CN101128588A - 转基因玉米种子中增强的玉米醇溶蛋白减少 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氨基酸水平提升的转基因玉米种子、用于产生反义RNA抑制环的重组DNA构建体以及这种构建体和表达反义RNA抑制环的转基因植物的制备和使用方法。

Description

转基因玉米种子中增强的玉米醇溶蛋白减少
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2004年2月10日提交的临时申请60/543,157号、2004年2月10日提交的临时申请60/543,187号和2004年8月11日提交的临时申请60/600,859号、2005年2月10日提交的实用新型申请11/057062号的优先权，所有申请的全部公开内容在此引入作为参考。
序列表的引入
文件“53428B.ST25.txt”包含了计算机可读形式的序列表，有21kb(在MS-window中测量)，于2005年2月9日创建，位于随同提交的CDROM上，并在此引入作为参考。
发明领域
本发明公开了氨基酸水平提升的转基因玉米种子、用于产生反义RNA基因抑制环的重组DNA构建体以及这种构建体和表达反义RNA基因抑制环的转基因植物的制备和使用方法。
背景
与其它植物相比，或与营养学上基于牛奶或鸡蛋设定的“完美”蛋白质模式相比，某些植物的特定氨基酸水平低。根据这些标准，玉米的赖氨酸、甲硫氨酸和色氨酸水平低。在转基因植物中提高氨基酸水平的努力包括表达重组DNA，与天然基因相比，该重组DNA能高水平地编码氨基酸合成途径中的蛋白质。一个用于在玉米中产生提升水平赖氨酸的此类基因是编码细菌二氢吡啶二羧酸合酶的基因。使氨基酸水平达到更高的策略包括抑制氨基酸分解代谢途径中蛋白质的编码基因。
基因抑制包括用于抑制基因的转录或与该基因相应的mRNA的积累来阻止转录物翻译为蛋白质的任一种熟知的方法。更详细地说，在美国专利5,107,065(Shewmaker等)和美国专利5,759,829(Shewmaker等)中公开了通过在植物细胞中插入带有反义方向DNA的重组DNA构建体来调节基因表达从而进行基因抑制。如Redenbaugh等在“Safety Assessment of Genetically Engineered FlavrSavrTM Tomato，CRC Press，Inc.(1992)”中公开的，用这种用于基因抑制的反义方向DNA构建体转化的植物可包含整合型DNA，所述DNA是通过农杆菌介导转化而整合到植物中的、因若干拷贝转移DNA(T-DNA)的共同插入而排列成的反向重复。反向重复插入可构成T-DNA的一部分或全部，例如，T-DNA可含有完整或部分反义构建体的反向重复。当转化构建体是简单的反义DNA构建体时，对包含反向重复元件的插入DNA的筛选能够提高对基因沉默有效的转化事件的鉴定效率。
在美国专利5,283,184(Jorgensen等)和美国专利5,231,020(Jorgensen等)中公开了由带有有义方向DNA的插入重组DNA构建体产生的基因抑制。如Jorgensen等在MoL Gen.Genet，207：471-477(1987)中所公开的，在此类有义构建体通过农杆菌转化的植物中提供基因抑制的插入T-DNA，主要以反向重复结构构成。还可参见Stam等在The Plant Journal，12：63-82(1997)和De Buck等在Plant MoI.Biol.46 433-445(2001)的报道，他们利用分离法研究支持了Jorgensen的发现，即在许多事件中，基因沉默是由多聚的转基因T-DNA介导的，其中这些T-DNA以反向重复布置。当用简单的有义方向DNA构建体进行转化时，对包含反向重复元件的插入DNA的筛选能够提高基因沉默的效率。
用两套独立的转录单位同时从有义方向DNA和反义方向DNA进行RNA转录，也能有效地实施基因沉默，例如，Shewmaker等在美国专利5,107,065中公开的，在其实施例1中，制备了具备有义和反义aroA基因的双元载体。在国际公布说明书WO99/53050号(Waterhouse等)中公开了相似的构建体。还可参见美国专利6,326,193，其中将靶基因DNA与反向启动子操作性连接。
植物中的基因抑制可以通过下述转化构建体来实现：该构建体能产生至少能沿其部分长度形成双链RNA的RNA。在EP 0426195 A1(Goldbach等)中公开的植物基因抑制中，用于转录出发夹形RNA的重组DNA构建体将对烟草斑迹枯萎病毒的抗性提供给转基因植物。还可参见Sijen等，The Plant Cell，Vol.8,2277-2294(1996)，其公开了利用携带豇豆花叶病毒基因反向重复(反义接有义之后)的构建体在转基因植物中介导病毒抗性。还可参见国际公布说明书98/53083号(Grierson等)和相关的美国专利申请公布说明书2003/0175965 A1号(Lowe等)，其公开了利用包含前接5’非翻译区反向重复的基因编码序列的双链RNA构建体进行基因抑制。在国际公布说明书WO99/53050号(Waterhouse等)和国际公布说明书WO 99/49029号(Graham等)中还公开了用于通过靶基因的双链RNA在植物中引起转录后基因抑制的构建体。还可参见美国专利申请公布说明书2002/0048814 A1号(Oeller)，其中DNA构建体被转录为带有形成发夹的多聚(T)-多聚(A)尾的有义或反义RNA。还可参见美国专利申请公布说明书2003/0018993A1号(Gutterson等)，其中在有义或反义DNA之后接NOS基因3’非翻译区的反向重复。还可参见美国专利申请公布说明书2003/0036197 A1号(Glassman等)，其中用于减少靶mRNA表达的RNA包含与靶mRNA有同源性的区段和具有与内源RNA无关的互补RNA区的区段。
在美国专利6,506,559(Fire等)中公开了通过植物中产生双链RNA来抑制基因表达，例如抑制取食植物的线虫中的基因表达。在美国专利申请10/465,800(Fillatti)中公开了在植物中使用的多基因抑制载体。
通过表达包含与靶基因启动子DNA反向重复操作性连接的启动子的DNA构建体，可实施转录抑制，如启动子反式抑制。Mette等在The EMBO Journal，Vol.18，pp.241-148，(1999)和Mette等在TheEMBO Journal，Vol.19，pp.5194-5201-148，(2000)中公开了可用于此类通过启动子反式抑制介导的基因抑制的构建体，上述两篇文献都在此引入作为参考。
披露用于植物中基因抑制的材料和方法的所有上述的专利、申请和国际公布说明书在此引入作为参考。
发明概述
本发明提供可用于产生转基因生物体基因抑制用的反义方向RNA的方法和重组DNA构建体。在本方面的一个方面，用于抑制多个靶基因的重组DNA构建体从其5’至3’方向包含：与反义方向DNA元件操作性连接的启动子元件和有义方向DNA元件，其中有义方向DNA元件比反义方向DNA元件短，而且从有义方向DNA转录的有义方向RNA与从反义方向DNA元件转录的反义方向RNA的5’最前端互补，因此所转录的RNA形成用于抑制多个靶基因的反义方向RNA环。
可将有义方向DNA克隆作为反义方向DNA元件的5’最前端区段的反向重复。带有此类有义方向DNA的构建体被转录为RNA，该RNA形成具有双链RNA区段、在其末端闭合的反义方向RNA环，如图1所示。为了形成反义方向RNA环，互补的DNA元件宜不大于反义方向DNA元件长度的一半，优选不大于反义方向DNA元件长度的三分之一，如，不大于反义方向DNA元件长度的四分之一。重组DNA元件的总体长度是可变的。诸如，反义方向DNA元件可以由500-5000个核苷酸构成，而互补DNA元件可以由50-500个核苷酸构成。在许多情况中，为了允许反义方向RNA环形成，反义方向DNA元件超过有义方向DNA元件长度的两倍是有效的。
反义转录单位可被设计用于抑制多个基因，其中DNA被排列为带有两个或多个来自不同待抑制靶基因的反义方向元件，反义方向元件之后接互补的、如与反义方向元件的5’最前端至少部分互补的有义方向元件。
本发明还提供通过在植物细胞中提供可转录出反义RNA环的本发明重组DNA构建体来抑制基因表达的方法。在本发明的其他方面，诸如用于向植物提供除增强氨基酸水平之外的其它性状，待抑制的靶基因可以是植物基因、植物害虫基因、植物病原体基因或其组合。在本发明的构建体、方法和植物中，待沉默的靶基因可以是天然基因或外源基因，或者是下述生物体的基因：该生物体摄食或接触其细胞中包含本发明的环形反义RNA的植物之组织。植物病原体包括：病毒，如黄瓜花叶病毒；细菌，如斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)(玉米细菌性枯萎)；和真菌，如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)(大豆锈病真菌)。植物害虫包括：线虫，如大豆胞囊线虫和根结线虫；和各个目的昆虫，包括鳞翅目(Lepidoptera)(诸如欧洲玉米螟)、鞘翅目(Coleoptera)(诸如十一星瓜叶甲)和同翅目(Homoptera)(诸如蚜虫)昆虫。
附图简述
图1是可用于本发明的产生反义方向RNA环的重组DNA构建体的图示说明。
图2是显示使用本发明构建体产生的基因抑制的蛋白质印迹分析。
图3显示指示玉米醇溶蛋白含量的质谱谱图。
图4是用于本发明一个方面的载体构建体设计的图解。
图5所示为表明野生型种子和转基因种子中玉米醇溶蛋白含量的质谱谱图。
图6说明谷粒蛋白质含量与其游离氨基酸水平的相关性。
详细描述
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是重组DNA构建体的核苷酸序列，所述构建体用于在转基因植物中转录出可形成抑制一个或多个基因的反义方向RNA环。有关那些构建体元件的描述见表1和表2。
在此使用的“互补”是指由于排列的核苷酸的互补性准许C-G和A-T或A-U成键而能够杂交的多核苷酸，诸如DNA的有义链和反义链，或RNA的自身互补链。
在此使用的“载体”指能够在宿主细胞中复制和/或另一DNA区段与其操作性连接而导致该连接片段复制的DNA分子。质粒就是典型的载体。
在此使用的“转基因”生物体，诸如植物或种子，是其基因组已经由于含外源遗传物质或天然遗传物质的额外拷贝的重组DNA的掺入而被改变，诸如由于该生物体或祖先生物体的转化或重组而被改变的生物体。转基因植物包括通过转化法得到的原初植株的子代植株，包括用野生型植株或其它转基因植株培育转基因植株的子代。在本发明中特别关注的作物包括玉米、大豆、棉花、canola(油菜)、小麦、水稻、向日葵、红花和亚麻，但并不仅限于这些。关注的其它作物包括可生产蔬菜、水果、草和木的植物。
用于植物转化的重组DNA构建体
本领域技术人员可以容易地制备用于在转基因植物中产生环状反义RNA基因抑制剂的重组DNA构建体。通常，此类DNA构建体至少包含：启动子，其在待抑制靶组织中有活性；可转录DNA元件，其具有与待抑制靶基因的核苷酸序列互补的序列；和转录终止元件。所拷贝的、用于基因抑制构建体中可转录DNA的靶基因元件，可以是启动子元件、内含子元件、外显子元件、5’UTR元件或3’UTR元件。虽然从待抑制靶基因序列拷贝的DNA的最小长度被认为是约21或23个核苷酸，但优选较大的核苷酸区段，如可长至靶基因的全长。任一DNA区段的有效长度是在50-5000个核苷酸范围内，比方说长度为500-5000个核苷酸的反义方向DNA，而互补DNA元件的长度可以是50-500个核苷酸或更多。DNA元件可以包括基因的多个部分，诸如与UTR、外显子和内含子中相邻的或分隔的基因元件互补的核苷酸。根据需要，此类构建体还可包含其它调节元件和编码转运肽、信号肽、选择标记和可筛选标记的DNA。
参照图1，其图解显示了重组DNA构建体，它含有启动子元件、反义方向DNA元件(表示为“a/s DNA”)、互补的有义方向DNA元件(表示为“s DNA”)和提供多聚腺苷酸信号和位点的DNA(表示为“polyA位点”)。该DNA构建体可转录出含有反义方向RNA区段和与反义方向RNA区段之5’最前端互补的互补RNA区段的RNA。反义方向RNA的5’末端和3’末端能自我杂交，形成闭合反义方向RNA环的双链RNA区段。例如，如果被转录的反义方向DNA链的5’最前端核苷酸序列是5’-CGGCATA-，则从提供反义元件的源DNA克隆来的反向重复DNA的被转录链的3’最前端序列将是-TATGCCG-3’。由于这些序列，反义方向RNA环将从dsRNA区段的一边展延，如
5′-GCCGUAU---------
3′-CGGCAUA---------
反义方向DNA和其自身互补DNA可以是相邻的，或被载体DNA分隔，如被分隔载体装配用限制性位点的至多约100个核苷酸左右的载体DNA所分隔。
用市售材料和本领域技术人员已知的方法可以进行重组DNA构建体的组装。一种用于组建转化用DNA构建体和载体的有用技术是GATEWAYTM克隆技术(可以从Invitrogen Life Technologies获得，Carlsbad，California)，它利用来自λ噬菌体载体构建的整合酶att系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，取代了限制性核酸内切酶和连接酶。该LR克隆反应在美国专利5,888,732和6,277,608、美国专利申请公开说明书2001283529、2001282319和20020007051中公开，所有上述文献都在此引入作为参考。也由Invitrogen供应的GATEWAYTM克隆技术使用手册也对常规克隆任一所需DNA到含有可操作植物表达元件的载体中提供了简明的指导。
Aslanidis，C.等在Nucleic Acids Res.，18，6069-6074，1990和Rashtchian，A.等在Biochem.，206，91-97，1992中公开了可替代载体的构建方法，其利用不依赖于连接的克隆技术，其中带有5’单链末端和3’单链末端的DNA片段被连接到随后能在体内扩增的所需载体中。
大量的在植物细胞中有活性的启动子已在文献中得到描述。这些启动子包括存在于植物基因组中的启动子和其它来源的启动子，包括在根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带的胭脂碱合成酶(nos)启动子和章鱼碱合成酶(ocs)启动子、花椰菜花叶病毒启动子(caulimovirus)，如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaicvirus)或玄参花叶病毒的启动子。举例来说，请参阅以下文献：美国专利5,322,938和5,858,742，其公开了多种形式的衍生于花椰菜花叶病毒的组成型启动子(CaMV35S)；美国专利5,378,619，其公开了玄参花叶病毒(FMV)35S启动子；美国专利5,420,034，其公开了油菜籽蛋白启动子；美国专利6,437,217，其公开了玉米RS81启动子；美国专利5,641,876，其公开了水稻肌动蛋白启动子；美国专利6,426,446，其公开了玉米RS324启动子；美国专利6,429,362，其公开了玉米PR-1启动子；美国专利6,232,526，其公开了玉米A3启动子；美国专利6,177,611，其公开了组成型玉米启动子；美国专利6,433,252，其公开了玉米L3油质蛋白启动子；美国专利6,429,357，其公开了水稻肌动蛋白2启动子和内含子；美国专利5,837,848，其公开了根特异性启动子；美国专利6,084,089，其公开了冷诱导型启动子；美国专利6,294,714，其公开了光诱导型启动子；美国专利6,140,078，其公开了盐诱导型启动子；美国专利6,252,138，其公开了病原体诱导型启动子；美国专利6,175,060，其公开了磷缺乏诱导型启动子；美国专利6,635,806，其公开了coixin启动子；U.S.2002/0192813A1，其公开了可用于设计有效植物表达载体的5′、3′和内含子元件；U.S.2004/0216189A1，其公开了玉米叶绿体醛缩酶启动子；和U.S.2004/0123347A1，其公开了水缺乏诱导型启动子，所有这些文献在此引入作为参考。这些启动子和大量其它的在植物细胞中有功能的启动子都是本领域技术人员已知的，可用于本发明的重组多核苷酸中以在转基因植物细胞中提供所需基因的表达。
此外，这些启动子可经过改变，以便含有多个“增强子序列”以有助于提高基因表达。这些增强子在本领域是已知的。通过包含具有这种构建体的增强子序列，选定蛋白的表达可得以提高。这些增强子通常存在于在真核细胞中有功能的启动子的5’至转录起始点间，但是通常被插入到编码序列的上游(5′)或下游(3’)。在某些情况下，这些5’增强子元件是内含子。作为增强子特别有用的是水稻肌动蛋白1基因(见美国专利5,641,876)和水稻肌动蛋白2基因的5’内含子、玉米叶绿体脱氢酶基因内含子、玉米热休克蛋白70基因内含子(美国专利5,593,874)和玉米皱缩1基因。
在本发明的其它方面，为了使种子组成得到改善，需要在植物种子组织中充分表达。用于种子组成修饰的示例性启动子包括来源于种子基因的启动子，如油菜籽蛋白(U.S.5,420,034)、玉米L3油质蛋白(U.S.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等(1997)TransgenicRes.6(2)：157-166)、球蛋白1(Belanger等(1991)Genetics 129：863-872)、谷蛋白1(Russell(1997)同上述)和过氧化物氧还蛋白抗氧化剂(Perl)(Stacy等(1996)Plant Mol Biol.31(6)：1205-1216)。
依据本发明制备的重组DNA构建体通常包括3’元件，它通常包含多聚腺苷酸信号和位点，特别是当该重组DNA用于蛋白表达以及基因抑制时。众所周知的3′元件包括：来自根瘤土壤杆菌基因的3′元件，如nos 3′、tml 3′、tmr 3′、tms 3′、ocs 3′、tr73′，诸如公开于美国专利U.S.6,090,627中的元件，该文献在此引入作为参考；来自植物基因的3′元件，如来自小麦(Triticum aesevitum)热休克蛋白17(Hspl73′)、小麦泛蛋白基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β-微管蛋白基因的3′元件，上述元件公开于美国专利申请公开说明书2002/0192813A1中，该文献在此引入作为参考；和豌豆(Pisum sativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs3′)和来源于宿主植物基因的3′元件。
基因抑制重组DNA构建体还可以与赋予农学上关注的其它性状的DNA叠加，后者包括提供除草剂抗性或抗虫性的DNA，如利用来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)的基因提供抗鳞翅目(lepidopteran)、共翅目(coliopteran)、同翅目(homopteran)、半翅目(hemiopteran)和其它昆虫的抗性。对其抗性在植物中有用的除草剂包括：草甘膦除草剂、膦丝菌素除草剂、oxynil除草剂、咪唑啉酮除草剂、二硝基苯胺除草剂、吡啶除草剂、磺酰脲除草剂、双丙氨酰膦除草剂、氨磺酰除草剂和草丁磷除草剂。本领域普通技术人员能够实现提供叠加的性状(参照美国专利申请公开说明书2003/0106096A1和2002/0112260A1、美国专利5,034,322、5,776,760、6,107,549和6,376,754)；和昆虫/线虫/病毒抗性，可参考美国专利5,250,515、5,880,275、6,506,599、5,986,175和美国专利申请公开说明书2003/0150017A1。上述所有文献在此引入作为参考。
转化方法
用重组DNA转化植物细胞的许多方法是本领域已知的，并可以用于本发明。对于植物转化，两种通常使用的方法是农杆菌介导转化和微粒轰击。微粒轰击法在美国专利5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、5,914,451(大豆)、6,160,208(玉米)、6,399,861(玉米)和6,153,812(小麦)中有说明，农杆菌介导转化在美国专利5,159,135(棉花)、5,824,877(大豆)、5,591,616(玉米)和6,384,301(大豆)中有描述，上述所有文献在此引入作为参考。对于基于根瘤土壤杆菌的植物转化系统而言，在转化构建体上存在的附加元件包括T-DNA左右边界序列，以促进重组多核苷酸掺入到植物基因组中。
一般来说，将重组DNA随机地(即在非特异性位置)引入靶株系的基因组是有效的。在特殊情况下，靶向重组DNA插入以达到位点特异性整合可能是有用的，诸如，用以取代基因组中现存的基因、使用植物基因组中现存的启动子、或在已知对基因表达有活性的预定位点插入重组多核苷酸。现有的已知在植物中起作用的几个位点特异性重组系统包括在美国专利4,959,317中描述的cre-lox和美国专利5,527,695中描述的FLP-FRT，这两篇文献都在此引入作为参考。
本发明的转化方法优选在培养基上和受控环境中的组织培养物中实施。“培养基”是指用于在体外，即在完整的活生物体之外，使细胞生长的众多营养物的混合物。受体细胞靶包括但不受限于：分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚和配子细胞如小孢子、花粉、精子和卵细胞。设想了任何能再生可育植株的细胞都可用作受体细胞。愈伤组织可以由包括但不受限于未成熟胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等等的组织源引发。能增殖为愈伤组织的细胞也是遗传转化用的受体细胞。本发明的制备转基因植物的实际转化方法和材料，诸如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化和随后可育转基因植物的再生，都在美国专利6,194,636和6,232,526中公开，所述文献在此引入作为参考。
可从可育的转基因植物收获转基因植物的种子，并将其用于培育本发明转化植物的后代世系，包括用于筛选农学性状增强的植物的杂交株系。除了用重组DNA直接转化植物外，还可以通过将带有重组DNA的第一植株与无该DNA的第二植株杂交来制备转基因植物。例如，可将重组DNA导入适合转化的第一株系以产生转基因植物，该转基因植物可与第二株系杂交，使该重组DNA渐渗进入第二株系。含有能提供增强农学性状(如产量提高)的重组DNA的转基因植物，可与含有赋予另一性状(如除草剂抗性或抗虫性)的其它重组DNA的转基因株系进行杂交，从而产生含有赋予两种性状的重组DNA的子代植株。通常，在这种用于组合性状的育种中，提供额外性状的转基因植物是雄性系，而携带基础性状的转基因植物是雌性系。这种杂交的子代将发生分离，因而一些植株携带有两个亲本性状的DNA，而一些植株携带一个亲本性状的DNA；这些植株可以用与亲本重组DNA相关联的标记来鉴别。携带两个亲本性状的DNA的子代植物可以与雌性亲本系进行多次回交，如通常6-8次，产生子代植物，它的基因型与一个原始转基因亲本系基本相同，但是其含有另一个转基因亲本系的重组DNA。
在实施转化时，在任一次转化实验中，通常将DNA仅导入少量的靶细胞中。标记基因用于提供有效的系统，来鉴定由于接受并整合转基因DNA构建体到其基因组中而被稳定地转化的细胞。优选的标记基因提供赋予对选择剂(如抗生素或除草剂)抗性的选择性标记。本发明的植物可对其有抗性的任一除草剂，都可用作选择标记试剂。使潜在的转化细胞暴露于该选择剂。一般说来，在存活细胞群体中将有赋予抗性的基因整合于其中并以足以允许细胞存活的水平表达的那些细胞。可对细胞进一步测试以确认外源DNA稳定整合。常用的选择性标记基因包括赋予对抗生素或除草剂的抗性的基因，抗生素如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4)，除草剂如草丁磷(bar或pat)和草甘膦(aroA或EPSPS)。这些可选择标记的实例在美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中有说明，所有上述文献在此引入作为参考。还可使用能提供目测鉴定转化子的筛选标记，诸如表达有色或荧光蛋白质如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基因，或者表达β-葡萄糖苷酶的基因或β-葡糖醛酸酶基因(GUS)，其各种显色底物是已知的。
能经受得住接触选择剂的细胞，或在筛选测验中记录为阳性的细胞，可以在再生培养基中培养并成熟为植株。在转移至用于成熟的温室或生长室之前，发育中的小植株可以被转移至植物生长混合物，并经健化，如在约85％相对湿度、600ppm CO2和25-250微爱因斯坦m-2s-1的光照的环境受控室中健化。在鉴定转化体后，让植物再生约6周至10个月，情况取决于起始组织。植株可以用本领域技术人员已知的常规植物育种法授粉，产生种子，如转基因玉米通常使用自花授粉。可对该再生转化植株或其子代种子或植物进行重组DNA表达的测试和增强农学性状是否存在的筛选。
转基因植物和种子
与对照植物比较，由本发明提供的转基因植物种子发育产生具有增强性状的转基因植物。通过筛选转化植株或子代种子中的增强性状，鉴定带有增强性状植物的这类种子。为保证效率，设计了一种筛选程序来评价含有重组DNA的多重转基因植物(事件)，如来自2-20次或更多次转基因事件的多重体植物。
由此处提供的转基因种子发育的转基因植物显示出引起产量增加的改善的农学性状或其它增加植物价值的性状，例如种子品质改善。特别感兴趣的是是由于以下原因而产量提高的植物：植物生长和发育改善、胁迫抗性、种子发育改善、光应答反应提高、花粉发育改善或者碳和/或氮代谢改善。
对于能产生种子和子代植物的可育转基因植物而言能经受得住的许多转基因事件，不会显示出增强的农学性状。必需进行筛选，以通过各种测定方法评估该性状以检测出增强的农学性状，从本文描述的转化植物群体中鉴别带有增强农学性状的转基因植物。这些测定方法也可以采取许多方式，包括但不受限于用于检测植物在化学组成、生物量、生理特性、形态结构变化的分析。
实施例1
本实施例说明转化载体的制备，该转化载体可用于将本发明的重组DNA构建体插入到转基因植物中来实践本发明的方法。
LKB/SDH基因编码赖氨酸酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶(SDH)的前体蛋白，这两种酶存在于赖氨酸分解代谢途径中。对LKR的抑制表现在赖氨酸含量的改变，如含量增加。通过在植物中表达重组DNA构建体可实施LKR抑制，其中该重组DNA构建体能产生从反义方向LKR DNA和有义方向LKR DNA转录的、形成反义方向RNA环的稳定化反义RNA。
制备在来自根瘤土壤杆菌的左右边界间含有两个转录单位的转化载体。一个用于标记的转录单位包含：
(a)水稻肌动蛋白启动子和水稻肌动蛋白内含子的DNA，
(b)来自拟南芥(Arabidopsis)EPSPS的叶绿体转运肽的DNA，
(c)根瘤土壤杆菌aroA(草甘膦抗性标记)的DNA，和
(d)根瘤土壤杆菌NOS终止子的DNA，
另一个用于LKR基因抑制的转录单位包含：
(a)玉蜀黍(Zea mays)GLB1启动子的DNA，
(b)玉蜀黍ADH1内含子的DNA，
(c)玉蜀黍LKR的反义方向DNA片段，
(d)玉蜀黍LKR的有义方向DNA片段，和
(e)玉蜀黍GLB1终止子的DNA。
SEQ ID NO：1是包含上面描述的标记和基因抑制元件的转化载体的DNA序列。有关SEQ ID NO：1中所含该转化载体元件的描述见下表1。
表1
SEQ ID NO：1的碱基  DNA区段的描述
  1-357  根瘤土壤杆菌右边界
  376-1744  水稻肌动蛋白启动子和水稻肌动蛋白内含子的DNA
  1784-2011  根瘤土壤杆菌EPSPS叶绿体转运肽的DNA
  2012-3379  根瘤土壤杆菌aroA(草甘膦抗性标记)的DNA
  3395-3647  根瘤土壤杆菌NOS终止子的DNA
  3691-4686  玉蜀黍Glb1终止子的DNA
  4692-5145  玉蜀黍LKR的有义方向DNA元件
  5152-6118  玉蜀黍LKR的反义方向DNA元件
  6123-6680  玉蜀黍ADH1内含子的DNA
  6687-8082  玉蜀黍GLB1启动子的DNA
  8149-8590  根瘤土壤杆菌左边界
用以表1中所列元件制备的载体转化玉米植物组织。利用农杆菌介导转化，得到了转基因玉米植株。培育来自两个独立转基因插入事件的转基因植物，产生F1代种子。分析来自每一事件的六粒成熟种子以确定转化和LKR抑制是否成功。切开成熟的转基因种子以提取蛋白质并用蛋白质印迹分析法进行分析。参见图2，与野生型比较，来自其中一个事件的种子显示LKR没有减少；而来自另一事件的种子显示出分离(1∶1半合型∶野生型)，因为与野生型比较，六粒种子中的三粒显示出LKR显著减少。
实施例2
本实施例说明可用于将本发明的重组DNA构建体插入到转基因植物中而实施本发明方法的宽范围的实施方案。用以下DNA元件制备转化载体，其中：
(a)“pGcx”是指来源于Coix lacrymaa-jobi的γ-coixin基因的启动子DNA；
(b)“pZ27”是指来源于玉蜀黍γ-玉米醇溶蛋白基因的启动子DNA；
(c)“pZ27t”是指在pZ27的3’区域有59个核苷酸的前导序列缺失的启动子DNA；
(d)“Z19as”是指来自玉蜀黍19千道尔顿α-玉米醇溶蛋白基因之编码序列的351个核苷酸反义方向区段的DNA；
(e)“Z19s”是指来自玉蜀黍19千道尔顿α-玉米醇溶蛋白基因之编码序列的351个核苷酸有义方向区段的DNA，是Z19as的反向重复；
(f)“Z22as＂是指来自玉蜀黍22千道尔顿α-玉米醇溶蛋白基因之编码序列的789个核苷酸反义方向区段的DNA；
(g)“Z22asL”是指来自玉蜀黍22千道尔顿α-玉米醇溶蛋白基因之编码序列的785个核苷酸反义方向区段的DNA；
(h)“Z22asSI”是指来自玉蜀黍22千道尔顿α-玉米醇溶蛋白基因之编码序列的789个核苷酸反义方向区段的DNA，其含有在非配对区域插入的来自玉蜀黍GB 1基因内含子3的长520个核苷酸的可剪接内含子；
(i)“Z22s”是指来自玉蜀黍22千道尔顿α-玉米醇溶蛋白基因之编码序列的289个核苷酸有义方向区段的DNA；是Z22as 5’末端的反向重复；和
G)“TE9”是指来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因的有义方向多聚腺核苷酸信号和位点的DNA。
参见表2和SEQ ID NO：2，除了用包含下图所示元件的转录单位取代用于LKR基因抑制的转录单位外，使用实施例1中的方法制备了包含“构建体2a”的转化载体：
“构建体2a”pZ27-Z19as-Z22asL-Z22s-Z19s-TE9
表2
  SEQ ID NO：2的碱基  DNA区段的注释
  1-357  根瘤土壤杆菌右边界
  376-1744  水稻肌动蛋白启动子和水稻肌动蛋白内含子的DNA
  1784-2011  根瘤土壤杆菌EPSPS叶绿体转运肽的DNA
  2012-3379  根瘤土壤杆菌aroA(草甘膦抗性标记)的DNA
  3395-3647  根瘤土壤杆菌NOS终止子的DNA
  3479-4391  豌豆RbcS2终止子的DNA
  4398-4748  Z19s的DNA
  4755-5043  Z22s的DNA
  5050-5835  Z22asL的DNA
  5842-6192  Z19as的DNA
  6204-7305  玉蜀黍Z27启动子的DNA
  7353-7794  根瘤土壤杆菌左边界
转化玉米愈伤组织，选择有单拷贝转化载体的事件以培育为植株。在29个单拷贝事件中，有26个培育出的植株的种子显示出19千道尔顿α-玉米醇溶蛋白和22千道尔顿α-玉米醇溶蛋白显著减少。
使用表3所示元件，用类似方法制备了其它的转化载体。
表3
  构建体2b1   pGcx-Z19as-Z22asSI-Z22s-Z19s-TE9
  构建体2b2*   pGcx-Z19as-Z22asSI-Z22s-Z19s-TE9
  构建体2c   pZ27-Z19as-Z22asSI-Z22s-Z19s-TE9
  构建体2d   PZ27t-Z19as-Z22asSI-Z22s-Z19s-TE9
  构建体2e   PZ27-Z19as-Z22asL-Z19s-TE9
*构建体2b2被插入到还包含有用于表达另一个基因的转录单位的转化载体中，在该转录单位中具有邻接pGcx的启动子。
在表4中报告了从单拷贝事件培育的植株所产生的种子中α-玉米醇溶蛋白被抑制的效率，表中报告了与所测试的每一种构建体产生的转基因事件总数目相比α-玉米醇溶蛋白减少的转基因事件的数目。玉米醇溶蛋白减少的表型可以通过MALDI-TOF MS(基质辅助激光解析飞行时间质谱)分析来观察。图3是证明玉米醇溶蛋白减少的典型的谱图。
表4
  构建体   19kDα-玉米醇溶蛋白   19和22kD α-玉米醇溶蛋白
  2a   26/29   26/29
  2b1   0/21   0/21
  2b2   5/7   0/7
  2c   20/21   18/21
  2d   7/8   1/8
  2e   12/14   2/14
实施例3
本实施例说明在带有构建体2a(pMON73566；表2和图4A)和构建体2e(pMON73566；表3、表5和图4B)的转基因植物中玉米醇溶蛋白减少以及由从单拷贝事件培育的植株所得的谷粒的油脂、蛋白质和氨基酸分布型，如表4所报告的。
参见表5和SEQ ID NO：2，除了用包含下图所示元件的转录单位取代用于LKR基因抑制的转录单位外，使用实施例1中的方法制备了包含“构建体2e”的转化载体：
“构建体2e”PZ27-Z19as-Z22asL-Z19s-TE9
表5
  SEQ ID NO：2的碱基  DNA区段的注释
  1-357  根瘤土壤杆菌右边界
  376-1744  水稻肌动蛋白启动子和水稻肌动蛋白内含子的DNA
  1784-2011  根瘤土壤杆菌EPSPS叶绿体转运肽的DNA
  2012-3379  根瘤土壤杆菌aroA(草甘膦抗性标记)的DNA
  3395-3647  根瘤土壤杆菌NOS终止子的DNA
  3479-4391  Pisum sativum的RbcS2基因终止子的DNA
  4398-4748  Z19s的DNA
  4750-5535  Z22asL的DNA
  5542-5892  Z19as的DNA
  5904-7003  玉蜀黍Z27启动子的DNA
  7353-7794  根瘤土壤杆菌左边界
转化玉米未成熟胚，选择有单拷贝转化载体的事件以培育为植株。在14个单拷贝事件中，有2个培育出的植株的种子显示出19千道尔顿α-玉米醇溶蛋白和22千道尔顿α-玉米醇溶蛋白两者都显著减少(表4)。
玉米醇溶蛋白减少
在带有pMON73567(其含有针对19kD和22kD α-玉米醇溶蛋白两者基因序列的dsRNA)的转基因植物中，29株中有26株显示出19kD和22kD α-玉米醇溶蛋白两者的积蓄量都减少(表4，构建体2a；图4A；图5B)。另外，在带有pMON73566(其含有仅针对19kDα-玉米醇溶蛋白基因序列的dsRNA，而将22kDα-玉米醇溶蛋白基因序列用作所述环)的转基因植物中，14株中有2株显示出19kD和22kDα-玉米醇溶蛋白两者的积蓄量都减少(表4，构建体2e；图4B；图5B)。10株其它的pMON73566事件大多表现出19kD α-玉米醇溶蛋白减少(表4，构建体2e；图4B；图5C)。从每种构建体挑选出2个代表性事件用于进行到下一世代，以收集纯合玉米穗用于组成分析。选择了包含构建体pMON73567的事件M80442和M82186以及包含构建体pMON73566的事件M80780和M80791。M80442、M82186和M80791表现出19kD和22kD α-玉米醇溶蛋白两者都减少，而M80780只表现出19kD α-玉米醇溶蛋白减少。
含油量
将来自2种减少玉米醇溶蛋白的构建体pMON73566和pMON73567的4个事件(M80442、M82186、M80780和M80791)种植在大田，通过分子测定法检测接合性。利用湿法化学油提取法测定了纯合转基因阳性玉米穗和对照玉米穗的谷粒中的油脂。称量约100mg研碎的样品，置于半填充砂的11ml压力池中。再加入额外的砂将池填满，将一张滤纸放在顶部，用螺旋帽盖上该池。然后按照厂商的方案，将池置于the Dionex Accelerated Solvent Extractor(Dionex，Sunnyvale，CA)的圆盘传送带上。用石油醚在1000psig(磅每平方英寸表压)和105℃下经过3个提取步骤进行油脂的提取。将最终提取产物加到预先称量过的小瓶中。在氮气流或空气流下于37℃蒸发溶剂2小时，然后称量小瓶。样品含油量的分析一式三份进行。对照谷粒的含油量平均为3.8％(表6)。转基因阳性谷粒的平均含油量范围从4.0％至5.2％。所有4个转基因事件种子的平均含油量呈现比野生型植物种子的平均含油量有所增加；M82186事件的含油量增加被认为是统计学上显著的。
表6
谷粒的组分分析和大小
  ％+SD a   野生型   pMON73566   pMON73567
  LH244   M80780   M80791   M80442   M82186
  油脂b   3.8±0.3   4.1±0.2   4.4±0.1   4.0±0.5   5.2±0.5
  蛋白质   9.6±1.1   8.7±1.0   9.9±1.2   9.3±1.0   10.0±0.7
  淀粉   70.4±0.9   68.7±0.4   67.3±0.3   68.5±0.6   67.8±1.0
  水份   9.0±0.4   10.5±0.2   10.4±0.3   10.5±0.2   10.5±0.7
  密度   1.31±0.00   1.20±0.01   1.20±0.02   1.20±0.01   1.21±0.01
  大小c   24.9±1.4   24.3±2.0   24.0±0.9   23.9±1.4   23.2±2.2
表6，油脂、蛋白质和淀粉含量的计算是基于干物质。除油脂外，每个玉米穗的堆积谷粒(bulked kernels)的近似含量用近红外线透射(NIT)分析。b含油量是用湿化学法得到。粗体数字表示用Dunnett氏检验与LH244数字有统计学差异(α＝0.05)。a数据是平均值±标准差。c大小的测量是以克计算的100颗谷粒的重量。
氨基酸分布型
用靶向19kDα-玉米醇溶蛋白的反义构建体转化的转基因植物，展现出成熟玉米种子中赖氨酸含量增加高至35％(Huang等，2004；Huang等，2005)。在包含靶向19kD和22kD α-玉米醇溶蛋白两者的pMON73567和pMON73566构建体的转基因植物中，赖氨酸含量的增加明显更大。如表7所示，在所分析的事件中，在M80780中观察到赖氨酸含量增加最少，为66％((4035ppm转基因-2438ppm野生型)/2438ppm野生型)，在M80791中发现赖氨酸含量增加最多，为105％((5003ppm转基因-2438ppm野生型)/2438ppm野生型)。相似地，与野生型LH244比较，转基因植物的色氨酸含量高得多(表7)。
表7
研碎谷粒的总氨基酸分析
  Ave±SDa   野生型   pMON73566   pMON73567
  LH244   M80780   M80791   M80442   M82186
  Ala   6687±594   5497±631   6417±855   5862±999   6458±322
  Arg   4342±293   6060±708   7313±1048   6665±1203   7165±655
  Asx   5555±377   8928±1651   11977±2034   10253±2803   11143±886
  Glx   17788±1623   15873±2421   18610±2762   16860±3617   18603±1322
  Gly   3400±166   4537±463   5377±770   4973±783   5290±410
  His   1498±126   2350±234   2253±441   2305±518   2470±160
  lle   3265±255   3030±368   3700±678   3373±587   3578±261
  Leu   11265±1074   7318±788   8327±1106   7718±1264   8270±497
  Lys   2438±132   4035±574   5003±866   4533±780   4800±443
  Phe   3760±282   3032±295   3637±506   3288±571   3455±260
  Ser   4067±364   4235±465   4620±425   4355±779   4785±325
  Thr   3062±226   3572±406   4047±446   3783±676   4130±279
  Trp   598±48   877±117   1087±158   940±201   1040±96
  Tyr   3720±307   3430±414   4093±432   3652±624   4045±270
  Val   4710±325   5312±598   6553±1068   5977±1030   6293±483
  总和   76155±5996   78087±10057   93013±12760   84535±16220   91553±6286
  Lys％(P)D   2.83±0.23   5.23±0.17   5.62±0.29   5.40±0.37   5.33±0.28
  Trp％(P)D   0.69±0.05   1.14±0.04   1.22±0.03   1.12±0.11   1.15±0.05
  Leu％(P)D   13.00±0.34   9.51±0.15   9.38±0.12   9.21±0.56   9.20±0.34
表7，样品是各个玉米穗堆积谷粒的研碎物。a数据(ppm)是玉米穗的平均值，用事件±标准差表示。测量了每一个事件的4个同源玉米穗。这些数据以表6中所测量的未扣除水份的蛋白质的百分比表示。粗体数字表示用Dunnett氏检验与LH244数字有统计学差异(α＝0.05)。Asx，天冬氨酸和天冬酰胺；Glx，谷氨酸和谷酰胺。
在于这些转基因植物种子中显示出显著增加的游离氨基酸中，有天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酸(表8)。，业已表明，这些游离氨基酸的积累量增加当CordapA存在时能增强赖氨酸生物合成(Huang等2005；Monsanto专利申请11/077089，于2005年3月10日提交)。
表8
研碎谷粒的游离氨基酸分析
  Ave±SDa   野生型   pMON73566   pMON73567
  LH244   M80780   M80791   M80442   M82186
  Ala   95±39   114±73   194±91   172±103   313±122
  Arg   50±24   92±64   121±40   110±53   160±38
  Asn   232±40   2341±667   3726±1102   2844±1184   2995±402
  Asp   143±30   692±386   1306±375   1040±479   1323±207
  Glu   256±33   582±492   1064±472   823±670   1207±119
  Gln   85±56   182±186   270±180   255±264   319±40
  Gly   18±6   25±13   37±13   31±15   44±7
  His   24±4   47±21   79±25   63±27   76±5
  IIe   13±5   18±12   25±8   21±9   36±9
  Leu   10±3   15±14   25±11   19±14   34±10
  Lys   25±12   40±26   66±39   57±40   70±11
  Phe   37±30   19±12   34±8   25±11   40±11
  Ser   50±21   69±41   115±50   88±53   176±76
  Thr   16±6   46±41   84±36   60±46   110±29
  Trp   8±1   17±5   23±4   21±5   25±1
  Tyr   34±6   94±52   163±18   120±48   182±52
  Val   33±10   46±32   76±29   62±33   101±26
  总和   1134±259   4447±1962   7417±2334   5819±3052   7225±336
表8，样品是各个玉米穗堆积谷粒的研碎物。a数据(ppm)是玉米穗的平均值，用事件±标准差表示。测量了每一个事件的4个同源玉米穗。粗体数字表示用Dunnett氏检验与LH244数字有统计学差异(α＝0.05)。
蛋白质含量
认为天冬酰胺合成酶的组成型表达通过将游离氨基酸通量从营养组织供应到发育的玉米穗中，增加玉米种子中的蛋白质含量。这些玉米醇溶蛋白降低系不仅游离氨基酸水平提高(表8)，而且其蛋白质积累量也与游离氨基酸的水平成比例(表6)。这些结果提示，将玉米醇溶蛋白降低和天冬酰胺合成酶表达结合可能有协同效应，这可能导致玉米蛋白质的质和量两者都得到改善。
本发明设想了应用来自其它玉米醇溶蛋白(包括但不限于19kD和22kD α-玉米醇溶蛋白、16kD和27kDγ-玉米醇溶蛋白、10kD δ-玉米醇溶蛋白和15kD β-玉米醇溶蛋白中的其它成员)的反义方向DNA元件和有义方向DNA元件，作为用于抑制多于一个基因的转录或者与这些基因相应的mRNA积累从而阻止这些转录物翻译为蛋白质的方法。特别是，设想的α-玉米醇溶蛋白包括在19kD大小范围的所有变异体和在22kD大小范围的所有变异体。
在此公开和要求保护的所有材料和方法都可以按照以上公开内容的指示进行制造和使用，而无需过多的实验。虽然本发明的材料和方法是以优选实施方案和说明性实施例来描述，但是对本领域技术人员来说，显然在不偏离本发明的理念、精神和范围的情况下，可对本文所述的材料和方法应用变体。对本领域技术人员显而易见的所有相似的替代物和改变均被视为落入所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和理念内。

Claims (18)

1.用于抑制多个玉米醇溶蛋白靶基因的重组DNA构建体，其以5′至3′方向包含：启动子元件，其与来自多个玉米醇溶蛋白靶基因的多个反义方向DNA元件操作性连接；反义方向DNA元件，其以5′至3′方向命名为元件1、元件2；和来自多个玉米醇溶蛋白靶基因的多个有义方向DNA元件，其以5′至3′方向命名为元件3、元件4；其中反义方向DNA元件2在其3′端至少有一部分序列与其自身或与有义方向DNA元件3不互补，并且其中由有义方向DNA元件转录的有义方向RNA与由反义方向DNA元件转录的反义方向RNA元件的5′最末端互补。
2.权利要求1中所述的重组DNA构建体，其中反义方向DNA元件1和2来自两个不同的待抑制靶基因，有义方向DNA元件3和4自两个不同的待抑制靶基因。
3.权利要求1中所述的重组DNA构建体，其中反义方向DNA元件1来自待抑制的19kDα-玉米醇溶蛋白靶基因，反义方向DNA元件2来自待抑制的22kDα-玉米醇溶蛋白靶基因，有义方向DNA元件3来自待抑制的22kDα-玉米醇溶蛋白靶基因，并且比反义方向DNA元件2短而且只与元件2的5’末端互补，有义方向DNA元件4来自待抑制的19kDα-玉米醇溶蛋白靶基因而且与元件15’末端的至少一部分序列互补。
4.权利要求1中所述的重组DNA构建体，其中多于1个玉米醇溶蛋白靶基因选自19kD和22kDα-玉米醇溶蛋白、16kD和27kDγ-玉米醇溶蛋白、10kDδ-玉米醇溶蛋白和15kDβ-玉米醇溶蛋白。
5.用于抑制多于1个玉米醇溶蛋白靶基因的重组DNA构建体，其以5′至3′方向包含：启动子元件，其与来自多于1个玉米醇溶蛋白靶基因的多于1个反义方向DNA元件操作性连接；反义方向DNA元件，其以5′至3′方向命名为元件1、元件2；和来自至少一个玉米醇溶蛋白靶基因的至少一个反义方向DNA元件，命名为元件3；其中反义方向DNA元件2在其3′端至少有一部分序列与其自身或与有义方向DNA元件3不互补，并且由有义方向DNA元件转录的有义方向RNA与由反义方向DNA元件转录的反义方向RNA的5′最末端互补。
6.权利要求5中所述的重组DNA构建体，其中反义方向DNA元件1和2来自两个待抑制靶基因，有义方向DNA元件3来自待抑制靶基因。
7.权利要求5中所述的重组DNA构建体，其中反义方向DNA元件1来自待抑制的19kDα-玉米醇溶蛋白靶基因，反义方向DNA元件2来自待抑制的22kDα-玉米醇溶蛋白靶基因，有义方向DNA元件3来自待抑制的19kDα-玉米醇溶蛋白靶基因。
8.权利要求5中所述的重组DNA构建体，其中多于1个玉米醇溶蛋白靶基因选自19kD和22kDα-玉米醇溶蛋白、16kD和27kDγ-玉米醇溶蛋白、10kDδ-玉米醇溶蛋白和15kDβ-玉米醇溶蛋白，其中至少1个玉米醇溶蛋白靶基因选自19kD和22kDα-玉米醇溶蛋白、16kD和27kDγ-玉米醇溶蛋白、10kDδ-玉米醇溶蛋白和15kDβ-玉米醇溶蛋白。
9.具有增强的赖氨酸、增强的油脂和增强的色氨酸中至少一种的玉米种子的制备方法，包括以下步骤：
a)用用于抑制多于1个玉米醇溶蛋白靶基因的权利要求1或权利要求4的重组DNA构建体转化植物细胞；和
b)将植物细胞再生成为可育的转基因植株，其中该植株在其基因组中包含该构建体；和
c)从植株收获种子，其中该种子相对于未用该构建体转化的同一品种的种子而言，具有增强的赖氨酸、增强的油脂和增强的色氨酸中的至少一种。
10.具有增强的赖氨酸、增强的油脂和增强的色氨酸中至少一种的玉米种子的制备方法，包括以下步骤：
d)用用于抑制多于1个玉米醇溶蛋白靶基因的权利要求5或权利要求8的重组DNA构建体转化植物细胞；和
e)将植物细胞再生成为可育的转基因植株，其中该植株在其基因组中包含该构建体；和
f)从植株收获种子，其中该种子相对于未用该构建体转化的同一品种的种子而言，具有增强的赖氨酸、增强的油脂和增强的色氨酸中的至少一种。
11.转基因植物，其在基因组中含有用于抑制多于1个玉米醇溶蛋白靶基因的权利要求1或权利要求4的DNA构建体；
12.从权利要求11的植物中收获的种子。
13.从权利要求11的植物中收获的种子，其中有义方向DNA元件来自两个待抑制靶基因，反义方向DNA元件来自两个待抑制靶基因。
14.权利要求12的种子的加工产品，其中产品是饲料、膳食或经部分纯化的蛋白质组合物。
15.转基因植物，其在基因组中含有用于抑制多于1个玉米醇溶蛋白靶基因的权利要求5或权利要求8的DNA构建体。
16.从权利要求15的植物中收获的种子。
17.从权利要求15的植物中收获的种子，其中有义方向DNA元件来自两个待抑制靶基因，反义方向DNA元件来自两个待抑制靶基因。
18.权利要求16的种子的加工产品，其中产品是饲料、膳食或经部分纯化的蛋白质组合物。
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