplo 3, el polipéptido Sr33 contiene los dominios CC-NB-LRR. Para proteínas CC-NB-LRR, se cree que el dominio Cc es necesario para señalar el inicio de una respuesta hipersensible (HR), la región central NB-ARC está implicada en regulación proteica y el dominio LRR está implicado en reconocimiento de ligandos. Para someter a ensayo si este modelo era correcto para el polipéptido Sr33 y para diseccionar la contribución relativa de los subdominios presentes en Sr33 en la función proteica general, Sr33 se sometió a truncamiento de dominio o mutagénesis dirigida al sitio (SDM) de aminoácidos particulares. Los aminoácidos seleccionados para SDM dirigida correspondían todos a aminoácidos conservados en las mismas posiciones que se ha mostrado que son importantes para la función proteica de MLA10, un ortólogo de Sr33 de cebada.

El experimento se realizó usando el vector pTN con expresión proteica controlada por un promotor CaMV 35S. Este vector se transformó en la cepa GV3101 de Agrobacterium y se introdujo en plantas de N. benthamiana de tres semanas de edad mediante infiltración a presión de la superficie abaxial de las hojas. Los datos se obtuvieron 72 96 horas después de la inoculación.

El dominio CC de Sr33 señaliza HR en N. benthamiana

Sr33 se truncó en cinco disposiciones como se indica en la Figura 7 (n.os 1-5) y se generó un constructo genético para expresión de cada polipéptido truncado en el vector pTN. Se sometió al ensayo la capacidad de cada constructo para inducir HR en hojas de N. benthamiana, incluyendo el constructo para expresión del polipéptido de longitud completa de 961 restos de aminoácido (n.° 6 en la Figura 7). En este experimento, un vector vacío sirvió como control negativo mientras que el dominio CC de MLA10 (aminoácidos 1-160) actuó como control positivo para la inducción de HR. La inspección visual de las hojas inoculadas indicó que solo las versiones truncadas de Sr33 que contienen el dominio CC (es decir, 1. CC, 2. CC-NB, 3.CC-NB-ARC, pero no Sr33 de longitud completa), pudieron inducir una HR débil asociada a la función de Sr33. Por tanto, los aminoácidos 1-160 de los polipéptidos Sr33 y MLA10 (dominios CC) se expresaron bajo el control del promotor CaMV35S en el vector Gateway pBlN. Usando este vector particular, se observó una HR más fuerte, evidente, confirmando que el dominio CC de Sr33 era tanto necesario como suficiente para inducir HR en plantas.

Ejemplo 8. La mutagénesis d irig ida al s itio de Sr33 en F99 o D501 autoactiva SR33 mientras que K207 inactiva SR33

Los mutantes de Sr33 dirigidos al sitio se expresaron en hojas de N. benthamiana de la misma manera. La inspección visual indicó que Sr33 de longitud completa no pudo inducir una HR cuando se expresó en N. benthamiana. El polipéptido Sr33 contenía dos aminoácidos conservados, que cuando mutaron en MLA10, se ha mostrado que autoactivan la proteína FL. El primer aminoácido correspondiente en Sr33 fue una fenilalanina (F) en la posición 99 (F99) en el dominio CC y el segundo fue un ácido aspártico (D) en la posición 501 (D501) en el motivo MHD del dominio ARC. Además, Sr33 contenía otro aminoácido conservado que, al mutar en MLA10, había mostrado que inactivaba la proteína FL. Este aminoácido era una lisina (K) en la posición 207 (K207) en el bucle P del dominio NB. Cuando se sometió a ensayo en N. benthamiana, se encontró que individualmente las mutaciones F99E y D501V autoactivaban Sr33, proporcionando ambas una HR visible fuerte, mientras que K207R no tenía ningún efecto. Sin embargo, cuando se realizó la mutación K207R en combinación con la mutación F99E o D501V, se encontró que esta modificación atenuaba/inactivaba la actividad autoactivante.

Ejemplo 9. Discusión

El mapeo genético y físico de alta resolución descrito en el Ejemplo 1 reveló la presencia de un grupo de genes, cada uno codificando una proteína NB-LRR, que incluía al menos seis miembros del gen que abarcaban el locus Sr33. Los mutantes inducidos y los análisis de complementación confirmaron que un solo gen, AetRGAle, dentro del grupo era necesario y suficiente para conferir resistencia mediada por Sr33. Se identificó que un gen NB-LRR diferente, AetRGA2, estaba estrechamente relacionado con Sr33. Existe una evidencia creciente de que pares de genes NB-LRR diferentes funcionan juntos para mediar la resistencia a enfermedades frente a aislados de patógenos, como se informó para la roya de la hoja del trigo (Lr10), tizón del arroz (Pikm), marchitez bacteriana y mota bacteriana (RRS1/RPS4) así como mildiú velloso (RPP2) in Arabidopsis (Eitas y Dangl, 2010). En el caso de Sr33, los experimentos de silenciamiento génico mediante supresión del gen AetRGA2a adyacente no tuvieron ningún efecto en la resistencia mediada por Sr33, indicando que AetRGA2a no era necesario para la función del gen de resistencia. Cabe destacar que AetRGA2a tenía un extremo C-terminal novedoso con un dominio de subunidad de exocisto 70. Aunque se conocen fusiones de genes que implican proteínas NB-LRR y otros dominios de proteínas funcionalmente diversos como quinasas y factores de transcripción WRKY (Brueggeman et al., 2008; Narusaka et al., 2009), esta es la primera vez que se ha informado de una proteína fusionada a subunidad NB-LRR-Exocisto 70.

El análisis genético comparativo de la región Sr33 a través de los genomas A y D de trigo y la región cromosómica correspondiente en cebada reveló una conservación de la familia de genes de resistencia al moho de tipo Bpm (proteína de unión a ARN) y relacionada con MIa (Wei et al., 2002; Jordan et al., 2011). En cebada, todos los alelos MIa funcionales conocidos pertenecen a una clase de análogos de genes de resistencia (Seeholzer et al., 2010) del grupo mixto de genes en el locus MIa. Sr33 comparte una identidad de secuencia de hasta un 86 % con los alelos MIa en cebada y el progenitor T. monococcum de genoma A diploide. Hasta la fecha, solo se ha informado de resistencia específica de raza contra el mildiú polvoriento (Blumeria graminis) para el locus de cebada (HvMla) y T. monococcum (TmMla). Los ejemplos anteriores describieron que un gen relacionado en secuencia con MIa, concretamente, el gen Sr33 en el locus ortólogo en el genoma D de trigo, confería resistencia contra un patógeno diferente al mildiú, concretamente, la roya del tallo del trigo, Puccinia graminis. Estudios genéticos anteriores mapearon los genes Sr31 y SrR R de roya del tallo (ahora denominados Sr50) a los loci homólogos de miembros génicos relacionados con MIa de centeno encontrados en segmentos cromosómicos del cereal centeno introgresados en trigo (Mago et al., 2002). Es posible que Sr33, Sr31 y Sr50 constituyan un conjunto homólogo de un linaje de genes similares a MIa para resistencia a roya del tallo del trigo.

Se demostró que la capacidad inmunitaria intermedia de amplio espectro mediada por Sr33 funciona independientemente de las proteínas chaperonas HSP90, SGT1 y RAR1. El análisis VIGS no distinguió un estado de resistencia a roya del tallo alterado en el trigo. No se detectó interacción entre Sr33 y estas proteínas cuando se coexpresaron en un sistema de dos híbridos de levadura. Está bien establecido que la función adecuada de un subconjunto de proteínas vegetales NB-LRR tipo R depende de estas chaperonas. Se cree que tal asociación promueve plegamiento, maduración y estabilidad de proteínas R compatibles (Jordan et al., 2011). Los datos indicaron que Sr33 no requiere mantenimiento y/o regulación de estos componentes de la maquinaria celular para resistencia a roya del tallo.

El dominio CC de HvMLA10 forma homodímeros, un atributo necesario para las capacidades señalización de muerte celular de esta proteína (Maekawa et al., 2011). Además, MLA10 interactúa directamente a través de una interfaz de dominio CC con dos factores de transcripción W r KY (WRKY1/2) (Shen et al., 2007). Además, el dominio CC de MLA1 del trigo diploide T. monococcum puede interactuar directamente con HvWRKY1 (Jordan et al., 2011). Esto indicó que tras la activación de la proteína, el dominio CC de las proteínas de tipo R NB-LRR probablemente funciona como la arquitectura de señalización, iniciando y coordinando las respuestas inmunitarias posteriores. Usando tres variantes de dominio CC de Sr33 representativas de una parte truncada del dominio CC (CC1-125), el dominio CC completo (CC1-160) y el dominio CC-NB (CC1-225), los inventores no pudieron detectar autoasociación de CC de Sr33 en levadura. Esto indicó que los dímeros CC de Sr33 no se forman en levadura o que la homodimerización de CC no es una característica exclusiva de todas las proteínas R de tipo CC. Además, el dominio CC de Sr33 no interactuó con WRKY1/2 ni de cebada ni de Ae. tauschii.

Parecía que la variante Asp588Asn de un solo aminoácido encontrada en el haplotipo II de la accesión PI603225 no alteraba la función de resistencia a roya del tallo. En ensayos de alelismo que implican el fenotipo de aislamiento de múltiples patógenos de PI603225 y el donante original de Sr33, no se obtuvieron plantas susceptibles en la progenie, proporcionando un respaldo adicional de que los haplotipos I y II eran variantes que funcionaban ambos como alelos de resistencia.

REFERENCIAS

Abdullah et al. (1986) Biotechnology 4:1087.

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Bariana y Mcintosh (1993) Genome 36:476-482.

Barker et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2: 235-350.

Bernoux et al. (2011) Cell Host Microbe. 9:200-211.

Bevan et al. (1983) Nucl. Acid Res. 11: 369-385.

Bieri et al. (2004) Plant Cell 16: 3480-3495.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para identificar un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis que comprende:

i) obtener un polinucleótido aislado unido operativamente a un promotor, comprendiendo el polinucleótido que codifica un polipéptido aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2,

ii) introducir el polinucleótido en una planta,

2. El proceso de la reivindicación 1, en donde se aplican uno o más de los siguientes,

b) la planta es una planta de cereal tal como una planta de trigo,

c) el polipéptido es un polipéptido vegetal o mutante del mismo, y

3. Una planta transgénica que ha integrado en su genoma un transgén que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis, en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un célula de la planta, y en donde además el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y/o el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de Se Q ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

4. La planta de la reivindicación 3, en donde la Puccinia graminis es Puccinia graminis f. sp. Tritici tal como una raza del grupo Ug99.

5. La planta de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

6. La planta de acuerdo con la reivindicación 3 a 5, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos un 95 % idéntica a una o ambas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

7. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que comprende uno o más polinucleótidos exógenos adicionales que codifican otro polipéptido de resistencia a patógenos de plantas.

8. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, que es homocigótica para el polinucleótido exógeno.

9. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en donde la planta es una planta de cereal tal como una planta de trigo, y/o la planta crece en un campo.

10. Un método para producir una planta transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, comprendiendo el método las etapas de

ii) regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

11. Un método para identificar una planta que comprende un transgén que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere resistencia a Puccinia graminis, comprendiendo el método las etapas de

i) obtener una muestra de ácido nucleico de una planta, y

ii) cribar la muestra para la presencia o ausencia del polinucleótido,

en donde la presencia del polinucleótido indica que la planta es resistente a Puccinia graminis,

en donde además el polipéptido comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 87 % idéntica a una o ambas de

5 12 . U n a p a r t e d e p l a n t a d e l a p l a n t a t r a n s g é n i c a d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 3 a 9 , q u e h a i n t e g r a d o e n s u g e n o m a u n t r a n s g é n q u e c o m p r e n d e e l p o l i n u c l e ó t i d o e x ó g e n o c o m o s e d e f i n e e n l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 3 a 9.

13 . L a p a r t e d e p l a n t a d e l a r e i v i n d i c a c i ó n 12 , q u e e s u n a s e m i l l a .

10

14 . U n m é t o d o p a r a p r o d u c i r h a r i n a , h a r i n a i n t e g r a l , a l m i d ó n u o t r o p r o d u c t o o b t e n i d o a p a r t i r d e s e m i l l a s d e a c u e r d o c o n l a r e i v i n d i c a c i ó n 13 .

15 . U s o d e u n a p l a n t a d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 3 a 9 , o p a r t e d e l a m i s m a , c o m o a l i m e n t o 15 p a r a a n i m a l e s , o p a r a p r o d u c i r a l i m e n t o p a r a c o n s u m o a n i m a l o a l i m e n t o p a r a c o n s u m o h u m a n o .