CN107653341B

CN107653341B - 一种检测粗山羊草抗白粉病基因的kasp标记及应用

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Publication number: CN107653341B
Application number: CN201711161820.9A
Authority: CN
Inventors: 孔令让; 王宏伟; 唐恒; 胡立芹; 宋时洋
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2017-11-21
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2037-11-21
Also published as: CN107653341A

Abstract

本发明涉及小麦遗传学及其分子育种领域，尤其涉及粗山羊草抗白粉病基因功能标记的开发与应用。本发明在对粗山羊草抗白粉病基因Ml2147图位克隆的基础上，利用其候选基因特异的结构序列，开发了SDAU‑kasp2147功能标记，并利用180多份粗山羊草自然种质及遗传后代材料进行验证。结果证明，这本发明提供的功能标记具有快速、直接、高通量等特点，特异性高，可在较短时间内完成大批量材料中该抗病基因的筛选和表型预测工作，可有效服务于小麦抗白粉病育种工作。

Description

一种检测粗山羊草抗白粉病基因的KASP标记及应用

技术领域

本发明涉及小麦遗传学及其分子育种领域，尤其涉及一种检测粗山羊草抗白粉病基因的功能标记及应用。

背景技术

小麦白粉病是由小麦白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.tritici）引起的气传真菌病害，是世界范围内最重要的小麦病害之一，严重影响到小麦的品质和产量。近年来，随着耕作制度的调整和气候的不断变化，在我国西南、华北、西北和东北等几大主要麦区，均有发病日益严重的趋势。因此，防治小麦白粉病对改善小麦品质、提高小麦产量具有重要意义。

目前，国际上已正式命名的小麦抗白粉病基因有70余个。随着小麦白粉病菌生理小种变异等原因，早期发现的一些抗白粉病基因已丧失了基本抗性，比如：Pm1、Pm5、Pm7、 Pm9 、Pm19、 Pm4a。而有些抗白粉病基因，例如：Pm12、Pm13、Pm16、Pm18、Pm20，虽然对小麦白粉病菌表现较高抗性，但由于大多数和不良农艺性状紧密连锁，很难应用到实际育种当中。因此，发掘并利用小麦及其近缘植物中的抗白粉病基因，对于拓宽小麦抗白粉病的遗传基础，服务于小麦育种具有重要意义。

粗山羊草（Aegilopstauschii, 2n=14, DD），是普通小麦D基因组的供体，蕴含着丰富的抗病、抗逆基因，并且有容易向小麦转移利用的特点。粗山羊草2147经过多年多点的抗病性鉴定，发现其是对小麦白粉病持久免疫的抗源。小麦白粉病抗病性鉴定及遗传分析表明，2147携带一个单显性抗病基因，暂时将其命名为Ml2147。

分子标记是现代小麦育种的一种重要辅助手段。功能标记是利用与性状直接相关的功能基因内部特定区域的多态性序列开发的新型分子标记，具有针对性强、直接准确等筛选特点。因此，利用基因序列开发功能标记，对于将图位克隆的结果应用到实际育种、快速准确地筛选该基因遗传后代及其它种质资源具有重要意义。

发明内容：

发明人在对2147抗白粉病基因进行精细定位的基础上（图1），对该基因进行图位克隆并获得Ml2147的候选基因。通过对该候选基因的结构分析和验证，发明人推测该基因C端存在的结构变异有可能是导致该基因表现抗病性的关键区域，利用180份粗山羊草自然群体进行单倍型分析及表型验证，证实了这一推测（图2）。结合粗山羊草自然群体进行单倍型分析及表型验证的结果(图2)，发明人发现了1个该抗病基因特有的SNP位点，根据这一位点，发明人开发了1对KASP标记SDAU-kasp2147，利用自然群体和携带该基因的遗传群体验证了该标记的分型结果（图3）。

SDAU-kasp2147的引物序列为：

上游序列为：SDAU-kasp2147-F-Fam（抗病位点结合）：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAGCAGCACTCCTCCTAGG-3’，

SDAU-kasp2147-F-Hex（感病位点结合）：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAGCAGCACTCCTCCTAGA-3’；

下游序列为：SDAU-kasp2147-R:

5’-TGACAAGCGTGCTCTTACCAATCC-3’。

利用粗山羊草抗白粉病基因Ml2147的功能标记SDAU-kasp2147可以鉴定或检测Ml2147是否存在，其使用方法分别如下：

（1）以小麦或粗山羊草DNA为PCR扩增模板，以SDAU-kasp2147为引物，进行PCR扩增，反应体系约为5μl。上述反应体系具体包括：20ng/μl的DNA 2.5μl，2×KASP Master mix2.5μl,KASP Assay mix(上下游引物混合液) 0.07μl.置于384孔PCR仪扩增。

（2）PCR扩增程序为:94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃复性60s（每循环降低0.6℃），10个循环；94℃变性20s，55℃复性60s， 26个循环；15℃保存；

（3）PCR结束后，置于384孔荧光定量PCR仪检测PCR分型结果；

（4）分析鉴定，分型若为“Allele1/ Allele1”则具有该抗病基因，分型若为“Allele2/ Allele2”或者“×”，则没有该抗病基因。

本研究与现有技术相比有以下优点：

（1）本发明获得Ml2147的功能标记： SDAU-kasp2147；

（2）SDAU-kasp2147属于KASP标记，具有高通量、操作简便等特点，可用于大规模育种材料的高通量筛选，提高分子育种的效率。

附图说明：

图1为抗白粉病基因Ml2147精细定位的遗传连锁图与中国春缺失系遗传图谱的对比图，以及与粗山羊草、短柄草、水稻、高粱对应位置的共线性关系比对；

图2为利用粗山羊草自然群体进行单倍型分析的结果。“实线方框”中表示Ml2147特有的SNP碱基；“虚线方框”中表示在单倍型分析的过程中，发现凡是在该基因位置C端有结构变异的材料，均表现抗白粉病，因此，推测该区域有可能是导致抗病的一个关键位置；

图3（a）表示用已知基因型的粗山羊草自然群体验证SDAU-kasp2147的分型效果，（b）表示用SDAU-kasp2147扫描山农7064×2147 BC₃F₂后代的分型结果；

图4 利用山农7064与粗山羊草2147进行远缘杂交，通过连续回交及自交，获得不同世代的遗传后代。

具体实施方式

下面用实施例进一步描述本发明，以利于对本发明及其优点、效果更好的了解，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

实施例1 作图群体的构建及精细定位

1.1材料

以抗病粗山羊草2147为亲本与感病粗山羊草AL8/78杂交，得F₁，自交得4299株F₂，进一步自交，得其对应的F_2:3家系；

1.2方法

1.2.1F₂群体苗期白粉病抗性的鉴定

将F₂群体种植于6cm×6cm塑料小盆，放在光照培养箱内，条件设置为：温度19℃，湿度80%，光照2000LUX，12h;温度17℃，湿度80%，黑暗，12h。于一心一叶期用E09菌种接种。接菌方法为扫拂法。7-10天后调查病情。抗病性分级采用6级分类法：

0型，免疫，植株无病斑；

0；型，近免疫，有坏死反应

1型，高抗，病斑小（一般直径小于1mm）菌丝层依稀可见绿色叶片，偶见较大病斑，但仍透绿，产孢量极少；

2型，中抗，叶片病斑直径小于1mm，但菌丝层较厚不透绿，能产生一定量孢子；

3型，中感，叶片病斑多一般直径大于1mm，菌丝层厚产孢量大，但病斑不连片；

4型，高感，叶片病斑一般直径大于1mm，菌丝层厚，产孢量多，病斑连片。

抗病等级划分：0-2级归为抗病类型，3-4级归为感病类型。根据2147×感病粗山羊草AL8/78 F₂群体及对应F_2:3家系抗、感单株分离比例，通过对其抗病性鉴定及卡方检验，推测该基因为单显性抗病基因，暂时命名为Ml2147；

1.2.2 F₂群体的分子标记分析：

(1)总DNA提取采用CTAB法；

(2)抗、感病池的建立：选取抗病粗山羊草2147×感病粗山羊草AL8/78杂交组合F₂分离群体106株用于SSR分析和抗病基因的初定位；依据分离群体分组分析法（Bulkedsegregation analysis,BSA）,分别选取10株免疫单株（抗病反应等级为0）和10株高感单株（抗病反应等级为4）的DNA等量混合分别构建抗病池（BR）和感病池（BS）；

(3)多态性分子标记的筛选及连锁标记的开发：

①利用抗病亲本、感病亲本、抗病池和感病池对小麦D基因组的140对（1D-7D每条染色体选约20对）SSR标记进行多态性筛选，

②本试验在确定该基因染色体定位后，利用目前公布的普通小麦中国春的物理图谱及相关测序信息（https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/blast.php），在定位区间内设计32对SSR标记，验证与该基因的连锁性。

筛选标记多态性的具体步骤为:

a.以粗山羊草DNA为PCR扩增模板，以小麦D基因组的140对（1D-7D每条染色体选约20对）SSR标记为引物，进行PCR扩增，反应体系为15μl。上述反应体系具体包括：50-100ng/μl的DNA 2μl，1.5μl 10×PCR buffer（含Mg²⁺），1.2μldNTP，上下引物各1.0μl，0.15μl r-TaqDNA polymerase，8.15μl H₂O；

b.PCR扩增程序为:95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；

c.电泳为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将1μl的PCR产物和0.5μlLoadingBuffer混合均匀后点样，120V电泳3h，硝酸银染色拍照；

d.统计抗感亲本及抗感池的带型差异，分析连锁关系。

(4)遗传连锁图构建：利用在抗、感池中筛选的多态性分子标记和构建的F₂群体表型，进行基因型分析。利用Kosambi函数计算分子标记与目标基因的遗传距离（cM），并使用Joinmap 4 .0软件分析多态性标记与抗病基因的连锁关系，并构建遗传连锁图；

1.3结果

1.3.1在106株F₂群体中，其中有抗病单株有83株，感病有23株，χ²=0.68，表明抗、感的分离比符合3R:1S（如下表1所示）；

表1 抗、感杂交组合不同世代群体对白粉病菌E09的苗期抗性分离比

1.3.2 Ml2147的染色体定位

本试验选取抗病粗山羊草2147×感病粗山羊草AL8/78杂交组合F₂分离群体106株用于SSR分析和抗病基因的初定位；选取平均分布于小麦1D-7D染色体的140对SSR标记对抗感亲本进行多态性筛选，筛选出5对SSR标记：Xgpw298、Xcfd26、Xcfd12、Xgwm174、Xgdm153在抗感性状池之间存在多态性。用106株F₂分离群体验证证明以上5对基因均与抗病基因Ml2147连锁。经查询小麦微卫星标记遗传图谱，发现这5对标记都被定位在5DL上，因此，初步推断该基因位于粗山羊草5DL上。为进一步确定该定位结果，利用中国春以及中国春缺体-四体材料，对上述5对标记进行了扩增，结果将该目的基因初步定位在bin5DL5-0.76-1.00区间。

1.3.3 Ml2147的精细定位

通过筛选在定位区间内设计的SDAU51等32对SSR标记，发现其中有18对在抗感亲本中有多态性，与该基因连锁（图1）。用4299株F₂分离群体对以上连锁标记进行扫描，利用Kosambi函数计算分子标记与目标基因的遗传距离（cM），并使用Joinmap 4 .0软件分析多态性标记与抗病基因的连锁关系，最终得到Ml2147的精细定位连锁图（图1），其中，距基因最近的两侧标记分别为：上侧：SDAUJX13(0.1cM)，下侧：SDAUJX32(0.2cM)。

实施例2 Ml2147的图位克隆及功能标记的开发

2.1材料

利用精细定位过程中筛选到的9株关键重组体，进一步设计标记，加密连锁图。

2.2方法

2.2.1重组体苗期白粉病抗性的鉴定（具体方法见实施例1）

2.2.2开发标记，加密精细定位连锁图（开发及筛选标记具体方法见实施例1）

2.2.3开发功能标记

（1）在找到候选基因后，根据该基因序列信息，设计扩增该基因全长的引物2147- qc-1，该引物上游序列2147-qc-1F为：CGGATGGACGCGCCTTCG，下游序列2147-qc-1R为：GTACTCTAGTGGCACCTTAAACCGG。扩增180份粗山羊草自然群体中的该基因片段，测序比对。

扩增该基因的具体步骤如下：

a. 以小麦或粗山羊草DNA为PCR扩增模板，以2147-qc-1为引物，进行PCR扩增，反应体系为50μl。上述反应体系具体包括：50-100ng/μl的DNA 4μl，25μl 2×GC buffer（含Mg²⁺），4μldNTP，上下引物各1.0μl，1μl LA-Taq DNA polymerase，14μl H₂O；

b. PCR扩增程序为:95℃预变性5min；94℃变性30s，66℃复性30s，72℃延伸6mins，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；

c.电泳为2％的琼脂糖凝胶电泳，将50μl的PCR产物和5μl的Loading Buffer混合均匀后点样，120V电泳30min，紫外光下快速拍照；

d.将能扩出该基因片段的条带切胶、送样测序（因该引物在D基因组特异，所以在验证粗山羊草自然群体时，无需进行TA克隆）。

（2）通过对自然群体抗、感材料中该基因序列的比对、分析，发现抗病材料具有一个特有的SNP，并且在C端有明显的结构变异（图2）。利用这个特有的SNP，开发了功能标记SDAU-kasp2147，并利用粗山羊草自然群体，对该KASP标记的有效性进行了PCR验证。

具体PCR步骤如下：

SDAU-kasp2147的主要操作步骤：

a. 以小麦或粗山羊草DNA为PCR扩增模板，以SDAU-kasp2147为引物，进行PCR扩增，反应体系约为5μl。上述反应体系具体包括：20ng/μl的DNA 2.5μl，2×KASP Master mix2.5μl,KASP Assay mix(上下游引物混合液) 0.07μl.置于384孔PCR仪扩增。

b. PCR扩增程序为:94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃复性60s（每循环降低0.6℃），10个循环；94℃变性20s，55℃复性60s， 26个循环；15℃保存；

c. PCR结束后，置于384孔荧光定量PCR仪检测PCR分型结果；

d.分析鉴定，分型若为“Allele1/ Allele1”则具有该抗病基因，分型若为“Allele2/ Allele2”或者“×”，则没有该抗病基因。

2.2.4山农7064×2147 转移利用后代的创建

利用粗山羊草与普通六倍体小麦山农7064（即：SN7064）进行远缘杂交，经幼胚培养，得杂合F₁植株，经过轮回亲本SN7064连续回交、结合与该基因连锁的标记进行分子标记辅助选择，选出携带该基因片段的回交后代，作为抗病新种质，服务于育种工作。

2.3结果

2.3.1确定Ml2147的候选基因

通过对Ml2147的进一步定位，将该基因锁定在80Kb物理区间内。利用PCR重叠覆盖区等方法，得到该80Kb内的大部分序列信息。通过对该区间序列信息的分析，发现该区间内有一个与抗病相关的NBS-LRR基因，利用粗山羊草自然群体的表型和单倍型分析，推测该基因有可能是Ml2147的候选基因。

2.3.2扩增并分析该抗病基因的特殊结构

通过PCR扩增，发现Ml2147的基因全长为5761bp，而感病材料中AL8/78的该基因全长为5952bp。通过对180份自然群体材料中该基因序列的扩增，发现有57份材料具有该抗病基因。相比感病材料中的该基因结构，Ml2147具有一个特有的SNP，并且在基因的C端有明显的结构变异（图2）。

2.3.3 开发功能标记

利用抗病基因特有的SNP，开发了功能标记SDAU-kasp2147。

2.3.4利用自然群体和遗传后代验证2对功能标记的有效性

利用KASP标记SDAU-kasp2147扫描180份自然群体和远缘杂交回交后代BC₃F₂，其分型结果如图3（a）和图3（b）所示，结果表明，该引物分型效果明显，经与之前测序结果对比，证明该引物分型准确度达98％；

因此，通过上述验证结果，表明SDAU-kasp2147是Ml2147的特异功能标记，可直接用于对种质材料中的该基因的筛选和抗性表现的预测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种检测粗山羊草抗白粉病基因的KASP标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tgcagcagca ctcctcctag g 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgcagcagca ctcctcctag a 41

<210> 3

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Claims

1.一种检测粗山羊草抗白粉病基因的KASP标记，其特征在于：所述分子标记是 SDAU-kasp2147

SDAU-kasp2147的引物序列为：

上游序列为： SDAU-kasp2147-F-Fam：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctgcagcagcactcctcctagg-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

SDAU-kasp2147-F-Hex：

5’-gaaggtcggagtcaacggattgcagcagcactcctcctaga-3’；其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

下游序列为： SDAU-kasp2147-R:

5’-tgacaagcgtgctcttaccaatcc-3’；其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。