BR112015003716B1 - Processo para a produção de recipientes para grãos de trigo, molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo rht-b1, polipeptídeo rht-b1, molécula de ácido nucleico, método para produção de farinha de trigo, farinha integral ou farelo, farinha de trigo, farinha integral ou farelo e método para introdução de um alelo rht-b1 mutante em uma planta de trigo sem o dito alelo - Google Patents

Abstract

GRÃO DE TRIGO, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE RECIPIENTES PARA GRÃOS DE TRIGO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, POLIPEPTÍDEO RHT-B1, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE FARINHA DE TRIGO, FARINHA INTEGRAL, AMIDO, GRÂNULOS DE AMIDO OU FARELO, FARINHA DE TRIGO, FARINHA INTEGRAL, AMIDO, GRÂNULOS DE AMIDO OU FARELO, E, MÉTODO PARA INTRODUÇÃO DE UM ALELO RHT-B1 EM UMA PLANTA DE TRIGO SEM O DITO ALELO A presente invenção provê uma planta de trigo, compreendendo um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht-B1 (Della). Grãos de trigo a partir de uma linha de trigo quase isogênica compreendendo o alelo Rht-B1c de nanismo foram sujeitos à mutagênese ácida de sódio. As plantas que apresentam taxas de alongamento foliar antecipadas ou a altura da planta madura maior do que o precursor de nanismo foram selecionados e o gene Rht-B1 sequenciado. Estes 35 alelos de Rht-B1c mutados identificados. Métodos similares também foram usados para identificar os alelos mutantes do alelo s1n1d nanismo em cevada, onde DELLA é codificada pelo gene s1n1.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção refere-se a mutantes com crescimento excessivo de trigo que compreendem um alelo Rht-B1c alterado. A presente invenção ainda diz respeito ao grão de tais plantas e a produtos derivados do grão.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[02] As plantas respondem pelas pistas de desenvolvimento, fisiológicas e ambientais por ajustes na taxa de crescimento, de partes ou do total. Muitos mecanismos foram descritos envolvendo mudanças no teor da classe de hormônios vegetais giberelinas (GAs) (revisto por Yamaguchi, 2008) ou em componentes de sinalização envolvendo GAs tal como as proteínas GID1 e DELLA (revisto por Sun, 2010). Estes resultam em uma regulação dinâmica de sinalização de GA de modo que o desenvolvimento seja coordenado com a sinalização de outros caminhos reguladores hormonais e com fatores ambientais, tais como luz, temperatura e disponibilidade de água (Hartweck, 2008; Achard and Genschik, 2009; Kuppusamy et al., 2009). A passagem da sinalização pelo relógio circadiano foi proposta para explicar as diferenças diurnas na taxa de crescimento (Arana et al., 2011).

[03] Uma variedade de mutantes de giberelina (GA), espontâneos em origem ou identificados após a mutagênese, foram caracterizados em plantas. Estes incluem fenótipos anões e alongados distintos (‘delgados’) que resultam tipicamente das mudanças no teor de GA ou na sinalização de GA. A identificação dos genes e a análise das proteínas que estes codificam ajudaram no desenvolvimento de um entendimento da regulação do crescimento por GA, particularmente nas espécies modelo arroz e Arabidopsis. Os GAs bioativos ligam-se a uma proteína do receptor de GA (‘GID1’, Ueguchi- Tanaka et al., 2005; Murase et al., 2008; Shimada et al., 2008) e forma um complexo que é então ligado por proteínas DELLA, que foram identificadas como uma sub-família da família do fator de transcrição de GRAS (Griffiths et al., 2006; Willige et al., 2007 ; Hirano et al., 2010) que funciona como inibidores do crescimento. Em um caso, a evidência sugere que a ligação de DELLA aos fatores de transcrição PIF evita a promoção da expressão dos genes requeridos para o crescimento intensificado (de Lucas et al., 2008; Feng et al., 2008).

[04] Os mutantes Della em cevada e arroz são de interesse particular porque estes incluem dois fenótipos marcadamente diferentes: tipos ‘delgados’ altamente alongados e anões ‘insensíveis a GA’. O primeiro traço é recessivo e caracterizado por uma resposta de GA extrema, visto que o último é dominante ou semidominante. As substituições de nucleotídeo simples diferentes no gene Slender1 que codifica DELLA resulta nestes fenótipos radicalmente diferentes (‘delgado alongado’ ou ‘delgado anão’, Ikeda et al., 2001; Chandler et al., 2002; Asano et al., 2009). O primeiro envolve a mutação que abole a capacidade do DELLA reprimir o desenvolvimento e o último ocorre devido ao acúmulo de DELLA por causa da falha em ligar-se ao complexo GA-GID1.

[05] O trigo comum é hexaplóide e o DELLA é codificado por três genes homólogos (Rht-A1, Rht-B1, Rht-D1) nos cromossomos 4AL, 4BS e 4DS dos genomas A, B e D de trigo, respectivamente, onde “L” indica o membro longo do cromossomo e “S” indica o membro curto do cromossomo. Isto tornou o estudo de mutantes mais difícil no trigo e, consequentemente menos é conhecido no trigo em comparação com o arroz e com a cevada. Alelos semianões ‘insensíveis a GA’ foram descritos para os genomas B e D (Peng et al., 1999; Pearce et al., 2011). Um exemplo de um alelo de crescimento impedido extremo é o alelo Rht-B1c no genoma B que resultou da inserção de um elemento de DNA. A maioria desta inserção foi predita ser unida a partir da transcrição do gene, mas 90 nucleotídeos permaneceram e resultaram em uma inserção em estrutura de 30 aminoácidos 30 preditos em DELLA (Pearce et al., 2011; Wu et al., 2011).

[06] Os genes com o crescimento semi-impedido foram proeminentes na geração de trigo e arroz visto que a Green Revolution por causa de seus efeitos benéficos no rendimento da lavoura. A redução modesta na altura (10 a 20 %) de semianões ocorreu devido a uma deficiência na promoção do crescimento por GA endógeno. No arroz, isto resultou da mutação em um gene GA biossintético, de modo que GA menos ativo esteve presente (Monna et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Spielmeyer et al., 2002). Em contraste, em mutações de nanismo de trigo no gene Della que resulta no desenvolvimento que foi relativamente ‘insensível’ a GA (Peng et al., 1999). As mutações de semi-nanismo originais foram espontâneas em origem e sua importância genômica é evidente a partir de seu uso disseminado em variedades correntes 50 anos após sua primeira introdução. Entretanto, os alelos Rht existentes têm algumas desvantagens.

[07] Portanto, permanece uma necessidade quanto a variedades de trigo semianãs melhoradas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[08] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma planta de trigo que compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht-B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5.

[09] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma planta de trigo que compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht-B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de nucleotídeo do alelo Rht-B1 difere da sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID N°: 1 pelo menos pela presença de uma mutação de local de união de íntron.

[010] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece grão de trigo que compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht-B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C- terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5.

[011] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um grão de trigo que compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht- B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C- terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de nucleotídeo do alelo Rht-B1 difere da sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID N°: 1 pelo menos pela presença de uma mutação de local de união de íntron.

[012] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece uma célula de trigo que compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht- B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C- terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5. Em uma forma de realização preferida, a célula de trigo é uma célula de endosperma de trigo. Tais células de endosperma de trigo não são capazes de serem regeneradas em uma planta de trigo.

[013] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece uma célula de trigo que compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht- B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C- terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de nucleotídeo do alelo Rht-B1 difere da sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID N°: 1 pelo menos pela presença de uma mutação de local de união de íntron. Em uma forma de realização preferida, a célula de trigo é uma célula de endosperma de trigo. Tais células de endosperma de trigo não são capazes de serem regeneradas em uma planta de trigo.

[014] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo Rht-B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C- terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5. Tais moléculas de ácido nucléico não são de ocorrência natural. A molécula de ácido nucléico pode ser isolada ou como um transgene em uma planta transgênica.

[015] Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo Rht-B1, o polipeptídeo compreendendo um domínio N-terminal e um domínio C- terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de nucleotídeo do alelo Rht-B1 difere da sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID N°: 1 pelo menos pela presença de uma mutação de local de união de íntron. Tais moléculas de ácido nucléico não são de ocorrência natural. A molécula de ácido nucléico pode ser isolada ou como um transgene em uma planta transgênica.

[016] Em um nono aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo Rht-B1, que compreende um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5.

[017] Em um décimo aspecto, a presente invenção fornece um oligonucleotídeo isolado que compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo do sétimo ou oitavo aspectos da presente invenção, em que os 19 nucleotídeos contíguos incluem pelo menos uma das substituições de nucleotídeo do grupo que consiste de G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A, com referência à SEQ ID N°: 1 ou que é totalmente complementar a esta.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] Figura 1: Exemplo de isolamento de mutantes de trigo com crescimento excessivo pela avaliação em planos. Uma muda mutante caracterizada por taxas de crescimento aumentadas é indicada.

[019] Figura 2: Mutantes com crescimento excessivo de trigo desenvolvido sob condições controladas, em comparação com plantas precursoras (anãs) e do tipo selvagem (altas). Da esquerda para a direita, os derivados de Maringá que carregam Rht-B1c (anã), Rht-B1a (alta) ou três derivados superdesenvolvidos diferentes de Rht-B1c. Os três derivados superdesenvolvidos diferem em sua altura final e as setas apontam para as partes superiores de cada linha. Dois dos derivados são semianões, o terceiro é um alto como o tipo selvagem.

[020] Figura 3: Esquema dos locais de substituições de aminoácido em mutantes com crescimento excessivo de cevada (setas superiores) e trigo (setas inferiores) no domínio GRAS C-terminal dos polipeptídeos DELLA. As regiões de aminoácido conservadas são indicadas.

[021] Figura 4: Mudas de cevada da mesma idade (esquerda para a direita) Himalaya (WT), M463 (grd2b), TR261 (grd2b, sln1m), M240 (sln1m), M640 (Sln1d), TR107 (Sln1d.10), TR60 (Sln1d.8).

[022] Figura 5: Morfologia alterada em algumas linhas mutantes de trigo. Um exemplo de morfologias normais (esquerda) e anormais (direita), com a última caracterizando folhas estreitas, ramos finos, e raiz deficientemente desenvolvida e, em alguns casos, cabeças com menos grãos do que o normal.

[023] Figura 6: Análise de PCR dupla do DNA e (l a r): controles Maringá rht-1, Maringá Rht-B1c; duas linhas superdesenvolvidas com morfologia anormal; duas linhas super-desenvolvidas com morfologia normal; sem controle padrão. Os marcadores de tamanho na esquerda. A faixa superior representa a amplificação de um fragmento do alelo Rht-B1c e a faixa inferior é um produto do gene Rht-D1.

[024] Figura 7: Alinhamento ClustalW de sequências de aminoácido codificadas por Rht-A1a (JF930277), Rht-B1(JF930278) e Rht- D1a(JF930281) no trigo.

[025] Figura 8: Alinhamento de polipeptídeo Rht-B1a de trigo (SEQ ID N°: 5, sequência superior) e proteína GAI de Arabidopsis thaliana (Acessão N° CAA75492, sequência inferior) por Blastp. Os asteriscos indicam aminoácidos que são idênticos (conservados) entre os dois polipeptídeos e símbolos “+” indicam aminoácidos similares, mas não idênticos.

Notas na Listagem de Sequência:

[026] SEQ ID N°: 1 mostra a sequência de nucleotídeo 3892nt do gene Rht-B1c de Maringá/Rht-B1c, começando no ATG da região que codifica a proteína ao TGA no final da região codificadora. A inserção de 2026nt do retrotransposon no gene Rht-B1 para gerar Rht-B1c ocorre imediatamente após o 147nt.

[027] SEQ ID N°: 2 mostra a sequência de nucleotídeo de 1956nt do cDNA que corresponde ao alelo Rht-B1c no trigo Maringá/Rht-B1c. A sequência é quase idêntica à sequência de nucleotídeo fornecida na Acessão Genbank N° JN857971 (Wu et al., 2011), que diferem apenas por 2 nucleotídeos nas posições 813 e 1851. A inserção 90nt no cDNA com relação ao cDNA do alelo Rht-B1a corresponde aos nucleotídeos 148 a 237 da SEQ ID N°: 2.

[028] SEQ ID N°: 3 mostra uma sequência de aminoácido do polipeptídeo de aminoácido 651 codificado pelo alelo Rht-B1c, isto é, codificado pelo gene tendo uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 e o cDNA da SEQ ID N°: 2. a inserção de 30 aminoácidos no polipeptídeo com relação ao polipeptídeo Rht-B1a são aminoácidos de 50 a 79 da SEQ ID N°: 3.

[029] SEQ ID N°: 4 mostra uma sequência de nucleotídeo do cDNA que corresponde ao alelo Rht-B1a (tipo selvagem), começando no códon de início de tradução ATG (Pearce et al., 2011) (Acessão Genbank N° JF930278).

[030] SEQ ID N°: 5 mostra uma sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1a (tipo selvagem) (Acessão Genbank N° JF930278), 621 aminoácidos.

[031] SEQ ID N°: 6 mostra a sequência de nucleotídeo 7057nt do gene Rht1-B1b de Triticum aestivum para (Acessão Genbank N° FN649763) do cultivar Xiaoyan54. Os nucleotídeos 1 a 2136 corresponde ao promotor e 5’UTR de Rht-B1b, os nucleotídeos 2137 a 4002 correspondem à região codificadora de proteína que é interrompida pela mudança de nucleotídeo de C para T na posição 2326 com relação ao tipo selvagem e nucleotídeos 4003 a 7057 corresponde ao 3’UTR de Rht-B1b e a região 3’ do gene.

[032] SEQ ID N°: 7 mostra a sequência de aminoácido 555 do polipeptídeo codificado por Rht-B1b, que é uma proteína Rht-B1 truncada N- terminal, tendo os primeiros 66 aminoácidos truncados com relação ao tipo selvagem Rht-B1a. A tradução reinicia com o aminoácido 67.

[033] SEQ ID N°: 8 mostra a sequência de nucleotídeo 3463nt do gene Rht-A1a de Triticum aestivum (tipo selvagem Rht-A1), (Acessão Genbank N° JF930277) os Nucleotídeos 1 a 1600 corresponde ao promotor e 5’UTR de Rht-A1a e os nucleotídeos 1601 a 3463 correspondem à região codificadora de proteína de Rht-A1a. A região codificadora de proteína é 96 % idêntica à região codificadora Rht-B1a.

[034] SEQ ID N°: 9 mostra a sequência de aminoácido 620 do polipeptídeo Rht-A1a (tipo selvagem).

[035] SEQ ID N°: 10 mostra a 1872 sequência de nucleotídeo de um cDNA que corresponde ao gene Rht-D1a (Acessão Genbank N° AJ242531).

[036] SEQ ID N°: 11 mostra a 623 sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-D1 (Accessão N° JF930281).

[037] SEQ ID N°: 12 mostra a 618 sequência de aminoácido do gene Sln1 de cevada (Accessão N° AK372064).

[038] SEQ ID N°: 13 mostra a sequência de aminoácido 532 do polipeptídeo GAI de Arabidopsis thaliana (Accessão N° CAA75492).

[039] SEQ ID N°: 14 mostra uma sequência de aminoácido da inserção de 30 aminoácidos no polipeptídeo Rht-B1c.

[040] SEQ ID N°: 15 mostra a 11 sequência de aminoácido do motivo “Della” no polipeptídeo Rht-B1a do tipo selvagem em trigo, que é interrompido no polipeptídeo Rht-B1c.

[041] SEQ ID N°: 16 mostra uma sequência de nucleotídeo do gene Rht-B1c (Accessão N° JN857970, Wu et al., 2011). O cDNA corresponde aos nucleotídeos 206 a 352 unido de 2289 a 4097.

[042] SEQ ID N°: 17 a 30 mostra a sequência de nucleotídeos dos iniciadores de oligonucleotídeo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Plantas

[043] A presente invenção fornece plantas de trigo, partes destas, tais como grão de trigo, produtos obtidos destas plantas e grãos, tais como ingredientes alimentícios e produtos alimentícios e métodos de produzir e usar os mesmos. Como usado aqui, o termo “trigo” significa uma planta, parte da planta, grão ou produto derivado destes das espécies Triticum aestivum L. ou Triticum turgidum ssp. durum ou Triticale. Triticum aestivum L., também conhecido como trigo de pão, é um trigo hexaplóide tendo uma organização de genoma de AABBDD, compreendido de 42 cromossomos. Os subgenomas “A”, “B” e “D” de Triticum aestivum L. são frequentemente referidos como “genomas”. Triticum turgidum ssp. durum, frequentemente referido como trigo duro é um trigo tetraplóide tendo uma organização de genoma de AABB, tendo 28 cromossomos. Progenitores diplóides de trigo hexaplóide ou tetraplóide incluem Triticum sp. tais como T. uartu, T. monococcum ou T. boeoticum para o genoma A, Aegilops speltoides para o genoma B e T. tauschii (também conhecido como Aegilops squarrosa ou Aegilops tauschii) para o genoma D, mas não são abrangidos em “trigo” como usado aqui. Entretanto, as plantas que são produzidas por técnicas convencionais usando- se Triticum aestivum L. como um parente em um cruzamento sexual com espécies que não Triticum Secale cereale (centeio), cuja progênie híbrida é referida aqui como Triticale, é abrangida em “trigo” como usado aqui. Preferivelmente, a planta de trigo é adequada para a produção comercial de grãos, tais como variedades comerciais de trigo de pão ou trigo duro, tendo características agronômicas adequadas que são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[044] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma planta de trigo que compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht-B1variante (não tipo selvagem), preferivelmente é homozigóticoo para o alelo Rht-B1. Nas formas de realização, a planta de trigo compreende um alelo Rht-B1 selecionado do grupo que consiste de Rht-B1c.1, Rht-B1c.2, Rht- B1c.3, Rht-B1c.4, Rht-B1c.5, Rht-B1c.6, Rht-B1c.7, Rht-B1c.8, Rht-B1c.9, Rht-B1c.10, Rht-B1c.12, Rht-B1c.15, Rht-B1c.16, Rht-B1c.17, Rht-B1c.18, Rht-B1c.21, Rht-B1c.22, Rht-B1c.23, Rht-B1c.24, Rht-B1c.26, Rht-B1c.27, Rht-B1c.28, Rht-B1c.29, Rht-B1c.30 e Rht-B1c.32, e é preferivelmente homozigóticoo para o alelo. Em formas de realização preferidas, a planta de trigo compreende um alelo Rht-B1 selecionado do grupo que consiste de Rht- B1c.22, Rht-B1c.23, Rht-B1c.24 e Rht-B1c.26 e é preferivelmente homozigóticoo para o alelo. Em uma forma de realização, o polipeptídeo Rht- B1 compreende um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5. SEQ ID N°: 5 apresenta a sequência de aminoácido de uma proteína Rht-B1a de trigo do tipo selvagem, com um comprimento de 621 aminoácidos, que é codificado por um alelo Rht-B1a tipo selvagem em trigo e que é usado aqui como a sequência de referência para um polipeptídeo Rht-B1 tipo selvagem.

[045] Alternativamente, a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 variante difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e a sequência de nucleotídeo do alelo Rht-B1 que codifica o polipeptídeo Rht-B1 variante difere da sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID N°: 1 pelo menos pela presença de uma mutação em ou adjacente a um local de união de íntron tal que a união de íntron da transcrição de RNA do alelo Rht-B1 é afetada. Como usado aqui, um “local de união de íntron” significa os 4 nucleotídeos que se estendem na junção de íntron, isto é 2 nucleotídeos ao 5’ e os 2 nucleotídeos ao 3’ lateral de junção de íntron. Como usado aqui, “adjacente a um local de união de íntron” significa os 3 nucleotídeos ao 5’ e os 3 nucleotídeos ao 3’ lateral do local de união de íntron. SEQ ID N°: 1 apresenta a sequência de nucleotídeo da região que codifica a proteína do alelo Rht-B1c, derivado da variedade de trigo base genética Maringá, começando no códon de início de tradução ATG ao códon de terminação de tradução TGA. A SEQ ID N°: 1 inclui a inserção de retrotransposon de 2026 nucleotídeos (nucleotídeos 148 a 2173) que foram inseridos no gene Rht-B1 para formar o alelo Rht-B1c (Wu et al., 2011). Nesta forma de realização, a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pelo alelo Rht-B1 pode ser identificado à SEQ ID N°: 3 ou pode ser diferente. O alelo Rht-B1 pode compreender tanto a mutação de união de íntron quanto codifica um polipeptídeo tendo as diferenças de (i) e (ii) no parágrafo prévio ou em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo têm as diferenças de (i) e (ii) acima e está precisando de qualquer mutação de local de união de íntron.

[046] Como usado aqui, “um polipeptídeo Rht-B1” significa um polipeptídeo que é codificado por um alelo Rht-B1 no trigo. Tipicamente, o polipeptídeo Rht-B1 tem um domínio N-terminal unido a um domínio C- terminal de cerca de 572 aminoácidos que é pelo menos 98 % idêntico na sequência de aminoácido aos aminoácidos 50 a 621 da SEQ ID N°: 5. O domínio C-terminal inclui o que é comumente referido ao domínio GRAS. Em uma forma de realização, o domínio N-terminal é de cerca de 49 a cerca de 79 aminoácidos de comprimento. Em uma forma de realização preferida, o domínio N-terminal é de cerca de 79 aminoácidos de comprimento tendo a sequência, tal como, por exemplo, aminoácidos 1 a 79 da SEQ ID N°: 3 ou uma variante com 1 a 5 substituições de aminoácido com referência aos aminoácidos 1 a 79 da SEQ ID N°: 3. Em uma forma de realização alternativa, o polipeptídeo Rht-B1 é derivado do polipeptídeo Rht-B1 tipo selvagem por uma truncação na extremidade N-terminal tal como, por exemplo, o polipeptídeo Rht-B1b (SEQ ID N°: 7) codificado pelo alelo Rht- B1b, também conhecido como o gene Rht1. Em uma forma de realização, o alelo Rht-B1 codifica um polipeptídeo Rht-B1 cuja sequência de aminoácido é pelo menos 98 % idêntico com SEQ ID N°: 3.

[047] Em uma forma de realização, a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 não é idêntico à SEQ ID N°: 5 e não é crítico para a SEQ ID N°: 7, embora isto possa abranger a SEQ ID N°: 7. Em uma forma de realização, se a sequência de aminoácido do polipeptídeo for idêntica à SEQ ID N°: 3, então o alelo Rht-B1 não tem a sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID N°: 1; em vez deste codificar uma sequência variante da SEQ ID N°: 1 tendo uma mutação em ou adjacente a um local de união de íntron com relação à SEQ ID N°: 1. Em uma forma de realização preferida, a sequência de aminoácido do polipeptídeo não é idêntica à SEQ ID N°: 3. Isto é, o polipeptídeo é diferente em sequência a cada um dos polipeptídeos Rht-B1a (tipo selvagem), o polipeptídeo Rht-B1b e o polipeptídeo Rht-B1c. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácido do polipeptídeo difere da sequência de aminoácido Rht-B1a apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido em uma região do polipeptídeo que corresponde aos aminoácidos 200 a 621 da SEQ ID N°: 5. Esta região do polipeptídeo Rht-B1a corresponde ao domínio GRAS do polipeptídeo.

[048] Em uma forma de realização preferida, a inserção com relação ao polipeptídeo Rht-B1a ((i) acima) de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 é uma inserção de cerca de 30 aminoácidos, cuja sequência é preferivelmente DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID N°: 14; que corresponde aos aminoácidos 50 a 79 da SEQ ID N°: 3) ou uma variante destes, em que a sequência da variante difere de SEQ ID N°: 14 pelas substituições de aminoácido, inserções ou anulações de não mais do que 5 aminoácidos, preferivelmente de 1 ou 2 substituições de aminoácido. A sequência DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID N°: 14) é a sequência da inserção no polipeptídeo Rht-B1c com relação ao polipeptídeo Rht-B1a. Esta inserção de 30 aminoácidos que resultou da inserção no gene Rht-B1 que formou o alelo Rht-B1c. Esta inserção está dentro do denominado motivo DELLA (DELLAALGYKV; SEQ ID N°: 15) do polipeptídeo Rht-B1 que é pensado ser requerido para a interação com a proteína do receptor GA, GID1, tal que o polipeptídeo com uma inserção não liga mais GID1. As variações desta sequência inserida podem ser obtidas através da mutagênese e as substituições, inserções ou anulações de 1 a 5 aminoácidos não são esperados afetar a perda da interação do polipeptídeo com GID1.

[049] Em uma forma de realização, o polipeptídeo da planta de trigo ainda compreende uma ou mais substituições de aminoácido, preferivelmente substituições de aminoácido conservativas, em uma região do polipeptídeo que corresponde aos aminoácidos 1 a 200 da SEQ ID N°: 5, também referido como o domínio DELLA do polipeptídeo Rht-B1 tipo selvagem porque compreende a sequência de aminoácido DELLAALGYKV (SEQ ID N°: 15), também referido como o motivo DELLA. É preferido, entretanto, que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 da invenção é idêntica à SEQ ID N°: 3 no domínio DELLA mutado, isto é, compreende aminoácidos 1 a 230 da SEQ ID N°: 3.

[050] Em outras formas de realização preferidas, a uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal estão na região do polipeptídeo que corresponde aos aminoácidos 200 a 621 da SEQ ID N°: 5. Em uma forma de realização preferida, a uma ou mais substituições de aminoácido compreendem uma substituição de um aminoácido selecionado do grupo que consiste de G260, V264, A271, G298, A299, A305, A310, P344, L346, G377, P394, R514, T524, S528, G563, V286, D371, A310, E579, S493, R283, R271, G274, A280, V234, R484, V285, G230, S488 e C240 com referência à SEQ ID N°: 3. É preferido que a substituição é selecionada do grupo que consiste de G260E, V264M, A271T, G298D, A299T, A305T, A310V, P344S, L346F, G377R, P394L, R514H, T524I, S528F, G563D, V286M, D371N, A310T, E579K, S493F, R283H, R271H, G274D, A280T, V234M, R484H, V285F, G230E, S488F e C240Y. Em uma forma de realização mais preferida, o alelo Rht-B1 da planta de trigo compreende uma variação de sequência com relação à SEQ ID N°: 1, cuja variação de sequência é selecionada do grupo que consiste de G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A. Estas variações de sequência correspondem às substituições de aminoácido listadas imediatamente acima, ver a Tabela 3.

[051] É preferido que a planta de trigo da invenção tem uma altura de planta aumentada com relação à planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c e uma altura diminuída com relação à planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1a quando as plantas são desenvolvidas sob as mesmas condições. Consequentemente, a planta de trigo da invenção é referida como "semianã". Em uma forma de realização preferida, a altura da planta de trigo da invenção está entre cerca de 70 % e cerca de 94 % da altura da planta de controle que é homozigótica para o alelo Rht-B1a (“fenótipo alto”), mais preferivelmente entre cerca de 75 % e cerca de 90 % da altura da planta que é homozigótica para o alelo Rht-B1a. Em comparação, a altura da planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c (“planta tornada anã”) é de cerca de 42 % da altura da planta que é homozigótica para o alelo Rht-B1a. A altura da planta de trigo da invenção pode estar em torno da mesma ou essencialmente a mesma altura de uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1b, que é de cerca de 80 a 81 % de uma altura das plantas altas ou pode ser menor do que a altura da planta Rht-B1b ou maior do que a altura da planta Rht-B1b. “altura da planta” como usado aqui significa a altura da planta madura do nível da base ao topo do ramo mais alto, isto é, à base da cabeça. As plantas que são homozigóticas para os alelos Rht-B1c, Rht-B1a ou Rht-B1b e que são usados como controles na comparação preferivelmente têm essencialmente a mesma base genética, mais preferivelmente, são linhas isogênicas próximas, com relação à planta de trigo da invenção; estas são, portanto, denominadas uma “planta de trigo correspondente que é homozigótica para o alelo Rht-B1c (ou Rht-B1a ou Rht- B1b)”. Aqueles habilitados na técnica são facilmente capazes de selecionar uma planta de trigo correspondente que é adequada para a comparação. Para realizar a comparação, a planta da invenção e a planta de controle são desenvolvidas essencialmente sob o mesmo tempo e condições ambientais, tal como em um ensaio de campo replicado, incluindo o mesmo regime de temperatura, condições de luz, nutriente e fornecimento de água e condições do solo. Preferivelmente, a altura da planta é medida para plantas de desenvolvimento no campo, embora as plantas desenvolvidas em estufa também podem ser usados para a comparação e desenvolvimento de acordo com os ensaios de campo como conhecido na técnica. As alturas da planta podem ser medidas em qualquer ponto no ciclo de desenvolvimento, mas são preferivelmente medidos na maturidade das plantas.

[052] Além disso, é preferido que a planta de trigo tem fertilidade aumentada e/ou produz uma quantidade aumentada de grão com relação à planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c e/ou tem comprimento de coleóptilo aumentado com relação à planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c e/ou é capaz de produzir grãos tendo dormência aumentada com relação ao grão obtido da planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1a. Preferivelmente, a quantidade de grãos produzidos pela planta é essencialmente a mesma ou maior do que, a planta de trigo correspondente que é homozigótica para o alelo Rht-B1b. Como usado aqui, “fertilidade” é definido como o número de grãos por cabeça e a “quantidade de grãos” ou “rendimento de grãos produzidos a partir de uma planta” significa a altura dos grãos maduros que podem ser coletados a partir da planta. Tais grãos tem, tipicamente, um teor de umidade de cerca de 10 % a cerca de 15 % em peso. As plantas de trigo da presente invenção também têm, preferivelmente, comprimento de coleóptilo aumentado com relação a uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c. Preferivelmente, o comprimento do coleóptilo da planta de trigo da presente invenção está entre 70 % e 120 %, preferivelmente entre 80 % e 100 % do comprimento do coleóptilo da planta que é homozigótica para o alelo Rht- B1a. Uma outra característica preferida das plantas de trigo da presente invenção é a dormência do grão obtido da planta. É preferido que as plantas têm dormência de grão aumentada com relação à planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1a. Preferivelmente, a planta de trigo tem, entre 50 % e 100 %, preferivelmente 60 % a 100 %, do nível de dormência de uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c. Em uma forma de realização, a taxa de germinação de grãos obtidos da planta de trigo da invenção é intermediário entre aquela do grão a partir de uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1a e o grão de uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c. A taxa de germinação pode ser estimada como descrito no Exemplo 1. Por exemplo, o tempo levado para a população de grãos atingir 50 % de germinação pode ser estimado. Em uma forma de realização preferida, o grão da planta de trigo da invenção requer entre 1 e 8 semanas mais, preferivelmente entre 2 e 5 semanas mais, de armazenamento em temperatura ambiente (“período pós-amadurecimento”) para a taxa de germinação atingir 50 % com relação ao grão a partir de uma planta de trigo correspondente que é homozigótica para o alelo Rht-B1a.

[053] Como deve ser entendido, quando uma comparação é feita entre as plantas ou grãos da presente invenção e aqueles que são homozigóticoos para o alelo Rht-B1c ou são homozigóticoos para o alelo Rht- B1a, a comparação é realizada com plantas desenvolvidas sob condições de desenvolvimento essencialmente idênticos, tempo de desenvolvimento, temperatura, água e fornecimento de nutriente, etc e para grãos obtidos a partir de tais plantas.

Grãos

[054] Em um segundo aspecto, a invenção fornece grão de trigo que é obtenível de ou obtenível de, ou que é parte das plantas de trigo da invenção. Como usado aqui, “grão” significa grãos quando é tipicamente coletado por fazendeiros a partir das plantas de trigo maduras que se desenvolvem no campo, incluindo o grão usado para a produção de alimentos ou em produtos alimentícios e grão germinado após ser semeado mas antes da emergência das mudas. Grão também inclui grãos que foram processados para a produção alimentícia ou que é um ingrediente em um produto alimentício. O grão de trigo coletado da invenção tem tipicamente um teor de umidade de cerca de 10 % a cerca de 15 % em peso. Em uma forma de realização, o grão de trigo compreende um alelo Rht-B1 que codifica um polipeptídeo Rht-B1 variante (não tipo selvagem), preferivelmente, o grão é homozigóticoo para o alelo. Em uma forma de realização, o polipeptídeo Rht-B1 compreende um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C-terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5. Nas formas de realização o grão de trigo compreende um alelo Rht-B1 selecionado do grupo que consiste de Rht-B1c.1, Rht-B1c.2, Rht-B1c.3, Rht-B1c.4, Rht-B1c.5, Rht-B1c.6, Rht- B1c.7, Rht-B1c.8, Rht-B1c.9, Rht-B1c.10, Rht-B1c.12, Rht-B1c.15, Rht- B1c.16, Rht-B1c.17, Rht-B1c.18, Rht-B1c.21, Rht-B1c.22, Rht-B1c.23, Rht- B1c.24, Rht-B1c.26, Rht-B1c.27, Rht-B1c.28, Rht-B1c.29, Rht-B1c.30 e Rht- B1c.32, e é preferivelmente homozigóticoo para o alelo. Em formas de realização preferidas, o grão de trigo compreende um alelo Rht-B1 selecionado do grupo que consiste de Rht-B1c.22, Rht-B1c.23, Rht-B1c.24 and Rht-B1c.26 e é preferivelmente homozigóticoo para o alelo.

[055] Alternativamente, a sequência da variante do aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 do grão difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e a sequência de nucleotídeo do alelo Rht-B1 que codifica o polipeptídeo Rht-B1 variante difere da sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID N°: 1 pelo menos pela presença de uma mutação em ou adjacente a um local de união de íntron tal que a união de íntron da transcrição de RNA do alelo Rht-B1 é afetada. Nesta forma de realização, a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pelo alelo Rht-B1 pode ser identificado à SEQ ID N°: 3 ou pode ser diferente. O alelo Rht-B1 pode compreender tanto a mutação de união de íntron quanto codificam um polipeptídeo tendo as diferenças de (i) e (ii) no parágrafo prévio ou em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo tem as diferenças de (i) e (ii) acima e está precisando de qualquer mutação de local de união de íntron com relação à SEQ ID N°: 1.

[056] O polipeptídeo Rht-B1 variante dos grãos e o alelo Rht-B1 que o codifica ainda pode ser definido como descrito nos parágrafos acima com respeito à planta de trigo. Em uma forma de realização preferida, os grãos têm dormência aumentada ao grão obtido a partir de uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1a. Em uma forma de realização, a taxa de germinação do grão da invenção é intermediária entre aquelas do grão de uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1a e o grão de uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c. A taxa de germinação pode ser estimada como descrito no Exemplo 1. Por exemplo, o tempo levado para as populações de grãos atingirem 50 % de germinação pode ser estimado. Em uma forma de realização preferida que mostram “dormência aumentada”, o grão da invenção requer entre 1 e 8 semanas mais, preferivelmente entre 2 e 5 semanas mais, de armazenamento em temperatura ambiente (“período pós-amadurecimento”) para a taxa de germinação atingir 50 % com relação ao grão de uma planta de trigo correspondente que é homozigótica para o alelo Rht-B1a. Também é preferido que o grão de trigo da invenção é capaz de desenvolver em uma planta de trigo quando o grão é semeado no solo, cuja planta tem uma altura aumentada com relação a uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c e uma altura diminuída com relação a uma planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1a quando as plantas são desenvolvidas sob as mesmas condições. A planta de trigo que origina-se do grão pode ter fertilidade aumentada e/ou produz uma quantidade aumentada de grãos com relação à planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht-B1c e/ou tem comprimento de coleóptilo aumentado com relação à planta de trigo que é homozigótica para o alelo Rht- B1c.

[057] A presente invenção também fornece um método de produzir grãos da invenção, o método compreendendo (i) desenvolver a planta de trigo da presente invenção e (ii) coletar os grãos da planta. Em algumas formas de realização, o grão de trigo foi processado de modo que este não é mais capaz de germinar. Isto pode ser atingido pela remoção do embrião da semente, por exemplo, por trituração ou por tratamento com calor ou outro processamento do grão. O grão pode ser grão esmagado, quebrado, parboilizado, laminados, perolizados, moído ou triturado.

[058] A presente invenção também fornece um método de produzir farinha, farinha integral, amido, grânulos de amido ou farelo, o método compreendendo obter o grão da presente e processamento do grão para produzir a farinha, farinha integral, amido, grânulos de amido ou farelo. Tais métodos de processamento são bem conhecidos na técnica. A etapa de obter os grãos pode compreender, por exemplo, coletar o grão da planta de trigo da invenção ou comprar o grão.

[059] A presente invenção também fornece produtos produzidos a partir de plantas ou grãos, tal como um produto alimentício, que pode ser um ingrediente alimentício. Os exemplos de produtos alimentícios incluem farinh, amido, pães fermentados ou não fermentados, massa, macarrão, forragem animal, cereais matinais, petiscos, tortas, malte, massas para torta e alimentos contendo temperos com base em farinha. O produto alimentício pode ser um bagel, um biscoito, um pão, a pão doce, um croissant, um bolinho, um muffin inglês, um muffin, a pão pita, um pão rápido, um produto de massa refrigerado/congelado, bolinhos, feijões cozidos, um burrito, chili, um taco, um tamale, uma tortilla, uma torta de pote, um cereal pronto para comer, uma refeição pronta para comer, recheio, uma refeição de microondas, um brownie, uma torta, uma torta de queijo, uma torta de café, um biscoito, uma sobremesa, uma massa para torta, um rocambole, uma barra doce, uma massa de torta, enchimento de torta, comida de bebê, uma mistura de cozimento, uma massa de farinha com ovos e leite, um panado, uma mistura de molho, um extensor de carne, um substituto de carne, uma mistura de condimentação, uma mistura de sabão, um molho, uma mistura para sopa, um tempero para salada, uma sopa, coalhada, um macarrão, uma massa, macarrões instantânos, macarrão chow mein, macarrão lo mein, uma inclusão de creme gelado, inclusão de sorvete, uma barra de creme gelado, um cone de sorvete, um sanduíche de sorvete, um biscoito fino, um crouton, uma rosquinha, um rolinho primavera, um lanche extrusado, uma barra de fruta e grão, um produto de lanche de microondas, uma barra nutricional, uma panqueca, um produto de padaria levemente cozido, um pretzel, um pudim, um produto com base em granola, um salgadinho, um alimento rápido, uma mistura de lanche, um waffle, uma massa de pizza, um alimento para animais ou alimento para animal doméstico. O produto alimentício pode ser preparado pela mistura do grão ou farinha, farinha integral ou farelo do dito grão, com um outro ingrediente. Um outro produto é uma alimentação animal, tal como grão coletado, feno, palha ou silagem. As plantas da invenção podem ser usadas diretamente como alimentação animal, por exemplo, quando se desenvolve no campo.

[060] Polinucleotídeos Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo Rht-B1 da invenção. A molécula de ácido nucléico pode ser isolada a partir da planta de trigo ou compreendida em uma planta de trigo ou como uma molécula de ácido nucléico exógena em uma planta, que pode ser qualquer planta tal como uma planta de cereal ou uma outra planta que não trigo. Em uma forma de realização, o polipeptídeo Rht-B1 compreende um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C- terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5. O polipeptídeo Rht-B1 da invenção ainda pode ser definido como descrito nos parágrafos acima com respeito à planta de trigo. Em formas de realização preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende um alelo Rht-B1 selecionado do grupo que consiste de Rht-B1c.1, Rht-B1c.2, Rht-B1c.3, Rht-B1c.4, Rht-B1c.5, Rht- B1c.6, Rht-B1c.7, Rht-B1c.8, Rht-B1c.9, Rht-B1c.10, Rht-B1c.12, Rht-B1c.15, Rht-B1c.16, Rht-B1c.17, Rht-B1c.18, Rht-B1c.21, Rht-B1c.22, Rht-B1c.23, Rht-B1c.24, Rht-B1c.26, Rht-B1c.27, Rht-B1c.28, Rht-B1c.29, Rht-B1c.30 e Rht-B1c.32. em formas de realização mais preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende um alelo Rht-B1 selecionado do grupo que consiste de Rht-B1c.22, Rht-B1c.23, Rht-B1c.24 e Rht-B1c.26.

[061] Polipeptídeos Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo Rht-B1 que compreende um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácido do domínio C- terminal é pelo menos 98 % idêntico aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5 e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo Rht-B1 difere da sequência apresentada como SEQ ID N°: 5 por pelo menos (i) uma inserção de um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID N°: 5 e (ii) uma ou mais substituições de aminoácido no domínio C-terminal com relação aos aminoácidos de 50 a 621 da SEQ ID N°: 5. O polipeptídeo Rht-B1 da invenção ainda pode ser definido como descrito nos parágrafos acima com respeito à planta de trigo.

[062] A presente invenção também fornece um método de genotipar a planta de trigo, o método compreendendo (i) obter uma amostra que compreende ácido nucléico ou proteína extraída da planta de trigo e (ii) detectar na amostra, uma molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo da presente invenção. Em formas de realização preferidas a planta de trigo compreende um alelo Rht-B1 selecionado do grupo que consiste de Rht-B1c.1, Rht-B1c.2, Rht-B1c.3, Rht-B1c.4, Rht-B1c.5, Rht-B1c.6, Rht-B1c.7, Rht- B1c.8, Rht-B1c.9, Rht-B1c.10, Rht-B1c.12, Rht-B1c.15, Rht-B1c.16, Rht- B1c.17, Rht-B1c.18, Rht-B1c.21, Rht-B1c.22, Rht-B1c.23, Rht-B1c.24, Rht- B1c.26, Rht-B1c.27, Rht-B1c.28, Rht-B1c.29, Rht-B1c.30 e Rht-B1c.32.

[063] A presente invenção também fornece um método de introduzir um alelo Rht-B1 em uma planta de trigo que precisa do dito alelo, o método compreendendo i) cruzar uma primeira planta de trigo precursora com uma segunda planta de trigo precursora, em que a segunda planta é uma planta de trigo da presente invenção e ii) cruzar novamente uma planta de progênie do cruzamento da etapa i) com uma planta do mesmo genótipo como a primeira planta precursora para produzir uma planta com uma maioria do genótipo do primeiro precursor mas que compreende o dito alelo Rht-B1.

[064] A molécula de ácido nucléico da presente invenção pode ser operacionalmente ligada a um promotor capaz de direcionar a expressão da molécula de ácido nucléico em uma célula vegetal. Também é fornecido um vetor que compreende ou que codifica a molécula de ácido nucléico da presente invenção e células hospedeiras que compreendem este vetor e/ou a molécula de ácido nucléico da presente invenção.

[065] A presente invenção também fornece uma planta geneticamente modificada onde a planta foi transformada com uma molécula de ácido nucléico da presente invenção e suas plantas de progênie que compreendem a molécula de ácido nucléico. Em certas formas de realização, a planta geneticamente modificada é uma planta de trigo ou planta de cevada.

[066] Cereais como usado aqui significa plantas ou grãos das famílias monocotiledôneas Poaceae ou Graminae que são cultivadas para os componentes comestíveis de suas sementes e inclui trigo, cevada, milho, aveias, centeio, arroz, sorgo, triticale, painço, trigo-mouro. Preferivelmente, a planta de cereal ou grão é planta ou grão de trigo ou de cevada, mais preferivelmente planta ou grão de trigo. Em uma outra forma de realização mais preferida, a planta de cereal não é arroz ou milho ou qualquer um destes.

[067] Como usado aqui, o termo "cevada" refere-se a quaisquer espécies do Gênero Hordeum, incluindo seus progenitores, bem como sua progênie produzida pelos cruzamentos com outras espécies. É preferido que a planta seja da espécie Hordeum que é comercialmente cultivada, tal como, por exemplo, uma cepa ou cultivar ou variedade de Hordeum vulgare ou adequado para a produção comercial de grãos.

[068] As plantas de trigos da invenção podem ter muitos outros usos que não para alimentação ou nutrição animal, por exemplo, usos em pesquisa ou criação. Em lavouras propagadas por sementes, tais como trigo, as plantas podem ser auto-cruzadas para produzir uma planta que é homozigótica quanto aos genes desejados ou tecidos haplóides, tais como o desenvolvimento de células germinativas pode ser induzido a duplicar o complemento de cromossomo para produzir uma planta homozigótica.

[069] As plantas de trigo da invenção podem ser cruzadas com plantas contendo uma base mais geneticamente desejável. A base genética desejável pode incluir uma combinação adequada de genes que fornecem rendimento comercial e outras características, tais como desempenho agronômico ou resistência à tensão abiótica. A base genética também deve incluir outra biossíntese de amido alterada ou genes de modificação, por exemplo, genes de outras linhas de trigo. A base genética pode compreender um ou mais transgenes, tais como, por exemplo, um gene que confere tolerância a um herbicida, tal como glifosato.

[070] Como usado aqui, o termo "ligado" refere-se a um local de marcador e um segundo local estando suficientemente próximo a um cromossomo que estarão herdados juntos em mais do que 50 % das meioses, por exemplo, de maneira não aleatória. Esta definição inclui a situação onde o local de marcador e o segundo local forma parte do mesmo gene. Além disso, esta definição inclui a situação onde o local de marcador compreende um polimorfismo que é responsável pela característica de interesse (em outras palavras o local de marcador é diretamente “ligado” ao fenótipo). O termo "geneticamente ligado" como usado aqui é mais estreito, apenas usado em relação onde um local marcador e um segundo local estando suficientemente próximo bem um cromossomo que estes serão juntos em mais do que 50 % de meioses. Deste modo, o percentual da recombinação observado entre o local por geração (centimórgãos (cM)), serão menos do que 50. Nas formas de realização particulares da invenção, o local geneticamente ligado pode ser 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 ou menos cM à parte em um cromossomo. Preferivelmente, os marcadores são menos do que 5 cM ou 2 cM à parte e mais preferivelmente cerca de 0 cM à parte.

[071] Como usado aqui, os "outros marcadores genético" podem ser qualquer uma das moléculas que são ligadas a um traço desejado de uma planta de cereal tal como trigo. Tais marcadores são bem conhecidos àquela pessoa habilitada na técnica e incluem marcadores ligados aos genes determinando traços tal resistência à doença, rendimento, morfologia da planta, qualidade do grão, outros traços de dormência tais como cores de grão, teor do ácido giberélico na semente, altura da planta, cor da farinha e outros. Exemplos de tais genes são genes de resistência à ferrugem no caule Sr2 ou Sr 38, os genes de resistência à ferrugem YrIO ou Yr 17, os genes de resistência a nematóide tais como Crel e Cre3, alelos no local de glutenina que determina a resistência da pasta tal como alelos Ax, Bx, Dx, Ay, By e Dy. Com relação específica a dormência de grão, outros marcadores incluem o gene R para a cor do grão vermelho (Himi et al., 2002), bem como marcadores descritos por Mares et al. (2005), Li et al. (2004), Kato et al. (2001), Mori et al. (2005) and Prada et al. (2004).

[072] O termo "planta" como usado aqui como um nome refere-se às plantas totais, mas como usado como um adjetivo refere-se em qualquer substância que está presente em, obtido de, derivado de, ou relacionado a uma planta, tal como por exemplo, órgãos da planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, flores), células simples (por exemplo, pólen), sementes, células vegetais e outros. As plantas fornecidas por ou consideradas pelo uso na prática da presente invenção incluem tanto monocotiledônias quanto dicotiledônias. Em formas de realização preferidas, as plantas da presente invenção são plantas da lavoura (por exemplo, cereais e grãos de leguminosas, milho, trigo, batatas, tapioca, arroz, sorgo, painço de soja, mandioca, cevada ou ervilha), ou legumes. As plantas podem ser desenvolvidas para a produção das raízes comestíveis, tubérculos, folhas, caules, flores ou fruto.

[073] Os termos "semente" e "grão" como usados aqui tem significados sobrepostos. O "grão" inclui a semente que foi coletada da planta e geralmente refere-se ao grão coletado, maduro mas também pode referir o grão após a inibição ou germinação, de acordo com o contexto. A “semente” pode referir-se ao grão maduro, antes ou após a coleta, ou para sementes imaturas que são desenvolvidas na planta. O grão maduro comumente tem um teor de umidade menor do que cerca de 10-15 %.

[074] Como usado aqui, o termo "gene" deve ser adotado em seu contexto mais amplo e inclui a sequência de desoxiribonucleotídeos que compreende a região codificadora de proteína de um gene estrutural e incluindo as sequências localizadas adjacentes à região codificadora tanto nas extremidades 5' quanto 3' para uma distância de pelo menos cerca de 2 kb em cada extremidade. As sequências que são localizadas 5' da região codificadora e que são presentes no mRNA são referidas como sequências 5' não traduzidas. As sequências que são localizadas 3' ou a jusante da região codificadora e que estão presentes no mRNA são referidas como as sequências não traduzidas 3'. O termo "gene" abrange tanto cDNA quanto as formas genômicas de um gene. Uma forma genômica ou clone de um gene contém a região codificadora que pode ser interrompida com as sequências não codificadoras denominadas "íntrons" ou "regiões de intervenção" ou "sequências de intervenção". Os íntrons são segmentos de um gene que são transcritos em RNA nuclear (hnRNA); íntrons podem conter os elementos reguladores tais como intensificadores. Os íntrons são removidos ou "unidos" a partir de um transcrito nuclear ou primário; íntrons portanto estão ausentes no transcrito de RNA mensageiro (mRNA). As funções de mRNA durante a tradução para especificar a sequência ou ordem dos aminoácidos em um polipeptídeo nascente. O termo "gene" inclui uma molécula de fusão ou sintética que codifica todos ou parte das proteínas da invenção descritas neste e uma sequência de nucleotídeo complementar em qualquer um do acima.

[075] Um alelo é uma variante de um gene em um local genético simples. O trigo hexaplóide tal como Triticum aestivum L. tem seis séries de cromossomos com uma organização de genoma de AABBDD. Cada cromossomo tem uma cópia de cada gene (um alelo). Se ambos alelos de um par de cromossomo são os mesmos, o organismo é homozigóticoo com relação àquele gene, se os alelos são diferentes, o organismo é heterozigoto com relação aquele gene. A interação entre os alelos em um local é geralmente descrita como dominante ou recessiva.

[076] As plantas de trigo da invenção podem ser produzidas e identificadas após a mutagênese. Esta pode fornecer uma planta de trigo que não é transgênica, que é desejável em alguns mercados, ou que é livre da molécula do ácido nucléico exógeno. Geralmente, uma célula de planta progenitora, tecido, semente ou planta pode ser submetida à mutagênese para produzir as mutações simples ou múltiplas, tais como substituições, anulações, adições de nucleotídeos e/ou modificação de códon.

[077] A mutagênese pode ser atingida pelos meios químicos ou radiação, por exemplo, EMS ou tratamento de azida sódica (Zwar and Chandler, 1995) da semente, ou irradiação gama, bem conhecido na técnica. A mutagênese química tende-se a favorecer as substituições de nucleotídeos antes do que anulações. A irradiação do suporte de íon pesado (HIB) é conhecida como uma técnica efetiva para a criação de mutação para produzir novos cultivos de plantas, ver por exemplo, Hayashi et al., 2007 and Kazama et al, 2008. A irradiação de suporte de íon tem dois fatores físicos, a dosagem (gy) e LET (transferência de energia linear, keV/um) para os efeitos biológicos que determinam a quantidade do dano de DNA e o tamanho da anulação de DNA e estes podem ser ajustados de acordo com a extensão desejada da mutagênese.

[078] Os agentes biológicos úteis na produção dos mutantes específicos pelo local incluem enzimas que incluem quebras de filamento duplo no DNA que estimulam os mecanismos de reparo endógenos. Estes incluem endonucleases, nucleases de dedo de zinco, atuadores TAL, transposases e recombinases específicas pelo local. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs), por exemplo, facilitam a clivagem específica pelo local dentro de um genoma permitindo os mecanismos de reparo endógenos ou outras uniões de extremidade para introduzir anulações ou inserções para reparar a fenda. A tecnologia de nuclease de dedo de zinco é resumida em Le Provost et al., 2009, ver também Durai et al., 2005 and Liu et al., 2010.

[079] O isolamento de mutantes pode ser atingido pela avaliação das plantas ou sementes mutagenizadas. Por exemplo, uma população mutagenizada de trigo podem ser avaliadas diretamente para o genótipo desejado ou indiretamente pela avaliação por um fenótipo tal como altura de planta. A avaliação diretamente para o genótipo preferivelmente inclui a avaliação para a presença de mutações que podem ser observadas nos ensaios PCR pela ausência dos marcadores como esperados quando alguns dos genes são anulados ou ensaios com base em heteroduplex como em Tilling, ou pelo sequenciamento profundo. A avaliação para o fenótipo pode compreender o desenvolvimento como descrito nos Exemplos. Usando esta metodologia amplas populações das sementes mutagenizadas podem ser avaliadas pelo desenvolvimento aumentado fornecendo a altura da planta aumentada.

[080] As mutações identificadas podem então ser introduzidas nas bases genéticas desejadas pelo cruzamento do mutante com uma planta da base genética desejada e realizando um número adequado de retrocruzamentos para cruzar a base precursora originalmente desejada.

[081] No contexto desta aplicação, uma "mutação induzida" ou "mutação introduzida" é uma variação genética artificialmente induzida que pode ser o resultado do tratamento químico ou radiação de uma semente ou planta progenitoras. Os derivados de inserção de nucleotídeo incluem as fusões de terminal 5' e 3' bem como inserções de intrassequência dos nucleotídeos simples ou múltiplos. As variantes da sequência de nucleotídeo de inserção são aquelas em que um ou mais nucleotídeos são introduzidos em um local na sequência de nucleotídeo, em um local pré-determinado como é possível com nucleases de dedo de zinco (ZFN), atuatores TAL ou métodos de recombinação homólogos, ou pela inserção aleatória com avaliação adequada do produto resultante. As variantes de anulação são caracterizadas pela remoção de um ou mais nucleotídeos da sequência. Preferivelmente, um gene mutante tem apenas uma inserção simples da sequência de nucleotídeos com relação ao gene de tipo selvagem e uma ou mais mutações de substituição. As variantes de nucleotídeo substitucionais são aquelas em que pelo menos um nucleotídeo na sequência seja removido e um nucleotídeo diferente inserido em seu lugar. O número preferido dos nucleotídeos afetados pelas substituições em um gene mutante com relação ao gene de tipo selvagem é um máximo de dez nucleotídeos, mais preferivelmente um máximo de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2, ou mais preferivelmente apenas um nucleotídeo.

[082] O termo "mutação" como usado aqui não inclui as substituições de nucleotídeos silenciosas que não afetam a atividade do gene e portanto incluem apenas alterações na sequência do gene que afetam a atividade do gene. O termo "polimorfismo" refere-se em qualquer mudança na sequência de nucleotídeo incluindo tais substituições de nucleotídeos silenciosas. Os métodos de avaliação podem primeiro envolver a avaliação para os polimorfismos e secundariamente para mutações dentro de um grupo das variantes polimórficas.

[083] A seleção assistida pelo marcador é um método bem reconhecido de seleção para as plantas heterozigóticas requeridas quando retrocruza com um precursor recorrente em um programa de criação clássico. A população das plantas em cada retrocruzamento de geração será heterozigótica para o gene de interesse normalmente presente em uma razão 1 : 1 em um retrocruzamento de população e o marcador molecular pode ser usado para distinguir os dois alelos do gene. Para extrair o DNA de, por exemplo, brotos jovens e teste com um marcador específico para o traço desejado submetido à introgressão, a seleção precoce das plantas para retrocruzament adicional é feita enquanto a energia e os recursos são concentrados em poucas plantas. Para ainda acelerar o programa de retrocruzamento, o embrião das sementes imaturas (25 dias pós-antese) pode ser taxado e desenvolvimento no meio de nutriente sob as condições estéreis, antes de permitir a maturidade de semente total.

[084] Qualquer técnica biológica molecular conhecida na técnica que é capaz de detectar os alelos de Rht-B1 pode ser usada nos métodos da presente invenção. Tais métodos incluem, mas não são limitados a, o uso da amplificação do ácido nucléico, sequenciamento do ácido nucléico, hibridização do ácido nucléico com sondas adequadamente rotuladas, análise conformacional de filamento simples (SSCA), eletroforese em gel de gradiente de desnaturação (DGGE), análise de heteroduplex (HET), análise de clivagem química (CCM), clivagem do ácido nucléico catalítico ou uma combinação deste (ver, por exemplo, Lemieux, 2000; Langridge et al., 2001).

[085] A "reação de cadeia de polimerase" ("PCR") é uma reação em que as cópias replicadas são feitas de um polinucleotídeo alvo usando um "par de iniciadores" ou "série de iniciadores" consistindo do iniciador "a montante" e um iniciador "a jusante" e um catalisador da polimerização, tal como um DNA polimerase e tipicamente uma enzima de polimerase termicamente estável. Os métodos de PCR são conhecidos na técnica e são ensinados, por exemplo, em "PCR" (Ed. MJ. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford).

[086] Um iniciador é uma oligossequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar em uma maneira específica pela sequência à sequência alvo e sendo estendida durante o PCR. Os amplicons ou produtos PCR ou fragmentos PCR ou produtos de amplificação são os produtos de extensão que compreendem o iniciador e as cópias recentemente sintetizadas das sequências alvo. Os sistemas de Multiplex PCR contêm séries múltiplas que resultam na produção simultânea de mais do que um amplicon. Os iniciadores podem ser perfeitamente pontuados à sequência alvo ou estas podem conter as bases internas mal combinadas que podem resultar na introdução da enzima de restrição ou locais de clivagem/reconhecimento do ácido nucléico catalítico nas sequências alvo específicas. Os iniciadores também podem conter as sequências adicionais e/ou contém nucleotídeos modificados ou rotulados para facilitar a captura ou detecção dos amplicons. Os ciclos repetidos da desnaturação do calor de DNA, anelação dos iniciadores a suas sequências complementares e extensão dos iniciadores anelados com o resultado a polimerase na amplificação exponencial da sequência alvo. Os termos sequência alvo ou alvo ou padrão referem-se às sequências do ácido nucléico que são amplificadas.

[087] Os termos "planta transgênica" e "planta transgênica de trigo" como usado aqui referem-se a uma planta que contém uma construção do gene ("transgene") não observada em uma planta de tipo selvagem das mesmas espécies, variedade e cultivo. Isto é, as plantas transgênicas (plantas transformadas) contêm o material genético que não contém antes à transformação. Um "transgene" como referido neste tem o significado normal na técnica da biotecnologia e refere-se a uma sequência genética que foi produzida ou alterada pela tecnologia de DNA ou RNA recombinantes e que foi introduzido em uma célula vegetal progenitora, no qual a célula é usada para produzir uma nova planta. O transgene pode incluir as sequências genéticas obtidas de ou derivadas de uma célula vegetal, ou outra célula vegetal, ou uma fonte não vegetal, ou uma sequência sintética. Tipicamente, o transgene foi introduzido na planta pela manipulação humana tal como, por exemplo, pela transformação mas qualquer método pode ser usado como uma pessoa habilitada na técnica reconhece. O material genético é tipicamente integrado estavelmente no genoma da planta. O material genético introduzido pode compreender as sequências que naturalmente ocorrem na mesma espécie mas em uma ordem redisposta ou em uma disposição diferente dos elementos, por exemplo, uma sequência anti-sentido ou uma sequência que codifica um RNA filamentado duplo ou um precursor de microRNA artificial. As plantas contendo tais sequências são incluídas neste nas "plantas transgênicas". As plantas transgênicas como definidas neste incluem toda a progênie de uma planta regenerada e transformada inicial (planta T0) que foi geneticamente modificada usando as técnicas recombinantes, onde a progênie compreende o transgene. Tal progênie pode ser obtida pela própria fertilização da planta transgênica primária ou pelo cruzamento de tais plantas com outra planta das mesmas espécies. Em uma forma de realização, as plantas transgênicas são homozigóticas para cada um e cada gene que foi introduzido (transgene) de modo que a progênie não segrega para o fenótipo desejado. As partes da planta transgênica incluem todas as partes e células das ditas plantas que compreendem o transgene tal como, por exemplo, sementes, tecidos cultivados, calo e protoplastos. Uma "planta não transgênica", preferivelmente uma planta não transgênica de trigo, é uma que não geneticamente modificada pela introdução do material genético pelas técnicas de DNA recombinantes.

[088] Como usado aqui, o termo "planta não transgênica correspondente" refere-se a uma planta que é o mesmo ou similar em mais características, preferivelmente isogênico ou quase isogênico com relação a planta transgênica, mas sem o transgene de interesse. Preferivelmente, a planta não transgênica correspondente é do mesmo cultivo ou variedade como o progenitor da planta transgênica de interesse, ou uma linha de planta irmã que perde a construção, frequentemente denominada um "segregante", ou uma planta do mesmo cultivo ou variedade transformada com uma construção do "vetor vazio" e pode ser uma planta não transgênica. O "tipo secagem", como usado aqui, refere-se a uma célula, tecido ou planta que não seja modificado de acordo com a invenção. As células de tipo selvagem, tecido ou plantas conhecidas na técnica e podem ser usadas como controle para comparar os níveis de expressão de um ácido nucléico exógeno ou extensão e natureza da modificação do traço com células, tecido ou plantas modificadas como descrito neste. Como usado aqui, “grão de trigo do tipo selvagem” significa um grão de trigo não transgênico, não mutagenizado correspondente. Os grãos de trigo de tipo selvagem específicos como usado aqui incluem mas não são limitados a Sunstate.

[089] Quaisquer um de diversos métodos podem ser utilizados para determinar a presença de um transgene em uma planta transformada. Por exemplo, a reação de cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as sequências que são únicas à planta transformada, com detecção dos produtos amplificados pela eletroforese em gel ou outros métodos. O DNA pode ser extraído das plantas usando os métodos convencionais e a reação de PCR realizada usando os iniciadores que distinguirão as plantas transformadas e não transformadas. Um método alternativo para confirmar um transformante positivo é pela hibridização Southern blot, bem conhecido na técnica. As plantas de trigo que são transformadas também podem ser identificadas isto é, distinguidas das plantas de trigo de tipo selvagem ou não transformadas pelo seu fenótipo, por exemplo, conferidas pela presença de um gene marcador selecionável, ou pelos imunoensaios que detectam ou quantificam a expressão de uma enzima codificada pelo transgene, ou qualquer outro fenótipo conferido pelo transgene.

[090] As plantas de trigo da presente invenção podem ser desenvolvidas ou coletadas pelo grão, principalmente para o uso como alimento para o consumo humano ou como alimentação animal, ou pela fermentação ou produtos de estoque de alimentação industrial tal como produção de etanol, entre outros usos. Alternativamente, as plantas de trigo podem ser usadas diretamente como alimentação. A planta da presente invenção é preferivelmente útil para a produção de alimento e em particular para a produção de alimento comercial. Tal produção de alimento pode incluir a fabricação da farinha, pasta, semolina ou outros produtos de grãos que pode ser um ingrediente na produção do alimento comercial. A invenção também fornece farinha, farelo ou outros produtos produzidos de grãos. Este pode ser processado ou não processado, por exemplo, pelo fracionamento ou alvejamento.

[091] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são geralmente usados de maneira intercambiável neste. Os termos "proteínas" e "polipeptídeos" como usados aqui também incluem variantes, mutantes, modificações e/ou derivados dos polipeptídeos da invenção como descritos neste. Como usado aqui, o "polipeptídeo substancialmente purificado" refere-se a um polipeptídeo que foi separado a partir dos lipídeos, ácidos nucléicos, outros peptídeos e outras moléculas com o qual é associado em seu estado natural. Preferivelmente, o polipeptídeo substancialmente purificado é pelo menos 60 % livre, mais preferivelmente pelo menos 75 % livre e mais preferivelmente pelo menos 90 % livre de outros componentes com o qual é naturalmente associado. Para o "polipeptídeo recombinante" é entendido um polipeptídeo feito usando as técnicas recombinantes, isto é, através da expressão de um polinucleotídeo recombinante na célula, preferivelmente uma célula vegetal e mais preferivelmente uma célula de trigo.

[092] A % da identidade de um polipeptídeo relativo a outro polipeptídeo pode ser determinada pela análise GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade da criação da fenda=5 e uma penalidade de extensão da fenda =0,3. A sequência em questão é pelo menos 250 aminoácidos de comprimento e a análise de GAP alinha as duas sequências em uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Mais preferivelmente, dois polipeptídeos em questão são alinhados em sua sequências de aminoácido de comprimento total.

[093] Com relação a um polipeptídeo definido, será apreciado que a % de identidade das Figuras maior do que aquela fornecida acima abrangerá as formas de realização preferidas. Deste modo, onde aplicável, na luz do mínimo da % de identidade das figuras, é preferida que o polipeptídeo compreenda uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 91 %, mais preferivelmente pelo menos 92 %, mais preferivelmente pelo menos 93 %, mais preferivelmente pelo menos 94 %, mais preferivelmente pelo menos 95 %, mais preferivelmente pelo menos 96 %, mais preferivelmente pelo menos 97 %, mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente pelo menos 99 %, mais preferivelmente pelo menos 99,1 %, mais preferivelmente pelo menos 99,2 %, mais preferivelmente pelo menos 99,3 %, mais preferivelmente pelo menos 99,4 %, mais preferivelmente pelo menos 99,5 %, mais preferivelmente pelo menos 99,6 %, mais preferivelmente pelo menos 99,7 %, mais preferivelmente pelo menos 99,8 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9 % idêntico à SEQ ID N° denominada relevante.

[094] As anulações da sequência de aminoácido geralmente varia de cerca de 1 a 15 resíduos, mais preferivelmente cerca de 1 a 10 resíduos e tipicamente cerca de 1 a 5 resíduos contínuos. Os mutantes de substituição tem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de polipeptídeo removida e um resíduo diferente inserido em seu local.

[095] Por “isolado" é entendido material que é substancialmente ou essencialmente livre dos componentes que normalmente acompanham em seu estado natural. Como usado aqui, um "polinucleotídeo isolado" ou "molécula do ácido nucléico isolado" significado que um polinucleotídeo que é pelo menos parcialmente separado de, preferivelmente substancialmente ou essencialmente livre de, a polissequência de nucleotídeos do mesmo tipo com o qual é associado ou ligado em seu estado natural. Por exemplo, um "polinucleotídeo isolado" inclui um polinucleotídeo que foi purificado ou separado das sequências que flanqueia em um estado de ocorrência natural, por exemplo, um fragmento de DNA que foi removido das sequências que são normalmente adjacentes ao fragmento. Preferivelmente, o polinucleotídeo isolado também é pelo menos 90 % livre de outros componentes tais como proteínas, carboidratos, lipídeos etc. O termo "polinucleotídeo recombinante" como usado aqui refere-se a um polinucleotídeo formado in vitro pela manipulação do ácido nucléico em uma forma não normalmente observada na natureza. Por exemplo, o polinucleotídeo recombinante pode ser na forma de um vetor de expressão. Geralmente, tais vetores de expressão incluem ácido nucléico regulador de tradução e transcripcional operavelmente conectado a uma sequência de nucleotídeo a ser transcrita na célula.

[096] A presente invenção refere-se ao uso dos oligonucleotídeos que pode ser usada como "sondas" ou "iniciadores". Como usado aqui, os "oligonucleotídeos" são polinucleotídeos até 50 nucleotídeos de comprimento. Este pode ser RNA, DNA, ou combinações ou derivados. Os oligonucleotídeos são tipicamente moléculas filamentadas simples relativamente curtas de 10 a 30 nucleotídeos, comumente 15-25 nucleotídeos de comprimento, tipicamente compreendido de 10-30 ou 15-25 nucleotídeos que são idênticos a, ou complementares à sequência de interesse. Quando usado como uma sonda ou como um iniciador em uma reação de amplificação, o tamanho mínimo de um tal oligonucleotídeo é o tamanho requerido para a formação de um híbrido estável entre o oligonucleotídeo e uma sequência complementar em uma molécula do ácido nucléico alvo. Preferivelmente, os oligonucleotídeos são pelo menos 15 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 18 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 19 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento. Os polinucleotídeos usados como uma sonda são tipicamente conjugados com um rótulo detectável tal como um radioisótope, uma enzima, biotina, uma molécula fluorescente ou uma molécula quimioluminescente.

[097] Os termos "variante de polinucleotídeo" e "variante" e outros referem-se aos polinucleotídeos apresentando a identidade da sequência substancial com uma polissequência de nucleotídeo de referência e que são capazes de funcionar em uma maneira análoga a, ou com a mesma atividade como, a sequência de referência. Estes termos também abrangem os polinucleotídeos que são distinguidos de um polinucleotídeo de referência pela adição, anulação ou substituição de pelo menos um nucleotídeo, ou que tem, quando comparado as moléculas de ocorrência natural, uma ou mais mutações. Consequentemente, os termos "variante de polinucleotídeo" e "variante" incluem polinucleotídeos em que um ou mais nucleotídeos foram adicionados ou anulados, ou substituídos com os nucleotídeos diferentes. Nesta relação, é bem entendido na técnica que certas alterações inclusivas de mutações, adições, anulações e substituições podem ser feitas e um polinucleotídeo de referência como o polinucleotídeo alterado retém a função biológica ou atividade do polinucleotídeo de referência. Consequentemente, estes termos abrangem os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que exibem a atividade enzimática ou reguladora, ou polinucleotídeos capazes de servir como sondas seletivas ou outros agentes de hibridização. Os termos "variante de polinucleotídeo" e "variante" também incluem as variantes alélicas de ocorrência natural. Os mutantes podem ser de ocorrência natural (isto é dizer, isolado de uma fonte natural) ou sintéticos (por exemplo, pela realização da mutagênese direcionada ao local no ácido nucléico). Preferivelmente, uma variante de polinucleotídeo da invenção que codifica um polipeptídeo com a atividade da enzima é maior do que 400, mais preferivelmente maior do que 500, mais preferivelmente maior do que 600, mais preferivelmente maior do que 700, mais preferivelmente maior do que 800, mais preferivelmente maior do que 900 e ainda mais preferivelmente maior do que 1.000 nucleotídeos de comprimento, até o comprimento total do gene.

[098] Uma variante de um oligonucleotídeo da invenção inclui as moléculas de variação dos tamanhos que são capazes de hibridizar, por exemplo, ao genoma de trigo em uma posição próxima aquela das moléculas de oligonucleotídeos específicas definidas neste. Por exemplo, as variantes podem compreender os nucleotídeos adicionais (tal como 1, 2, 3, 4, ou mais), ou menos nucleotídeos contanto que estes ainda hibridizam à região alvo. Além disso, aos poucos nucleotídeos podem ser substituídos sem influenciar a capacidade do oligonucleotídeo para hibridizar à região alvo. Além disso, as variantes podem prontamente ser indicadas que hibridizam próximas (por exemplo, mas não limitado a, dentro de 50 nucleotídeos) da região do genoma da planta onde os oligonucleotídeos específicos definidos neste hibridizam.

[099] Por "corresponde a" ou "correspondente a" no contexto dos polinucleotídeos ou polipeptídeos é entendido um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo que substancialmente idêntica ou complementar em todas ou uma porção da polissequência de nucleotídeo de referência ou (b) codificando uma sequência de aminoácido idêntica a uma sequência de aminoácido em um peptídeo ou proteína. Esta frase também inclui seu escopo de um peptídeo ou polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácidos em um peptídeo ou proteína de referência. Os termos usados para descrever as conexões da sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos incluem "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "porcentagem da identidade de sequência", "identidade substancial" e "idêntica" e são definidos com relação a um número mínimo definido dos nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos ou preferivelmente no comprimento total. Os termos "identidade de sequência" e "identidade" são usados de maneira permutável neste para referir à extensão que as sequências são idênticas em uma base de nucleotídeo-por-nucleotídeo ou uma base do ácido aminoácido-por-aminoácido em uma janela de comparação. Deste modo, uma "porcentagem da identidade de sequência" é calculada pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas na janela de comparação, determinando o número das posições no qual a base do ácido nucléico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorrem em ambas sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total das posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 um rendimento da porcentagem da identidade de sequência.

[0100] A % de identidade de um polinucleotídeo pode ser determinada pela análise GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de fenda =5 e uma penalidade de extensão de fenda =0,3. A não ser de outra maneira estabelecida, a sequência em questão é pelo menos 45 nucleotídeos de comprimento e a análise GAP alinha-se as duas sequências em uma região de pelo menos 45 nucleotídeos. Preferivelmente, a sequência em questão é pelo menos 150 nucleotídeos de comprimento e a análise GAP alinha-se em duas sequências em uma região de pelo menos 150 nucleotídeos. Mais preferivelmente, a sequência em questão é pelo menos 300 nucleotídeos de comprimento e a análise GAP alinha-se em duas sequências em uma região de pelo menos 300 nucleotídeos, ou pelo menos 400, 500 ou 600 nucleotídeos em cada caso. A referência também pode ser feita à família BLAST dos programas como por exemplo, divulgada por Altschul et al., 1997. Um debate detalhado da análise de sequência pode ser observado na unidade 19.3 de Ausubel et al., 1994-1998, Capítulo 15.

[0101] As sequências de aminoácidos ou nucleotídeo são indicadas como "essencialmente similar" quando tais sequências tem uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 98 %, mais particularmente pelo menos cerca de 98,5 %, muito particularmente cerca de 99 %, especialmente cerca de 99,5 %, mais especialmente cerca de 100 %, muito especialmente são idênticas. É claro que quando as sequências de RNA são descritas como essencialmente similares a, ou tem um certo grau de identidade de sequência com, sequências de DNA, timina (T) na sequência de DNA é considerada igual a uracila (U) na sequência de RNA.

[0102] Com relação aos polinucleotídeos definidos, será apreciado que a % da identidade das Figuras maior do que aquela fornecida acima abrangerá as formas de realização preferidas. Deste modo, onde aplicável, na luz do mínimo da % de identidade das figuras, é preferido que o polinucleotídeo compreenda uma polissequência de nucleotídeo que é pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 91 %, mais preferivelmente pelo menos 92 %, mais preferivelmente pelo menos 93 %, mais preferivelmente pelo menos 94 %, mais preferivelmente pelo menos 95 %, mais preferivelmente pelo menos 96 %, mais preferivelmente pelo menos 97 %, mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente pelo menos 99 %, mais preferivelmente pelo menos 99.1 %, mais preferivelmente pelo menos 99,2 %, mais preferivelmente pelo menos 99,3 %, mais preferivelmente pelo menos 99,4 %, mais preferivelmente pelo menos 99,5 %, mais preferivelmente pelo menos 99,6 %, mais preferivelmente pelo menos 99,7 %, mais preferivelmente pelo menos 99,8 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9 % idêntico à SEQ ID N° denominada relevante.

[0103] Em algumas formas de realização, a presente invenção refere- se a estringência das condições de hibridização para definir a extensão da complementaridade de dois polinucleotídeos. A "estringência" como usado aqui, refere-se à temperatura e condições de força iônica e presença ou ausência de certos solventes orgânicos, durante a hibridização. Quanto maior a estringência, maior será o grau de complementaridade entre uma sequência de nucleotídeo alvo e a polissequência de nucleotídeo rotulada. As "condições estringentes" referem-se à temperatura e condições iônicas sob o qual apenas as sequências de nucleotídeo tendo uma frequência alta de bases complementares hibridizarão. Como usado aqui, o termo "hibridiza-se sob condições de estringência baixa, estringência média, estringência alta, ou estringência muito alta" descreve condições para a hibridização e lavagem. A orientação para realização das reações de hibridização pode ser observada em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, incorporado neste por referência. As condições de hibridização específicas referidas neste são como seguem: 1) condições de hibridização de estringência baixa no cloreto de sódio 6 X/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45° C, seguidas por duas lavagens em 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS a 50-55° C; 2) condições de hibridização de estringência média em 6 X SSC a cerca de 45° C, seguidas por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS a 60° C; 3) condições de hibridização de estringência alta em 6 X SSC a cerca de 45° C, seguidas por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS a 65° C; e 4) condições de hibridização de estringência muito alta são 0,5 M de fosfato de sódio, 7 % de SDS a 65° C, seguidas por uma ou mais lavagens a 0,2 X SSC, 1 % de SDS a 65° C.

[0104] Como usado neste, um "gene quimérico" ou "construção genética" referem-se a qualquer gene que não é um gene natural em sua localização natural isto é foi artificialmente manipulado, incluindo um gene quimérico ou construção genética que é integrado no genoma de trigo. Tipicamente um gene quimérico ou construção genética compreendem as sequências codificadoras de proteína transcritas ou reguladoras que não são observadas juntos na natureza. Consequentemente, um gene quimérico ou construção genética podem compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas dispostas em uma maneira diferente do que aquele observada na natureza. O termo "endógeno" é usado neste para referir-se a uma substância que é normalmente produzida em uma planta não modificada no mesmo estágio de desenvolvimento como a planta sob investigação, preferivelmente uma planta de trigo. Um "gene endógeno" refere-se a um gene natural em sua localização natural no genoma de um organismo preferivelmente em uma planta de trigo. Como usado neste, a "molécula de ácido nucléico recombinante" refere-se a uma molécula de ácido nucléico que foi construída ou modificada pela tecnologia de DNA recombinante. Os termos "polinucleotídeo estranho" ou "polinucleotídeo exógeno" ou "polinucleotídeo heterólogo" e outros referem- se a qualquer ácido nucléico que é introduzido no genoma de uma célula pelas manipulações experimentais, preferivelmente o genoma de trigo, mas que não naturalmente ocorre na célula. Estes incluem formas modificadas das sequências do gene observadas naquela célula contanto que o gene introduzido contenha alguma modificação, por exemplo uma mutação introduzida ou a presença de um gene marcador selecionável, relativo ao gene de ocorrência natural. Os genes estranhos ou exógenos podem ser genes observados na natureza que são inseridos em um organismo não natural, genes naturais introduzidos em uma nova localização dentro do hospedeiro natural, ou genes quiméricos ou construções genéticas. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. O termo "geneticamente modificado" inclui a introdução de genes nas células, genes de mutação nas células e alteração ou modulação da regulação de um gene em uma célula ou organismos em que estes procedimentos foram realizados ou sua progênie.

[0105] "Conectando operacionalmente" ao promotor ou elemento intensificador a um polinucleotídeo que pode ser transcrito significa colocar o polinucleotídeo que pode ser transcrito (por exemplo, polinucleotídeo que codificada a proteína ou outro transcrito) sob o controle regulador de um promotor, que então controla a transcrição daquele polinucleotídeo. Na construção das combinações do gene estrutural/promotor heterólogo, é geralmente preferida posicionar um promotor ou variante deste em uma distância a partir do local de início da transcrição do polinucleotídeo que pode ser transcrito, que é aproximadamente o mesmo como a distância entre aquele promotor e o gene controla em seu ajuste natural; isto é, o gene de que o promotor é derivado. Como é conhecido na técnica, alguma variação nesta distância pode ser acomodada sem a perda da função.

[0106] Com relação às plantas de cereal, como usado neste o termo "germinação" refere-se à emergência do coleorriza do revestimento de semente após inibição.

[0107] A "taxa de germinação" de uma semente refere-se à porcentagem das sementes em uma população que tem germinado em um período de tempo, por exemplo até 21 dias, ou no período 1 a 10 dias, após o início da inibição. Uma população das sementes pode ser avaliada diariamente em diversos dias para determinar a porcentagem de germinação no tempo. Certos aspectos da invenção dizem respeito a alteração/modulação da taxa de germinação da semente. Esta alteração/modulação pode ser transitória durante a vida total da semente. Por exemplo seguindo a coleta da semente da planta transgênica da invenção pode ter uma taxa alterada de germinação quando comparado a uma semente de uma planta não transgênica correspondente na coleta, entretanto, seguindo seis meses de armazenagem em um silo a semente da mesma planta transgênica da invenção pode ter a mesma taxa de germinação quando comparada a uma semente de uma planta não transgênica correspondente seguindo seis meses de armazenagem em um silo, ou vice versa. Em outras palavras, em algum ponto na vida total da semente terá uma taxa alterada da germinação quando comparada a um controle adequado (tipo selvagem ou não transgênico etc.) que foi exposto às mesmas condições.

[0108] Como usado neste, o termo "dormente" refere-se ao dano das sementes intactas viáveis da planta para germinar sob as condições favoráveis específicas, particularmente em termos da temperatura e na presença da umidade. A dormência é um traço quantitativo. Com relação a cevada e trigo, as sementes da planta são consideradas dormentes se menores do que 90 % das sementes intactas viáveis germinam após 7 dias a 20° C seguindo o início da inibição. As sementes viáveis são aquelas que são capazes de germinar após a quebra da dormência, por exemplo um período substancial (semanas ou meses) de armazenagem em temperatura ambiente ou tratamento por calor, bem conhecidas na técnica.

[0109] Como usado neste, o termo "não dormente" refere-se à capacidade das sementes de uma planta germinar sob as condições favoráveis especificadas. Com relação a cevada e trigo, as sementes da planta são consideradas não dormentes se pelo menos 90 % das sementes intactas viáveis germinam após 7 dias a 20° C seguindo o início da inibição.

[0110] Como usado neste, o termo "amplificação do ácido nucléico" refere-se a qualquer método in vitro para aumentar o número das cópias da molécula de ácido nucléico com o uso de um DNA polimerase. A amplificação do ácido nucléico resulta na incorporação dos nucleotídeos em uma molécula de DNA ou iniciador portanto formando uma nova molécula de DNA complementar a um padrão de DNA. A molécula de DNA recentemente formada pode ser usada como um padrão para sintetizar as moléculas de DNA adicionais.

[0111] A presente invenção inclui a produção de várias plantas transgênicas. Esta inclui, mas não são limitado a, plantas que tem um ou mais dos traços desejados exibidos pelas plantas de trigo da presente invenção.

[0112] As construções do ácido nucléico úteis para a produção das plantas transgênicas mencionadas acima podem ser prontamente produzidas usando as técnicas padrão. Para garantir a expressão apropriada do gene que codifica um mRNA de interesse, a construção do ácido nucléico tipicamente compreende um ou mais elementos reguladores tais como promotores, intensificadores, bem como terminação de transcrição ou sequências de poliadenilação. Tais elementos são bem conhecidos na técnica. A região de iniciação transcripcional compreende os elementos reguladores que podem fornecer a expressão regulada ou constitutiva na planta. Os elementos reguladores podem ser selecionados de, por exemplo, promotores específicos de semente, ou promotores não específicos pelas células de semente (tal como promotor de ubiquitina ou CaMV35S ou promotores 35S intensificados). Exemplos dos promotores específicos de semente úteis para a presente invenção incluem, mas não são limitado ao, promotor de glutenina de peso molecular baixo de trigo (Colot et al., 1987), a a-amilase que expressa o promotor nas sementes de trigo (Stefanov et al., 1991) e o promotor de hordeína (Brandt et al., 1985). O promotor pode ser modulado pelos fatores tal como temperatura, luz ou tensão. Comumente, os elementos reguladores serão fornecidos 5’ da sequência genética a ser expressada. A construção também pode conter outros elementos que intensificam transcrição tal como as regiões de poliadenilação nos 3’ ou os os 3’ ou terminadores de transcrição.

[0113] Tipicamente, a construção do ácido nucléico compreende um marcador selecionável. Os marcadores selecionáveis auxiliam na identificação e avaliação das plantas ou células que foram transformadas com a molécula de ácido nucléico exógena. O gene marcador selecionável pode fornecer a resistência de antibiótico ou herbicida a uma célula de trigo, ou permite a utilização dos substratos tal como manose. O marcador selecionável preferivelmente confere a resistência de higromicina a uma célula de trigo.

[0114] Preferivelmente, a construção do ácido nucléico é estavelmente incorporada no genoma da planta. Consequentemente, o ácido nucléico compreende elementos apropriados que permitem a molécula a ser incorporada no genoma, ou a construção é colocada em um vetor apropriado que pode ser incorporado em um cromossomo de uma célula vegetal.

[0115] Em uma forma de realização da presente invenção inclui um vetor recombinante, que inclui pelo menos uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção, inserida em qualquer vetor capaz de liberar a molécula de ácido nucléico em uma célula hospedeira. Um tal vetor contém as sequências do ácido nucléico heterólogas, que são as sequências do ácido nucléico que não são naturalmente observadas adjacentes a molécula de ácidos nucléicos da presente invenção e que preferivelmente são derivadas das espécies outras do que as espécies de que as moléculas de ácido nucléico são derivadas. O vetor pode ser RNA ou DNA, procariótico ou eucariótico e tipicamente é um vírus ou um plasmídeo.

[0116] Outra forma de realização da presente invenção inclui uma célula recombinante que compreende uma célula hospedeira transformada com uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção. A transformação da molécula de ácido nucléico em uma célula pode ser acompanhada por qualquer método pelo qual uma molécula de ácido nucléico pode ser inserida na célula. As técnicas de transformação incluem, mas não são limitado a, transfecção, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto. Uma célula recombinante pode permanecer unicelular ou pode desenvolver em um tecido, órgão ou um organismo multicelular. As moléculas de ácidos nucléicos transformadas da presente invenção podem permanecer extracromossomais ou podem integrar em um ou mais locais dentro de um cromossomo da célula transformada (isto é, recombinante) em uma tal maneira que sua capacidade de ser expressada é retida. As células hospedeiras preferidas são células vegetais, mais preferivelmente células da planta de cereal, mais preferivelmente células de cevada ou trigo e ainda mais preferivelmente uma célula de trigo.

[0117] Preferivelmente, a planta transgênica é uma planta de cereal. Os exemplos das plantas de cereal incluem, mas não são limitado a, trigo, cevada, aveias de sorgo e centeio. Mais preferivelmente, a planta de cereal é trigo ou cevada. Ainda em uma forma de realização preferida, a planta de cereal não é arroz.

[0118] As plantas transgênicas, como definidas no contexto da presente invenção incluem plantas e suas progênie que foram geneticamente modificadas usando as técnicas recombinantes. Este geralmente seria para modular a produção de pelo menos um polipeptídeo definido neste na planta desejada ou órgão da planta. As partes da planta transgênica incluem todas as partes e células das ditas plantas tal como, por exemplo, tecidos cultivados, calo e protoplastos. As plantas transformadas contém material genético que estas não contêm antes da transformação. O material genético é preferivelmente estavelmente integrado no genoma da planta. O material genético introduzido pode compreender as sequências que naturalmente ocorre nas mesmas espécies mas em uma ordem rearranjada ou em uma disposição diferente dos elementos, por exemplo uma sequência anti-sentido. Tais plantas são incluídas neste como “plantas transgênicas”. Uma “planta não transgênica” é uma que não foi geneticamente modificada com a introdução do material genético pelas técnicas de DNA recombinantes. Em uma forma de realização preferida, as plantas transgênicas são homozigóticas para cada e a cada gene que foi introduzido (transgene) de modo que sua progênie não segrega para o fenótipo desejado.

[0119] Diversas técnicas existem para a introdução do material genético estranho em uma célula vegetal. Tais técnicas incluem a aceleração do material genético revestido em micropartículas diretamente nas células (ver, por exemplo, U.S. 4.945.050 e U.S. 5.141.131). As plantas podem ser transformadas usando a tecnologia de Agrobacterium (ver, por exemplo, U.S. 5.177.010, U.S. 5.104.310, U.S. 5.004.863, U.S. 5.159.135). A tecnologia de eletroporação também foi usada para transformar as plantas (ver, por exemplo, WO 87/06614, U.S. 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 e WO 93/21335). Além disso às numerosas tecnologias para a transformação da plantas, o tipo do tecido que é contatado com os genes estranhos pode variar também. Tal tecido deve incluir mas não seria limitado ao tecido embriogênico, tipo I e II do tecido de calo, hipocotila, meristema, e outros. Quase todos os tecidos das plantas podem ser transformados durante o desenvolvimento e/ou diferenciação usando as técnicas apropriadas descritas neste.

[0120] Um número de vetores adequados para a transfecção estável das células vegetais ou para o estabelecimento das plantas transgênicas foram descritos em, por exemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; and Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, os vetores de expressão da planta incluem, por exemplo, um ou mais genes da planta clonados sob o controle transcripcional das sequências reguladoras 5’ e 3’ e um marcador selecionável dominante. Tais vetores de expressão da planta também podem conter uma região reguladora do promotor (por exemplo, uma região reguladora que controla a expressão indutível ou constitutiva, ambientalmente ou desenvolvimento regulado ou específico de tecido ou célula), um local de partida de iniciação de transcrição, um local de ligação de ribossomo, um sinal de processamento de RNA, um local de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.

[0121] Qualquer um de diversos métodos pode ser utilizados para determinar a presença de uma planta transformada. Por exemplo, a reação de cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as sequências que são únicas à planta transformada, com detecção dos produtos amplificados pela eletroforese em gel ou outros métodos. O DNA pode ser extraído a partir das plantas usando-se os métodos convencionais e a reação PCR realizada usando os iniciadores que distinguirá as plantas transformadas e não transformadas. Por exemplo, os iniciadores podem ser indicados que amplificarão uma região de DNA da leitura do vetor de transformação na construção e o iniciador reverso indicado do gene de interesse. Estes iniciadores apenas amplificarão um fragmento se a planta foi sucessivamente transformada. Um método alternativo para confirmar um transformante positivo é pela hibridização Southern blot, bem conhecido na técnica. As plantas que são transformadas também podem ser identificadas isto é distinguidas das plantas de tipo selvagem ou não transformadas por seu fenótipo, por exemplo, conferido pela presença de um gene marcador selecionável, ou conferido pelo fenótipo de uma dormência da semente desejada.

[0122] Os métodos para a transformação das plantas de cereal tais como trigo e cevada para a introdução da variação genética na planta pela introdução de um ácido nucléico exógeno e regeneração das plantas de protoplastos ou embriões de planta imaturos são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Wan and Lemaux (1994), Tingay et al., (1997), Pedido de Patente Canadense N°. 2.092.588, Pedido de Patente Australiano N° 61781/94, Patente Australiano N° 667939, Patente U.S. N°. 6.100.447, Pedido de Patente Internacional PCT/US97/10621, Patente U.S. N°. 5.589.617, Patente U.S. N°. 6.541.257 e outros métodos são apresentados na especificação da Patente WO99/14314. Preferivelmente, as plantas de trigo ou cevada transgênicas são produzidas pelos procedimentos de transformação mediados por Agrobacterium tumefaciens. Os vetores realizam a construção do ácido nucléico desejado podem ser introduzidos nas células de trigo regenerados das plantas cultivadas de tecido ou explantes, ou sistemas de planta adequados tais como protoplastos.

[0123] As células de trigo regeneradas são preferivelmente de escutelo dos embriões imaturos, embriões maduros, calo derivado destes, ou o tecido meristemático.

[0124] A seleção assistida pelo marcador é um método bem reconhecido de seleção para plantas heterozigotas requeridas quando retrocruzamento com um precursor recorrente em um programa de criação clássica. O retrocruzamento da população das plantas em cada geração será heterozigótico para o gene de interesse normalmente presente em uma razão 1:1 em um retrocruzamento de população e o marcador molecular pode ser usado para distinguir os dois alelos do gene. Para a extração de DNA de, por exemplo, os brotos jovens e teste com um marcador específico para a característica desejada submetida à introgressão, precocemente a seleção das plantas ainda para o retrocruzamento é feita enquanto a energia e recursos são concentrados em poucas plantas. Ainda para acelerar o programa retrocruzamento, o embrião das sementes imaturas (25 dias pós-antese) pode ser taxado e desenvolvido em um meio de nutriente sob as condições estéreis, antes do que permitindo a maturidade de semente total.

[0125] Qualquer técnica biológica molecular conhecida na técnica que é capaz de detectar os alelos Rht-B1 pode ser usada nos métodos da presente invenção. Tais métodos incluem, mas não são limitados ao uso da amplificação do ácido nucléico, sequenciamento do ácido nucléico, hibridização do ácido nucléico com as sondas rotuladas adequadas, análise de conformação de filamento simples (SSCA), eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE), análise heteroduplex (HET), análise de clivagem química (CCM), clivagem do ácido nucléico catalítico ou uma combinação deste (ver, por exemplo, Lemieux, 2000; Langridge et al., 2001). A invenção também inclui um uso das técnicas do marcador molecular para detectar os polimorfismos ligados aos alelos Rht-B1. Tais métodos incluem a detecção ou análise dos polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), RAPD, polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLP) e polimorfismos de microssatélite (repetição de sequência simples, SSR). Os marcadores firmemente ligados podem ser obtidos prontamente pelos métodos bem conhecidos na técnica, tal como Bulked Segregant Analysis, como revisto por Langridge et al., (2001).

[0126] Em toda parte desta especificação a palavra "compreende", ou variações tais como "que compreende" ou "compreendendo", serão entendidas implicar a inclusão de um elemento, inteiro ou etapa estabelecida, ou grupo dos elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo dos elementos, inteiros ou etapas.

[0127] Todas as publicações mencionadas nesta especificação são neste incorporadas por referência. Qualquer debate dos documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou outros que foram incluídos na presente especificação é unicamente para o propósito de fornecer um contexto para a presente invenção. Isto não deve ser tomado como uma admissão que qualquer um ou todos estes assuntos formam parte do fundamento da técnica anterior ou foram de conhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção quando existiu na Austrália ou qualquer lugar antes da data de prioridade de cada reivindicação deste pedido.

[0128] Como usado neste, especificação de assunto, as formas singulares "um", "uma" e "o" inclui os aspectos plurais a não ser o contexto claramente de outra maneira indicada. Deste modo, por exemplo, referência a "um" inclui um simples, bem como dois ou mais; a referência a "uma" inclui, um simples bem como dois ou mais; a referência a "o" inclui um simples, bem como dois ou mais apresentados.

[0129] Em geral, descrevendo a invenção, a mesma será mais prontamente entendida por referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos por meio de ilustração e não são pretendidos como limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1. Materiais e métodos Material vegetal

[0130] Os grãos da variedade de trigo alto Maringá (Rht-B1a) e uma linha anã quase isogênica (Rht-B1c) na base genética Maringá foram obtidos de Australian Winter Cereals Collection, Tamworth, NSW, Australia. Maringá é uma variedade de trigo de pão brasileira foi produzida por sete cruzamentos (BC7) com seleção recorrente do alelo anão (Rht-B1c) em Maringá (Hoogendoorn et al. 1988).

[0131] Cevada Himalaya e três derivados mutantes anões previamente caracterizados são descritos na tabela 1. As plantas foram desenvolvidas em uma estufa nos potes de 20 cm contendo uma mistura com base de composto sob a luz natural com extensão do comprimento do dia em 14 horas fornecidas durante os meses de inverno, ou no campo em Black Mountain ou na Ginninderra Experimental Station, ambos localizados em Canberra, Australia.

Mutagênese

[0132] O método para a mutagênese dos grãos de cevada e trigo foi uma simplificação de um procedimento previamente usado (Zwar and Chandler, 1995). 1 a 2 kg do grão de cada linha foram absorvidos duas vezes em sua massa de água a 4° C durante a noite. Estes foram transferidos aos cilindros medidos 2 litros enchidos com água e aerados com ar pressurizado por 8 h, com uma mudança de água fresca dada após 4 h. Os grãos foram então incubados por 2 h em azida de Na 1 mM recentemente preparados no tampão de fosfato de 0,1 M K pH 3,0 e então lavado extensivamente em água corrente por 2 h, colocado em uma capela de fumigação para secar durante a noite e semear no campo dentro de diversos dias de tratamento.

[0133] Construção de linhas derivadas que carregam alelos de super- desenvolvimento

[0134] Os alelos super-desenvolvidos de cevada foram retrocruzados, intercruzados e cruzados com cepas diferentes para gerar uma série de linhas adequadas para a caracterização fisiológica detalhada. Quatro dos novos alelos de Sln1 super-desenvolvidos ocorridos em bases de nanismo grd2b ou gse1n e foram cruzados novamente duas gerações aos fenótipos de WT permitindo a comparação dos super-desenvolvimentos em bases altas e anãs. A perda do alelo de nanismo original foi confirmada por PCR. Os sete novos alelos de super-desenvolvimento de Sln1 ocorreram na base anã de Sln1d e quatro destes (Sln1d.7, Sln1d.8, Sln1d.9 e TR103) ocorreram através das duas gerações de retrocruzamento ao WT.

Produção de a-Amilase por meio-grãos de endosperma

[0135] Os meio-grãos de endosperma foram preparados e incubados com ou sem GA3 (1 µM) a 22° C por 0, 42 ou 72 h. A cada amostra, 1,5 mL da solução de 10 mm de CaCl2 foram adicionados, os meio-grãos foram homogeneizados e uma alíquota de 1 mL foi purificada pela centrifugação (20.000 g por 5 min). O sobrenadante foi analisado pela atividade de a- amilase usando o procedimento de Megazyme alfa-amilase (Ceralpha).

Avaliação da dormência de grão

[0136] As plantas foram desenvolvidas como setas simples no campo e as cabeças foram examinadas duas vezes por semana para monitorar a secagem. Quando toda a cor verde foi perdida das cabeças, estas foram julgadas ser fisiologicamente maduras e foram taxadas e levadas ao laboratório. As cabeças foram colocadas em uma capela de fumigação por 48 h para promover a secagem final, especialmente dos grãos basais que tendem a permanecer úmidos e foram então debulhados manualmente. Os grãos foram colocados em um envelope manila e deixados no ambiente laboratorial pelos períodos diferentes de pós-maturação. A germinação foi avaliada pela incubação de 100 grãos de cada linha no papel de filtro úmido em um ambiente 20° C com iluminação de fluorescente de intensidade baixa. A porcentagem da germinação de cada amostra do grão foi avaliada após 7 dias de incubação. A germinação foi definida neste contexto como emergência da radícula da raiz do revestimento de semente. Em um primeiro experimento sazonal, muitas amostras dos grãos, especialmente das plantas de trigo altas, mostraram dormência baixa e existe a germinação considerável (pelo menos 50 % dos grãos germinados) após apenas 13 a 19 dias pós-maturação. Estas linhas foram não foram geralmente testadas novamente. Outras amostras de grãos tem germinação baixa após 13 a 19 dias pós-maturação e estas foram testadas novamente após 32 a 33 dias e se a germinação ainda foi baixa, novamente após 48 a 49 dias pós-maturação. As contagens de registros de dormência relativa foram dados em uma escala de 1 (menos dormente) a 4 (dormência mais alta).

[0137] Em um segundo experimento sazonal, as estimativas de dormência focalizadas em linhas semianãs e de controle e a germinação foi determinada semanalmente a partir da coleta até a dormência ser perdida ou até 12 semanas pós-maturação. Um exemplo dos resultados de um teste de dormência de grão é dado na Figura 9. Uma medida da dormência de grão foi determinada como o número de semanas de armazenagem do grão (também denominado “pós-maturação”) em temperatura ambiente na ordem de pelo menos 50 % dos grãos em uma população de grãos para germinar, como estimado pelo método descrito no parágrafo prévio.

Comprimentos de Coleóptilo de linhas de superdesenvolvimento de cevada e trigo

[0138] Os comprimentos de coleóptilo foram determinados em mudas trigo e cevada após 21 dias de desenvolvimento no escuro com um programa de temperatura diário de 12 h a 12° C e 12 h a 8° C, na presença de fornecimentos totalmente adequados de água.

[0139] Emergência a partir da semeadura profunda sob condições secas.

[0140] As amostras de grãos foram semeadas em uma profundidade de 10 cm no solo (solo de pote padrão) na estufa. O teor de umidade do solo inicial foi de 12 a 14 % (p/p). A germinação, desenvolvimento precoce e estabelecimento da muda, até a emergência da terceira folha, ocorreu sem qualquer irrigação adicional para simular condições de solo seco no campo. A porcentagem de grão que produziram mudas emergidas e o tempo de emergência foram avaliados.

Taxas de alongamento de folha e curvas de resposta de dose de GA

[0141] Os métodos foram previamente descritos (Chandler and Robertson, 1999). As curvas foram adaptadas aos pontos de dados usando-se uma equação de Hill de 4 parâmetros.

Medições do comprimento da raiz

[0142] O desenvolvimento de raiz é estimado sob condições controladas e no desenvolvimento de plantas no campo. No primeiro caso, os comprimentos da raiz são estimados por varredura, enquanto no campo, núcleos de 2 m são retirados e os números de raiz estimados em intervalos de 10 cm ao longo dos núcleos.

Amplificação por PCR de DNA e sequenciamento

[0143] O DNA foi preparado a partir das folhas de cevada ou trigo pelo método de Ellis et al., 2005. As sequências de trigo foram amplificadas usado-se pares iniciadores em que um iniciador foi específico para o gene Rht-B1 (Tabela 2). A metade 3’ do gene foi amplificada usando-se iniciadores avançados e iniciadores reversos conservados que foram específicos para as sequências de gene B na região 3’ UT. A amplificação por PCR das sequências de cevada usaram iniciadores específicos para os genes Sln1, Spy1 e Gse1. Os fragmentos amplificados foram tratados com Exosap-IT (Affymetrix) para remover os iniciadores e então sequenciados usando-se Big Dye Terminator (Applied Biosystems).

Sequências de DNA

[0144] As sequências dos genes Rht-A1a, Rht-B1a e Rht-D1b de trigo e as proteínas codificadas deste modo estão nas acessões JF930277, JF930278 e JF930281 respectivamente. As sequências de aminoácido são alinhadas por ClustalW, msotrando os aminoácidos que diferem (Figura 7). A sequência de nucleotídeo parcial do gene Rht3-B1c no derivado Maringá anão é mostrado na SEQ ID N° 1.

[0145] A sequência da proteína Rht-B1c codificada pelo alelo Rht- B1c e mostrada na SEQ ID N° 3.

[0146] As acessões de sequência para os genes Sln1 e Spy1 de cevada são AK372064 e AF035820 respectivamente.

Exemplo 2. Isolamento de mutantes de trigo que compreendem novos alelos de Rht-B1

[0147] Grãos de um trigo variedade Maringá, que compreenderam um alelo Rht-B1c causaram nanismo vegetal grave, foram tratados com azida de sódio como descrito no Exemplo 1. Os grãos mutagenizados foram semeados no campo e as plantas M1 resultantes permitidas auto-fertilizar. Grãos M2 foram coletados das plantas M1 na maturidade. As sementes M2 foram semeadas no campo ou em densidade alta em planos (Figura 1) na estufa e avaliados quanto à altura aumentada durante o desenvolvimento precoce ou quando maturam no campo. Cerca de 1,6 milhões de plantas M2 foram avaliadas por estes métodos. A Figura 1 mostra como os mutantes podem ser facilmente identificados. Aproximadamente 400 plantas foram selecionadas apresentando taxas de alongamento de folha precoce ou altura de planta madura que variou de levemente maior do que a variedade Maringá precursora anã (Rht-B1c) a tão altas quanto as plantas Rht-B1a (alelo do tipo selvagem) quase isogênicas. Estes foram alto-fertilizados e as plantas da progênie desenvolvidas sob condições controladas e comparadas com as plantas precursoras (Rht-B1c) e do tipo selvagem (Rht-B1a) (Figura 2). Estas plantas foram denominadas “mutantes com crescimento excessivo” porque estas se desenvolveram em taxas aumentadas ou até a altura madura aumentada com relação à variedade precursora.

[0148] A mutação do nanismo no alelo Rht-B1c ocorreu devido a uma inserção de 2026bp no gene Rht-B1 em Maringá (Wu et al., 2011). O teste PCR revelou que cerca da metade das 400 plantas mutantes selecionadas foi positiva quanto à presença da inserção neste gene; tais plantas retiveram um gene Rht-B1. O remanescente das plantas selecionadas foi negativo quanto ao ensaio de PCR e pareceu perder o gene Rht-B1 totalmente, embora o gene homólogo codificado pelo genoma D (Rht-D1) ainda esteve presente com base nas amplificações de PCR positivas. Muitos neste último grupo tiveram alterações morfológicas distintas e fertilidade de espiga deficientes. É provável que estes representaram anulações do gene Rht-B1 junto com quantidades variantes de DNA cromossomo flanqueador. Estas linhas de anulação ainda não foram estudadas.

[0149] O gene Rht-B1 em cada um dos 139 mutantes que não de anulação foi sequenciado pela amplificação das regiões do gene por PCR. Trinta e cinco alelos derivados de Rht-B1c foram identificados, cada variante do alelo Rht-B1c em Maringá. Estes foram denominados Rht-B1c.1, Rht- B1c.2, Rht-B1c.3 etc. Estes são listados na Tabela 3. Muitos dos 35 alelos foram representados por linhas múltiplas contendo uma mutação específica idêntica. Em alguns casos, estas linhas múltiplas podem ser irmãs, visto que em outros casos estes pode ter eventos mutacionais independentes representados. Houve um total de 62 eventos independentes que geraram os 35 alelos.

[0150] Os mutantes apresentaram três classes diferentes de mutante responsável para o fenótipo de super-desenvolvimento. Em uma primeira classe, dez alelos compreenderam códons de terminação de tradução prematura no gene Rht-B1. Na maioria dos casos, o códon mutante foi de um códon TGG (que codifica Trp) a um TGA (códon de interrupção). Na cevada, os códons de interrupção prematuros em DELLA resultaram em um fenótipo delgado alongado e esterilidade masculina. Em contraste, as plantas destas dez linhas de trigo mutantes, com uma exceção, desenvolveram-se a uma altura que foi a mesma ou quase a da isolinha alta (tipo selvagem) e apresentou uma fertilidade similar ao tipo selvagem. Presumivelmente, a expressão das proteínas Rht-1 de genoma A e/ou D naqueles mutantes forneceram compensação genética para os genes mutantes nulos de genoma B e limitaram a expressão fenotípica ‘alta’ em vez de ‘delgada”. A única exceção, plantas do único Rht-B1c.22 representativo (linha TR544) foram semianões em vez de ‘altas’. Este fenótipo deve ocorrer devido à união alterada do gene Rht-B1c.22 mutado nestas plantas que geraram uma proteína Rht-B1 com uma inserção em estrutura diferente (debatida abaixo).

[0151] A segunda classe compreendeu substituições de aminoácido na proteína Rht-B1 codificada pelo genoma B. Vinte exemplos são listados na Tabela 3. Foi de interesse comparar estas 20 substituições as mutantes de substituição DELLA isolados em cevada (Exemplo 5), ver Figura 3. Através das duas espécies, houveram 31 substituições simples de aminoácido, incluindo quatro locais onde as mudanças de aminoácido idênticas ocorreram. Foi observado que mutações idênticas, ainda que independentes, ocorreram dentro da cevada e dentro do trigo, onde a mesma mutação foi observada em posições correspondentes em linhas derivadas de subpopulações diferentes de grãos M2.

[0152] A Figura 3 mostra esquematicamente os locais de substituições de aminoácido nos mutantes com relação à posição de motivos conservados na região C-terminal das proteínas de cevada e trigo. A observação que as mutações superdesenvolvidas foram distribuídas pela maior parte da região C- terminal indicada aqui foi o potencial considerável para as alterações na ligação das proteínas DELLA para interagir os parceiros da proteína.

[0153] A terceira classe de mutantes incluiu 5 alelos cada um contendo uma mutação em regiões de Rht-B1 preditos estarem envolvidos na excisão da maioria da inserção no gene Rht-B1 que gerou o alelo Rht-B1c (Tabela 3). Cada um destes alelos afetou um dos quatro nucleotídeos imediatamente adjacentes ao doador de união e locais receptores. Em alguns casos incluindo o alelo Rht-B1c.22 e dependendo do que, o software de predição de união foi usado, houve o potencial para estas alterações de sequência para alterar o local preferido de união, desse modo, gerando as proteínas Rht-B1 com inserções em estrutura levemente maiores ou menores. Estes alelos de união produziram presumivelmente menos da proteína Rht-B1 contendo a inserção de 30 aminoácidos e/ou produziram proteínas Rht-B1 modificadas com inserções na estrutura alteradas. Evidência experimental para a alteração na eficiência de união foi obtida pelo exame do RNA pelos métodos de RT-PCR.

Exemplo 3. Teste fenotípico de mutantes de trigo compreendendo novos alelos de Rht-B1

[0154] Os mutantes com crescimento excessivo de trigo compreendendo novos alelos de Rht-B1 foram testados quanto a diversas características que foram relevantes para aplicações práticas no campo para a produção de trigo comercial. Os comprimentos de caules maduros, os comprimentos dos coleóptilos e a dormência de grão relativa para o grão obtido a partir das plantas mutantes foram medidos e comparados com as plantas de controle. Os dados estão incluídos na Tabela 4. Os comprimentos do caule de plantas madura foram estimados em condições de campo irrigado diferentes (isto é, bem irrigados) e em estações diferentes. Na maioria dos casos, quatro pontos de dados independentes foram obtidos e usados para calcular as médias mostradas na Tabela 4, que são expressados como uma porcentagem relativa às plantas Rht-B1a. Os alelos diferentes levaram a comprimentos de ramos diferentes, com alguns exemplos (por exemplo Rht- B1c.6, c.8, c.21) sendo quase tornadas anãs e outras (Rht-B1c.11, c.25, c.31) tão altas quanto à isolinha Rht-B1a. Na maioria dos casos, houve pouca variação entre as linhas que carregaram o mesmo alelo. Com base no semi- nanismo observado para plantas da isolinha Rht-B1b sendo de aproximadamente a altura de 81 % das plantas do tipo selvagem (altas), houveram 15 novos alelos que causaram uma extensão similar de nanismo, por exemplo, na faixa de 75 a 91 % da altura alta.

[0155] Os comprimentos de Coleóptilo também foram medidos para as plantas mutantes e calculadas como uma porcentagem do comprimento de coleóptilo médio para plantas Rht-B1a. Os valores das médias entre 2 e 4 medições independentes são mostradas na Tabela 4. Houve mais variação para os comprimentos de coleóptilo dentro de uma linha do que observado para o comprimento de caule. Em parte, isto pode ter relação com as diferenças entre os grãos de fontes do campo e de estufa. Os grãos desenvolvidos no campo estão disponíveis para a vasta maioria de linhas na estação de plantio seguinte e medições de coleóptilo adicionais são realizadas. É esperado que estes mostrem menos variação. Em geral, houve uma correlação positiva geral entre os comprimentos de caule e comprimentos de coleóptilo. Trabalho adicional é requerido para estimar a significância estatística de diferenças em alguns casos onde a correlação parece quebrar.

[0156] A dormência de grãos da maioria das linhas mutantes foi estimada para o grão coletado a partir de duas estações no campo. Em ambas as estações, as isolinhas Maringá altas e Rht-B1b mostraram dormência baixa visto que a isolinha Rht-B1c teve dormência relativamente alta. Houveram diferenças consideráveis em registros de dormência de grão relativos entre as linhas de superdesenvolvimento diferente. Os são apresentados na Figura 9 para algumas das linhas, em comparação com os controles. Foram de interesse particular os alelos que forneceram uma altura de planta semianã adequada e que retiveram dormência de grão considerável, tal como Rht- B1c.9, c.17, c.22, c.23, c.24, c.26, c.27). Estes incluíram as quatro linhas semianãs sendo correntemente retrocruzados nas variedades de elite.

[0157] Muitas das linhas foram testadas em uma terceira estação no campo. Os dados para o registro de altura e dormência da planta são mostrados na Tabela 8. Os resultados foram consistentes na tendência com as duas estações prévias, mostrando que o grão de algumas linhas mutantes requeridas consideravelmente mais longas em armazenamento (“pós- maturação”) para 50 % dos grãos germinaram no teste de germinação padrão (Exemplo 1). Embora a tendência em dormência entre as linhas e os controles tenha sido a mesma de estação para estação, os números absolutos para qualquer linha variaram de estação para estação.

Exemplo 4. Isolamento de mutantes com crescimento excessivo em cevada

[0158] Para isolar os mutantes com crescimento excessivo em cevada, três mutantes anões de cevada do ‘Himalaya’ foram escolhidas como o material de partida. Cada mutante compreendeu uma substituição de nucleotídeo simples definida em um gene envolvido em (i) biossíntese de GA, isto é Grd2 que codifica GA3-oxidase, (ii) o receptor de GA ‘GID1’, codificado pelo gene Gse1 e (iii) resposta de GA, isto é, o gene Sln1 que codifica a proteína DELLA em cevada. Os grãos de cada linha anã foram tratados com azida de sódio, semeados no campo e deixados auto-fertilizar para produzir semente M1. Estas foram semeadas para produzir plantas M1, a partir das quais os grãos M2 foram coletados. As mudas M2 resultantes que desenvolvem-se no solo foram avaliadas no segundo estágio de folha para aqueles que mostram desenvolvimento mais rápido do que suas irmãs anãs. Três categorias diferentes de mutante foram recuperadas de um total de cerca de 106 grãos semeados, representado cerca de 50.000 espigas de M1.

[0159] A primeira categoria, de mais relevância para esta aplicação, incluiu 22 plantas que se desenvolveram mais rapidamente do que suas irmãs anãs. Estas foram totalmente férteis e suas plantas de progênie foram uniformes e mostraram desenvolvimento rápido. Em cada caso, a presença da mutação do nanismo original foi confirmada pelo sequenciamento do fragmento de PCR apropriado. Suas taxas de alongamento de folha foram maiores do que o esperado com base em uma mutação de nanismo estando presente. Estes apresentaram uma faixa em extensão de intensificação do desenvolvimento, alguns com taxas de alongamento de folha levemente, mas significantemente, mais rápida do que sua precursora anã e outras que alongaram tão rápido quando ou ainda levemente mais rápido do que as plantas do tipo selvagem altas (ver abaixo). As alturas na maturidade dos mutantes diferentes com crescimento excessivo variaram de intermediárias entre precursora anã e tipo selvagem a tão alta quanto o tipo selvagem.

[0160] A segunda categoria, recuperada apenas na base anã Sln1d, incluiu três plantas que desenvolveram-se mais rapidamente do que suas irmãs tornadas anãs mas ainda retiveram algum grau de nanismo. Na geração seguinte, a progênie destas plantas consistiu de plantas anãs e delgadas alongadas típicas em uma razão aproximada de 3:1. A análise adicional (abaixo) mostrou que estes compreenderam novos alelos de sln1 em que uma segunda mutação funcionou como um supressor intragênico da mutação Sln1d.

[0161] A terceira categoria, observada na biossíntese de GA e bases anãs de receptor de GA, consistiram de mutantes delgados alongados típicos. Estes foram facilmente reconhecidos por seu fenótipo alongado altamente característico e cor verde clara e, seguindo o transplante, por seus caules altamente alongados e esterilidade. Esta classe de mutante foi esperada porque os alelos nulos sln1 alongados são epistáticos a defeitos na biossíntese de GA ou função receptora de GA (Chandler and Robertson, 1999).

Exemplo 5. Identificação das mutações de cevada e estudos de ligação genética

[0162] O DNA foi preparado a partir de plantas delgadas das três linhas segregadoras na base anã Sln1d (segunda categoria acima) e o gene Sln1 foi sequenciado. As plantas de cada linha continham uma nova mutação diferente no gene Sln1 resultando em um códon de terminação de tradução prematura dentro da estrutura de leitura aberta (ORF). Os novos alelos mutantes foram derivados de Sln1d e, portanto, foram denominados Sln1d.1, Sln1d.2, Sln1d.3 (Tabela 1). Estes representaram novas mutações intra- alélicas, onde uma segunda mutação converteu os locais de nanismo Sln1d em um alelo sln1 alongado de perda de função típica. Estas plantas ainda não foram estudadas.

[0163] O gene Sln1 total foi sequenciado em cada um dos mutantes com crescimento excessivo (primeira categoria acima), para confirmar que o alelo Sln1d ainda esteve presente e determina se outras mutações ocorreram neste gene visto que foi um de diversos genes candidatos em que uma nova mutação deve levar a um fenótipo superdesenvolvido. Novas mutações no Sln1 ORF foram observados em 20 das 22 plantas. As mutações definiram onze novos alelos do gene Sln1. Algumas das plantas carregaram mutações idênticas e foram presumivelmente irmãs. Sete dos novos alelos superdesenvolvidos Sln1 ocorreram na base anã Sln1d e foram, portanto, alelos que compreendem mutações supressoras intra-gênicas. Estes foram denominados Sln1d.4 - Sln1d.10. Três mutações ocorreram na base grd2b (sln1m, sln1o, sln1s) e uma ocorreu na base de gse1n (sln1n). Cada um dos novos alelos diferiu de seu alelo parental por uma substituição de nucleotídeo simples que resultou em uma substituição de aminoácido simples na sequência de proteína SLN1. As substituições de aminoácido que foram obtidas são listadas na Tabela 1 (linhas TR). Estes todos ocorreram no terminal C 60 % da proteína SLN1, correspondente ao domínio GRAS e todos estes corresponderam às mutações análogas nos mutantes de trigo descritos acima. Dois eventos mutacionais idênticos foram observados resultando na substituição de aminoácido G829A, um ocorrendo na população de mutante Sln1d.7 e o outro na população sln1s. Estes foram eventos mutacionais independentes visto que o primeiro foi um derivado do alelo Sln1d, visto que o último ocorreu em um gene Sln1 tipo selvagem na base anã grd2b.

[0164] As duas linhas superdesenvolvidas remanescentes (TR26, TR103) perderam qualquer mutação nova no Sln1 ORF e representaram potencialmente mutações em outros genes. Estes ocorreram em uma base anã Sln1d. As plantas destas linhas foram cruzadas com Himalaya, junto com Sln1d.5 como um controle positivo, para estimar a ligação genética entre o alelo de nanismo Sln1d e o novo alelo de super-desenvolvimento. A população de F2 do cruzamento de controle WT x Sln1d.5 mostrou a distribuição de 3:1 (Sln1d.5:WT) esperada em taxas de alongamento de folha máximas. Não houveram indivíduos F2 com a taxa de desenvolvimento lenta Sln1d precursor, indicando a ligação completa nesta população relativamente pequena entre a mutação de nanismo original e a mutação superdesenvolvida secundária. A mutação secundária foi, portanto, uma mutação supressora intra-gênica. Um resultado similar foi observado para a população TR103 x WT F2, indicando que a mutação superdesenvolvida em TR103 mostrou a ligação completa a Sln1d. Em contraste, a população TR26 x WT F2 incluiu uma maioria de mudas com taxas de desenvolvimento do mesmo como Sln1d, cerca de 25 % com taxas de desenvolvimento do mesmo como WT e algumas mudas com as taxas de desenvolvimento intermediárias. Estes resultados foram consistentes com a mutação superdesenvolvida no TR26 estando em um gene que foi desligado do Sln1.

[0165] Diversos outros genes sinalizadores de GA candidatos em TR26 foram sequenciados. O receptor GA (Gse1) e dois genes candidatos F- box foram os mesmos em sequência como no tipo selvagem, mas a sequência de Spindly1 revelou uma substituição de nucleotídeo simples (spy1a, Tabela 1) que resultou em uma substituição de aminoácido no sexto motivo TPR de SPY1. Em Arabidopsis, esta região é importante para a atividade de SPY porque esta inclui os diversos alelos mutantes (Silverstone et al., 2007). SPY1 codifica um regulador negativo de sinalização de GA que foi primeiro identificado em Arabidopsis, mas os genes funcionalmente relacionados foram mostrados por último existir em cevada (Robertson et al., 1998) e arroz (Shimada et al., 2006).

[0166] Em resumo, os 22 mutantes de cevada com crescimento excessivo representaram 13 eventos mutacionais independentes. Onze destes foram novos alelos Sln1 que causaram substituições de aminoácido simples em SLN1. O décimo segundo foi estreitamente ligado ao Sln1 mas em uma região não identificada, possivelmente uma mutação de promotor e o décimo terceiro foi um novo alelo em um gene não ligado, Spy1.

Exemplo 6. Taxas de alongamento de folha de cevada compreendendo novos alelos Sln1

[0167] A taxa diária máxima de alongamento (LERmax) atingida pela folha sob condições padrão foi uma medida robusta de responsividade de GA (Chandler and Robertson, 1999) e foi, portanto, determinado para todas as linhas de super-desenvolvimento de cevada e seus precursores (Tabela 5). As treze linhas de super-desenvolvimento originais tiveram todas valores LERmax significantemente mais altas do que seu precursor anão respectivo, embora a extensão da intensificação do desenvolvimento tenha variado de uma maneira dependente de alelo. Três alelos de superdesenvolvimento (sln1m, sln1n e sln1s) foram comparados tanto em sua base genética de nanismo original quanto após retrocruzamento à base WT alta. As taxas de desenvolvimento foram consistentemente menores em bases anãs, indicando que os alelos de superdesenvolvimento ainda foram submetidos à sinalização de GA diminuída resultando da biossíntese de GA impedida ou função de receptor de GA. Em uma base do tipo selvagem, os alelos de superdesenvolvimento tenderam a intensificar as taxas de desenvolvimento.

Exemplo 7. Produção de a-amilase por meio-grãos de endosperma

[0168] A produção de a-amilase por meio-grãos de endosperma de cevada do tipo selvagem é dependente da presença de um GA ativo. Portanto, monitoramento da atividade de a-amilase na ausência de um GA ativo forneceu uma medida conveniente da extensão de sinalização de GA ‘basal’ nos mutantes. As duas linhas de controle com sensibilidade de GA normal (WT, grd2b) mostrou um aumento de quase 15 vezes em atividade de a- amilase em níveis basais após 72 h de incubação com GA3 (Tabela 5). Quando mutantes com crescimento excessivo e seus precursores anões foram examinados, a quantidade inicial de atividade de a-amilase em meio-grãos de endosperma maduro foi muito baixa, mas com incubação de algumas linhas de superdesenvolvimento (Sln1d.4, Sln1d.7, Sln1d.8, Sln1d.9; Sln1d,spy1a; grd2b,sln1m; grd2b,sln1o; grd2b,sln1s) mostraram a produção intensificada de a-amilase com relação a seu precursor anão, visto que outros (Sln1d.5, Sln1d.6, Sln1d.10; gse1n,sln1n) não. Entre os derivados de superdesenvolvimento de Sln1d, o derivado de Sln1d.9 foi excepcional, acumulando níveis muito altos de a-amilase tanto em 42 h quanto em 72 h de incubação, a despeito desta linha que mostra apenas uma restauração modesta de taxa de desenvolvimento (Tabela 5).

Exemplo 8. Outras características associadas cm alelos de superdesenvolvimento

[0169] As plantas das linhas de superdesenvolvimento foram próximas ao normal em aparência durante o desenvolvimento e na maturidade, à parte das diferenças em altura total. Houve uma faixa em alturas entre os nove derivados de superdesenvolvimento de Sln1d, embora nenhum tenha sido tão alto quanto o tipo selvagem em maturidade. Os comprimentos de coleóptilo de linhas de superdesenvolvimento variaram em geral, de acordo com os valores LERmax e com altura de planta final.

[0170] Uma característica geral das plantas de cevada mutantes de superdesenvolvimento foi que estes produziram grãos maiores do que seus precursores anões. Em coletas diferentes através de estações de desenvolvimento diferentes, os tamanhos de grãos foram geralmente intermediários entre o anão parental (massa de grão de cerca de 40 mg) e o tipo selvagem alto (massa de grão de cerca de 55 mg). Entretanto, diversas das linhas de superdesenvolvimento que foram tão altas quando o tipo selvagem em maturidade teve cabeças e grãos consideravelmente maior. Em gerações de estufa diferentes, os grãos de grd2b e sln1m produziram 40 % mais do que aqueles do precursor anão de grd2b. Quando retrocruzado com a base Himalaya, houve um aumento médio de 20 % observado no peso do grão e no cruzamento com cepas diferentes com a variedade comercial Sloop, um aumento de 15 % foi observado em material BC2. Uma análise total é feita quando linhas irmãs BC3 de Sloop estão disponíveis.

Exemplo 9. Descrição de alguns marcadores perfeitos

[0171] Os novos alelos de Rht-B1c em trigo ou cevada são facilmente introduzidos em programas de criação e podem ser seguidos pela seleção auxiliada por marcador usando-se um marcador perfeito genérico para os alelos de superdesenvolvimento. Por exemplo, para trigo, este envolve a amplificação de PCR entre os dois iniciadores, um dos quais está na inserção de 2062bp no gene Rht-B1c e os outros que estão fora da inserção, tal como na região codificadora de Rht-B1. A amplificação do produto apropriado ocorrerá apenas quando o DNA padrão é do material vegetal que contém pelo menos uma cópia do alelo de superdesenvolvimento. Dois exemplos destes são dados na Tabela 2. Estas amplificações podem ser usadas para distinguir facilmente os novos alelos derivados de Rht-B1c do outro alelo de seminanismo Rht-B1b e o gene de seminanismo Rht-D1b. os marcadores para o outro gene Rht-B1 que não o alelo Rht-B1c ou seus alelos derivados podem ser gerados facilmente usando-se um par de iniciador que flanqueia o local de inserção em Rht-B1c.

Exemplo 10. Retrocruzamento de alelos selecionados a outras variedades de trigo

[0172] Os estudos de cruzamento em cevada como descrito acima mostraram 100 % de co-hereditariedade entre o alelo mutante Rht-B1s e o fenótipo de superdesenvolvimento. No trigo, dois experimentos de cruzamento foram realizados. No primeiro, as plantas de seis linhas de superdesenvolvimento foram cruzadas com homozigóticoos de Maringá para o alelo de Rht-B1b (semianão) e plantas de outras quatro linhas foram cruzadas com o homozigóticos de Maringá para o alelo Rht-B1a do tipo selvagem (alto). A progênie F1 foi autopolinizada para produzir plantas F2. Em caso algum houve a presença de qualquer planta anã (Rht-B1c homozigótica) detectada na geração de F2, indicando que para cada uma das dez linhas, 100 % de ligação genética foi observada entre o novo alelo Rht- B1s e o fenótipo de superdesenvolvimento e a nova mutação que suprime o nanismo ocorreu no gene Rht-B1 em vez de estar em qualquer lugar no genoma. Nos cruzamentos com Rht-B1b, os padrões de hereditariedade esperados foram mostrados para os alelos de superdesenvolvimento e Rht-B1b na progênie de F2, isto é uma razão de 1:2:1 homozigótico : heterozigoto : homozigótico. Em um dos cruzamentos, o precursor de superdesenvolvimento (linha TR550, Rht-B1c.8) foi consideravelmente observado mais transformado em anão do que Rht-B1b e a população de F2 mostrou segregação quanto à altura (superdesenvolvimento de homozigótico = 65 cm, heterozigoto = 80 a 85 cm, homozigótico Rht-B1b = 95 a 100 cm) em uma razão não significantemente diferente de 1:2:1, que indica o fenótipo foi determinado por uma diferença de gene simples. De maneira importante, este alelo de desenvolvimento moderadamente transformado em anão foi associado com dormência alta na linha TR550. Além disso, as populações de grão F3 das plantas F2 desenvolvidas no campo F2 mostraram dormência alta para plantas F2 homozigóticas Rht-B1c.8, dormência intermediária para plantas F2 homozigóticas Rht-B1c.8/Rht-B1b e dormência baixa para plantas F2 homozigóticas Rht-B1b. Este resultado indicou que o alelo de superdesenvolvimento foi determinante tanto dos fenótipos de altura quanto de dormência após o cruzamento.

[0173] As quatro linhas cruzadas com Maringá Rht-B1a foram as linhas denominadas 544, 612, 705 e 791 (Tabela 4), que compreendem o alelo Rht-B1s Rht-B1c.22, RhtB1c.23, Rht-B1c.24 e Rht-B1c.26, respectivamente. Em cada caso, a razão de segregação genotípica esperada foi observada na geração F2. As plantas F2 homozigóticas para o alelo de superdesenvolvimento mostrou a redução de altura esperada e a dormência intensificada, indicando que o alelo Rht-B1s mutante pode ser cruzado em outras bases genéticas e retém o efeito fenotípico. Isto também indicou a ligação genética dos dois fenótipos, isto é, a altura da planta semianã e a dormência intensificada, causada pelo alelo mutante Rht-B1s.

[0174] No segundo experimento, os alelos de superdesenvolvimento selecionados foram introduzidos nas linhas de criação de elite pelo retrocruzamento, com a intenção de substituir seu gene de seminanismo existente (Rht-B1b ou Rht-D1b) com um novo alelo de superdesenvolvimento. Isto foi realizado a fim de combinar o fenótipo de altura de semianã em maturidade com outras características benéficas, tais como emergência melhorada e níveis mais altos de dormência do grão. Os cruzamentos foram feitos usando-se plantas das linhas 544, 612, 705 e 791 como doadores de pólen com plantas de 10 variedades de trigo de elite diferentes, isto é Crusader, EGA Gregory, Espada, Lincoln, Magenta, Yitpi, Young, KWS Chasmin, KWS Scirocco, McNeal e Outlook. Os grãos F1 foram obtidos a partir de todos os cruzamentos e para os três alelos doadores foram semeados para o retro-cruzamento adicional para os precursores recorrentes. Os marcadores de PCR foram usados para confirmar que as plantas F1 foram híbridas. Um dos quatro doadores foi levemente mais alto do que as plantas tendo Rht-B1b, mas três dos quatro doadores foram muito similares em altura um ao outro e às plantas tendo Rht-B1b (semianãs). Um ou dois alelos adicionais que são levemente mais transformados em anões do que Rht-B1b e tendo dormência de grão excelente estão incluídos nos experimentos de cruzamento, tais como Rht-B1c.3 e/ou Rht-B1c.17.

Debate

[0175] Os mutantes com crescimento excessivo de cevada e trigo foram isolados seguindo a mutagênese de variedades anãs contendo um alelo de que transforma gravemente em anão. Os mutantes de interesse retiveram a mutação que causou a transformação em anão grave nas variedades parentais, mas desenvolveram-se mais rápido do que as plantas parentais por causa de uma mutação recentemente induzida no mesmo gene Rht-B1 ou Sln1. Estes foram caracterizados pela sinalização de GA intensificada, embora a extensão da intensificação foi específica tanto para o alelo quanto a resposta de GA sendo considerados. Os resultados indicaram que os genes Della (Sln1 em cevada, Rht-B1 em trigo) foram os locais mais frequentes de superdesenvolvimento. Em apenas um único caso houve um gene diferente implicado - na cevada, um dos mutantes com crescimento excessivo ocorreu devido a uma nova mutação em Spy1.

[0176] Cinco linhas independentes de evidência suportaram a conclusão que as novas mutações nos genes Della identificados aqui foram responsáveis pelos fenótipos de superdesenvolvimento, em vez de uma mutação não ligada ou uma mutação em um gene diferente ou sendo simplesmente uma consequência geral de tratamento com mutagênio. Primeiro, para cada um dos 13 mutantes de cevada um ‘gene de controle’ (Gse1) em torno do mesmo comprimento quando o Sln1 foi sequenciado e em caso algum houve uma mudança de base selecionada. Em segundo lugar, as mutações observadas foram quase exclusivamente (em 30 de 31 mutantes) uma substituição de G a A, assumindo que C a T representa G a A no filamento de DNA oposto, similar às observações prévias em mutantes induzidos por azida em outros locais incluindo Gse1 (receptor GA), Sln1, genes para a biossíntese de GA e biossíntese de amido. A redundância no código genético prognosticou com mudanças de G a A aleatórias, 33 % não devem ter substituição de aminoácido correspondente. Entretanto, nenhum caso simples foi observado de uma substituição de nucleotídeo silenciosa em mais do que 90 mutantes recentemente induzidos, cada um compreendendo uma mutação em uma estrutura de leitura aberta nestes genes de cevada diferentes. Esta ausência indicou que as mutações foram recuperadas apenas onde uma mudança de aminoácido prejudicou a função da proteína, levando a mudanças no fenótipo. Em terceiro lugar, as mutações identificadas envolveram quase sempre os resíduos de aminoácido que foram conservados. Por exemplo, as mutações DELLA envolveram resíduos de aminoácido que foram idênticos, com apenas duas ou três exceções, entre espécies de cereal e a Arabidopsis taxonomicamente distante. Isto pode ser visto na Figura 8 que mostra um alinhamento de trigo Rht-B1a e proteínas de Arabidopsis GAI, mostrando os aminoácidos idênticos conservados entre as duas sequências. A substituição de resíduos de aminoácidos altamente conservados deve ser mais provável de resultar em interrupção funcional para a atividade de proteína do que mudanças em resíduos deficientemente conservados. Em quarto lugar, tratamentos por mutagênese independentes deram exemplos de mutações idênticas e, portanto, as substituições de aminoácido idênticas correspondentes, induzidas dentro da cevada, entre cevada e trigo e dentro do trigo. Em quinto lugar, seguindo cruzamento e a segregação subsequentes, 100 % de ligação foi sempre observado entre os fenótipos mutantes e as sequências genéticas mutantes onde os estudos de ligação foram completados.

[0177] Os alelos de superdesenvolvimento intensificaram a sinalização de GA e assim por diante, foram mais prováveis para reduzir a quantidade de proteína DELLA ou sua atividade funcional, o último envolvendo provavelmente suas interações com outras proteínas. Em alguns casos, de união diferencial, houve o potencial para proteínas DELLA com inserções de aminoácido em estrutura diferente a serem produzidos. Por exemplo, os mutantes em ocasiões produziram inserções mais curtas ou mais longas do que a inserção de 30 aminoácidos na proteína Rht-B1c. As substituições de aminoácido podem levar à degradação aumentada de DELLA se estes resultarem em uma afinidade mais forte para o complexo de GA- GID1 ou a subunidade F-box. As mudanças aleatórias foram interações de proteína de improváveis a mais fortes, embora com eventos muito raros de avaliação de mutante eficiente devem ser recuperadas. Tentativas prévias de determinar os conteúdos de proteína DELLA em partes diferentes da planta de trigo por procedimentos de anticorpo tenham sido mal sucedidos (Pearce et al., 2011). Os cientistas pensam que é mais provável que as proteínas DELLA mutantes geradas descrito acima tenham afinidade reduzida para outros interagir com parceiros de proteína. Um número considerável de substituições de aminoácido ocorreu no motivo LHR1, uma região que, em Arabidopsis, está envolvida com as interações de PIF4 e PIL5 (de Lucas et al., 2008; Feng et al., 2008). Os efeitos diferenciais de alelos de superdesenvolvimento particulares em desenvolvimento versus produção de a-amilase em cevada sugeriu que regiões diferentes da proteína DELLA interajam com parceiros de proteína diferentes para regular estas duas respostas.

[0178] Foi inesperado que quase todos os mutantes com crescimento excessivo estiveram em um único gene, especialmente um que foi demonstrado ser de importância fundamental no controle do desenvolvimento em uma faixa de espécies de planta tanto sob condições controladas quanto de campo. A preponderância de novos alelos no gene codificador de DELLA tanto em trigo quanto em cevada destacaram a importância deste gene no controle do desenvolvimento. Por exemplo, entre os derivados superdesenvolvidos do anão biossintético de GA, os mutantes que devem ter aumentado o teor de GAs ativos, tais como, por exemplo, mutações nos genes catabólicos de GA não foram identificados a despeito dos números de mutantes analisados. O sucesso no isolamento dos novos mutantes em trigo originou-se do fato que o nanismo devido aos alelos semidominantes, tal como Rht-B1c foi eficazmente uma característica diploide, envolvendo apenas um dos três genomas. Isto permitiu a seleção de uma faixa de alelos derivados de perda de função (com relação ao Rht-B1c), muitos dos quais envolveram mutações secundárias intra-gênicas.

[0179] Em ambas as espécies, novos alelos foram recuperados para uma característica agronomicamente importante, isto é, a altura da planta. Além disso, a variação foi observada em outras características influenciadas por GA, algumas das quais foram de interesse prático. Tamanho de grão de cevada maior e produção aumentada de a-amilase sem a necessidade de suplementação de GA foram ambos observados. Ambas as características foram consideradas serem úteis, por exemplo, para vigor de muda precoce melhorado e desempenho de maltagem melhorado, respectivamente. A coleção grande de mutantes de trigo incluiu mutantes com uma faixa na extensão do nanismo além dos alelos de seminanismo além daqueles dos alelos de seminanismo Rht-1 existentes, que são esperados serem de valor no alvejamento de alelos específicos para ambientes específicos (Flintham et al., 1997). Também ouve variação considerável em outras características de GA de importância prática, por exemplo, comprimento de coleóptilo aumentado com relação plantas homozigóticas para Rht-1 e dormência de grão aumentada com relação às plantas homozigóticas para Rht-B1a ou Rht-B1b. Estes alelos devem funcionar com determinantes genéticos principais para introduzir uma série de características nas linhas de criação, expedidas pelos marcadores moleculares perfeitos disponíveis para o gene.

[0180] Os genes DELLA são altamente conservados através de várias espécies. As comparações de sequência entre proteína Rht-B1a de trigo e as proteínas de Arabidopsis thaliana GAI são mostradas na Figura 8. Como pode ser visto, houve um grau grande de identidade entre estas sequências de proteína através de espécies diferentes. Importantemente, das 20 substituições de aminoácido encontradas nos mutantes de trigo com crescimento excessivo, todo exceto de dois a três estiveram nos aminoácidos conservados entre os polipeptídeos codificados pelos genes de trigo e Arabidopsis genes. Isto foi fortemente suportador dos resíduos nestas posições particulares nas proteínas DELLA em várias espécies sendo particularmente importantes quanto à atividade. Tabela 1: linhas de cevada, genótipos e mutações Notas de rodapé 1 As coordenadas referem-se às posições na sequência codificadora de HvSln1 ou sequência de aminoácido SLN1 de Himalaya (Acessão Genbank AK372064) começando em ATG e terminando em TGA. para TR26, as coordenadas referem-se à posição na sequência codificadora HvSpy1 (AF035820) ou sequência de aminoácido SPY1, começando em ATG e terminando em TGA. 2 os grãos são progênie de heterozigotos que segregam no local Sln1 quando indicado (as plantas delgadas alongadas homozigóticas são estéreis). 3 Sln1d.1- Sln1d.10 são derivados de Sln1d e contêm a mutação Sln1d original além das novas substituições indicadas. Apenas as linhas de superdesenvolvimento (Sln1d.4-Sln1d.10) podem ser mantidas como homozigóticas. 4 Linhas estabelecidas após dois retrocruzamentos com Himalaya antes de selecionar quanto à homozigozidade do alelo mostrado. Tabela 2: Sequência de nucleotídeos de iniciadores de PCR usados aqui (5’ a 3’) Tabela 3: Linhas de trigo, genótipo Rht-B1 e mutações Tabela 4: Fenótipos de linhas de superdesenvolvimento de acordo com o alelo Tabela 5: taxas de alongamento de folha e produção de mutantes de a- amilase de cevada com crescimento excessive Tabela 6: Efeito de spy1a nas taxas de desenvolvimento e produção de a- amilase Tabela 7: Comprimento de coleóptilos (em mm) de linhas de desenvolvimento de cevada Tabela 8. Altura da planta com relação à variedade alta (alelo Rht-B1a) e registros de dormência de grão para plantas de trigo da linhas mutantes * Registro de dormência calculada como o número de semanas de armazenamento do grão na ordem para 50% dos grãos germinarem no teste de germinação. REFERÊNCIAS Achard et al., (2009). J. Exptl Bot. 60, 1085-1092. Arana et al., (2011). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 9292-9297. Asano et al., (2009). Mol. Genet Genomics 281, 223-231. Carol et al., (1995Planta 197, 414-417. Chandler et al., (1999). Plant Physiol. 120, 623-632. Chandler et al., (2002). Plant Physiol 129, 181-190. Chandler et al., (2008). Mol. Plant. 1, 285-294. de Lucas M et al., (2008). Nature 451, 480-484. Dill et al., (2004). Plant Cell 16, 1392-1405. Ellis et al., (2005). Theor Appl Genet 111, 423-430. Feng et al., (2008). Nature 451, 475-479. Flintham et al., (1997). J. Agric. Sci. 128, 11-25. Fu et al., (2002). Plant Cell 14, 3191-3200. Griffiths et al., (2006). Plant Cell 18, 3399-3414. Hartweck, (2008). Planta 229, 1-13. Hirano et al., (2010). Plant Cell 22, 2680-2696. Hoogendoorn et al., (1988). In Miller T.E., Koebner, R.M.D., Proceedings of the Seventh International Wheat Genetics Symposium, Institute of Plant Science Research, Cambridge, U.K., pp. 1093-1100. Ikeda et al., (2001). Plant Cell, 13, 999-1010. Kuppusamy et al., (2009). Plant Mol. Biol. 69, 375-381. Monna et al., (2002). DNA Res. 9, 11-17. Murase et al., (2008). Nature 456, 459-463. Pearce et al., (2011). Plant Physiol. DOI:10.1104/pp.111.183657. Peng et al., J (1999Nature 400, 256-261. Robertson et al., (1998). Plant Cell 10, 995-1007. Sasaki et al., (2002). Nature 416, 701-702. Sasaki et al., (2003). Science 299, 1896-1898. Shimada et al., (2006). Plant J. 48, 390-402. Shimada et al., (2008Nature 456, 520-544. Silverstone et al., (1997). Genetics 146, 1087-1099. Silverstone et al., (2007). Plant Physiol. 143, 987-1000. Spielmeyer et al., (2002). Proc Natl Acad Sci (USA) 99, 9043-9048. Sun, (2010). Plant Physiol 154, 567-570. Ueguchi-Tanaka et al., (2005). Nature 437, 693-698. Willige et al., (2007). Plant Cell 19, 1209-1220. Wilson et al., (1995). Plant Physiol 108: 495-502. Wolbang et al., (2004). Plant Physiol 134, 769-776. Wu et al., (2011) Plant Physiol DOI:10.1104/pp.111.185272. Yamaguchi, (2008). Annu. Rev. Plant Biol. 59, 225-251. Yamamoto et al., (2010). Plant Cell 22, 3589-3602. Zwar et al., (1995). Planta 197, 39-48.

Claims (21)

1. Processo para a produção de recipientes para grãos de trigo, o processo caracterizado por: (a) ceifar as partes moídas acima de plantas de trigo para produzir o grão de trigo, (b) debulhar e/ou joeirar as partes das plantas de trigo para separar o grão do restante das partes da planta, (c) peneirar e/ou classificar o grão separado na etapa b), e carregar o grão peneirado e/ou classificado em recipientes produzindo recipientes de grãos, e (d) processar o grão de modo que não é mais capaz de germinar, em que o grão de trigo é definido por ter um alelo Rht-B1 mutante que codifica um polipeptídeo Rht-B1 mutante, o alelo Rht-B1 mutante definido por ter uma variação de sequência em relação à SEQ ID NO:1 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica o polipeptídeo Rht-B1 mutante, a variação de sequência sendo selecionada do grupo que consiste em G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A e G3671A, em que o polipeptídeo Rht-B1 mutante é definido por ter um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo Rht-B1 mutante difere da sequência de SEQ ID NO:5 por pelo menos (i) uma inserção da sequência de aminoácidos consistindo em DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID NO:14), sendo a referida inserção entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID NO:5, e (ii) uma ou duas substituições de aminoácidos no domínio C- terminal correspondente ao aminoácido G260, V264, A271, G298, A 299, A305, A310, P344, L346, G377, P394, R514, T524, S528, G563, V286, D371 ou E579 com referência à SEQ ID NO: 3, ou correspondente ao aminoácido S493, R283, R271, A280, V234 , R484, V285, G230, S488 ou C240 com referência à SEQ ID NO:5.

2. Processo para a produção de recipientes para grãos de trigo, o processo caracterizado pelo fato de: (a) colher partes acima do solo de plantas de trigo que produzem o grão de trigo, (b) debulhar e/ou joeirar as partes das plantas de trigo para separar o grão de o restante das partes da planta, (c) peneirar e/ou classificar os grãos separados na etapa b) e carregar os grãos peneirados e/ou classificados em caixas, produzindo assim caixas de grãos, e (d) processar o grão de modo que não é mais capaz de germinar, em que o grão de trigo é definido por ter um alelo Rht-B1 mutante que codifica um polipeptídeo Rht-B1 mutante, o alelo Rht-B1 mutante definido por ter uma variação de sequência em relação à SEQ ID NO:1 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a polipeptídeo Rht-B1 mutante, cuja variação de sequência é selecionada do grupo que consiste em G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T8TA, G3624A, G2792A, CC G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A, em que o polipeptídeo Rht-B1 mutante é definido por ter um domínio N- terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácidos do mutante Rht-B1 polipeptídeo difere da sequência apresentada como SEQ ID NO:5 por pelo menos uma inserção da sequência de aminoácidos que consiste em DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID NO:14), sendo a referida inserção entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID NO:5.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substituição é selecionada do grupo que consiste em G260E, V264M, A271T, G298D, A299T, A305T, A310V, P344S, L346F, G377R, P394L, R514H, T524I, S528F, G563D, V286M, D371N, A310T e E579K com referência à SEQ ID NO: 3, e S493F, R283H, R271H, A280T, V234M, R484H, V285F, G230E, S488F e C240Y com referência à SEQ ID NO: 5.

4. Processo da reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a variação de sequência ser selecionada do grupo consistindo em G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A.

5. Processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato do grão de trigo ser homozigótico para o alelo Rht-B1 mutante.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato do grão de trigo ser triturado, partido, parboilizado, enrolado, perolizado, moído ou moído.

7. Molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo Rht-Bl, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeo possui uma variação de sequência relativa à SEQ ID NO:1 ou uma sequência degenerada da mesma, cuja variação de sequência é selecionada do grupo consistindo em G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A.

8. Polipeptídeo Rht-Bl, o polipeptídeo Rht-Bl caracterizado pelo fato de que possui um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, e em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo RHT-BL difere da sequência SEQ ID NO: 5, em pelo menos, (i) uma inserção da sequência de aminoácido consistindo de DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID NO:14), a referida inserção sendo entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID NO: 5, e (ii) uma ou duas substituições de aminoácidos no domínio C-terminal correspondente ao aminoácido G260, V264, A271, G298, A299, A305, A310, P344, L346, G377, P394, R514, T524, S528, G563, V286, D371, ou E579 com referência à SEQ ID NO:3, ou correspondente ao aminoácido S493, R283, R271, A280, V234, R484, V285, G230, S488 ou C240 com referência à SEQ ID NO:5.

9. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a variação de sequência é selecionada do grupo que consiste em G148A, G148T, G147A, G2084A, G2083A e G3671A.

10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a substituição é selecionada do grupo que consiste em G260E, V264M, A271T, G298D, A299T, A305T, A310V, P344S, L346F, G377R, P394L, R514H, T524I, S528F, G563D, V286M, D371N, A310T e E579K com referência à SEQ ID NO: 3, e S493F, R283H, R271H, A280T, V234M, R484H, V285F, G230E, S488F e C240Y com referência à SEQ ID NO: 5.

11. Método para produção de farinha de trigo, farinha integral ou farelo, o método caracterizado por obter grão de trigo definido por ter um alelo Rht-B1 mutante que codifica um polipeptídeo Rht-B1 mutante, o alelo Rht-B1 mutante definido por ter uma variação de sequência em relação à SEQ ID NO:1 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica o polipeptídeo Rht-B1 mutante, a variação de sequências sendo selecionada a partir do grupo consistindo em G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A e G3671A , em que o polipeptídeo Rht-B1 mutante é definido por ter um domínio N-terminal e um domínio C-terminal, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo Rht- B1 mutante difere da sequência de SEQ ID NO:5 por pelo menos (i) uma inserção da sequência de aminoácidos consistindo em DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID NO:14), sendo a referida inserção entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID NO:5, e (ii) uma ou duas substituições de aminoácidos no C-domínio terminal correspondente ao aminoácido G260, V2 64, A271, G298, A299, A305, A310, P344, L346, G377, P394, R514, T524, S528, G563, V286, D371 ou E579 com referência à SEQ ID NO: 3, ou correspondente ao aminoácido S493, R283 , R271, A280, V234, R484, V285, G230, S488 ou C240 com referência à SEQ ID NO:5, e processar o grão de trigo para produzir a farinha, a farinha integral ou farelo.

12. Método para produção de farinha de trigo, farinha integral ou farelo, o método caracterizado pela obtenção de grão de trigo definido por ter um alelo Rht-B1 mutante que codifica um polipeptídeo Rht-B1 mutante, o alelo Rht-B1 mutante definido por ter uma variação de sequência em relação a SEQ ID NO:1 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica o polipeptídeo Rht-B1 mutante, cuja variação de sequência é selecionada do grupo que consiste em G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T , G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A, em que o polipeptídeo Rht-B1 mutante é definido por ter um domínio N-terminal e um C-terminal domínio, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo Rht-B1 mutante difere da sequência estabelecida pela SEQ ID NO:5 por pelo menos uma inserção da sequência de aminoácidos consistindo em DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID NO:14), sendo a referida inserção entre os aminoácidos 49 e 50 de SEQ ID NO:5.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a substituição é selecionada do grupo que consiste em G260E, V264M, A271T, G298D, A299T, A305T, A310V, P344S, L346F, G377R, P394L, R514H, T524I, S528F, G563D, V286M, D371N, A310T e E579K com referência à SEQ ID NO: 3, e S493F, R283H, R271H, A280T, V234M, R484H, V285F, G230E, S488F e C240Y com referência à SEQ ID NO: 5

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a variação de sequência é selecionada do grupo que consiste em G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato do grão de trigo ser homozigótico para o alelo Rht-B1 mutante.

16. Farinha de trigo, farinha integral ou farelo, produzidos pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado por possuir a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 7 ou 9, e/ou o polipeptídeo como definido na reivindicação 8 ou 10, em que adicionalmente a farinha de trigo, farinha integral ou farelo foi refinado por um ou mais ou todos de fracionamento, alvejamento e tratamento térmico.

17. Farinha de trigo, farinha integral ou farelo de acordo com a reivindicação 16, caracterizada ainda pelo fato da farinha de trigo, farinha integral ou farelo ser homozigótica para o alelo Rht-B1 mutante

18. Método para introdução de um alelo RHT-B1 mutante em uma planta de trigo sem o dito alelo, o método caracterizado por: (a) cruzar uma primeira planta de trigo precursora com uma segunda planta de trigo precursora, em que a segunda planta é uma planta de trigo que produz o grão de trigo, o grão de trigo possuindo um alelo RHT-B1 mutante que codifica um polipeptídeo RHT-B1 mutante, o alelo RHT-B1 mutante possuindo uma variação de sequência relativa à SEQ ID NO:1 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica o polipeptídeo RHT-B1 mutante, cuja variação de sequência é selecionada do grupo consistindo de G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A e G2083A, em que o polipeptídeo RHT-B1 mutante possui um domínio N- terminal e um domínio C-terminal, e em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo RHT-B1 mutante difere da sequência definida na SEQ ID NO:5 em pelo menos (i) uma inserção da sequência de aminoácido DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID NO:14), a referida inserção sendo entre os aminoácidos 49 e 50 da SEQ ID NO:5, e (ii) uma ou duas substituições de aminoácidos no domínio C-terminal correspondente ao aminoácido G260, V264, A271, G298, A299, A305, A310, P344, L346, G377, P394, R514, T524, S528, G563, V286, D371, ou E579 com referência à SEQ ID NO:3, ou correspondente ao aminoácido S493, R283, R271, A280, V234, R484, V285, G230, S488 ou C240 com referência à SEQ ID NO:5, e (b) retrocruzar uma planta descendente do cruzamento da etapa (a) com uma planta do mesmo genótipo que a primeira planta precursora para produzir uma planta com uma maioria do genótipo do primeiro precursor, que possui entretanto o dito alelo RHT-B1 mutante.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado ainda pelo fato de que o grão de trigo é homozigoto para o alelo Rht-B1 mutante

20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado adicionalmente pelo fato de que a planta descendente é genotipada para a presença ou ausência do dito alelo utilizando um método de genotipagem de planta ou grão de trigo, o método de genotipagem caracterizado por: (i) obter uma amostra possuindo ácido nucleico ou proteína extraída da planta ou grão de trigo e (ii) detectar na amostra uma molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 7 ou 9, ou um polipeptídeo, como definido como definido na reivindicação 8 ou 10.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a planta de trigo possui um alelo RHT-B1 possuindo uma variação de sequência relacionada a SEQ ID NO:1 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica um polipeptídeo RHT-B1 mutante, cuja variação de sequência é selecionada do grupo consistindo de G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, C2865T, C2966T, C2972T, G3065A, C3117T, G3477A, C3507T, C3519T, G3624A, G2792A, CC2108TA, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A, e G2083A.