EA025360B1 - Растения с модифицированным метаболизмом крахмала - Google Patents

Abstract

В изобретении представлен способ получения генетически модифицированного растения, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности в сравнении с контрольным растением, причем такой способ включает в себя стадии i) получения множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, ii) идентификации из этого множества растений растения, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид, и iii) отбора этого генетически модифицированного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении. В некоторых вариантах осуществления это растение имеет увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость в сравнении с контрольным растением. В некоторых конкретных вариантах осуществления фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградация крахмала модифицирована модификацией экспрессии или активности одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из α-амилазы (ЕС 3.2.1.1), β-амилазы (ЕС 3.2.1.2), глюкоамилазы (ЕС 3.2.1.3), фосфорилазы крахмала (ЕС 2.4.1.1), гликозилазы (ЕС 3.1.3.3), сахаразы-изомальтазы (ЕС 3.2.10), амиломальтазы (ЕС 2.4.1.25), мальтазы (ЕС 3.2.1.20), изоамилазы и α-глюкан-вода-дикиназы (GWD, ЕС 2.7.9.4).

Description

Область техники, к которой относится изобретение

В изобретении представлены способы увеличения потенциала продуктивности организма. Более конкретно, это описание рассматривает метаболизм крахмала в растениях и обеспечивает растения, в том числе злаковые растения, такие как пшеница и ячмень, имеющие модифицированный метаболизм крахмала и потенциал продуктивности. Это описание изобретения описывает различные способы получения растений, имеющих модифицированный потенциал продуктивности, такой как увеличенные урожай, рост, биомассу, жизненность и т. д., и способы получения представляющих интерес продуктов из этих модифицированных растений.

Уровень техники

Библиографические подробности публикаций, на которые ссылается автор в этом описании, собраны в конце этого описания.

Ссылка в этом описании на любую предыдущую публикацию (или информацию, полученную из нее) или любой материал, который является известным, не является и не должна считаться подтверждением или признанием того, что эта предыдущая публикация (или информация, полученная из нее) или известный материал образует часть обычного общего знания в области приложения усилий, к которой относится это описание.

Растения являются первичным источником повторно используемой энергии, и способы увеличения потенциала продуктивности конкретного растения являются очень желательными. Крахмал является основным углеводным запасным материалом в растениях, а также основным обеспечивающим энергию компонентом в пищевых рационах человека. Важность функциональности крахмала в качестве конечного продукта, например в пищевых продуктах, приобрела недавно повышенное признание. Структурные свойства крахмала также являются важными в промышленных (непищевых) применениях, в которых крахмал используется, например, в качестве желирующего вещества, наполнителя, водоудерживающего агента или склеивающего агента.

В зерновых растениях крахмал составляет приблизительно 45-65 мас.% зрелого зерна. Крахмал состоит только из глюкозидных остатков, но обнаруживается в виде двух типов молекул, амилозы и амилопектина, которые могут быть различны на основе молекулярного размера или других свойств. Молекулы амилозы являются в основном линейными полимерами, состоящими из а-1,4-связанных глюкозидных единиц, тогда как амилопектин является в высокой степени разветвленной молекулой с α-1,6глюкозидными связями, соединяющими многочисленные линейные цепи а-1,4-связанных глюкозидных единиц. Амилопектин состоит из больших молекул в диапазоне размеров между несколькими десятками тысяч и сотнями тысяч глюкозных единиц с приблизительно 5% а-1,6-разветвлений. С другой стороны, амилоза состоит из молекул в диапазоне размеров между несколькими сотнями и несколькими тысячами глюкозидных остатков с менее чем одним процентом разветвлений (в отношении обзора см. Ви1еоп с1 а1., 1998). Крахмалы злаков дикого типа обычно содержат 20-30% амилозу, тогда как остальная часть является амилопектином.

Крахмал первично синтезируется в растениях в фотосинтезирующих тканях, таких как листья, в форме транзиторного крахмала. Он мобилизуется во время последующих темновых периодов, поставляя углерод для экспорта в органы-стоки и энергетического метаболизма или для хранения в таких органах, как семена или клубни. Синтез и долгосрочное хранение крахмала имеет место в амилопластах запасающих органов, где крахмал откладывается в виде полукристаллических гранул с диаметром до 100 мкм. Гранулы содержат как амилозу, так и амилопектин, причем амилоза обычно является аморфным материалом в природной грануле крахмала, тогда как амилопектин является полукристаллическим вследствие укладки линейных глюкозидных цепей.

Синтез крахмала в эндосперме высших растений выполняется набором ферментов, которые катализируют четыре ключевых стадии. Во-первых, АДФ-глюкозопирофосфорилаза активирует мономерный предшественник крахмала посредством синтеза АДФ-глюкозы из 0-1-Р и аденозинтрифосфата (АТФ). Во-вторых, активированный глюкозильный донор, АДФ-глюкоза, переносится к не-редуцирующему концу предсуществующей а-1,4-связи крахмалсинтазами. В-третьих, расщепляющие крахмал ферменты вводят точки ветвления посредством отщепления участка а-1,4-связанного глюкана с последующим переносом отщепленной цепи к акцепторной цепи с образованием новой а-1,6-связи. Расщепляющими крахмал ферментами являются только ферменты, которые могут вводить а-1,6-связи в α-полиглюканы и, следовательно, играть существенную роль в образовании амилопектина. Наконец, деветвящие крахмал ферменты удаляют некоторые из связей ветвей, хотя механизм, при помощи которого они действуют, не выяснен.

Хотя и ясно, что по меньшей мере эти четыре активности необходимы для нормального синтеза крахмальных гранул (зерен) в высших растениях, в эндосперме высших растений обнаружены множественные изоформы каждой из этих четырех активностей, и были предложены конкретные роли для индивидуальных изоформ на основе мутационного анализа или посредством модификации уровней экспрессии генов с использованием трансгенных подходов (АЬе1 е1 а1., 1996, 1оЬ1ш§ е1 ай, 1999, §сйта11 е1 а1., 2000). Однако, точный вклад каждой изоформы каждой активности в биосинтез крахмала все еще явля- 1 025360 ется неизвестным, и эти вклады могут существенно различаться между видами. В эндосперме злаков присутствуют две изоформы АДФ-глюкозопирофосфорилазы, одна форма в амилопласте и одна форма в цитоплазме (Репуег е! а1., 1996, ТЬогЬ.)огп8еп е! а1., 1996). Четыре класса крахмалсинтазы обнаружены в эндосперме злаков, изоформа, локализованная исключительно в крахмальном зерне, связанная с гранулой крахмала (крахмальным зерном) крахмалсинтаза (ОВ88), которая является важной для синтеза амилозы, две формы, которые распределены между этой гранулой (крахмальным зерном) и растворимой фракцией (881, Ы е! а1., 1999а, 8811, Ы е! а1., 1999Ь), и четвертая форма, которая локализована полностью в растворимой фракции, 88ΙΙΙ (Сао е! а1., 2000, Ы е! а1., 1999Ь, Ы е! а1., 2000). Было показано, что мутации в 88ΙΙ и 88ΙΙΙ изменяют структуру амилопектина (Оао е! а1., 1998, Сга1д е! а1., 1998). Не были описаны мутации, определяющие роль активности 88Ι.

В эндосперме злаков экспрессируются три формы ветвящего фермента, ветвящий фермент Ι (8ΒΕΙ), ветвящий фермент Па (8ВЕПа) и ветвящий фермент ПЬ (8ВЕПЬ) (Небтап апб Воуег, 1982, Воуег апб Рге188, 1978, Μί/ипо е! а1., 1992, 8ип е! а1. 1997). Геномные последовательности и кДНК-последовательности были охарактеризованы для риса (Ыакатига апб УатапоиеШ, 1992), кукурузы (ВаЬа е! а1., 1991; р18Йег е! а1., 1993; Оао е! а1., 1997) и пшеницы (КереШп е! а1., 1997; №пг е! а1., 1997; КаЬтап е! а1., 1997). Сопоставление последовательностей выявляет высокую степень сходства последовательностей как на уровне нуклеотидов, так и на уровне аминокислот и позволяет классифицировать их в классы 8ВЕЕ 8ВЕПа и 8ВЕПЬ. 8ВЕПа и 8ВЕПЬ обычно обнаруживают приблизительно 80% идентичность последовательности друг с другом, в частности, в центральных районах этих генов.

Два типа деветвящих ферментов присутствуют в высших растениях и определяются на основе их субстратных специфичностей, деветвящие ферменты изоамилазного типа и деветвящие ферменты пуллуланазного типа (Муег8 е! а1., 2000). Мутации 8идагу-1 в кукурузе и рисе ассоциированы с недостаточностью обоих ветвящих ферментов (1ате8 е! а1., 1995, КиЬо е! а1., 1999), однако случайная (нерегулярная) мутация картируется в том же положении, что и ген ветвящего фермента изоамилазного типа.

Крахмалы, экстрагированные почти из всех видов растений, являются до некоторой степени фосфорилированными. Степень фосфорилирования обычно находится в диапазоне 0,1-0,4% глюкозидных остатков, которые фосфорилированы при углероде 3 или углероде 6 глюкозильных единиц в виде фосфатных моноэфиров (В1еппо\у е! а1., 2000а). Обычно, приблизительно 80% фосфатных групп связаны в положениях С-6 и приблизительно 20% при С-3. Однако, степень фосфорилированя существенно варьируется в зависимости от ботанического источника. Крахмал из клубня картофеля обнаруживает среднее 25 ммолей глюкозо-6-фосфата на мг крахмала, в то время как крахмалы злаков обнаруживают только 1/10 этого количества глюкозо-6-фосфата в запасном крахмале. Присутствие фосфатных групп в крахмале влияет на способность всасывания воды после желирования (клейстеризации) и на свойства вязкости.

Фосфорилирование крахмала катализируется группой ферментов, принадлежащих к семейству дикиназ. Два фермента, которые проводят фосфорилирование крахмала, были идентифицированы в картофеле и АгаЫбор818, а именно α-глюкан-вода-дикиназа (О\УЭ; ЕС 2.7.9.4, известная также как белок К.1 или ΟΚΙ), и фосфоглюкан-вода-дикиназа (Р\УЭ; ЕС 2.7.9.5). Первый катализирует перенос β-фосфата АТФ к положению либо С-3, либо С-6 глюкозильного остатка и γ-фосфата к молекуле воды с высвобождением ортофосфата, в то время как последний катализирует перенос фосфатов к фосфоглюкану (уже фосфорилированному О\УЭ) и к воде (Ваип8даагб е! а1., 2005; Ко!!шд е! а1., 2005). Более недавно КШе е! а1. предположили, что фосфорилирование в положении 3 или 6 глюкозильных остатков в крахмале катализируется Р\УЭ и О\УЭ. соответственно (КШе О. е! а1., 2006).

Антисмысловая репрессия гена, кодирующего О\УЭ в картофеле, уменьшала крахмал, связанный с фосфатом, на 80% (У1к8о-№е18еп е! а1., 2001). Кроме того, мутация в гене, названном 8ех1 (фенотип избытка крахмала), в АгаЫбор818 ШаПапа устраняла фосфорилирование крахмала, подтверждая участие О\УЭ в качестве ответственного за это фермента (2еетаи апб Кее8, 1999). Кроме того, как мутант АгаШбор818, так и трансгенные антисмысловые растения картофеля обнаруживали фенотип избытка крахмала в листьях, демонстрируя роль О\УЭ в деградации транзиторного крахмала. Отдельно от супрессии фосфорилирования крахмала в этих растениях не наблюдали модификации структуры крахмала. Однако, О^Э-антисмысловые растения картофеля обнаруживали уменьшение фенотипа подслащивания на холоду в клубнях, а также фенотипа избытка крахмала в листьях (ЬогЬегШ е! а1., 1998). Эти растения картофеля обнаруживали также увеличение количества клубней, ассоциированное с уменьшением массы отдельных клубней, но не обнаруживали какого-либо другого действия на накапливание крахмала в этих клубнях. Мутанты АгаШбор818 8ех1, которые испытывали влияние в их метаболизме транзиторного крахмала, имели также измененный метаболизм углеводов, росли медленно и поздно зацветали (Уи е! а1., 2001).

Взаимосвязь между деградацией крахмала и содержанием фосфата в крахмале остается невыясненной. Крахмал, продуцируемый антисмысловыми линиями из картофеля, проявлял высокую устойчивость к деградации β-амилазой, что позволяет предполагать, что фосфорилирование крахмала может быть необходимым условием для деградации β-амилазой. Фосфорилированные остатки могли бы быть сигналом нацеливания для этого фермента для деградации крахмала во время ночного периода. Некоторые иссле- 2 025360 дования предполагают ассоциацию α-амилазы в белке К1 (ОАЭ) с гранулой крахмала (крахмальным зерном) перед началом деградации.

Деградация и фосфорилирование крахмала в прорастающих семенах злаков, таких как пшеница, являются менее понятными и представляют собой высоко специализированную систему, включающую в себя ухудшение ткани и индукцию гидролитических ферментов, а также деградацию крахмала.

Пшеница является главным продуктом во многих странах и составляет приблизительно 20% килоджоулей пищи для всего народонаселения мира. Характеристики переработки пшеницы делают ее предпочтительной основой для большинства перерабатываемых продуктов на основе зерновых, таких как хлеб, макаронные изделия и лапша (лентовидные макаронные изделия). Потребление пшеницы увеличивается по всему миру с увеличением изобилия. Хлебопекарная (мягкая) пшеница (ТпОсит аекйуит) является гексаплоидом, имеющим три различных генома, А, В и Ό, и большинство известных генов в пшенице присутствуют в трех экземплярах, по одному на каждом геноме. Этот гексаплоидный характер хлебопекарной пшеницы выдвигает проблему нахождения и комбинирования мутаций генов в каждом из этих трех геномов. Присутствие трех геномов оказывает буферящее действие маскированием мутаций в отдельных геномах в противоположность более легко идентифицируемым мутациям в диплоидных видах. Известная вариация в структуре крахмала пшеницы была ограниченной относительно вариации, доступной в кукурузе или рисе. Другим способствующим этому фактором является то, что эффективность трансформации пшеницы отстает от трансформации других злаков. Считается, что гены, участвующие в фосфорилировании крахмала, и их действия не изучались ранее, и неизвестно, могут ли эффекты, наблюдаемые на фосфорилировани крахмала в картофеле и АгаЫйор818, оба из которых являются двудольными, сходным образом реплицироваться в однодольных видах, таких как пшеница.

Сущность изобретения

Данное изобретение основано частично на открытии, что модификация фосфорилирования эндогенного крахмала и/или деградации крахмала в растениях изменяет производительную (продуктивную) способность этого растения. В некоторых вариантах осуществления это приводит к увеличенному потенциалу продуктивности, наблюдаемому, без ограничения, в таких признаках, как увеличенная или улучшенная биомасса, жизненность, всхожесть, мощность проростков, скорость роста, высота, общая площадь листьев, интенсивность фотосинтеза на площадь листа, количество листьев на растение, количество колосьев на растение, количество побегов на растение, количество семян на растение, количество семян на колос, средняя масса семян, общая масса семян на растение, содержание или состав крахмала семян или клубней, толщина стебля, количество междоузлий, количество ответвлений, количество цветков, размер или форма цветков, цвет цветков, количество стручков на растение, размер стручков, количество семян на стручок, количество плодов на растение, количество завязей плодов, размер плодов, форма плодов, цвет плодов, качество плодов, устойчивость к болезням, масса корня, количество корней, длина корней и/или урожай и/или замедленное старение, в сравнении с контрольным растением. В других вариантах осуществления растения имеют увеличенные эндогенную гликозилазу и/или перевариваемость в сравнении с контрольным растением.

Таким образом, в одном варианте осуществления это описание изобретения описывает способы улучшения потенциала продуктивности растений модификацией фосфорилирования эндогенного крахмала и/или деградации крахмала в растении. В некоторых вариантах осуществления эти способы включают в себя получение генетически модифицированного растения, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности в сравнении с контрольным растением. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает в себя стадии ί) получения множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, ίί) идентификации из этого множества растений растения, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает в себя (ίίί) отбор генетически модифицированного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении.

В другом варианте осуществления это описание изобретения описывает способ получения генетически модифицированного растения, которое имеет увеличенную эндогенную гликозилазу в сравнении с контрольным растением. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает в себя стадии ί) получения множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, ίί) идентификации из этого множества растений растения, которое имеет увеличенную эндогенную гликозилазу относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает в себя ίίί) отбор генетически модифицированного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении.

В другом варианте осуществления это описание изобретения описывает способ получения генети- 3 025360 чески модифицированного растения, которое имеет увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, ίί) идентификации из этого множества растений генетически модифицированного растения, которое имеет увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает в себя ίίί) отбор генетически модифицированного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении.

В следующем родственном варианте осуществления это описание изобретения описывает способ определения, имеет ли генетически модифицированное растение увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения одного или нескольких растений, которые содержат в их геномах гетерологичный полинуклеотид, и ίί) определения, имеют ли одно или несколько растений увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения, и где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении.

Предпочтительно стадия ίί), направленная на идентификацию или определение увеличенного потенциала продуктивности, увеличенной активности эндогенной гликозилазы или увеличенной перевариваемости, включает в себя оценивание фенотипа, которым является, модифицированное содержание или модифицированный состав крахмала, и/или идентификацию растения, которое имеет модифицированное содержание или модифицированный состав крахмала, например уровня фосфорилирования крахмала, увеличенного потенциала продуктивности, увеличенной эндогенной гликозилазы, по меньшей мере, в некоторых его клетках или органах или увеличенной перевариваемости по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения.

Это описание изобретения описывает также способ идентификации гена, участвующего в увеличенном потенциале продуктивности в растении в сравнении с контрольным растением, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения множества растений, каждое из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, ίί) измерения потенциала продуктивности каждого растения и необязательно того, имеют ли они увеличенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения, ίίί) идентификации растения, имеющего увеличенный потенциал продуктивности, и ίν) идентификации в нем гетерологичного полинуклеотида с идентификацией посредством этого гена, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении.

Это описание дополнительно описывает способ идентификации полинуклеотида, который способен к увеличению потенциала продуктивности растения, увеличению эндогенной гликозилазы в растении или увеличению перевариваемости по меньшей мере одной части растения в сравнении с контрольным растением, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения одного или нескольких гетерологичных полинуклеотидов, каждый из которых содержит регуляторную последовательность, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, ίί) введения этого гетерологичного полинуклеотида (этих гетерологичных полинуклеотидов) в клеткипредшественники, ткани, органы, семена или растения, ίίί) генерирования из них множества растений, ίν) определения, имеет ли по меньшей мере одно растение, содержащее гетерологичный полинуклеотид, увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения, и ν) отбора этого полинуклеотида.

В одном варианте осуществления это описание обеспечивает способ получения генетически модифицированного растения, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает в себя стадии ί) получения гетерологичного полинуклеотида, содержащего регуляторную последовательность, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, ίί) введения этого гетерологичного полинуклеотида в клетки-предшественники, ткани, органы, семена или растения, ίίί) получения из них множества растений, по меньшей мере одно из которых содер- 4 025360 жит в его геноме этот гетерологичный полинуклеотид, ίν) идентификации растения из этого множества растений, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид, и ν) отбора этого растения с получением посредством этого генетически модифицированного растения. В другом варианте осуществления этот способ включает в себя стадии ί) мутагенеза клеток-предшественников, тканей, органов, семян или растений, ίί) получения из них множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме этот гетерологичный полинуклеотид, содержащий регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, и ίίί) идентификации растения из этого множества растений, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения.

Рассматриваемый гетерологичный полинуклеотид может вводиться в это растение любым подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления эти способы включают в себя стадию введения гетерологичного полинуклеотида в клетки-предшественники, ткани, органы, семена или растения и генерирования из них множества растений. В других вариантах осуществления эта стадия включает в себя трансформацию и/или мутагенез клетки-предшественника, ткани, органа, семени или растения.

В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый агент понижающим образом регулирует экспрессию гена, кодирующего фермент, участвующий в фосфорилировании эндогенного крахмала и/или деградации крахмала, или его функциональную активность. В конкретных вариантах осуществления этот агент понижающим образом регулирует фосфорилирование эндогенного крахмала в этом растении.

В некоторых вариантах осуществления данные способы дополнительно включают в себя тестирование пробы нуклеиновой кислоты из этого растения на мутацию в гене, кодирующем полипептид, участвующий в деградации крахмала и/или фосфорилировании крахмала.

В некоторых вариантах осуществления фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала модифицируют модификацией экспрессии или активности одного или нескольких ферментов или регуляторных белков, участвующих в деградации крахмала и/или фосфорилировании крахмала. Примеры ферментов выбраны из группы, состоящей из α-амилазы (ЕС 3.2.1.1), β-амилазы (ЕС 3.2.1.2), глюкоамилазы (ЕС 3.2.1.3), фосфорилазы крахмала (ЕС2.4.1.1), гликозилазы (ЕС 3.1.33), сахарозоизомальтазы (ЕС 3.2.10), амиломальтазы (ЕС 2.4.1.25), мальтазы (ЕС 3.2.1.20), изоамилазы и α-глюканвода-дикиназы (С^Б, ЕС 2.7.9.4). В конкретных вариантах осуществления фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала модифицируют увеличением экспрессии или активности αамилазы или β-амилазы и/или уменьшением экспрессии или активности С\УБ. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемые способы дополнительно включает в себя уменьшение экспрессии или активности фосфогликан-вода-дикиназы (Ρ^Ό, ЕС 2.7.9.5). В предпочтительных вариантах осуществления регуляторный белок не является белком, кодируемым генами 8ех1 и/или 8ех4 в ЛгаЫйор818 и/или картофеле.

В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый агент экспрессируется в запасающем органе этого растения, таком как развивающиеся семена, корень, клубень или стебель. В конкретных вариантах осуществления этот агент экспрессируется в фотосинтетически активной ткани растения. В дополнительных вариантах осуществления фосфорилирование крахмала и/или деградация крахмала относятся к транзиторному крахмалу.

В некоторых примерных вариантах осуществления, относящихся к увеличенной эндогенной гликозилазе, эта гликозилаза является α-амилазой, β-амилазой, глюкоамилазой или их комбинациями.

Описанные в этой спецификации способы не ограничиваются каким-либо конкретным типом растения. Ссылка на растение включает в себя растение, выбранное из травянистых растений, овощей, зерновых, бобовых и несущих плоды или цветки растений. В некоторых вариантах осуществления зерновыми культурами являются пшеница, кукуруза (маис), ячмень, рис, рожь, овес, просо, сорго, тритикале, гречиха, ίοηίο, лебеда квиноа, спельта, пшеница твердая (дурум), хлебопекарная (мягкя) пшеница, полба (пшеница-однозернянка), амарант, дикий рис (семена водяного тростника) или тэфф (полевичка аргентинская).

В некоторых вариантах осуществления вышеописанных способов рассматриваемые генетически модифицированные растения дополнительно содержат гетерологичный полинуклеотид, который кодирует агент, который понижающим образом регулирует экспрессию или активность α-амилазы или βамилазы, функционально связанный с регуляторной последовательностью транскрипции, или мутацию в гене, кодирующем α-амилазу или β-амилазу. В некоторых вариантах осуществления выбирают растение, которое имеет уменьшенную экспрессию или активность α-амилазы или β-амилазы по меньшей мере в одном органе этого растения. В некоторых вариантах осуществления этот агент экспрессируется в запасающем органе или ген, кодирующий α-амилазу или β-амилазу, экспрессируется в запасающем органе. В

- 5 025360 других вариантах осуществления этим агентом является молекула РНК, которая понижающим образом регулирует экспрессию фермента дикиназы. В некоторых вариантах осуществления понижающим образом регулируются комбинации гликозилаз, таких как α-амилаза и β-амилаза.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает растения, части растений и продукты растений, продуцируемые способами этого изобретения, их применения и способы использования этих растений, частей или продуктов. Эти растения или части растений могут быть модифицированы в соответствии с любым из описанных здесь признаков в контексте с этими способами или любой их комбинации. Таким образом, данное изобретение обеспечивает генетически модифицированные растения, полученные, продуцированные или идентифицированные описанными здесь способами. Ссылка на растение или часть растения включает в себя часть растения, которая является семенем, листом, стеблем, корнем, клубнем, цветком, плодом, стручком или черенком, полученными из этого растения.

Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления это описание изобретения описывает генетически модифицированное растение, содержащее в его геноме гетерологичный полинуклеотид, содержащий регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, где это растение характеризуется наличием модифицированного фосфорилирования крахмала и/или деградации крахмала и дополнительно наличием увеличенного потенциала продуктивности, увеличенной эндогенной гликозилазы и/или увеличиваемой перевариваемости по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления это описание обеспечивает генетически модифицированное растение, содержащее в его геноме введенную мутацию в гене, который кодирует эндогенный полипептид фосфорилирования крахмала и/или деградирующий крахмал фермент, где это растение характеризуется наличием модифицированного фосфорилирования крахмала и/или деградации крахмала и дополнительно наличием увеличенного потенциала продуктивности, увеличенной эндогенной гликозилазы и/или увеличиваемой перевариваемости по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением.

В других вариантах осуществления это описание обеспечивает генетически модифицированное растение, содержащее в его геноме один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, каждый из которых содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, где это растение характеризуется наличием уменьшенного фосфорилирования крахмала и/или деградации крахмала по меньшей мере одной части этого растения, увеличенной или уменьшенной экспрессии и/или активности гликозилазы, предпочтительно амилазы, в зрелых семенах этого растения и увеличенным потенциалом продуктивности в сравнении с контрольным растением. В других вариантах осуществления эти растения проявляют уменьшенный уровень полипептида-мишени фосфорилирования крахмала и/или деградирующего крахмал фермента по меньшей мере в первом органе этого растения и необязательно увеличенный уровень полипептида-мишени фосфорилирования крахмала и/или деградирующего крахмал фермента по меньшей мере во втором органе этого растения, где эти первый и второй органы являются одними и теми же или различными органами. В некоторых вариантах осуществления этот полипептид-мишень или фермент выбраны из группы, состоящей из α-амилазы, β-амилазы, глюкоамилазы, фосфорилазы крахмала, гликозилазы, сахарозо-изомальтазы, амиломальразы, мальтазы, изомальтазы и α-глюкан-вода-дикиназы.

В одном варианте-примере этот агент понижающим образом регулирует экспрессию или функциональную активность фермента, участвующего в фосфорилировании эндогенного крахмала и/или деградации крахмала. В некоторых вариантах осуществления этот агент понижающим образом регулирует уровень или функциональную активность дикиназы. В некоторых вариантах осуществления этой дикиназой является ΟΑΌ или ΟΑΌ и ΡΑΌ.

В некоторых вариантах осуществления этот агент экспрессируется в запасающем органе этого растения. В других вариантах осуществления этот агент экспрессируется в фотосинтетически активной ткани этого растения. В одном варианте-примере фосфорилирование крахмала и/или деградация крахмала относится к транзиторному крахмалу.

Это изобретение обеспечивает также зерно хлебных злаков с уменьшенным фосфорилированием крахмала в листьях и/или зерне и увеличенной гликозилазой в этом зерне. Комбинация этих двух признаков обеспечивает особые преимущества в отношении применения этого зерна, необязательно в дополнение к увеличенной продуктивности растения. Уменьшение фосфорилирования крахмала в этой комбинации равно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% относительно соответствующего контрольного растения. Увеличенная гликозилаза, предпочтительно α-амилаза, в этой комбинации увеличивается по меньшей мере на 100%, предпочтительно по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 300% или более предпочтительно по меньшей мере на 500% относительно соответствующего контрольного растения.

Композиции растений, описанные в данном описании, не ограничиваются конкретным типом рас- 6 025360 тения. Ссылка на растение включает в себя растение, выбранные из покрытосемянных, однодольных растений, двудольных растений, травянистых растений, овощей, зерновых, бобовых и несущих плоды или цветки растений или любой комбинации этих классификаций с образованием подкласса. В некоторых вариантах осуществления модифицированные двудольные растения являются улучшенными. В конкретных вариантах осуществления улучшенными являются зерновые однодольные растения, такие как зерновые культуры, сахарный тростник, сахарная свекла, сорго, рожь и т. д.

В некоторых вариантах осуществления зерновой культурой является пшеница, кукуруза (маис), ячмень, рис, рожь, овес, просо, сорго, гречиха, ίοηίο, лебеда квиноа, спельта, пшеница твердая (дурум), мягкая (хлебопекарная) пшеница, полба (пшеница-однозернянка), амарант, дикий рис (семена водяного тростника) или тэфф (полевичка аргентинская). Этой пшеницей может быть мягкая (хлебопекарная) пшеница (гексаплоидная пшеница), пшеница твердая (дурум) или тритикале. Кукуруза является предпочтительно кукурузой зубовидной и может быть белой кукурузой или желтой кукурузой. В некоторых вариантах осуществления это растение является растением другим, чем ЛгаЫбор515 ГЬайапа и/или кукуруза (маис).

В некоторых вариантах осуществления регуляторная последовательность транскрипции предпочтительно управляет экспрессией полинуклеотида в запасающем органе и/или ткани растения, которая является фотосинтетически активной.

В других вариантах осуществления это растение дополнительно содержит полинуклеотид, функционально связанный с регуляторной последовательностью транскрипции, который кодирует агент, понижающим образом регулирующий активность амилазы.

В других вариантах осуществления часть растения характеризуется наличием модифицированного содержания или состава крахмала, увеличенного потенциала продуктивности, увеличенной эндогенной гликозилазы или увеличенной перевариваемости, относительно соответствующей части контрольного растения.

В одном конкретном варианте осуществления это описание относится к семенам, содержащим крахмал, где уровень глюкозо-6-фосфата в крахмале этих семян меньше 10 нг/мг крахмала и уровень амилазной активности в муке, полученной из этих семян, составляет по меньшей мере 4 единицы/г муки.

Данное описание рассматривает продукт описанного здесь генетически модифицированного растения.

В одном варианте осуществления это описание обеспечивает продукт, который является переработанным зерном, мукой, мукой из цельного зерна или по меньшей мере частично очищенным крахмалом, где этот продукт имеет модифицированное содержание крахмала или модифицированный общий состав крахмала относительно соответствующего продукта из контрольного растения.

Это описание раскрывает способ получения такого продукта, включающий в себя выращивание растения и/или сбор этого растения или части рассматриваемого генетически модифицированного растения. В некоторых вариантах осуществления этот способ предназначен для получения обработанного зерна, муки, муки из цельного зерна или, по меньшей мере, частично очищенного крахмала и включает в себя часть растения, такую как зерно, из описанных здесь генетически модифицированных растений.

В других вариантах осуществления это описание обеспечивает способ получения пищевого продукта, включающий в себя смешивание описанного здесь растения или части этого растения или описанного здесь продукта описанного здесь растения с другим пищевым ингредиентом и необязательно варку, выпечку, обжаривание, варку на пару, кипячение, экструзию или иную обработку этой смеси.

В другом варианте осуществления этот продукт является продуктом ферментации, и это описание изобретения описывает способ, включающий в себя ферментацию продукта, который является обработанным зерном, мукой, мукой из цельного зерна или, по меньшей мере, частично очищенным крахмалом, где этот продукт имеет модифицированное содержание крахмала или модифицированный общий состав крахмала относительно соответствующего продукта из контрольного растения, или мукой или крахмалом, полученными обработкой части растения, такой как зерно, из описанных здесь генетически модифицированных растений. В некоторых вариантах осуществления продуктом ферментации является этанол.

Еще в одном варианте осуществления это описание обеспечивает способ использования для питания человека или животного, включающий в себя обеспечение описанных здесь или описанных выше генетически модифицированных растения, части растения, продукта или продукта, продуцируемого этим способом, для человека или животного. В некоторых вариантах осуществления это описание обеспечивает продукт, продуцируемый описанным выше или описанным здесь способом.

В другом аспекте рассматриваемое описание раскрывает применение гетерологичного полинуклеотида для получения растения, характеризующегося увеличенным потенциалом продуктивности, увеличенной эндогенной гликозилазой или увеличенной перевариваемостью его семян или по меньшей мере одного из его органов в сравнении с контрольным растением, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении.

- 7 025360

В другом варианте осуществления это описание обеспечивает применение описанного здесь или описанного выше генетически модифицированного растения или его части, содержащей крахмал, для получения пищевого продукта или непищевого продукта или корма для животных для усиления роста или улучшения здоровья животных. В некоторых вариантах осуществления этим продуктом является этанол.

В другом варианте осуществления это описание раскрывает применение растения или его части для приготовления пищевого материала для потребления человеком, где это растение или его часть генетически модифицированы введением по меньшей мере двух гетерологичных полинуклеотидов, где это растение характеризуется увеличенным потенциалом продуктивности, уменьшенным фосфорилированием крахмала и/или уменьшенной деградацией крахмала в листьях этого растения и уменьшенной эндогенной гликозилазой в семенах этого растения, где каждый гетерологичный полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении.

В другом варианте осуществления это описание обеспечивает способ идентификации или применения молекулярного маркера потенциала продуктивности растения, увеличенной эндогенной гликозилазы или увеличенной перевариваемости семян или по меньшей мере одной другой части растения в сравнении с контрольным растением, причем этот способ включает в себя получение пробы нуклеиновой кислоты из растения и обработку этой пробы для идентификации полиморфизма в гене, кодирующем ОАО, или полиморфизма, генетически связанного с геном, кодирующим ОАЭ, в этом растении.

В другом варианте осуществления это описание изобретения описывает способ оценивания растения, включающий в себя получение пробы нуклеиновой кислоты из растения и обработку этой пробы для определения идентичности выбранных нуклеотидов в гене ОАЭ; и ассоциирование любого идентифицированного нуклеотида с признаком, связанным с потенциалом продуктивности в этом растении.

Данное описание обеспечивает новые молекулы нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления это описание изобретения описывает выделенную или химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность или комплементарную последовательности, кодирующей полипептид α-глюкан-вода-дикиназы, содержащий аминокислотную последовательность δΕΟ ГО N0: 3, или его биологически активную часть или его вариант, имеющий по меньшей мере 90% идентичность последовательности с δΕΟ ГО N0: 3.

В другом варианте осуществления это описание обеспечивает выделенную или химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая соответствует или является комплементарной δΕΟ ГО N0: 2, или δΕΟ ГО N0: 5, или δΕΟ ГО N0: 8, δΕΟ ГО N0: 9, или δΕΟ ГО N0: 10 (ОАЭ риса), или δΕΟ ГО N0: 11, 12, 13 или 14 (ОАЭ сорго), или их кодирующей белок или биологически активной части или их варианту, имеющему по меньшей мере 90% идентичность последовательности с δΕΟ ΙΌ N0: 2 (ОАО пшеницы), или δΕΟ ΙΌ N0: 5 (ОАО пшеницы), или δΕΟ ΙΌ N0: 8, 9, или 10 (ОАО риса), или δΕΟ ΙΌ N0: 11, δΕΟ ΙΌ N0: 12, δΕΟ ΙΌ N0: 13, или δΕΟ ΙΌ N0: 14 (ОАО сорго) или их кодирующим белок районом.

В некоторых вариантах осуществления это описание изобретения описывает выделенную или химерную молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при условиях высокой строгости с δΕΟ ΙΌ N0: 2, или δΕΟ ΙΌ N0: 5, или δΕΟ ΙΌ N0: 8, 9 или 10 или с их кодирующей белок или биологически активной частью или с ее вариантом, имеющим по меньшей мере 90% идентичность последовательности с δΕΟ ΙΌ N0: 2 (ΟΑΌ пшеницы), или δΕΟ ΙΌ N0: 5 (ОАО пшеницы), или δΕΟ ГО N0: 8, 9 или 10 (ОАО риса), или δΕΟ ГО N0: 11, δΕΟ ГО N0: 12, δΕΟ ГО N0: 13, или δΕΟ ГО N0: 14 (ОАО сорго) или их кодирующим белок районом.

В некоторых вариантах осуществления это описание обеспечивает конструкцию химерной нуклеиновой кислоты, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, описанную здесь, функционально связанную с регуляторной последовательностью транскрипции. В некоторых вариантах осуществления это описание обеспечивает выделенную или химерную молекулу нуклеиновой кислоты, способную уменьшать экспрессию гена, кодирующего полипептид, имеющий активность ОАО, в зерновом растении. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота является РНК или кодирует РНК, которая является антисмысловой РНК, косупрессивной РНК, дуплексной РНК, шпилечной РНК или рибозимом.

В некоторых вариантах осуществления это описание изобретения описывает применение выделенной или химерной молекулы нуклеиновой кислоты для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид, имеющий активность ОАО, в зерновом растении.

В другом варианте осуществления это описание обеспечивает зонд одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащий 20 последовательных нуклеотидов, где эта нуклеотидная последовательность из 20 нуклеотидов является идентичной комплементу нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность δΕΟ ГО N0: 2, или δΕΟ ГО N0: 5, или δΕΟ ГО N0: 8, 9 или 10 (РАО риса), или δΕΟ ГО N0: 11, δΕΟ ГО N0: 12, δΕΟ ГО N0: 13, или δΕΟ ГО N0: 14 (ОАО сорго) или их кодирующей белок или биологически активной части или их варианту, имеющему по меньшей мере 90% идентичность последовательности с δΕΟ ГО N0: 2 (ОАО пшеницы), или δΕΟ ГО

- 8 025360

N0: 5 (САП пшеницы), или 8ЕА) ГО N0: 8, 9 или 10 (САП риса), или 8ЕА) ГО N0: 11, 8ЕА) ГО N0: 12, 8ЕС ГО N0: 13, или 8ЕЦ ГО N0: 14 (САЭ сорго) или их кодирующим белок районом.

В другом варианте осуществления это описание обеспечивает зонд одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащий 20 последовательных нуклеотидов, где эта нуклеотидная последовательность из 20 нуклеотидов является идентичной нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется при строгих условиях с 8ЕЦ ГО N0: 2, или 8ЕА) ГО N0: 5, или 8ЕА) ГО N0: 8, 8ЕА) ГО N0: 9, или 8ЕА) ГО N0: 10 (РАО риса), или с 8ЕА) ГО N0: 11, 8ЕЦ ГО N0: 12, 8ЕЦ ГО N0: 13, или 8ЕЦ ГО N0: 14 (САЭ сорго) или с их кодирующей белок или биологически активной частью, или их вариантом, имеющим по меньшей мере 90% идентичность последовательности с 8ЕЦ ГО N0: 2 (САЭ пшеницы), или 8ЕЦ ГО N0: 5 (САЭ пшеницы), или 8ЕЦ ГО N0: 8, 9 или 10 (РАО риса), или 8ЕА) ГО N0: 11, 8ЕА) ГО N0: 12, 8ЕА) ГО N0: 13, или 8ЕА) ГО N0: 14 (ОАО сорго) или их кодирующим белок районом.

В другом варианте осуществления это описание обеспечивает зонд одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащий 20 смежных нуклеотидов, где эта нуклеотидная последовательность из 20 нуклеотидов является идентичной комплементу нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид α-глюкан, водадикиназы, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 3 или ее биологически активную часть, или ее вариант, имеющий по меньшей мере 90% идентичность последовательности с 8ЕЦ ГО N0: 3.

В другом варианте осуществления данное описание обеспечивает матрицу молекул нуклеиновых кислот, прикрепленную к твердому носителю, причем эта матрица содержит олигонуклеотид, который будет селективно гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей ген, кодирующий полипептид, имеющий САО-активность, в зерновом растении.

В другом варианте осуществления это описание обеспечивает экспрессирующий вектор, клеткухозяина, клетку растения, часть растения, растение или семена, содержащие описанную выше выделенную или химерную молекулу нуклеиновой кислоты, или конструкцию, содержащую указанную молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с регуляторной последовательностью транскрипции. В некоторых вариантах осуществления эта конструкция экспрессируется в клетке-хозяине, клетке растения, растении, части или семени растения, и это описание обеспечивает способ получения полипептида СА0 зернового растения или его варианта или способ получения его биологически активного фрагмента или варианта, причем указанный способ включает в себя экспрессию этой конструкции в клетке-хозяине, растении, части или семени растения.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления это описание обеспечивает способы улучшения растений, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, и) идентификации из этого множества растений модифицированного растения, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид, и ίίί) отбора этого генетически модифицированного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, где это генетически модифицированное растение имеет увеличенный потенциал продуктивности относительно контрольного растения.

В другом родственном варианте осуществления это описание изобретения описывает способ улучшения растения, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, ίί) идентификации из этого множества растений генетически модифицированного растения, которое имеет увеличенную гликозилазу относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид, и ίίί) отбора этого генетически модифицированного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, где это генетически модифицированное растение имеет увеличенную эндогенную гликозилазу в сравнении с контрольным растением.

Еще в одном варианте осуществления это описание изобретения описывает способ улучшения растений, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме гетерологичный полинуклеотид, ίί) идентификации из этого множества растений генетически модифицированного растения, которое имеет увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения и содержит гетерологичный полинуклеотид, и ίίί) отбора этого генетически модифицированного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, где это генетически модифицированное растение имеет увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей в

- 9 025360 сравнении с контрольным растением.

В следующем варианте осуществления это описание изобретения описывает способ улучшения растений, причем этот способ включает в себя стадии ί) получения одного или нескольких растений, которые содержат в их геномах гетерологичный полинуклеотид, и ίί) определения, имеют ли эти один или несколько растений увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из их частей относительно контрольного растения, где этот полинуклеотид содержит регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, где это генетически модифицированное растение имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением.

В следующем варианте осуществления это описание изобретения описывает способ улучшения растений, причем указанный способ включает в себя стадии ί) получения гетерологичного полинуклеотида, содержащего регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует агент, который модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, ίί) введения этого гетерологичного полинуклеотида в клетки-предшественники, ткани, органы, семена или растения, ίίί) получения из них множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме этот гетерологичный полинуклеотид, ίν) идентификации растения из этого множества растений, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения и содержит этот гетерологичный полинуклеотид, и ν) отбора этого растения с получением посредством этого генетически модифицированного растения, где это генетически модифицированное растение имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением.

В следующем варианте осуществления это описание изобретения описывает способ улучшения растений, причем указанный способ включает в себя стадии ί) мутагенеза клеток-предшественников, тканей, органов, семян или растений, ίί) получения из них множества растений, по меньшей мере одно из которых содержит в его геноме этот гетерологичный полинуклеотид, содержащий регуляторную последовательность транскрипции, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая модифицирует фосфорилирование эндогенного крахмала и/или деградацию крахмала в этом растении, и ίίί) идентификации растения из этого множества растений, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей относительно контрольного растения, где это генетически модифицированное растение имеет увеличенный потенциал продуктивности, увеличенную эндогенную гликозилазу или увеличенную перевариваемость по меньшей мере одной из его частей в сравнении с контрольным растением.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 является графическим представлением содержания глюкозо-6-фосфата О6Р в крахмале зерна геСУО-трансгенных линий пшеницы.

Фиг. 2 является графическим представлением содержания амилозы в крахмале зерна гкСУОтрансгенной пшеницы.

Фиг. 3 является графическим представлением данных, показывающих способность набухания крахмала зерна г^СУ Ό-трансгенной пшеницы.

Фиг. 4 является графическим представлением данных, показывающих способность к клейстеризации (вязкости крахмала) крахмала зерна (либо муки из цельного зерна без ингибитора α-амилазы, либо очищенного крахмала в присутствии ингибитора α-амилазы) из гкСУО-трансгенной пшеницы.

Фиг. 5 является графическим представлением данных, показывающих увеличенную жизненность, биомассу и увеличенный урожай зерна гкСУО-трансгенной пшеницы.

Фиг. 6 является фотографическим представлением, показывающим увеличенную жизненность, биомассу и увеличенный урожай гкСУО-трансгенной пшеницы.

Фиг. 7 является графическим представлением данных, показывающих уменьшенный уровень содержания С6Р в транзиторном (лист) крахмале гкСУО-трансгенных линий пшеницы.

Фиг. 8 является графическим представлением данных, показывающих увеличенное количество колосков на растение в СУО-трансгенных линиях пшеницы различных генетических фонов.

Фиг. 9 является графическим представлением данных, показывающих повышенную α-амилазную активность семян гкСУО-трансгенной пшеницы относительно контролей.

Краткое описание таблиц

Таблица 1 обеспечивает описание обеспеченных здесь §ЕЦ ΙΌ N0.

Таблица 2 обеспечивает субклассификацию аминокислот.

- 10 025360

Таблица 3 обеспечивает примеры аминокислотных замен.

Таблица 4 обеспечивает величины способности к клейстеризации для гкО^О-трансгенной пшеницы.

Таблица 5 обеспечивает результаты анализов роста (массу семян, продукцию семян) для гкСХУЭтрансгенной пшеницы.

Таблица 6 обеспечивает результаты анализов роста (площадь листьев, налив зерна, колосья) для гкО^Э-трансгенной пшеницы.

Таблица 7 обеспечивает структуру экзон/интрон пшеницы в сравнении с С\УЭ риса. Подробное описание изобретения

Во всем этом описании и в пунктах формулы изобретения, которая следует далее, если нет других указаний, слово содержать и его вариации, такие как содержит и содержащий, должны рассматриваться как обозначающие включение указанного целого числа или указанной стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или другой стадии или группы целых чисел или стадий. Под термином состоящие из имеется в виду включение того, что следует после фразы состоящие из, и ограничение тем, что следует после этой фразы. Таким образом, фраза состоящие из указывает на то, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными и что никакие другие элементы не могут присутствовать. Под термином состоящие по существу из имеется в виду включение любых элементов, перечисленных после этой фразы, и ограничение другими элементами, которые не мешают и не вносят вклад в активность или действие, указанные в этом описании для перечисленных элементов. Таким образом, фраза состоящие по существу из указывает, что перечисленные элементы являются необходимыми и обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или могут не присутствовать в зависимости от того, влияют они или не влияют на активность или действие перечисленных элементов.

Каждый вариант осуществления в этом описании должен применяться ти1айк ти1апб15 для каждого другого варианта, если нет явно выраженного другого указания.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности называются индификаторным номером последовательности (ЗЕО ГО N0:). Эти ЗЕО ГО N0: соответствуют цифровым идентификатором последовательностей (см. в списке последовательностей) <400> 1 (ЗЕО ГО N0: 1), <400> 2 (ЗЕО ГО N0: 2) и т. д. Суммирование идентификаторов последовательностей обеспечено в табл. 1 после примеров. Список последовательностей обеспечен после формулы изобретения.

Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, обычно понимаемое специалистами с обычной квалификацией в данной области. Хотя в практике или тестировании данного изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, сходные с описанными здесь или эквивалентные описанным здесь, предпочтительные способы и материалы описаны. Для целей данного изобретения ниже определены следующие термины.

Артикли а и ап используются здесь для указания одного или более одного (т. е. по меньшей мере одного) из грамматических дополнений этого артикля. Например, ап с1стспГ обозначает один элемент или более чем один элемент.

Термин приблизительно используется здесь для обозначения количества, уровня, величины, измерения, длины, положения, размера или величины, которая варьируется на 30%, предпочтительно на 20% и более предпочтительно на 10% относительно диапазона ссылочных количества, уровня, величины измерения, длины, положения, размера или ступени величины.

Крахмал.

Данное изобретение основывается на наблюдении, что модификация экспрессии гена, участвующего в фосфорилировании крахмала и/или деградации крахмала в растениях, в частности в листьях, было ассоциировано с неожиданными эффектами в параметрах продуктивности растения, таких как урожай зерна. Это было неожиданным, так как предыдущие исследования показали, что модификация синтеза или запасания крахмала приводит к уменьшениям в урожае. Не ожидалось, что уменьшение фосфорилирования или деградации транзиторного крахмала в листьях, которое участвует в мобилизации фиксированного углерода в другие части растения, может приводить к увеличениям урожая.

Крахмал определяется здесь как полисахарид, состоящий, по существу, из α-пиранозных единиц. Крахмал является основным запасным углеводом в растениях, таких как, например, зерновые культуры, в том числе пшеница. Крахмал синтезируется в амилопластах и образуется и хранится в гранулах в развивающемся запасающем органе, таком как зерно; его называют здесь запасным крахмалом. Он включает в себя амилозу, по существу линейный (<0,1% точек ветвления) а-1,4ГО-глюкопиранозный полимер и амилопектин, который имеет короткие цепи α-Ό-глюкопиранозных единиц, первично связанные α-1,4связями с а-1,6-связанными ответвлениями. Крахмал зерновых растений дикого типа содержит до приблизительно 20-30% амилозы и приблизительно 70-80% амилопектина. Одним дополнительным важным различием между амилозой и амилопектином является молекулярная масса этих полимеров. Амилоза имеет спиральную конформацию с молекулярной массой 10⁴-10⁶ Да, тогда как амилопектин имеет молекулярную массу приблизительно 10⁷-10⁸ Да. Недавние исследования показали, что приблизительно до

- 11 025360

0,1% сайтов а-1,6-гликозидного ветвления может встречаться в амилозе, и, следовательно, ее описывают как по существу линейная. Амилоза определяется здесь как включающая в себя, по существу, линейные молекулы а-1,4-связанных глюкозидных (глюкопиранозных) единиц и амилозоподобный длинноцепочечный амилопектин (иногда называемый промежуточным материалом или амилозоподобным амилопектином, Такеба е! а1., 1993Ь; Регдакоп, 1994). Доля амилозы в крахмале определяется здесь на основе масса/масса (м/м), т.е. масса амилозы в виде процента массы общего крахмала из зерна. Содержание амилозы может быть определено любым из способов, известных в данной области, в том числе вытеснительной хроматографией ВЖХ (НРЬС), например в 90% (м/о) ДМСО, способами с конканавалином А (Меда/уше Ιηΐ, 1ге1апб) или предпочтительно иодометрическими способами, например, как описано в примере 1. Способ ВЖХ может включать в себя деветвление крахмала (Ва1еу апб СшПп, 1996) или может не включать в себя деветвление крахмала.

Крахмал сначала синтезируется и накапливается в листьях и других зеленых тканях растения в виде продукта фотосинтеза. Этот крахмал называют здесь транзиторным крахмалом или т. п., так как он накапливается в пластидах фотосинтезирующих тканей в течение дня и деградируется, по меньшей мере, во время ночи. Таким образом, как синтетические, так и деградативные (расщепляющие) ферменты присутствуют в этой клетке одновременно, и эта система подвержена суточной регуляции. Ночью транзиторный крахмал гидролизуется до сахаров, которые транспортируются сначала в виде сахарозы из тканей-источников в ткани стока для использования в росте растения, в качестве источника энергии для метаболизма или для хранения в тканях в виде запасного крахмала. Расщепление транзиторного крахмала в листьях обсуждалось недавно 2еетап е! а1., 2004. Это расщепление осуществляется функцией ферментов, таких как амилазы, деветвящие ферменты, α-глюканфосфорилазы и глюканотрансферазы.

Почти все крахмалы растений фосфорилируются в некоторой степени при гидроксильных группах С3 и С6 амилопектина, но степень фосфорилирования существенно варьируется в зависимости от растения-источника. Крахмал клубня картофеля обычно имеет 25 нмолей глюкозо-6-фосфата на мг крахмала с диапазоном 0,2-0,4% (м/м). Большинство фосфатных групп в крахмале картофеля связаны с амилопектином, очень мало с амилозой. В отличие от крахмала картофеля крахмал зерна злаков содержит только 0,02-0,04% фосфата. В данном контексте термин фосфорилированный крахмал относится к крахмалу, который имеет фосфатные группы, связанные в виде моноэфиров в положениях С-3 и/или С-6 глюкозных единиц. Уровень фосфатных групп в пробах крахмала может быть легко измерен способами, известными в данной области, предпочтительно способом с малахитовым зеленым, как описано в примере 1, и подходящим образом выражен в виде молей на мг крахмала. Уровень гликозил-6-фосфатных остатков в пробах крахмала может быть легко измерен анализом амилоглюкозидазы, как описано в примере 1.

Деградация крахмала.

Начальная стадия деградации крахмала, как в листьях, так и в прорастающих семенах, включает в себя фермент эндоамилазу (α-амилазу, ЕС 3.2.1.1), который в прорастающем семени секретируется из алейронового слоя, а в листьях присутствует в хлоропластах. Этот фермент атакует крахмал в конкретных сайтах на крахмальном зерне (грануле), вызывая питтинг (изъязвление) на поверхности крахмального зерна (гранулы). Дополнительная атака на молекулах крахмала производится α-глюканфосфорилазой (ЕС 2.4.1.1), которая производит глюкозо-6-фосфат из нередуцирующего конца цепей а-1,4-глюкана, и деветвящими ферментами, такими как изоамилаза (ЕС3.2.1.68) и пуллуланаза (ЕС3.2.2.142), которые удаляют точки ветвления α-1,6. Другими участвующими ферментами являются экзоамилаза β-амилаза (ЕС3.2.1.2), которая высвобождает мальтозу из нередуцирующего конца цепей глюкана, диспропорционирующий фермент (Ό-фермент, ЕС2.4.1.25) и α-глюкозидаза (мальтаза, ЕС3.2.1.20) или мальтозофосфорилаза (ЕС2.4.1.8), которые могут действовать на линейные цепи. В АгаЫборЖ и других двудольных растениях активность β-амилазы превышает активность всех других метаболизирующих глюкан ферментов приблизительно на порядок величин и, по-видимому, присутствует как внутри, так и снаружи хлоропластов.

Глюкан-вода-дикиназа (ΟνΌ, ЕС2.7.9.4), по-видимому, регулирует степень, с которой другие ферменты атакуют гранулы (зерна) крахмала. ΟνΌ переносит β-фосфат АТФ в положение либо С6, либо С3 гликозильных единиц в амилопектине, и присутствие таких фосфатов может быть сигналом для протекания деградации. Считалось, что присутствие фосфатных групп может изменять электростатические взаимодействия между цепями глюкана или с взаимодействующими белками, что позволяет инициировать этот процесс. Ο\νΌ становится связанным с крахмальными зернами (гранулами) листа во время расщепления крахмала (Ктйе е! а1. 2000) и может быть более активным в это время. Сама активность ΟνΌ, повидимому, регулируется, по меньшей мере, в некоторых растениях в циркадном режиме посредством циклов день/ночь.

Антисмысловые эксперименты для уменьшения экспрессии ΟνΌ (также называемого белком КТ или ОК1) в картофеле уменьшали связанный с крахмалом фосфат на 90% (У1к8о-№е18еп е! а1., 2001). Мутация в гомологичном гене в АгаЫборЖ (НаПапа (называемом кех1 для фенотипа избытка крахмала) была ассоциирована с супрессией содержания фосфата крахмала и подтверждала участие ΟνΌ в фосфорилировании крахмала (2ее!пап апб Кеек, 1999). Кроме того, супрессированные линии мутанта как АгаЫбор- 12 025360

818, так и картофеля обнаруживали фенотип избытка крахмала, где крахмал накапливался в количествах за пределами нормальных уровней в листьях, подтверждая роль О\УЭ в деградации транзиторного крахмала. В этих исследованиях не наблюдали модификации структуры крахмала. Уменьшенное содержание фосфата крахмала в клубнях картофеля сопровождалось уменьшением подслащивания на холоду клубней картофеля (ЬогЬейЬ с1 а1., 1998), что позволяет предположить уменьшение амилазной или другой гидролазной активности. Мутанты ЛгаЫбор818 8ех1, поврежденные в отношении метаболизма транзиторного крахмала, также имели измененный метаболизм углеводов, росли медленно и поздно зацветали (Уи е1 а1., 2001).

В 2005 году Ваии8даагб е1 а1. определили новый класс вода-дикиназы, фосфоглюкоза-вода-дикиназы (РУБ). Этот фермент, похожий на С\УЭ. но отличающийся от него, был активным в дополнительном фосфорилировании предварительно фосфорилированного крахмала (Койид е1 а1., 2005). Юйе е1 а1. предположили, что фосфорилирования в положениях С3 или С6 гликозильных остатков в крахмале катализировались Р\УЭ и О\УЭ соответственно (Кгйе О. е1 а1., 2006 ).

Деградация и фосфорилирование крахмала в прорастающих семенах зерновых культур являются частично выясненными, но они являются высоко специализированной системой, в которой участвуют разрушение ткани и индукция гидролитического фермента.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает улучшения в продуктивности или утилизации растений модификацией фосфорилирования и/или деградации крахмала в растениях и основывается на наблюдениях ассоциации между этими двумя событиями. Эта модификация фосфорилирования и/или деградации крахмала может иметь место в транзиторном крахмале, например, в листьях растения, в запасном крахмале, например, в зерне, или в обоих случаях. Эта модификация растения, предпочтительно зернового растения, в соответствии с этим изобретением включает в себя, без ограничения, одно или несколько изменений активности или количества ферментов фосфорилирования и/или деградации (расщепления) крахмала в листьях и/или эндосперме.

В данном контексте модификация обозначает изменение в материале или его функции, которое может быть увеличением или уменьшением количества, активности, скорости продуцирования, скорости инактивации, скорости распада, задержки появления, добавления или удаления материала, мутации или любой их комбинации, пока имеется изменение функции в качестве следствия. В данном контексте модуляция функционального уровня или сходный термин обозначает либо увеличение, либо уменьшение функционального уровня представляющего интерес гена или белка. Функциональный уровень должен пониматься как термин, относящийся к уровню активного белка, в случае уровня белка, способного выполнять фосфорилирование крахмала или деградацию крахмала. Этот функциональный уровень является комбинацией действительного уровня белка, присутствующего в клетке-хозяине, и удельной активности этого белка. Таким образом, этот функциональный уровень может быть, например, модифицирован увеличением или уменьшением действительной концентрации белка в клетке-хозяине, которое может быть легко достигнуто изменением экспрессии гена, кодирующего этот белок. Этот функциональный уровень может быть также модифицирован модуляцией удельной активности этого белка. Такое увеличение или уменьшение удельной активности может быть достигнуто экспрессией вариантного белка с более высокой или более низкой удельной активностью или заменой эндогенного гена, кодирующего релевантный белок, аллелем, кодирующим такой вариант. Увеличение или уменьшение удельной активности может быть также достигнуто экспрессией эффекторной молекулы. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии подходящей кодирующей последовательности, или активности, или количества фермента выбирают таким образом, что он является по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 80% или даже приблизительно 100%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 500% или по меньшей мере на 1000% более высоким или по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% более низким, чем ссылочный уровень экспрессии, или уменьшенным до недетектируемого уровня.

В данном контексте термины модификация, изменение, увеличение, увеличенный, уменьшение, уменьшенный, ингибированный, мутантный или т. п. считаются относительными терминами, т.е. в сравнении с состоянием дикого типа или неизмененным состоянием. Растение дикого типа называют здесь также контрольным растением и эти термины являются взаимозаменяемыми. Термин уровень белка относится к количеству конкретного белка, например ОХУЭ, которое может быть измерено любыми способами, известными в данной области, такими как, например, анализ Вестерн-блотов, или другими иммунологическими способами. Уровнем активности фермента называют количество конкретного фермента, измеренное в анализе фермента. Должно быть понятно, что этот уровень активности фермента может быть измененным в мутанте, если продуцируется более или менее активный белок, но не уровень экспрессии (количество) самого белка. Напротив, количество белка может быть измененным, но активность (на единицу белка) остается одной и той же. Уменьшения как в количестве, так и в активности также являются возможными, например, когда экспрессия гена, кодирующего этот фер- 13 025360 мент, уменьшаются транскрипционно или посттранскрипционно. В некоторых вариантах осуществления уменьшение уровня белка или активности, например 0\И, равно по меньшей мере 40% или по меньшей мере 60% в сравнении с уровнем белка или активности в листе или эндосперме немодифицированного зернового растения, например пшеницы, или по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. Это уменьшение уровня белка или активности фермента может иметь место на любой стадии в развитии листа, семени или зерна, в частности во время дневного времени, когда имеет место фотосинтез, или во время стадии налива зерна, хотя крахмал синтезируется в развивающемся эндосперме, или на всех стадиях развития зерна вплоть до зрелости. Термин дикий тип имеет в данном контексте его обычное в области генетики значение и включает в себя растение, предпочтительно зерновое растение, культивары или генотипы которого не являются модифицированными, как описано здесь. Предпочтительными сортами дикого типа, которые являются легко доступными публично, являются: для мягкой (хлебопекарной) пшеницы, су. ВоЬ \ййе; для кукурузы (2еа таук), Коипбир Кеабу Сот 2; для риса, №рропЬаге; для сорго (8огдйит Ысо1ог), су. 8итас.

В одном варианте осуществления это изменение включает в себя уменьшение количества и/или активности 0\И в листьях или эндосперме растения, которое, как наблюдали, приводит к уменьшенному содержанию фосфата в крахмале листьев и/или зрелых семенах, например в зерне зернового растения. В другом варианте осуществления эта модификация включает в себя уменьшение активности Р\И, а также 0\И.

В следующем варианте осуществления эта модификация включает в себя уменьшение 0\И и увеличение амилазной активности в зерне злаков, предпочтительно α-амилазы. Другие осуществляющие деградацию крахмала ферменты, которые могут быть изменены в комбинации с любыми из вышеописанных ферментов, включают в себя β-амилазу, фосфорилазу или деветвящие крахмал ферменты, такие как изомальтаза или пуллуланаза. Этими изменениями могут быть, например, увеличенная активность, уменьшенная активность, измененная локализация или тайминг активности. При объединении изменений некоторых из этих ферментов характеристики крахмала другие, чем содержание фосфата, могут быть также изменены. В одном варианте модифицированное растение, предпочтительно зерновое растение, содержит изменения активности множественных вызывающих деградацию крахмала ферментов в эндосперме, предпочтительно включающие в себя уменьшение активности 0\И, так что содержание фосфата в крахмале этого зерна уменьшается. В следующем варианте осуществления активность одного или нескольких вызывающих деградацию крахмала ферментов изменяются в растениях в тканях других, чем эндосперм или листья, например активность 0\И может быть увеличена в эндосперме для компенсации некоторой потери активности, вызываемой трансгеном, кодирующим 0\Э-ингибируюшую молекулу, предназначенную первично для экспрессии в листьях, или активность амилазы, предпочтительно α-амилазы может уменьшаться в эндосперме. Этим изменением в активности фермента может быть увеличение или уменьшение в величине или изменение в тайминге экспрессии. Синтез крахмала может быть дополнительно улучшен сверхэкспрессией одного или нескольких ферментов биосинтеза крахмала в комбинации с уменьшением в 0\И. Гены, кодирующие такие ферменты, могут быть генами из любого из различных источников, известных в данной области, например из бактерий, зерновых растений или других источников, и могут быть модифицированы для изменения каталитических свойств, например изменения температурной зависимости этих ферментов (например, см. \О 94/09144).

Этот модифицированный фенотип может быть получен частичным или полным ингибированием экспрессии гена 0\И или генов 0\И и Р\И. Фенотип низкого содержания фосфата крахмала или т. п., в данном контексте относится к общему крахмалу, полученному из растения или части растения, например листа или зерна, имеющему содержание фосфата крахмала менее 0,02%, или альтернативно уменьшенное по меньшей мере на 50% относительно соответствующего контрольного крахмала. Степень, до которой ингибируется этот ген или эти гены, будет в некоторой степени определять характеристики крахмала, продуцируемого в зерне пшеницы. Любой из диапазона способов гель-электрофореза, проводимый на белках, экстрагированных из эндосперма модифицированной пшеницы, будет выявлять природу и степень модификации в отношении активности 0\И и/или Р\И. Модификация может происходить в виде уменьшения 0\И-активности, полной элиминации активности фермента или изменения в распределении 0\И или других ферментов в листе или эндосперме. Например, 0\И или другая активность может быть уменьшена действием на распределение этих ферментов в эндосперме, с уменьшением уровня фермента, который является связанным с гранулой крахмала (крахмальным зерном). Для проведения этих тестов крахмал может быть экстрагирован из эндосперма пшеницы, и белки в нем могут быть анализированы, например, как описано в Кайтап е1 а1., 1995. Способы, хорошо известные в данной области, такие как электрофорез в ДСН-ПААГ и иммуноблоттинг, проводят на фракциях растворимого крахмала и гранул крахмала, и эти результаты используют для идентификации растений или зерна, в которых произошли модификации в отношении 0\И или других ферментов.

Изменение активностей ферментов фосфорилирования или деградации крахмала может быть достигнуто введением одной или нескольких генетических вариаций в зерновое растение, предпочтительно пшеницу. То есть эти генетические вариации приводят, прямо или косвенно, к изменению активности

- 14 025360 ферментов в части растения во время роста и развития и вследствие этого к описанным здесь модификациям крахмала. Эта генетическая вариация может быть гетерологичным полинуклеотидом, который вводят в растение или клетку-предшественник, например, трансформацией или мутагенезом. Эта генетическая вариация может быть затем введена в различные генетические среды скрещиванием, как известно в области селекции растений.

Количество или активность ферментов, таких как С\УЭ или амилазы, в тканях или частях растения могут быть измерены с использованием любого способа, известного в данной области, например ферментативного анализа, способов иммунодетектирования, вестерн-блоттинга или анализов ЕЬ18А, или уровень соответствующих мРНК может быть измерен такими способами, как, например, анализ гибридизации нозерн-блоттинга или полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Уровень фосфорилирования крахмала может быть также измерен для указания уровней фермента во время синтеза крахмала. Зерновое растение или зерно, имеющие измененный уровень конкретного белка или активности фермента в его эндосперме, могут быть подвергнуты скринингу или отобраны на основе уменьшенного уровня этого белка или фермента (прямой анализ), или отбор может быть основан на фенотипе этого зерна или растения пшеницы, например на уменьшенном уровне фосфата или визуальном фенотипе этого растения или его части, например на щуплом зерне, или измененных свойствах гранул крахмала, или измененной морфологии растения. Растение пшеницы с измененными свойствами крахмала, используемые здесь, могут быть идентифицированы с использованием любого из способов, известных в данной области, либо непосредственно определением свойств крахмала, либо опосредованно, например детектированием присутствия генетической вариации в этом растении или его зерне. Это растение может быть одним растением в популяции растений пшеницы, например в селекции пшеницы.

Потенциал продуктивности.

Это изобретение обеспечивает растения с увеличенными характеристиками продуктивности. Примеры свойств увеличенной продуктивности включают в себя, но не ограничиваются ими, признаки, которые являются предпочтительными для фермера (растениевода), такие как рост, урожай, биомасса и жизненность, а также родственные свойства, такие как устойчивость к стрессу, засухе, вредителям или болезням, или улучшенные эстетические качества, такие как характеристики цветка или листа, признаки, которые являются предпочтительными для потребительских продуктов, собираемых из этого растения, такими как улучшенное содержание питательных или вкусовых веществ в пище или напитке человека или корме животных, или предпочтительными для установки для переработки кормов или промышленной установки, например, для улучшенных технологических свойств. В таких применениях эти растения обычно выращивают для использования их зерна, плодов или других частей растений, включающих в себя листья, стебли, листовые обертки (кукурузы), вегетативные части и т. п., в пищевых продуктах или напитках для человека или животных, в том числе для использования в качестве части силоса для животных, или для декоративных целей. В одном варианте осуществления растительный материал этого изобретения улучшал применение в качестве силоса для корма животных, например, как описано в публикации заявки на патент США с № И8 2006/0150278, включенной здесь в качестве ссылки. В этом варианте осуществления гетерологичный полинуклеотид предпочтительно экспрессируется от регуляторной последовательности транскрипции, которая экспрессируется преимущественно в вегетативных частях растения, предпочтительно листьях или стеблях, и даже более предпочтительно этот гетерологичный полинуклеотид экспрессируется при низких уровнях или недетектируемых уровнях в семенах этого растенияУ. величенный потенциал продуктивности может быть измерен любым способом, известным в данной области, в соответствии с представляющим интерес параметром.

Как описано в примерах, растения, имеющие уменьшенное фосфорилирование крахмала в результате понижающей регуляции продуцирования С\УЭ. обнаруживали также увеличенные уровни αамилазы. Таким образом, это описание обеспечивает способ получения генетически модифицированного растения, которое имеет уменьшенный уровень фосфорилирования крахмала и увеличенные эндогенные гликозилазы в сравнении с контрольным растением, причем этот способ включает в себя отбор из множества растений, которые содержат в их геноме гетерологичный полинуклеотид, функционально связанный с регуляторной последовательностью транскрипции, который кодирует агент, который понижающим образом регулирует фосфорилирование эндогенного крахмала, растения, которое понижающим образом регулирует активность фосфорилирования крахмала и в котором уровень эндогенной гликозилазы является увеличенным относительно контрольного растения. Альтернативно, этим гетерологичным полинуклеотидом может быть мутированный ген, например, содержащий индуцированную мутацию, соответствующую гену дикого типа, кодирующему фермент или регуляторный белок, участвующий в фосфорилировании крахмала, где результатом этой мутации является фосфорилирование крахмала. В данном контексте множеством растений называют по меньшей мере два растения, предпочтительно по меньшей мере 10 растений и даже более предпочтительно по меньшей мере 50, 100 или 200 растений. Обычно это множество растений, в каждом случае, содержит трансген или индуцированную мутацию, но не все растения обнаруживают одну и ту же степень модификации, обнаруживая некоторый диапазон в степени этого эффекта. Таким образом, способы этого изобретения могут включать в себя стадию отбора или идентификации, в которой растение, имеющее оптимальные уровни модификации, идентифицируют

- 15 025360 и отбирают.

В некоторых вариантах осуществления деградация крахмала, или уровень, или функциональная активность фермента, участвующего в деградации крахмала или фосфорилировании крахмала, понижающим образом регулируется до уровня меньшего чем приблизительно 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 15% и предпочтительно меньшего чем приблизительно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% относительно соответствующего контрольного растения для достижения увеличения потенциала продуктивности. В одном варианте осуществления это уменьшение деградации крахмала или уровня или функциональной активности фермента, участвующего в деградации крахмала или фосфорилировании крахмала, понижающим образом регулируется в фотосинтетической ткани, такой как, например, листья, для достижения увеличения потенциала продуктивности, или альтернативно, в запасающем органе для крахмала, предпочтительно семени. Предпочтительно в этом варианте осуществления это уменьшение приводит к существенному увеличению потенциала продуктивности, которое обычно равно по меньшей мере приблизительно 20, 25 или 30%, но особенно по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50 или 55% или более предпочтительно равно по меньшей мере приблизительно 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более высокому увеличению потенциала продуктивности относительно соответствующего контрольного растения при тех же самых условиях окружающей среды. Величина уменьшенной деградации крахмала или уменьшенного фосфорилирования крахмала может зависеть от других факторов, таких как вид или линия (сорт) и уровень, локализация или тайминг активности фермента деградации крахмала или фосфорилирования крахмала и/или уровень или активность их субстратов и/или вспомогательных молекул или кофакторов в пути деградации крахмала. Однако, считается, что любая оптимизация, которая может потребоваться в таком случае, может быть достигнута с использованием рутинных способов, в том числе описанных здесь способов.

Уменьшенная деградация крахмала может выполняться в тканях по всему растению, например, с использованием конститутивного промотора для запуска экспрессии гетерологичного гена, который понижающим образом регулирует деградацию крахмала. Альтернативно, она может выполняться в тканяхисточниках (листьях), в транспортных тканях или в тканях стока (эндосперме) с использованием тканеспецифического или регулируемого развитием промотора. Клетка стока и ткань стока относятся в данном контексте к клеткам, тканям и органам, которые содержат нетто-приток органического углерода, который входит в эти клетки в формие, другой, чем фиксация диоксида углерода, т. е. в виде сахаров или других углеводов. В растениях ткани стока включают в себя все нефотосинтезирующие ткани, а также фотосинтетические ткани с нетто-поступлением органического углерода, фиксированного другими фотосинтетическими клетками или полученного иным образом из окружающей среды или окружения другим способом, чем прямая фиксация диоксида углерода.

В другом варианте осуществления уровень фосфорилирования эндогенного крахмала модулируется с использованием ферментов фосфорилирования крахмала с различными функциональными активностями. Это может возникать из различий удельных активностей или стабильностей этих ферментов в клеточном компартменте, в котором выполняется деградация крахмала. В некоторых вариантах осуществления активность деградирующего крахмал фермента, который используется для деградации эндогенного крахмала, увеличивается по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% или даже по меньшей мере на приблизительно 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000% или уменьшается по меньшей мере на приблизительно 10, 20, 30 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 97, 98 или 99% или даже по меньшей мере на приблизительно 99,5 или 99,9% относительно уровня ссылочного фермента в контрольном растении. Деградирующие крахмал ферменты разных активностей могут быть природновстречающимися или могут быть получены синтетическими или рекомбинантными способами, например модификацией каталитического сайта или другого сайта (например, субстратсвязывающего сайта, кофакторсвязывающего сайта) ссылочного или исходного фермента. Обычно эта модификация достигается заменой, добавлением или делецией по меньшей мере одной аминокислоты в последовательности исходного фермента с использованием, например, целесообразных или установленных способов мутагенеза или комбинаторных химических способов, известных в данной области. Вариантные ферменты деградации крахмала могут содержать консервативные замены аминокислот. Консервативная замена аминокислоты является заменой, в которой конкретный аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, аминокислотный остаток в исходном ферменте подходящим образом заменяют другим аминокислотным остатком из того же самого семейства боковых цепей. Альтернативно, в другом варианте осуществления мутации могут быть введены случайным образом вдоль всего полинуклеотида или части полинуклеотида, которая коди- 16 025360 рует ссылочный фермент, например, насыщающим мутагенезом, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на активность этого фермента для идентификации мутантов с активностью, отличающейся от активности исходного фермента.

В других вариантах осуществления уровень и местоположение деградации эндогенного крахмала модулируют с использованием крахмалдеградирующего фермента, направленного на другие функциональные субклеточные компартменты. В иллюстративных примерах эта активность модифицируется в листе и/или семени. Это может достигаться экспрессией ядерного гена, приводящей к синтезу в цитозоле формы этого фермента без сигнальных последовательностей для транспорта в другие клеточные компартменты. В других иллюстративных примерах эта активность направляется в запасающий компартмент, такой как амилопласт или вакуоль, или в запасающий и транспортный компартмент, такой как внеклеточное (апоплазматическое) пространство, включением в последовательности этого фермента сигнала для транспорта этого фермента из цитозоля в желаемое клеточное пространство. Определенные сигнальные последовательности могут приводить к распределению фермента между двумя или более клеточными пространствами.

Эти способы включают в себя анализ растений или проростков такими способами, как электрофорез, хроматография (в том числе бумажная хроматография, тонкослойная хроматография, газовая хроматография и жидкостная хроматография высокого разрешения). Отдельные компоненты обычно идентифицируют сравнением профилей разделения со стандартами известной идентичности или аналитическими способами, такими как масс-спектрометрия и ядерная магнитно-резонансная спектроскопия. Например, может быть сделана ссылка на пример 9, Койшкоп, Тйе Огдатс СопкШиеШк о£ Шдйег Р1ап!к, Согйик Ргекк, Ыойй Атйегк!, И8А, 1980; Айатк е! а1., Апа1. Вюсйет., 266:11-84, 1999; Уегопеке е! а1., Εηζ. М1сгоЫа1 Тесй., 24:263-269, 1999; Непйпх е! а1., I. 1пкес! Рйукю1., 47:423-432, 2001; Тйотркоп е! а1., Сагйойуйга1е Кек., 357:149-161, 2001; и цитируемые в них ссылки. Углеводы могут быть анализированы с использованием стандартных протоколов, известных лицам с квалификацией в данной области.

Гены.

Данное изобретение включает в себя модификацию активности генов и конструирование и применение химерных генов. В данном контексте термин ген включает в себя последовательность дезоксирибонуклеотидов, которая включает в себя кодирующий белок район структурного гена или которая транскрибируется в клетке, но не транслируется, а также ассоциированные некодирующие и регуляторные районы. Такие ассоциированные районы обычно расположены смежно с этим кодирующим районом на 5'- и 3'-концах на расстоянии приблизительно 2 т.п.н. на каждой стороне. В этой связи этот ген может включать в себя регуляторные сигналы, такие как промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые природно ассоциированы с данным геном, или гетерологичные регуляторные сигналы, и в этом случае этот ген называют химерным геном. Последовательности, которые расположены 5' (слева) от кодирующего района и которые присутствуют на мРНК, называют 5'нетранслируемыми последовательностями. Последовательности, которые расположены 3' (справа) или ниже по ходу транскрипции от кодирующего района и которые присутствуют на мРНК, называют 3'нетранслируемыми последовательностями. Термин ген включает в себя как кДНК, так и геномные формы гена.

Г ен ОАЭ пшеницы или т. п. относится в данном контексте к нуклеотидной последовательности, кодирующей ОАЭ в пшенице, который может быть легко отличен от РАИ или других белков квалифицированными в данной области специалистами. Гены ОАЭ пшеницы включают в себя природновстречающиеся варианты, существующие в пшенице, в том числе гены, кодируемые геномами А, В и Ό пшеницы обыкновенной, а также не встречающиеся в природе варианты, которые могут быть получены квалифицированными специалистами в области генной модификации. В предпочтительном варианте осуществления ген ОАЭ является молекулой нуклеиновой кислоты, которая может присутствовать в пшенице или выделена или произведена из пшеницы, содержащей нуклеотиды, имеющие последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с кодирующим районом гена ОАЭ, показанную в 8Еф ГО N0: 2.

Аналогичным образом, ген РАИ пшеницы или т. п. обозначает нуклеотидную последовательность, кодирующую РАИ в пшенице, который может быть легко отличен от других дикиназ или других белков квалифицированными в данной области специалистами. Он включает в себя природновстречающиеся варианты генов, существующие в пшенице, в том числе гены, кодируемые геномами А, В и Ό пшеницы обыкновенной, а также не встречающиеся в природе варианты, которые могут быть получены квалифицированными специалистами в области генной модификации.

Геномная форма или клон гена, содержащего этот кодирующий район, может прерываться некодирующими последовательностями, называемыми интронами, или промежуточными районами, или промежуточными последовательностями. Интрон обозначает в данном контексте сегмент гена, который транскрибируется в виде части первичного РНК-транскрипта, но не присутствует в зрелой молекуле мРНК. Интроны удаляются или сплайсируются из ядерного или первичного транскрипта; таким образом, интроны отсутствуют в мессенджер-РНК (мРНК). Интроны могут содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры. Экзоны обозначают в данном контексте районы ДНК, соответствующие РНК- 17 025360 последовательностям, которые присутствуют в зрелой мРНК или молекуле зрелой РНК, в случаях, когда эта РНК не транслируется. мРНК действует во время трансляции, указывая последовательность или порядок аминокислот в возникающем полипептиде. Термин ген включает в себя синтетическую или слитую молекулу, кодирующую все или часть белков описанного здесь изобретения, и нуклеотидную последовательность, комплементарную любой из вышеописанных молекул. Ген может быть введен в подходящий вектор для внехромосомного поддержания в клетке или для интегрирования в геном-хозяина.

В данном контексте химерный ген обозначает любой ген, который не является природным геном в его природном местоположении. Обычно химерный ген содержит регуляторные и транскрибируемые или кодирующие белок последовательности, которые не обнаруживаются вместе в природе. Таким образом, химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые произведены из различных источников, или регуляторные и кодирующие последовательности, произведенные из одного и того же источника, но расположенные в порядке, отличающемся от порядка, обнаруживаемого в природе. Термин эндогенный используется здесь для обозначения вещества, которое в норме продуцируется в немодифицированном растении на той же самой стадии развития, на которой оно продуцируется в растении, применяемом в исследовании. Термин эндогенный ген относится к природному гену в его природном местоположении в геноме организма. В данном контексте рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты называют молекулу нуклеиновой кислоты, которая была сконструирована или модифицирована с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Термины чужеродный полинуклеотид, или экзогенный полинуклеотид, или гетерологичный полинуклеотид и т. п. относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, которую вводят в геном клетки экспериментальными манипуляциями. Они включают в себя последовательности генов, обнаруживаемые в этой клетке, пока этот введенный ген содержит некоторую модификацию (например, мутацию, присутствие гена селектируемого маркера и т. д.) относительно природно-встречающегося гена. Чужеродными или экзогенными генами могут быть гены, обнаруживаемые в природе, которые встроены в неприродный организм, природные гены, введенные в новое местоположение в природном хозяине, или химерные гены. Трансген является геном, который был введен в этот геном процедурой трансформации. Термин генетически модифицированные включает в себя введение генов в клетки, мутирование генов в клетках и изменение или модулирование регуляции гена в клетке или организмах, к которым были применены эти действия, или их потомстве.

Полинуклеотиды.

Данное изобретение относится к различным полинуклеотидам. В данном контексте термины полинуклеотид, или нуклеиновая кислота, или молекула нуклеиновой кислоты обозначают полимер нуклеотидов, который может быть ДНК, или РНК, или их комбинацией и включает в себя ιηΡΝΛ, οΚΝΛ, οΩΝΑ. ®ΝΆ, δίΚΝΆ, δΙιΡΝΛ и ΙιρΡΝΑ. Полинуклеотид может быть ДНК или РНК клеточного, геномного или синтетического происхожения, например, полученным на автоматизированном синтезаторе, и может быть объединен с углеводами, липидами, белком или другими веществами, помечен флуоресцентной группой или другими группами или присоединен к твердому носителю для выполнения конкретной определенной здесь активности. Нуклеотиды этого полимера могут быть модифицированы в соответствии с известными в данной области способами, например аналоги фосфодиэфирных связей включают в себя фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфороанилидат, фосфороамидат, но эти полинуклеотиды предпочтительно являются немодифицированными или модифицированными только в том случае, когда это происходит в клетке. Этот полимер может быть одноцепочечным, в основном двухцепочечным или частично двухцепочечным. Примером частично двухцепочечной РНК-молекулы является шпилечная РНК (ΗΡΝΛ), короткая шпилечная РНК (δΙιΡΝΛ) или самокомплементарная РНК, которая включает в себя двухцепочечный стебель, образованный спариванием оснований между нуклеотидной последовательностью и ее комплементом, и последовательность петли, которая ковалентно соединяет эту нуклеотидную последовательность и ее комплемент. Спаривание оснований обозначает в данном контексте стандартное спаривание между нуклеотидами, включающее в себя пары оснований С:И. Комплементарные обозначает два полинуклеотида, способные спаривать основания вдоль части их длин или вдоль полной длины одного или обоих полинуклеотидов. Термин полинуклеотид используется взаимозаменяемо с термином нуклеиновая кислота.

Под термином выделенный имеется в виду материал, который, по существу, или в основном не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его в его природном состоянии. В данном контексте выделенный полинуклеотид или выделенная нуклеиновая кислота обозначают полинуклеотид, который, по меньшей мере, частично выделен, предпочтительно, по существу, или в основном не содержит полинуклеотидных последовательностей того же самого типа, с которыми он ассоциирован или связан в его природном состоянии. Например, выделенный полинуклеотид включает в себя полинуклеотид, который был очищен или отделен от последовательностей, которые фланкируют его в природновстречающемся состоянии, например ДНК-фрагмент, который был отделен от последовательностей, которые являются обычно соседними относительно этого фрагмента. Предпочтительно этот выделенный полинуклеотид по меньшей мере на 90% свободен от других компонентов, таких как белки, углеводы, липиды и т. д. Термин рекомбинантный полинуклеотид относится в данном контексте к полинуклеоти- 18 025360 ду, образованному ίη νΐΐΓο манипулированием нуклеиновой кислоты с получением формы, обычно не обнаруживаемой в природе. Например, рекомбинантный полинуклеотид может находиться в форме экспрессирующего вектора. Обычно такие экспрессирующие векторы включают в себя регуляторную нуклеиновую кислоту транскрипции и трансляции, функционально присоединенную к этой нуклеотидной последовательности.

Данное изобретение относится к применению олигонуклеотидов. В данном контексте олигонуклеотиды являются полинуклеотидами с длиной до 50 нуклеотидов. Они могут быть РНК, ДНК или их комбинациями или производными. Олигонуклеотиды обычно являются относительно короткими одноцепочечными молекулами с длиной 10-30 нуклеотидов, обычно 15-25 нуклеотидов. При применении в качестве зонда или праймера в реакции амплификации минимальным размером такого олигонуклеотида является размер, требуемый для образования стабильного гибрида между этим олигонуклеотидом и комплементарной последовательностью на молекуле-мишени нуклеиновой кислоты. Предпочтительно эти олигонуклеотиды имеют длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов, даже более предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов.

Полинуклеотиды, используемые в качестве зонда, обычно конъюгированы с детектируемой меткой, такой как радиоизотоп, фермент, биотин, флуоресцентная молекула или хемилюминесцентная молекула. Олигонуклеотиды этого изобретения применимы в способах детектирования аллеля С\УБ или другого гена, связанного с представляющим интерес признаком, например модифицированным крахмалом. Такие способы используют, например, гибридизацию нуклеиновых кислот и во многих случаях включают в себя удлинение праймера подходящей полимеразой (используемой в ПЦР).

Один вариант олигонуклеотида этого изобретения включает в себя молекулы варьирующихся размеров определенных здесь молекул конкретных олигонуклеотидов и/или молекул, способных гибридизоваться, например, с геномом пшеницы, вблизи определенных здесь молекул конкретных олигонуклеотидов. Например, варианты могут содержать дополнительные нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4 или более), или менее нуклеотидов, пока они все еще гибридизуются с районом-мишенью. Кроме того, несколько нуклеотидов могут быть заменены без влияния на способность олигонуклеотида гибридизоваться с районом-мишенью. Кроме того, могут быть легко сконструированы варианты, которые гибридизуются вблизи (например, без ограничения, в пределах 50 нуклеотидов) района генома растения, где гибридизуются определенные здесь специфические олигонуклеотиды.

Термины вариант полинуклеотида и вариант и т. п. относятся к полинуклеотидам или их комплементарным формам, проявляющим существенную идентичность последовательности с последовательностью ссылочного полинуклеотида. Эти термины включают в себя также полинуклеотиды, которые отличаются от ссылочного полинуклеотида добавлением, делецией или заменой по меньшей мере одного нуклеотида. Таким образом, термины вариант полинуклеотида и вариант включают в себя полинуклеотиды, в которых один или несколько нуклеотидов добавлены, делетированы или заменены другими нуклеотидами. В этой связи в данной области хорошо известно, что в отношении ссылочного полинуклеотида могут быть произведены некоторые изменения, в том числе мутации, добавления, делеции и замены, посредством которых этот измененный полинуклеотид сохраняет биологическую функцию или активность ссылочного полинуклеотида. Таким образом, эти термины включают в себя полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, которые проявляют ферментативную или другую регуляторную активность, или полинуклеотиды, способные служить в качестве селективных зондов или других гибиридизующихся агентов. Термины вариант полинуклеотида и вариант включают в себя также природновстречающиеся аллельные варианты.

Под терминами соответствует чему-либо или соответствующий чему-либо имеют в виду полинуклеотид (а), имеющий нуклеотидную последовательность, которая, по существу, идентична или комплементарна всей или части последовательности ссылочного полинуклеотида, или (Ь) кодирующий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности в пептиде или белке. Эта фраза включает также в себя пептид или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая, по существу, идентична последовательности аминокислот в ссылочном пептиде или белке. Термины, используемые для описания родства последовательностей между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами, включают в себя ссылочную последовательность, окно сравнения, идентичность последовательности, процент идентичности последовательности, существенную идентичность и идентичные и определены в отношении минимального числа нуклеотидов или аминокислотных остатков или на протяжении полной длины. Термины идентичность последовательности и идентичность используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на ту степень, до которой эти последовательности являются идентичными на основе последовательных нуклеотидов или последовательных аминокислот на протяжении окна сравнения. Таким образом, термины процент идентичности последовательности рассчитывают сравнением двух оптимально сопоставленных последовательностей на протяжении окна сравнения, определением числа положений, при которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, А, Т, С, С, и) или идентичный аминокислотный остаток (например, А1а, Рго, 8ег, ТЬг, С1у, Уа1, Ьеи, 11е, РЬе, Туг, Тгр, Ьук, Агд, Ηίκ, Акр, С1и, Акп, С1п, Сук и Ме1) встречается в обеих по- 19 025360 следовательностиях, с получением числа совпадающих положении, делением этого числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножением результата на 100 для получения процента идентичности последовательности.

Процентная идентичность полинуклеотида может быть определена при помощи анализа САР (№еб1етаи апб ХиизсЬ, 1970) (программы ССС) с пенальти (штрафом) создания гэпа=5 и пенальти (штрафом) удлинения гэпа=0,3. Если нет других указаний, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 45 нуклеотидов, и этот анализ САР сопоставляет эти две последовательности на протяжении района по меньшей мере 45 нуклеотидов. Предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет длину 150 нуклеотидов, и этот анализ САР сопоставляет эти две последовательности на протяжении района по меньшей мере 150 нуклеотидов. Более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет длину 300 нуклеотидов, и этот анализ САР сопоставляет эти две последовательности на протяжении района по меньшей мере 300 нуклеотидов или по меньшей мере 400, 500 или 600 нуклеотидов в каждом случае. Может быть также сделана ссылка на семейство программ ВЬА§Т, например, описанных А11зс1ш1 е! а1., Νιιαί. Асйз Кез. 25:3389, 1997. Подробное обсуждение анализа последовательностей может быть найдено в ИиН 19.3 о£ АизиЬе1 е! а1., Сиггеи! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ίοΐιη ХПеу & §оиз 1ис, 1994-1998, СЬар1ег 15.

Нуклеотидные или аминокислотные последовательности указываются как по существу сходные, когда такие последовательности имеют идентичность последовательностей по меньшей мере приблизительно 75%, конкретно по меньшей мере приблизительно 80%, более конкретно по меньшей мере приблизительно 85%, совсем конкретно приблизительно 90%, особенно приблизительно 95%, в частности приблизительно 100%, особенно предпочтительно они являются идентичными. Ясно, что, когда последовательности РНК описываются как, по существу, сходные с ДНК-последовательностями, или имеют определенную степень идентичности последовательностей с ДНК-последовательностями, тимин (Т) в этой ДНК-последовательности рассматривается как равный урацилу (И) в этой РНК-последовательности.

В отношении определенных полинуклеотидов будет понятно, что цифры %-ной идентичности более высокие, чем цифры, обеспеченные выше, будут включать в себя предпочтительные варианты. Таким образом, когда это применимо, в свете минимальных цифр %-ной идентичностипредпочтительно этот полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по предпочтительно по предпочтительно по предпочтительно по меньшей мере на 92%, меньшей мере на 94%, меньшей мере на 96%, меньшей мере на 98%, более предпочтительно по более предпочтительно по более предпочтительно по более предпочтительно по меньшей мере меньшей мере меньшей мере меньшей мере на 93%, на 95%, на 97%, на 99%, предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более более более более более более более более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентичной релевантной предложенной 8ЕС ГО ΝΟ.

Предпочтительно полинуклеотид этого изобретения, который кодирует полипептид с активностью СХО, имеет длину, большую чем 400, более предпочтительно большую чем 500, более предпочтительно большую чем 600, более предпочтительно большую чем 700, более предпочтительно большую чем 800, более предпочтительно большую чем 900 и даже более предпочтительно большую чем 1000 нуклеотидов.

Полинуклеотиды данного изобретения могут иметь в сравнении с природно-встречающимися молекулами одну или несколько мутаций, которые являются делециями, инсерциями или заменами нуклеотидных остатков. Мутанты могут быть либо природно-встречающимися (т.е. выделенными из природного источника), либо синтетическими (например, полученными выполнением сайт-направленного мутагенеза на конкретной нуклеиновой кислоте).

Данное изобретение относится к строгости условий гибридизации для определения степени комплементарности двух полинуклеотидов. Строгостью называют в данном контексте температурные условия и условия ионной силы и присутствие или отсутствие некоторых органических растворителей во время гибридизации. Чем выше строгость, тем более высокой будет комплементарность между нуклеотидной последовательностью-мишенью и меченой полинуклеотидной последовательностью. Строгими условиями называют температурные и ионные условия, при которых будут гибридизоваться только нуклеотидные последовательности, имеющие высокую частоту комплементарных оснований. В данном контексте термин гибридизуется при низкой строгости, средней строгости, высокой строгости или очень высокой строгости описывает условия гибридизации и промывки. Руководство для выполнения реакций гибридизации может быть найдено в Сиггеи! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ЖЬи ХПеу & §оиз Ν.Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6. В этой ссылке описаны водные и неводные способы, и может использоваться любой из них. В данном контексте термин гибридизуется при низкой строгости, средней строгости, высокой строгости или очень высокой строгости описывает условия гибридизации и промывки. Конкрет- 20 025360 ные условия гибридизации, приведенные здесь, являются следующими: 1) условия гибридизации низкой строгости в 6 Х хлориде натрия/цитрате натрия (δδϋ) при приблизительно 45°С с последующими двумя промывками в 0,2 Х δδϋ, 0,1% ДСН при 50-55°С; 2) условия гибридизации средней строгости в 6 Х δδί'.’ при приблизительно 45°С с последующими одной или несколькими промывками в 0,2 Х δδί'.', 0,1% ДСН при 60°С; 3) условия гибридизации высокой строгости в 6 Х δδί'.' при приблизительно 45°С с последующими одной или несколькими промывками в 0,2 Х δδί'.', 0,1% ДСН при 65°С; и 4) условия очень высокой строгости в 0,5М фосфате натрия, 7% ДСН при 65°С с последующими одной или несколькими промывками при 0,2 Х δδϋ, 1% ДСН при 65°С.

Полипептиды.

Термины полипептид и белок обычно используются взаимозаменяемо. Эти термины белки и полипептиды в данном контексте включают в себя также варианты, мутанты, модификации, аналоги и/или производные описанных здесь полипептидов этого изобретения. В данном контексте по существу очищенным полипептидом называют полипептид, который был отделен от липидов, нуклеиновых кислот, других пептидов и других молекул, с которыми он ассоциирован в его природном состоянии. Предпочтительно, по существу, очищенный белок является по меньшей мере на 60% свободным, более предпочтительно по меньшей мере на 75% свободным и более предпочтительно по меньшей мере на 90% свободным от других компонентов, с которыми он природно ассоциирован. Под рекомбинантным полипептидом имеют в виду полипептид, полученный с использованием рекомбинантных способов, т. е. посредством экспрессии рекомбинантного полипептида в клетке, предпочтительно клетке растения и более предпочтительно клетке зернового (злакового) растения.

Процентная идентичность одного полипептида относительно другого полипептида может быть определена при помощи анализа ОАР (№ей1етап аий АиизсЬ, 1970) (программы ОСО) с пенальти (штрафом) создания гэпа=5 и пенальти (штрафом) удлинения гэпа=0,3. Запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, и этот анализ ОАР сопоставляет эти две последовательности на протяжении района по меньшей мере 15 аминокислот. Более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 50 нуклеотидов, и этот анализ ОАР сопоставляет эти две последовательности на протяжении района по меньшей мере 50 аминокислот. Более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот, и этот анализ ОАР сопоставляет эти две последовательности на протяжении района по меньшей мере 100 аминокислот. Даже более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 250 аминокислот, и этот анализ ОАР сопоставляет эти две последовательности на протяжении района по меньшей мере 250 аминокислот.

В данном контексте биологически активным фрагментом является часть полипептида этого изобретения, которая сохраняет определенную активность полноразмерного полипептида. В особенно предпочтительном варианте осуществления этот биологически активный фрагмент способен фосфорилировать крахмал с образованием С6-фосфорилированного крахмала. Биологически активные фрагменты могут быть любого размера, пока они сохраняют определенную активность, но предпочтительно они имеют длину по меньшей мере 100 или 200 аминокислотных остатков.

Что касается определенного полипептида, будет понятно, что цифры %-ной идентичности более высокие, чем описанные выше цифры, будут включать в себя предпочтительные варианты. Таким образом, когда это возможно, предпочтительно этот полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более более более более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1% предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентичной релевантной представленной δΕΟ ΙΌ N0.

Мутанты аминокислотной последовательности полипептидов данного изобретения могут быть получены введением подходящих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту данного изобретения или синтезом ίη νίίτο желаемого полипептида. Такие мутанты включают в себя, например, делеции, инсерции или замены остатков в этой аминокислотной последовательности. В этой аминокислотной последовательности может производиться комбинирование делеции, инсерции и замены для получения конечной конструкции при условии, что конечный пептидный продукт имеет желаемые характеристики.

Мутантные (измененные) пептиды могут быть получены любым способом, известным в данной области. Например, полинуклеотид этого изобретения может быть подвергнут мутагенезу ίη νίίτο. Такие

- 21 025360 способы мутагенеза ίη νίΐΓΟ включают в себя субклонирование этого полинуклеотида в подходящий вектор, трансформацию этого вектора в штамм-мутатор, такой как Е. сой ХЬ-1 гей (§1га1адспс), и размножение этих трансформированных бактерий в течение подходящего числа генераций. В другом примере полинуклеотиды этого изобретения подвергают способам перетасовки ДНК, широко описанных Нагауата (1998). Эти способы перетасовки ДНК могут включать в себя гены, родственные генам этого изобретения, такие как гены С\УЭ из видов растений, других чем пшеница или ячмень, и/или включают в себя другие гены из того же самого растения, кодирующие сходные белки (например, гены С\УЭ пшеницы). Продукты, полученные из мутированной/измененной ДНК, могут быть легко подвергнуты скринингу с использованием описанных здесь способов для определения, обладают ли они, например, активностью С\УЭ.

В конструировании мутантов аминокислотной последовательности местоположение сайта мутации и природа мутации будет зависеть от подлежащего модификации свойства (подлежащих модификации свойств). Эти сайты для мутации могут быть идентифицированы индивидуально или последовательно, например (1) заменой сначала выбранными консервативными аминокислотами и затем более радикальными отборами в зависимости от полученных результатов, (2) делецией остатка-мишени или (3) инсерцией других остатков, смежных с локализованным сайтом.

Делеции аминокислот обычно находятся в диапазоне приблизительно 1-15 остатков, более предпочтительно приблизительно 1-10 остатков и обычно приблизительно 1-5 смежных остатков.

Мутанты с заменами имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле полипептида и другой остаток, инсертированный на его место. Представляющие наибольший интерес сайты для заменяющего мутагенеза включают в себя сайты, идентифицированные в качестве активного сайта (активных сайтов). Другими представляющими интерес сайтами являются сайты, в которых конкретные остатки, полученные из различных штаммов или видов, являются идентичными. Эти положения могут быть важными для биологической активности. Эти сайты, особенно сайты, находящиеся в последовательности трех других идентично консервативных сайтов, предпочтительно заменяются относительно консервативным образом. Такие консервативные замены показаны в табл. 3 под заголовком примерные замены.

В объем этого изобретения включены также полипептиды этого изобретения, которые дифференциально модифицируются во время или после синтеза, например биотинилированием, бензилированием, гликозилированием, ацетилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связыванием с молекулой антитела или другого клеточного лиганда и т. д. Эти модификации могут служить для увеличения стабильности и/или биологической активности полипептида этого изобретения или служить в качестве лиганда для связывания другой молекулы.

Полипептиды данного изобретения могут быть получены различными путями, включающими в себя получение и извлечение природных полипептидов, получение и извлечение рекомбинантных полипептидов и химический синтез этих полипептидов. В одном варианте осуществления выделенный полипептид данного изобретения получают культивированием клетки, способной экспрессировать этот полипептид, в условиях, эффективных для продуцирования этого полипептида, и извлечением этого полипептида. Предпочтительной для культуры клеткой является рекомбинантная клетка данного изобретения. Эффективные условия культивирования включают в себя, но не ограничиваются ими, эффективные среды, биореактор, температуру, рН и кислородные условия, которые позволяют продуцирование полипептида. Эффективной средой называют любую среду, в которой клетку культивируют для продуцирования полипептида данного изобретения. Такая среда обычно включает в себя водную среду, имеющую ассимилируемые источники углерода, азота и фосфатов и подходящие соли, минеральные вещества, металлы и другие нутриенты, такие как витамины. Клетки данного изобретения могут культивироваться в общепринятых ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, тест-пробирках, микротитрационных планшетах и чашках Петри.

Культивирование проводят при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. Такие условия культивирования известны специалисту с обычной квалификацией в данной области.

Данное изобретение относится к элементам, которые являются функционально соединенными или связанными. Термины функционально соединенные или функционально связанные и т. п. относятся к связыванию полинуклеотидных элементов в функциональной связи. Обычно функционально соединенные последовательности нуклеиновых кислот являются непрерывно связанными и, когда необходимо соединение двух кодирующих белок районов, непрерывными и находящимися в одной рамке считывания. Кодирующая последовательность является функционально присоединенной к другой кодирующей последовательности, когда РНК-полимераза будет транскрибировать эти две кодирующие последовательности в единую РНК, которая при трансляции затем транслируется в единый полипептид, имеющий аминокислоты, произведенные из обеих кодирующих последовательностей. Эти кодирующие последовательности не должны быть обязательно смежными друг с другом, пока эти экспрессируемые последовательности в конечном счете процессируются с образованием желаемого белка.

- 22 025360

В данном контексте термин цис-действующая последовательность, цис-действующий элемент, или цис-регуляторный район, или регуляторный район, или подобный термин должен пониматься как любая последовательность нуклеотидов, которая при помещении подходящим образом относительно экспрессируемой генетической последовательности способна регулировать, по меньшей мере, частично экспрессию этой генетической последовательности. Квалифицированным в данной области специалистам будет известно, что цис-регуляторный район может быть способен к активации, сайленсингу, усилению, репрессии или изменению другим образом уровня экспрессии и/или специфичности в отношении типа клеток и/или связанной с развитием специфичности последовательности гена на транскрипционном или посттранскрипционном уровне. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения цисдействующей последовательностью является активаторная последовательность, которая усиливает или стимулирует экспрессию экспрессируемой генетической последовательности.

Функциональное присоединение промоторного или энхансерного элемента к транскрибируемому полинуклеотиду означает помещение этого транскрибируемого полинуклеотида (например, кодирующего белок полинуклеотида или другого транскрипта) под регуляторный контроль промотора, который затем регулирует транскрипцию этого полинуклеотида. В конструировании комбинаций гетерологичный промотор/структурный ген предпочтительно помещать промотор или его вариант на расстоянии от сайта старта транскрипции транскрибируемого полинуклеотида, которое является приблизительно таким же, что и расстояние между этим промотором и геном, который он регулирует, в его природной обстановке; т. е. геном, из которого получен этот промотор. Как известно в данной области, некоторая вариация в этом расстоянии может осуществляться без потери функции. Подобным образом предпочтительное помещение элемента регуляторной последовательности (например, оператора, энхансера и т. д.) относительно транскрибируемого полинуклеотида, подлежащего помещению под его контроль, определяется положением этого элемента в его природной обстановке; т. е. в генах, из которых он получен.

Термин промотор или промоторная последовательность используется здесь в его самом широком смысле и включает в себя район гена, обычно слева (5') от кодирующего РНК района, который регулирует инициацию и уровень транскрипции. Промотор включает в себя регуляторные последовательности транскрипции классического геномного гена, включающего в себя последовательности ТАТАбокса и ССААТ-бокса, а также дополнительные регуляторные элементы (т. е. расположенные слева активирующие последовательности, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию гена в ответ на связанные с развитием и/или окружающей средой стимулы, или тканеспецифическим или специфическим в отношении типа клеток образом. Промотор обычно, но не обязательно (например, в случае некоторых промоторов ΡοΙΙΙΙ), расположен слева от структурного гена, экспрессию которого он регулирует. Кроме того, регуляторные элементы, содержащие промотор, обычно расположены в пределах 2 т.п.н. от стартового сайта транскрипции этого гена. Промоторы могут содержать дополнительные специфические регуляторные элементы, расположенные более дистально относительно стартового сайта, для дополнительного усиления экспрессии в клетке и/или изменения тайминга или индуцируемости экспрессии структурного гена, к которому они функционально присоединены.

Конститутивным промотором называют промотор, который управляет экспрессией функционально связанной транскрибируемой последовательности во многих или всех тканях растения. Термин конститутивный в данном контексте не обязательно указывает на то, что этот ген экспрессируется на одном и том же самом уровне во всех типах клеток, но указывает на то, что этот ген экспрессируется в широком диапазоне типов клеток, хотя часто детектируется некоторое вариирование в уровне экспрессии. Селективная экспрессия относится в данном контексте к экспрессии почти исключительно в конкретных органах этого растения, таких как, например, эндосперм, зародыш, листья, плоды, клубни или корень. В одном варианте осуществления промотор экспрессируется во всех фотосинтетических тканях, которые могут соответствовать всем находящимся на воздухе (воздушным) частям этого растения, например, промотор, который участвует в экспрессии гена, необходимого для фотосинтеза, такой как промоторы малой субъединицы рубиско. Этот термин может также относиться к экспрессии на конкретных стадиях развития в органе, например, в раннем или позднем эмбриогенезе или различных стадиях зрелости; или к экспрессии, которая является индуцируемой определенными условиями окружающей среды или обработками. Таким образом, селективная экспрессия может контрастировать с конститутивной экспрессией, которая относится к экспрессии во многих или во всех тканях растения при большинстве или при всех условиях, испытываемых растением.

Селективная экспрессия может быть также результатом компартментации продуктов экспрессии генов в конкретных тканях, органах растений или стадий развития. Компартментация в конкретных субклеточных местоположениях, таких как цитозоль, вакуоль или апопластическое пространство, может быть достигнута включением в эту структуру продукта гена соответствующих сигналов для транспорта в требуемое клеточное пространство или в случае полуавтономных органелл (пластид и митохондрий) интегрированием трансгена с подходящими регуляторными последовательностями непосредственно в геном этой органеллы.

Тканреспецифический промотор или органоспецифический промотор является промотором, который преимущественно экспрессируется в одной ткани или одном органе относительно многих других

- 23 025360 тканей или органов, предпочтительно большинства, если не всех других тканей или органов в растении. Обычно этот промотор экспрессируется при уровне, в 10 раз более высоком в конкретной ткани или в конкретном органе, чем в других тканях или органах. Одним иллюстративным тканеспецифическим промотором является промотор для гена глютенина высокой молекулярной массы (НМ\У), Вх17. Под термином специфический промотор для ткани стока метаболитов имеется в виду промотор, который преимущественно управляет экспрессией функционально связанной транскрибируемой последовательности в ткани стока метаболитов растения (например, эндосперме, тканях плодов, ткани клубней, ткани семян, ткани стеблей злаков (соломин) или ткани листа-стока) в сравнении с экспрессией в других тканях этого растения, включающих в себя ткани-источники (например, лист).

Промоторы, рассматриваемые данным изобретением, могут быть природными относительно растения-хозяина, подлежвщего трансформации, или могут быть получены из альтернативного источника, где этот район является функциональным в растении-хозяине. Другие источники включают в себя Т-ДНКгены, такие как промоторы генов для биосинтеза нопалина, октапина, маннопина или промоторы других опинов; промоторы из растений, такие как промоторы убиквитинов, такие как промотор ИЫ из гена иЫ-1 кукурузы, С11П81еп8еп е! а1., (1996) (см., например, и.8. патент № 4962028) или промоторы актина; тканеспецифические промоторы (см., например, патент США № 5459252, выданный СопкПпд е! а1.; \УО 91/13992, выданный Абуапсеб ТесЬио1од^е8); промоторы из вирусов (в том числе специфических в отношении хозяина вирусов) или частично или полностью синтетические промоторы. Многочисленные промоторы, которые являются функциональными в однодольных и двудольных растениях, хорошо известны в данной области (см., например, Огеуе, (1983), 8а1отоп е! а1., (1984), Оагйпке1 е! а1., (1983); Вагкег е! а1., (1983); в том числе различные промоторы, выделенные из растений и вирусов, такие как промотор вируса мозаичной болезни цветной капусты (СаМУ 358, 198). Известны многие районы тканеспецифических промоторов, такие как промотор малой субъединицы Рубиско, который преимущественно экспрессируется в ткани листа. Другие районы инициации транскрипции, которые преимущественно обеспечивают транскрипцию в определенных тканях или при определенных условиях выращивания, включают в себя районы из напина, АСР семени или листа, зеина и т. п. Известны также специфические для плодов промоторы, одним из таких промоторов является промотор Е8, описанный ОеПкпап е! а1. (1988) и ОеПаРеппа е! а1. (1989). Не ограничивающие способы оценивания промоторной активности описаны МебЬеггу е! а1. (1992, 1993), 8атЬгоок е! а1. 1989 и МсРНегеоп е! а1. (И.8. патент № 5164316).

Альтернативно или дополнительно, этот промотор может быть индуцибельным (индуцируемым) промотором или регулируемым стадией развития промотором, который способен запускать экспрессию введенного полинуклеотида на подходящей стадии развития этого растения. В этом последнем варианте осуществления этот регуляторный элемент транскрипции является подходящим образом регулируемым развитием промотором для регуляции тайминга экспрессии. Выбор промотора может сделать возможной специфическую экспрессию введенного полинуклеотида, хронометрируемую для использования преимущества флуктуации уровней крахмала. Последовательности промоторов могут включать в себя цисдействующие последовательности, которые регулируют транскрипцию, где эта регуляция включает в себя, например, химическую или физическую индукцию (например, регуляция на основе метаболитов, света или других физико-химических факторов), или регуляцию на основе дифференцировки клеток (например, ассоциированную с листьями, корнями, семенами или т.п. в растениях; см., например, патент США № 5459252, описывающий корнеспецифический промотор). Таким образом, промоторный район или регуляторную часть такого района получают из подходящего гена, который таким образом регулируется. Например, ген 1,5-рибулозобисфосфаткарбоксилазы индуцируется светом и может быть использован для инициации транскрипции. Известны другие гены, которые индуцируются стрессом, температурой, поранением, действиями патогенов и т. д.

Другие цис-действующие последовательности, которые могут быть использованы, включают в себя энхансеры транскрипции и/или энхансеры трансляции. Энхансерные районы хорошо известны в данной области и могут включать в себя кодон инициации трансляции АТО и смежные последовательности. Этот кодон инициации должен находиться в фазе с рамкой считывания кодирующей последовательности, относящейся к чужеродному или экзогенному полинуклеотиду, для гарантии трансляции всей последовательности. Сигналы регуляции трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различные происхождения, как природное, так и синтетическое. Районы инициации трансляции могут быть обеспечены из источника района инициации транскрипции или из чужеродного или экзогенного полинуклеотида. Эта последовательность может быть также произведена из источника промотора, выбранного для запуска транскрипции и может быть специфически модифицирована таким образом, что она увеличивает трансляцию мРНК.

Примеры энхансеров транскрипции включают в себя, но не ограничиваются ими, элементы из промотора СаМУ 358 и генов октопинсинтазы, например, описанные Ьа8! е! а1. (патент США № 5290924, который включен здесь в качестве ссылки).

Конструкция нуклеиновой кислоты данного изобретения обычно содержит 3'-нетранслируемую последовательность приблизительно 50-1000 пар нуклеотидных оснований, которая может включать в себя последовательность терминации транскрипции. 3'-нетранслируемая последовательность может содер- 24 025360 жать сигнал терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования характеризуется влиянием на добавление участков полиадениловой кислоты к 3 '-концу мРНК-предшественника. Сигналы полиаденилирования обычно узнаются по присутствию гомологии с канонической формой 5'ААТААА-3', хотя встречаются и вариации. Примерами подходящих 3'-нетранслируемых последовательностей являются 3'-транскрибируемые нетранслируемые районы, содержащие сигнал полиаденилирования из гена нопалинсинтазы (ηοδ) АдгоЪас!егшт 1итсГас1СП5 (Веуаи с1 а1., (1983) и терминатор для транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы АдгоЪаСегшт 1итеГас1еи5. Альтернативно, подходящие 3'нетранслируемые последовательности могут быть произведены из генов растений, таких как 3'-конец генов ингибитора I или II протеазы из картофеля или томата, гены запасных белков сои и ген малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (88КИВ18С0), хотя могут быть также использованы другие 3'-элементы, известные специалистам с квалификацией в данной области. Альтернативно, 3нетранслируемые регуляторные последовательности могут быть получены бе ηονο, как описано, например, в статье Аи (Мебюбз ίη Еп/уто1оду. 153:292, 1987), которая включена здесь в качестве ссылки.

Поскольку ДНК-последовательность, инсертированная между сайтом инициации транскрипции и стартом кодирующей последовательности, т. е. нетранслируемая 5'-лидерная последовательность (5'ИТК) может влиять на экспрессию гена, можно также использовать конкретную лидерную последовательность. Подходящие лидерные последовательности включают в себя последовательности, которые содержат последовательности, выбранные для прямой оптимальной экспрессии чужеродной или эндогенной ДНК-последовательности. Например, такие лидерные последовательности включают в себя предпочтительную консенсусную последовательность, которая может увеличивать или сохранять стабильность мРНК и предотвращать неподходящую инициацию трансляции, как описано, например, ΙοδΗί (1987).

Кроме того, могут быть использованы нацеливающие последовательности для нацеливания на фермент, кодируемый этим чужеродным или экзогенным полинуклеотидом, во внутриклеточный компартмент, например в хлоропласт, в клетках растений или во внеклеточное окружение. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность транспортного или сигнального пептида, может быть функционально связана с последовательностью, которая кодирует выбранный фермент рассматриваемого изобретения, так что при трансляции этот транспортный или сигнальный пептид может транспортировать этот фермент в конкретное внутриклеточное или внеклеточное место назначения и затем может быть посттрансляционно удален. Транспортные или сигнальные пептиды действуют, облегчая транспорт белков через внутриклеточные мембраны, например мембраны эндоплазматического ретикулума, вакуоли, везикулы, пластиды, митохондрии и плазмалеммы. Например, нацеливающая последовательность может направлять желаемый белок в конкретную органеллу, такую как вакуоль или пластида (например, хлоропласт), а не в цитозоль. Таким образом, конструкция нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать кодирующую транспортный пептид последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную между районом промотора и чужеродным или экзогенным полинуклеотидом.

Векторы.

Данное изобретение использует векторы для манипуляции или переноса генетических конструкций. Под вектором имеют в виду молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК-молекулу, полученную, например, из плазмиды, бактериофага или вируса растений, в которую может быть инсертирована или клонирована последовательность нуклеиновой кислоты. Вектор предпочтительно содержит один или несколько уникальных сайтов рестрикции и может быть способен к автономной репликации в определенной клетке-хозяине, в том числе клетке-мишени, или ткани-мишени, или клеткепредшественнике, или ткани-предшественнике, или быть интегрируемым с геномом определенного хозяина, так что эта клонированная последовательность является воспроизводимой. Таким образом, этот вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует в виде внехромосомной частицы, репликация которой не зависит от хромосомной репликации, например, в виде линейной или замкнутой кольцевой плазмиды, внехромосомного элемента, минихромосомы или искусственной хромосомы. Этот вектор может содержать любые средства для гарантии саморепликации. Альтернативно, этот вектор может быть вектором, который при введении в клетку интегрируется в геном реципиентной клетки и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), в которую (в которые) он был интегрирован. Векторная система может содержать единственный вектор или единственную плазмиду, два или более вектора или две или более плазмиды, которые вместе содержат общую ДНК, подлежащую введению в геном этой клетки-хозяина или транспозон. Выбор вектора будет обычно зависеть от совместимости этого вектора с клеткой, в которую должен быть введен этот вектор. Этот вектор может также включать в себя селектируемый маркер, такой как ген устойчивости к антибиотику, который может быть использован для отбора подходящих трансформантов. Примеры таких генов устойчивости хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам.

Конструкция нуклеиновой кислоты этого изобретения может быть введена в вектор, такой как плазмида. Плазмидные векторы обычно включают в себя дополнительные последовательности нуклеи- 25 025360 новых кислот, которые обеспечивают легкий отбор, амплификацию и трансформацию экспрессионной кассеты в прокариотические и эукариотические клетки, например произведенные из рИС векторы, произведенные из р8К векторы, произведенные из рОЕМ векторы, произведенные из р8Р векторы или произведенные из рВ8 векторы. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот включают в себя сайты инициации репликации для обеспечения автономной репликации этого вектора, гены селектируемых маркеров, предпочтительно кодирующие устойчивость к антибиотикам или гербицидам, уникальные сайты множественного клонирования, обеспечивающие множественные сайты для инсертирования последовательностей нуклеиновых кислот или генов, кодируемых в этой конструкции нуклеиновой кислоты, и последовательности, которые усиливают трансформацию прокариотических и эукариотических клеток (в частности, клеток растений).

Под маркерным геном имеют в виду ген, который придает определенный фенотип клеткам, экспрессирующим этот маркерный ген, и, следовательно, позволяет отличать такие трансформированные клетки от клеток, которые не имеют такого маркера. Ген селектируемого маркера придает признак, на который может проводиться отбор, на основе устойчивости к селективному агенту (например, гербициду, антибиотику, облучению, нагреву или другой обработке, повреждающей нетрансформированные клетки). Поддающийся скринингу маркерный ген (или репортерный ген) придает признак, который может быть идентифицирован посредством наблюдения или тестирования, т. е. посредством скрининга (например, активность β-глюкуронидазы, люциферазы, ОРР или другого фермента, не присутствующего в нетрансформированных клетках). Этот маркерный ген и представляющая интерес нуклеотидная последовательность не должны быть связанными.

Для облегчения идентификации трансформантов конструкция нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит ген селектируемого или поддающегося скринингу маркера в виде чужеродного или экзогенного полинуклеотида или в дополнение к чужеродному или экзогенному полинуклеотиду. Фактический выбор маркера не является решающим, пока он является функциональным (т. е. селективным) в комбинации с выбранными клетками растений. Маркерный ген и представляющий интерес чужеродный или экзогенный полинуклеотид не должны быть связанными, так как котрансформация несвязанных генов, как, например, описано в патенте США № 4399216, также является эффективным способом в трансформации растений.

Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, например устойчивость к ампициллину, канамицину, эритромицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Примеры селектируемых маркеров для отбора трансформантов растений включают в себя, но не ограничиваются ими, ген Ьуд, который кодирует устойчивость к гигромицину В; ген неомицинфосфотрансферазы (пр1), придающий устойчивость к канамицину, паромомицину, О418 и т. п., например, как описано Ройукик с1 а1. (Мо1. Оеп. Оепек, 799:183, 1985); ген глутатион-8-трансферазы из печени крысы, придающий устойчивость к произведенным из глутатиона гербицидам, описанный, например, в ЕР-А 256223; ген глутаминсинтетазы, придающий после сверхэкспрессии устойчивость к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, как описано, например, в \УО 87/05327, ген ацетилтрансферазы из 81герЮтусе5 утйосЬготодепек, придающий устойчивость к этому селективному агенту фосфинотрицину, как описано, например, в ЕР-А 275957, ген, кодирующий 5-енолшикимат-3фосфатсинтазу (ЕР8Р8), придающий устойчивость к Ν-фосфонометилглицину, как описано, например, НшсЬее е1 а1. (Вю1есЬ., 6:915, 1988), ген Ьаг, придающий устойчивость к биалофосу, как описано, например, в \УО 91/02071; ген нитрилазы, такой как Ьхп из 1<1еЬые11а о/аенае, который придает устойчивость к бромоксинилу (81а1кег е1 а1., 8с1епсе, 242:419, 1988); ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΡΚ), придающий устойчивость к метотрексату (Т1Ы1е1 е1 а1., 1. Вю1. СЬет., 263:12500, 1988); мутантный ген ацетолактатсинтазы (ЛЬ8), который придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ингибирующим ЛЬ8 химикалиям (ЕР-А 154204); мутированный ген антранилатсинтазы, который придает устойчивость к 5-метилтриптофану; или ген далапондегалогеназы, который придает устойчивость к гербициду.

Предпочтительные поддающиеся скринингу маркеры включают в себя, но не ограничиваются ими, ген шйЛ, кодирующий фермент β-глюкуронидазу (ОИ8), для которого известны различные хромогенные субстраты, ген β-галактозидазы, кодирующий фермент, для которого известны хромогенные субстраты, ген экворина (РгакЬег е1 а1., 1985), который может быть использован в детектировании кальцийчувствительной биолюминесценции; ген зеленого флуоресцентного белка (№еЬ/ е1 а1., 1995); ген люциферазы (1ис) (Оте е1 а1., 1986), который позволяет детектирование биолюминесценции, и другие маркеры, известные в данной области. Под репортерной молекулой в данном описании подразумевают молекулу, которая посредством ее химической природы обеспечивает аналитически идентифицируемый сигнал, который облегчает определение активности промотора относительно белкового продукта.

Способы модификации экспрессии генов.

В некоторых вариантах осуществления уровень фосфорилирования и/или деградации эндогенного крахмала модулируют увеличением уровня экспрессии нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид для этих активностей в клетке растения, или уменьшением уровня экспрессии генов,

- 26 025360 кодирующих белки, участвующие в этих активностях в этом растении. Например, это может быть достигнуто на уровне транскрипции с использованием промоторов различной силы или индуцируемых промоторов, которые способны регулировать уровень транскрипта, экспрессируемого из этой кодирующей последовательности. В некоторых вариантах осуществления вводят гетерологичные последовательности, которые кодируют факторы транскрипции, которые модулируют или усиливают экспрессию генов, продукты которых понижающим образом регулируют фосфорилирование крахмала. Уровень экспрессии этого гена может модулироваться изменением числа копий на клетку конструкции, содержащей эту кодирующую последовательность и регуляторный элемент транскрипции, который функционально присоединен к ней и который является функциональным в этой клетке. Альтернативно, может быть отобрано множество трансформантов, и они могут быть подвергнуты скринингу на трансформанты с подходящим (благоприятным) уровнем и/или подходящей (благоприятной) специфичностью экспрессии трансгена, возникающими в результате влияния эндогенных последовательностей, находящихся вблизи сайта интеграции трансгена. Подходящими уровнем и характером экспрессии трансгена являются уровень и характер экспрессии, которые приводят к существенному увеличению потенциала продуктивности, такого как урожай или биомасса, или существенному уменьшению деградации крахмала в клетках растения. Это может быть детектировано простым тестированием трансформантов в различных стадиях развития.

Уменьшенная экспрессия гена может достигаться введением и транскрипцией химерного гена, вызывающего сайленсинг генов, введенного в клетку-хозяина. Этот химерный ген сайленсинга генов может быть введен стабильно в геном клетки-хозяина или он может быть введен транзиторно, например, на вирусном векторе. В данном контексте эффектом сайленсинга генов называют уменьшение экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в клетке-хозяине, предпочтительно клетке растения, которое может достигаться введением вызывающей сайленсинг РНК. Такое уменьшение может быть результатом уменьшения транскрипции, в том числе посредством метилирования ремоделирования хроматина или посттранскрипционной модификации этих РНК-молекул, в том числе посредством деградации РНК, или обоих механизмов. Сайленсинг гена не должен обязательно интерпретироваться как уничтожение экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или гена-мишени. Достаточно того, что уровень экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в присутствии вызывающей сайленсинг РНК является более низким, чем в ее отсутствие. Этот уровень экспрессии может быть уменьшен по меньшей мере на приблизительно 10%, или по меньшей мере на приблизительно 15%, или по меньшей мере на приблизительно 20%, или по меньшей мере на приблизительно 25%, или по меньшей мере на приблизительно 30%, или по меньшей мере на приблизительно 35%, или по меньшей мере на приблизительно 40%, или по меньшей мере на приблизительно 45%, или по меньшей мере на приблизительно 50%, или по меньшей мере на приблизительно 55%, или по меньшей мере на приблизительно 60%, или по меньшей мере на приблизительно 65%, или по меньшей мере на приблизительно 70%, или по меньшей мере на приблизительно 75%, или по меньшей мере на приблизительно 80%, или по меньшей мере на приблизительно 85%, или по меньшей мере на приблизительно 90%, или по меньшей мере на приблизительно 95%, или по меньшей мере на приблизительно 100%. Нуклеиновые кислоты-мишени могут включать в себя эндогенные гены, трансгены или вирусные гены или гены, вводимые вирусными векторами. Нуклеиновая кислота-мишень может дополнительно включать в себя гены, которые стабильно введены в геном клетки-хозяина, предпочтительно ядерный геном клетки-хозяина.

Антисмысловые РНК-молекулы.

Для уменьшения экспрессии генов в соответствии с этим изобретением могут быть использованы антисмысловые способы. Термин антисмысловая РНК должен рассматриваться как обозначающий РНК-молекулу, которая комплементарна по меньшей мере части специфической мРНК-молекулы и способна уменьшать экспрессию гена, кодирующего эту мРНК. Такое уменьшение обычно происходит зависимым от последовательности образом, и считается, что оно происходит посредством нарушения посттранскрипционного события, такого как транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, стабильности мРНК или ингибирования трансляции. Применение антисмысловых способов хорошо известно в данной области (см., например, О. Найтапп апб 8. Епбге8, Мапиа1 о£ ЛпП8еп8е Ме1Нобо1оду, К1и\уег (1999)). Применение антисмысловых способов в растениях обсуждалось в обзоре Воищие (1995) апб 8епюг (1998). Вонище, 1995 перечисляет большое количество примеров того, как антисмысловые последовательности были использованы в системах растений в качестве способа инактивации генов. Автор утверждает также, что получение 100%-ного ингибирования активности какого-либо фермента может быть необязательным, так как частичное ингибирование будет с большой вероятностью приводить к измеримому изменению в этой системе. 8еиюг, 1998 утверждает, что антисмысловые способы являются в настоящее время установленным способом манипулирования экспрессией генов.

В данном контексте термин антисмысловой полинуклеотид, который гибридизуется при физиологических условиях, означает, что этот полинуклеотид (который является полностью или частично одноцепочечным) способен, по меньшей мере, образовывать двухцепочечный полинуклеотид с РНКпродуктом подлежащего ингибированию гена, обычно мРНК, кодирующей белок, такой как обеспеченные здесь белки, при нормальных условиях в клетке. Антисмысловые молекулы могут включать в себя последовательности, которые соответствуют структурным генам, или последовательности, которые осу- 27 025360 ществляют контроль над экспрессией гена или событием сплайсинга. Например, антисмысловая последовательность может соответствовать кодирующему району-мишени генов этого изобретения или 5'нетранслируемому району (ИТК) или 3'-ИТК или их комбинации. Она может быть комплементарна частично последовательностям интронов, которые могут сплайсироваться во время или после транскрипции, предпочтительно только последовательностям экзонов гена-мишени. Ввиду обычно более высокого разнообразия ИТК, нацеливание на эти районы обеспечивает более высокую специфичность ингибирования генов.

Длина антисмысловой последовательности должна быть равна по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидам и более предпочтительно по меньшей мере 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидам до максимально полной длины подлежащего ингибированию гена. Может быть использована полноразмерная последовательность, комплементарная полному транскрипту гена. Эта длина наиболее предпочтительно равна 100-2000 нуклеотидам. Степень идентичности антисмысловой поликлональна транскрипту-мишени, должна быть равна по меньшей мере 90% и более предпочтительно 95-100%. Антисмысловая РНК-молекула может, конечно, содержать неродственные последовательности, которые могут функционировать в качестве факторов стабилизации этой молекулы.

Генетические конструкции для экспрессии антисмысловой РНК могут быть легко получены присоединением промоторной последовательности к району гена-мишени в антисмысловой ориентации, которую в данном контексте называют обращенной ориентацией относительно ориентации транскрипции и трансляции (если она имеет место) этой последовательности в гене-мишени в клетке растения.

Рибозимы.

Термин рибозим относится к РНК-молекуле, которая специфически узнает особую субстратную РНК и катализирует ее расщепление. Обычно рибозим содержит антисмысловую последовательность для специфического узнавания нуклеиновой кислоты-мишени и ферментативный район, называемый здесь каталитическим доменом. Типами рибозимов, которые особенно применимы в этом изобретении, являются молотоголовый рибозим (На5е1о££ апб Сег1ас1г 1988, Реттап е£ а1. 1992) и шпилечный рибозим (8Ырру е£ а1., 1999). ДНК, кодирующая эти рибозимы, может быть химически синтезирована с использованием способов, известных в данной области. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рибозим этого изобретения. Обычно ДНК, кодирующая рибозим, может быть инсертирована в экспрессионную кассету или транскрипционную кассету. Сайты специфического расщепления рибозима в любой потенциальной РНК-мишени идентифицируют сканированием этой молекулы-мишени на сайты расщепления рибозима, которые включают в себя следующие последовательности: СИЛ, ОИИ и ОИС. После идентификации короткие РНК-последовательности между 15 и 20 рибонуклеотидами, соответствующие району гена-мишени, содержащему сайт расщепления, могут оцениваться на предсказанные структурные признаки, такие как вторичная структура, которая может делать олигонуклеотидную последовательность непригодной. При использовании рибозимы могут быть выбраны из группы, состоящей из молотоголовых рибозимов, топороголовых рибозимов, пе\\1сателлитных рибозимов, рибозимов Те£гаЪутепа и РНКазы Р, и сконструированы в соответствии со способами, известными в данной области, на основе гена-мишени (например, см. патент США № 5741679). Пригодность кандидатных мишеней может также оцениваться тестированием их доступности в отношении гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами, с использованием анализов с защитой от рибонуклеаз.

Как и в случае описанных здесь антисмысловых полинуклеотидов, рибозимы этого изобретения должны быть способны гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты-мишенью (например, мРНК, кодирующей полипептид, обеспеченный в виде 8ЕО ГО N0: 2, 8ЕО ГО N0: 5) при физиологических условиях, а именно условиях в клетке, в частности условиях в клетке растения, такой как клетка пшеницы или ячменя.

Интерференция РНК/дуплексная РНК.

В данном контексте искусственно введенная бδΡNΑ-молекула обозначает прямое введение 6δΚΝΑ-молекулы (двухцепочечной молекулы РНК), которая может, например, осуществляться эндогенно транскрипцией из химерного гена, кодирующего такую бδΡNΑ-молекулу, но не относится к превращению одноцепочечной РНК-молекулы в 6δΡΝΑ в эукариотической клетке или клетке растения. Интерференция РНК (ΚΝΑί) особенно применима для специфического уменьшения экспрессии гена или ингибирования продуцирования конкретного белка. Хотя и не желая быть ограниченными теорией, Аа£егЬои8е е£ а1. (1998) обеспечили модель для механизма, при помощи которого 6δΚΝΑ может быть использована для уменьшения продуцирования белка. Этот способ основывается на присутствии молекул 6δΚΝΑ, которые содержат последовательность, которая, по существу, идентична мРНК представляющего интерес гена или его части. Удобным образом, эта 6δΚΝΑ может продуцироваться от единого промотора в рекомбинантном векторе или клетке-хозяине, где смысловая и антисмысловая последовательности транскрибируются с образованием шпилечной РНК, в которой эти смысловая и антисмысловая последовательности гибридизуются с образованием района 6δΚΝΑ с неродственным районом, образующим структуру петли, так что эта шпилечная РНК содержит структуру стебель-петля. Конструирование и получение подходящих бδΡNΑ-молекул для данного изобретения находится вполне в пределах компетенции

- 28 025360 квалифицированного в данной области специалиста, особенно с учетом Vа!е^Ηои8е е! а1., 1998; διηίΐΗ е! а1, 2000; νθ 99/32619; νθ 99/53050; νθ 99/49029 и νθ 01/34815.

В одном примере вводят ДНК, которая регулирует синтез, по меньшей мере, частично двухцепочечного РНК-продукта (двухцепочечных РНК-продуктов) с гомологией в отношении подлежащего инактивации гена-мишени. Таким образом, эта ДНК содержит как смысловую, так и антисмысловую последовательности, которые при транскрипции в РНК могут гибридизоваться с образованием двухцепочечного РНК-района. В предпочтительном варианте осуществления эти смысловая и антисмысловая последовательности разделены спейсерным районом, который содержит интрон, который при транскрипции в РНК сплайсируется. Было показано, что это расположение приводит к более высокой эффективности сайленсинга генов. Этот двухцепочечный район может содержать одну или две РНК-молекулы, транскрибированные либо из одного ДНК-района, либо из двух ДНК-районов. Эта 6κΚΝΑ может классифицироваться как длинная ΗρΚΝΑ, имеющая длинные смысловые и антисмысловые районы, которые могут быть в значительной степени комплементарными, но не должны быть полностью комплементарными (обычно большими чем приблизительно 200 п.н., в диапазоне 200-1000 п.н.). ΗρΚΝΑ может быть также довольно малой с двухцепочечной частью в диапазоне размеров от приблизительно 30 до приблизительно 42 п.н., но не более длинной чем 94 п.н. (см. νθ 04/073390, включенный здесь в качестве ссылки). Считается, что присутствие этого двухцепочечного РНК-района запускает реакцию из эндогенной системы растения, которая разрушает как эту двухцепочечную РНК, так и гомологичный РНК-транскрипт из гена-мишени растения, эффективно уменьшая или элиминируя активность этого гена-мишени.

Длина смысловой и антисмысловой последовательностей, которые гибридизуются, должна быть равна в каждом случае по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам, предпочтительно по меньшей мере 30 или 50 нуклеотидам и более предпочтительно по меньшей мере 100, 200, 500 нуклеотидам или 1000 нуклеотидам. Может быть использована полноразмерная последовательность, соответствующая полному транскрипту гена. Эти длины наиболее предпочтительно равны 100-2000 нуклеотидам. Степень идентичности смысловой и антисмысловой последовательностей транскрипту-мишени должна быть по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90% и более предпочтительно 95-100%. Чем длиннее эта последовательность, тем менее строгим является требование в отношении идентичности полной последовательности. Эта РНК-молекула может, конечно, содержать неродственные последовательности, которые могут функционировать в качестве факторов стабилизации этой молекулы. Промотором, используемым для экспрессии б8ΚNА-образующей конструкции, может быть промотор любого типа, если полученная 6κΚΝΑ является специфической в отношении продукта гена в линии дифференцировки, являющейся мишенью для разрушения. Альтернативно, этот промотор может быть специфическим в отношении линии дифференцировки в том смысле, что он экспрессируется только в клетках конкретной линии дифференцировки. Это может быть выгодным, когда наблюдается некоторое перекрывание в гомологии с геном, который экспрессируется в линии дифференцировки, не являющейся мишенью. Этот промотор может быть также индуцируемым регуляторными факторами или внутриклеточными факторами среды. Обычно эта РНК-молекула экспрессируется под контролем промотора РНКполимеразы II или РНК-полимеразы III. Примеры последнего включают в себя промоторы ΓΚΝΑ или κπΚΝΑ.

Примеры б8ΚNА-молекул, которые могут быть использованы для понижающей регуляции продуцирования полипептида с ΟνΌ-активностью, обеспечены в примерах 7 и 10.

Другой вызывающей сайленсинг РНК может быть неполиаденилированная РНК, содержащая по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов, имеющая по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с комплементом нуклеотидной последовательности гена-мишени, такая как описанная в νθ 01/12824 или υδ 6423885 (оба документа включены здесь в качестве ссылки). Еще одним типом вызывающей сайленсинг РНК является РНК-молекула, описанная в νθ 03/076619 (включенном здесь в качестве ссылки), содержащая по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов, имеющая по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени или ее комплементом, и дополнительно содержащая в значительной степени двухцепочечный район, описанный в νθ 03/076619. Вызывающая сайленсинг РНК может быть также двухцепочечной РНК, содержащей смысловую и антисмысловую цепь, как определено здесь, где эта смысловая и антисмысловая РНК способны к спариванию оснований друг с другом с образованием двухцепочечного района РНК (предпочтительно эти указанные по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов этих смысловой и антисмысловой РНК являются комплементарными одна другой. Смысловой и антисмысловой районы могут также присутствовать в одной РНК-молекуле, так что может образовываться шпилечная РНК (ΗρΚΝΑ), когда эти смысловой и антисмысловой районы образуют двухцепочечный район РНК. ΗρΚΝΑ хорошо известна в данной области (см., например, νθ 99/53050, включенный здесь в качестве ссылки).

МикроРНК-регуляция является явно специализированным ответвлением пути РНК-сайленсинга, которое развилось в направлении регуляции генов, ответвляясь от общепринятых ΚΝΑί/ΡΤΟδ. МикроРНК являются специфическим классом коротких РНК, которые кодируются в ген-подобных элементах, организованных в характерном обращенном повторе. При транскрипции гены микроРНК дают нача- 29 025360 ло содержащим структуру стебель-петля РНК-предшественникам, из которых затем процессируются микроРНК. МикроРНК обычно имеют в длину приблизительно 21 нуклеотид. Высвобождаемые ιηίΡΝΛδ включают в ШЗС-подобные комплексы, содержащие конкретную субпопуляцию белков АгдопаЩе, которые проявляют последовательность-специфическую репрессию (см., например, МШаг апй АаЮгНоихс, 2005; РакдитеШ е1 а1., 2005; А1те1Йа апй АШЫге, 2005).

Косупрессия.

Другим молекулярно-биологическим подходом, который может быть использован, является косупрессия. Механизм косупрессии еще не выяснен полностью, но считается, что он включает в себя посттранскрипционный сайленсинг генов (РТС8) и в этом отношении может быть очень похожим на многие примеры антисмысловой супрессии. Он включает в себя введение лишней копии гена или его фрагмента в растение в смысловой ориентации относительно промотора для его экспрессии, которая в данном контексте относится к той же самой ориентации, в которой происходит транскрипция и трансляция (если она имеет место) этой последовательности относительно последовательности в гене-мишени. Размер этого смыслового фрагмента, его соответствие районам гена-мишени и его степень гомологии с геном-мишенью являются такими же, что и антисмысловые последовательности, описанные выше. В некоторых случаях эта дополнительная копия последовательности гена препятствует экспрессии этого генамишени растения. Делается ссылка на описание патента АО 97/20936 и описание Европейского патента 0465572 в отношении способов осуществления подходов косупрессии. Антисмысловые, косупрессионные или двухцепочечные РНК-молекулы могут также содержать в значительной степени двухцепочечный РНК-район, предпочтительно содержащий сигнал ядерной локализации, описанные в АО 03/076619.

Любые из этих технологий для уменьшения экспрессии генов могут быть использованы для координированного уменьшения активности множественных генов. Например, одна РНК-молекула может быть нацелена против семейства родственных генов посредством нацеливания на район этих генов, который являются общим. Альтернативно, мишенями могут быть сделаны неродственные гены посредством включения множественных районов в одну РНК-молекулу, где каждый район нацелен на отличающийся ген. Это может быть легко выполнено слиянием этих множественных районов под контролем единого промотора.

Способы введения нуклеиновых кислот в клетки растений/трансформация.

Ряд способов, хорошо известных для исследователей в данной области, являются доступными для введения молекул нуклеиновых кислот в клетку-хозяина растения. Термин трансформация обозначает изменение генотипа организма, например бактерии или растения, введением чужеродной или экзогенной нуклеиновой кислоты. Под трансформантом имеют в виду организм, измененный таким образом. В данном контексте термин трансгенные относится к генетически модифицированному растению, в котором эндогенный геном дополнен или модифицирован случайной или сайт-направленной интеграцией или стабильным поддержанием в реплицируемой неинтегрированной форме, введенного чужеродного или экзогенного гена или чужеродной или экзогенной последовательности. Под трансгеном имеют в виду чужеродный или экзогенный ген или чужеродную или экзогенную последовательность, которые введены в растение. Эта молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном этого растения или она может быть реплицирована в виде внехромосомного элемента. Под геномом имеют в виду общий наследуемый генетический комплемент клетки, растения или части растения, и он включает в себя хромосомную ДНК, пластидную ДНК, митохондриальную ДНК и внехромосомные ДНК-молекулы. Термин регенерация, используемый здесь в отношении материалов растений, обозначает выращивание целого дифференцированного растения из клетки растения, группы клеток растения, части растения, например семени или кусочка растения, такого как, например, кусочек из зародыша, скутеллума (щитка), протопласта, каллюса или другой ткани.

Конкретный выбор технологии трансформации будет определяться ее эффективностью для трансформации определенных видов растений, а также опытом и предпочтением лица, применяющего на практике это изобретение, с конкретной методологией выбора. Квалифицированному в данной области специалисту будет очевидно, что конкретный выбор системы трансформации для введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетки растений не является существенным для этого изобретения или ограничивающим это изобретение, при условии, что достигается приемлемый уровень переноса нуклеиновой кислоты. Руководство по практическому осуществлению систем трансформации для улучшения растений обеспечены в ВпсН (1997).

В принципе, как двудольные, так и однодольные растения, которые поддаются трансформации, могут быть модифицированы введением конструкции нуклеиновой кислоты в соответствии с этим изобретением в реципиентную клетку и выращиванием нового растения, которое захватывает и экспрессирует полинуклеотид согласно этому изобретению.

Было показано, что возможны введение и экспрессия чужеродных или экзогенных полинуклеотидов в двудольных растениях, таких как табак и бобовые, такие как, например, люцерна, с использованием Т-ДНК индуцирующей опухоль (Τί) плазмиды АдгоЪаОегшт 1итеГас1еп5 (см., например, ИтЬеск, патент США № 5004863 и Международную заявку РСТ/И8 93/02480). Конструкция этого изобретения может быть введена в клетку растения с использованием А. ШтеГааепк, содержащей Τί-плазмиду. В при- 30 025360 менении культуры А. ШтеГастеик в качестве трансформирующего носителя наиболее выгодно применение неонкогенного штамма АдтоЬас!етшт в качестве векторного носителя, так чтобы была возможна нормальная неонкогенная дифференцировка трансформированных тканей. Предпочтительно АдгоЬас!егшт несет бинарную систему Τί-плазмиды. Такая бинарная система содержит (1) первую Τί-плазмиду, имеющую район вирулентности, важный для введения транспортной ДНК (Т-ДНК) в растения, и (2) химерную плазмиду. Эта химерная плазмида содержит по меньшей мере один пограничный район Т-ДНКрайона Τί-плазмиды дикого типа, фланкирующий подлежащую переносу нуклеиновую кислоту. Было показано, что системы Τί-плазмиды эффективны для трансформации клеток растений, например, как описано Ие Ргатопб (В1о!есйпо1оду, 7:262, 1983) и Ноекета е! а1. (ЫаШге, 303:179, 1983). Такая бинарная система является предпочтительной ш!ет айа, поскольку она не требует интеграции в Τί-плазмиду в АдгоЬас!етшт.

Способы с применением АдтоЬас!етшт включают в себя, но не ограничиваются ими: (а) совместное культивирование с культивируемыми выделенными протопластами; (Ь) трансформацию клеток или тканей растений АдгоЬас!етшт; (с) трансформацию семян, апексов или меристем АдтоЬас!етшт или (б) инокуляцию т р1ап1а, например, способом погружения цветков, описанным Весй1о1б е! а1. (1993). Этот подход основан на вакуум-инфильтрации суспензии клеток АдтоЬас!етшт. Альтернативно, может быть введена химерная конструкция с использованием индуцирующих корни (Κΐ) плазмид АдгоЬас!етшт в качестве векторов.

Способы трансформации зерновых растений, таких как пшеница и ячмень или другие однодольные растения, такие как сахарный тростник, для введения генетической вариации в растение введением экзогенной нуклеиновой кислоты и регенерации растений из протопластов или незрелых зародышей растений, хорошо известны в данной области, см., например, \ап апб Ьетаих (1994), Ипдау е! а1. (1997), заявку на патент Канады № 2092588, заявку на патент Австралии № 61781/94, заявку на патент Австралии № 667939, патент США № 6100447, международную заявку на патент РСТ/и§97/10621, патент США № 5589617, патент США № 6541257, и другие способы представлены в описании патента \О 99/14314. Предпочтительно трансгенные растения пшеницы или ячменя получают процедурами трансформации с использованием АдгоЬас!етшт ШтеГастеик. Векторы, несущие желаемую конструкцию нуклеиновой кислоты, могут вводиться в регенерированные клетки пшеницы ткани культивируемых растений или эксплантатов или подходящие системы растений, такие как протопласты. Этими регенерированными клетками пшеницы являются предпочтительно клетки из скутеллума незрелых зародышей, зрелых зародышей, каллюса, полученного из них, или меристематической ткани.

Эта генетическая конструкция может также вводиться в клетки растений электропорацией, как описано, например, Рготт е! а1. (Ргос. Ыаб. Асаб. δοί., И.8.А, 52:5824, 1985) и 8Ытато!о е! а1. (ЫаШге 335:274-276, 1989). В этом способе протопласты растения подвергают электропорации в присутствии векторов или нуклеиновых кислот, содержащих релевантные последовательности нуклеиновых кислот. Электрические импульсы высокой напряженности поля делают мембраны обратимо проницаемыми, что делает возможным введение нуклеиновых кислот. Электропорированные протопласты растений восстанавливают клеточную стенку, делятся и образуют каллюс растения.

Другим способом введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетку растения является высокоскоростное баллистическое проникновение с использованием малых частиц (также известное как бомбардировка частицами или бомбардировка микроснарядами) с нуклеиновой кислотой, подлежащей введению, в матриксе малых гранул или частиц или на их поверхности, например, как описано К1еш е! а1. (№Циге 327:70, 1987). Хотя обычно необходимо только одно введение новой нуклеиновой кислоты, этот способ, в частности, обеспечивает множественные введения.

Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты может быть введена в клетку растения контактированием этой клетки растения с использованием механических или химических средств. Например, нуклеиновая кислота может быть механически перенесена микроинъекцией непосредственно в клетки растения с использованием микропипеток. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть перенесена в клетку растения с использованием полиэтиленгликоля, который образует комплекс преципитации с генетическим материалом, который поглощается этой клеткой.

Имеются различные способы, известные в настоящее время, для трансформации однодольных растений. В настоящее время способами трансформации однодольных растений являются бомбардировка микроснарядами клеток эксплантатов или суспензий, опосредованный АдгоЬас!етшт перенос генов и прямое поглощение или электропорация, описанная, например, 8Ытато!о е! а1., 1989. Трансгенные растения кукурузы были получены введением гена Ьаг 81гер1отусек йудгоксорюик Ьаг в эмбриогенные клетки суспензионной культуры кукурузы при помощи бомбардировки микроснарядами (0огбоп-Катт, 1990). Растения пшеницы были регенерированы из эмбриогенной суспензионной культуры отбором только старых компактных и узелковых эмбриогенных каллюсных тканей для создания амбриогенных суспензионных культур (УакП, 1990). Объединение с системами трансформации для этих культур позволяет применять данное изобретение к однодольным растениям. Трансгенные растения сахарного тростника были регенерированы из эмбриогенного каллюса, как описано, например, Во\уег е! а1. (1996).

Альтернативно, объединение других способов может быть использовано для увеличения эффектив- 31 025360 ности процесса трансформации, например бомбардировки покрытыми АдгоЬаФегшш микрочастицами (ЕР-А-486234) или бомбардировки микрочастицами для индукции поранения с последующим совместным культивированием с АдгоЬаФегшш (ЕР-А-486233).

Предпочтительными растениями для данного изобретения являются виды, выращиваемые или собираемые для получения ценных веществ, в том числе крахмала, например в качестве пищевых продуктов, кормов, ферментации или промышленных запасов, среди других применений.

Мутагенез.

Растения этого изобретения могут быть получены и идентифицированы после мутагенеза. Это может обеспечивать растение, которое не является трансгенным, что является желательным на некоторых рынках.

Мутанты могут быть либо природно-встречающимися (т. е. выделенными из природного источника), либо синтетическими (например, полученные выполнением сайт-направленного мутагенеза на нуклеиновой кислоте), либо индуцированными. Обычно клетка-предшественник растения, ткань, семена или растение могут быть подвергнуты мутагенезу для получения единственных или множественных мутаций, таких как замены, делеции, добавления нуклеотидов и/или модификации кодонов. В контексте этой заявки индуцированная мутация является искусственно введенной генетической вариацией, которая может быть результатом химического, радиационного или биологического мутагенеза, например введения транспозона или Т-ДНК. Предпочтительными мутациями являются нуль-мутации, такие как нонсенс-мутация, мутация со сдвигом рамки, инсерционные мутации или мутации сайта сплайсинга, которые полностью инактивируют ген. Нуклеотидные инсерционные производные включают в себя 5'- и 3'терминальные слияния, а также инсерции в последовательность единственного или множественных нуклеотидов. Вариантами инсерционных нуклеотидных последовательностей являются варианты, в которых один или несколько нуклеотидов введены в заранее заданный сайт в этой нуклеотидной последовательности, хотя возможна также случайная инсерция с подходящим скринингом полученного продукта. Делеционные варианты характеризуются удалением одного или нескольких нуклеотидов из последовательности. Предпочтительно мутантный ген имеет только единственную инсерцию или делецию последовательности нуклеотидов относительно гена дикого типа. Вариантами мутаций с заменой являются варианты, в которых по меньшей мере один нуклеотид в этой последовательности был удален и другой нуклеотид был инсертирован на его место. Предпочтительное количество нуклеотидов, вводимых заменами в мутантном гене, относительно гена дикого типа равно максимально десяти нуклеотидам, более предпочтительно максимально 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 нуклеотидам, или наиболее предпочтительно только одному нуклеотиду. Такая замена может быть молчащей в том смысле, что эта замена не изменяют аминокислоту, определяемую этим кодоном. Альтернативно, конструируют консервативные замены для изменения одной аминокислотой другой, сходно действующей аминокислоты. Типичными консервативными заменами являются замены в соответствии с таблицей, приведенной выше, примерные замены.

Термин мутация в данном контексте не включает в себя молчащие нуклеотидные замены, которые не влияют на активность гена, и, следовательно, включает в себя только изменения в последовательности гена, которые влияют на активность гена. Термин полиморфизм относится к любому изменению в нуклеотидной последовательности, включающему в себя такие молчащие нуклеотидные замены.

В предпочтительном варианте осуществления растение содержит делецию по меньшей мере части гена С\УБ. Как известно в данной области гексаплоидные пшеницы, такие как пшеница мягкая (хлебопекарная пшеница), содержат три генома, которые обычно обозначают как геномы А, В и Ό, тогда как тетраплоидные пшеницы, такие как пшеница твердая, содержат два генома, обычно обозначаемые как геномы А и В. Каждый геном содержит 7 пар хромосом, которые можно наблюдать цитологическими способами во время мейоза и, следовательно, идентифицировать, как хорошо известно в данной области.

Мутагенез может быть получен химическими или радиационными способами, например обработкой ЕМ§ или азидом натрия (Ζ\\ήτ апй СЬапй1ег, 1995) семян или облучением гамма-лучами, как хорошо известно в данной области. Выделение мутантов достигается скринингом мутагенизированных растений или семян. Например, мутагенизированная популяция пшеницы может быть подвергнута скринингу на низкое содержание фосфата в листе или крахмальных зернах, на мутацию в гене С\УБ при помощи ПЦР или анализа на основе гетеродуплекса или потерю белка С\УБ при помощи ЕЬ1§А. В полиплоидном растении скрининг выполняют обычно в генотипе, который уже лишен одной или двух активностей С\УБ, например в растении пшеницы, которое уже является мутантом в генах С\УБ на двух из трех геномов, так что ищут мутант, полностью лишенный функциональной активности. Альтернативно, эта мутация может быть идентифицирована с использованием таких способов, как ίί11ίη§, в популяции, мутагенизированной таким агентом, как ЕМ§ (§1айе е1 а1., 2005). Затем такие мутации могут вводиться в желаемые генетические среды скрещиванием этого мутанта с растением желаемой генетической среды и выполнением подходящего числа обратных скрещиваний для элиминации исходно нежелательной родительской генетической среды.

Мутантные (измененные) пептиды могут быть получены с использованием любого способа, известного в данной области. Например, полинуклеотид этого изобретения может быть подвергнут мутагенезу ίη νίίτο. Такие способы мутагенеза ίη νίΐτο включают в себя субклонирование этого полинуклеотида в

- 32 025360 подходящий вектор, трансформацию этого вектора в штамм-мутатор, такой как Е. сой ХЬ-1 гей (81га1адепе) и размножение трансформированных бактерий в течение подходящего числа генераций. В другом примере полинуклеотиды этого изобретения подвергают способам перетасовки ДНК, широко описанным Нагауата (1998). Эти способы перетасовки ДНК могут включать в себя гены, родственные генам этого изобретения, такие как гены ОАО из видов растений, других чем пшеница или ячмень, и/или включают в себя другие гены из того же самого растения, кодирующие сходные белки. Продукты, полученные из мутированной/измененной ДНК, могут быть легко подвергнуты скринингу с использованием описанных здесь способов для определения, обладают ли они, например, активностью ОАО.

Эта мутация может быть введена в растение непосредственно при помощи мутагенеза или опосредованно скрещиванием двух исходных (родительских) растений, одно из которых содержало введенную мутацию. Модифицированные растения, такие как растения пшеницы, могут быть трансгенными или нетрансгенными. С использованием мутагенеза может быть получено нетрансгенное растение, лишенное представляющей интерес функции. Это изобретение относится также к зерну или другим частям растений, полученным из этих растений, и любому размножающемуся материалу этих растений, который может быть использован для получения растений с желаемыми характеристиками, такому как культивируемые ткань или клетки. Это изобретение также относится к способам получения или идентификации таких растений или зерна, продуцируемого такими растениями.

Растения этого изобретения могут быть получены с использованием процесса, известного как Т1ЬЬШО (Тагдейпд 1пйисей Ьоса1 Ьекюпк ΙΝ Оепотек) (Нацеливание на индуцированные локальные повреждения в геномах). В первой стадии вводимые мутации, такие как изменения новых пар отдельных оснований, вводят в популяции растений обработкой семян (или пыльцы) химическим мутагеном и затем продвижением размножения растений до генерации, в которой мутации будут стабильно наследоваться. ДНК экстрагируют и запасают семена из всех членов этой популяции для создания ресурса, который может оцениваться повторяемо на протяжении времени.

Для ТШЬШО-анализа конструируют праймеры ПЦР для специфической амплификации единственного представляющего интерес гена-мишени. Специфичность особенно важна, если мишенью является член семейства генов или часть полиплоидного генома. Затем меченные красителем праймеры могут быть использованы для амплификации продуктов ПЦР из объединенной ДНК множественных индивидуальных растений. Эти продукты ПЦР денатурируют и повторно отжигают для возможности образования ошибочно спаренных пар оснований. Ошибочно спаренные основания или гетеродуплексыпредставляют как природно-встречающиеся полиморфизмы отдельных нуклеотидов (8ΝΓ) (т.е. несколько растений из этой популяции, вероятно, несут один и тот же полиморфизм), так и индуцированные 8ΝΓ (т.е. только редкие индивидуальные растения, вероятно, проявляют эту мутацию). После образования гетеродуплексов применение эндонуклеазы, такой как Се1 Ι, которая узнает и расщепляет ошибочно спаренную ДНК, является ключом для обнаружения новых 8ΝΓ в популяции ТШЬШО.

С использованием этого подхода могут быть подвергнуты скринингу многие тысячи растений для идентификации любого индивидуального растения с изменением единственного основания, а также малых инсерций или делеций (1-30 п.н.) в любом гене или конкретном районе этого генома. Анализируемые геномные фрагменты могут находиться в диапазоне размеров приблизительно от 0,2 до 1,6 т.п.н. При 8-кратном объединении, фрагментах 1,4 т.п.н. (не считая концов фрагментов, где детектирование 8ΝΓ является проблематичным вследствие фона) и 96 дорожках на один анализ это объединение позволяет подвергать скринингу миллион п.н. геномной ДНК на отдельный анализ, что делает ТШЬШО высокопроизводительным способом.

ТШЬШО описан дополнительно в 81айе апй КпаиГ (2005) и НешкоГГ е! а1. (2004).

Кроме позволения эффективного детектирования мутаций, высокопроизводительная технология ТШЬШО является идеальной для детектирования природных полиморфизмов. Таким образом, исследование неизвестной гомологичной ДНК на образование гетеродуплексов относительно известной последовательности выявляет количество и положение полиморфных сайтов. Идентифицируют как изменения нуклеотидов, так и малые инсерции и делеции, в том числе, по меньшей мере, некоторые повторяющиеся количества полиморфизмов. Это было названо ЕсойШпд (Сота1 е! а1., 2004).

Каждый 8ΝΓ регистрируют по его приблизительному положению в пределах нескольких нуклеотидов. Таким образом, каждый гаплотип может быть помещен в архив на основе его мобильности. Данные последовательности могут быть получены с относительно малым увеличением усилий с использованием аликвот той же самой амплифицированной ДНК, которую используют для анализа расщепления ошибочных спариваний. Левый или правый секвенирующий праймер для отдельной реакции выбирают по его близости к этому полиморфизму. Программа секвенатора выполняет множественное сопоставление и обнаруживает изменение основания, которое в каждом случае подтверждалось полосой в геле.

ЕсойШпд может выполняться с меньшими затратами, чем полное секвенирование, способ, используемый в настоящее время для обнаружения большинства 8ΝΓ. Скринингу могут быть подвергнуты планшеты, содержащие сопоставленные экотипические ДНК, а не пулы ДНК из мутагенизированных растений. Поскольку детектирование имеет место на гелях с разрешением почти пары оснований и распределения фона являются однородными вдоль дорожек, полосы, которые имеют идентичный размер,

- 33 025360 могут совпадать, обнаруживая и генотипируя 8ΝΡ в единой стадии. Таким путем конечное секвенирование 8ΝΡ является простым и эффективным, что достигается тем фактом, что аликвоты тех же самых продуктов ПЦР, используемых для скрининга, могут быть подвергнуты секвенированию ДНК.

В данном контексте термин генетически связанные относится к локусу маркера и второму локусу, находящемуся достаточно близко на хромосоме, для того чтобы они наследовались вместе, например, в более чем 50% мейозов, не случайным образом. Это определение включает в себя ситуацию, в которой локус маркера и второй локус образуют часть одного и того же гена. Кроме того, это определение включает в себя ситуацию, в которой локус маркера содержит полиморфизм, который является ответственным за представляющий интерес признак (другими словами, локус маркера непосредственно связан с фенотипом). Таким образом, процент рекомбинации, наблюдаемый между этими локусами на генерацию (сантиморган (сМ)) будет равен менее 50. В конкретных вариантах осуществления этого изобретения генетические локусы могут находиться на расстоянии друг от друга 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 или менее сМ на хромосоме. Предпочтительно эти маркеры находятся на расстоянии друг от друга менее 5 или 2 сМ и более предпочтительно на расстоянии приблизительно 0 сМ.

В данном контексте другие генетические маркеры могут быть любыми молекулами, которые связаны с желаемым признаком зернового растения, такого как пшеница. Такие маркеры хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам и включают в себя молекулярные маркеры, связанные с генами, определяющими такие признаки, как устойчивость к болезням, урожай, морфология растений, качество зерна, другие признаки покоя, такие как цвет зерна, содержание гибберелловой кислоты в зерне, высота растения, цвет муки и т. п. Примерами таких генов в пшенице являются гены устойчивости к ржавчине 8г2 или §г38, гены устойчивости к желтой ржавчине Уг10 или Уг17, гены устойчивости к нематодам, такие как Сге1 и Сге3, аллели при локусах глютенина, которые определяют крепость теста, такие как аллели Ах, Вх, Όχ, Ау, Ву и Оу, гены ΚΙιΙ, которые определяют полукарликовый габитус роста и, следовательно, устойчивость к полеганию посевов (Еад1е§ еΐ а1., 2001; Ьапдпйде еΐ а1., 2001; §йагр еΐ а1., 2001).

Селекция с использованием маркера является хорошо признанным способом селекции на гетерозиготные растения, необходимым при обратном скрещивании с родительской формой, с которой вновь скрещивается гибрид в классической программе селекции. Популяция растений в каждой генерации обратного скрещивания будет гетерозиготной в отношении представляющего интерес гена, в норме присутствующего в отношении 1:1 в популяции обратного скрещивания, и этот молекулярный маркер может быть использован для различения этих двух аллелей этого гена. С использованием экстракции ДНК, например, из молодых проростков, и тестирования со специфическим маркером для полученного интрогрессией желаемого признака может быть выполнена ранняя селекция растений для дополнительного обратного скрещивания при затрате энергии и ресурсов на меньшем количестве растений.

Любой молекулярно-биологический способ, известный в данной области, который способен детектировать аллели СХУО или другого гена, может быть использован в способах данного изобретения. Такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, применение амплификации нуклеиновых кислот, секвенирования нуклеиновых кислот, гибридизации нуклеиновых кислот с мечеными подходящим образом зондами, одноцепочечного конформационного анализа (88СА), денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ЭССЕ), гетеродуплексного анализа (НЕТ), анализа химического расщепления (ССМ), каталитического расщепления нуклеиновых кислот или их комбинации (см., например, Ьет1еих, 2000; Ьапдпйде еΐ а1., 2001). Это изобретение включает в себя также применение способов с молекулярными маркерами для детектирования полиморфизмов, связанных с аллелями (например) гена СХУО, которые придают измененное фосфорилирование и/или измененную деградацию крахмала. Такие способы включают в себя детектирование или анализ полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (КРЬР), ΚΑΡΌ, полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов (АРЬР) и полиморфизмов микросателлитов (простого повтора последовательности, δδΚ). Прочно связанные маркеры могут быть легко получены способами, хорошо известными в данной области, такими как Ви1кей δед^едаηΐ Апа1у818, обсуждаемый в обзоре Ьапдпйде еΐ а1., 2001.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является реакцией, в которой получают реплицированные копии полинуклеотида-мишени с использованием пары праймеров или набора праймеров, состоящих из левого и правого праймеров, и катализатора полимеризации, такого как ДНК-полимераза, и обычно термостабильного полимеразного фермента. Способы для ПЦР известны в данной области и описаны, например, в РСК (Ей. Мй. МсРйегкоп апй δΌ Мо11ег (2000) ΒΙΟδ δ^πΙίΓΚ РиЪйкйеге Б1й., ОхГогй). ПЦР может выполняться на кДНК, полученной из обратной транскрипции мРНК, выделенной из клеток растений, экспрессирующих ген АВА 8'-гидроксилазы. Однако, будет более предпочтительным выполнение ПЦР на геномной ДНК, выделенной из растения.

Праймер является олигонуклеотидной последовательностью, которая способна гибридизоваться зависимым от последовательности образом с последовательностью-мишенью и удлиняться во время ПЦР. Ампликоны, или продукты ПЦР, или фрагменты ПЦР, или продукты амплификации являются продуктами удлинения, которые содержат праймер и заново синтезированные копии последовательностеймишеней. Мультиплексные системы ПЦР содержат множественные наборы праймеров, которые приво- 34 025360 дят к одновременному получению более одного ампликона. Праймеры могут быть точно спаривающимися с этой последовательностью-мишенью или они могут содержать внутренние не спаривающиеся основания, которые могут приводить к введению сайтов рестрикционного фермента или каталитических сайтов узнавания/расщепления нуклеиновых кислот в конкретных последовательностях-мишенях. Праймеры могут также содержать дополнительные последовательности и/или содержать модифицированные или меченые нуклеотиды для облегчения захвата или детектирования ампликонов.

Повторяемые циклы тепловой денатурации этой ДНК, отжига праймеров с их комплементарными последовательностями и удлинение отожженных праймеров полимеразой приводят к экспоненциальной амплификации последовательности-мишени. Термины мишень или последовательность-мишень или матрица относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, которые амплифицируются.

Способы прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам и могут быть найдены, например, в АизиЬе1 е1 а1. и δатЬгоок е1 а1. Секвенирование может проводиться любым подходящим способом, например дидезоксисеквенированием, химическим секвенированием или их вариациями. Прямое секвенирование имеет преимущество определения вариации в любой паре оснований конкретной последовательности.

Растения.

Термин растение (р1аШ), применяемое здесь в виде существительного, относится к целым растениям, но при использовании в качестве прилагательного (р1аШ) относится к любому веществу, которое присутствует в растении, получено из растения, произведено из растения или относится к растению, например органы растения (например, листья, стебли, корни, цветки), отдельные клетки (например, пыльца), семена, клетки растения и т. п. Проростки и прорастающие семена, из которых развиваются корни и побеги, также включены в термин растение. Термин части растения относятся в этом контексте к одной или нескольким тканям растения или одному или нескольким органам растения, которые получены из целого растения и которые содержат крахмал. Части растения включают в себя вегетативные структуры (например, листья, стебли), корни, органы/структуры цветков, семена (включающие в себя зародыш, эндосперм и оболочку семени), ткань растения (например, проводящую ткань, основную паренхиму и т. п.), клетки растения и потомство растения. Термин клетка растения относится в данном контексте к клетке, полученной из растения или находящейся в растении, и включает в себя протопласты или другие клетки, полученные из растений, продуцирующие гаметы клетки и клетки, которые регенерируются в целые растение. Клетки растения могут быть клетками в культуре. Под тканью в культуре имеется в виду дифференцированная ткань в растении или ткань, полученная из растения (эксплантат), или недифференцированная ткань, полученная из незрелых или зрелых зародышей, семян, корней, побегов, плодов, клубней, пыльцы, опухолевой ткани, такой как корончатые галлы, и различные формы агрегации клеток растений в культуре, такие как каллюсы. Примерами тканей растения, находящихся в семенах или выделенных из семян, являются эндосперм, алейроновый слой и зародыш.

В данном контексте термин зерно обычно относится к зрелым собранным семенам растения, но может также относиться к зерну после набухания или проращивания в соответствии с контекстом. Зрелое зерно злаков, таких как пшеница, обычно имеет содержание влаги менее приблизительно 18-20%.

Трансгенное растение в данном контексте обозначает растение, которое содержит генную конструкцию, не обнаруживаемую в растении дикого типа того же самого вида, той же самой разновидности или того же самого культивара (сорта). То есть трансгенные растения (трансформированные растения) содержат генетический материал, который они не содержали перед трансформацией. Трансген имеет в данном контексте обычное значение, подразумеваемое в области биотехнологии, и относится к генетической последовательности, которая была получена или изменена технологией рекомбинантных ДНК или РНК и которая была введена в клетку растения. Трансген может включать в себя генетические последовательности, полученные или произведенные из клетки растения или клетки другого растения или нерастигельного источника, или синтетическую последовательность. Обычно трансген был введен в растение манипуляцией человека, например трансформацией, но может быть использован любой способ, известный квалифицированному в данной области специалисту. Этот генетический материал предпочтительно стабильно интегрируется в геном этого растения. Введенный генетический материал может содержать последовательности, которые природно встречаются в том же самом виде, но в реаранжированном порядке или в другой аранжировке элементов, например антисмысловую последовательность. Растения, содержащие такие последовательности, включены здесь в термин трансгенные растения. Не трансгенное растение является растением, которое не было генетически модифицировано введением генетического материала способами рекомбинантных ДНК. В предпочтительном варианте осуществления трансгенные растения являются гомозиготными в отношении каждого и любого гена, который был введен (трансген), так что их потомки не расщепляются в отношении желаемого фенотипа.

В данном контексте термин соответствующее нетрансгенное растение относится к растению, которое является изогенным относительно трансгенного растения, но не имеет представляющего интерес трансгена. Предпочтительно соответствующее нетрансгенное растение является растением того же культивара (сорта) или той же самой разновидности, что и предшественник представляющего интерес трансгенного растения, или линией растений-сиблингов (сибсов), которая не имеет этой конструкции, часто

- 35 025360 называемой сегрегантом, или растением того же самого культивара (сорта) или той же самой разновидности, трансформированного пустой векторной конструкцией, и может быть нетрансгенным растением. Дикий тип относится в данном контексте к клетке, ткани или растению, которые не были модифицированы в соответствии с данным изобретением. Клетки, ткань или растения дикого типа могут быть использованы в качестве контролей для сравнения уровней экспрессии экзогенной нуклеиновой кислоты, или степени, или природы модификации признака клетками, тканью или растениями, модифицированными, как описано здесь.

Трансгенные растения, определенные в контексте данного изобретения, включают в себя потомство растений, которые были генетически модифицированы с использованием рекомбинантных способов, где это потомство содержит представляющий интерес трансген. Такой потомок может быть получен самооплодотворением первичного трансгенного растения или скрещиванием таких растений с другим растением того же самого вида. В основном это делается для получения по меньшей мере одного белка/фермента, определенного здесь, в желаемом растении или органе растения. Части трансгенного растения включают в себя все части и клетки указанных растений, содержащие трансген, такие как, например, культивируемые ткани, каллюс и протопласты.

Любой из нескольких способов может быть использован для определения присутствия трансгена в трансформированном растении. Например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) может быть использована для амплификации последовательностей, которые являются уникальными в отношении трансформированного растения, с детектированием амплифицированных продуктов при помощи гель-электрофореза или других способов. ДНК может быть экстрагирована из этих растений при помощи общепринятых способов, и может быть проведена ПЦР-реакция с использованием праймеров для амплификации специфической ДНК, присутствие которой будет различать трансформированные и нетрансформированные растения. Например, могут быть сконструированы праймеры, которые будут амплифицировать район ДНК из трансформирующего вектора считыванием в эту конструкцию, и обратный праймер, сконструированный из представляющего интерес гена. Эти праймеры будут амплифицировать фрагмент только в том случае, если это растение было успешно трансформировано. Альтернативным способом подтверждения положительного трансформанта является блот-гибридизация по Саузерну, хорошо известная в данной области. Растения, которые являются трансформированными, могут быть также идентифицированы, т. е. отличны от нетрансформированных растений или растений дикого типа, по их фенотипу уменьшенного содержания фосфата крахмала, полученного из семян этого растения, или родственного фенотипа, такого как увеличенный потенциал продуктивности.

В данном контексте термин прорастание относится к появлению кончика корня из оболочки семени после набухания. Скоростью прорастания называют процент семян в популяции, которая проращивалась на протяжении некоторого периода времени, например 7 или 10 дней, после набухания. Популяция семян может оцениваться ежедневно на протяжении нескольких дней для определения процента прорастания на протяжении времени.

Что касается семян данного изобретения, термин скорость прорастания, которая является, по существу, той же самой означает, что скорость прорастания трансгенных семян равна по меньшей мере 90% от скорости прорастания изогенных нетрансгенных семян. Скорости прорастания могут быть рассчитаны с использованием известных в данной области способов.

Растениями, обеспечиваемыми или рассматриваемыми для применения на практике данного изобретения, включают в себя покрытосемянные и голосемянные растения и среди покрытосемянных - однодольные и двудольные растения. В предпочтительных вариантах осуществления растениями данного изобретения является сельскохозяйственные растения (например, зерновые и бобовые растения, кукуруза, пшеница, картофель, тапиока, рис, сорго, просо, кассава, ячмень или горох) или другие бобовые. Эти растения могут выращиваться для получения годных в пищу корней, клубней, листьев, стеблей, цветков или плодов.

В некоторых вариантах осуществления трансгенным растением является зерновое растение. Примеры зерновых растений включают в себя, но не ограничиваются ими, пшеницу, ячмень, рис, маис (кукурузу), сорго, овес и рис. Более предпочтительно зерновым растением является пшеница, ячмень, кукуруза или сорго.

В данном контексте термин пшеница относится к любому виду рода Тгйюит, в том числе его предшественникам, а также его потомкам, полученным скрещиванием с другими видами. Пшеница включает в себя гексаплоидную пшеницу, которая имеет организацию генома ΛΆΒΒΌΌ, состоящую из 42 хромосом, и тетраплоидную пшеницу, которая имеет организацию генома ААВВ, состоящую из 28 хромосом. Гексаплоидная пшеница включает в себя Т. аекИуит, Т. крейа, Т. тасйа, Т. сотрас1ит, Т. крйаегососсит, Т. уаубоун и их межвидовые кроссы (гибриды). Тетраплоидная пшеница включает в себя Т. бигит (также называемую здесь дуром (твердой пшеницей) или Тгйюит (игЦбит ккр. бигит), Т. бюоссо1бек, Т. бюоссит, Т. ро1отсит и их межвидовые гибриды. Кроме того, термин пшеница включает в себя потенциальные предшественники гексаплоидной или тетраплоидной Тгйюит кр., такие как Т. иаби, Т. топососсит или Т. Ъоеобсит для генома А, Аедйорк крейшбек для генома В и Т. 1аиксйй (также известную как Аедйорк кдиаггока или Аедйорк 1аиксйй) для генома Ό. Культивар (сорт) пшеницы для при- 36 025360 менения в данном изобретении может принадлежать, но не ограничивается ими, к любому из вышеперечисленных видов. В изобретение включены также растения, которые получают общепринятыми способами с использованием ТгНюит зр. в качестве родительского растения в половом скрещивании с видами, не являющимися ТгНюит (такими как рис [8еса1е сегеа1е]), включающими в себя, но не ограничивающимися им, ТгНюа1е. Предпочтительно растение пшеницы является пригодным для коммерческого получения зерна, таким как коммерческие сорта гексаплоидной пшеницы или пщеницы дуром, имеющие подходящие агрономические характеристики, которые известны квалифицированным в данной области специалистам.

В данном контексте термин ячмень относится к любому виду рода Ногбеит, в том числе его предшественникам, а также его потомкам, полученным скрещиванием с другими видами. Предпочтительно это растение является видом Ногбеит, который коммерчески культивируется, таким как, например, линия или культивар или разновидность Ногбеит уи1даге, или является пригодным для коммерческого получения зерна.

Получение пищевых продуктов.

Это изобретение обеспечивает улучшенные растения, имеющие увеличенный потенциал продуктивности. В некоторых вариантах осуществления оно применимо в растениях, которые собирают для пищевых продуктов.

Ясно, что пищевые растения включают в себя фрукты, орехи или овощи, собранные для получения листьев, стеблей, плодов, клубней, семян и стручков.

В другом аспекте это изобретение обеспечивает зерновые растения и зерно, предпочтительно пшеницу, которое применимо для получения пищевых продуктов или кормов, причем это зерно содержит модифицированное содержание фосфата и необязательно модифицированный уровень расщепляющих крахмал ферментов. Предпочтительно растение, из которого получают зерно, имеет уменьшенный уровень активности СХЭ в эндосперме во время развития. Растение данного изобретения применимо для производства пищевых продуктов, в частности для коммерческого производства пищевых продуктов. Такое производство пищевых продуктов может включать в себя приготовление муки, теста или других продуктов, которые могут быть ингредиентом в коммерческом производстве пищевых продуктов. В одном варианте осуществления, который является желательным для применения в производстве пищевых продуктов, семена или зерно растения имеют содержание фосфата, которое является, по существу, тем же самым или увеличенным относительно растения дикого типа, и уровень активности расщепляющих ферментов, в частности одной или нескольких амилаз, таких как α-амилаза или β-амилаза, который уменьшается присутствием трансгена или индуцированной мутации, которые уменьшают экспрессию гена, кодирующего такой расщепляющий фермент в зерне. Мука или тесто из такого зерна имеет желаемые свойства для хлебопекарного производства или другого производства пищевых продуктов на основе модифицированной вязкости крахмала и/или уменьшенного уровня амилазы. В альтернативном варианте осуществления, который является желательным для корма животных или для промышленных применений, таких как производство биоэтанола, эти семена или это зерно растения имеют содержание фосфата, которое является уменьшенным относительно растения дикого типа, и уровень активности расщепляющих ферментов, в частности одной или нескольких амилаз, таких как α-амилаза или β-амилаза, который является увеличенным в ассоциации с уменьшенным содержанием фосфата, как приведено в примерах здесь. Такие содержащие зерно или крахмал продукты, полученные из них, имеют увеличенную перевариваемость при применении в качестве пищи или увеличенную скорость или эффективность превращения при применении для производства этанола.

Желаемая генетическая среда этого растения будет требовать учета агрономического выхода и других характеристик. Такие характеристики могут зависеть от того, желательно ли иметь зимние или весенние типы, от агрономической продуктивности, устойчивости к болезням и устойчивости к абиотическому стрессу. Для применения в Австралии может быть желательным перенос скрещиванием измененного признака крахмала растения пшеницы в такие культивары пшеницы, как Вах1ег, Кеииебу, Тт/, Ргате, Козе11а, Сабоих, О|атоибЫгб или другие обычно выращиваемые сорта. Другие сорта будут подходящими для других районов выращивания. Предпочтительно чтобы растение, предпочтительно пшеница, разновидность этого изобретения, обеспечивала урожай, не меньший чем 105% урожая соответствующей разновидности дикого типа, по меньшей мере, в нескольких районах выращивания, более предпочтительно не меньший чем 110% и даже более предпочтительно не меньший чем 115%. Этот урожай может быть легко измерен в контролируемых полевых испытаниях.

В следующих вариантах осуществления содержание крахмала зерна составляет по меньшей мере приблизительно 25, 35, 45 или 55-65% (м/м) и предпочтительно является увеличенным относительно дикого типа. Пшеница дикого типа, выращиваемая для коммерческих целей, имеет содержание крахмала обычно в диапазоне 55-65% в зависимости до некоторой степени от выращиваемого культивара. Альтернативно, семена или зерно этого изобретения имеют содержание крахмала по меньшей мере 90% относительно содержания крахмала зерна из растения дикого типа и предпочтительно по меньшей мере 95, 100, 102 или 105%. Другие желаемые характеристики включают в себя способность зерна к размолу, в част- 37 025360 ности твердость (стекловидность) зерна. Другим аспектом, который может придавать растению пшеницы более высокую ценность, является степень экстракции крахмала из зерна, причем более высокие скорости экстракции являются более полезными. Форма зерна является также другим признаком, который может влиять на коммерческую применимость растения, следовательно, форма зерна может влиять на легкость, с которой это зерно может измельчаться при помоле.

Крахмал легко выделяется из зерна этого изобретения, например зерна пшеницы, с использованием стандартных способов, например способа 8с1ш1тап е! а1. (1991). В промышленном масштабе может быть использован мокрый способ помола или сухой способ помола. Размер гранул крахмала является важным в перерабатывающей крахмал промышленности, где происходит отделение более крупных гранул А от более мелких гранул В.

Пищевой продукт.

Это изобретение включает в себя также пищевые продукты, напитки или фармацевтические препараты, получаемые с продуктами, предпочтительно продуктами, содержащими крахмал, полученный из растений или зерна этого изобретения. Такое получение пищевых продуктов может включать в себя приготовление муки, теста или других продуктов, которые могут быть ингредиентом в коммерческом производстве пищевых продуктов. Зерно этого изобретения или продукты, получаемые из него, содержащие крахмал, могут быть использованы в различных пищевых применениях для потребления человеком. В данном контексте термин люди относится к Ното 8ар1еп8.

Зерно, полученное из измененного растения пшеницы, может быть легко использовано в процедурах переработки, и, следовательно, это изобретение включает в себя измельченное, молотое, дробленое, шелушенное или плющенное в хлопья зерно или продукты, полученные из переработанного или цельного зерна растений этого изобретения, в том числе муку. Эти продукты могут быть затем использованы в различных пищевых продуктах, например мучных продуктах, таких как хлеб, печенье, бисквиты и т. п., или пищевых добавках, таких как загустители или связывающие агенты, или для приготовления напитков, лентовидных макаронных изделиях, макаронных изделиях или супах быстрого приготовления. Зерно или продукты, полученные из зерна данного изобретения, особенно желательны в зерновых завтраках или в виде экструдированных продуктов. Крахмалы этого изобретения могут быть также использованы для образования плотных гелей, которые применимы в кондитерской промышленности или позволяют сократить время формования или выдержки. Они могут быть также использованы в качестве покрытия, например, для уменьшения абсорбции масла в обжариваемом картофеле или других пищевых продуктах. Этот крахмал может быть включен в жирные или масляные продукты, такие как маргарин или шортенинг, заправку для салатов, яичные продукты, такие как майонез, молочные продукты, такие как мороженое, йогурт или сыр, зерновые продукты, такие как кукурузная или пшеничная мука, фруктовые соки, другие пищевые продукты и пищевые вещества, или этот измененный крахмал может быть переработан в напитки или пищевые продукты, такие как хлеб, печенье, бисквиты, зерновые завтраки, макаронные изделия, лентовидные макаронные изделия или соусы.

В хлебе продукты крахмала в форме муки или муки из цельного зерна могут заменять 10% (м/м) или более неизмененной муки или муки из цельного зерна, предпочтительно заменять по меньшей мере 30% и даже более предпочтительно по меньшей мере 50% неизмененной муки или муки из цельного зерна. Таким образом, этот состав может иметь, например, 90 частей муки, 10 частей измененного крахмала пшеницы, 2 части жира, 2 части соли, 1 часть улучшителя качества, 2,5 части дрожжей. Приготовление этого хлеба может выполняться способом быстрого теста или другими способами, как известно квалифицированным в данной области специалистам.

Альтернативно, крахмальный продукт этого изобретения может быть включен в мучной продукт на основе макаронного теста. Количество крахмала этого изобретения, используемое в этом составе макаронного теста, может находиться в диапазоне 10-100% (м/м) в расчете на общую массу мучного материала, более предпочтительно в диапазоне 10-80%. Другие подходящие мучные материалы будут с легкостью выбраны квалифицированным в данной области специалистом. К этой композиции может быть также добавлен другой материал, например сушеный меланж (сушеная яичная масса) или яйца без скорлупы (меланж) (желтки, белки или и то, и другое) или вещества с высоким содержанием белка, такие как молочный белок или рыбный белок. Могут быть также добавлены витамины, минеральные вещества, соли кальция, аминокислоты, буферящие агенты, такие как динатрийгидрофосфат, пряности, камедь, клейковина или глицерилмоностеарат.

Другие части растений этого изобретения, которые являются съедобными, могут быть использованы в качестве пищевых продуктов для потребления человеком или в качестве корма для использования для животных. Например, листья, стебли, корни, клубни, плоды, стручки (бобы) или экстракты или части этих органов, содержащие клетки этого изобретения, из любых из этих органов могут быть использованы для потребления человеком или животными. Применение растений в виде свежих или переработанных фруктов или овощей хорошо известно в данной области, и такие применения включены в данное изобретение. Увеличенная перевариваемость растений этого изобретения и их частей может обеспечивать преимущества для применения этих материалов в качестве корма для животных, например корма для свиней, крупного рогатого скота, лошадей, домашней птицы, такой как куры, и других животных. В частно- 38 025360 сти, ожидаются преимущества от увеличенной перевариваемости крахмала этих продуктов для эффективности превращения корма животных и в результате увеличенных скоростей роста.

Пищевой продукт, или напиток, или фармацевтический препарат может быть упакован в готовом для продажи виде или в форме продуктов навалом или насыпью. Данное изобретение обеспечивает способы приготовления пищевого продукта, напитка или фармацевтического препарата этого изобретения и рецепты или инструкции для приготовления таких пищевых продуктов или напитков. Эти способы могут содержать стадии сбора растения или части растения, отделения зерна от других частей растения, измельчения, экстракции, размола, отделения волокна, варки, затаривания, упаковки или другие стадии обработки, известные в данной области. Способы или рецептуры или инструкции могут включать в себя стадии обработки продукта растения этого изобретения и/или смешивания его с другими пищевыми ингредиентами, такие как нагревание или выпечка этой смеси или продукта, например по меньшей мере до 100°С. Этот способ может включать в себя стадию упаковки этого продукта таким образом, что он готов к продаже.

Корма и применение для животных.

Растения этого изобретения и продукты, получаемые или производимые из них, предпочтительно собранный продукт, такой как, например, зерно, имеют преимущества в качестве корма для животных. Не ограничивая себя теорией, авторы считают, что это обусловлено увеличенной перевариваемостью и биодоступностью крахмала в этом продукте. В предпочтительном варианте осуществления это ассоциировано с увеличенным уровнем амилаз в этом продукте. Хотя уменьшение содержания фосфата крахмала в этом продукте само по себе может уменьшать перевариваемость, оно было преодолено увеличенным уровнем амилаз, в частности α-амилаз, и общим результатом была увеличенная перевариваемость. Это создает конкретное преимущество в отношении эффективности превращения этого корма в продукт животного, который может быть посредством этого увеличен по меньшей мере на 2%, предпочтительно по меньшей мере на 5% или по меньшей мере на 7% относительно немодифицированного соответствующего продукта дикого типа. Это преимущество может наблюдаться для любых молодых животных, таких как куры, телята или ягнята, или со старыми животными, вырастающими до полного размера. Эффективность превращения корма может быть легко измерена с использованием способов, известных в данной области.

Промышленная применимость.

Продукты растений, предпочтительно зерно, имеют конкретные преимущества в производстве промышленных продуктов, таких как, например, этанол. Наблюдаемая ассоциация увеличенных параметров продукции, таких как выход, с увеличенным превращением крахмалов в сахара, описанная здесь, обеспечивает конкретные преимущества. Например, применение продуктов этого изобретения в превращении крахмала в сахара для ферментации требует меньшего добавления экзогенной амилазы и позволяет работать при более низких температурах, что уменьшает расходы на энергию.

Это изобретение описывается далее следующими не ограничивающими изобретение примерами.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1.

Материалы и способы.

Экстракция крахмала из зерна.

Зрелые семена размалывали при помощи МкгоМШ из Ме1еГет (Рго1о1уре), и измельченный материал пропускали через сито 0,5 мм. Полученную муку из цельного зерна взвешивали, и воду, эквивалентную 50% этой массы, добавляли для смягчения этой ткани. Тесто готовили механическим смешиванием воды и муки. Избыток воды добавляли для экстракции крахмала из клейковины, и затем суспензию крахмала фильтровали через фильтр 100 мкм для удаления остатков клеток. Эту экстракцию повторяли 4 раза или до тех пор, пока в тесте не оставалось крахмала. Этот крахмал осаждали центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин при 4°С). Белковую верхушку удаляли, и этот крахмал ресуспендировали в избытке воды. Эту промывку повторяли 3 раза. Экстрагированный крахмал лиофилизировали в лиофилизаторе РТ§ (Мобе1 Ио. РБ-3-55Б-МР). При помощи этого способа 10 г зерна давали приблизительно 6 г муки и затем 3 г крахмала.

Экстракция крахмала из листового материала.

Крахмал экстрагировали из листьев растений с использованием способа, описанного в БеКа11е е1 а1., (2005). Пробы листьев лиофилизировали, затем измельчали в 15-25 мл буфера для экстракции (МОР8 100 мМ, рН 7,2, ЭДТА 5 мМ, этиленгликоль 10% (м/о) при помощи блендера Ро1у1гоп с хранением проб, охлаждаемых на льду. Эту смесь фильтровали через двухслойный М1гас1о£Ь-фильтр и центрифугировали с сохранением осадка, содержащего крахмал. Затем этот крахмал очищали через 90%-ный градиент Перколла 90%-ным центрифугированием при 4000 об/мин в течение 40 мин при 4°С.

Измерение уровней фосфата и глюкозо-6-фосфата в пробах крахмала.

Общее содержание фосфата в крахмале определяли с использованием способа с малахитовым зеленым, адаптированного из Ектап апб 1адег, (1993). 10 мг сухого крахмала солюбилизировали ресуспендированием его в 500 мкл 10%-ного раствора ДМСО, и кипятили эту смесь в течение 10 мин. 200 мкл рас- 39 025360 твора смешивали с 200 мкл буфера С1агк и ЬиЬ (0,054М КС1, 0,145М НС1); 120 мкл Н₂О; 80 мкл НС1 4М и 200 мкл раствора малахитового зеленого 3:1 (0,2%-ного раствора малахитового зеленого: 10%-ного раствора (МН₄)₆Мо₇О₂₄(4Н₂0) 10% в 4М НС1). Эта кислота гидролизует фосфатные группы из С6 и С3, и свободный фосфат измеряют анализом с малахитовым зеленым. Для измерения оптической плотности при 660 нм использовали спектрофотометр. Получали также калибровочную кривую с использованием стандартов раствора С1Р от 0,01 до 5 мМ, обработанных так же, как и пробы крахмала. Содержание фосфата обычно измеряли в трех повторностях, и среднее выражали в виде количества ммолей на мг крахмала.

Уровни глюкозо-6-фосфата (С6Р) измеряли способом анализа амилоглюкозидазы, адаптированным из Эекие е! а1., (1992). Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу использовали специально в этом анализе следующим образом. 5 мг высушенного крахмала растворяли в 500 мкл 10%-ного ДМСО в воде и кипятили 10 мин для растворения крахмала. Готовили серию разведений в двух повторностях. Крахмал в каждой пробе деградировали действием 70 мкл раствора амилоглюкозидазы (АС8, набор для анализа крахмала из Еп/у1ес) в течение 2 ч при 55°С. Эту реакцию останавливали добавлением 350 мкл воды и 350 мкл раствора 1 (ТЕА-буфер рН 7,6, НАДФ, АТФ (из набора для анализа крахмала Еп/у!ес)). 0Ό при 340 нм измеряли (обозначенную как 0Όο) перед добавлением следующего реагента. Для первой серии для измерения количества крахмала добавляли 5 мкл смеси раствора (гексокиназа и С6РбН (200 Е/100 Е на 0,7 мл, из набора для анализа крахмала Еп/у1ес)). Для второй серии для измерения количества С6Р добавляли 5 мкл С6Р6Н без гексокиназы (С7877-2КИ, 8щта, 18 ед/мл). Эти смеси инкубировали при 25°С в течение 15 мин, и 0Ό измеряли при 340 нм. Это измерение повторяли каждые 10 мин до стабилизации этого 0Ό (обозначенного 0ИГ).

Количество крахмала или количество С6Р рассчитывали с использованием уравнения:

[Крахмал или С6Р] [мг·мл^-1]=(Ο^Г-Ο^ο)х 1,069/фактор разведения.

Первая серия измеряла концентрацию и количество крахмала в каждой пробе, тогда как вторая серия измеряла количество С6Р, присутствующее в крахмале.

Распределение размеров крахмальных гранул (зерен).

Распределение размеров гранул (зерен) крахмала, полученных в виде взвесей крахмала в воде, определяли с использованием анализатора размеров частиц с использованием лазерной диффракции (Μοбе1 2600с Огор1е1 апб Рагйс1е 8|/ег, Макет ПМгитепК Макет, ИК). Гранулы А определяются как частицы с диаметром более 10 мкм при определении этим анализатором, гранулы В - как частицы с диаметром менее 10 мкм. Распределение размеров гранул, определенное здесь, выражали в виде частоты гранул В, выраженной в виде процента общего объема гранул крахмала (81»ббагб, 1999).

Свойства крахмала.

Распределение длин цепей в крахмале анализировали после деветвления проб крахмала изоамилазой с высвобождением глюкозидных цепей из амилопектина в этих пробах. Электрофорез углеводов с использованием флуорофора (РАСЕ) проводили, как описано 0'8Неа е! а1., (1998) при помощи системы капиллярного электрофореза Р/АСЕ 5510 (Весктап) с детектированием а^§οη-^IР.

Профиль температуры клейстеризации каждой пробы крахмала измеряли в дифференциальном сканирующем калориметре Ругк I (Регкш Е1тег, №г\га1к СТ, И8А). Этот анализ измеряет непосредственно энергию, требующуюся для клейстеризации крахмала. Пробы готовили предварительным перемешиванием крахмала в воде при соотношении 1:2 (сухой крахмал:вода). И8С-кювету наполняли этой смесью и герметически заделывали. Используемым эталоном была пустая кювета. Производили четыре измерения для каждого из 2 эндотермов (клейстеризации и диссоциации амилозы-липида): начальной (οη8еΐ) температуры, максимальной температуры, конечной температуры и энтальпии.

Вязкость растворов крахмала измеряли на Ρаρ^б-V^5сο-Аηа1у5е^ (КУА, №\\ροΠ 8с1епййс Р1у Иб., \Vа^^^е\\Όοб. 8убпеу), например, с использованием условий, сообщенных Ва!еу е! а1., 1997. Параметры, которые измеряли, включали в себя максимальную вязкость (максимальную вязкость горячей пасты), удерживающую силу, конечную вязкость и температуру пастирования.

Объем набухания муки или крахмала определяли в соответствии со способом Кοη^к-Кο8е е! а1. (2001). Поглощение воды измеряли взвешиванием пробы до и после смешивания пробы муки или крахмала с водой при 90°С и после сбора клейстеризованного материала.

Фракционирование крахмала гельпроникающей хроматографией (гель-фильтрацией).

Гельпроникающую хроматографию на колонках Сефарозы использовали для разделения крахмала на фракции амилопектина (более крупных молекул) и амилозы (более мелких молекул). Количество 1-2,5 мг крахмала, растворенного в 500 мкл 10 мМ №0Н, наносили на колонку Сефарозы СЬ2В (0,5 см внутренний диаметрх65 см длина), уравновешенной 10 мМ №0Н, и хроматографировали с использованием этого раствора. Фракции 250-300 мкл собирали при скорости 1 фракция/1,5 мин. Глюканы в каждой фракции детектировали посредством взаимодействия иод-полисахарид согласно Вапкз е! а1. (81агсН/б1е 8!агке, 23:118-124, 1971) или посредством анализа глюкозы (Еп/у1ес).

Содержание амилозы проб крахмала определяли также колориметрическим (иодометрическим) способом Μοιτίδοπ апб Ьа1дпе1е! (1983) с небольшой модификацией, заключающейся в следующем. При- 40 025360 близительно 2 мг крахмала точно взвешивали (с точностью до 0,1 мг) в пробирку на 2 мл с завинчивающейся крышкой, снабженную резиновым промывателем в крышке. Для удаления липида, 1 мл 85% (о/о) метанола смешивали с этим крахмалом, и эту пробирку нагревали в водяной бане при 65°С в течение 1 ч с периодическим смешиванием при помощи вортекса. После центрифугирования при 13000 д в течение 5 мин супернатант осторожно удаляли, и стадии экстракции повторяли. Затем этот крахмал сушили при 65°С в течение 1 ч и растворяли в растворе мочевины-диметилсульфоксида (υΌΜδΟ; 9 объемов диметилсульфоксида к 1 объему 6М мочевины) с использованием 1 мл υΌΜδΟ на 2 мг крахмала (взвешенного, как описано выше). Эту смесь немедленно перемешивали интенсивно на вортексе и инкубировали в водяной бане при 95°С в течение 1 ч с периодическим встряхиванием на вортексе для полного растворения крахмала. Аликвоту раствора крахмал-υΌΜδΟ (50 мкл) обрабатывали 20 мкл реагента Ц-Ы, который содержал 2 мг иода и 20 мг иодида калия на мл воды. Эту смесь доводили до 1 мл водой. Оптическую плотность этой смеси при 650 нм измеряли перенесением 200 мкл в микропланшет и считыванием оптической плотности при помощи микропланшет-ридера Етах Ртеакюп М1стор1а!е Шабе!· (Мо1еси1аг Оеу1сек, υδΑ). Пробы стандарта, содержащие от 0 до 100% амилозы и 100-0% амилопектина, готовили из амилозы картофеля и амилопектина кукурузы (или картофеля) 01дта) и обрабатывали так же, как и тест-пробы. Содержание амилозы (процент амилозы) определяли из величин оптической плотности с использованием уравнения регрессии, произведенного из оптических плотностей для этих стандартных проб.

Анализ фермента α-амилазы.

Активность α-амилазы в пробах муки или муки из цельного зерна определяли с использованием набора для анализа Сега1рН Ату1аке из Меда/уте ПЛетаЦопа! кектб Ь!б. в соответствии с рекомендациями изготовителя. В гидролизе олигосахарида, добавляемого из этой смеси реагентов эндогенным действием α-амилаз, избыточные количества α-глюкозидаз, присутствующие в этой смеси, давали количественный гидролиз этого олигосахарида с образованием глюкозы и свободного п-нитрофенрола. По существу, аликвоту зернового экстракта инкубировали с субстратной смесью при 40°С в течение 20 мин, реакцию останавливали, и окраску проявляли добавлением слабого щелочного раствора. Измеряли оптическую плотность при 400 нм, которая связана непосредственно с уровнем α-амилаз в анализируемой пробе. Эти результаты выражали в виде Ου (сега1рНа-единиц) на г муки или экстракта.

Трансформация пшеницы бомбардировкой незрелых зародышей пшеницы.

Частицы золота покрывали очищенной ДНК двух плазмид: 2 мкг плазмидной ДНК, кодирующей ген селектируемого маркера (пр!), в этом случае ρСΜηеоδΤ^δ2 (Маак е! а1., Мо1 Втеебшд, 3: 15-28, 1997), и 2 мкг плазмидной ДНК, кодирующей представляющий интерес ген, в этом случае ρВx17-ΟV^_IΚ, осаждением с использованием СаС1₂/спермидина, как было ранее описано Сао е! а1. (Р1ап! Се11 Юрокет, 77:586-591, 1992). Эта смесь частица золота/ДНК содержала 30 мг/мл частиц золота со средним размером 1,5-3,0 мкм. Для бомбардировки выделяли 50 незрелых зародышей при 12 днях после цветения и с длиной приблизительно 1,5-2 мм, и рубчики удаляли. Их помещали в центре чашки с агаром, содержащим высокоосмотическую среду ΜδΜ, которая была средой Μδ, содержащей 150 г/л мальтозы и 0,1 г/л миоинозита, с образованием зоны-мишени с диаметром приблизительно 3 см. Эти зародыши-мишени инкубировали (предобрабатывали) на чашках с ΜδΜ в течение 4 ч, как описано Уаш е! а1. (Р1ап! Се11 ^ройет, 12: 84-88, 1993) и затем бомбардировали 5 мкл смеси частиц золота, имеющих покрытие, при частичном вакууме (приблизительно 85 кПа) с использованием баллистической системы доставки Ρ^δ-1000/Не. Расстояние между нанесенной ДНК и зародышами-мишенью было равно 9 см, и используемое давление было равно 900 кПа.

Регенерация/отбор трансформантов.

Спустя 24 ч после бомбардировки смесью этих плазмид, зародыши переносили на среду ΜδΚ ^δсреда, рН 5,9, содержащая 30 г/л сахарозы, 0,1 г/л миоинозита и 2,5 мг/л 2,4-Ό) и инкубировали в течение 14 дней в темноте при 24°С для индукции соматических зародышей. Затем эти культуры переносили на селективную среду ΜδVΟ50 (Μδ-среда, рН 5,9, содержащая 30 г/л сахарозы, 0,1 г/л миоинозита) с 50 мг/л генетицина (Ο418) в качестве селективного агента и поддерживали в режиме 16 ч света (приблизительно 25 мкЕ м^-2с^-1) и 8 ч темноты. Затем их переносили в новые чашки с селективной средой ΜδVΟ50 каждые 3 недели. Проростки, которые образовывались, субкультивировали один раз на свежей ΜδVΟ50 для дополнительного роста. Проростки с высотой приблизительно 10-15 см пересаживали в почву на столе с аэрозольным орошением в течение 2 недель и затем переносили в оранжерею с температурным режимом 24°С (день) и 18°С (ночь). Присутствие трансгена в регенерированных растениях подтверждали экстракцией ДНК из проб ткани и проведением ПЦР-реакций с использованием трансгенспецифических праймеров.

Экстракция РНК из проб растений и количественная ОТ-ПЦР.

Общую РНК экстрагировали из проб листьев с использованием набора ΚNеаку Р1ап! М1ш Κι! (ЦН ΑΟΕΝ, НПбеп, Оегтапу) в соответствии с инструкциями поставщика. Синтез кДНК выполняли с использованием набора для синтеза первой цепи с олиго-б!-праймером. Специфические амплификации детектировали с использованием ВпШап! δΥΒΚ Огееп ОРСТ Мак!етМ1х (δΤΚΑΤΑΟΕΝΕ). Специфическую флу- 41 025360 оресценцию детектировали при 520 нм и анализировали при помощи программы анализа МХ4000 сравнением со специфическими калибровочными кривыми. Одностадийную ОТ-ПЦР также выполняли с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР О1адеп (ΟΙΛΟΕΝ, НПбеп, Оегтапу).

Пример 2. Идентификация генов ОАЭ и ΡΑΌ в пшенице и других зерновых растениях.

Аминокислотные последовательности для последовательностей белка К1 из картофеля (Номер доступа ΑΑΚ11735) и белка ΡΑΌ Λ^аЬ^бοрδ^δ (ΝΡ_194176) использовали в качестве запрашиваемых последовательностей для запроса Е8Т-последовательностей пшеницы в базе данных NСΒI с использованием программы ΒΕΑ^Ν. Были идентифицированы 17 Е8Т (перечисленные ниже), которые могли быть сопоставлены вместе и собраны в последовательность из 2273 пар оснований (8Е0 ГО N0: 1).

ДЫО626658.11 С.1626658 неопубликованная кДНК-библиотека У.О§Й1ага. еЫСУ773056.11 ГОА3067452 библиотека РСА8 Тпйсит аекйцит. с1Ы1С1б94861.II С1694861 неопубликованная кДНК-библиотека У.О^Ьага. еЫСА7438б5.11 \¥п1а,рк006.к23 ιντϊΐ; Тпйсит аевйуит сОМА. аЫВО240991,1| ТаЕ05010007К. ТаЕ05 Тпйсит аезйуит οΌΝΑ.

6Ы |С1696711.11 С.1696711 неопубликованная кДНК-библиотека У.0§1Ьага,

6ЫР730334.11 0730334 неопубликованная кДНК-библиотека У.О§1Ьага. аЫВО237936.11 ТаЕ()5010ΓΧΙ7Ρ ТаЕ05 Тпйсит аевйуит οϋΝΑ. аЬ|СК197520, II РОА3005996 библиотека РОАЗ ТНПсит аеяйуит.

6Ы 0650741.110650741 неопубликованная кДНК-библиотека У.ОфЬага.

6Ы 0542660. II 0542660 неопубликованная кДНК-библиотека У.О§Й1ага. аЬ|СК197837.11 РОА8006317 библиотека РОАЗ Тййсига асыЕит,

6ЫЮ590517.11 0590517 неопубликованная кДНК-библиотека У.О^Ьага. аЫВЕ516396.11 \У11Е609_А08_А 15ΖΑ АВА-обработанный зародыш пшеницы. аЫРУ742247,Ц ЕЗТ0817 обработанная холодом кДНК-библиотека пшеницы.

6Ы 0673389. II0673389 неопубликованная кДНК-библиотека У.Ообциа.

6Ы 0566400, Ц 0566400 неопубликованная кДНК-библиотека У.О^Ьага.

Эту последовательность использовали для запроса последовательностей пшеницы в базе данных Т1Ог (ЬНр://№№№.Бдг.огд/1бЬ/е2к1/1ае1). Это давало кДНК-последовательность 3677 пар оснований (8Е0 ГО N0: 2) (Т1Ог Αссеδδ^οη № ТΑ53350_4565), перекрывающую последовательность 2273 пар оснований. Эти две последовательности обнаруживали 99% идентичность в этом перекрывающемся районе. При сравнении предсказанной аминокислотной последовательности (8Е0 ГО N0: 3), кодируемой этой состоящей из 3677 нуклеотидов последовательностью, с последовательностями белков в базе данных белков NСΒI было видно, что она обнаруживает высокое сходство с последовательностями белков К1 из картофеля и Α^аЬ^бοрδ^δ (71 и 67% идентичность соответственно). Эта последовательность пшеницы обнаруживает также высокую степень сходства с последовательностью из генома риса (0δ06§0498400), которая предположительно является гомологом из риса. Эта кДНК-последовательность была на 87% идентична нуклеотидной последовательности риса, а аминокислотные последовательности были идентичными на 88%. Нуклеотидная последовательность ΟΑΌ представлена в виде 8Е0 ГО N0: 2, а аминокислотная последовательность в виде 8Е0 ГО N0: 3.

При сравнении этой кДНК пшеницы с геномной последовательностью риса (0δ06§0498400) удалось определить структуру экзон/интрон этого гена риса, и была определена предположительная структура экзона этой кДНК пшеницы (табл. 8).

Исследование Е8Т-последовательностей ячменя позволило идентифицировать Е8Т ВИ993423 ячменя из 663 нуклеотидов (8Е0 ГО N0: 4), которая обнаруживала сходство с последовательностями ΟΑΌ из пшеницы и риса в районе экзона 23 и 3' и которая, как считается, соответствует гомологичному гену ячменя. Была идентифицирована другая кДНК пшеницы, состоящая из 4302 нуклеотидов (8Е0 ГО N0: 5), которая кодирует белок, который имеет крахмалсвязывающий домен, сходный с белком К1 картофеля.

Последовательность кДНК 3677 п.н. пшеницы содержала открытую рамку считывания (0КЕ) 3027 п.н. от положения нуклеотида 382 до положения 3409; по-видимому, она является полноразмерной, так как при сопоставлении этой кДНК с кДНК риса эти две последовательности были одинаковыми на протяжении полной длины кДНК риса. Эта 0КЕ кодировала белок с последовательностью 1009 аминокислот с рассчитанной молекулярной массой 112,8 кД. Эта последовательность белка содержала 3 консервативных домена с предположительной функцией: домен связывания крахмала приблизительно из аминокислот 100-200, фосфор-акцепторный сайт приблизительно из аминокислот 200-300 и домен связывания РЕР/пирувата приблизительно из аминокислот 740 - С-конец, причем считается, что этот домен обратимо катализирует превращение АТФ в АДФ.

Были идентифицированы две другие Е8Т пшеницы, СА484881 и СО347457, которые имели гомоло- 42 025360 гию с последовательностью АгаЫйоркщ кодирующей РАО. Они не соответствовали последовательности 2273 п.н., но кодировали полипептиды, которые обнаруживали гомологию с крахмалсвязывающими доменами и белком РАО из АгаЙ1Йор818. Конкретно, эти две ΕδΤ-последовательности РАО обнаруживали сходство с аминокислотами 973-1153 (82% идентичность) и аминокислотами 1172-1196 (88% идентичность) гена АТСАО2/САО3/РАО (РНОЗРНОСЬиСАН ААТЕК ΟΙΚΙΝΆ8Ε) [АгаЫйорык йайапа] (№_194176) соответственно. Они обнаруживали также гомологию с РАО риса (Ок12§0297500). Эти полноразмерные последовательности гена РАО пшеницы могут быть выделены способами 5'- и 3'-КАСЕ с использованием праймеров на основе этих Е8Т-последовательностей или другими способами, известными в данной области.

Дополнительный поиск идентифицировал четыре Е8Т из сорго, которые были гомологичны кДНКпоследовательности САО пшеницы (8ЕЦ ГО NО: 2) и, следовательно, являлись, по-видимому, частью гена САО сорго. Этими последовательностями были: Ассеккюп № ΒΙ245998 (8ЕЦ ГО NО: 11), имеющая нуклеотидную последовательность, которая была на 83% идентична последовательности САО пшеницы (8ЕЦ ГО NО: 2) от положения нуклеотида 2057 до 2542; Ассеккюп № СР074015, имеющая последовательность, идентичную на 89% САО пшеницы от нуклеотида 874 до 1559; Ассеккюп № ЕН406623, имеющая последовательность, идентичную на 89% САО пшеницы от нуклеотида 1323 до 1885; и Ассеккюп № СО423248, имеющая последовательность, идентичную на 85% САО пшеницы от нуклеотида 2517 до 3434. Эта полноразмерная последовательность гена САО сорго может быть выделена способами 5'-и 3'КАСЕ с использованием праймеров на основе вышеуказанных ЕЗТ-последовательностей или другими способами, известными в данной области.

Пример 3. Получение растений, трансформированных конструкциями, которые ингибируют экспрессию гена САО.

Для тестирования эффекта ингибирования экспрессии гена САО конструировали конструкцию гена, которая могла бы экспрессировать двухцепочечнную молекулу РНК для ингибирования гомологичных генов в пшенице, нацеливанием на консервативный район, соответствующий крахмалсвязывающему домену.

Эта конструкция содержала промотор из гена глютенина Вх17 НМА из пшеницы для экспрессии этой йкΚNΆ, этот промотор был выбран в качестве тканеспецифического промотора, который преимущественно экспрессируется в эндосперме зерновых растений. Таким образом, ожидалось, что ингибирование экспрессии гена могло происходить в эндосперме.

Это ингибирующую ген конструкцию собирали в клонирующем векторе рВх 171КсаАОТ следующим образом. Этот вектор содержал следующие элементы в следующем порядке: эндоспермспецифический промотор из гена НМАС Вх17 пшеницы, содержащий первые 1897 нуклеотидов геномной последовательности Вх17, как сообщалось в Кеййу е! а1. (1993), прямую последовательность а11К (1447 п.н., включающие в себя ссйВ-отрицательный селектируемый ген) с сайтом ВатН1 на ее 5'-конце и сайтом ЕсоК1 на 3'-конце, интрон 4 ветвящего крахмал фермента риса (507 п.н., от нуклеотида 6201 до нуклеотида 6674 Ассеккюп № 010838) в обратной ориентации относительно этого промотора, интрон 9 ветвящего крахмал фермента риса (420 п.н., от нуклеотида 9112 до нуклеотида 9605 010838) в прямом направлении, обратную последовательность а11К (1435 п.н., включающие в себя вторую копию ссйВ с сайтом 8ре1 на ее 5'-конце и сайтом Крп1 на ее 3-конце, и, наконец, последовательность терминации транскрипции пок3' (267 п.н., из рЕти, СНатЬейат е! а1., 1994). Этот вектор не содержал гена селектируемого маркера, но вторую плазмиду, содержащую ген пр! котрансформировали для создания возможности отбора трансформированных клеток. Нуклеотидные последовательности, названные вышеуказанными номерами доступа, включены здесь в качестве ссылки.

ПЦР-фрагмент, соответствующий части гена САО пшеницы, амплифицировали из кДНК эндосперма пшеницы при стандартных условиях с использованием праймеров САОР: 5'ААААССАТССССТАСССССТТСТСССТСААСАСТТС-3' (8ЕЦ ГО 6) и САОК: 5'ААААСААТТСАСТАСТАТСАССТТСАССТССАССАС-3' (8ЕЦ ГО 7) и температуры отжига 62°С. Эта ПЦР-реакция амплифицировала фрагмент 597 п.н. кДНК САО пшеницы, соответствующий нуклеотидным положениям 581-1020 8ЕЦ ГО NО: 2 для САО. Этот район гена пшеницы в направлении 5'конца транскрибируемой последовательности соответствовал части гена картофеля, кодирующего аминокислоты 470-670 Ассеккюп № ААК11735 (этот номер доступа включен здесь в качестве ссылки). Предполагается, что этот район в полипептиде картофеля приближенно соответствует крахмалсвязывающему домену белка САО.

Этот ПЦР-фрагмент расщепляли 8ре1 и Крп1 и лигировали с ДНК вектора р1КВх 17саАОТ, расщепленной той же самой парой рестрикционных ферментов, с образованием посредством этого промежуточной конструкции рВх17-САО_К. Затем дополнительную ДНК этого ПЦР-фрагмента расщепляли Ват1 и ЕсоК1 и лигировали с ДНК рВх17-САО_К, расщепленной теми же самыми ферментами, с образованием рВх 17-САО_1К.

ДНК этой конструкции использовали для опосредованной бомбардировкой трансформации незрелых зародышей пшеницы (су. ВоЪ А1Ше) с использованием частиц золота, как описано в примере 1.

- 43 025360

Около 1100 зародышей обрабатывали с использованием этого баллистического способа и из них регенерировали 25 проростков. 18 растений выживали для выращивания до зрелости в оранжерее. При их тестировании на устойчивость к генетицину, указывающую на присутствие гена селектируемого маркера, или посредством ПЦР-скрининга были идентифицированы 13 положительных трансгенных растений пшеницы (обозначаемых как генерация Т0, линии гкОУИ), содержащих рВх 17-ОХУЭ_1К. ПЦР-скрининг проводили на ДНК, выделенной из проб листьев, и использовали праймер 2ЬВх17рго, расположенный в промоторе этой конструкции, и праймер ОХУЭК 5'-ААААОААТТСАСтАОТАТСАССТТСАССТсСаСОАС-3' (8ЕЦ ГО N0: 7). Эта ПЦР амплифицировала фрагмент 713 п.н. из растений, трансформированных рВх 17-ОУИ_1К.

Пример 4. Ген дикиназы, регулируемый понижающим образом, и анализ трансформированных растений пшеницы.

Растения Т0 выращивали в оранжерее и давали им самооплодотворяться с образованием семян Т1. Отдельные семена Т1 каждой трансгенной линии высевали для получения растений-потомков. Т1растения, которые были положительными в отношении присутствия этого трансгена, идентифицировали и самооплодотворяли с получением семян Т2. Ожидалось, что такие растения Т1 являются либо гомозиготными, либо гетерозиготными в отношении трансгена; они могли быть различены анализом генерации Т2 для каждой линии. Т1-растения, которые были отрицательными в отношении присутствия трансгена (сегреганты), также сохраняли и давали им самооплодотворяться для получения генерации Т2 растений, не имеющих трансгена, которые могли служить в качестве контроля (дикого типа) для сравнения фенотипических свойств.

Крахмал выделяли из высушенного зерна Т2 трансгенных линий, как описано в примере 1. Содержание крахмала трансгенных зерен является, по-видимому, сходным с содержанием крахмала зерна дикого типа, не наблюдали значимых различий в содержании крахмала. Пробы крахмала Т2 анализировали на их содержание глюкозо-6-фосфата (О6Р) с использованием адаптированного протокола из набора для анализа крахмала Еп/у1ес, как описано в примере 1. Анализировали пробы крахмала из 12 линий гкОУО Т1. Из этих линий 8 содержали конструкцию ΚΝΑί и 3 были нуль-сегрегантами, которые служили в качестве контролей (дикого типа). Из этих 8 трансформированных линий гкОУИ 7 обнаруживали явное уменьшение уровней О6Р в крахмале зерна в сравнении с исходным растением дикого типа (су. ВоЬ ХУЬПе), а также в сравнении с их сегрегантами дикого типа (см. фиг. 1). Одна линия (ОУИ5-9Х) обнаруживала уменьшенный уровень О6Р в сравнении с ВоЬ ХУННе, но уровень О6Р не был значимо уменьшенным в сравнении с соответствующим нуль-сегрегантом (г8ОУЭ5-9А). Эти результаты показывают, что этот ген-мишень кодировался функциональным ОХУЭ в пшенице.

Структурный и молекулярный анализ крахмала.

Пробы крахмала из зерна этих трансгенных линий анализировали также на распределение их длин цепей, содержание амилозы, а также распределение размеров гранул (крахмальных зерен). Профили распределения длин цепей получали при помощи капиллярного электрофореза после изоамилазного деветвления крахмала, как описано в примере 1. Для 12 анализированных линий не наблюдали значимых модификаций распределения длин цепей, причем положение основного максимума появляется при одной и той же степень полимеризации (ИР) для каждой пробы, и эти кривые были фактически идентичными при наложении одних на другие. При сравнении распределений размеров гранул или частоты (%) В-гранул в этих зернах также не наблюдали значимых изменений между трансгенными и нетрансгенными линиями. Содержание амилозы (выраженное в виде процента общего крахмала, экстрагированного из этого зерна) в пробах крахмала для большинства трансгенных линий было слегка более низким (на 2-3% более низким), чем в соответствующих контролях или исходной линии ВоЬ ХУЬйе (фиг. 2). Трансгенная линия Г5ОХУЭ5-9Х имела содержание амилозы, которое статистически не отличалось от его контроля.

Физико-химические свойства этого крахмала.

Исследовали физико-химические свойства проб крахмала из трансгенных линий, в том числе свойства пастирования, вязкость и индекс набухания.

Набухаемость крахмала из трансгенных линий испытывали, как описано в примере 1, и эти данные сравнивали с данными для контрольных проб (фиг. 3). Крахмал из трансгенного зерна с наивысшим уменьшением содержания связанного с крахмалом О6Р, т.е. наивысшей степенью сайленсинга генов на фенотипическом уровне, показал значимое уменьшение (по меньшей мере на 20%) индекса набухания при 95°С, в то время как для других линий не наблюдали значимой модификации.

Свойства пастирования крахмала анализировали с использованием 9% (м/о) суспензий крахмала, приготовленных с использованием 3 г крахмала и 25 мл воды, и КарМ Ушсо Апа1у8ег (№\\рог1 8с1еп11Пс, 8уйпеу, АиШгаПа) в присутствии нитрата серебра при конечной концентрации 4 мкг/мл в качестве ингибитора α-амилазы или в отсутствие добавленного ингибитора. Репрезентативные данные показаны на фиг. 4 и в табл. 4, которые изображают вискограммы для крахмала, выделенного из 5 выбранных трансгенных линий и контроля ВоЬ ХУЬйе. Линии с наивысшей степенью уменьшения О6Р также обнаруживали наивысшее уменьшение величин пастирования крахмала зерна, в частности максимальной вязкости и времени максимума. Однако, трансгенные линии с меньшим действием на содержание О6Р обнаружива- 44 025360 ли только слабую модификацию или отсутствие модификации их профилей КУА. Уменьшение вязкости, наблюдаемое для линии гкС\УБ4-1, было равно по меньшей мере 30%. Подобно поведению в других анализах крахмала зерна крахмал из линии гкС\УБ5-9Х обнаруживал тот же самый профиль вязкости, что и профиль его контроля.

Анализ активностей ферментов, относящихся к крахмалу.

Неожиданно, тот же самый тип анализа, проводимый на пробах муки из цельного зерна (в отличие от применения очищенного крахмала, выше), из трансгенного зерна в отсутствие ингибитора α-амилазы, выявил сильный особый фенотип (фиг. 4). Причиной для добавления ингибитора амилазы в этом эксперименте была попытка получения лучшего разрешения вискограммы и избегания какого-либо порога, обусловленного амилолитическими ферментами, наблюдаемого для исходной линии (В^У26). Однако, к удивлению авторов, КУА-профиль муки из цельного зерна был полностью разрушен и имел очень низкий максимум вязкости и очень низкую конечную вязкость. Профиль, полученный для муки из цельного зерна из исходной линии, восстанавливался добавлением нитрата серебра или ЭДТА в качестве ингибиторов амилазы к этой суспензии перед анализом с образованием профиля сходной формы относительно профиля КУА выделенного крахмала.

Этот результат позволил авторам предположить присутствие увеличенного пула α-амилаз в трансгенном зерне. Для испытания этой гипотезы уровень α-амилазной активности в семенах анализировали, как описано в примере 1. Данные для выбранных линий, включающих в себя следующую генерацию (Т3) этих линий, показаны на фиг. 5. Для этих анализированных линий гкСХУБ α-амилазная активность, повидимому, является повышенной, по меньшей мере, приблизительно в 2-5 раз в сравнении с исходной линией или контрольными линиями. При измерении β-амилазной активности наблюдали увеличения по меньшей мере 20% в этой муке в сравнении с ^трансформированным контролем. Был сделан вывод, что уменьшенная активность С\УБ в этом растении была ассоциирована с увеличенным накапливанием амилаз в трансгенных зернах, как α-амилазы, так и β-амилазы.

Уровни других ферментов, участвующих в деградации крахмала, также измеряли в трансгенном зерне с использованием протоколов, описанных Ζеетаη еΐ а1., Р1аШ 1оита1 15: 357-365 (1998). Ферменты α-глюкозидза, β-глюканаза, И-фермент, целлюлаза, лихеназа и ксиленаза, все присутствовали в сходных количествах в трансгенных семенах в сравнении в контрольными семенами, хотя некоторые семена обнаруживали слабые увеличения активностей отдельных ферментов. Был сделан вывод, что основное действие на активность ферментов было направлено на амилазы, в частности на α-амилазу.

Иссечение развивающихся семян (25 ИРА) и зрелого зерна из трансгенных и контрольных растений для разделения алейронового слоя и перикарпия, тканей эндосперма и зародыша с последующим измерением амилазной активности на этих тканях показало, что увеличенная α-амилазная активность была локализована прежде всего в алейроне и перикарпии. Только низкие уровни активности наблюдали в эндосперме и очень низкую активность в зародышах.

При выделении алейроновых слоев и окрашивании их иодидом пропидия, который является флуоресцентным соединением, которое не может входить в живые клетки, имеющие интактную клеточную мембрану, или диацетатом карбоксифлуоресцеина (СРИА), который может пересекать клеточную мембрану и входить в клетки, наблюдали, что имелись гораздо больше клеток в алейроновых слоях трансгенного зерна, которые прогрессировали в программированную смерть клеток, в сравнении с контрольными алейроновыми слоями.

Другие углеводы.

Анализировали уровни нескольких углеводов из листьев, колосьев и стеблей этих растений при 25 ИРА. Анализы выполняли в двух независимых экспериментах. Эти анализы показали, что имелись существенные увеличения в уровнях фруктозы, сахарозы и глюкозы в стеблях трансгенных растений в сравнении с растениями ВоЬ \У1Ше дикого типа. Уровни крахмала также увеличивались, но уровни фруктана уменьшались в стеблях.

Измененные фенотипы растений.

Удивительным и неожиданным образом наблюдали также, что понижающая регуляция экспрессии гена С^И в трансформированных линиях пшеницы приводила к большим модификациям морфологии и развития растений при выращивании в оранжерее. Наиболее важно, что при выращивании в одних и тех же условиях, включающих в себя свет, температуру и полив, трансгенные растения выглядели более жизнеспособными, более здоровыми и продуцировали больше биомассы, в том числе больше листьев, колосьев и вторичных колосков, чем соответствующие контрольные растения. Количество зерна, продуцируемое на одно растение, увеличивалось, по существу, по меньшей мере на 50% в сравнении с исходными или контрольными растениями, см. данные в табл. 5 в отношении продукции семян (в граммах семян на одно растение) и фиг. 6, которая показывает типичные размеры колосьев.

Для подтверждения этих наблюдений дополнительные исследования роста проводили на отобранных трансгенных линиях, контролях и исходных растениях для возможности проведения статистического анализа. Эти измеренные параметры включали в себя скорость прорастания, площадь листьев на разных стадиях роста и количество колосьев на одно растение. Эти анализы проводили для 5 повторностей

- 45 025360 каждой линии растений. Эти данные показаны в табл. 6. Из этих данных был сделан вывод, что продуцирование биомассы трансгенных растений увеличивалось с ранней стадии после прорастания, например на стадии 2-го листа, и пока не формировались колосья. Биомасса увеличивалась в среднем на 30%, а в некоторых растениях более чем на 40%. Площадь листьев увеличивалась по меньшей мере на 50%, в некоторых линиях более чем на 60%. Количество побегов на растение увеличивалось по меньшей мере на 50%, иногда более чем на 20%. Количество колосьев на растение увеличивалось по меньшей мере на 40%, в некоторых случаях по меньшей мере на 50%. Обычно продукция семян на растение увеличивалась по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% со сходной массой отдельных семян.

Даже более удивительно, наблюдали также существенное влияние на рост и развитие растений для трансгенной линии гзОАЭ5-9Х. Как показано выше, крахмал семян этой линии не был значимо модифицирован на уровне его О6Р или вязкости, так что не было сразу заметно, почему должно было осуществляться влияние на рост и развитие этой линии растения. Перед этими наблюдениями считалось, что промотор глютенина НМА, применяемый для создания ингибирующей конструкции КХАк мог быть ограничен в экспрессии только эндоспермом. Однако, наблюдаемый профиль роста позволял в сильной степени предполагать, что экспрессия этого промотора давала утечку, в частности, в листьях растения, где имеется транзиторный метаболизм крахмала после фотосинтеза. Для испытания этой возможности действия конструкции РИА! на этот транзиторный метаболизм крахмала уровни О6Р крахмала, присутствующие в листьях из выбранных трансгенных и контрольных линий, измеряли в конце периода дневного света. Эта временная точка соответствовала наивысшей активности ОАЭ и наивысшему накапливанию транзиторного крахмала во время 24-часового периода и была выбрана, поскольку активность фермента обнаруживает циркадную вариацию.

Полученные данные показаны на фиг. 7. В соответствии с наблюдениями по росту и развитию этой линии уровни О6Р, присутствующие в крахмале листа, уменьшались разительно в сравнении с ст. ВоЬ А1Ше или контрольными растениями. Этот результат подтвердил, что конструкция КХА1 должна была экспрессироваться при уровнях, достаточных для нарушения регуляции ОАЭ в листьях, и посредством этого влиять на транзиторный метаболизм крахмала.

Выводы.

Было показано, что уменьшение активности глюкоза-вода-дикиназы конструкцией, которая кодировала ингибитор экспрессии гена, кодирующего ОАЭ, в трансгенной пшенице, уменьшало содержание глюкозо-6-фосфата в запасном крахмале, в данном случае в крахмале зерна. Это доказало, что этот генмишень кодировал функциональный фермент ОАЭ. Уменьшение уровней моноэстерифицированного фосфата способствовало модификации свойств пастирования и и уменьшению индекса набухания этого крахмала. В новом и неожиданном наблюдении зерно из этих трансгенных растений также обнаруживало в сильной степени увеличенные уровни α-амилазы и значительные увеличения уровней β-амилазы, которые влияли также на природные свойства пастирования муки из цельного зерна. Обе эти амилазы в норме экспрессируются прежде всего в алейроновом слое зерна и особенно после насыщения влагой и во время прорастания зерна, так что считается вероятным, что большая часть увеличенной амилазы могла бы также экспрессироваться в алейроновом слое. Такие эффекты были только умеренными при анализе очищенного крахмала, где белки удалены. Можно было ожидать, что такие эффекты на муке оказывают действия на хлебопечение и другие пищевые применения. Однако, наиболее неожиданным наблюдением было то, что конструкция ΚΉΛί в сильной степени влияла на рост и развитие растений, приводя к существенному увеличению продукции биомассы и выхода зерна. Продукция биомассы и семян увеличивалась на 30-40% или более и была ассоциирована с уменьшением уровней глюкозо-6-фосфата в транзиторном крахмале. На основе результатов, полученных с растениями трансгенной линии гзОАО5-9Х, действие на рост и урожай было опосредовано первично модификацией экспрессии гена в зеленых тканях, таких как листья, а не в развивающемся зерне. Это было неожиданным, так как промотор, используемый для запуска конструкции КХАн был выбран таким образом, что он был эндоспермспецифическим, с очень низкой экспрессией в других тканях. Кроме того, действия на развитие и морфологию растений наблюдались задолго до развития семян.

Пример 5. Влияние ингибирования экспрессии гена ОАЭ в различных генетических средах.

Для установления действия понижающей регуляции гена ОАЭ в различных генетических средах трансгенные растения, содержащие конструкцию рВ/17-ОАЭДР скрещивали с растениями коммерческих сортов пшеницы мягкой (хлебопекарной пшеницы) АезЮта, Ните и 8ип51а1е. Получали зрелые семена Р1. При высевании этих семян в оранжерее при контролируемых условиях Р1-растения из гибридов с каждым из этих трех коммерческих сортов обнаруживали увеличенное количество вторичных колосков на растение, см., например, данные на фиг. 8 для 4 или 5 растений для каждой линии. Был сделан вывод, что эти увеличенные параметры продуктивности распространялись в различные генетические среды.

Растения, полученные из этих семян и из дополнительных обратных скрещиваний, будут дополнительно анализироваться описанным выше образом на рост и развитие, а также на свойства крахмала. Всхожесть семян и развитие растений будет сравниваться с исходными растениями для подтверждения

- 46 025360 фенотипов, наблюдаемых для трансгенных линий в генетической среде сорта ВоЬ АЫ!е. Будут измеряться такие характеристики, как время прорастания, скорость ранней стадии роста и площадь листьев, кроме количества побегов, количества колосьев и урожая. Будут также проводиться полевые испытания для оценивания продуктивности в поле.

Пример 6. Модулирование экспрессии ОАО.

Сверхэкспрессия ОАО.

Сверхэкспрессия ОАО в пшенице или других растениях требует использования кДНК или геномной ДНК, кодирующей ОАО. Для этого может быть использована полноразмерная кДНКпоследовательность (8ЕЦ ГО N0: 2), функционально присоединенная к промотору, который может быть гетерологичным промотором относительно кодирующего ОАО района.

Уровни экспрессии генов, кодирующих ОАО и РАО в различных тканях и на протяжении развития растений.

Количественные анализы ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводят на пробах мРНК, выделенных из различных тканей растений, в частности листа и эндосперма, на протяжении развития растений для измерения распределений экспрессии генов ОАО и РАО. Уровни экспрессии в листьях измеряют каждые 3 ч на протяжении 24-часового периода для выяснения роли циркадного ритма в уровнях экспрессии, как было описано для модели С. гешйагй!н (Ка1 е! а1., 2005). Варьирование содержания крахмала и α-амилазной активности также подвергают мониторингу в листьях для анализа транзиторного метаболизма углеводов.

Эндоспермы собирали из растений дикого типа на различных стадиях развития и использовали для выделения РНК для исследования экспрессии ОАО и РАО на протяжении развития эндосперма количественной ОТ-ПЦР.

Многочисленные генотипы со сходными отношениями амилопектин/амилоза были отобраны на их конкретные физико-химические свойства. Эмпирически известно, что некоторые культивары особенно пригодны для выпечки и приготовления лентовидных макаронных изделий. (Сйага). Известно, что некоторые культивары хороши для Азиатского пропаренного хлеба (Вах1ег), а другие известны из-за их свойств, позволяющих получать хлеб с пористым мякишем или хлеб с липким мякишем (АС Вате апй А1кеп).

Пример 7. Модулирование экспрессии ОАО и РАО.

Мутация РАО в рисе.

Аминокислотную последовательность белка РАО из АгаЫйор818 ШаПапа (ΝΈ_194176) использовали в качестве запрашиваемой последовательности для запроса базы данных инсерционных мутантов риса Ток17. Три различных линии Ток17 ^О0294, Ν09050_0_701_1Λ и Т29717Т) были идентифицированы, и были получены семена этих линий. Эти меченые геномные последовательности риса (8ЕЦ ГО №: 8-10), ассоциированные с этими тремя инсерциями, каждая из которых обнаруживала гомологию (приблизительно 70% идентичность) с последовательностью РАО АгаЫйор818, что указывало на то, что эти инсерции находились в пределах гена РАО.

N00294

ТССТООАОСАОСАОТАТАТаАТАООТТАОАОАААОТССОССАТААТПТТ

ОТАОТТТОСТСААОААТТТАТТТООСАТТАСААСТААОСТОАСТОСТТОТ

ТТСАОТОТСССТАТаОАТОАООААОАТОААОТСОТАСТСОАСТАСАССАС

АОАСССССТСАТТАСАОАТСАОООАТССАААААТСААТССТСТСОАОСАТ

ТОСАСОООСТСОТСАТОССАТТСАООАТТТСТАТООСТСАССАСАОООСА

- 47 025360

САаОАТОТТСАСООТОСАОТОААООААОООААССТАТААОТАОТАСАОАС ААОАССАСАААТОТААТСТАТАТОТАТАТТТТАТАОССААОТСААТСАОО АААТОТТаТАОАОТААОАТАТАСОООССОТОООАСАТОТАТААСАСОТТА ТОСТССТТТТГТТ(5ЕО ΓΟΝΟ: 8)

Νϋ9050_0_701_1Α

ТСТАСААСТАСААСТТТТТАОААТСТООАССААААССТСОАСТОТТТОАО

СОАОСТТСТОАТТСТСАОАОААОСТОСАССАОСТАОААССТСССССАААС

АООСССТТАООТАОСТООТТАСААОТСТОАТСАСАСТОТТТТАаОТТТеТ

СТОТТОТТОТАТАТСАОАТАОСТАААТОСАТАОСТОТОАОСТАОАОТТОТ

АААОАТАААСТТСОТОАОСТСАОСТООООАСААААТСАТСАОАТТТТОТА ТТСТСССАОСАОАОСАААТАаООАТТТСССТОТОАОТОСАТаССТОАСТТ ОТСТОТТООТСТАТОАААТСООСССТСААОТОТОСТТСТАТСООССТТОТ САСТАСТЫАССАООСООТАТТОСАОАОСАОАТТТСТТСОСССАТТТТСТС СТТТТТСТСТСТ (КЕЕ) ГО ΝΟ: 9)

Т29717Т

СТТОООААОАСООТОСОТОТТАОАТТТОТОСТОААОАОСОААТОСАСОТТ

СООССАОАОСТТССАССТТОТСООСОАССАСССОаСОСТСООССТСТССС

АТССОТСОААООСАОТОССТТГООАТТООТСАОААООАСАСОАСТООАСТ

ОТООАОАААОТОАОССТтеСАТСОТОСОСАТТаТТТОАТОТАСТСТССТТ

ТТСАОСТААТСАТСАССССТТТТСТГСТОТАСАаОАСТТОССАОССААСА

АОТТСАТТОАОТАСААОТТССТОСТССААОАТТТОТСОООСААОТТОСАТ

ТООСАСААТООТСОТААТАОААОСОТАСАОАСАСОТОАААСТССАААСАТ

ТСТАСТСОТАТАТОААОАТТООООТААТОСАААТАОТСАСАСАОТАСААО

АССАОООТАААОТОТССАТТОООАТООАООАООСТАААТТСТСССТТООС

АТОаАОСАООСТОТАОТТССАОАТОАТАОТОАААОСАОАО (ЗЕЕ) ГО ΝΟ: 10)

Поскольку ожидалось, что эти инсерционные мутации Тоз17 являются рецессивными, для каждой из них выделяли гомозиготные мутанты. Это требовало сначала разработки способа скрининга для различения гомозигот и гетерозигот для каждого из аллелей дикого типа и мутанта для идентификации растений как растения дикого типа, гетерогенного или гомогенного мутанта. Это выполняли следующим образом.

Для каждой линии конструировали и получали две пары праймеров, см. ниже. Тоз17 праймер, используемый в каждой паре праймеров А, имел нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности в элементе Тоз17, следовательно, этот элемент должен был присутствовать для того, чтобы происходила амплификация. Таким образом, положительный результат ПЦР с использованием пары праймеров А идентифицировал растение как имеющее мутантный аллель, тогда как отрицательный результат ПЦР для пары праймеров А выявлял, что это растение является растением дикого типа в отношении гена РХО. Каждая пара праймеров В различала мутантные линии, которые были гетерозиготными, из мутантных линий, которые были гомозиготными, и подтверждала статус диких типов. Каждая пара праймеров В фланкировала сайт инсерта Тоз17. Отрицательный результат для пары праймеров В выявлял растение, являющееся гомозиготным мутантом, так как размер предсказанного продукта амплификации в присутствии Тоз17 был таким большим, что нельзя было ожидать его амплификации. Объединение этих двух положительных результатов ПЦР для обеих пар праймеров различало растение как гетерозиготное в отношении аллелей дикого типа и мутантных аллелей.

Мутант ТозП	Пара праймеров А	Пара праймеров В
риса Ρλ¥ΟΙ	Тоз! 7праймер 7οί77Ρ\νθΙ	&	НотоО\¥ОГог & Тоз 17Р V/ 011
ΡΨΏΙΙ	7ού77ι [раймер 77и/7Р\УГ)[1	&	НотоС\¥ОГог & Тоз! 7Ρ\νθΙΙ
ρν/οιπ	Гоз! 7праймер 77м77РиТ>ТП	&	НотоОАУОГог& 77κ/7Ρ\νθΠί

Праймеры Пм//праймер ΥίΜ/ΖΙΛνΏΙ 77м/7РТОП 7ол77Р\¥1)|[| ΗοηιοΡν/ϋ&Γ

Последовательности от 5’ - 3’ дТТ0ТТА0аТТ0САА0ТТАСТТ(5Е<3 Ю ΝΟ: 15) СТТСССТТССТТСАСТОСАС (ЗЕ-О ГО N0: 16) ОСААООСТСАСТТГСТССАС <5Ер 1ΟΝΟ: 17) ТССАТСССААТООАСАСТТТ (ЗНО 10 N0: 18) ТАССАСАТССААСССО (ЙЕС) Ю N0: 19)

С использованием этого способа были идентифицированы гомозиготные растения для каждой из

- 48 025360 этих трех инсерционных линий. Семена из этих растений анализировали с использованием способов, описанных выше для пшеницы, и высевали при контролируемых условиях для испытания фенотипов растений. Наблюдали небольшое уменьшение содержания фосфата крахмала в одном инсерционном мутанте в сравнении с сортом дикого типа №рроиЬате, но было неясно, имелось ли уменьшение в сравнении с крахмалом из сегреганта из этой линии, лишенного этой инсерции, вследствие больших отрезков, изображающих графически величину ошибки, в этих анализах. Не было значимого различия в содержании крахмала, индексе набухания, /_тах, распределении длин цепей или уровне α-амилазы в пробах муки из зерна этих инсерционных линий в сравнении с сегрегантами, лишенными инсерции или дикого типа. Эти данные позволяют предположить, что имелось только слабое действие вследствие инактивации только Р\И в рисе. Однако, данные из Ваипкдаагб е! а1. (2005) позволяют предположить, что объединение 0\Ό и Р\И в АгаЫбор515 обнаруживает увеличенное действие в сравнении с одним 0\Э.

Несколько других инсерционных линий риса были идентифицированы в базе данных Опдепе (й!1р://огудепе5бЬ.с1габ.й-/шбех.й!тГ), которые, по-видимому, содержат инсерции Т-ДНК в гене 0\Э риса. Они были следующими:

ЗА-51160, соответствующая Р8Т А29424 ЗА-07997, соответствующая Р8Т А16348 2А-40470, соответствующая Р8Т А07158 ЗА-17981, соответствующая Р8Т А27803

Эти линии могут быть получены из ро5ΤЕСН (КериЬНс оГ Когеа). Кроме того, были идентифицированы две линии, которые, по-видимому, имеют инсерты в гене §ЕХ4 риса, который кодирует фосфорилазу крахмала: 1В-06142, соответствующую Ρ8Τ А3204, и 2Ό41347, соответствующую ΡδΤ Ό08500. Они будут анализированы в отношении вышеописанных свойств.

Пример 8. Дополнительные мутанты в 0\Э в зерновых растениях.

Г еномспецифические праймеры для генов 0\Э пшеницы.

Геномспецифические праймеры конструировали для амплификации фрагментов генов 0\Ό специфически из геномов А, В и Ό и различения посредством этого этих трех гомологичных генов в гексаплоидной пшенице. Это достигалось следующим образом. Несколько районов интронов из гена 0\Ό из гексаплоидной пшеницы амплифицировали при помощи ПЦР, и эти фрагменты клонировали и секвенировали. В большинстве случаев могли быть идентифицированы три варианта последовательности, соответствующие генам 0\Ό из геномов А, В и Ό, но без возможности отнесения каждого варианта к конкретному геному. Для получения этого отнесения те же самые ПЦР-реакции проводили также с использованием в качестве матрицы геномной ДНК из линий с определенными хромосомными делециями, и амплифицированные фрагменты клонировали и секвенировали таким же образом. Эти линии содержали гены 0\Э только для двух из геномов, в то вермя как третий отсутствовал. Например, линия с хромосомной делецией Ν7Λ17Ε была нуль-линией в отношении хромосомы 7А и, следовательно, была лишена гена 0\Ό генома А, но имела 2 копии гена 0\Ό хромосомы 7Ό и 4 копии гена 0\Э хромосомы 7В. Таким образом, амплификация последовательностей интронов из делеционных линий N7ΛΤ7В, Ν7ΕΤ7Ω и N7^Τ7Λ сделала возможным отнесение этих вариантов последовательности к каждому конкретному геному.

Пятнадцать клонированных фрагментов секвенировали из каждой амплификации и посредством этого идентифицировали уникальные специфические модификации генома, которые коррелировали с геномами А, В и Ό. Например, замену С на Т наблюдали в делеционной линии, где присутствовал геном А, но не в А-нуль-линии. Это означает, что этот вариант последовательности 0\Ό с Т был специфическим для генома А. Затем такие полиморфизмы использовали для конструирования специфических пар праймеров следующим образом:

Геном А:

Праймер ОШЩРогА* 5’-ОАААСАСАТАОТСТО-3’ (ЗЕО ΙΟΝΟ; 20)

Праймер 1В_ОТО2геу 5’-ТТОСООТОССТТТАСС-3' (ЗЕО ГО N0: 21)

Геном В:

Праймер 0\ТО1РогВ*_НТМ 5'-ОАААОАААСАСАТАОТСТО-3’ (ЗЕО ГО N0: 22)

Праймер 1В_0МТОЗгеу 5’-АТСТОТАААССТОТСТТОТО-3’ (ЗЕО Ю N0: 23)

Геном И:

Праймер ОТО2Гог2 5’-ТТОСООТОСС1ТТАСС-3' (5Е0 ГО ΝΟ: 24)

Праймер 1В_О1ДГОЗгеу 5’-АТСТОТАААССТОТСТТОТО-3’ (5Е0 ГО N0: 25)

При использовании этих пар праймеров в ПЦР-реакцих с геномной ДНК пшеницы с использованием следующих условий проведения циклов ПЦР: 94°С в течение 5 мин, затем 40 циклов 94°С в течение 30 с, 53°С в течение 30 с, 72°С в течение 40 с, с последующими 72°С 5 мин, и фракционировании этих продуктов гель-электрофорезом, могли быть различены следующие продукты амплификации: для гена 0\Ό на А-геноме наблюдали уникальный фрагмент приблизительно 600 п.н., для гена 0\Э на В- 49 025360 геноме - фрагмент приблизительно 1000 п.н., тогда как для гена О\УЭ на Ό-геноме - фрагмент приблизительно 500 п.н. Эти три ПЦР-реакции могли объединяться в единой мультиплексной ПЦР-реакции с использованием всех трех пар праймеров для возможности высокопроизводительного скрининга мутагенизированных семян и популяций растений.

При использовании этих ПЦР-реакций на делеционных линиях пшеницы с более ограниченными определенными хромосомными делециями, лишенными специфических хромосомных сегментов, отсутствие амплифицированных продуктов из некоторых делеционных линий указывало на то, что гены О\УЭ в пшенице были расположены на конце короткого плеча хромосомы 7, т.е. хромосомы 78.

Мутация гена О\УЭ в пшенице.

Семена пшеницы культивара СЬага мутагенизировали бомбардировкой тяжелыми ионами по способу, по существу, такому же, какой описан 8Ш!8ика№а е! а1., Оепе8 Оепе!. 8у8!. 82:167-170 (2007). Эти мутагенизированные семена выращивали с получением растений М1, и семена, полученные из отдельных растений, собирали и поддерживали с обеспечением 8000 отдельных мутагенизированных линий.

Эти 8000 линий подвергали скринингу с использованием геномспецифических пар праймеров, описанных выше, для идентификации мутантов, лишенных любого из трех генов О\УЭ. Были идентифицированы два мутанта, лишенные сегмента гена, соответствующего гену О\УЭ В-генома, и был идентифицирован один мутант, лишенный сегмента гена О\УЭ Ό-генома. Эти мутантные растения, которые предположительно является нуль-мутантами генов ОУО, выращивали в оранжерее, и они были, повидимому, фенотипически нормальными. Эти растения скрещивали с получением двойных мутантов, лишенных генов СУЭ как В-, так и Ό-геномов.

Дополнительные мутагенизированные линии испытываются для идентификации нуль-мутантов в отношении гена О\УЭ на А-геноме. При идентификации такие растения могут скрещиваться с двойным мутантом В- и Ό-генома с получением тройного мутанта в каждом из А, В- и Ό-геномов.

Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что описанное здесь изобретение может быть подвергнуто вариациям и модификациям другим, чем вариации и модификации, описанные здесь. Должно быть понятно, что это изобретение включает в себя все такие вариации и модификации. Это изобретение включает в себя также все стадии, признаки, композиции и соединения, на которые делаются ссылки или указания в этом описании, по отдельности или в совокупности, и любые и все комбинации любых двух или более указанных стадий или признаков.

Таблица 1

Суммирование идентификаторов последовательностей

ΚΕΟϋΕΝΟΕ Ш ΝΟ:	ОПИСАНИЕ
	Генетическая последовательность пшеницы, соответствующая К1 (картофель) и Р\\Т) (АгаЫ0ор$&)
2	кДНК С\УВ пшеницы
3	Аминокислотная последовательность, кодируемая 5ЕО ΙΟ ΝΟ: 2
4	ЕЗТ Ο\¥ϋ ячменя
5	кДНК ОХУО-подобных генов пшеницы
6	Прямой праймер для гена 0\УО
7	Обратный праймер для гена ΟΆΊ)
8	Частичные инсерционные последовательности Р\УЭ риса
9	Частичные инсерционные последовательности ΡΨΏ риса
10	Частичные инсерционные последовательности Р\\'Т) риса
11	ЕЗТ гена О%Т> сорго (Ассеззюп Νο ΒΙ245998)
12	ЕЗТ гена (ЛУП сорго (Ассеззюп Νο СР074015)
13	Е8Т гена ΟΨϋ сорго (Ассеззюп Νο ЕН406623)
14	ЕЗТ гена (ЛУП сорго (Ассеззюп Νο СП423248)
15	Праймер для гена Р\УП риса
16	Праймер для гена Р\УП риса
17	Праймер для гена Р\УЛ риса
18	Праймер для гена Р\\'Т) риса
19	Праймер для гена РО риса
20	Праймер для гена ΟΨϋ пшеницы
21	Праймер для гена ОХУП пшеницы
22	Праймер для гена О\УП пшеницы
23	Прймер для гена О\\Т) пшеницы
24	Праймер для гена СЛУП пшеницы
25	Праймер для гена СЛУЛ пшеницы

- 50 025360

-Подклассы

Таблица 2

Классификация аминокилот

-Аминокислоты

Кислые Аспарагиновая кислота, Глутаминовая кислота

Щелочные Нециклические: Аргинин, Лизин; Циклическая:

Гистидин

Заряженные Аспарагиновая кислота, Глутаминовая кислота, Аргинин,

Лизин, Гистидин

Малые Глицин, Серин, Аланин, Треонин, Пролин

Полярные/нейтральные Аспарагин, Гистидин, Глутамин, Цистеин, Серин,

Греонин

Поляряые/болыпие Аспарагин, Глутамин

Гидрофобные (Тирозин, Валин, Изолейцин, Лейцин, Метионин, (Фенилаланин, Триптофан

Ароматические Триптофан, Тирозин, Фенилаланин

Остатки, влияющие на[Глицин и Пролин ориентацию цепи_{__

Таблица 3

Примерные и предпочтительные аминокислотные замены
Первоначальный >	.1] 1РИМЕР[Н)1|1 замены	ирьлноч ГИТМГ.НЫЬ
остаток .		3 УМ-Ы1Ы
А1а	Уа1. Ией, Пе	Уа1 ’ ’
А Г 2.	!_уз, ϋΐη, АХП	Руз
А?	СЛп, ШяДу». Аге	СЛп
Азр	(Ли	(Ли
Суз	5ег	йег
(Лп	Азп. ΗΪ5, Иук.	Азп
СПи	Аар, И уз	, Азр
(Л у	Рго	ΡΐΟ
ГПа	Азп, СПп, Пуз, Аре	Αιή
Г1е	Пей, Уа1, МеГ, А1а, РЬсМогк'и	Пей
Пси	МоНеи, Пе, УЛ, Мет, А1а, РЬе	Пе
Иуз	Агц, (Лп, Ляп	Аге;
Ме!	, Пси, Пе, РЬе	Пси
РЬе	' Пей, УЛ, Не. А1а	Пей
Рго	СЛу	О Зу
Хег	ТЬг	ТЬг
ТЬг	5ег	$сг
Тгр	Туг	1 уг
Туг	Тгр, РЬе, ТЬг, 8ег	РЬе
УЛ	Пе, Ьеи, МсП РЬе.	А1н, Пей

Νοτίευ

Таблица 4

	Пик	Впадина	Расщепление	Конечная вязкость	Обратный ход	Время пика	Температура пастирования
ВУУ26 (родитель)	398.92	176.25	222.67	401.67	225.42	8.53	78.45
тесхт-ш (контроль)	429.67	181.92	247.75	427.58	245.67	8.47	65.45
гвСЧУПЫС	365.17	167.25	197.92	340.25	173	8.53	81.45
(контроль)	410.67	198.75	211.92	402.5	203.75	8.53	68.95
ΓδΟ\νϋ3-1Α	330.5	179.67	150.83	378.08	198.42	8.6	78.9
Γ8θ\νϋ4-1 (контроль)	425,5	166.33	259.17	365.58	199.25	8.47	66
Г5С\УР4-1Т	355.42	191.58	163.83	381.67	190.08	8.53	81.4
Г8С\\Т)4-Ю	365.17	167.25	197.92	340.25	173	8.53	81.45
Γ8θ\νϋ5-9Α (контроль)	411.42	199	212.42	406.25	207.25	8.6	77.4
Г8СХУП5-9Х	412.25	197.83	214.42	400.33	202.5	8.6	78.35

Параметры семян для семян Т2 из трансгенных и контрольных (\\1) растений

Таблица 5

	Масса семян (мг)	Продукция семян
Среднее	стандартное отклонение	(г на растение)
В\У26 (исходное растение)	37,54	2,52	16
С\¥Ш-1 Н («()	41,98	2,71	12
ΟΆυΐ-Ι Г	46,45	6,68	27,5
С\ЗП1-1 С	45,10	3,60	25
С\ЗОЗ-1 1, (»1)	44,00	3,96	14
СЗУЦЗ-! А	46,71	3,90	27,5
С\3'03-1 с	46,13	4,57	24
С\¥ПЗ-1 0	44,81	3,26	20
Γ.\νϋ4-1 Е («()	46,51	3,76
Ο\νϋ4-1 А	44,64	5,67	18,5
<ЖО4-1 Р	42,20	3,65
СЗ¥О4-1 О	49.89	3,22	20
СЧФ4-1 Т	60,30	2,14
СУТО5-9 А («0	43,83	4,90	10
ίϊ\νΌ5-9 X	45.58	5,03	24

- 51 025360

Таблица 6

	Площадь листа (см3)	Колосья	Продукция семян	Иасса семян	Содержание крахмала
стадия 2 листьев	стадия 4 листьев	г на растение	г на растение	г на колос	(г на 100 семян)	(%)
ВХУ26 (родитель)	4,4 ±0,4	48,4 ±6,9	5,8±1,9	9,0 ±2,1	1,3 ±0,2	3,4 ±0,4	64,4 ±2,6
геСХУЮ 1-1С	6,5 ±1,1	76,8 ±10,2	9,8 ±1,48	15,3 ±2,7	1,8 ± 0,2	4,9 ±0,3	59,6 ±2,4
гвСХУП 3-1А	6,6 ±0,4	82,0 ±5,6	8,2 ±1,64	11,5 ± 3,7	1,7 ± 0,2	4,6 ±0,3	65,6 ±3,4
геСХУЛ 3-1С	7,9 ±1,0	87,8 ±6,7	8,4 ±1,67	11,9 ± 1,5	1,6 ± 0,2	4,8 ±0,3	67.4 ±4.8
геСХУЛ 4-1А	6,4 ±1,3	77,9 ±13,8	8 ±1,22	10,6 ±2	1,6 ±0,1	4,3 ±0,2	66,2 ±3,5
гвСХУЛ 5-9Х	7,1 ±0,5	82,9 ±12,6	8,2 ±1,48	12,7 ±2,8	1,7 ±0,1	4,5 ±0,2	65,7 ±3,9
гзСХУЛ 5-9А (с№1)	4,8 ±0,6	58,2 ±4,5	7,25 ±1,5	10,9 ±1	1,5 ± 0,1	4,0 ±0,2	67,9 ±2,3
гзСХУЛ 3-1Ь (соп1го!)	5,1 ±0,5	59,9 ±5,6	7,2 ±0,83	9,9 ± 1,4	1,3 ±0,1	3,9 ±0,1	63,9±1,6

Таблица 7

Структура экзон/интрон гена С\УЭ пшеницы в сравнении с геном риса

Номер Размер

экзона	Экзон		экзона			Номер	Размер
пшени-	пшеницы	пше-	Положение экзона	интрона	интрона
цы			ницы	риса		риса	риса
	от п(	ДО ηί	(п.н.)	от ηί	ДО ηί		(п.н.)
Экзон 1	1	328	328	1713	2032	Интрон 1	89

Экзон 2	342	417	76	2122	2197	Интрон 2	14
Экзон 3	434	527	94	2312	2405	Интрон 3	81
Экзон 4	531	670	140	2487	2626	Интрон 4	590
Экзон 5	662	761	100	3217	3316	Интрон 5	78
Экзон 6	758	903	146	3395	3540	Интрон 6	229
Экзон 7	896	1059	164	3770	3933	Интрон 7	86
Экзон 8	1058	1150	93	4020	4112	Интрон 8	91
Экзон 9	1157	1336	180	4204	4383	Интрон 9 Интрон	943 73
Экзон 10	1334	1399	66	5327	5392	10 Интрон	83
Экзон 11	1397	1462	66	5466	5531	11 Интрон	212 117
Экзон 12	1465	1522	58	5615	5672	12 Интрон
Экзон 13	1520	1674	155	5885	6039	13 Интрон	816 81
Экзон 14	1673	1759	87	6157	6243	14 Интрон
Экзон 15	1756	1934	179	7060	7238	15 Интрон	64 81
Экзон 16	1942	2042	101	7320	7420	16 Интрон
Экзон 17	2041	2258	218	7485	7702	17 Интрон	683
Экзон 18	2254	2361	108	7784	7891	18 Интрон
Экзон 19	2384	2501	118	8575	8692	19 Интрон	126
Экзон 20	2499	2626	128	8819	8946	20 Интрон	362
Экзон 21	2624	2738	115	9309	9423	21 Интрон	176
Экзон 22	2740	2837	98	9600 2	9697 99	22 Интрон	296
Экзон 23	2834	3105 3	72	94	10265	23 Интрон	68
Экзон 24 Экзон 25	101 3217	3218 3435	118 219	10334 10531	10451 10749	24	79

- 52 025360

В1ВЫОСКАРНУ

АЬе1 βίαί, ТНе ΡΙαηί Аоигпа! 10: 981-991,1996 Абатз βίαί, Αηαί Вюскет., 266: 77-84, 1999 А1те1(3а апб АПзЬйе, СеН ΒίοΙ 15: 251-258, 2005 Α1ΐ.$ο1ΐίΐ1 βί αί, Ναοί. Ленк Вез. 25: 3389, 1997 Ап, МшкоНз ϊη Епгуто1о§у, 153: 292, 1987

АизиЬе1 (Еб) Сиггеш РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Βίο!ο§ν, 5^1Ь Εάΐίίοη, ΙοΗη \¥Пеу & 5опз, 1пс, ΝΥ, 2002

АизиЬе! βί αί ебз., Сиггеш Ргоюсок ίη Мо1еси1аг ΒίοΙοξγ, 1оЬп ХУбеу апб 8опз, Νε\ν Уогк, 1990

АизиЬе! βί αί, (ебз.), СиггеШ РгоСосок ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, боЬп \\'Пеу & 8опз, ΝΥ, 6.3.1-6.3.6., 1989

АизиЬе! βί а!., Сиггеш Ргоюсок ίη Мо1еси1аг Вю1о§у 1оЬп \¥Пеу & 5оп$ 1пс, СЬарСег 15, 1994-1998

ВаЬа е/ αί, Вюскет Вюркуз Вез Соттип 181: 87-94, 1991

Вапкзе/бгА 8/агск/сНе 5Югке, 23: 118-124,1971

Вагкег βίαί, ΡΙαηίΜοΙ. ΒίοΙ,, 2: 235-350, 1983

Ва(су βί αί, 7. 5сг. РооНА§г1с. 74: 503-508,1997

Ваипз§аагб βί αί, Тке ΡΙαηί Аоигпа! 41, 595-605, 2005

ВесЫоМ βί αί, С.В. АсаН. Зс! Рапз, 316: 1194, 1993

Веуап βίαί, ΝυοΙ. АсйЗВез., 11: 369, 1983

ΒϊγοΗ, Αηη Ββν ΡΙαηί Ркузю! ΡΙαηί ΜοΙ ΒίοΙ 48: 297-326,1997

ΒΙεηηοΆ βίαί, Ιηί. Λ. ΒίοΙ. Масгото! 27: 211-218, 2000а

В1еппо\уе/я7, СагЪокуПг. Ро1ут. 41: 163-174, 20006

Воппег е/й/., Еиг. Л. Вюскет., 46: 83, 1974

Воигцие ΡΙαηί Зс! 105: 125-149,1995

ΒοννεΓ βί αί, Μοίββ. ВгееН., 2: 239-249,1996

Воуег апб Рге1зз, СагЬокуНгаю Везеагск 61: 321-334, 1978

Ви1еоп βίαί, АшегпаПопа! Аоигпа1 о/Βίοίοξίοα! Масгото!еси1ез, 23: 85-112, 1998

Сао βί αί ΡΙαηί СеН КероПег, 11: 586-591,1992

Сао βίαί, Агскгуез. о/Вюскеткпу ап<АВюркузюз. 373: 135-146, 2000

СЬатЬег1ат βί αί, Аиз1. Λ. ΡΙαηί Ркузю!., 21: 95—112, 1994

СЬпз1епзеп βίαί., Тгапз§еп. Вез., 5: 213-218.1996

Сота! βί αί, ΡΙαηί А 37: 778-786,2004

Сга1§ βί αί, ΡΙαηί СеП 10: 413-426,1998

Όβ Ргатопб, Вю1ескпо1о%у, 1: 262, 1983 ОеИстап βίαί, ΕΜΒΟΑ, 2: 3315-3320, 1998 ОеПаРеппа β! αί, ΡΙαηί СеП, 1: 53-63, 1989

Ое11арог1а βί αί, ίη Скготозоте ЗюисЮге αηάРипсНоп, рр. 263-282, 1988 Ое1гие βί αί, Аоигпа! о/Вааепо1о£у, 774:3612-3620, 1992 БекаНе βίαί, ΡΙαηί А 43: 398-412,2005

Оепуег βίαί, ΡΙαηίРкузю!о§у 112: 779-785, 1996

Еа§1ез βί αί, Лиз1. А. А§пс. Вез. 52: 1 349-1356, 2001

ЕНгИсЬ, Ргос. Ναίί АсаН. Зс! 1АЗА, 75: 1433, 1978

Ектап апсПа§ег, Апа!Вюскет 214: 138-141, 1993

Епскзоп βί αί, Зсгепсе, 249: 527-533, 1990

Рег§азоп, ЗреШаШу Согпз еНз, СВСРгезз 1пс. рр 55-77, 1994

ПзЬег βί αί, ΡΙαηί Ркузю!102: 1045-1046, 1993

Рготт βί αί, Ргос. Ναίί АсаН. Зег., 1А.З.А, 82: 5824, 1985

Оао βίαί, Р!аШ Ркузю!114: 69-78,1997

Оао βίαί, ΡΙαηί СеН 10: 399-412, 1998

ОагЯпке! βί αί, СеН, 27:143-153, 1983

Оогбоп-Катт, ΡΙαηί СеН, 2: 603-618, 1990

Огеуе, Μοί Αρρί Οβηβί., 1: 499-511,1983

Нагауата, ТгепНз Вю1ескпо!16: 76-82, 1998

НаЛтапп апб Епбгез, Мапиа! о/АпНзепзе Μβίίοάοίο^ν, К1ииег, 1999

Назе1о£Гапб Оег1асЬ, ΝαΗα-β 334: 585-591, 1988

Небтап апб Воуег, ВюскепПса! СепеНсз 20: 483-492, 1982

Непбпх βί а!., А. 1пзес1 Ркузю!, 47: 423-432, 2001

НеткоГГβΐ αί, ΡΙαηί Ркузю! 135: 630-636,2004

НтсЬее βίαί, ВкХеск., 6: 915, 1988

Ноб§зоп, В1о/Тескпо1о2у, 9: 19-21,1991

Ноекета е/о/., Лх/п/ге, 303: 179, 1983

НогзсЬ βί αΙ.,Ββίβηοβ, 227: 1229, 1985

1ки1а βί αί, ΒίοίβοΗ., 8: 241,1990

Латез βί αί, ΡΙαηί СеН 7: 417-429,1995 боЫга£ βί αί, ΡΙαηί Аоигпа118: 163-171, 1999 бозЫ, 7¥ыс/. АскА Вез., 15: 6643, 1987

Каи βί αί, А. Сеп. МюгоЫо!., 129: 2703, 1983

К1ее βί а1.,Аппиа1 Κβνίβχν ο/ΡΙαηί Ркузю1озу, 38: 467,1987

- 53 025360

ΚΙβίη βί ак, кка1иге 327: ΊΟ, 1987

Котк-Козе βί ак, 3ίακ1ι/Αιβ 3!агке 53: 14-20, 2001

Κοίΐίη§ βί αί, ΡΙαηίРкузю1о§у 137 ρρ 242-252,2005

КиЬоеГа/., Ρίαηί ркузю1о§у. 121: 399-409, 1999

Киггек, Еиг. 7. Вюскет., 270: 1628-1644,2003

Ьапдпбде βί ак, Айз!. А§г1с. Кез. 52: 1043-1077, 2001

Ьее, ΡΙαηί Мок Βίο!., 13: 21-30, 1989

Ьепиеих, Сиггеп! Сепопйсз 1: 301-311,2000

Ы βίαί., ΡΙαηί Ркузю1о§у 123: 613-624, 2000

Ы βίαί., ΡΙαηίркуз1о1о§у. 120: 1147-1155, 1999а

Ι,ίίΑ, ТкеогеИса! апААррНеА СепеИсз 98: 1208-1216, 1999Ь βί ак, Рипс! Ιηίβξτ Сепопйсз 3: 76-85, 2003

ЫиеМ/.,7. Ат. Скет. Зое. 118: 1587-1594, 1996

ЬогЬейЬ е( αί, Ναί. ВйХескпок 16: 473 Ή77, 1998

Мааз βί ак, Мо1 ВгееАт§, 3: 15-28, 1997

Магтиг βί ак, 7 Мок ΒίοΙ., 5: 109, 1962

МсРЬегзоп ап(1 МоПег (Еб), ВЮ8 8с1еп(Шс РиЬНзЬегз Ыб, ОхГогб, 2000

МебЬеггу βί ак, ΡΙαηί Се114: 185-192, 1992

МейЬеггу βίαί, ΡΙαηί А. 3: 619-626, 1993

МШаг апб АУа1егЬоизе, Рипс1 Ιηίβ§τ Сепопйсз 5: 129-135,2005

Μίζιιηο βίαί, Аоита! о/Вюскетгзпу 112: 643-651, 1992

Μοιτίδοη апб Ьа1§де1е1, Аоигпа1 о/Сегеа! Заепсе 1: 9-20,1983

Муегз е! ак, ΡΙαηίРкузю1о§у 122: 989-997, 2000

Νάχτ βί ак, ΡΙαηί 5с1122: 153-163, 1997

Иакатига апб УатапоисЫ, ΡΙαηί Ркузю199: 1265-1266, 1992

ИеесНетап апб ХУипзсЬ, 7. Мок В'юк 48:443-453, 1970

Νίεύζ βί ак, ΡΙαηί Се11 ВероПз, 14: 403, 1995

Ονν βί ак, Заепсе, 234: 856,1986

РазяитеШ е! ак, Сигг Ορΐη Οβηβί ΕβνβΙορ 15: 200-205,2005 Реттапе/я/., СепеПЗ: 157-163,1992

Р1аз1егк βί ак, Сиггепк Ορϊηΐοη ίη ОепеИсз апАϋβν., 10: 562-67,2000

Ро1гукиз βίαί, Мок Сеп. Сепек., 199: 183, 1985

РгазЬег ек ак, Вюскет. Вюркуз. Кез. Сотт., 126: 1259,1985

КаЬтап βί ак, Сепоте 40: 465-474, 1997

Ка1 βί ак, ΡΙαηί Ркуз. 142: 305-317,2006

К.еббуе/а/„ Ткеог. Аррк Сепек, 85: 616-624,1993

Кетт§1оп'5 РЬагтасеибса1 Заепсез, 18^л Еб., Маск РиЬИзЫпд, Сотрапу, ЕазЮп, РА, υ.δ.Α., 1990

ЯереШп ет ак, ΡΙαηί Оепе Ке§рр. 97-094, 1997 КлПе ек ак, ЕЕВЗрр. 4872-4876, 2006

КоЫпзоп, Тке Ог&пйс СопзИкиепкз о/ Ш%кег Р1апкз, Согбиз Ргезз, ЫойЬ АтНегз!, иЗА, 1980

8>&\<упюъекак,ЕМВОА, 3: 141-146, 1984

ЗатЬгоок ек αί Мо1еси1аг С1опгп§: А ЬаЬогакогу Мапиа1 (2пб ¢4.), Со1б 5рпп$ НагЪоиг ЬаЬогаЮгу, Со1б Зрппд НагЬоиг, ΝΥ, 1989

ЗатЬгоок, Мо1еси1аг С1опт§: А ЕаЬогагогу Мапиа!, З^г<| Εάίΐίοη, СЗНЬР, СЗН, ΝΥ,

2001

5сЬи1тап апб КаттюлчПа, Зкагск 43: 387-389, 1991 ЗсЬ\уаП е/ ак, ккакиге Вюсескпок 18: 551-554,2000 Зетог, Вюкеск. Сепек Εηξΐη. Кеуз. 15: 79-119,1998 ЗЬагр екак, Аизк А А§пс Кез 52: 1357-1366,2001 ЗЫтато1о ек ак, ккакиге 338: 274-276, 1989 ЗЫрру βίαί, Мок Вюкеск. 12: 117-129,1999 ЗЬПзикахуа ек ак, Сепез Сепек Зузк. 82: 167-170,2007 31абе апб КпаиГ, Тгапз^етс Кез 14:109-115,2005 ЗткЬ βί ак, ккашге 407: 319-320, 2000 Зоокпапап βί ак, Вюкесктциез 17: 1077-1080,1994 31а1кег βί ак, Заепсе, 242: 419, 1988

Зиттейопег ак, АпИзепзе апАккис1е:с асиАЕги% Ее\*е1ортепк 7: 187-195, 1997 Зип ек ак, Тке Νβ\ν Ркую1о§151137: 215-215, 1997 8и1сИЯе, Ргос. ΝαίΙ. АсаА. Зек иЗА, 75: 3737,

Такеба βίαί., СагЬокуАгаке Кезеагск 240: 253-262, 1993а Такеба екак, СагЬокуАгакеКезеагск246: 273-281, 1993Ь ТЫ11е1е/а/., Α. ΒίοΙ. Скет., 263: 12500, 1988 ТЬотрзоп екак, СагЬокуАгаке Кез., 331: 149-161,2001 ТЬогЬ)отзеп βίαί., ΡΙαηίАоигпа! 10: 243-250,1996 Ттдау екак, ΡΙαηί А. 11: 1369-1376,1997 Туа§1 είαϊ., Ргос. ΝαίΙ. АсаА. Зек ША, 93: 5395-5400, 1996 Уат βί ак, ΡΙαηί Се11 КероПег, 12: 84—88, 1993 УазП, Βίο/Тескпок 8: 429-434, 1990

- 54 025360

У'егопезе βί αί, Εηζ. М1сгоЫа1 Теск., 24'. 263-269, 1999 νϊΙςδθ-ΝίεΙδεη βί αί, Вютасгото1си1ез 3: 836-841, 2001 νΐΙςδο-ΝίεΙδβη βίαί, СагЬокуЗг. Рез. 337, рр. 327-333,2001

Уо§е1 βί а!., Регтеп1а1юп апб ВюсНеписа! Еп§теепп§ НапдЬоок: Ргтс1р1ез, Ргосезз Оез:§п, αηά Едшртеп1,^оуе& РиЬНсайопз, РагкКлд§е, Ν.Ι, и5А, 1996 \¥ап апб Ьетаих, ΡΙαηί Ркузю1. 104: 37-48, 1994 ^аЮгНоизе βί αί, Ргос. Ναίί Аса<1. 8с1. 0^Т5А 95: 13959-13964,1998

Ψβΐΐδ, Ме1ко<Аз Епгуто!., 202: 2699-2705, 1991

Уи βίαί, ΡΙαηί Се1113: 1907-1918, 2001 2еетап βί αί, Νβ\ν Рку1о1о§сз1163: 247-261, 2004 2еетап βίαί, ΡΙαηί .к>игпа1 15: 357-365,1998 2ико\У8ку βί αί, Ргос. Ναίί АсаЗ. 5с1 118А, 80: 1101,1983 2иаг ап<1 СЬап(11ег, ΡΙαηία 197: 39-48,1995

ЗЕДОЕЫСЕ ЫЗТ1Ы<3 <110> Согптоп»еа1сН Зс1епЫ£з.с ап<5 1пйиа£г1а1 ЕезеагсЬ Огдап1заМоп

Огахпе ЕезеагсЬ ап<3 ϋβνβ1ορηιβη£ согрогасгоп РАЬ, Деап-РЫПрре Ггапсохз М1сЬе1 МОКЕЬЬ, Ма£С.Ьем КеппесЗу ы, гЬопдух <120> Р1апсе маЛЬ ιηοάΐίίβά 8£агсЬ тейаЬоНзт <13 0> 3Об91137/ЛЕН/ОХТ <150> ли 2007906467 <151> 2007-11-27 <1б0> 25 <170=» РаЬепЫп уегзаоп 3.4 <210> 1 <211> 2273 <212> ΠΝΑ <213> ТгФЫсит аезЬгуит <220>

<221> Ш1зс_1еасиге <222> (324)..(324) <223> п 1а а, с, д, ог ύ <220>

<221> т1зс_£еа£иге <222> (771)..(775) <223> Λ ίε а, С, д, Οι £

<400> 1 дд£даадд££	£са£дд££дд	СдССсаааСс	аасссддСда	аСддСССаСс	аСсСддСССС	60
сс£да£Сбдс	сСсаа£С£д£	дсссдассас	дСсдаддаСа	аассадсада	десасссссс	120
дадддд££а£	СддаддсЬсд	СдССдаасСа	сдссссссдс	ссассддссе	аСсСдаасдс	180
ссдааддасс	£СаСС££££С	ддасассдсс	сссдасссса	сСЪСсаддас	адсадссдаа	240
аддседсаед	аддздсСдаа	СдаСдсздса	ссддадаааа	ссасдсассс	саСсадСссС	300
д££с££дааа	аСсССдссСС	дсспассдас	дасаасдаад	асаСсССаСа	ссдсссааад	360
ддасддааСс	дадссаСдда	еасддссаад	сааааддасд	ассаасдддс	ссСссасдсе	420
ааадсасьсо	ССдасадаас	садасССдсс	СССдсдадса	адддсдааса	аСасСасааС	480
а£да£дсадс	ссСсддсСда	асаСсССддс	СсаССасСса	асдССдадда	асдддсадсс	540
дасаСсСЬса	садаадаадС	аасссдСддс	ддассадсса	ссассссасс	СдсССССсСд	600

- 55 025360

аассдаСССд асссСдССсС садааакдсс дсасассЬСд даадссддса дд+ЬаЪЬадс	660
ссадССдаад ЬаасаддЬЬа СаССдСадСд д+СдаСаадС СдсСССсЬдС Ьсаааасааа	720
асСЬаЬдаСа аассаасааС ссССдСддса аададъдъса адддададда пппппСасса	780
даСддСдЬкд ЪЬддсдЬдаЬ аасассСдаЬ аСдссадаСд ЬСсЬдСсЪса ЬдСдСсадСЬ	840
сдадсаадда аССдсааддС дССдСССдсд асаСдсЬСЬд ассСдаасаС ссСдСсСдаа	900
сЬСсааддас аСдаадддаа ддСдСЛЬСсс ЫзсаааасСа сССсЬдсада СдСсассСас	960
адддаддСаС сддасадСда асСССсааСС СсЬСсада+д сасааддСдд СдаадсааСа	1020
ссаьсьссас саъьадссаа дааааадссс сЬсддааааЬ аьдсаакаьс адсддаадад	1080
СЪсСсЬдакд аааЬддЬкдд адсааадЬсс сдсаасаСад сакасскдаа аддаааадЬа	1140
ссССсаСддд СЬдд+аЪссс аасаСсадСЬ дссаЬассаС ССдддассЬС ЬдадаадаЬа	1200
ССдСссдакд адассааЬаа ддаадСадса саааасаЬас адаЬдссдаа дддсадасСЬ	1260
дсСсаадаад аССССадСдс ЬсСаддадаа аессддаааа ссдСЪсЪЪаа ЬсСаасЬдсЬ	1320
ссаасЬсаас еддссаадда дсСдааддад аадаЪдсСаа дсСссддааь дсссъддсск	1380
ддадасдааа дЬдассассд СЬдддадсаа дсаЬддаСдд сааЬЪааааа ддСЬСдддса	1440
ЬсааааСдда акдааададс акасЬЬСадЬ асасдсаадд Сдаадсксда ЬсакдадСас	1500
сЬССссаСдд сСдССсССдк асаадаааЪЪ дСсаасдсад аскаСдссЬС ЬдСсаЬЪсаС	1560
асЬасдаасс сдСсаСссдд адасьссссс дадаСаСаСд сЬдаадъддс даааддасЬС	1620
ддададасас ССдСдддадс ССаСссСддс сдьдсса+да дсССсдСд+д еаадааадас	1680
дассЬЬдасЪ сЬсссааддЬ асЬдддЬЬас ссЬадсаадс сааЬЬддЬсЬ сЬЬсаЬааад	1740
сддСсааСса ЬсЬкссдсЪс адасЬскааС. ддСдаддаСс СддааддЬСа сдсСддадса	1800
дддседсаЬд аСадСдСссс Сасддаъдсд даадаЪдаад ЫздкасСсда сСасасдасс	1860
дасссксЬса СсаседасСс Сдда+Сссдд адсЬсааСсс СсЬсаадсаЬ ЪдсасдддсС	1920
ддссасдсса ССдаддадсС скаЬдддЬса ссдсаддаСд СЬдадддадС адЬдааддаС	1980
дддаадаСсЬ асдСад+сса дасаадасса садаСдЬааЬ аЬдСа+дЬаЬ аддсадсЬса	2040
адсЬдЬадад СадСаддаСа +д+ддЬссСЬ дсЬддсаЪдЬ аЬадсссЪас СсаСадаЬдс	2100
асаасаааЪс ЬасдСЪдСЬа ЪСЬаЬСЬдса СаСасдсСса дааСаадсЬС СдаСсасаСа	2160
скдЪаЪССсс йададсасса даасаЬдЬаЬ дсасда+сад дааСаЪдасс ССаЬЬааааа	2220
саСсддддда дааедссссд адсааСсСаС аСССасасде дссссСаСаа сдс	2273

<210> 2 <211> 3677 <212> ϋΝΑ <213> ТгхЫсиш аезЫуиш <400> 2

ддаадаадда	аддаасСдса	ддсСдадССд	дасааСддад	ссСсадССда	СсааССаадд	60
аадаааассд	Сдаааддааа	ссССдаааад	ааадСССсса	адсаассдда	даадаадаад	120
СасССсСсад	СадаааддаС	ссадсдсада	аасададаСа	СсасдсаасС	СсССааСааа	180
саСаадссСд	еддССасада	асадсаадСа	ааадсСдсас	ссааасадсс	аасСдССССд	240
даСсСсССса	сааадСссСС	дсаададддд	дасаасСдСд	асдСсссаад	саддаадсСС	300
сссаадаСсд	дСдаСдадда	даСасСддса	ассдссасаа	асдссссадд	Саааассада	360
дсссасссдд	саасааассд	Сасддадсса	сССаССсССс	асСдддсасс	ддсааааааС	420
сссддадааС	дддаддсасс	сссссссадс	аСадСдссСС	сСддсСсаас	адССсСсдас	480
ааддсаСдСд	ааасССсаСС	сддСдадСсС	дааССддаСд	дСССдсааСа	ссаддЫздЬЪ	540
дадаСададс	ССдасдасдд	садасасаад	дддаСдсссС	ССдССсСссд	дсдЪддСдаа	600
асаСддаСаа	адаасаасда	сСсСдасССс	СаСССддаСС	Ссаасассаа	адССассаад	660
аааСсааадд	аСасдддСда	СдссддСааа	ддсассдсаа	аддасссссс	ддааадааСа	720
дсадаСсСдд	аддаадасдс	ссадсдаСсС	СССаСдсаса	дасссаасас	ЬдсддсддаЬ	780
сСадССдасс	аадссадада	СдсСддасСа	ссдддсассд	ССддасСССС	сдсссддасс	840
адасСсаСдС	сСассаддса	ассааСаСдд	аасаадаасС	асаасдсдаа	ассасдЬдад	900
аСаадссаад	сасаадасад	дСССасадаС	дассССдада	аСаСдСасаа	аадЪСассса	960
садСасадад	адассссаад	аасдссассд	СсЪдсСдССд	дСсдСддадд	СдааддЬдаЬ	1020
дССддСсадс	дСаСссдСда	СдадаСаССа	дсааъссада	даааСааСда	сСдсаааддС	1080
ддааССаСдд	аадааСддса	ссадааасСд	сасаасааСа	саадсссада	едасдсадсс	1140
аСаСдссадд	сдаСаассда	ССаСаСсаад	адсдаСССсд	аСаСсаасдС	ССасЬдддас	1200
ассССдааса	ааааСддсаС	аассааадаа	сдасСдССда	дсСаСдаСсд	СдсааЬЪсаС	1260
Ссадаассаа	ааССсаддад	Сдассадааа	даддддссас	сседсдассс	дддсаасСаЬ	1320
аСдадаадсс	СдааддсСдС	дсасссСддС	дссдаСсССд	адСсСдсСаС	ЬдсдасаСдЬ	1380
аСдддаСаса	ааСсададдд	СдааддСССс	аСддССддСд	сссааассаа	сссддСдааЬ	1440
ддСССаСсас	сСддСССССс	СдаСССдсСС	сааСССдСдс	ССдассаСдС	сдаддаСааа	1500
Ссадсададс	сасССсССда	ддддССаССд	даддсссдСд	ССдаасСасд	сссС+ЬдсЪс	1560

- 56 025360

асСддсСсаС	сСдаасдсСС	дааддаСсСС	аСсСССССдд	асаССдсСсС	СдаССсСасС	1620
сссаддасад	садССдааад	дСсдСаСдад	дадсСдааСд	аСдсадсасс	ддадааааСС	1680
асдСасССса	сеадссссдс	СсССдааааС	сССдссССдС	ссасСдасда	саасдаадас	1740
аСсССаСаСС	дсССаааддд	аСддааСсда	дссаСддаса	СддССаадса	аааддаСдас	1800
сааСдддсСс	СсСасдсСаа	адсаСССсСС	дасадаасса	дасССдсссС	Сдсдадсаад	1860
ддсдаасааС	асСасааСаС	дасдсадссс	СсддсСдааС	аСсССддсСс	аССасСсаас	1920
дССдаддааС	дддсСдССда	саСсССсаса	даадаадСаа	ССсдСддСдд	аСсадсСдсс	1980
асСССаСсСд	сСсССсСдаа	ссдаСССдас	ссСдССсСеа	даааСдСсдс	асассССдда	2040
адССддсадд	ССаССадссс	адССдаадСа	асаддССаСа	ССдСадСддС	СдаСаадССд	2100
ССССсСдССс	аааасаааас	ССаСдаЪааа	ссаасааСсс	ССдСддсааа	дадСдСсаад	2160
ддададдаад	аааСассада	СддСдССдСС	ддедсдасаа	сасссдасас	дссадаСдСС	2220
сСдСсСсаСд	СдСсадССсд	адсааддаас	СдсааддСдС	СдСССдсдас	аСдсСССдас	2280
ссдааСассс	СдСсСдааСС	СсааддасаС	даадддаадд	СдССССссСС	саааасСасС	2340
СсСдсадаСд	СсассСасад	ддаддСаСсд	дасадСдаас	ССаСдсадСс	аадсссссса	2400
даСдсасаад	дСддСдаадс	аасасеассс	ссассассад	Ссаадааааа	дССссССдда	2460
аааСаСдсаа	СаСсадсдда	ададссоссс	дасдааасдд	ССддадсааа	дссссдсаас	2520
аСадсасасс	сдаааддааа	адСассССса	СдддССддСа	СсссаасаСс	адССдсдаСа	2580
ссаСССддда	ссСССдадаа	даСаССдСсС	даСдадасса	асааддаадС	адсасаааас	2640
аСасадаСдс	сдаадддсад	асССдсСсаа	даадаССССа	дСдсСсСадд	адааасссдд	2700
аааасСдССс	ССааСсСаас	СдсСссаасС	саассддССа	аддадсСдаа	ддадаадаСд	2760
ссаадсСссд	дааСдсссСд	дссСддадаС	дааадСдасс	ассдССддда	дсаадсаСдд	2820
аСддсааССа	ааааддсссд	ддсаСсаааа	СддааСдааа	дадсаСассС	СадСасасдс	2880
ааддсдаадс	СсдаСсаСда	дСассСССсс	асддссдссс	ССдСасаада	ааССдСсаас	2940
дсадасСаСд	ссСССдСсаС	СсаСасСасд	аасссдСсаС	сСддадаССс	ССсСдадаСа	3000
СаСдсСдаад	СддСдааадд	асССддадад	асасССдСдд	дадсССаСсс	СддссдСдсс	3060
аСдадсССсд	СдСдСаадаа	адаСдассСС	дасСсСссса	аддСасСддд	сСасссСадс	3120
аадссааССд	дСсСсССсаС	ааадсддсса	аСсаСсССсс	дсСсадасСс	СааСддСдад	3180
даСсСддаад	дССасдсСдд	адсадддссд	СаСдаСадСд	СсссСаСдда	СдСддаадаС	3240
даадССдСас	СсдасСасас	дассдасссС	сСсаСсасСд	асСсСддаСС	ссддаасСса	3300
аСссСсСсаа	дсассдсасд	ддсСддссас	дссаСсдадд	адсСсСаСдд	дСсассасад	3360
даСдССдадд	дадСадСдаа	ддаСдддаад	аСсСасдСад	сссадасаСд	ассасадаСд	3420
саасасдсас	дсаСасдсдд	сСсаадССдС	ададСадСад	даСаСдСддС	ссССдсСддс	3480
аСдСаСадСС	сСасСсаСад	аСдсасааса	сасссасдсс	дссасссасс	сдсасасасд	3540
сСсадааСаа	дсСССдаСса	саСасСдСаС	сссссададс	ассадаасас	дсасдсасда	3600
ссаддаасас	дассССаССа	аааасаСсдд	дддадааедс	СССдадсааС	сСаСаСССас	3660
асдсдссссС	аСааСдС					3677

<210> 3 <211> 1009 <212> ΡΕΤ <213> Тг1С1сит аезСхуит

<400> 3

МеС 1

С1и

Рго

Ьеи

Ие 5

Ьеи

ΗΪ3

Тгр

А1а

Ьеи 10

А1а

Ьуз

Азп

Рго

С1у 15

<31и

Тгр

С1и

А1а

Рго 20

Рго

Зег

Зег

Не

Ча1 25

Рго

Зег

<31у

Зег

ТЬг 30

Ча1

Ьеи

АЗр

Ьув

А1а 35

Суз

С1и

ТЬг

Зег

РЬе 40

С1у

<31и

Зег

С1и

Ьеи 45

Азр

С1у

Ьеи

С1п

Туг 50

С1п

Ча1

Ча!

<31и

Не 55

С1и

Ьеи

Азр

Азр

<31у 60

Агд

Туг

Ьуз

<31у

МеС 65

Рго

РЬе

Ча1

Ьеи

Агд 70

Агд

<31у

С1и

ТЬг

Тгр 75

Не

Ьуз

Азп

Азп

Азр 80

Зег

Азр

РЬе

Туг

Ьеи 85

Азр

РЬе

Азп

ТЬг

Ьуз 90

Ча1

ТЬг

Ьуз

Ьуз

Зег 95

Ьуз

Азр

ТЬг

С1у

Азр 100

А1а

С1у

Ьуз

<31у

ТЬг 105

А1а

Ьуз

Азр

РЬе

Ьеи 110

<31и

Агд

Не

А1а

Азр 115

Ьеи

<31и

С1и

Азр

А1а 120

<31п

Агд

Зег

РЬе

МеС 125

Ηί3

Агд

РЬе

Азп

Не

А1а

А! а

Азр

Ьеи

Ча!

Азр

С1п

А1а

Агд

Азр

А1а

С1у

Ьеи

Ьеи

<31у Не Уа1 О1у Ьеи РЬе Уа1 Тгр Не Агд РЬе Мес Зег ТЬг Агд <31п 145 150 155 160

Ьеи Не Тгр Азп Ьуз Азп Туг Азп Уа1 Ьуз Рго Агд С1и 11е Зег О1п 165 170 175

А1а С1п Азр Агд РЬе ТЬг Аер Аер Ьеи С1и Азп МеС Туг Ьуз Зег Туг 180 185 190

Рго <31п Туг Агд <31и Не Ьеи Агд МеЪ Ьеи Ьеи Зег А1а \7а1 С1у Агд 195 200 205

01у С1у С1и С1у Азр Уа1 С1у С1п Агд Не Агд Азр С1и Не Ьеи Уа1 210 215 220

Не С1п Агд Азп Азп Азр Суз Ьуз С1у С1у Не Ме! О1и <31и Тгр Ηίβ 225 230 235 240 <31п Ьуз Ьеи Ηίβ Азп Азп ТЬг Зег Рго Азр Азр Х7а1 Уа1 Не Суз <31п 245 250 255

А1а Не Не Азр Туг Не Ьуз Зег Азр РЬе Азр Не Азп νβΐ Туг Тгр 260 265 270

Азр ТЬг Ьеи Азп Ьуз Азп О1у Не ТЬг Ьуз С1и Агд Ьеи Ьеи Зег Туг 275 280 285

Азр Агд А1а Не Ηίβ Зег <31и Рго Ьуз РЬе Агд Зег Азр С1п Ьуз <31и 290 295 300

С1у Ьеи Ьеи Агд Аэр Ьеи С1у Азп Туг МеС Агд Зег Ьеи Ьуз А1а Уа1 305 310 315 320

Ηίβ Зег <31у А1а Азр Ьеи 61и Зег А1а Не А1а ТЬг Суз Ме! С1у Туг 325 330 335

Ьуз Зег С1и <31у С1и б1у РЬе Ме! Уа1 С1у Уа1 <31п Не Азп Рго Х7а1 340 345 350

Азп С1у Ьеи Зег Зег <31у РЬе Рго Азр Ьеи Ьеи С1п РЬе νβΐ Ьеи Азр 355 360 365

<400> 4

сддсасдадд	дссаадаада	ЬСЪСадсдсС	сЬаддадааа	Ьдсддаааас	СдСасССааЬ	60
сЪаасЬдсЪс	саасссааск.	ддЬсааддад	сСдааддада	адаЬдсСаад	сСсСддааСд	120
сссЬддссСд	дддаЬдааад	Ьдассассдс	Сдддадсаад	саСддаСддс	ааССааааад	180
дСЬСдддсак	сааааЬддаа	Ьдааададса	ЬаЬЬЬЬадса	сасдсааддС	даадсксдас	240
сакдассасс	ЬСЬссаСддс	СдССсЬЬдСа	саадаааССд	Ссаасдсада	сСаЬдссЬЫ:	300
дССаССсаСа	ссасааассс	дЬсаЪсСдда	даЬЬсСЪссд	адаЬаЬаЬдс	ЬдаадЬддСа	360
аааддасССд	дададасасС	ЬдЬдддадсЬ	ЬаЬссСддсс	дЬдссаСдад	сСЬсдЬдкдЪ	420
аадаааааЬд	дссСЪдасЬс	ЬсссаадасС	сЬааЪддЬда	ддаЕсЬддаа	ддЬЬаЬдскд	480
дадсадддсС.	дСаСдаЬадС	дксссЬаЬдд	аЬдСддаада	сдаддСЬдЬа	сСЬдасЬаса	540
ссасЬдассс	ЬсЬсаЕсасЪ	дасксддда!:	сссддаасЕс	ааС-ссЬсСса	адсаСЛдсас	600
дддсЬддсса	сдссаЬсдад	дадсСсСаСд	ддЬсассдса	ддасдЪкдад	ддадЬадСда	660

адд 663 <210> 5 <211> 4302

<212> ΏΝΑ <213> ТгаЛхсит аезСгутлт
<400> 5 аСддсдсСаа	ддааддадад	аСаСссаСсс	ддаСсссдда	адссдааСсс	асссасссас	60
ссаСсссаЬа	сСдсссССас	даСсдадсСд	СССдаСаССс	дСдсадаСда	дсддаССсСс	120
сдсддсадсС.	дссдсддссд	адсдсссдСс	ддааддССса	ссссддаСдс	саасСссдад	180
сССааддСда	саССдаассс	адсассдсад	ддССсддСдд	СддадаСсаа	СсСададдса	240
асСаасасса	дсддсСсссС	даСасСдсаС	Сддддсдссс	ССсдсссдда	Сададдадаа	300
СддсСссСас	саЪсссддаа	ассадаСддс	асдасадСдС	асаадаасад	ддсссССадд	360
асдссССССа	СааадСсадд	сдаСаасСсс	асдсСдаааа	ССдадаСада	СдаСсссдса	420
дСдсаадсса	ССдадССссС	саСаСССдаС	даддсасдда	аСааССддСс	адссессссс	480
дддССассса	СссСасссСд	СССсССддаа	СдсадаадаС	ассааасаас	аасасСсСас	540
сссддасадд	аддадСаСда	адсадсасда	асСдадССда	СададдааСС	ааасаадддс	600
дСССсСЪСдд	адаадсСасд	адсдааасЬд	асааадасас	сСдаддсаас	сдасадсаас	660
дсСссСдсаС	сСдааадсас	сдСдасСасС	ааадСсссад	аддаасССдс	асаадСссад	720
дсссасасаа	ддсдддадаа	адсаддсаад	ссаааССасд	ссссададаа	дсааССддСс	780
дадсссдадд	аадсааддаа	ддаасСдсад	СсСдадссдд	аСааддддас	сСсадССдад	840
садсъдадда	асаааасССС	дааадддаас	аССдадасаа	аадСССссаа	дсадсСдаад	900
дасааааааС	асССССсСдС	ддааадааСС	садсддаааа	аасдадаСаС	СдСдсаасСа	960
сССаааааас	асаадсссас	СдССаСддаа	дсдсаадСад	адасСссСаа	асаасссасС	1020
дССсСддаСс	СсССсасааа	дСсаССасад	дадсаддаСа	ассдсдаддс	СсСаадсада	1080
аадсССССса	адССсддСда	сааддадаСа	сСддааааас	сааадССсас	ССддсаасаа	1140
асСаСаСдда	дссасССаСа	ссссассддд	сдссдссааа	ададааСдда	дадСддсада	1200
саасдсдддс	сСдСассдаС	ддддСдсССС	дСаасСдСда	аддсассСсс	сСсаадсаСа	1260
сСдссаСсСд	дССсаСсаСС	дссадасаад	дсаСдСдааа	сССсаССсад	СдааСаСдаа	1320
ССдааСддСс	СдсаССдСса	ддаСасСддС	даСдсСддСа	ааддсасСдс	сааддссссд	1380
сССдааадаа	СадсадаСсС	ададдаадаС	дсссаасдаС	ессссасдса	садаССсааС	1440
аССдсадсад	аСсСадССда	ссаадсаада	даСааСддаС	СаССдддСаС	СаССддааСС	1500
сссдсссдда	ССаддССсаС	ддсСасаадд	саасСааСаС	ддаасаадаа	сСасааСдСд	1560
аадссасдСд	адаСаадсаа	адсасаадаС	аддсссасад	аСдаСсССда	дааСаСдСас	1620
адаасССасс	сасааСаСса	ддадаЪсССа	адааСдаСаа	СдСсСдсСдС	СддСсдддда	1680
ддСдааддСд	аСдССддСса	асдсаССсдС	даСдадаСаС	СадСааСсса	дадаааСааС	1740
дасСдсааад	дСддааСдаС	ддаддадСдд	сассадааас	Сдсасаасаа	Сасаадссса	1800
дасдасдсад	СдаСсСдсса	ддсссСасСС	даСЬаСаСса	ададСдаССС	СдаСаССддС	1860
дССЪасСддд	асассссдаа	аааадаСддС	аСаасаааад	адсдсесасс	дадсСаФдаС	1920
сдассдаССс	аССсададсс	аааСССсадд	адСдаасада	аадасддссс	аскссдЪдас	1980
ССдддсааСС	асасдадаад	ссСсаадаСд	дадддСассс	СдасасааСс	асСдсдааСд	2040
дсадЬдсаСС	сСддСдсСда	СсССдааСсС	дсСаСадсаа	сССдсаСддд	акасаааЬса	2100
дадддСдаад	дСССсаСддС	СддСдССсад	аССааСссад	сдаадддссс	дссаСсЬдда	2160
СССссСаааС	СдсССдааСС	СдСасССдас	саСдССдадд	аСаааСсадс	адаассасСЬ	2220
сССдаддддС	СаССддаддс	СсдадсСдаа	сСасасссСС	СдсСссССдд	сЬскссСдаа	2280
сдсаСдаадд	аСсССаСсСС	СССадасаСС	дсСсССдаСС	сСасСССсад	дасадсадСЬ	2340
дааадаСсаС	аСдаддадсС	сааСааСдСа	даассадада	аааССаСдСа	сССсаСсадС	2400
сССдСссССд	ааааСссСдс	СССаСссасс	дасдасааСд	аадаСаСссС	аСаССдсССа	2460

- 60 025360

аадддасдда аСсаадссСС ддаааЪддск ааасадаааа асаассааСд ддсСсЬсСаС	2520
дсСааадсаС ССседдасад аассадасСС дсссССдсаа дсаадддада асааСасСаЬ	2580
аасссдасдс адсссСсадс СдааЬаЬсЬЬ ддсесдССас ссаасаьсда ссаасдддса	2640
дСЬааСассС ССасадаада ааЪЬаЬСсдЬ ддСддаСсад сЬдсСасссС дЬсСдсксЬЪ	2700
сСдааЪсдда СйдаЪссЬдЪ СсТСаддааС дЬСдсасадс ЬСддаадЬЬд дсаддЫзаЬа	2760
адсссадЬЬд аадЬаСсадд ССасаЬЬдЬа дЬддСЬдаЬд аасЬдсСХдс СдЬСсаааас	2820
ааасссЕаСд аСааассаас СаСссЪЪдЪд дсааададСд Ссаадддада ддаадаааСа	2880
ссадаСддад СЪдЬТддСдС СаСЬасассЬ дакаСдссад аЪдЫзсЬсЬс ссаСдЪакса	2940
дсссдадсаа ддааЬЪдсаа ддСМзСаТСС дсаасаСдсС сЬдаСссСаа сассССдЬсС	3000
даасьссаад дасаСдаЬдд дааадкдкСТ сссС£сааас сСасСЬсЬдс адасатсасс	3060
Ьасадддада ЪЪссададад сдаасСдсаа СсаддЫзсСс ЬаааСдсада адсСддссад	3120
дсадСдссаЪ сСдСдСсаСЬ адЬсаадаад аадЬЬЬскЬд даааакаЬдс ааЪаксадса	3180
даадааЬЬсЬ сйдаддаааь дддсдСсссС асаСсадССд сдаЪЬссаЪС сдддассССС	3240
дадааддССС СдСсСдасда ааСсааСаад даадСсдсдс ааассаСаса аакдсЪдаад	3300
ддаааасССд сСсаадакда СССЕадСдсЬ скаддсдааа Ъасддаааас СдЬСсЪсааЬ	3360
ЫзаасЬдсЪс сЬасСсаасС даСсааддаа сСдааддада адаСдсСадд сСсЬддааЬд	3420
сссСддссЬд дадаьдаадд Ьдассаасдс Ьдддадсаад саеддаъддс ааьъааааад	3480
дСССдддсдС саааакддаа Сдааададса ТаССЫзадса сСсдСааддъ даадсссдас	3540
са(здасЪасс ЫзЪссаЬддс СдСасЫздСа саадаааЕБд ЬсааЪдсада сСаЬдссЬТС	3600
дЪсаСЬсаСа сСасСаассс аСсаСсддда даЬЬсдЬсЬд адаСаСаСдс ЬдаадЪддЬд	3660
ааадддсСЬд дадааасасЬ (здсаддадсс ТаСссСддСс дсдссакдад сЪЬЪдкаЬдС	3720

аадааааасд ассЫздасСс СсссааддСа сСдддСССсс саадсаадсс аайзддЬсСс 3780

СйсаСааада да(зсааЬсаь ссьссдссса дасьссаасд дсдаддасьс адаадддкаЬ 3840 дсСддадсад дасЬдйаЪда ЬадЪЬсдсЬс аадааЪСЬаЬ ССддсаЫзас аасСаадсЪд 3900 асСдсСЬдЫ: СсадСдСссс ЪаСддаСдад даадаСдаад СсаСасйсда сСасассасс 3960 дасссссСса ССасадайса дддаСЬссаа аааСсСаСсс СсСсдадсаС СдсасдддсС. 4020 ддссайдсса седаддадсС ссасдддссс ссасаддаСд ссдадддЬдс адЬдааддаа 4080 дддаадсСаС асдЪадйаса дасаадасса садаСдддаа аадссаддда ддассасйас 4140 саадСдсСдд дадсдасддй СааССсаасд ссЬсаддада Ссааддаддс ссасаддаад 4200 сессадааас дасассаъай ссСдайаЫзд сСддсСасаа дддьсаьдса СдасЬасасс 4260 сСасЬдсРда аСдаддсаЬа сааддсассд асдаддаасс аа 4302 <210> б <211> 36 <212> ΕΝΑ <213> ТгхЬхсит аезЫуцт <400> 6 ааааддаТсс ддСассдссС ъссддсссаа садссс 36 <210> 7 <211> 36 <212> ΕΝΑ <213> Тг1С1сит аезЫтеит <400> 7 аааадааьсс асСадЬаЬса ссССсассСс сасдас 36 <210> 8 <211> 413 <212> ΕΝΑ <213> Огуга зрр.

<400> 8

Ьдсъддадса	дсадСаЬаЬд	а(заддССада	дааадСссдс	саЬааЫзЬЫз	дСадЫзСдск	60
саадааСЪСа	сссддсаТЬа	саасСаадсС	дасСдсССдС	ЬСсадЬдЬсс	сСаСддаСда	120
ддаадаЪдаа	дЬсдСасксд	ассасассас	адасссссЬс	аССасадаЪс	адддасссаа	180
аааСсааСсс	СсСсдадсаЬ	ЬдсасдддсС	ддЬсаЕдсса	РСдаддакЬС	сЬаСдддСса	240
ссасадддса	саддаСдЫзд	адддСдсадС	дааддааддд	аадсСаЬаад	СадСасадас	300
аадассасаа	а1зд(заа1зсСа	СасдсаЬаЫз	ЕЬасадссаа	дйсааксадд	аааСдСЪдЪа	360
дадСаадака	ЪасдддссдС	дддасаЬдЬа	ЪаасасдССа	СдсЪссССЛЪ	ссе	413

<210> 9 <211> 462 <212> ΏΝΑ <213> Огуга ерр.

<220>

<221> ТО13С_£еаСиге <222> (408)..(408) <223> η Ϊ3 а, с, д, ог ϊ <400> 9

- 61 025360

ьссасаасСа	саассссхеа	даассЬддас	саааадсЬдд	аседеесдад	ддадсМсСд	60
аССсСдадад	аадсСдсадс	адсСадаадс	Ьсссссааас	аддссссеад	дЪадсЪддбЪ	120
асаадСссда	СсасасЬдСС	сеаддеесдс	сСдССдеедС	аСаСсадаСа	дсСаааСдса	180
ьадсЬдЬдад	сеададСЬдЬ	даеааасйдд	аааЬаддСса	дддаасдСоЬ	СЬССССдсса	240
аадбаСдддС	ааадаСааас	ССддСдадсС	садсСдддда	сааааЪсаСс	адаСССЪдСа	300
СЪсСсссадс	ададсаааСа	дддаСЪСдсс	СдСдадСдса	сдссСдасСЬ	дсссдсьдде	360
сСаедаааед	ддссдСдаад	СдбдсССсСа	СдддссССдС	сасСасСпас	саддсддСаС	420
Сдсададсад	аЬЬЬсЪЬддс	ссаЬЬЪЬдЬс	сЬЬЬЬЬсЬсЬ	сЬ		462

<210> 10 <211> 490 <212 <213 ϋΝΑ

Огуга зрр.

<400> 10 сссдддаада сддсдсдьдс садасссдсд седаададдд аасдсасдсс сддссададс 60

ЬбссассССд есддсдасда сссддсдсес ддсс+сСддд аСссдЬсдаа ддсадЬдссС. 120

ЬСддаССддЬ садааддаса сдасСддасЬ дСддадааад СдадссСЬдс аСсдСдсдса 180 есдсесдасд сасесссссе есдаддеаае саесассссе есссеессде асаддасссд 240 ссадссааса адеедассда дсасаадсьс дедсбдсаад асеедесддд саадсьдсас. 300

СддсадааСд дСсдСааСад аадсдСасад асаддСдааа сСдсааасаС СсСадСсдСа 360

СаЬдаадаСС ддддсаасдс аааСадЬсад асадбадаад аддадддСаа адСдСссаСЬ 420 дддасддадд адддсааасс дсссдссддд асддаддадд седеадССсс адаСдаСаде 480 дааадсадад 490 <210> 11 <211> 492 <212> ΟΝΑ <213> ЗогдЬит Ысо1ог <220>

<221> т13С_£еаЬиге <222> (484)..(484) <223> η ίδ а, с, д, ог £ <400> 11 дсасдаддсс садссдаадс ассаддесае дсддссдбдд ссдабдадбс асСЬдсСдСс 60 садаасаааС сССабдаЪаа ассаассаСс сССдСддсаа ададсдссаа дддададдаа 120 даааСассад аЬддадСадС СддСдСааСС асасс£даСа сдссадасде СсСдСсссаС 180 дсдссадссс дадсааддаа садсааддСа сСдСССдсаа ссСдССССда ссаСассасС 240 ссдсссдаас ССдааддаба сдабсадааа сСдсСССссС СсаадссСас СЪсСдсадаС 300 аЪаассСаСа дддадаСсас адададсдад сСЬсадсааС саадССсСсс аааСдсадаа 360 дССддссаСд садсассасс СаЬССсаССд дссаадаада ааСССсССдд ааааСаСдса 420 аСаСсадсСд аадааССсас сдаддаааЬд дССддддсса адбсСсддаа абадсаЬасс 480

Ссападдааа ад 492 <210> 12 <211> 704 <212> ΏΝΑ <213> ЗогдЬит Ысо1ог <400> 12

аадаасеаЪа	аЪдСдаадсс	асдСдадаСа	адсааадсас	аддаСаддСЬ	СасадаСдаС	60
сЪСдадааСа	СдСасадаас	ССаСссСсад	Сасададада	сассаадаас	даСааСддсС	120
дсЬдЬСддбс	дСддаддСда	аддсдасдъс	ддСсаасдса	сссдсдасда	даСаССадСа	180
аСасададаа	аеаасдасбд	саааддедда	аСдаСддаад	ааСддсасса	даааССдсас	240
аасааСасаа	дсссадаЬда	СдСадСдаСа	ЪдссаддсаС	СааССдаССа	СаСааааааС	300
СССдаСаСаа	дсдъЬСасСд	ддасассЪЬд	аасаааааСд	дсаСаассаа	ададсдСсСс	360
ссдадссасд	аЬсдсдсСаС	СсаССсадаа	ссаааСССса	даадСдааса	дааддадддС	420
ССасСссдСд	ассСдддааа	ССасаСдада	адссСааадд	сСдСдсаССс	СддСдсСдаС	480
сССдааСсСд	сЬаСадсаас	ССдСабддда	СасаааСсад	адддсдаадд	СССсаСддсЬ	540
ддсдССсада	СсааЬссадС	даадддЬЬЬд	ссаСсСддаС	сСссСдадСС	дсССдааССС	600
дСдсССдасс	аЬдССдадда	сааассадса	даассасССс	ССдаддддсе	аССддаадсС	660
сдадсьдасс	СдсдсссССС	дсССсЪСдаС	СсдссСдаас	дсас		704

<210> 13 <211> 563 <212> ϋΝΑ <213> ЗогдЬит Ысо1ог дадаадссСа ааддссдЬдс аССсСддСдс СдаЬсССдаа СсСдсСаСад саасССдСаС 60 дддасасааа СсададддЬд ааддСССсаС ддс+ддсдСС садаСсааСс садСдааддд 120

- 62 025360

СССдссаСсЬ	ддаСССссЬд	адСЬдсССда	аСЬСдЬдсЬЬ	дассаСдЬСд	аддаСаааЬс	180
адсадаасса	сЬСсЬСдадд	ддсЬаСЬдда	адсЬсдадЪС	даЬсЬдсдсс	сСССдсЬСсС	240
СдаЬЬсассС	даасдсаСда	аадаксЬСаС	аЫЛЬСддас	аЬЬдсЬсЬСд	аСЬсЬассСЬ	300
саддасадса	аъьдаааддс	саСакдадда	дсСсааСдаЬ	дсадссссад	адааааъааь	360
дСасС-СсаЬс	адьсььдьсс	ссдааааьси	СдсдССССса	аЪСдасдаса	аСдаадасаЪ	420
ссЪдбаЬЬдс	ССааадддаЬ	ддаассаадс	сЬСддаааСд	дсЬаадсааа	аадасдасса	480
аьдддсьссс	СасдсСааад	саЬССсЬСда	садааЬсада	сСЬдсссССд	сдадсааддд	54 0
адаасадЬас	саЬааЬаЪда	Ьдс				563

<210> 14 <211> 705 <212> ϋΝΑ <213> ЗогдЬит Ь1со1ог <400> 14

дЬСсесдСдс	аадаадССдС	дааСдсадаС	СаСдсЬСЬСд	Ьсаессасас	Сасааассса	60
СсдЬсЬддад	аЬЬсЬСсЬда	даСаЪаЪдсЬ	даадЬсдЬда	аадддсСсдд	ададасСсСс	120
дЪдддадссС	аСссСддСсд	СдсЬасдадс	СССдССЪдса	ааааадаСда	ссССдасСсС	180
сссаадССас	ЫзддСЬассс	дадсаадсса	аСЬддСсСсС	ссабааддсд	аСсдаЬсаСс	240
СССсдЪЪсЬд	асЬссаасдд	сдаддаЬсЬд	дааддСЬасд	ссддадсадд	аЫхаСаСдаС	300
адОдСассда	ьддаьдадда	ддаСдаадСс	дьасььдаье	асасаасСда	сссъсьсаьа	360
дСадаСсдЬд	даСЪссдааа	СЬсааСасЬс	ЬсаадсаСсд	сасдддсЬдд	ссаЬдссаЬС	420
даададсСаС	абддЬСсСсс	Ссаддасдьс	дадддсдсад	СдааддаСдд	аааааСсСаС	480
дЬадСссада	саадассаса	дакдСадсаЬ	дСаСдЪаЬЬа	дсЬадсесаа	СаадсасЬдС	540
СдСасдсЬЬд	СаЬддСЬддд	асаЬаЬдддЬ	дЪСаЬддсаЬ	дЬаЬадСЬСа	СдссСадаЬд	600
Ьасаасасдс	дСааасСсЬЬ	акаЬаСдСаЬ	аСаСдсЬдаа	асаадсаСЬд	дСссСдсааС	660
ььсасьдьда	ссадСсССЪд	ааааЬдааса	СдссдасССа	СЬддс		705

<210>

<211>

<212>

<213>

ΟΝΑ

Огуга зрр.

<400> 15 аСЬдЬСаддЬ ЬдсаадСЬад ЬЬ <210>

<211>

<212>

<213>

ΟΝΑ

Огуга зрр.

<400> 16 сССсссЪЬсс ЪЕсасЪдсас <210>

<211>

<212>

<213>

ΏΝΑ

Огуга зрр.

<400> 17 дсааддсЬса сЬЬСсСссас <210>

<211>

<212>

<213?

ΏΝΑ

Огуга зрр.

<400> 18

СссаСсссаа СддасасЬСЬ <210>

<211>

<212>

<213>

ША

Огуга зрр.

<400> 19 сасдасаСдд аадссд <210> 20 <211> 15 <212> ША <213> ТггЫсит зрр.

<400> 20 дааасасаЬа дСссд <210>

<211>

<212>

<213>

ША

ТгхЫсит зрр.

<400> 21

ССдсддСдсс ССЬасс <210> 22 <211> 19 <212> ΟΝΑ

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Генетически модифицированное растение, которое имеет увеличенный потенциал продуктивности, содержащее в своем геноме гетерологичный полинуклеотид, который содержит последовательность контроля транскрипции, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует дуплексную РНК, которая снижает количество эндогенной α-глюкан-вода-дикиназы (СЖГО) в растении, так что указанное растение имеет пониженный уровень Ο\\Ί ) в семени по сравнению с растением дикого типа, где последовательность контроля транскрипции предпочтительно управляет экспрессией Ο\\Ί) в семени растения, где увеличенным потенциалом продуктивности является увеличенные общая масса семян на растение, количество семян на растение, количество семян на головку или стручок, средняя масса семян, мощность проростков или повышенное содержание крахмала в семенах.
2. 2. Растение по п.1, которое дополнительно имеет увеличенную биомассу по сравнению с растением дикого типа.
3. 3. Растение по п.1 или 2, дополнительно модифицированное для содержания пониженного уровня эндогенной фосфогликан-вода-дикиназы 1АЛГО по сравнению с растением дикого типа.
4. 4. Растение по любому из пп.1-3, где растение является однодольным растением.
5. 5. Растение по п.4, где растение является пшеницей, кукурузой, ячменем, рисом или сорго.
6. 6. Растение по п.5, которое является пшеницей.
7. 7. Растение по п.5, которое дополнительно включает увеличенный уровень эндогенной гликозилазы по сравнению с растением дикого типа.
8. 8. Растение по любому из пп.1-7, где α-глюкан-вода-дикиназа включает аминокислотную последовательность 8Ер Ιϋ ΝΟ: 3 или ее вариант, идентичный по меньшей мере на 90% 8Ер Ιϋ ΝΟ: 3.
9. 9. Часть растения по любому из пп.1-8, содержащая гетерологичный полинуклеотид по п.1, представляющая собой семена, листья, стебли, корни, цветки, плоды, стручки или черенки, полученные из этого растения.
10. 10. Часть растения по п.9, где указанное растение является растением по п.5, которое дополнительно характеризуется наличием повышенного уровня эндогенной гликозилазы относительно соответствующей части растения дикого типа.
11. 11. Часть растения по п.9 или 10, где α-глюкан-вода-дикиназа включает аминокислотную последовательность 8Ер ГО ΝΟ: 3 или ее вариант, идентичный по меньшей мере на 90% последовательности 8Ες ГО ΝΟ: 3.
12. 12. Семена растения по любому из пп.5-7, содержащие крахмал, где уровень глюкозо-6-фосфата в крахмале этих семян составляет менее 10 нг/мг крахмала, а уровень активности амилазы в муке, полученной из этих семян, составляет по меньшей мере 4 единицы/г муки.
13. 13. Продукт, полученный из растения по любому из пп.1-8, части растения по пп.9-11 или семени по п.12, который является обработанным зерном, мукой, мукой из цельного зерна.
14. 14. Применение части растений по пп.9-11, представляющей собой зерно или клубни, для получения обработанного зерна, муки, муки из цельного зерна или очищенного крахмала.
15. 15. Применение продукта по п.13 для получения пищевого продукта.
16. 16. Применение растения по любому из пп.1-8 для получения пищевого продукта или корма для животных.
17. 17. Применение части растения по любому из пп.9-11 для получения пищевого продукта или корма для животных.
18. 18. Применение семени по п.12 для получения пищевого продукта или корма для животных.

    - 64 025360
19. 19. Применение по пп. 16-18 для усиления роста животных.

    Гл юкозо-6-фосфат