JP5562295B2 - 分枝酵素の活性を改変した小麦、ならびにそれから得たデンプンおよびデンプン含有品 - Google Patents

分枝酵素の活性を改変した小麦、ならびにそれから得たデンプンおよびデンプン含有品 Download PDF

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Description

本発明は、相対的にアミロース含有量が高い穀粒デンプンを有する小麦植物に関する。本発明はまた、胚乳中のデンプン分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）の活性を低下させた小麦、およびこのような植物を得る方法にも関する。本発明はまた、穀粒およびデンプン、ならびにそれから得た食料品および非食料品にも関する。
穀類では、成熟した穀粒の約４５〜６５％重量をデンプンが占めている。デンプンは、２つのタイプの分子、すなわちアミロースおよびアミロペクチンからなっている。アミロースは、α−１，４結合したグルコシド鎖からなるほぼ直鎖状の分子であり、一方、アミロペクチンは直鎖同士を結合するα−１，６グルコシド結合で高度に枝分かれしている。
高等植物の胚乳におけるデンプンの合成は、４つの重要なステップを触媒する一揃いの酵素群によって行われる。第１に、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼが、Ｇ−１−ＰおよびＡＴＰからＡＤＰ−グルコースを合成することによって、デンプンのモノマー前駆物質を活性化する。第２に、活性化されたグルコシル基供与体、すなわちＡＤＰ−グルコースが、デンプン合成酵素によって、既存のα−１，４結合の非還元末端に移される。第３に、デンプン分枝酵素が、α−１，４結合したグルカン部分を切断することにより分岐点を導入し、続いて切断した鎖を受け入れ先の鎖に移して新しいα−１，６結合を形成させる。デンプン分枝酵素は、α−ポリグルカンにα−１，６結合を導入できる唯一の酵素であり、したがって、アミロペクチンの形成において極めて重要な役割を果たしている。最後に、作用機序は解明されていないが、デンプン脱分枝酵素が分枝結合の一部を除去する（Ｍｙｅｒｓ他、２０００年）。
少なくともこれら４種の酵素活性が高等植物における通常のデンプン粒合成に必要であることは明らかであり、４種の酵素活性のそれぞれについて複数のアイソフォームが高等植物の胚乳中で発見されており、変異解析に基づいて（Ｗａｎｇ他、１９９８年、Ｂｕｌｅｏｎ他、１９９８年）、または遺伝子導入手法を用いて遺伝子発現レベルを改変することによって（Ａｂｅｌ他、１９９６年、Ｊｏｂｌｉｎｇ他、１９９９年、Ｓｃｗａｌｌ他、２０００年）、個々のアイソフォームの具体的な役割が提示されてきた。しかし、デンプン生合成に対する各酵素活性の各アイソフォームの正確な寄与は依然として分かっておらず、これらの寄与が種間で著しく異なるかどうかも分かっていない。穀類の胚乳には、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼの２種のアイソフォームが存在する。すなわちアミロプラスト内部に１つの型、細胞質に１つの型が存在している（Ｄｅｎｙｅｒ他、１９９６年、Ｔｈｏｒｂｊｏｒｎｓｅｎ他、１９９６年）。各型は、２種のサブユニットからなっている。トウモロコシのしわ型（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）（ｓｈ２）変異体および脆性（ｂｒｉｔｔｌｅ）（ｂｔ２）変異体は、それぞれ大サブユニットおよび小サブユニット中の損傷を示している（ＧｉｒｏｕｘおよびＨａｎｎａｈ、１９９４年）。穀類の胚乳には次の４クラスのデンプン合成酵素が存在している。デンプン粒の内部にもっぱら局在しているアイソフォーム、すなわち顆粒結合型デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）、顆粒と可溶性画分の間に分配されている２種の型（ＳＳＩ（Ｌｉ他、１９９９年ａ）；ＳＳＩＩ（Ｌｉ他、１９９９年ｂ））、ならびに可溶性画分中に全体がある４番目の型、すなわちＳＳＩＩＩ（Ｃａｏ他、２０００年、Ｌｉ他、１９９９年ｂ、Ｌｉ他、２０００年）である。ＧＢＳＳはアミロース合成に不可欠であることが示されており（Ｓｈｕｒｅ他、１９８３年）、ＳＳＩＩおよびＳＳＩＩＩの変異によりアミロペクチン構造が変えられることが示されている（Ｇａｏ他、１９９８年、Ｃｒａｉｇ他、１９９８年）。ＳＳＩ活性の役割を定義する変異は記載されていない。
分枝酵素の３種の型、すなわち、分枝酵素Ｉ（ＳＢＥＩ）、分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）、分枝酵素ＩＩｂ（ＳＢＥＩＩｂ）は、穀類の胚乳で発現される（ＨｅｄｍａｎおよびＢｏｙｅｒ、１９８２年、ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９７８年、Ｍｉｚｕｎｏ他、１９９２年、Ｓｕｎ他、１９９７年）。コメ（ＮａｋａｍｕｒａおよびＹａｍａｎｏｕｃｈｉ、１９９２年）、トウモロコシ（Ｂａｂａ他、１９９１年；Ｆｉｓｈｅｒ他、１９９３年；Ｇａｏ他、１９９７年）、および小麦（Ｒｅｐｅｌｌｉｎ他、１９９７年；Ｎａｉｒ他、１９９７年；Ｒａｈｍａｎ他、１９９７年）のゲノム配列およびｃＤＮＡ配列は特徴を明らかにされている。配列アラインメントにより、ヌクレオチドレベルでもアミノ酸レベルでも配列の類似性の程度が高いことが判明しており、ＳＢＥＩクラス、ＳＢＥＩＩａクラス、およびＳＢＥＩＩｂクラスへの分類が可能である。ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは一般に、特に遺伝子の中心領域において、互いに約８０％の配列同一性を示す。ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは、その発現パターンによって区別することもできる。ＳＢＥＩＩｂは一般に胚乳で特異的に発現されるが、ＳＢＥＩＩａは植物のすべての組織中に存在する。
小麦胚乳では、ＳＢＥＩ（Ｍｏｒｅｌｌ他、１９９７年）はもっぱら可溶性画分に存在し、一方、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは、可溶性画分にもデンプン粒結合画分にも存在している（Ｒａｈｍａｎ他、１９９５年）。トウモロコシおよびコメでは、高アミロースのフェノタイプは、アミロース増量（ａｅ）遺伝子としても知られているＳＢＥＩＩｂ遺伝子の損傷に起因することが示されている（ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９８１年、Ｍｉｚｕｎｏ他、１９９３年；Ｎｉｓｈｉ他、２００１年）。これらＳＢＥＩＩｂ変異体では、胚乳のデンプン粒が異常な形態を示し、アミロース含有量はかなり高くなり、残存するアミロペクチンの分岐頻度は少なくなり、短鎖（＜重合度１７、特に重合度８〜１２）の比率が低くなっていた。さらに、デンプンの糊化温度は高くなっていた。加えて、アミロースとアミロペクチンの「中間体」と定義される物質がかなり溜まっていた（Ｂｏｙｅｒ他、１９８０年、Ｔａｋｅｄａ、他、１９９３年ｂ）。 一方、突然変異誘発（Ｍｕ）挿入因子によってＳＢＥＩＩａ遺伝子で突然変異が起こり、その結果としてＳＢＥＩＩａタンパク質発現を欠いているトウモロコシ植物は、葉のデンプンでは分岐が変わっていたが、胚乳デンプンの分岐については野生型植物との区別が不可能であった（Ｂｌａｕｔｈ他、２００１年）。同様に、ＳＢＥＩＩａ活性が欠損したコメ植物でも、胚乳（Ｎａｋａｍｕｒａ ２００２年）のアミロペクチン鎖の性質に有意な変化は起きなかった（Ｎａｋａｍｕｒａ ２００２年）。トウモロコシおよびコメのいずれにおいても、ＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子はゲノム中で互いに結合していない。
トウモロコシでは、ｄｕｌｌ１変異が起こると、変化の程度は遺伝的背景に応じて変わるが、デンプン含有量が少なくなり、胚乳のアミロースレベルが高くなり、残存アミロペクチンの分岐の程度が高くなる（ＳｈａｎｎｏｎおよびＧａｒｗｏｏｄ、１９８４年）。この変異に対応する遺伝子は、トランスポゾン突然変異誘発遺伝子（Ｍｕ）を用いるトランスポゾン標識法によって同定および単離され、デンプン合成酵素ＩＩ（ＳＳＩＩ）と呼ばれる酵素をコードしていることが示されている（Ｇａｏ他、１９９８年）。現在この酵素は、穀類のＳＳＩＩＩファミリーのメンバーとして認識されている（Ｌｉ他、２００３年）。変異胚乳では、ｄｕｌｌ１変異に伴ってＳＢＥＩＩａ活性のレベルが低下していた。他の穀類では、これに対応する変異は報告されていない。これらの研究結果が他の穀類、例えば小麦に関連性があるかどうかは分かっていない。
ＷＯ９４／０９１４４では、センス遺伝子およびアンチセンス遺伝子を使用してトウモロコシのデンプン合成酵素（ＳＳ）とＳＢＥとの天然の比率を変えることを示唆している。しかし、提案されている分子戦略を実証するデータは何も提示されておらず、ＳＢＥＩＩａ活性を特異的に低下させることは示唆されていない。
ジャガイモでは、その後の研究によりいくらかの性質の変化が確認されたものの（Ｓａｆｆｏｒｄ他、１９９８年）、ＳＢＥＩのみをダウンレギュレーションしてもデンプン構造に最小限の影響しか与えない（Ｆｉｌｐｓｅ他、１９９６年）。しかし、ジャガイモでＳＢＥＩＩおよびＳＢＥＩを一緒にダウンレギュレーションすると、ＳＢＥＩＩのみをダウンレギュレーションした場合よりもはるかに相対的アミロース含有量が増加した（Ｓｃｈｗａｌｌ他、２０００年）。
高等植物には２種類の型の脱分枝酵素が存在しており、その基質特異性に基づいて、イソアミラーゼ型脱分枝酵素およびプルラナーゼ型脱分枝酵素と定義されている（Ｍｙｅｒｓ他、２０００年）。トウモロコシおよびコメにおけるシュガリー（ｓｕｇａｒｙ）−１変異は、双方の脱分枝酵素の欠損に関連付けられている（Ｊａｍｅｓ他、１９９５年、Ｋｕｂｏ他、１９９９年）が、原因となる変異は、イソアミラーゼ型脱分枝酵素遺伝子と同じ場所に位置している。穀類からクローン化されている代表的なデンプン生合成遺伝子を表１に挙げる。
表１．穀類で明らかにされているデンプン分枝酵素遺伝子
Figure 0005562295
デンプンは、食品工業、製紙工業、および化学工業で広く使用されている。デンプンの物理的構造は、食料品または非食料品もしくは工業製品用のデンプンの栄養特性および取扱特性に大きな影響を与え得る。アミロペクチン鎖長の分布、結晶性の程度およびタイプ、ならびに糊化温度、粘度、膨潤体積などの特性を含めて、いくつかの特質をデンプン構造の指標とみなすことができる。アミロペクチン鎖長の変化は、結晶性の変化、糊化、またはアミロペクチンの老化の指標とすることができる。
デンプン組成物、特にアミロース含有量が高いことに関連付けることができるレジスタントスターチと呼ばれる型は、腸の健康、特に大腸の健康に重要な意味をもっている。したがって、腸の健康を促進する手段として食品に使用するために、トウモロコシなどいくつかの穀物において高アミロースデンプンの開発が行われてきた。レジスタントスターチの有益な効果は、大腸に栄養物が供給され、そこで大腸内の腸内微生物叢にエネルギー源が与えられ、このエネルギー源が発酵されて、特に短鎖脂肪酸が形成されることにより得られる。これらの短鎖脂肪酸は、結腸細胞に栄養物を提供し、一部の栄養物の大腸からの摂取を増進し、結腸の生理活性を促進する。一般に、レジスタントスターチまたは他の食物繊維が提供されない場合は、結腸は代謝的に比較的不活発である。
化学的方法あるいは別法で改変されたデンプンは、食品に利用することができ、改変されていない供給源によっては通常得られない機能性を与えるが、そのような改変は、改変に伴うプロセスが原因となって、価値のある他の成分を改変しまたは望ましくない感覚をもたらす傾向がある。したがって、未改変の形態で食品に使用できる構成成分からなる供給源を提供することが好ましい。
全世界で毎年生産される小麦の量は、穀物作物のうちで最も多い。小麦のデンプン構造で分かっている変異は、トウモロコシまたはコメで得られる変異と比べて限定されており、小麦の形質転換効率が他の穀類での効率に遅れをとっていること、ならびにパン小麦が６倍体の性質を有することがその理由の一部である。Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦）には３種のゲノムが存在するため、２倍体種では変異をより容易に確認できるのに対して、個々のゲノムの変異を隠すことによる緩衝効果がある。トウモロコシまたはコメのアミロース増量フェノタイプに対応するＳＢＥＩＩｂの変異体は、小麦では明らかにされていない。ＳＢＥＩＩａ変異またはＳＢＥＩＩｂ変異によって与えられる小麦のフェノタイプは分かっていない。モチ性遺伝子（ＧＢＳＳ、ＺｈａｏおよびＳｈａｒｐ、１９９８年）の変異体およびＳＧＰ−１タンパク質を完全に欠いた変異体（Ｙａｍａｍｏｒｉ他、２０００年）が知られている。後者の変異体は、タンパク質電気泳動での分析によりＳＧＰ−１（ＳＳＩＩ）タンパク質のゲノムＡ、ゲノムＢ、およびゲノムＤの個々の型を欠く系統を交配することによって作製された。ＳＳＩＩ ヌル型の種子の調査により、変異によってアミロペクチン構造が変化し、デンプン粒が変形し、相対的アミロース含有量がデンプンの約３０〜３７％に増え、野生型のレベルより約８％多くなることが示された（Ｙａｍａｍｏｒｉ他、２０００年）。比色測定、電流滴定（いずれもヨウ素結合について行う）、およびコンカナバリンＡ法によってアミロースを測定した。ＳＳＩＩ ヌル変異体から得たデンプンは、等価な非変異型の植物から得たデンプンと比べて、低い糊化温度を示した。ＳＳＩＩ−ヌル型穀粒のデンプン含有量は、野生型での６０％から５０％未満にまで減少していた。
ＷＯ９９／１４３１４では、小麦関連の２倍体植物であるＡｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ（タルホ小麦）からのＳＢＥＩＩａ遺伝子の単離について記載しているが、改変デンプンを含む小麦は作製しなかった。
ＷＯ００／１５８１０では、小麦のＳＢＥＩＩｂ遺伝子のｃＤＮＡクローニングについて記載している。彼らは、アミロースレベルを変えた小麦植物を得ることはせず、アミロースを少なくとも５０％含むデンプンを有する小麦を教示しなかった。
ＷＯ０１／６２９３４も、小麦のＳＢＥＩＩｂ遺伝子について記載し、小麦植物に分枝酵素活性の阻害物質を導入することを示唆しているが、アミロースを少なくとも５０％含むデンプンを有する小麦を教示していない。
ＷＯ０１／３２８８６は、小麦胚乳に存在するＳＢＥＩの１つの型をコードしているｃＤＮＡを明らかにした。コードされているポリペプチドは、Ａ型のデンプン粒に優先的に関連していることが発見された。彼らは、ＳＢＥＩ活性を抑制することも、改変されたデンプン粒の形態を示すことも、小麦のアミロース量を増やすこともしなかった。
したがって、アミロース比率が約５０％より高いデンプンを有する小麦は知られていない。高アミロースのトウモロコシ変種およびオオムギ変種が知られているが、これらの穀類から作られた製品は、小麦が好ましい穀類である製品に関しては、例えばパン、パスタ、またはヌードルではアミロース含有量が非常に多い小麦と比べて不利である。
これらのタイプの高アミロースデンプンは有用であるが、アミロース含有量のより高い小麦デンプンが、特にデンプン合成の改善および他の特質、例えば収穫後改変の必要が減ることと関連している場合は好ましい。このようなデンプン製品はまた、消化に対して比較的抵抗性があり、健康面でより大きな利益をもたらす。
当業者なら、本明細書で記述する本発明が、具体的に記述するもの以外の変更や修正を受けることが分かるであろう。本明細書で記述する本発明が、このような変形法および改良法のすべてを含むことを理解すべきである。本発明はまた、本明細書で参照または指示するこのようなステップ、特徴、組成物、および化合物のすべても個別にまたは合わせて含み、また、前記ステップまたは特徴のうちのいずれか２つ以上からなる任意の組合せおよびすべての組合せも含む。
本明細書を通じて、文脈上別の意味で解釈する必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載した整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくはステップ、または整数（ｉｎｔｅｒｇｅｒｓ）もしくはステップの群を包含するが、他の整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）およびステップ、ならびに整数（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）およびステップの群のどれも除外しないことを意味しているものと理解されたい。本発明は、本明細書で記述する個々の実施形態によって範囲を限定されるべきではなく、これらの実施形態は例証するためのものであるにすぎない。本明細書で記述するように、機能的に等価な製品、組成物、および方法が本発明の範囲に含まれることは明らかである。
本明細書中で本発明者らが参照した刊行物の書誌詳細は、明細書の最後にまとめている。本明細書で記述する参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。従来技術に関する本明細書の参考文献は、任意の１種または複数の従来技術の文献を含めて、前記の従来技術がオーストラリアで周知の一般的知識であり、あるいはオーストラリアで周知の一般的知識の一部を形成していることを認めるものまたは示唆するものとしてみなすべきではない。
本明細書では、「に由来する、から得た（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、特定の完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）または完全体群（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）が、指定した種に由来するものであるが、必ずしも指定の供給源から直接得られているわけではないことを示すと理解すべきである。
本明細書で参照するヌクレオチド残基の記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される記号であり、Ａはアデニンを示し、Ｃはシトシンを示し、Ｇはグアニンを示し、Ｔはチミジンを示す。
第１の態様で、本発明は、穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも５０％である小麦植物から得た穀粒を提供する。この小麦植物は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルが低くてよく、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂの両方の遺伝子発現、酵素活性、またはその双方のレベルが低いのが好ましい。この穀粒は、遺伝的変異、すなわちＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、酵素活性、またはその双方を阻害するＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異、あるいはＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、酵素活性、またはその双方を阻害する導入核酸のいずれかを含んでよい。さらに、この穀粒はＳＢＥＩに同様の遺伝的変異を含んでもよい。この穀粒は、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＢＳＳ、ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、イソアミラーゼ型脱分枝酵素、及びプルラナーゼ型脱分枝酵素からなる群から選択されるタンパク質および／または酵素活性を、改変されたレベルでさらに含んでもよい。この穀粒は、導入遺伝子を含んでよく、また、この導入遺伝子は、アンチセンスＲＮＡ分子、コサプレッションＲＮＡ分子、リボザイムＲＮＡ分子、または二重鎖ＲＮＡ分子をコードしてよい。この導入遺伝子によって、ＳＢＥＩＩａをコードしているｍＲＮＡの発現レベルが低められることが好ましい。この穀粒は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子に変異を含んでよく、１つの形態では少なくとも１つのゲノムにＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異があり、ゲノムのうちの２つもしくは３つにヌル変異があってもよい。穀粒のデンプン中のアミロース比率は、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、７０％、または８０％でよい。別の形態では、穀粒内部のデンプン粒の少なくとも５０％は、偏光下で観察すると非複屈折性に見える。穀粒は、非しわ型でよく、平均重量は少なくとも３６ｍｇまたは４０ｍｇである。代わりの形態では、殻のない状態での穀粒のデンプン含有量は、少なくとも２５％（ｗ／ｗ）または少なくとも３５％（ｗ／ｗ）であり、野生型穀粒のデンプン含有量の少なくとも９０％でよい。穀粒は、全粒、玄穀、製粉した穀粒、挽き割りにした穀粒、圧扁した穀粒、精白した穀粒、粉砕した穀粒、またはパーボイルド穀粒でよい。
第１の態様の別の形態で、本発明は、デンプンと、野生型の穀粒に比べて胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルを低下させる遺伝的変異とを含む、小麦植物から得た穀粒を提供する。この遺伝的変異は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異またはＳＢＥＩＩａ遺伝子の発現の阻害物質をコードする導入核酸を含み、穀粒のデンプン中のアミロース比率は少なくとも３０％である。
第２の態様では、本発明は、それだけには限らないが、小麦粉、全粒小麦粉、セモリナ粉を含めて第１の態様の穀粒に由来する製粉製品または本発明の穀粒から得たデンプン、あるいはこのような小麦粉、全粒小麦粉、セモリナ粉、デンプンを組み込んだ食料品、あるいは穀粒を圧扁した製品、薄く削った製品、または押し出した製品を提供する。この製品には、別の供給源から得た小麦粉、全粒小麦粉、セモリナ粉、またはデンプンと混合した、本発明の第１の態様の穀粒から得た小麦粉、全粒小麦粉、セモリナ粉、またはデンプンを含めてよい。
第３の態様では、本発明は、第１の態様の小麦植物の穀粒から得たデンプン粒またはデンプンを提供する。第３の態様の特定の形態では、さらに、小麦植物の胚乳のＳＢＥＩＩａ酵素活性レベルが低められている。
第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に記載のデンプンと食品成分または水を含む組成物にあると言える。この態様は、食品、非食品組成物及びデンプンに他のデンプンまたはデンプン含有品とを混合したものを含む。
第５の態様では、本発明は、上記の本発明の第４の態様に記載のデンプン粒および別の食品成分または水を含む組成物を提供する。
第６の態様では、本発明は、先の態様に記載の穀粒またはデンプン粒もしくはデンプンを製造するのに使用できる小麦植物を提供する。小麦植物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでもよく、それから得られる穀粒も同様である。
第７の態様では、本発明は、ｉ）親となる小麦植物または小麦種子に遺伝的変異を導入するステップと、ｉｉ）野生型の植物または種子と比べて胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルが低下している、親小麦植物または小麦種子の子孫の植物または種子を同定するステップとを含む、穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも５０％であるデンプンを含有する穀粒を結実することができる小麦植物を作製する方法を提供する。
第７の態様の第２の形態では、本発明は、ｉ）ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異またはＳＢＥＩＩａ遺伝子の発現の阻害物質をコードする導入核酸を含む遺伝的変異を、親となる小麦植物または小麦種子に導入するステップと、ｉｉ）野生型の穀粒と比べて胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルが低下している、親小麦植物または小麦種子の子孫の植物または種子を同定するステップとを含む、穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも３０％であるデンプンを含有する穀粒を結実することができる小麦植物を製造する方法を提供する。遺伝的変異を導入するステップは、ＳＢＥＩＩａ遺伝子発現の阻害物質を発現する外来の核酸の導入を含んでもよく、親となる小麦植物の突然変異誘発を含んでもよい。
第７の態様の第３の形態では、本発明は、ｉ）ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異を含む遺伝的変異を、親となる小麦植物または小麦種子に導入するステップと、ｉｉ）野生型の穀粒と比べて胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルが低下している、親小麦植物または小麦種子の子孫の植物または種子を同定するステップと、ｉｉｉ）ＳＢＥＩＩｂ遺伝子の変異を含む遺伝的変異を、親となる小麦植物または小麦種子に導入するステップと、ｉｖ）野生型の穀粒と比べて胚乳のＳＢＥＩＩｂの遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａの酵素活性、またはその双方のレベルが低下している、親小麦植物または小麦種子の子孫の植物または種子を同定するステップと、ｖ）胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルが低い植物を、胚乳のＳＢＥＩＩｂ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩｂ酵素活性、またはその双方のレベルが低い植物と交配させるステップと、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂの双方の遺伝子発現、酵素活性、またはその双方が低い小麦植物を同定するステップとを含む、穀粒を結実することができる小麦植物を作製する方法を提供する。
第７の態様の第４の形態では、本発明は、ａ）小麦のＡゲノム、Ｂゲノム、またはＤゲノムから発現されるＳＢＥＩＩａ活性が低下した小麦植物または穀粒を同定し、ｂ）前記小麦植物またはステップａ）の穀粒から得た小麦植物を、ＳＢＥＩＩａ活性の低い第２の小麦植物と交配させるステップ、あるいは、ｃ）ＳＢＥＩＩａ酵素活性の低い植物をＳＢＥＩＩｂ酵素活性の低い植物と交配させ、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂの双方の活性が低い小麦植物を同定するステップを含む、その穀粒のデンプン中の相対的アミロース含有量が少なくとも５０％であり、好ましくは胚乳のＳＢＥＩＩａ酵素活性が低活性である小麦植物を作製する方法を提供する。第７の態様の植物は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｓｓｐ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦の亜種）であることが好ましい。
第８の態様では、上記に示した方法によって植物を改変し特性を改変したデンプンを抽出してなる、改変デンプンの作製方法を提供する。
第９の態様では、本発明は、小麦のＳＢＥＩＩｂ遺伝子、またはＳＢＥＩＩａ遺伝子にそれぞれ結合する分子マーカーを用いて小麦植物または小麦種子の集団をスクリーニングするステップと、結合した分子マーカーの有無に基づいて植物または種子を同定するステップとを含む、ＳＢＥＩＩａ遺伝子またはＳＢＥＩＩｂ遺伝子の変異に関して小麦植物または小麦種子を同定する方法を提供する。
第９の態様の第２の形態では、本発明は、小麦のＳＢＥＩＩｂタンパク質、またはＳＢＥＩＩａタンパク質にそれぞれ特異的な抗体を用いて小麦植物または小麦種子の集団をスクリーニングするステップと、抗体結合の有無に基づいて植物または種子を同定するステップとを含む、ＳＢＥＩＩａ遺伝子またはＳＢＥＩＩｂ遺伝子の変異に関して小麦植物または小麦種子を同定する方法を提供する。
第１０の態様では、本発明は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子が染色体２Ａの長腕から欠けている変異、あるいは染色体２Ａの長腕上のＳＢＥＩＩａ遺伝子が、野生型穀粒と比べて穀粒の胚乳のＳＢＥＩＩａタンパク質、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方を低下させる変異を有する変異を含む、小麦植物から得た穀粒を提供する。この変異はＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異でも、ＳＢＥＩＩａ遺伝子の少なくとも一部の欠失でもよい。穀粒は、ＳＢＥＩＩｂ遺伝子が染色体２Ａの長腕から欠けている変異、あるいは染色体２Ａの長腕上のＳＢＥＩＩｂ遺伝子が、野生型穀粒と比べて穀粒の胚乳のＳＢＥＩＩｂタンパク質、ＳＢＥＩＩｂ酵素活性、またはその双方を低下させる変異を有する変異をさらに含んでもよい。遺伝子欠失によって、染色体２Ａの長腕上のＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子の双方の発現を中断させてもよい。
植物は、野生型穀粒と比べて染色体２Ｂの長腕上のＳＢＥＩＩａ遺伝子にコードされたデンプン分枝酵素活性を低下させる遺伝的変異をさらに含むことができるデュラム小麦植物でよい。別の遺伝的変異は、染色体２Ｂの長腕からのＳＢＥＩＩａ遺伝子の欠失、または野生型穀粒と比べて穀粒の胚乳のＳＢＥＩＩａ酵素活性を低下させる染色体２Ｂの長腕上のＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異を含んでよい。
植物は、野生型穀粒と比べて染色体２Ｂ、染色体２Ｄ、またはその双方の長腕上のＳＢＥＩＩａ遺伝子にコードされたデンプン分枝酵素活性を低下させる遺伝的変異をおそらくはさらに含むであろうＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｓｓｐ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦の亜種）であってもよい。さらなる遺伝的変異は、前記染色体のうちの少なくとも１つからのＳＢＥＩＩａ遺伝子の欠失、または野生型穀粒と比べて穀粒の胚乳のＳＢＥＩＩａ酵素活性を低下させる前記染色体のうちの少なくとも１つのＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異を含む。
植物には、ＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、活性またはその双方の阻害物質をコードする核酸を導入してよい。ＳＢＥＩＩａ酵素活性のレベルは、野生型穀粒と比べて少なくとも４０％低下させることができる。穀粒のデンプン中のアミロース比率は、少なくとも３０％または少なくとも５０％でよい。穀粒は、非しわ型でよく、平均重量は少なくとも３６ｍｇでよい。穀粒から得たデンプン粒の少なくとも５０％が、偏光下で観察すると非複屈折性に見えるものでよい。本発明の一形態では、殻のない状態での穀粒のデンプン含有量は、少なくとも２５％（ｗ／ｗ）であり、あるいは、デンプン含有量は野生型穀粒のデンプン含有量の少なくとも９０％である。
本発明の形態のうちのいずれかに記載の穀粒のアミロペクチンでは、アミロペクチンをイソアミラーゼで脱分枝した後に測定すると、野生型穀粒のアミロペクチンと比べて重合度が４〜１２の鎖長部分の比率が低下していてもよい。
穀粒は、ＳＢＥＩタンパク質、ＳＢＥＩ酵素活性、またはその双方を低レベルで含んでもよく、また、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＢＳＳ、ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、イソアミラーゼ型脱分枝酵素、プルラナーゼ型脱分枝酵素、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、野生型穀粒と比べてレベルを変えられた酵素をさらに含んでもよい。
本発明のこの第１０の態様の形態は、穀粒、穀粒から抽出されたデンプン粒、および、例えば小麦粉、全粒小麦粉、またはセモリナ粉など穀粒から製造された製品またそのデンプンを包含する。
Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ（タルホ小麦）から得たデンプン分枝酵素ＩＩａ遺伝子（ｗＳＢＥＩＩ−Ｄ１）の配列を示す表である［配列番号１］。６倍体の小麦（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦））のゲノムＤのＳＢＥＩＩａ遺伝子に対応している。 Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦）から得た小麦のＳＢＥＩＩｂ遺伝子配列（ｗｂｅ２ｂゲノム）の一部を示す表である［配列番号２］。 二重鎖ＲＮＡコンストラクトの概略図である。Ａ：使用されている遺伝子要素の順序は、センス方向にプロモーター、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子配列（エキソン１、２および３）、アンチセンス方向に、イントロン（イントロン３）、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子配列（エキソン１、２、３および４）、および転写ターミネーター／ポリアデニル化配列であった。Ｂ：ｄｓ−ＳＢＥＩＩａおよびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ遺伝子の転写物は、センス配列とアンチセンス配列のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分を有する「ヘアピン」ＲＮＡ構造を形成する。ヌクレオチドのＧＴおよびＡＧにはさまれたイントロン配列はスプライシングされる。 光学顕微鏡で観察したデンプン粒の写真である。Ａ）は、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統８３．１ｂに由来する野生型デンプン粒を含む小麦種子でから得たデンプン粒であり、Ｂ）は、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統５０．１ｂに由来する変形デンプン粒を含む小麦種子から得たデンプン粒である。 図４の小麦種子から得たデンプン粒の複屈折性を偏光下で可視化した写真である。 小麦ＳＢＥＩＩａのｃＤＮＡ配列の一部分を比較する表である。ｓｂｅ９は、ＡＦ３３８４３２．１の一部に対応する。Ｙ１１２８２［配列番号３］、ｓｒ９９７［配列番号４］、ｓｒ９９５［配列番号５］、ｓｂｅ９［配列番号６］の配列の一部を示している。 初めの６３個のアミノ酸に基づき小麦のＳＢＥＩＩａ配列の一部分をパイルアップ（ＰＩＬＥＵＰ）比較した図である。クローンに対応する遺伝子の推定されるゲノム位置を示している。 Ｄ−ゲノムポリペプチド（ｓｒ８５４）［配列番号７］の推測されるアミノ酸配列をＡゲノムまたはＢゲノム（ｙ１１２８２）［配列番号８］の産生物と比較した表である。トランジット配列（位置１〜５４）はイタリック体で示している。 様々な小麦登録種から得たＳＢＥＩＩｂ遺伝子のイントロン３領域をＰＣＲ増幅した結果を示す図である（レーン１〜１１）。ＰＣＲ増幅は、プライマーＡＲＡ１９ＦおよびＡＲＡ２３Ｒを用い、次にＲｓａ１で消化して行った。ゲノムＡ、Ｂ、およびＤに対応するバンドを矢印で示している。レーン３（Ａｕｓ１７３４０）およびレーン５（Ａｕｓ１０１０３）は、ゲノムＤに特異的なマーカーを欠いており、一方、レーン８（Ａｕｓ１２５０９）およびレーン９（Ａｕｓ１２５６５）は、ゲノムＢのマーカーを欠いている。 ＳＢＥＩＩｂのイントロン３領域に由来するプローブを用いて、小麦登録種由来のＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションした結果を示す写真である。各レーンは、１）Ａｕｓ１２５６５、２）Ａｕｓ１２５０９、３）Ａｕｓ１０１０３、４）ＣＳＤＴ２ＤＬ−４、５）Ａｕｓ１２５３０（デュラム小麦）、６）ＣＳＤＴ２ＢＬ−９、７）Ａｕｓ６３２３、８）ＣＳＤＴ２ＤＳ、９）Ａｕｓ１７３４０、１０）Ａｕｓ１２７４５、１１）ＣＳＤＴ２ＤＬ−４、１２）Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ（タルホ小麦）に対応している。 ＳＢＥＩＩｂのイントロン３領域のＰＣＲ増幅により、Ａｕｓ１７３４０ａとＡｕｓ１２５０９を交配したＦ２集団をスクリーニングした結果を示す図である。ＰＣＲ増幅は、プライマーＡＲ２ｂ１９ｃＦおよびＡＲ２ｂ２３ｃＲを用い、次にＲｓａＩで消化して行った。レーン８はゲノムＢのマーカーとゲノムＤのマーカーの双方を欠いており、したがってＢＤ５４系統は、ＢＤの二重ヌル（ｄｏｕｂｌｅ−ヌル）系統を示している。 ＳＢＥＩＩｂのイントロン３領域に由来するプローブを用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン１〜４）およびＥｃｏＲ１（レーン５〜８）で消化したＢＡＣクローンをサザンハイブリダイゼーションした結果を示す写真である。各レーンは、１）ＢＡＣ４、２）ＢＡＣ５、３）ＢＡＣ９、４）ＢＡＣ１２、５）ＢＡＣ４、６）ＢＡＣ５、７）ＢＡＣ９、８）ＢＡＣ１２に対応している。 Ａ）Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ（タルホ小麦）染色体（大きな写真および挿入写真の下の方）および小麦染色体（挿入写真の上の方）に対してｗＳＢＥＩＩ−ＤＡ１プローブおよび反復ＤＮＡ配列プローブ（ｐＳｃ １１９．２）を用いて行った蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法の結果を示す写真である。 Ｂ）小麦染色体に対してＳＢＥＩＩｂプローブを用いて行った蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法の結果を示す写真である。 指定した種子発育のいくつかの段階（開花の１０、１５、２５日後、Ｍ＝成熟）の野生型Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ（ＣＳ）系統およびＳＧＰ−１ ヌル小麦系統の顆粒結合タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した結果を示す図である。銀染色ゲルの画像のタンパク質バンド強度を測定した。成熟したＣＳ種子のＧＢＳＳのバンド強度を基準の１００とし、指定した発育段階における他の酵素の量を、成熟ＣＳのＧＢＳＳに対するパーセンテージとして表している。ａ）がＧＢＳＳ、ｂ）がＳＳＩ、ｃ）がＳＢＥＩＩである。黒い棒グラフは、ＳＧＰ−１ ヌルを示す。ＣＳおよびＳＧＰ−１ ヌル系統から得た顆粒結合タンパク質の電気泳動画像の例を示す。 可溶性画分中のＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂの相対量を示すグラフである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのイムノブロットをスキャンし、画像のタンパク質バンド強度を測定した。ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂの融合タンパク質を標準としてゲル上で使用して、タンパク質の量を概算した。 Ａ．小麦（ｃｖ Ｒｏｓｅｌｌａ）胚乳分枝酵素活性を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析した結果を示すグラフである。胚乳の可溶性タンパク質を硫酸アンモニウムで分画し、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラム、続いてＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ陰イオン交換カラムに添加してクロマトグラフィー分析をした。Ｂ）小麦胚乳ＳＢＥＩの抗−ＷＢＥ１抗体を用いて免疫検出分析を行い、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離させた結果を示す写真である。ＡおよびＢとして示すＳＢＥＩタンパク質バンドは、それぞれゲノムＡおよびゲノムＢに由来する産生物であり、ＤｉおよびＤｉｉは、ゲノムＤに由来する産生物である。レーン１はＣＳ、レーン２はＮ７ＢＴ７Ａ、レーン３はＮ７ＡＴ７Ｂ、レーン４はＮ７ＤＴ７Ａから得た抽出物に対応するＣ）抗−ＷＢＥ１抗体を用いた陰イオン交換クロマトグラムで活性なピークを示す、精製画分の免疫検出分析の結果を示す写真である。レーン１は、胚乳の粗製な可溶性抽出物であり、レーン２の画分はピーク１を示し、レーン３の画分はピーク２を示している。 抗ＷＢＥＩ抗体を用いた免疫検出によりＳＢＥＩアイソフォームを分離するために、ＶＣ３．１．１１とＣＳ７ＡＬ−１５の交配種の倍加半数体の子孫をスクリーニングした結果を示す写真である。レーン１〜１４は、倍加半数体の子孫系統に対応している。レーン６は、Ａ１１３と呼ばれる三重（ｔｒｉｐｌｅ）ヌル型ＳＢＥＩ変異系統であり、レーン７は、Ｄ２８と呼ばれるＳＢＥＩアイソフォームが正常な系統である。 Ｖｅｅｒｙ３とＧａｂｏ １ＢＬ．１ＲＳの交配種のガンマ線で誘発した突然変異種子から得たＤＮＡ（レーン１〜６）を、プライマーＡＲ２ｂ１９ｃＦ／ＡＲ２ｂ２３ｃＲを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す写真である。レーン２は、変異種子ＭＬＴ２Ｂ８を示し、レーン７は、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇを示す。 小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子のゲノムＡ特異的プライマー、すなわちＡＲＩＩａＡＦ／ＡＲＩＩａＡＲを用いて、小麦系統から得たＤＮＡをＰＣＲ増幅した結果を示す写真である。レーン１〜５は、順に、ＣＳ、ＭＬＴ２Ｂ８、ＭＬＴ２Ｄ１、Ｄｔ２ＡＳ、およびＢＤ２１９（ゲノムＢとゲノムＤの双方のＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ植物がヌル変異体である植物）である。 デンプンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、小麦系統ａ）Ａｃｃ１４４００８およびｂ）Ａｃｃ１４４０８７から得たデンプンをセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ２Ｂゲルクロマトグラムにより分析した結果を示すグラフである。 小麦のトランスジェニック系統から得たデンプンの鎖長の特性を、形質転換されていないコントロールのＮＢ１（小麦）の鎖長特性に対して比較した結果を示すグラフである。形質転換されていないコントロールから得たデンプンの個々の少糖類の全重量のパーセンテージを、トランスジェニック系統から得たデンプンの対応する値から引いている。サンプルの凡例は、０８５（黒の菱形）、０２５（黒の三角）、００８（白丸）である。
＜小麦のＳＢＥＩＩａの改変＞
本発明は、小麦胚乳のＳＢＥＩＩａ活性を低下させると、修飾されたデンプンが産生され、特に小麦穀粒の相対的なアミロースレベルが高くなるという研究結果に基づいている。この予想外の結果は、ＳＢＥＩＩａの変異によってアミロペクチン／アミロースの特性が改変されなかったトウモロコシおよびコメでの研究結果と対照的である（Ｂｌａｕｔｈ他、２００１年、Ｎａｋａｍｕｒａ、２００２年）。別の実施形態では、ＳＢＥＩＩｂ活性ならびにＳＢＥＩＩａ活性を低下させるなど、１種または複数の追加のデンプン生合成酵素活性を改変する。これら２種の活性をコードする遺伝子の変異には、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂが、トウモロコシおよびコメでは関連していないのとは対照的に、小麦では密接に関連しているという驚くべき研究結果が役立つ。本発明者らは、予想外に、ＳＢＥＩＩａ活性およびＳＢＥＩＩｂ活性のレベルが低い小麦植物の穀粒が非しわ型であるということも発見した。
＜小麦植物を作製する方法＞
一態様では、本発明は、穀粒中のデンプンを改変した小麦植物を作製する方法、特にデンプン中のアミロース比率を少なくとも３０％に増加させる方法を提供する。通常、６倍体の小麦およびデュラム小麦では、デンプン中のアミロース比率は、約１８〜約３０％の範囲であり、一部の変異体（ＳＧＰ−１欠損）では最大約３５％である。一実施形態では、本発明の方法は、アミロースを少なくとも３０％含むデンプンを有する穀粒を結実する小麦植物を提供するために、親となる小麦植物または小麦種子に遺伝的変異を導入するステップを含む。本明細書で定義するデンプン中のアミロース比率は、重量／重量（ｗ／ｗ）、すなわち、穀粒から得たデンプンの重量に対するパーセンテージとしてアミロース重量を示した値に基づく。別の実施形態では、デンプン中のアミロース比率は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である（それぞれｗ／ｗ）。本発明の別の実施形態では、この方法により、少なくとも８０％または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のアミロース比率が得られる。
別の実施形態では、この方法は、小麦胚乳のデンプン分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）タンパク質、酵素活性またはその双方のレベルを変えること、好ましくは低下させることを含む。すなわち、小麦植物に遺伝的変異が導入されると、直接的にまたは間接的にＳＢＥＩＩａのレベルが変更され、その結果として本明細書に記述するようにデンプンが修飾される。先の実施形態と相互に排他的ではない別の実施形態では、この方法は、小麦胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子の発現レベルを変えること、好ましくは低下させることを含み、あるいは、この方法は、胚乳のＳＢＥＩＩａ活性を低下させるような小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異を含む。ＳＢＥＩＩａ遺伝子発現のレベルまたは他の遺伝子のレベルの低下は、核酸、例えば阻害性分子をコードする導入遺伝子の導入によって実現することができる。阻害性分子の例としては、アンチセンスＲＮＡ分子、コサプレッションＲＮＡ分子、リボザイムＲＮＡ分子、または二重鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。
本明細書では、「改変すること」、「増加させること」、「増加された」、「低下させること」、「低下した」、「阻害された」などの用語は、比較的な用語、すなわち野生型または未改変の状態と比較しての用語とみなす。「タンパク質のレベル」とは、特定のタンパク質、例えばＳＢＥＩＩａの量を意味し、これは、例えば、ウェスタンブロット分析や他の免疫学的方法など当技術分野で既知の任意の方法によって測定することができる。「酵素活性のレベル」とは、酵素アッセイで測定した特定の酵素の量を意味する。変異体の酵素活性のレベルは改変されているがタンパク質自体の発現レベル（量）は改変されていないことがあると理解されよう。逆に言えば、タンパク質の量を変えることはできるが、程度の差はあれ活性なタンパク質が産生される場合は、その活性は同じままである。例えば、その酵素をコードする遺伝子が不活性化されるようなときには、量および活性の双方の低下も起こり得る。一部の実施形態では、タンパク質または活性のレベルは、未修飾の小麦の胚乳におけるタンパク質または活性のレベルと比べて、少なくとも４０％または少なくとも６０％、あるいは少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低下している。タンパク質活性、酵素活性、または遺伝子発現のレベルの低下は、穀粒のどの発育段階でも、特に発育中の胚乳でデンプンが合成される時期である穀粒の登熟期の間に起こってもよく、成熟に至るまでの穀粒発育のすべての段階で起こってもよい。
本明細書では、本質的にα−グルコピラノース単位で構成された多糖類を「デンプン」と定義する。デンプンは、小麦中の主要な貯蔵炭水化物であり、アミロプラスト中で合成され、顆粒中で形成および貯蔵される。デンプンは、ほぼ直鎖状のα−１，４−Ｄ−グルコピラノースポリマーであるアミロースと、主にα−１，４結合したα−Ｄ−グルコピラノース単位にα−１，６結合分枝が付いた短鎖を有するアミロペクチンとを含む。野生型植物から得た小麦デンプンは、アミロースを最大約２０％〜３０％、アミロペクチンを最大約７０％〜８０％含む。これら２種の分子の別の有意な差は、分子量である。アミロースはらせん状の構造で分子量が１０４〜１０６ダルトンであり、一方、アミロペクチンの分子量は１０７〜１０８ダルトンである。近年の研究により、アミロース中に最大約０．１％のα−１，６−グリコシドの枝分かれ部位が存在することがあることが示され、したがって、「ほぼ直鎖状」と表現されている。本明細書では、α−１，４結合のグルコシド（グルコピラノース）単位およびアミロース様の長鎖アミロペクチン（「中間体」または「アミロース様アミロペクチン」と呼ばれることがある。Ｔａｋｅｄａ他、１９９３年ｂ；Ｆｅｒｇａｓｏｎ、１９９４年）から構成されるほぼ直鎖状の分子を含めて、「アミロース」と定義する。例えば９０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯを用いてのサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、コンカナバリンＡ法（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社、アイルランド）を含めて当技術分野で既知の方法のいずれかを用いるか、好ましくは例えば実施例１で記述するヨード滴定法によってアミロース含有量を決定することができる。ＨＰＬＣ法は、デンプンの脱分枝を伴うものでも（ＢａｔｅｙおよびＣｕｒｔｉｎ、１９９６年）、脱分枝を伴わないものでもよい。穀粒重量およびアミロース含有量から、穀粒当たりのアミロース蓄積量を計算し、トランスジェニック系統とコントロールの系統とを比較することができる。
別の実施形態では、この方法は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて小麦胚乳中のＳＢＥＩＩａの量または活性を決定するステップを含む。ある実施形態では、例えば、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ検定法などの免疫検出法によってタンパク質のレベルを測定し、または、それに対応するｍＲＮＡのレベルを、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析や逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）など当技術分野で公知の方法によって測定する。別の実施形態では、この方法は、胚乳中のＳＢＥＩＩａタンパク質または酵素活性のレベルが変えられている小麦植物または穀粒を選択またはスクリーニングするステップを含む。選択ステップは、ＳＢＥＩＩａ活性またはタンパク質のレベルの低下に基づいてもよく、あるいは、アミロース比率の上昇やアミロペクチン比率の低下など小麦植物の穀粒のフェノタイプ、見た目のフェノタイプ、例えばしわ型穀粒、またはデンプン粒の特性の変化に基づいてもよい。
本発明は、本明細書で記述する方法のうちのいずれかを用いて、直接的にデンプンの特性を測定して、または間接的に、例えば、植物またはその穀粒中の遺伝的変異の存在を検出することによって、穀粒のデンプンの特性が変えられた小麦植物を同定する方法を含むと理解されるであろう。植物は、小麦植物の集団の植物、例えば、小麦育種の植物などでよい。
ＳＢＥ活性は、酵素アッセイ、例えばホスホリラーゼ刺激法（ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９７８年）によって直接測定することができる。この検定法では、ホスホリラーゼａによるメタノール不溶性ポリマー（α−Ｄ−グルカン）へのグルコース１−リン酸の取込に対するＳＢＥの刺激を測定する。ＳＢＥ活性は、グルカンポリマーの枝分かれの結果として生じるグルカン−ポリヨウ素錯体の吸光度の減少を測定するヨウ素染色法によって測定することができる。ＳＢＥ活性は、イソアミラーゼによる分解の後、基質として還元されたアミロースから生成される還元末端を測定する分枝結合検定法によって検定することもできる（Ｔａｋｅｄａ他、１９９３年ａ）。ＳＢＥＩ活性またはＳＢＥＩＩｂ活性がない状態で活性を測定することが好ましい。ＳＢＥのアイソフォームは、様々な基質特異性を示す。例えば、ＳＢＥＩはアミロースを枝分かれさせる活性が高く、一方、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは、アミロペクチン基質を枝分かれさせる割合が高い。アイソフォームは、移動されるグルカン鎖の長さに基づいて区別することもできる。本明細書で記述するものなど特異的な抗体を用いて、ＳＢＥタンパク質を測定してもよい。ＳＢＥＩＩ活性は、穀粒の発育中に、発育中の胚乳で測定してもよく、あるいは、等価であるが改変されていない穀粒中にタンパク質がなお存在し、免疫学的方法で検定することができる成熟穀粒で測定してもよい。
別の態様では、本発明は、穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも５０％になるように、小麦胚乳中の複数のデンプン生合成酵素の活性を改変し、好ましくは低下させる方法であって、前記酵素のうちの１種がＳＢＥＩＩａである方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂの双方のタンパク質または酵素活性のレベルが低められ、あるいは、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂ、およびＳＢＥＩの３種すべてのレベルが低められる。ＳＢＥＩＩａとともに改変することができる他のデンプン生合成酵素は、ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩである。デンプン脱分枝酵素は、例えばイソアミラーゼまたはプルラナーゼの活性を改変することもできる。ＳＢＥＩＩａが改変される限りにおいて、上記の酵素の任意の組合せでも提供される。別の実施形態では、植物の胚乳以外の組織に存在する１種または複数のデンプン生合成酵素の活性が改変される。例えば、主に胚乳での発現を目的としたＳＢＥＩＩａ阻害分子をコードする導入遺伝子によって活性の損失が起こると、それを補うために、葉のＳＢＥＩまたはＳＢＥＩＩの活性が増大されることがある。改変は、例えば、量の増加または減少でも、発現時期の変化でもよい。あるいは、ＳＢＥＩＩａの低下とともに、１種または複数のデンプン生合成酵素を過剰発現させることによって、デンプン合成をさらに改良することができる。このような酵素をコードする遺伝子は、様々な供給源のうちのいずれかから、例えば、細菌または小麦以外の他の供給源から得てもよく、また、触媒特性を変えるように、例えば、酵素の温度依存性を変えるように修飾することができる（例えば、ＷＯ９４／０９１４４を参照のこと）。
高アミロースのフェノタイプは、ＳＢＥＩＩａ遺伝子の発現、またはＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子を部分的にまたは全体的に阻害することによって実現することができる。１つまたは複数の遺伝子が阻害される程度によって、小麦穀粒で作られるデンプンの特質がある程度決められることになる。修飾された小麦胚乳から抽出されたタンパク質に対して一連のゲル電気泳動法のいずれかを実施すると、その特質とＳＢＥＩＩａ活性および／またはＳＢＥＩＩｂ活性に対する修飾の程度が明らかになる。修飾は、ＳＢＥＩＩａ活性および／またはＳＢＥＩＩｂ活性の低下、酵素活性の完全な消失、または胚乳内のＳＢＥＩＩｂまたは他の酵素の分布の変化として起こることがある。これらの検定を実施するために、例えば、Ｒａｈｍａｎ他により１９９５年に概説されているように、小麦胚乳からデンプンを抽出し、その中のタンパク質を分析することができる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）やイムノブロッティングなど当技術分野で公知の技術を、可溶性画分およびデンプン粒画分に対して実施し、結果を用いてＳＢＥＩＩａ酵素および／またはＳＢＥＩＩｂ酵素に修飾が起こっている植物または穀粒を同定する。
＜小麦植物＞
別の態様では、本発明は、デンプン中のアミロース比率が少なくとも３０％である穀粒を結実することができる小麦植物を提供する。別の実施形態では、アミロース比率は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である。別の実施形態では、その穀粒がデンプン中にこれらのレベルのうちのいずれかのアミロースを含む小麦植物は、野生型穀粒と比べて胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルを低下させる遺伝的変異を含む。好ましい実施形態では、この遺伝的変異は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異またはＳＢＥＩＩａ遺伝子発現の阻害物質をコードする導入核酸を含む。この阻害物質は、アンチセンスＲＮＡ分子、コサプレッションＲＮＡ分子、リボザイムＲＮＡ分子、二重鎖ＲＮＡ分子、あるいはＳＢＥＩＩａの発現および／または活性を阻害する類似の分子を含んでよい。
本明細書では、例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦の亜種）（一般的な小麦またはパン小麦）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦）の他の亜種、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍＬ．ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ（リベット小麦の亜種）（マカロニ小麦または硬質小麦としても知られているデュラム小麦）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（ヒトツブ小麦の亜種）（栽培型のヒトツブ小麦または小型のスペルト小麦）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉ ｓｓｐ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉ（チモフェービ小麦の亜種）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｇｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｄｉｃｏｃｃｏｎ（リベット小麦の亜種）（栽培型のエンマー小麦）、およびＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ（リベット小麦）の他の亜種を含めて（Ｆｅｌｄｍａｎ）、商業的に栽培されている普通小麦属の種に属する任意の植物を小麦植物と定義する。小麦は、ＡＡＢＢＤＤ型のゲノムを有する６倍体小麦でも、ＡＡＢＢ型のゲノムを有する４倍体小麦でもよい。本発明による小麦の遺伝的変異は、ライムギおよびオオムギを含めた一部の関連種にハイブリダイゼーションによって伝達することができるため、本発明は、パン小麦とライムギの交配種であるライ小麦を含めて、このようにして形成された交配種も含む。特定の実施形態では、小麦植物は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦）種のものであり、好ましくは、亜種ａｅｓｔｉｖｕｍのものである。あるいは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通小麦）からデュラム小麦に変異または導入遺伝子を容易に移すことができるため、小麦は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ（リベット小麦の亜種）であることが好ましい。
本発明は、野生型植物から抽出したデンプンと比べてアミロースを高比率で含むデンプンを有する穀粒を結実することができる、胚乳中のＳＢＥＩＩａタンパク質、酵素活性、またはその双方のレベルを低下させた小麦植物も提供する。ＳＢＥＩＩａのレベルの低下は、穀粒の発育過程の少なくとも一段階で起こってもよく、成熟に至るまでの全過程で起こってもよい。別の実施形態では、胚乳中のＳＢＥＩＩａのレベルは、野生型と比べて少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低められる。「野生型」という用語は、遺伝学の分野におけるの通常の意味を指し、本明細書で教示するような修飾をしていない小麦の栽培品種または遺伝子型を含む。
本発明は、遺伝子型および／またはフェノタイプにおいて、親の小麦植物の望ましい形質を有する子孫植物および子孫穀粒も提供する。本発明の範囲は、培養組織や培養細胞などのような望ましい形質を有する植物を作製するのに使用できる、小麦植物の増殖性の材料のどれにでも及ぶ。
本発明は、ＳＢＥＩＩａ活性の低下に加えて、ＳＢＥＩＩｂまたは他のデンプン生合成酵素を改変し、好ましくは低下させた小麦植物も含む。ＳＢＥＩＩａ活性およびＳＢＥＩＩｂ活性の低下した植物は、ＳＢＥＩＩａの低下した植物とＳＢＥＩＩｂの低下した植物とを交配することによって、あるいは、ＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子の双方の発現を阻害する分子をコードする導入遺伝子を導入することによって作製することができる。本明細書で示すように、小麦のＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子は密に結びついているため、小麦のゲノムのうちの１つによりコードされているＳＢＥＩＩａアイソフォームおよびＳＢＥＩＩｂアイソフォームを欠いている変種を同定し、そのような変種を交配して少なくとも２つのゲノムによってコードされているアイソフォームを低下させた植物を作製することによって、両方の活性を低下させた植物を作製することもできる。
本発明は、他の遺伝的背景または前述の小麦植物と交配できる他種における遺伝的変異または変異も含む。改変された（変異した）植物を、より望ましい遺伝的背景を有する植物と交配することができる。最初の交配後、適切な回数だけ戻し交配を実施して、望ましくない遺伝的背景を取り除くことができる。望ましい遺伝的背景として、商業用の収穫高および農業生産力や非生物ストレスへの耐性など他の特質を与える遺伝子の適切な組合せを挙げることができる。遺伝的背景には、改変デンプンを生合成または修飾する他の遺伝子、例えば、原因となる遺伝子が分かっていないしわ型胚乳を有する他の小麦系統に由来する遺伝子も含まれ得る。
植物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでもよい。
本発明は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子が染色体２Ａの長腕（２ＡＬ）から欠けている変異、あるいは染色体２Ａの長腕上のＳＢＥＩＩａ遺伝子が、野生型穀粒と比べて穀粒の胚乳のＳＢＥＩＩａ酵素活性を低下させる変異を有する変異を含む小麦植物も提供する。２４００種の小麦の登録品種を徹底してスクリーニングしたが、本発明者らは、天然に存在するこのような植物を発見できなかった。このことは、２ＡＬ上の機能的なＳＢＥＩＩａ遺伝子を保持するための選択が自然に起こっている可能性があることを示唆している。しかし、突然変異誘発後には、このような植物を作製し、同定することができた。これらの植物は、一部の市場で望ましいとされる非トランスジェニックである。これらの植物は、パン小麦でも、デュラム小麦でも、他の小麦でもよい。好ましい実施形態では、この小麦植物は、２ＡＬ染色体上のＳＢＥＩＩａ遺伝子の少なくとも一部の欠失を含み、この欠失はＳＢＥＩＩｂ遺伝子の少なくとも一部に及ぶことがある。当技術分野で理解されているように、パン小麦などの６倍体小麦は、一般にゲノムＡ、ゲノムＢ、ゲノムＤと呼ばれる３種のゲノムを含み、一方、デュラム小麦などの４倍体小麦は、一般にゲノムＡおよびゲノムＢと呼ばれる２種のゲノムを含む。各ゲノムは７対の染色体を含み、これらは減数分裂の進行中に細胞学的方法によって観察することができる。これらの染色体は、通常、大きさに従い最大のものから最小のものの順序で示され、したがって、染色体２は各ゲノムで２番目に大きい染色体である。各染色体には、染色体２上に非対称的に配置されたセントロメアがあり、それゆえに染色体２の２つの腕は、「短腕」および「長腕」と呼ばれている。本明細書では、この用語の標準的な意味に従って、長腕に沿ったセントロメアと先端の間の染色体部分を「染色体２Ａの長腕」と定義する。「染色体２Ｂの長腕」および「染色体２Ｄの長腕」という用語は、それぞれ小麦のゲノムＢまたはゲノムＤの染色体２に関するという点を除いて、同様に定義される。
本発明者らは、小麦の染色体２上でＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子が密に結びついしていることを発見した。特定の実施形態では、この小麦植物は、少なくともＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異を含む染色体腕２ＡＬを過半数（＞５０％）含む。すなわち、本質的には、少なくともＡゲノムのＳＢＥＩＩａ遺伝子に変異を含む染色体２ＡＬが存在している。２ＡＬの存在は、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（実施例９を参照のこと）などの細胞学的技術によって、または２ＡＬに特異的な分子マーカーを用いることによって、確認することができる。好ましい実施形態では、この小麦植物は、前記変異に関してホモ接合性である。この変異は、ヌル変異でよい。この変異は、遺伝子欠失でよい。
特定の実施形態では、欠失対立遺伝子は、ＭＬＴ２Ｂ８植物またはＭＬＴ２Ｄ１植物に由来するものである。これらの植物の変異したＳＢＥＩＩａ対立遺伝子は２ＡＬ染色体上に存在するため、交配によって、これらの対立遺伝子をパン小麦またはデュラム小麦の変種に導入することができる。したがって、本発明は、このような植物、およびそれらから得られる穀粒およびデンプン製品を含む。これらの対立遺伝子を、他の有用なデンプン生合成遺伝子もしくは対立遺伝子、または他の有用な遺伝形質と組み合わせてよい。
本発明の範囲が、このような小麦植物、またはこのような植物から得られる穀粒を作製または同定する方法に及ぶことは明らかである。
＜穀粒＞
本発明は、野生型小麦穀粒から抽出したデンプンと比べて改変されたデンプンを含む小麦穀粒も提供する。本明細書では、ほぼ成熟した穀粒を穀粒と定義する。これには、商業的環境で収穫された穀粒が含まれる。一実施形態では、改変デンプンは、少なくとも一部には小麦穀粒の胚乳の発育中にＳＢＥＩＩａ活性を低下させた結果物である。先の実施形態と相互に排他的ではない別の実施形態では、この穀粒のアミロース比率（全デンプンに対するパーセンテージ）は上昇している。これは、野生型植物から得た穀粒と比べた、デンプン中のアミロペクチンの減少率として測定することができる。野生型小麦デンプンは、アミロースを約２０〜３０％、アミロペクチンを約７０〜８０％有する。本発明の穀粒は、好ましくはアミロースを少なくとも５０％（ｗ／ｗ）含むデンプンを含有する。別の実施形態では、ＳＢＥＩＩａ活性およびＳＢＥＩＩｂ活性の双方が、胚乳の発育中に低められる。別の実施形態では、ＳＢＥＩの活性も低められる。別の実施形態では、当技術分野でよく理解されている方法によって測定したアミロース比率がは、穀粒のデンプンの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％（各ｗ／ｗ）である。アミロースレベルの上昇は、デンプン粒の形態が異常になること、または光学顕微鏡もしくは当技術分野で既知の他の方法で観察すると顆粒の複屈折性が失われていることによって、証明することができる。特定の実施形態では、ヨード滴定法によって、例えば、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬａｉｇｎｅｌｅｔ（１９８３年）の方法のような分光光度的方法でよい、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、例えば、ＢａｔｅｙおよびＣｕｒｔｉｎ、１９９６年）によって、アミロース比率を測定する。
別の実施形態では、この小麦穀粒は、例えば、糊化温度の上昇もしくは低下、糊化の進行中もしくは糊化後の膨潤特性の変化、粘度の変化、アミロペクチンの鎖長分布の変化、またはこれらの任意の組合せなどの物理的特質が改変されたデンプンを含む。糊化温度の上昇または低下は、糊化の第１ピーク、第２ピーク、またはその双方に対するものでよい。例えば糊化エンタルピーなどデンプンの１種または複数の特性は未変化でよい。示差走査熱量計で測定した糊化の第１ピーク（最高点）の温度は、野生型穀粒から得た対応するデンプンでの第１ピークの温度と比べて、少なくとも３℃または５℃、好ましくは少なくとも７℃または８℃、より好ましくは少なくとも１０℃上昇していてよい。特定の実施形態では、温度上昇は、３℃〜１２℃の範囲である。
穀粒は、しわ型でも非しわ型でもよく、好ましくは非しわ型のフェノタイプを有する。本明細書では、穀粒の大多数、好ましくは個々の穀粒の少なくとも９０％が、丸いフェノタイプまたは十分に充実したフェノタイプを示す場合、「非しわ型」と定義する。これは、通常、正常レベルまたはほぼ正常なレベルのデンプン蓄積に関連付けられている。一方、本明細書では、「しわ型」フェノタイプという用語は、穀粒の大多数、具体的には少なくとも穀粒の９０％のデンプン蓄積量が減少している場合を意味する。それぞれ野生型穀粒と比べて、少ししわ型の穀粒とは、平均デンプン含有量が少なくとも３０％に低下しているものであり、中程度のしわ型穀粒とは、平均デンプン含有量が少なくとも５０％に低下しているものであり、高度のしわ型穀粒とは、平均デンプン含有量が少なくとも７０％に低下しているものである。しわの程度は、成熟穀粒の重量に対するパーセンテージとして、相対的デンプン含有量によって測定することもできる。改変されていない屋外栽培の小麦穀粒のデンプン含有量は約６５％であるのに対し、しわ型穀粒のデンプン含有量は５０％未満に減少している。
別の実施形態では、穀粒の平均重量は、少なくとも３６ｍｇまたは４０ｍｇである。穀粒の平均重量は、数が分かっている穀粒、すなわち代表試料となるひとかたまりの穀粒の重量を測定し、穀粒の数で全重量を割ることによって、決定する。デンプン含有量、平均重量、および非しわ型フェノタイプなど穀粒の特質が野生型レベルに近いものが、穀粒の商業的製造に望ましいことが理解されよう。
本発明は、小麦粉、粗挽き粉、練り粉、または穀粒からもしくは穀粒を用いて製造した他の製品も提供する。これらは、例えば、分別または漂白による加工をしなくても加工をしてもよい。本発明は、本発明の小麦植物から得た、食品製造に有用な小麦穀粒をさらに提供する。さらに、本発明は、他の方法で加工された穀粒も含む。したがって、穀粒は、製粉しても、粉砕しても、圧扁しても、精白しても、粗挽きもしくは挽き割りにしても、パーボイルドしても（ポレンタ）よく、例えばクスクス粉でもよい。
＜デンプン＞
別の態様では、本発明は、本明細書で記述する小麦植物の穀粒から得た、アミロース比率が高くアミロペクチン比率が低いデンプンを提供する。好ましい実施形態では、デンプンは、野生型小麦に比べて胚乳のＳＢＥＩＩａタンパク質、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベルが低下した小麦植物の穀粒から得られる。別の実施形態では、野生型小麦に比べて、ＳＢＥＩＩａ活性およびＳＢＥＩＩｂ活性の双方が低く、または、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂ、およびＳＢＥＩの３種すべてのレベルが低い。
別の態様では、本発明は、本明細書で記述する小麦植物の穀粒から得た、アミロースを少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％含むデンプンを提供する。このデンプンは、少なくとも部分的に精製されている。すなわち、このデンプンは、穀粒の少なくとも１種の他の成分から分離されている。精製デンプンは、デンプンをタンパク質、油、および繊維から分離することを伴う精白プロセス、例えば湿式粉砕プロセスによって穀粒から得ることができる。精白プロセスの最初の製品は、デンプン粒の混合物または組成物であり、したがって、本発明は、本明細書で記述する加工デンプンを含むこのような顆粒を包含する。
デンプンの糊化温度は上昇していても、低下していてもよいが、上昇していることが好ましい。特定の実施形態では、ＤＳＣによる測定によれば、第１ピークの立ち上がりの温度または第１ピークの最高点の温度のうちの少なくとも１つが、野生型小麦穀粒から抽出したデンプンと比べて、少なくとも３℃、少なくとも５℃、少なくとも７℃、または少なくとも１０℃上昇している。特定の実施形態では、温度上昇の範囲は３℃〜１２℃である。特に留意すべきことには、糊化温度は、第１ピークの立ち上がりの温度が低下するとともに、ピーク最高点の温度が上昇していることがある。先の実施形態と相互に排他的ではない別の実施形態では、ＤＳＣにより測定すると、デンプンの糊化温度の第１ピークは変わっているが、アミロースと脂質の高熱分解に対応する第２ピークの温度はほぼ変わっていない。別の実施形態では、デンプンの糊化エンタルピーは減少しており、例えば、対応する野生型小麦デンプンのエンタルピーと比べて、少なくとも２５％または少なくとも４０％減少している。
別の実施形態では、このデンプンは、特異的な物理的特質によって示される改変された構造を有するレジスタントスターチを高レベルで含む。このような特質には、消化酵素に物理的に接近しにくい特質が含まれることがあり、これは、デンプン粒の形態が変わっていること、相当量のデンプン結合脂質が存在すること、結晶化度の変化、アミロペクチン鎖長分布の変化、またはこれらの任意の組合せが原因となっている可能性がある。高アミロース比率も、レジスタントスターチのレベルに寄与している。
本発明は、好ましくは高レベルのレジスタントスターチとともに、増量した食物繊維を含む、例示的な小麦植物の穀粒から得たデンプンも提供する。
本発明の範囲が、本明細書で記述する小麦デンプンを製造する方法に及ぶことは明らかである。一実施形態では、本方法は、本明細書で記述する小麦穀粒を得るステップと、その穀粒からデンプンを抽出するステップを含む。この小麦穀粒は、本明細書で記述する小麦植物を栽培し、穀粒を収穫することによって得ても、穀粒の生産者または穀粒の輸入業者から入手してもよい。
＜遺伝子活性の低減方法＞
ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂその他のデンプン生合成または修飾遺伝子の発現および／または活性は、１つまたは複数の遺伝的変異を小麦植物に導入することにより変わることがある。本明細書において用いる場合、「遺伝的変異」とは、この文脈において、対象とする遺伝子の発現または活性に影響を及ぼす、小麦植物ゲノムにおける遺伝性の任意の変化を意味する。遺伝的変異としては、点変異、挿入、置換、逆位、重複、転座および好ましくは欠失などの突然変異ならびに１つまたは複数の導入遺伝子のゲノムへの導入を含む。
本明細書において用いる場合、「核酸分子」および「核酸配列」という語句は、ヌクレオチドのポリマーを指し、これは一本鎖でもよい二本鎖でもよい。それは、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはこれらの任意の組合せを含み得る。小麦細胞への導入のために、送達性または安定性を改善するべく核酸分子を化学的に修飾してもよいし、ウイルスベクターなどのベクターの一部として保護してもよい。核酸分子はクローン技術によって得てもよいし、周知の技術である技術によって合成してもよい。核酸分子は、コード鎖もしくは非コード鎖（アンチセンス）または、例えば、逆位反復コンストラクトにおけるような、これらの組合せを含み得る。遺伝子に「対応する」核酸配列と言う場合、「対応する」という用語は、ヌクレオチド配列が、参照遺伝子またはその指示された部分と同じヌクレオチド配列を有するか、通常のワトソン−クリック型塩基対において正確に相補的であるヌクレオチド配列を有するか、そのような配列のＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）等価物であるか、遺伝子のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡであるような、ヌクレオチド配列関係を指す。
ヌクレオチド配列は、５'から３'方向へ、標準的な１文字ヌクレオチド省略形を使用して一本鎖配列によって表す。「相補性」は、塩基対合によってアニールされる２本の一本鎖核酸分子または配列の関係を記述するものである。例えば、５'−ＧＡＣＴ−３'は、その相補鎖５'−ＡＧＴＣ−３に対合する。「相同性」または「相同的」は、文脈によって２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の間の配列の類似性または同一性を指す。「％同一性」という用語は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ ＶアルゴリズムまたはＢｌａｓｔｎもしくはＢＬＡＳＴ２配列プログラム（これらは米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手可能で、インターネット上ではｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で利用可能であり、好ましくはデフォルトのパラメータ設定とする）などの標準的なものとなっているアルゴリズムを使用してアラインメントを行った２つのヌクレオチド配列間のヌクレオチドの合致の％を指す。同様にして、「％同一性」はポリペプチド配列を指すこともある。
本明細書において、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂその他のデンプン生合成支配遺伝子またはアンチセンス、コサプレッション、リボザイム、二重鎖ＲＮＡ分子その他をコードする遺伝子などを含め「遺伝子」という場合、その最も幅広い文脈で解するものとし、プロモーターと転写ターミネーター−ポリアデニル化配列などの制御領域を伴う転写領域を有する古典的なゲノム遺伝子を含む。転写領域は転写されたが、翻訳されなかった配列（非翻訳配列、ＵＴＲ）を含み、状況に応じて、タンパク質コード領域もしくはイントロン（これは成熟したＲＮＡを形成するために除かれる）またはこれらの任意の組合せを含んでもよい。「遺伝子」は、エキソンに対応するｃＤＮＡから得られる形態およびＲＮＡゲノムで見られるようなＲＮＡ遺伝子を含む。「遺伝子」という用語は、機能的な産物の全部または一部をコードする合成または融合分子を記述するためにも用いられる。
細胞、好ましくは、小麦細胞中に存在する場合、「遺伝子」は、「生物活性」分子または「遺伝子産物」（これはＲＮＡでもポリペプチドでもよい。）の「発現」を指示する。この過程は、最も一般的にはＲＮＡを生産するための転写とタンパク質を生産するための翻訳による。これらの産物は、その後細胞内で修飾されてもよい。ＲＮＡは、例えば、ポリアデニル化、スプライシング、キャッピング、２１〜２３のヌクレオチド断片へのダイシング、核からの輸送またはタンパク質に対する共有結合もしくは非共有結合的な相互作用によって修飾されてもよい。例えば、タンパク質はリン酸化、グリコシル化または脂質化によって修飾されてもよい。本明細書において用いる場合、これらの過程はすべて「遺伝子の発現」その他の用語に包含される。
本明細書において用いる場合、「小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子」および「小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子」という用語ならびに関連語は、それぞれ、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ酵素をコードする小麦から同定された遺伝子、および他の小麦の種類に存在する相同遺伝子を指す。これらは表１に列挙する遺伝子配列を含むが、これらに限定されるものではない。ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ遺伝子の配列には、異なる小麦の種類からの自然変異があると思われる。相同遺伝子は、当業者であれば容易に認識できる。ＳＢＥＩＩｂ遺伝子またはタンパク質についてと同様に、相同的なＳＢＥＩＩａ遺伝子またはタンパク質の間の配列同一性の程度は、少なくとも９０％であると考えられる。
本発明で用いる遺伝子は、天然に存在するＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂその他に由来してもよいし、標準的な組み換え技術によってその他のデンプン生合成支配遺伝子に由来するものでもよい。本明細書において用いる場合、「組み換え核酸分子」その他の用語は、天然に存在しない配列であるか、本来別個の２以上の配列セグメントの人工的組合せによって作られる配列を有する配列を指す。この人工的組合せは、化学合成によって、または、より一般的に、例えば、周知の技術である遺伝子工学技術によって、単離された核酸セグメントを人工的に操作することによって作られるものでもよい。「組み換え」という用語は、単に核酸の一部の追加、置換または欠失のみによって変更された核酸を含む。多くの場合、組み換え核酸は、プロモーター配列に機能的に連結された核酸配列を含んでもよい。そのような組み換え核酸は、例えば、細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部でもよい。
一般に、遺伝子は１つまたは複数のヌクレオチド置換、欠失および／または添加（例えばコドン修飾）を生じる突然変異生成に付してもよい。そのような遺伝子のヌクレオチド挿入型の誘導体は、５'および３'端融合ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの内部配列挿入を含む。挿入型のヌクレオチド配列変異形では、１つまたは複数のヌクレオチドがヌクレオチド配列で予め定められたサイトに導入されるが、ランダムな挿入を行い結果として生じる産物を適宜スクリーニングすることも可能である。欠失型変異形は、配列から１つまたは複数のヌクレオチドの除去によって特徴付けられる。置換型のヌクレオチド変異形は、配列の少なくとも１つのヌクレオチドが取り除かれ、異なるヌクレオチドがその位置に挿入されたものである。置換がコドンによって定義されるアミノ酸を変えないという点で、そのような置換は「サイレント」でもよい。あるいは、保存的な置換基は、１つのアミノ酸を別の同様に働くアミノ酸に変えるように設計される。典型的な置換は、以下に従ってなされるものである：
保存的なアミノ酸置換に適する残基
元の残基 置換例
Ａｌａ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｇｌｎ；Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ；Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
＜導入遺伝子＞
ＳＢＥｌｌａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他デンプン生合成または修飾遺伝子の発現および／または活性は、１つまたは複数の導入遺伝子を小麦植物にもたらすことによって変更され得る。本明細書で言う「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの技術分野における通常の意味を有し、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって製造されたか変更され、対象とする有機体または細胞（好ましくは小麦細胞）に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、有機体または細胞に由来する遺伝子配列（例えば、アンチセンス配列）を含んでもよい。導入遺伝子は、典型的には、前記有機体または細胞に由来しない外来性の核酸を含む。「トランスジェニック」とは、導入遺伝子を含む有機体または細胞を指す。「非トランスジェニック」とは、ゲノム中にいかなる導入遺伝子も存在しないことを指す。安定した継承のために、好ましくは導入遺伝子を有機体または細胞のゲノムに組み込む。
当業者は、遺伝子またはそれに対する相補配列の発現のためには、前記遺伝子が、細胞内でプロモーター配列との機能的な関係に置かれる必要があると承知している。本明細書の目的のためのプロモーターの選択は、必要な発現レベルおよび／または発現させるべき組織、器官および種によって、特に胚乳特異的プロモーターによって変わり得る。
プロモーター配列の制御調節の下に核酸分子を置くことは、発現がプロモーター配列によって制御されるように前記分子を位置付けることを意味する。プロモーターは、通常（但し、必須ではない）、それが調節する核酸分子の上流に、または５'末端に位置する。さらにまた、プロモーターを含む調節要素は、通常、遺伝子の転写開始部位の２ｋｂ以内に位置する。異種プロモーター／構造遺伝子組合せの構築では、一般に、その自然の条件下でプロモーターとそれが制御する遺伝子（すなわち、それからプロモーターが誘導される遺伝子）との間の距離とほぼ同じ距離に、遺伝子転写開始部位からプロモーターを隔てて配置するのが好ましい。当技術分野において知られているように、この距離が若干変化してもプロモーター機能を損なうことなく対応できる。同様に、その制御下に置かれる異種遺伝子に関しての調節配列要素の好ましい位置は、その自然の条件下での要素（すなわち、それから誘導される遺伝子）の位置によって定義される。また、当技術分野で知られているように、この距離においても若干の変化は生じ得る。
本発明の遺伝子コンストラクトにおける使用に適したプロモーターの例としては、ウイルス、イースト、カビ、バクテリア、昆虫、鳥、哺乳類および植物の遺伝子に由来するプロモーターが挙げられ、好ましくは植物細胞で機能し得るもの、より好ましくは小麦の胚乳で発現し得るものが挙げられる。プロモーターは構成的に、または発現が起こる組織によって異なるように発現を調節するものでよい。あるいは、発現は発現が起こる発育時期に関して、または、外刺激（例えば生理的ストレスまたは温度）に応じて異なってもよい。
ＳＢＥＩＩａその他のデンプン生合成支配遺伝子活性を低減する方法は、導入遺伝子を小麦の再生可能な細胞に導入して、形質転換細胞からトランスジェニック小麦植物を再生させるステップを含み得る。アミロペクチンの合成に関係する分枝酵素はＳＢＥＩ、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂを含み、本発明はＳＢＥＩＩａのみの、または、ＳＢＥＩＩｂまたはＳＢＥＩ発現の変更と組み合わせた発現低減を包含する。したがって、導入遺伝子（複数可）はこれらの遺伝子のうちの２つ以上を不活性化してもよい。さらに、導入遺伝子（例えば、二重鎖ＲＮＡ、アンチセンスまたはリボザイムＲＮＡをコードするもの。下記参照）が直接ＳＢＥｌｌｂまたはＳＢＥＩ遺伝子形質発現を標的とするという点で、ＳＢＥＩＩｂやＳＢＥＩの失活は直接的でもよいし、あるいは、それはＳＢＥＩＩｂまたはＳＢＥＩの発現に間接的に変更をもたらすものでもよい。例えば、導入遺伝子ＲＮＡは配列同一性または塩基の対合に関してＳＢＥＩＩａ遺伝子／ＲＮＡのみを標的としてもよいが、胚乳におけるタンパク質の安定性または分布を変えることによって、ＳＢＥＩＩｂまたはＳＢＥＩ活性の低減をもたらすものでもよい。さらに、本発明の形態は、ＳＢＥＩＩａの変更された活性と１つまたは複数の他のアミロペクチン合成酵素（これらの酵素はＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩおよびイソアミラーゼまたはプルラナーゼなどの脱分枝酵素を含んでもよい。）の変更の組合せにある。これらのいずれかまたはすべての発現は、導入遺伝子の導入によって変更され得る。
小麦のアミロペクチン合成遺伝子についてはいくつかのＤＮＡの塩基配列が知られており、それらのいずれでも小麦における遺伝子失活のための導入遺伝子を設計するためのベースとすることができる。これらのものとしてはＳＢＥＩＩａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１１２８２、ＡＦ３３８４３１およびＡＦ３３８４３２）およびＳＢＥＩＩｂ（ＷＯ００／１５８１０、ＷＯ０１／６２９３４）が挙げられる。小麦のＳＢＥＩ遺伝子は、Ｒａｈｍａｎ他（１９９７年）およびＲａｈｍａｎ他（１９９９年）に記載されている。ＳＢＥＩのためＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔａｕｓｃｈｉｉ配列（これは小麦ＤゲノムＳＢＥＩ遺伝子との相同性が高い。）は、ＷＯ９９／１４３１４に見ることができる。小麦のＳＢＥＩのためのｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいてアクセッション番号ＡＦ０７６６７９でアクセスすることができる。大麦その他の密接に関連する種から得られる他のアミロペクチン合成遺伝子のホモログは、小麦において遺伝子形質発現レベルを修飾するのに用いることもできる。そのような遺伝子またはその断片は、ＰＣＲ増幅または標識化プローブへのハイブリダイゼーションを含む当技術分野では周知である方法によって得ることができる。
本明細書において用いる場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性がプローブと標的配列の間にあるならば、ハイブリダイゼーションが通常、起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ（１５ｍＭクエン酸トリナトリウム））、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよびサケ精子ＤＮＡなどの変性剪断キャリアＤＮＡ２０μｇ／ｍｌからなる溶液中で一夜インキュベーションした後、ハイブリダイゼーションの支持体をおよそ６５℃で０．１×ＳＳＣで洗浄するというものである。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）、特に第１１章に例示されている。
導入遺伝子コンストラクトの調製に用いるホモログの領域は、対応する小麦遺伝子と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５〜１００％の同一性を適当な領域内に有すべきである。また、導入遺伝子は、小麦胚乳内で発現されるアミロペクチン合成遺伝子を特異的に標的とし、植物中、他の場所でのアミロペクチン合成にはより小さなまたは最小限の影響しか与えないことが好ましい。これは、導入遺伝子中の胚乳特異的プロモーターなどの適当な調節配列の使用によって達成してもよい。
＜アンチセンス＞
小麦などの植物において遺伝子活性に変更を加える、特に低減する遺伝子工学アプローチは、当技術分野において周知である。これらの方法は、標的遺伝子のＲＮＡと相補的でハイブリダイズすることができる適当なアンチセンス分子の発現のための、遺伝子コンストラクトの導入を含む。アンチセンス分子は標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳または処理または安定性に干渉し、それによって遺伝子の発現を不活性化すると考えられる。アンチセンス配列を考案する方法は周知の技術であり、これらの例は米国特許第５１９０１３１号、欧州特許明細書第０４６７３４９−Ａ１号、欧州特許明細書第０２２３３９９−Ａ１号および欧州特許明細書第０２４０２０８号に見ることができ、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。植物におけるアンチセンス法の使用は、Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５年）とＳｅｎｉｏｒ（１９９８年）によって概説されている。Ｂｏｕｒｑｕｅは、植物システムにおいてアンチセンス配列を使った遺伝子失活の多数の例を列挙している。彼女も、部分的な阻害がシステムにおいてかなりの変化を確かにもたらすであろうから、酵素活性の１００％の抑制を達成することは必要ではないと述べている。Ｓｅｎｉｏｒ（１９９８年）は、アンチセンス法は、現在、植物で遺伝子形質発現を操作することの非常に安定した技術であると述べている。
小麦ＳＢＥｌｌａ、ＳＢＥＩＩｂ、ＳＢＥＩその他のデンプン生合成または修飾遺伝子についてのアンチセンス分子は、小麦ｍＲＮＡ配列に基づくことができるか、他の種（例えば、大麦）から得られる相同なＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列に由来し得る。アンチセンス配列は、これらの遺伝子のいずれかの転写物の全部または一部に、または、それらの発現（例えば、それらのスプライシング）の制御を及ぼす配列について対応すればよい。アンチセンス配列は、小麦ＳＢＥＩＩａその他の遺伝子の標的とされたコード領域または５'−非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３'−ＵＴＲまたはこれらの組合せに対応してもよい。それは、ある程度、イントロン配列（それは転写の間または後に除かれ得る）と相補的でもよいが好ましくは標的遺伝子のエキソン配列のみに相補的である。ＵＴＲは一般に違いがより大きいことからすれば、これらの領域を標的とすることは、遺伝子抑制により大きな特異性をもたらす。特定の実施形態において、アンチセンス配列の長さは、遺伝子ＲＮＡ配列の相補鎖と対応する少なくとも１９の隣接するヌクレオチド、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００または少なくとも１０００のヌクレオチドである。すべての遺伝子転写物と相補的な全長配列を用いてもよい。特定の実施形態において、アンチセンス配列の長さは、１００〜２０００ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、標的とされた転写物に相補的なアンチセンス配列の配列同一性の程度は、少なくとも８５％、少なくとも９０％または９５〜１００％である。アンチセンスＲＮＡ分子は、もちろん、分子を安定させるために機能してもよい無関係な配列を含んでもよい。
＜コサプレッション＞
使用し得る別の分子生物学的製剤アプローチは、コサプレッションである。コサプレッションのメカニズムは、十分理解されていないが、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を含むと考えられており、この点ではアンチセンス抑制の多くの例と、非常に類似している。それは、その発現のためには、プロモーターに関してセンス方向に植物内に遺伝子の余分なコピーまたはその断片を導入することが必要である。センス断片のサイズ、標的遺伝子領域との対応および標的遺伝子への配列同一性の程度は、上述のアンチセンス配列に関してと同様である。若干の例では、遺伝子配列のさらなるコピーは、標的植物遺伝子の発現の妨害をする。コサプレッションアプローチを実行する方法については、ＷＯ９７／２０９３６および欧州特許明細書第０４６５５７２号を参照されたい。
＜二重鎖ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング＞
遺伝的変異を小麦植物に導入するために使用され得るさらなる方法は、二重鎖あるいは二本鎖ＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングである。この方法も、ＰＴＧＳを含む。この方法では、失活させるべき標的遺伝子に相同で少なくとも部分的に二本鎖であるＲＮＡ産物（複数可）の合成を指示するＤＮＡを導入する。したがって、ＤＮＡは、ＲＮＡに転写されるときハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるセンスとアンチセンス配列からなる。好ましい実施形態において、センス配列とアンチセンス配列は、ＲＮＡに転写されるとき、スプライシングで除かれるイントロンからなるスペーサー領域によって分離されている。この構成は、遺伝子サイレンシングをより高効率にすることが示された。二本鎖領域は、１または２のＤＮＡ領域から転写される１または２のＲＮＡ分子を含んでもよい。二本鎖分子の存在は、二本鎖ＲＮＡおよびさらには標的植物遺伝子からの相同なＲＮＡ転写物も破壊する内在性植物システムからの応答を誘発し、標的遺伝子の活性を能率的に低減するか排除する。この技術を実施する方法については、オーストラリア特許明細書第９９／２９５１４−Ａ号およびＷＯ９９／５３０５０を参照されたい。特定の実施形態において、ハイブリダイズするセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、少なくとも１９の隣接するヌクレオチド、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００または少なくとも１０００のヌクレオチドである。すべての遺伝子転写物と対応する全長配列を用いてもよい。特定の実施形態においては、長さは範囲１００〜２０００ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、センス配列およびアンチセンス配列の標的とされた転写物への配列同一性の程度は、少なくとも８５％、少なくとも９０％または９５〜１００％である。ＲＮＡ分子は、もちろん、分子を安定させるために機能してもよい無関係な配列を含んでもよい。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下に発現されるものでもよい。後者の例は、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターを含む。二本鎖ＲＮＡ分子は、互いに連結された複数の遺伝子からの配列を含んでもよく、それによって複数の遺伝子を標的としてもよい。
＜リボザイム＞
小麦の遺伝子形質発現の望ましい失活をもたらす遺伝的変異は、１つまたは複数のリボザイムをコードする核酸分子を含む。リボザイムは、１またはしばしば２つのハイブリダイズしている配列によって定義される特定のサイトで他のＲＮＡ分子を切断することができる、酵素または触媒機能を有するＲＮＡ分子である。ＲＮＡの切断により、標的遺伝子の発現を不活性化する。リボザイムはアンチセンス分子の働きをしてもよく、それが遺伝子失活に寄与してもよい。リボザイムは、ハイブリダイズしている配列の間で１つまたは複数の触媒領域（好ましくはハンマーヘッドまたはヘアピンタイプ）を含む。ＲＮＡｓｅＰ、Ｇｒｏｕｐ ＩまたはＩＩイントロンおよびデルタ型肝炎ウイルスタイプを含め、他のリボザイムのモチーフを用いてもよい。欧州特許明細書第０３２１２０１号および米国特許第６，２２１，６６１号が参照される。例えばＷｅｇｅｎｅｒ他（１９９４年）によって、遺伝子導入植物の遺伝子を不活性化するリボザイムの使用が示されている。
＜遺伝子コンストラクト／ベクター＞
本発明は、遺伝子阻害分子をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ、好ましくはＤＮＡを含む単離された核酸分子も提供する。ある実施形態において、核酸分子は、小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子配列を標的とし、小麦穀粒の胚乳のその発現を失活させるアンチセンス、センス（コサプレッション）、二本鎖ＲＮＡまたはリボザイム分子をコードする。本発明はまた、プロモーター、エンハンサーおよび転写末端またはポリアデニル化配列などの１つまたは複数の調整要素を含む単離された核酸分子を含むかコードする遺伝子のコンストラクトを提供する。そのような要素は当技術分野において周知である。植物、特に小麦などの単子葉植物において、遺伝子のコンストラクトは、導入遺伝子の発現を助けるイントロン配列を含んでもよい。「イントロン」という用語は、その通常の意味では、転写されるが、タンパク質をコードせず、翻訳前にＲＮＡからスプライシングにより除かれる遺伝子の部分を意味するように使われる。導入遺伝子が翻訳産物をコードするか、そうでなく転写領域のどこかをコードするならば、イントロンは５'−ＵＴＲまたはコード領域に組み入れられてもよい。
本発明はさらに遺伝子のコンストラクトを含むベクター（例えば、プラスミドベクター）を提供する。「ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ発現が可能な発現ベクターおよび１つの細胞または有機体から別のもう１つまで転移され得る形質転換ベクターを含む。例えば、大腸菌またはアグロバクテリウムなどの原核細胞において、ベクターは細胞内での複製をもたらす配列を含む。特定の実施形態において、ベクターは少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列によって定まるＴ−ＤＮＡ配列（これは小麦細胞に導入することができる。）を含むバイナリーベクターである。本発明は、さらに、ベクターを含む細胞、例えば、未熟な胚の胚盤の細胞などの再生可能な細胞でもよいアグロバクテリウムまたは小麦細胞を提供する。あるいは、細胞は導入遺伝子を含む形質転換された小麦細胞でもよい。
＜プロモーター／ターミネーター＞
別の実施形態において、本発明の導入遺伝子または他の遺伝子コンストラクトは、小麦の胚乳内で調節されたか構成的な発現をもたらし得る転写開始領域（プロモーター）を含む。プロモーターは組織特異的で、選択的に、または、もっぱら胚乳の発現を与えるものでもよい。プロモーターは、（高分子グルテニンプロモーター、小麦ＳＳＩプロモーター、小麦ＳＢＥＩＩプロモーター、小麦ＧＢＳＳプロモーターなどの）胚乳特異的または（ユビキチンプロモーターまたはＣａＭＶ３５Ｓまたは強化された３５Ｓプロモーターなどの）胚乳に非特異的なプロモーターのいずれから選択してもよい。プロモーターは、温度、光またはストレスなどの要因によって調整されてもよい。通常、プロモーターは、発現されるべき遺伝子配列の５'をもたらされる。コンストラクトは、ｎｏｓ３'またはｏｃｓ３'ポリアデニル化領域または転写ターミネーターなどの転写を強化する他の要素も含んでもよい。例示したＤＮＡ領域は、適当な選択可能なマーカー遺伝子配列と他の要素を含むベクターに、または、ベクターがこれらの配列を含んで同時形質転換され得るベクターに取り込まれる。
＜小麦の形質転換法＞
小麦などの単子葉植物の形質転換法、すなわち、外来性の核酸の導入によって遺伝的変異を植物に導入し、プロトプラストまたは未熟な植物胚から植物を再生する方法は、当技術分野において知られており、例えば、Ｂｅｃｋｅｒ他、１９９４年、Ｃｈｅｎｇ他、１９９７年、Ｈｅ他、１９９４年、Ｈｅｓｓ他、１９９０年、Ｎｅｈｒａ他、１９９４年、Ｖａｓｉｌ他、１９９２年、Ｖａｓｉｌ他、１９９３年、Ｗｅｅｋｓ他、１９９３年、Ｗｅｉｒ他、２００１年、オーストラリア特許出願番号第７５４６０／９４号、欧州特許出願番号第７０９４６２号、ＷＯ９３／０４１７８、ＷＯ８９／１２０１２、ＷＯ９４／１３８２２およびＷＯ９９／１４３１４を参照されたい。望ましいヌクレオチド配列または遺伝子のコンストラクトおよび選択可能なマーカーを運ぶベクターは、組織栽培された植物または外植体の再生可能な小麦細胞またはプロトプラストなどの適当な植物システムに導入すればよい。選択可能なマーカー遺伝子は、小麦細胞に抗生物質または除草剤耐性を提供してもよいし、マンノースなどの基質の利用性を可能にするものでもよい。選択可能なマーカーは、好ましくはアスラム、ジェネテシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）またはハイグロマイシン耐性を小麦細胞に与える。再生可能な小麦細胞は、好ましくは、未熟な胚の胚盤、成熟した胚、これらに由来するカルスまたは分裂組織に由来する。
形質転換植物は選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよいし、あるいは、そのような遺伝子は再生の間か後に、例えば、ゲノムからの選択可能なマーカー遺伝子の切除により、または、ＳＢＥＩＩａ阻害導入遺伝子から離れた選択可能なマーカー遺伝子の分離によって除去してもよい。
導入遺伝子または突然変異が染色体に融和した植物は、例えば、導入遺伝子またはフェノタイプ観察に特有の適当な核酸プローブを使うことによりスクリーニングすることができる。いくつかの方法のいずれも、形質転換植物の存在を決定するために使用され得る。例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）は形質転換植物に特有な配列を増幅するのに用い得る（ゲル電気泳動その他の方法による増幅産物の検出を行う）。ＤＮＡは従来法を使用して植物から抽出してもよく、ＰＣＲ反応は、形質転換植物と非形質転換植物を識別するプライマーを使って実行してもよい。例えば、コンストラクトに読み込まれる形質転換ベクターからＤＮＡ領域を増幅するプライマーを設計してもよいし、逆方向プライマーは対象とすべき遺伝子から設計してもよい。植物がうまく形質転換されたならば、これらのプライマーは断片を増幅するのみである。陽性の形質転換体を確かめる別の方法は、当技術分野において周知であるサザンブロットハイブリダイゼーションによる。形質転換植物または変異体は、非形質転換植物または野生型植物からそのフェノタイプ（例えば、選択可能なマーカー遺伝子の存在によって、または免疫学的方法による特定のタンパク質の存在によって、または、タンパク質の欠如（例えば、ＥＬＩＳＡ分析アッセイまたはウェスタンブロット分析によって検出されるものとしての胚乳のＳＢＥＩＩａタンパク質の欠如）によって与えられる）によって識別すなわち区別される。そのような植物をスクリーニングする際に使われる徴候は、穀粒のフェノタイプの特徴の観察（例えば、縮んだ穀物の視覚検査または測定によって）、増加したアミロース含有量の試験または顕微鏡で複屈折の存在について調べることによることもできる。
＜変異＞
小麦胚乳においてＳＢＥＩＩａ酵素その他のデンプン生合成酵素の活性の低減をもたらす遺伝的変異の導入は、それぞれの遺伝子内における適当な突然変異にもよって達成されてもよいし、遺伝子の調節配列内における適当な突然変異にもよって達成されてもよい。本明細書の文脈では、「誘発突然変異」は化学産物、放射線または生物ベースの突然変異生成（例えば、トランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡ挿入）の結果でもよい人工的に誘発された遺伝的変異である。遺伝子が阻害される程度は、ある程度、生産されるデンプンの特徴を決定する。突然変異はトランケーションまたはヌル変異でもよく、これらがデンプンの性質に重要な影響を及ぼすことは知られている。しかし、変更されたデンプン構造は、デンプンまたは小麦穀粒において対象とする特徴をもたらすのに十分にアミロペクチン合成酵素活性を低減する漏出突然変異からも生じるであろう。他の染色体再編成も有効であり得、これらは挿入、欠失、逆位、重複または点変異を含んでもよい。本明細書で用いられる「ヌル変異」は、対象とすべき遺伝子の活性の完全かまたは完全に近い損失をもたらす突然変異を指し、例えば、遺伝子活性がもはや見出されないものを指す。
ＳＢＥＩＩａ遺伝子は、染色体２の長腕に位置する。この遺伝子その他の遺伝子への突然変異（特に欠失突然変異）は、対象とすべき遺伝子（例えば、ＳＢＥＩＩａ遺伝子または二重突然変異体の場合には、おそらく結合されたＳＢＥＩＩｂ遺伝子にまで拡大される。）に集中させることが好ましい。この文脈における遺伝子は、転写領域とともにプロモーター領域と転写終了／ポリアデニル化信号を含む。転写領域は、タンパク質コード領域（複数可）ならびにｍＲＮＡの５'非翻訳および３'非翻訳領域、さらに存在し得る任意のイントロン領域を含む。遺伝子への突然変異は、遺伝子の任意の領域におけるまたは領域の組合せでもよく、１つのヌクレオチドのみの変更（例えば、コード領域のフレームシフト突然変異）からすべての遺伝子の欠失に及び得る。遺伝的変異のためにホモ接合性である植物が好ましい。
欠失は、１００または２、３００程度、おそらくは５００キロベース単位のサイズに制限してもよい。特定の実施形態において、欠失は少なくとも２、３０００キロベースまたは５０００キロベース未満まで拡がる。本発明は、それぞれのゲノムの染色体２の長腕の多くを含むより大きな欠失を含んでもよいが、染色体２の長腕は多数の他の遺伝子をその上に集中させて有するので、小麦植物の生命力に対し影響を与えるため、これは好ましくない。したがって、大きな欠損が起こる場合は、これらは植物生命力に対し悪影響を与え、それゆえに、その商業的な生存能力に対し悪影響を与えるため、少なくとも染色体２の長腕の大多数が存在することが望ましい。好ましい実施形態において、染色体２Ａの長腕の大部分は存在する。
突然変異生成は、化学または放射線手段、例えば、種子のＥＭＳまたはアジ化ナトリウム（ＺｗａｒおよびＣｈａｎｄｌｅｒ、１９９５年）処理またはガンマ照射によって達成できる。変異体の単離は、突然変異を起こす植物または種をスクリーニングすることによって達成してもよい。例えば、小麦の突然変異集団は、穀粒のハイアミロース含有量および／または通常より長いアミロペクチン鎖分布またはＥＬＩＳＡによるＳＢＥＩＩａタンパク質の損失、または、変更された穀粒形状（Ｇｒｅｅｎ他、１９９７年）についてスクリーニングされ得る。スクリーニングは、好ましくは、既にＳＢＥ活性のうちの１つが欠如している小麦遺伝子型、例えば、ＳＢＥＩＩｂ陰性のバックグラウンドでなされる。そのような突然変異は、次いで、望ましい遺伝的バックグラウンドを有する植物との間で交配し、当初の望ましくない親のバックグラウンドを消し去るために適当な数の戻し交配を実行することによって、望ましい遺伝的バックグラウンドに導入し得る。
別の実施形態において、突然変異は小麦においてＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現または活性に影響を及ぼす。そのような突然変異の確認は、トウモロコシまたはコメと対照的に２つの遺伝子が小麦では密接に結びついているという予想外の知見によって容易になる。１つの遺伝子の欠失は他の遺伝子に容易に及ぶことがあり、無効な対立遺伝子（ヌル変異）を両方の遺伝子にもたらす。この知見は、小麦の少なくとも１つのゲノムの両方の遺伝子の変異体である自然な変異体のスクリーニングを容易にし、２つまたは３つのゲノムにおいて両方の遺伝子に複合的な突然変異のある小麦を生産するためのスクリーニングを可能にする。そのような小麦は、小麦穀粒の高アミロースな非トランスジェニック源と産物を提供する。
ＳＢＥＩＩａまたはアミロペクチン合成に関与している他の酵素をコードする遺伝子の突然変異は、通常、アミロース含有量の比率の増大を引き起こす。個々の穀粒当たりのアミロースの量はアミロペクチンからアミロースまで炭素の流れが変更される結果として増大し得るが、あるいは、穀粒当たりのデンプン生産高の顕著な減少があるならば、それは減少することもある。いずれにせよ、デンプン中パーセンテージとしてのアミロースの相対的レベルは増加する。
変形したデンプン粒を有する種がハイアミロース大麦（Ｍｏｒｅｌｌ他、２００３年）および、デンプン中におよそ９０％のアミロースを有する低アミロペクチン（ＬＡＰＳ）トウモロコシ（Ｓｉｄｅｂｏｔｔｏｍ他、１９９８年）で報告されている。
複屈折は、２つの方向に光を屈折させる物質の能力である；これは、偏光顕微鏡で見たとき、「マルタ十字」と呼ばれる暗い十字架を各々のデンプン粒上に生み出す。複屈折は、顆粒内のポリマーの構造組織の秩序程度の指標である（ＴｈｏｍａｓおよびＡｔｗｅｌｌ、１９９９年）。デンプン粒の複屈折の損失は、通常、アミロース含有量の増加とよく相関している。
＜食糧生産への適性＞
別の面で、本発明は食糧生産に役立つ小麦（穀粒が相対的に高いアミロース含有量を有し低減されたアミロペクチン含有量を有するデンプンを含有する。）を提供する。好ましくは、穀粒が得られる小麦植物は、成長の間、胚乳で低減されたＳＢＥＩＩａ活性レベルを有する。本発明の小麦植物は、食糧生産のために、特に、商業的食糧生産のために役立つ。そのような食糧生産は、商業的食糧生産の成分となし得る小麦粉、生地その他の産物の製造を含んでもよい。
小麦の望ましい遺伝的バックグラウンドは、農業生産高および他の特徴の考慮を含む。そうした特徴には冬小麦種または春小麦種、農業的な成績、耐病性と非生物的なストレス耐性を有するのが望ましいか否かを含んでもよい。オーストラリアでは、バクスター、ケネディ、ジャンズ（Ｊａｎｚ）、フレーム、ロゼッルラ（Ｒｏｓｅｌｌａ）、カドゥー（Ｃａｄｏｕｘ）、ダイアモンドバード（Ｄｉａｍｏｎｄｂｉｒｄ）その他一般に栽培されている種類などの小麦栽培品種に変更されたデンプンの特徴を交配してみたいであろう。提供される例はオーストラリアの生産領域に特有であるが、他の変種は他の栽培地域に適している。本発明の小麦変種は、少なくともいくつかの栽培地域における、対応する野生型変種の８０％以上の生産量を与えることが好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらにより好ましい。生産量は、制御された野外試験ですぐに計測できる。
さらなる実施形態において、穀粒のデンプン含有量は、少なくともおよそ２５％、３５％、４５％または５５％〜６５％（ｗ／ｗ）である。商業的に栽培される野生型小麦は、通常５５〜６５％の範囲のデンプン含有量を有し、ある程度は成長させる栽培品種に依存する。あるいは、本発明の穀粒は、等価であるが改変されていない小麦由来の穀粒の少なくとも９０％のデンプン含有量を有する。野生型より低いデンプン含有量は、おそらくはアミロペクチンレベルが低減された結果である。デンプン含有量がたとえ低くても、ハイアミロース産物に比較的高い価値があるため、穀粒は商業食糧生産に依然有用となり得る。他の望ましい特徴は、穀粒を挽く能力、特に穀粒硬度を含む。より高価値の小麦植物を作る別の面は、穀粒からのデンプン抽出の程度であり、抽出率が高いほどより有用である。穀粒の形状は植物の商業的な有用性に影響を与え得るもう１つの特徴でもあり、このように、穀粒の形状は穀粒を挽く上での便利さまたはその反対の影響を及ぼし得る。例えば、細長い穀粒形態では、それを挽いて、処理するのが難しくなる可能性がある。
より実の詰まった穀粒はより大きな生産量を達成する観点から望ましく、高レベルのアミロースを有するデンプンの生産または、変更された鎖長分布を有する改変されたデンプン中でのデンプン生産などのような本発明の特定の利点は成し遂げられ得る。このように、穀粒は好ましくは非縮小フェノタイプを有する。しかし、本発明の他の面は、より充填度の低い穀粒によって、より良好に達成されることもあり得る。このように、アリューロン層または胚またはタンパク質のデンプンへの割合はより充填度の低い穀粒でより高いこともあり、それによって、アリューロン層またはタンパク質といった有益な構成要素がより高い小麦粉その他の産物がもたらされる。高いアリューロン層産物はこのように葉酸塩などの特定のビタミン分がより高くてもよいし、あるいは、それはカルシウムなどの特定のミネラル分がより高くてもよく、より高い抵抗性デンプンレベルと組み合わさって、大腸におけるミネラル分の強化摂取に相乗的効果をもたらし得る。
デンプンは、標準分析法、例えば、Ｓｃｈｕｌｍａｎ他（１９９１年）の方法を用いて小麦穀粒から容易に分離される。工業的スケールでは、湿式または乾式ミリングを使うことができる。デンプン粒サイズは、より大きなＡ顆粒をより小さなＢ顆粒から分離するデンプン加工産業で重要である。本発明の小麦植物の粒から得られるデンプンは、相対的に高いアミロース含有量を有する。
＜変化したデンプンの物理的特徴＞
糊化は、過剰量の水中における分子秩序の熱による崩壊（破壊）であり、粒膨潤、結晶化温度、複屈折の喪失、粘性の増大とデンプン可溶化などの特性の同時的かつ非可逆的変化を伴う。トウモロコシのａｅ（アミロース増量体）変異体からのハイアミロースデンプンは、通常のトウモロコシより高い温度を示した（Ｆｕｗａ他、１９９９年、Ｋｒｕｅｇｅｒ他、１９８７年）。他方、デンプン合成酵素ＩＩａ活性が欠如している大麦ｓｅｘ６変異体からのデンプンは低い糊化温度を有し、対照植物と比較したとき、糊化ピークに対するエンタルピーは減少した（Ｍｏｒｅｌｌ他、２００３年）。
本発明の別の面では、示差走査熱量測定で測定した際にデンプンは変更された糊化温度を有する。これは野生型植物由来のデンプンと比較して増加することも減少することもある。変更された糊化温度は、相対的に高いアミロース含有量に加わる場合もある。示差走査熱量測定で測定した場合、野生型小麦デンプンの糊化温度は、典型的には、最初のピーク（開始温度と定義される）の温度が約６１℃（Ｒａｈｍａｎ他、２０００年）である。
デンプンは、野生型デンプンと比較した過剰の熱水によるその膨張率によって特徴付けることができる。体積膨張は、典型的にはデンプンまたは小麦粉と過剰の水を混合し、加熱（典型的には９０℃以上）することで測定される。次いで、試料を遠心によって集め、沈殿した物質の質量を試料の乾燥重量によって割ることで膨張体積を表す。食品調製物、特に水和する食品調製物のデンプン含有量を増やすよう求められる場合は、低い膨張特性が有用である。
本発明の選択された形の小麦のデンプン構造は、結晶化度が小麦から分離される通常のデンプンと比較して低減するという点でも異なり得る。デンプンの結晶化度の低減は、官能特性の強化と結びつくとも考えられ、よりスムーズな舌触りに寄与する。このように、デンプンはさらに、１つまたは複数のアミロペクチン合成酵素の活性レベルの低減から生じる低減された結晶化度を示してもよい。結晶化度は、典型的にＸ線結晶学によって調べられる。
変更されたアミロペクチン構造の１つの基準は、デンプンの鎖長分布または重合度である。鎖長分布は、イソアミラーゼ脱分枝の後、蛍光ラベル糖鎖電気泳動（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＦＡＣＥ）を用いて決定され得る。本発明のデンプンのアミロペクチンは、脱分枝した時点で、野生型植物からのデンプンの分布より大きい５〜６０の範囲の鎖長分布を有し得る。より長い鎖長のデンプンは、枝分れの頻度が相応して減少する。したがって、デンプンは依然存在するアミロペクチン中により長いアミロペクチン鎖長の分布を有してもよい。
＜食物特性＞
デンプンは人間の食餌における主要な炭水化物源であり、本発明とそれに由来する産物の穀粒は食物調製に用いることができる。例えば家畜生産において、または、ペットフードにおいて、食物は人または動物によって消費され得る。変更された小麦植物に由来する穀粒は食品加工の方法においてすぐに使うことができ、したがって、本発明は、前述の小麦植物を処理した穀粒または全粒から得られる、挽いたか、粉砕したか、粗挽きしたか、球状にしたか、ロール状にした穀粒または製品（小麦粉を含む。）を含む。これらの製品は、次いで、様々な食品、例えば、パン、ケーキ、ビスケットなどのデンプン質製品、または増粘剤または結着剤などの食品添加物中で、または、飲物、麺、パスタまたはインスタントスープに用いてもよい。本発明の穀粒に由来する穀粒または産物は、特に朝食用シリアルにおいて、または、押出加工された製品として望ましい。本発明のハイアミロースデンプンは、菓子類産業において有用なハイストレングスゲル類を形成するのに用いることもでき、または、より低温で短時間の硬化時間を可能にする。それらは、例えば、深揚げポテトその他の食品において油吸収を減らすためのコーティングとしても用い得る。
＜食物繊維＞
本明細書において、食物繊維は、健康な人間の小腸では吸収されずに大腸に入る炭水化物および炭水化物消化産物である。これは、抵抗性デンプン、β−グルカンならびに他の可溶性および不溶性炭水化物ポリマーを含む。それは、少なくとも部分的には、常駐微生物相によって大腸内で発酵可能な炭水化物部分を含むことを目的とする。
本発明のデンプンは、好ましくは比較的高いレベルの食物繊維、特にアミロースを含む。本発明の穀粒の食物繊維含有量は、単に胚乳のアミロース含有量の相対的な増加によって生じてもよいし、そうでなくてもよい。
本発明の実施形態は、高レベルの食物繊維との組合せにおいて、アリューロン層と胚の組合せに起因してもよい。具体的には、アリューロンまたは胚の相対的レベルがより高い状態で存在する場合に、これが起こるのでもよい。小麦穀粒がわずかに縮小する場合、胚乳は量が低減されて存在し、アリューロン層と胚は比較的に増大した量で存在する。このように、小麦は高いレジスタントスターチと組み合わせて比較的高いレベルのある種の有益な要素またはビタミンを有し、そのような要素としては、二価カチオン、生物が利用可能なＣａ＋＋と葉酸塩などのビタミン、あるいは、トコフェロールやトコトリエノールなどの抗酸化剤を含む。粉砕製品の１つの具体的形状は、アリューロン層が粉砕製品に含まれるものでもよい。具体的な粉砕プロセスは、粉砕製品中のアリューロン層の量を強化するように行ってもよい。このように、アリューロン層および胚を含むように粉砕または他の加工をした穀粒に由来する製品はいずれも、別の源からこれらの要素を加える必要がなく、さらなる栄養的な利益を有する。
＜レジスタントスターチ＞
レジスタントスターチは、健康な人間の小腸に吸収されずに大腸に入るデンプンおよびデンプン消化産物の合計と定義される。したがって、レジスタントスターチは、消化されて小腸で吸収される産物を除外する。レジスタントスターチは物理的に接触しがたいデンプン（ＲＳ１形）、抵抗性顆粒（ＲＳ２）、老化デンプン（ＲＳ３）、化学修飾デンプン（ＲＳ４）を含む。食物で消費されるとき、本発明のデンプンの変更されたデンプン構造と特にハイアミロースレベルはレジスタントスターチの増加を引き起こす。デンプンは消化するにはいくぶん接触しがたいＲＳ１形でもよい。Ｖ−複合体結晶度で測定されるデンプン−脂質会合体もレジスタントスターチのレベルに寄与しそうである。
本発明の１つの利点は、それが特定の栄養的な利益である産物を提供し、さらに、デンプンまたは小麦穀粒の他の構成要素を修飾する必要なしにそのような産物を提供するという点であることが理解されるであろう。しかし、デンプンまたは穀粒の他の成分への修飾は望ましい場合もあり、本発明はそのような修飾された構成成分を包含する。修飾の方法はよく知られており、抵抗性形を増やすために、従来法によるデンプンその他の成分の抽出とデンプンの修飾を含む。デンプンは、熱および／または水分での処理によって、物理的に（例えば、ボールミリング）、酵素処理で（例えば、α−またはβ−アミラーゼ、プルラナーゼその他）、化学加水分解（液体またはガス状の試薬を使用して湿式または乾式で）、酸化、二官能基試薬（例えばナトリウムトリメタリン酸、オキシ塩化リン）を用いた架橋またはカルボキシメチル化によって修飾され得る。
＜血糖指数＞
血糖指数（ＧＩ）は、デンプンを含む食品の消化率に関するものであって、運動時、血中グルコース濃度に関する白パンまたはブドウ糖の効果を試験食物の効果と比較するものである。血糖指数は、食事後の血清グルコース濃度と血中グルコースホメオスタシスのためにインシュリンの必要量に関する食物の影響可能性の目安である。本発明の食品によって提供される１つの重要な特徴は、血糖インデックスが減少することである。さらにまた、食品は最終的な消化レベルが低く、したがって比較的低カロリーとなし得る。低カロリー産物は、粉砕小麦穀粒から作り出される小麦粉の含有に基づくものでもよい。そのような食品は、お腹を満たし、腸の健康を強化し、食後の血清グルコースと脂質濃度を減らすとともに低カロリー食品を提供するという効果を有し得る。
＜食品以外の応用＞
本発明は、アミロースレベルを上昇させ、アミロペクチンを低減させた修飾または改善されたデンプンを提供し、これらの特性は種々の産業の必要条件のいずれをも満たす。デンプンは、フィルム、紙、織物、段ボールおよび接着性産業（Ｙｏｕｎｇ、１９８４年）で、例えば、サイズ剤として、広く非食品産業において使われている。小麦デンプンは、ブドウ糖シロップの生産のための、または、エタノール産生のための基質として用いてもよい。改変されていないデンプンの物性は若干のアプリケーションでその有用性を制限し、高価であるか他の不利益があることがあり得る化学修飾がしばしば必要となる。特に他の物性と組み合わせてアミロペクチン含有量を低減したために、本発明は収穫後改変の必要がより少ないデンプンを提供する。例えば、糊化温度、デンプンの剪断応力抵抗性、フィルム強さおよび／または水抵抗ならびに本発明の穀粒から製造される産物は、変更してもよい。デンプンは、ポリスチレンや他のパッキング材料の代わりとして生分解性のある緩い充填パッキング材料を調製するのに用いてもよい。
本発明の各面に関して様々な説明を行ってきたが、本発明が本発明の２つ以上の面の組合せによるでもよいことが理解されるであろう。
＜実施例１．材料と方法＞
炭水化物の決定と分析
デンプンは、Ｓｃｈｕｌｍａｎ他（１９９１年）の方法を使用して小麦穀粒から分離した。デンプン含有量は、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｂｒａｙ、Ｃｏ Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド共和国）によって供給される全デンプン分析キットを使用して測定した。次いで、デンプン含有量を対照植物と比較する。総穀粒重量からのデンプン重量を引いて穀粒の全非デンプン含有量を求め、総重量の低減がデンプン含有量の低減によるかどうか確定する。
デンプン試料のアミロース含有量は、以下の通り、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬａｉｇｎｅｌｅｔ（１９８３年）の比色（ヨウ素還元）方法をわずかに変更して測定した。およそ２ｍｇのデンプンを、ふたのゴムワッシャーと嵌まる２ｍｌのネジキャップ付チューブに、正確に秤量した（０．１ｍｇまで正確）。脂質を取り除くために、８５％（ｖ／ｖ）メタノール１ｍｌをデンプンと混合し、時折ボルテックスにかけながら６５℃水浴中で１時間チューブを加熱した。１３，０００ｇ、５分間の遠心の後、上清を慎重に取り除き、抽出工程を繰り返した。次いで、デンプンを６５℃で１時間乾燥して、２ｍｇデンプン（上記のように秤量）につき１ｍｌの尿素−ジメチルスルホキシド溶液（ＵＤＭＳＯ；１容積の６Ｍ尿素量に対し９容積のジメチルスルホキシド）を用いて溶解させた。混合物は直ちにボルテックスにかけ激しく混合し、デンプンを完全に溶解させるために断続的にボルテックスにかけつつ、９５℃水浴中で１時間インキュベートした。デンプン−ＵＤＭＳＯ溶液（５０μｌ）のアリコートを、水ｍｌ当たり２ｍｇのヨウ素と２０ｍｇのヨウ化カリウムを含む２０μｌのＩ２−ＫＩ試薬で処理した。混合物を水で全量１ｍｌとした。２００μｌをマイクロプレートに移し、Ｅｍａｘ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を用いて吸光度を読むことにより６５０ｎｍでの混合物の吸光度を測定した。０〜１００％のアミロースと１００％〜０％のアミロペクチンを含む標準試料をポテトアミロースとコーン（またはポテト）アミロペクチン（Ｓｉｇｍａ）から作り、試験試料と同様に処理した。アミロース含有量（パーセンテージアミロース）は標準試料の吸光度に由来する回帰式を使用して吸光度値から決定した。脱分枝したデンプンのアミラーゼ／アミロペクチン比の分析は、Ｃａｓｅ他（１９９８年）によって行ってもよいし、またはＢａｔｅｙおよびＣｕｒｔｉｎ（１９９６年）によって記載されるように脱分枝デンプンを分離するＨＰＬＣ法によって行ってもよい。
デンプン試料の脱分枝後に、デンプン鎖長の分布は、Ｍｏｒｅｌｌ他（１９９８年）によるキャピラリー電気泳動ユニットを用いて蛍光ラベル糖鎖電気泳動（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＦＡＣＥ）によって分析し得る。デンプン試料の糊化温度プロフィールは、Ｐｙｒｉｓ １示差走査熱量計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、コネチカット州、米国）で測定し得る。デンプン溶液の粘度は、例えば、Ｂａｔｅｙ他（１９９７年）が報告したような条件を用いてＲａｐｉｄ−Ｖｉｓｃｏ−Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＲＶＡ、Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ、シドニー）上で測定し得る。測定し得るパラメータとしては、ピーク粘度（最大熱ペースト粘度）、維持強さ、最終的な粘性および糊化温度が挙げられる。小麦粉またはデンプンの膨潤量は、Ｋｏｎｉｋ−Ｒｏｓｅ他（２００１年）の方法によって測定され得る。水の取り込みは、小麦粉またはデンプン試料を水と混ぜる前後、所定の温度で試料を量り、糊化した材料を回収することで測定される。
β−Ｇｌｕｃａｎレベルは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｂｒａｙ、Ｃｏ Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド共和国）によって供給されるキットを使用して測定され得る。
胚乳のタンパク質発現の分析
胚乳の特定のタンパク質発現は、ウェスタンブロット手順によって分析した。胚乳はすべての母体組織から切り離し、およそ０．２ｍｇの試料を、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセリン、５ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）を含む５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（４２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４と８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）、ｐＨ７．５の６００μｌ中でホモジナイズした。粉砕試料を１３、０００ｇで１０分間遠心処理し、上清アリコートを使用まで−８０℃で凍結した。総タンパク評価のために、０．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ標準液０、２０、４０、６０、８０および１００μｌアリコートを用いてＢＳＡ標準曲線を準備した。試料（３μｌ）は蒸留水で全量１００μｌとし、１ｍｌのＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ試薬を各々に加えた。吸光度はブランクとして標準曲線から０ ＢＳＡ試料を用い、５９５ｎｍで５分後に計測し、試料のタンパク質レベルを測定した。各々の胚乳から２０μｇ総タンパクを含む試料を、０．３４ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、アクリルアミド（８．０％）、過硫酸アンモニウム（０．０６％）およびＴＥＭＥＤ（０．１％）を含む８％非変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。電気泳動後、タンパク質はＭｏｒｅｌｌ他（１９９７年）によるニトロセルロース膜に移し、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ特異抗体と免疫反応させた。
＜実施例２．小麦ＳＢＥＩＩＡとＳＢＥＩＩＢ発現変更のための遺伝子コンストラクト＞
小麦のＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現を低減すべく二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトを作成した。そのようなコンストラクトにおいて、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子の一部に対応する望ましい核酸配列は、発現したＲＮＡが塩基対合可能で二重鎖または二本鎖ＲＮＡを形成し得る相補領域を含むように、プロモーターに対しセンスとアンチセンスの両方に存在した。センスとアンチセンス配列の間のスペーサー領域は、形質転換植物においてＲＮＡの一部として転写されるとき、堅い「ヘアピン」二重構造を作るためにスプライシングにより除かれるイントロン配列からなるものとした。イントロンを含むことで、二重鎖ＲＮＡコンストラクトによって与えられる遺伝子サイレンシングの効率が増すことが分かっている（Ｓｍｉｔｈ他、２０００年）。望ましい核酸を、高分子量グルテニン（ＨＭＷＧ）プロモーター配列（Ｄｘ５サブユニット遺伝子、アクセッション番号Ｘ１２９２８、Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、１９８９年のプロモーター）とアグロバクテリウム由来ノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ３'）からのターミネーター配列に連結した。これは、ｄｓＲＮＡ配列の胚乳特異的発現をもたらした。
ＳＢＥＩＩａ二重鎖ＲＮＡコンストラクトは、小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３８４３１、図１参照）からＰＣＲによって増幅される１５３６ｂｐのヌクレオチド配列を含んでいた。これは以下を含んでいた；エキソン１と２の全体とエキソン３の一部を含み（図１のヌクレオチド位置１０５８〜１３３６、１６６４〜１７６１および２０３８〜２２１９）ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩの制限部位を各側に有する４６８ｂｐ配列（断片１）、ＳＢＥＩＩａのエキソン３と４の一部およびイントロン３の全部を含み（図１のヌクレオチド位置２２２０〜２７３１）ＫｐｎＩとＳａｃＩの部位を各側に有する５１２ｂｐ配列（断片２）ならびにＳＢＥＩＩａの完全なエキソン１、２および３を含み（図１のヌクレオチド位置１０５８〜１３３６、１６６４〜１７６１および２０３８〜２２７９）ＢａｍＨＩとＳａｃＩの部位を各側に有する５２８ｂｐ配列（断片３）。次いで、断片３の配列が断片１に対してアンチセンス方向において断片２にライゲートされるように、断片１、２と３をライゲートした。最初に、ＨＭＷＧプロモーター配列とｎｏｓ３'ターミネーターを含むベクターｐＤＶＯ３０００内で二重鎖ＲＮＡコンストラクトを生成した。ベクターｐＤＶＯ３０００の遺伝子コンストラクトはｐＤＶＯ３−ＩＩａと名付け、二重鎖ＲＮＡ遺伝子はｄｓ−ＳＢＥＩＩａとした。
ＳＢＥＩＩｂ二重鎖ＲＮＡコンストラクトについての戦略も同様とした。ＳＢＥＩＩｂコンストラクトは、小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子（配列は、図２で概説）からＰＣＲによって増幅される１６０７ｂｐの断片を含んでいた。これは、エキソン１と２の全体とエキソン３の一部を含み（図２のヌクレオチド位置４８９〜６４０、７８９〜９３４および１５９８〜１７６９）ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩの制限部位を各側に有する４７１ｂｐ配列（断片１）、ＳＢＥＩＩｂのエキソン３と４の一部およびイントロン３の全部を含み（図２のヌクレオチド位置１７７０〜２３６４）ＫｐｎＩとＳａｃＩの制限部位を各側に有する５８９ｂｐ配列（断片２）ならびにＳＢＥＩＩｂの完全なエキソン１、２および３を含み（図２のヌクレオチド位置４８９〜６４０、７８９〜９３４および１５９８〜１８７２）ＢａｍＨＩとＳａｃＩの制限部位を各側に有する５２８ｂｐ配列（断片３）を含んでいた。次いで、断片３の配列が断片１に対してアンチセンス方向において断片２にライゲートされるように、断片１、２と３をライゲートした。ベクターｐＤＶＯ３０００のＳＢＥＩＩｂ二重鎖ＲＮＡ遺伝子コンストラクトはｐＤＶＯ３−ＩＩｂと名付け、二重鎖ＲＮＡ遺伝子はｄｓ−ＳＢＥＩＩｂとした。コンストラクトを図３に模式的に示す。
次いで、ｄｓ−ＲＮＡ発現カセットの各々を制限酵素−Ｘｈｏｌで切り離し、バイナリー形質転換ベクターｐＧＢ５３およびｐＢＩＯＳ３４０に挿入した。ｐＧＢ５３は、コメアクチンプロモーターによってドライブされるアスラム耐性（ｓｕｌ）をコードする遺伝子の導入によってｐＳＢｌｌ（Ｋｏｍａｒｉ他、１９９６年）から作られ、対象とすべき遺伝子の導入のためにＴ−ＤＮＡ右側境界に隣接して特有のＸｈｏＩサイトを残した。同様に、ｐＢＩＯＳ３４０はカナマイシンとジェネテシン耐性をコードするｎｐｔＩＩ遺伝子の導入によってｐＳＢｌ（Ｋｏｍａｒｉ他、１９９６年）から作られ、コメアクチンプロモーターによってドライブされ、ここでも、右側境界に隣接して特有のＸｈｏＩサイトを残した。ｐＧＢ５３とｐＢＩＯＳ３４０のＳＢＥＩＩａコンストラクトはそれぞれｐＣＬ５１とｐＣＬ５９と名付け、ｐＧＢ５３とｐＢＩＯＳ３４０中のＳＢＥＩＩｂコンストラクトはそれぞれｐＣＬ５４とｐＣＬ６０とした。
＜実施例３：小麦の形質転換＞
ｖｉｒプラスミドｐＡＬ４４０４およびｐＳＢｌを運ぶ無害化したＡｇｒｏｂａｃｔｅｉｌｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４に小麦の形質転換のための遺伝子コンストラクトをエレクトロポーレーションによって導入し、続いてスペクチノマイシンを含む培地上で選択した。形質転換したアグロバクテリウム株を、２日間固化させたＹＥＰ培地上２７℃でインキュベートした。次いでバクテリアを回収して、小麦接種のため、６５０ｎｍで光学濃度２．４まで４００ｍＭアセトシリンゴンを含むＴＳＩＭ１（１００ｍｇ／ｌｍｙｏ−イノシトール、１０ｇ／ｌブドウ糖、５０ｍｇ／ｌ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．５によるＭＳ培地）に再懸濁させた。
小麦植物（品種ＮＢ１、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ Ｓｅｅｄｓ Ｌｔｄ、Ｒｏｔｈｗｅｌｌ、Ｌｉｎｃｓ．から得られる春小麦種）を、１日１６時間の日照とするために明かりを補って温室内で２２／１５℃日／夜の温度で成長させた。５０ｃｍのひこばえ茎を含むように開花期後およそ１４日で（胚：長さおよそ１ｍｍ）でひこばえを収穫した。次いで、止め葉以外、すべての葉をひこばえから取り除き、止め葉は清浄化してカビ胞子による汚染を除いた。次いで、各々の小穂の包穎と最初の２つの小花から外穎を慎重に取り除いて未熟種子を露出させた。一般に、各々の小穂にはこれらの２粒の種のみが見つかった。この手順を、花序の全長に沿って実行した。次いで、穂には簡単な表面殺菌を行うために７０％ＩＭＳを吹き付けた。
アグロバクテリウム懸濁液（１μｌ）を、１０μｌハミルトン注射器を使って、未熟種子内においてほぼ胚盤：胚乳の界面の位置で、露出した種子すべてに接種した。次いで、ひこばえを水中に置き、種の乾燥を防ぐために半透明のビニール袋で覆い、明かりをつけたインキュベーター中に２３℃で３日間、日照１日当たり１６時間、４５＿Ｅｍ−２ｓ−１ＰＡＲで置いた。同時培養３日の後、接種した未熟種子を取り除き、７０％エチルアルコール（３０秒）、次いで２０％漂白剤（Ｄｏｍｅｓｔｏｓ、２０分）で表面を殺菌し、無菌蒸留水で完全に洗浄した。未熟な胚を無菌的に単離し、Ｗ３培地（ＭＳに２０ｇ／ｌショ糖と２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを補い、６ｇ／ｌ Ｔｙｐｅ Ｉアガロース（Ｓｉｇｍａ）で固めたもの）に置き、１５０ｍｇ／ｌタイメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）（Ｗ３Ｔ）を加え、胚盤（プレート当たり２０胚）を一番上とした。培養物を、２５℃で光（１当たり１６時間の日照、８０＿Ｅｍ−２ｓ−１ＰＡＲ）中に置いた。胚上の胚軸の成長を単離後およそ５日後に評価し、カルス生産を改善するために必要な場合、軸は取り除いた。胚は４週間Ｗ３Ｔ上で維持し、単離２週間後、新しい培地に移し、胚形成能力を評価した。
４週成長させた後、接種した胚に由来するカルスは、Ｗ３Ｔ媒地上に植菌した非接種胚から得られる対照カルスと非常に類似していた。バクテリアの存在は、接種した胚に由来するカルスの胚形成能力を実質的に低減させたようには見えなかった。胚形成カルスを、２ｍｇ／ｌアスラム（ｐＧＢ５３誘導体を使用した）または２５ｍｇ／ｌ（ｐＢＩＯＳ３４０誘導体）および１５０ｍｇ／ｌタイメンチン（Ｗ３２ＡＴ）を含むＷ３培地に移した。カルスをさらに２週間、この媒地上で維持し、次いで、各カルスを２ｍｍ−サイズの小片に分け、Ｗ３２ＡＴ上に再植菌した。バイナリーベクターコンストラクトなしでＬＢＡ４４０４の接種に由来する対照胚は、選択培地上で形質転換カルスを生じなかった。
さらに２週間培養後、胚形成性カルスの成長についてすべての組織を評価した：４週後にも選択培地上で継続的な成長の徴候を示しているすべてのカルスが、再生培地（４０ｇ／ｌマルトースと１５０ｍｇ／ｌタイメンチン（ｐＨ５．８）を加えたＲＭＴ−ＭＳ、６ｇ／ｌアガロース（Ｓｉｇｍａ １型）で固化）に移された。新芽をこの培地上で４週間再生し、次いで、芽の伸長と発根のために１５０ｍｇ／ｌタイメンチンを加えたＭＳ３０に移した。次いで、幼若植物を土壌混合物に移し、２週間噴霧ベンチに保持し、最後に温室に移した。
ｐＣＬ５４またはｐＣＬ６０（ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ）を使っている合計３２１７個の胚およびｐＣＬ５１またはｐＣＬ５９（ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ）を使っている２０１０個の胚をこの方法によって処理し、６１個の植物をＩＩｂ形質転換のためにカルスから再生し、３１個の植物をＩＩａ形質転換のためにカルスから再生した。選択培地上の生存状況は、それらが遺伝子コンストラクトによって首尾よく形質転換されていることを示唆した。選択可能なマーカー遺伝子で形質転換した植物の大多数（すべてではない）は、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ阻害遺伝子を一体化するものと期待される；これらは以下の例に記載するように容易に識別することができた。
実験から得られた良好な再生可能性を伴う複数の安定した組み込みイベントの回復は、本明細書で用いられる種接種形質転換法が小麦について報告されている他の方法と同じように効率的なことを示した。株ＡＧＬ１などの代わりのアグロバクテリウム株またはハイグロマイシン抵抗性をコードする遺伝子などの選択可能なマーカーも本明細書方法に用い得る。
＜実施例４．小麦形質転換体の分析＞
形質転換は、以下の方法の１つまたは複数で測定した：
導入遺伝子の１つまたは複数についてのＰＣＲ分析。ＰＣＲ分析は、ＳｔａｃｅｙおよびＩｓａａｃ（１９９４年）によって記載されるミニプレップ法を使用し、新鮮な葉資料１〜２ｃｍ２から抽出されるゲノムＤＮＡについて行った。ＰＣＲ反応は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子からの断片（４６２ｂｐ）を増幅すべく設計された、例えば、プライマーＳＢＥＩＩａ−Ｆｏｒ：５'−ＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＴＴＴＧ−３'［配列番号９］およびＳＢＥＩＩａ−Ｒｅｖ：５'−ＧＡＣＴＡＣＣＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣ−３'［配列番号１０］を用いて、またはＳＢＥＩＩｂ（５０５ｂｐ）についてＳＢＥＩＩｂ−ＤｕｐＦｏｒ５'−ＡＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧ−３'［配列番号１１］およびＳＢＥＩＩｂ−ＤｕｐＲｅｖ５'−ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣ−３'［配列番号１２］を用いて行った。反応条件は以下の通りとした：「ホットスタート」（９４Ｃ、３分）後、３０サイクルの変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長（７３℃、２分）後、７３℃（５分）で１サイクル。
サザンブロットハイブリダイゼーション分析は、凍結乾燥した粉砕組織（ＳｔａｃｅｙおよびＩｓａａｃ、１９９４年）から、より大規模（９ｍｌ）に抽出したＤＮＡに対して実行する。ＤＮＡ試料は０．２ｍｇ／ｍｌに調整し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩなどの制限酵素で消化した。ＳｔａｃｅｙおよびＩｓａａｃ（１９９４年）に記載されるように、制限酵素消化、ゲル電気泳動と真空ブロッティングを実行する。ｄｓ−ＳＢＥＩＩコンストラクトのイントロン３領域を含むジゴキシゲニンで標識したプローブは、ＭｃＣｒｅｅｒｙおよびＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ（１９９４年）の方法によってＰＣＲにより製造される。サザンブロットへのプローブのハイブリダイゼーションおよび化学発光による検出は、ＭｃＣｒｅｅｒｙおよびＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ（１９９４年）の方法によって実行する。
ＰＣＲ分析の結果を表２にまとめる。ＰＣＲによって示される導入遺伝子が陽性だった植物は、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａについて２７の独立した形質転換イベントとｄｓ−ＳＢＥＩＩｂについての６１の独立したイベントを含んでいた。
表２．ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂＲＮＡ二重鎖コンストラクトによる小麦の形質転換
Figure 0005562295
＜実施例５．二重鎖ＲＮＡコンストラクトで形質転換した植物から得た穀粒の分析＞
デンプン顆粒形態
Ｔ０形質転換小麦植物から得た成熟したＴ１種子からのデンプン顆粒の形態を、光学顕微鏡法によって観察した。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａで独立に形質転換した２５本のＴ０植物とｄｓ−ＳＢＥＩＩｂで独立に形質転換した１２本の植物の各々からのそれぞれ１０個の穀粒を分析した。各胚乳はデンプン顆粒を放出させるために穏やかに押しつぶし、それを水中に分散して、光学顕微鏡の下で視覚化した。分析した２５のｄｓ−ＳＢＥＩＩａ系統のうち、１２個は変形顆粒（例えば、図４参照）を含む穀粒を有していたが、視覚的観察では異なる種子では変形レベルは様々であった。これに対し、１２のｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ系統のいずれも、光学顕微鏡法下で観察したとき胚乳中のデンプン顆粒の顕著な変形は示さなかった。結果を、表３と４にまとめて示す。
表３．ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック小麦系統のＴ１種子のデンプン顆粒形態
Figure 0005562295
＊各系統からの１０粒の種子のデンプン顆粒形態を観察した。
１０粒すべての種が通常の顆粒形態を有する場合は、形態を＋として示し、ひどく変形した種子がある場合は−で、また、若干の異常がある（すなわち、少なくともいくつかの種子にある程度の変形があるが、ひどい変形のものはない）場合は＋／−とした。
表４．ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック小麦系統のＴ１種のデンプン顆粒形態。
Figure 0005562295
＋は、各系統からの１０粒の種子すべてが正常なデンプン顆粒形状を有していたことを示す。
偏光下のデンプン顆粒を観察したところ、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ穀粒については、変形顆粒（図５）のため、複屈折が著しく低減していたことが分かった。複屈折の損失は、系統５０．ｌｂからの種子では顆粒の９４％で観察され、一方、同じ系統の別の種子からの正常な顆粒が完全な複屈折（表５）を示しており、変形フェノタイプと相関している。正常な顆粒による種子は、導入遺伝子が不足している分離体であると思われ、したがって、発現型的には正常である。
表５．ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック小麦系統５０．１ｂのＴ１種子からのデンプン顆粒の複屈折
Figure 0005562295
＋通常のデンプン顆粒、−ひどく変形した顆粒、＋／−若干の変形のある顆粒
光学顕微鏡観察の結果は、デンプン顆粒の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって確認する。このために、精製したデンプンに金でスパッタリングして、室温、１５ｋＶで走査する。
穀粒重量
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ形質転換植物（温室で等しい条件下で生育）からの個々の穀粒を秤量した（表６）。植物５０．１ｂ、５８．２ａ、６１．２ａおよび１０９からのひどく変形した顆粒を有する穀粒は、同じ条件下で生育した野生型植物の粒と比較して、平均重量で顕著な低減はなかった。したがって、デンプン生産は、大きく変形したデンプン顆粒を有する種子においてであっても実質的にされる低減するようには見えなかった。このデータは、胚乳中のＳＢＥＩＩａ活性の低減した野外生育小麦の収穫高がだいたい普通であることも示唆している。
表６．ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック小麦系統からのＴ１種子の穀粒重量
Figure 0005562295
Ｔ２トランスジェニック小麦胚乳のＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂタンパク質の分析
５つの独立した形質転換系統を代表して１３ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ形質転換Ｔ１植物からと、３つの独立した形質転換系統を代表して９ｄｓ−ＳＢＥＩＩａからの種子（Ｔ２）を、胚乳内のＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂタンパク質発現について、非変性ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって分析した。先に述べたように、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ系統はすべて正常の顆粒形態を有するが、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ植物はすべて異常なデンプン顆粒形態を有する系統からのものであった。ＳＢＥＩＩａの検出のために用いた抗体は、ウサギ由来の３ＫＬＨであり、これはアミノ酸配列ＡＡＳＰＧＫＶＬＶＰＤＥＳＤＤＬＧＣ［配列番号１３］を有し、成熟ＳＢＥＩＩａのＮ末端からの配列に対応する合成ペプチドに対して誘導したものであり、使用に際して１：５０００に希釈した。ＳＢＥＩＩｂの検出のために用いた抗体はＲ６であり、これはアミノ酸配列ＡＧＧＰＳＧＥＶＭＩＧＣ［配列番号１４］を有し、成熟ＳＢＥＩＩｂのＮ末端からの推定配列に対応する合成ペプチドに対して誘導したものであり、使用前に１：６０００に希釈した。使用した二次抗体は、ＧＡＲ−ホースラディッシュペルオキダーゼ複合体とした（１：３０００希釈）。免疫反応バンドは、アマシャムＥＣＬ−検出システムを使用して明らかにした。
植物の中には導入遺伝子についてヘテロ接合のものもあると予想されたため、２２本のＴ１植物の各々から７粒の成長中の穀粒（開花後１５日）の各々から胚乳を分析した。１３のｄｓ−ＳＢＥＩＩａ植物のうちの１２は、胚乳中にＳＢＥＩＩａタンパク質レベルの低減を示すＴ２子孫を生じた。１系統からの全７粒の種子（５０．３ｘ．９）はＳＢＥＩＩａを完全に欠いているようであったが、他の４本の植物からの全７粒の種はＳＢＥＩＩａの明らかに低減した発現を示した（表７）。これらは、導入遺伝子についてホモ接合性である系統を表しているであろう。７系統はＳＢＥＩＩａが存在しない点またはＳＢＥＩＩａレベルが低減している点、または場合によってはタンパク質が明らかには低減してない点で分かれており、これらの系統はおそらく導入遺伝子についてのヘテロ接合体を表している。１３系統（５０．３ｘ．６）は野生型発現についてホモ接合性だった（表７）。
表７．Ｔ２ ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック小麦系統からの胚乳タンパク質のウェスタンブロット分析
Figure 0005562295
試験した９のｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統のうち、３つ（１１０．１６ｂ．２、１１０．１６ｂ．５および１１０．１６ｂ．１９）は一様に、７粒の子孫種子のいずれにおいてもＳＢＥＩＩｂ発現は示さなかったが、２は野生型発現について均一、残る４は発現なし、発現低減または野生型に分離した（表７）。種子からの胚は、Ｔ２植物とＴ３種子を生じさせるべく成長させてもよく（胚レスキュー）、これらは導入遺伝子に関してＴ２種子の遺伝子の状態を確かめるためにＰＣＲとタンパク質発現分析でスクリーニングする。
これらのデータは、二重鎖ＲＮＡコンストラクトが小麦胚乳のＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現低減に関して有効なことを示す。データはまた、ＳＢＥＩＩｂ発現のみの低減はデンプン顆粒形態を実質的に変化させなかったことをも示す。
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ導入遺伝子を含み、ＳＢＥＩＩａタンパク質が欠如しているトランスジェニック種子におけるＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現とｄｓ−ＳＢＥＩＩｂを含む種子のＳＢＥＩＩａ遺伝子の発現の発現も、ウェスタンブロット法によって分析した。予想外にも、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａを含むトランスジェニック種子では、ＳＢＥＩＩｂが大きく減少した。しかし、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂについてトランスジェニックな種子では、逆の影響は観察されなかった。ＳＢＥＩＩｂがｄｓ−ＳＢＥＩＩｂによって完全にサイレンスにされた種子でＳＢＥＩＩａ発現は変わらなかった。ＳＢＥＩＩｂの発現は、二重鎖コンストラクトのために使われる領域の遺伝子間での配列相同性のためにｄｓ−ＳＢＥＩＩａコンストラクトによって抑制された可能性があり、ＳＢＥＩＩｂの活性は、いくつかの他のメカニズムによってｄｓ−ＳＢＥＩＩａ導入遺伝子によって低減された可能性がある。
ＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡレベルにおいても、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ法などの標準的な技術によって（例えば、非保存領域由来のプローブを用い、または遺伝子のうちの１つにおいて特異的なサイトにハイブリダイズする他のサイト、例えば、３'非翻訳領域ではハイブリダイズしないプライマー対を用いて）具体的に決定し得る。そのような領域またはサイトは、２つの遺伝子配列の比較によって、容易に確認できる。
＜実施例６．形質転換小麦のデンプン分析＞
トランスジェニック小麦穀粒中でのアミロースおよびアミロペクチンレベル
実施例１に記載したように、６つのプールしたＴ１種子試料からのデンプンのアミロース含有量を測定した。プールした種子試料は、以下のようにしてトランスジェニック小麦系統から得た：
プール１−ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統８５．２ｃからデンプン変形顆粒を有していた種子
プール２−ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統８５．１ａから正常顆粒を有していた種子
プール３−ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統１１０．１８ａから正常顆粒を有していた種子
プール４−ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統５８．１ａ、５８．２ａおよび６１．２ａ（一緒にプール）から変形顆粒を有していた種子
プール５−ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統８３．１ｂから正常顆粒を有していた種子
プール６−ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統７５．３ｘから正常顆粒を有していた種子
各々の分析は、デンプン試料の４つの複製を用いて行った。これらの分析のために、吸光度をアミロース含有量に変換するのに用いられる回帰式は、Ｙ＝５７．５４８ｘ−８．７９３であった（ここで、Ｙはアミロース含有量（％）であり、ｘは吸光度）。
結果を表８に示す。変形デンプン顆粒の存在は、明らかにアミロース含有量の増加を伴っていた。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統（プール１および４）からの変形顆粒を有する穀粒由来のデンプンは５０％を超えるアミロース含有量を有していたのに対し、他のデンプンプール（正常なデンプン顆粒を有する穀粒に由来する）は２１〜２６％の範囲でアミロース含有量を有していた。これはＳＢＥＩＩｂ（表８）の発現が低減された系統ＩＩｂ １１０．１８ａからのデンプンを含んでおり、このことは、小麦中においてＳＢＥＩＩｂのみ失活させても、穀粒デンプン中でのアミロースレベルは実質的に増加しないことを示唆する。
表８．トランスジェニック小麦系統のヨウ素還元法によって推定されるアミロース含有量
Figure 0005562295
分析の第２セットは、プール ４とＳＳＩＩ（Ｙａｍａｍｏｒｉ他、２０００年）が欠如している小麦からのデンプンおよびＳＳＩＩａの変異体である大麦系統Ｍ２９２からの試料を用いてヨウ素還元法によって行った。プール４小麦種子（ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統）について測定されたアミロース含有量は、小麦および大麦のＳＳＩＩ変異体からのデンプンのそれより相当に高かった。
これはこれらの穀粒中のデンプンのアミロペクチン含有量が相当に、すなわち、野生型のおよそ７５％から、５０％未満またはさらには２０％未満にまで低減されることを意味する。
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａとｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ導入遺伝子を含む系統は、上述の遺伝子導入植物を交配することによって発生する。そのような子孫の穀粒デンプン中のアミロース含有量は、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａのみを含む植物由来のデンプンのアミロース含有量以上に、例えば７５または８０％まで増加し、ＳＢＥＩＩａに加えてＳＢＥＩＩｂの抑制がさらにアミロースレベルを上昇させることを示している。
＜実施例７．Ａ、ＢおよびＤ ゲノムからのＳＢＥＩＩａの比較＞
小麦ｃＤＮＡのコンストラクトおよびゲノムライブラリー
小麦胚乳ｃＤＮＡとゲノムライブラリーは、ファージベクター（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年）における標準分析法によって作成した。２つのｃＤＮＡライブラリー（一方は栽培品種Ｒｏｓｅｌｌａ（Ｒａｈｍａｎ他、１９９９年）由来のＲＮＡから、他方は栽培品種Ｗｙｕｎａ（Ｒａｈｍａｎ他、２００１年）から作成した。ＲｏｓｅｌｌａライブラリーはベクターＺＡＰＩＩ中にあってＥｃｏＲＩとＮｏｔＩプライマーを用い、他方、Ｗｙｕｎａライブラリーは試薬に伴って与えられるプロトコルに従ってＺｉｐＬｏｘベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に存在した。ライブラリーの力価は、大腸菌のＹ１０９０（ＺＬ）株で試験して２×１０６ｐｆｕの力価であった。ゲノムライブラリーは、Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ変異体１００９７由来のＤＮＡから作成した。ＤＮＡをＳａｕ３Ａで消化し、部分装填ｌａｍｂｄａＧＥＭ１２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲートした。クローンフラグメントは、ＳａｃＩまたはＸｈｏＩ消化で放出できた。Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ ＤＮＡのゲノムライブラリーは、Ｔｕｒｎｅｒ他（１９９９年）に記載されている。
ＳＢＥＩＩａ ｃＤＮＡ配列の隔離
小麦ＳＢＥＩ遺伝子配列のプローブを使って低ストリンジェンシーで（Ｒａｈｍａｎ他、２００１年）で、栽培品種Ｒｏｓｅｌｌａから調製されるライブラリーからｃＤＮＡを分離した。得られた最も長いクローン（ｓｂｅ９と命名）の配列決定を行ったところ、ＳＢＥＩＩａタイプの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ３３８４３２．１）をコードすることが分かった。その後、栽培品種Ｗｙｕｎａ（Ｒａｈｍａｎ他、２００１年）から調製した胚乳ｃＤＮＡライブラリーから、ｓｂｅ９の位置５３６〜８９０に対応するプローブを用いて３つのクローンを分離した。ライブラリースクリーニングの条件は、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精液ＤＮＡで４２℃、１６時間のハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、３×１時間（中程度のストリンジェンシー）で洗浄とした。クローンを配列決定することにより、３つの異なる配列が得られ、これらを以下、ｓｒ９９５およびｓｒ９９７（図６）と表す。
これらのｃＤＮＡ配列を調べることにより、様々な配列が小麦胚乳で発現していることが示されたが、これらは異なる小麦ゲノムからのＳＢＥＩＩａ転写物と対応しているようである。他の既知の小麦ＳＢＥＩＩａ ｃＤＮＡ配列による配列とのＰＩＬＥＵＰ比較は、ｓｒ９９５とｓｒ９９６配列が、Ｄ−ゲノム配列ｗＳＢＥ−Ｄ１（ｓｒ８５４）（図７）に由来するｍＲＮＡ配列とクラスターになっていることを示し、ｓｒ９９５およびｓｒ９９６がＤゲノムＳＢＥＩＩａからの転写物を表していることを示唆した。Ｙ１１２８２配列（Ｎａｉｒ他、（１９９７年））とクラスターになっているＳｒ９９７は、それらがおそらく同じゲノム（ＡゲノムかＢゲノム）に由来するものであることを示している。前述のｓｂｅ９（ＡＦ３３８４３２．１）はおそらくＹ１１２８２と同じゲノムに由来するものであろうが、選択的スプライシングイベントを表し、５'末端の近くで１つのエキソンがスプライシングで除かれたものと一致している。
小麦Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍのＡ、ＢおよびＤゲノムからのＳＢＥＩＩａ遺伝子との区別
遺伝子またはＲＮＡ転写配列における相違は、遺伝子レベルにせよＲＮＡレベルにせよ、突然変異スクリーニングのためのＡ、ＢおよびＤゲノム特異的プライマー設計の基礎として用い得る。例えば、図６は、Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッションＹ１１２８２を含むｃＤＮＡ由来のＳＢＥＩＩａヌクレオチド配列とｃＤＮＡ ｓｂｅ９（ＡＦ３３８４３２．１）、ｓｒ９９７およびｓｒ９９５の部分配列と比較している。ゲノム配列はＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のＳＢＥＩＩａ遺伝子に利用可能である（例えば、表１参照）。ゲノム配列は、Ａ、ＢおよびＤゲノムに割り当てられた。比較は染色体の多型を示し、そのいずれもが配列を分子的手段によって識別するのに用いることができる。
エキソン５領域に基づくフォワードプライマー（５'−ＡＴＣＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧ−３'）［配列番号１５］およびエキソン６領域に基づくリバースプライマー（５'−ＣＴＧＣＡＴＴＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＴＴＧ−３'）［配列番号１６］をＡ、ＢおよびＤゲノム由来の産物間の識別をするのに用いた。そのようなプライマーは、Ａ、ＢまたはＤゲノム（下記参照）由来のＳＢＥＩＩａ遺伝子の１つまたは複数の変異体である変種またはアクセッションをスクリーニングするためにＰＣＲ反応で用いてもよい。
ＳＢＥＩＩｂ遺伝子を小麦のＡ、ＢおよびＤゲノムから区別するためにＰＣＲベースのマーカーも開発した。例えば、プライマー対ＡＲＡ１９Ｆ（５'−ＣＡＣＣＣＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＧＧＴＡＣＡＣＴＧ−３'）［配列番号１７］とＡＲＡ１５Ｒ（５'−ＴＣＣＡＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡ−３'）［配列番号１８］を用いたＰＣＲ反応の後、制限酵素ＲｓａＩで増幅産物の消化を行うことで、ＳＢＥＩＩｂ遺伝子と３つのゲノムを区別することができた。
ｃＤＮＡ配列の違いを、推定タンパク質配列に反映する。例えば、Ｄゲノム（ｓｒ８５４）とＡまたはＢゲノム（Ｙ１１２８２）ポリペプチドに対して推定したノーカットアミノ酸配列を図８で比較する。１つまたは複数のゲノムに特異的な活性が欠如している小麦の種類をスクリーニングするために、ＳＢＥＩＩａタンパク質に対するゲノム特異的抗体を産生するために使うことのできた領域６８８〜６９８と７３５〜６とでは顕著な差異が明らかである。他の違いは、図８のアミノ酸位置１〜５４と対応する輸送ペプチド配列で起こる。
＜実施例８．１つまたは複数のＳＢＥＩＩ遺伝子における小麦の種類変異体の識別＞
ＢおよびＤゲノム中のＳＢＥＩＩｂヌル変異の識別
３００のオーストラリアの小麦の種類を含む１５００の小麦寄託種の合計、オーストラリア冬穀物コレクション（ＡＷＣＣ、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｗｉｎｔｅｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｔａｍｗｏｒｔｈ、ＮＳＷ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からの９００の小麦寄託種と３００の小麦生産地種を、プライマーＡＲＡ１９Ｆ（上記参照）とＡＲＡ２３Ｒ（５'−ＣＴＧＣＧＣＡＴＡＡＡＴＣＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＧ−３'）［配列番号１９］を用いて多形イントロン３領域に対応するＳＢＥＩＩｂマーカーを用いたＰＣＲ増幅でスクリーニングした。ＰＣＲ増幅は、上述の条件を用いた。増幅産物を制限酵素ＲｓａＩで消化して、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。３つの系統（Ａｕｓ１２７４５、Ａｕｓ１７３４０およびＡｕｓ１０１０３）はＤゲノムマーカーが欠けており、２つの系統（Ａｕｓ１２５０９およびＡｕｓ１２５６５）はＢゲノムマーカー（図９）が欠けていた。これらの系統は、ＢまたはＤゲノムのためのＳＢＥＩＩｂ遺伝子において推定されるヌル変異体を表す。
ＰＣＲの結果を確認するために、ヌル変異体系統からＤＮＡ上で、サザンブロットハイブリダイゼーション分析を行った。標準分析法によって植物から調製したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロットした。
Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡラベリングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ）を使用して、ＳＢＥＩＩｂ（位置２０１９〜２３９１、図２参照）遺伝子のイントロン３領域から放射性ラベリングしたプローブを生成し、厳しいハイブリダイゼーション条件下に使用した。Ａｕｓ１７３４０とＡｕｓ１０１０３は、Ｄゲノムから〜４．８ｋＢバンドを失っており、Ａｕｓ１２５０９とＡｕｓ１２５６５は、Ｂゲノムから〜３．４ｋＢを失っていた（図１０）。したがって、これらの系統は、それぞれ、ＤまたはＢゲノムＳＢＥＩＩｂ遺伝子についてのヌル変異体であることが確認された。
Ｂ＋Ｄ２倍ヌル変異体の世代
以下の交配を実行した：
Ａｕｓ１７３４０ａ×Ａｕｓ１２５０９
Ａｕｓ１７３４０ｂ×Ａｕｓ１２５０９
Ａｕｓ１７３４０ａ×Ａｕｓ１２５６５
Ａｕｓ１７３４０ｂ×Ａｕｓ１２５６５
Ａｕｓ１２７４５ ×Ａｕｓ１２５０９
Ａｕｓ１２７４５ ×Ａｕｓ１２５６５
Ａｕｓ１７３４０ａとＡｕｓ１７３４０ｂは、同じＡｕｓ１７３４０栽培品種の２つの異なるバイオタイプであり、両方とも、ＤゲノムＳＢＥＩＩｂ遺伝子マーカーについて無効であることを確認した。Ｆ１植物を自家受粉し、Ｆ２子孫はＢとＤ両方のゲノムＳＢＥＩＩｂ遺伝子の変異体（２倍ヌル変異体）である植物のためのＰＣＲ方法によってスクリーニングした。プライマー対ＡＲ２ｂ１９ｃＦ（５'−ＣＴＡＴＧＣＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣ−３'［配列番号２０］とＡＲ２ｂ２３ｃＲ（５'−ＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＴＧＡＡＣＧ−３'［配列番号２１］（これは、ＡＲＡ１９Ｆ／ＡＲＡ２３Ｒと同じ領域を増幅する）を用いたＰＣＲ増幅後、制限酵素Ｒｓａｌを用いた消化によってＳＢＥＩＩｂ突然変異の分離を観察した。典型的分離パターンを図１１に示す。カイ二乗分析で、交配Ａｕｓ１７３４０ａ×Ａｕｓ１２５０９とＡｕｓ１７３４０ａ×Ａｕｓ１２５６５の分離パターンが９：３：３：１（表９）の期待される比率に当て嵌まることが分かった。分離は、他の交配では非常に歪んでいた。
表９．ＢとＤサブゲノムにおけるＳＢＥＩＩｂヌル変異体間の交配のＦ２集団のカイ二乗分析
Figure 0005562295
表中のχ２ （９：３：３：１）の値（０．０５）、ｄｆ３＝７．８１
アルビノ植物は親の系統にかかわりなくすべて交配で検出され、変異体葉緑素関連の遺伝子も集団内で分離していたことを示した。分析した２４のアルビノ植物のうち、２３はＢ＋Ｄ二重ヌル変異体であり、１は野生型であるように見えた。Ｂ＋Ｄ二重ヌル変異を伴う５つの正常に見える緑色植物を、試験した７１８の系統から確認した。これらのうちの３はＡｕｓ１７３４０ｂ×Ａｕｓ１２５０９（ＢＤ２１９、ＢＤ３０３、ＢＤ３４１）、１つはＡｕｓ１７３４０ａ×Ａｕｓ１２５０９（ＢＤ５４）、１つはＡｕｓ１７３４０ｂ×Ａｕｓ１２５６５（ＢＤ６３６）に由来するものであった。この結果から、ＢおよびＤゲノムＳＢＥＩＩｂ遺伝子における突然変異は、２つの突然変異した遺伝子位置が一緒になった場合、アルビノフェノタイプを与えている葉緑素関連遺伝子における突然変異と密接な関連があることが明らかになった。しかし、極めて低い頻度ではあるものの、正常のＢ＋Ｄ二重ヌル変異体系統をもたらす、ＳＢＥＤ遺伝子と葉緑素関連遺伝子の間の組み換え事象が確認された。これは、２つの遺伝子が密接に結合されるが、分離され得ることを示す。
＜実施例９．ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂは小麦中で結合している＞
ＢＡＣクローンの単離
Ａ．ｔａｕｓｃｈｉｉ ｍｅｙｅｒｉ品種（Ｍｏｕｌｌｅｔ他、１９９９年）から作られる大きな挿入コスミドバイナリーコスミド（ＢＡＣ）ライブラリーをＳＢＥＩＩｂ遺伝子のイントロン３領域（位置２０１９〜２３９１、図２）でプローブし、ＳＢＥＩＩｂ遺伝子を含むＢＡＣを単離した。４つのポジティブなクローンを単離して、ＢＡＣ−４、−５、−９および−１２と称した。これらがＳＢＥＩＩｂ遺伝子を含んでいることを確認するために、これらのクローンからＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲｌで消化し、同じプローブ（図１２）を使ってサザンブロットハイブリダイゼーションを実行した。クローンＢＡＣ−５は、ＥｃｏＲｌを伴う〜７．５ｋＢのサイズの１つの強いハイブリダイズバンドと、ＨｉｎｄＩＩＩを伴う〜６．１、３．６、２．３および１．７のサイズの４つのバンドを示した（図１２）。これは、ＢＡＣ−５上でのＳＢＥＩＩｂの存在を示した。ＢＡＣ−５上での遺伝子の３'の存在を調べるため、ＳＢＥＩＩｂｃＤＮＡ配列に基づく、エキソン１７を増幅するように設計された特定のプライマー（ＡＲ２ｂ３ｐｒ２Ｆ、５'−ＧＧＡＴＡＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＣＡＴＧＧ−３'［配列番号２２］およびＡＲ２ｂ３ｐｒ２Ｒ、５'−ＣＣＡＴＡＡＡＧＴＴＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣ−３'）［配列番号２３］、および２０（ＡＲ２ｂ３ｐｒ１Ｆ、５'−ＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧ−３'）［配列番号２４］およびＡＲ２ｂ３ｐｒ１Ｒ、５'ＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＣ−３'）［配列番号２５］を使ってＰＣＲ増幅を行った。プライマーのセットは両方とも、エキソン１７については１２８ｂｐ、エキソン２０については１４５ｂｐサイズの期待される産物を増幅し、ＢＡＣ−５がＳＢＥＩＩｂの３'末端を含むことを示した。これは、エキソン２０からＰＣＲ産物を配列決定することによってさらに確かめられた。
ＳＢＥＩＩｂに加えてＳＢＥＩＩａ遺伝子の存在についてもＢＡＣ−５を調べた。プライマーＡＲ２ａｋｐｎＩＦ５'−ＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＧＡＣＣＣ−３'［配列番号２６］を使ったヌクレオチド配列決定反応は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子のイントロン３領域に対応する配列を与え、ｗＳＢＥＩＩ−Ｄｌの位置２２６５〜２４７８（図１）に由来する配列と同じであった。この結果は、ＳＢＥＩＩａがＢＡＣ−５上にも存在することを示唆し、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂがおそらく小麦において密接に結合しているであろうことを意味した。
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）
Ｔｕｒｎｅｒ他（１９９９年）によって記載されたようにして、ｗＳＢＥ ＩＩ−Ｄ１ゲノムクローンＦ２（Ｒａｈｍａｎ他、２００１年）とｗＳＢＥＩＩ−Ｄ２クローン（Ｒａｈｍａｎ他、２００１年）とのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉと小麦からの染色体潰砕物に対して実行した。ハイブリダイズした染色体の同一性を、染色体識別（Ｍｕｋａｉ他、１９９０年）のために使われる反復塩基配列である二重標識ｗｉｔｈｐＳｃ１１９．２によって確認した。ｗＳＢＥＩＩクローンの両方とも染色体２（図１３）の先端領域にハイブリダイズし、小麦における２つのＳＢＥＩＩ遺伝子の近くを示した。
小麦ＳＢＥＩＩｂヌル変異体はＳＢＥＩＩａについての変異体でもある
先に述べたように確認したＳＢＥＩＩｂヌル変異体を、プライマーＳｒ９１３Ｆ（５'−ＡＴＣＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧ−３'）［配列番号２７］およびＥ６Ｒ（５'−ＣＴＧＣＡＴＴＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＴＴＧ−３'）［配列番号２８］を用いて、ＳＢＥＩＩａ遺伝子における突然変異についてスクリーニングした。これらのプライマーは、ｗＳＢＥ ＩＩ−Ｄ１のイントロン５領域を増幅して、Ａ、ＢおよびＤゲノム上でＳＢＥＩＩａ遺伝子を識別するように設計した。
ＳＢＥＩＩｂ Ｂゲノムヌル変異体Ａｕｓ１２５６５およびＡｕｓ１２５０９は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子のＢゲノムヌル変異体でもあると分かった。同様に、ＳＢＥＩＩｂ、Ａｕｓ１７３４０およびＡｕｓ１０１０３のＤゲノムヌル変異体は、ＳＢＥＩＩａのＤゲノムヌル変異体でもあった。さらにまた、ＳＢＥＩＩｂ、ＢＤ３４１およびＢＤ６３６のＢ＋Ｄゲノム二重突然変異体系統は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子のＢ＋Ｄゲノム二重ヌル変異体でもあった。データは、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂが、コメとトウモロコシとは対照的に、小麦においては密接に結合することを証明し、上述のこれらの遺伝子のＢおよびＤゲノムコピーについての突然変異が欠失突然変異を表すことを示す。
３重ヌルＳＢＥＩＩａ小麦変異体
上述の方法は、ＳＢＥＩＩａおよび／またはＳＢＥＩＩｂのＡ−ゲノム変異体を単離させるのに用いてもよい。例えば、ＳＢＥＩＩａおよび／またはＳＢＥＩＩｂに密接に結合するＢＡＣ−５領域は、遺伝子中でＡ−ゲノム突然変異をスクリーニングするためにプローブまたはＰＣＲプライマーの設計のために使われる。Ａ−ゲノム変異体は、Ｂ＋Ｄ二重ヌル系統と交配してＡ＋Ｂ＋Ｄ３重ヌル系統を生産する。あるいは、Ｂ＋Ｄゲノム二重ヌル変異体の突然変異生成は照射その他の手段で実行され、三重ヌル変異体は、ＳＢＥＩＩａ活性を完全に欠いており、状況に応じてＳＢＥＩＩｂ活性が特定される。非常に高いアミロース濃度を備えた非トランスジェニック小麦品種が提供される。
＜実施例１０．小麦におけるＳＢＥＩＩＡ遺伝子の突然変異＞
ＳＢＥＩＩａの活性低減に至る小麦におけるＳＢＥＩＩａ遺伝子の突然変異は、ガンマ線照射または化学的突然変異誘発、例えばエチルメタンスルホン酸エステル（ＥＭＳ）を用いて達成する。ガンマ線誘発突然変異のために、種子は６０Ｃｏ源（ＺｉｋｉｒｙａｅｖａおよびＫａｓｉｍｏｖ（１９７２年）から２０〜５０ｋＲの量の照射を受ける。ＥＭＳ突然変異生成は、Ｍｕｌｌｉｎｓ他（１９９９年）に従って種子をＥＭＳ（０．０３％、ｖ／ｖ）で処理して行う。Ｂ＋Ｄ二重ヌルバックグラウンドでは、変異体穀粒は増加したアミロース含有量または変更したデンプン顆粒形態に基づいて特定され、上述の方法によって確認される。ＳＢＥＩＩｂ活性を保持するＳＢＥＩＩａの変異体は再変異してもよく、子孫は、ＳＢＥＩＩａに加えてＳＢＥＩＩｂ活性の喪失についてスクリーニングでき、または、ＳＢＥＩＩａ変異体はＳＢＥＩＩｂ変異体と交配して、突然変異を結合して、胚乳において実質的にＳＢＥＩＩ活性が欠如している種類の非トランスジェニック小麦を生産する。
＜実施例１１．ＳＧＰ−１小麦変異体はＳＢＥＩＩａ活性およびＳＢＥＩＩｂ活性において低減している＞
小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）のＡ、ＢおよびＤゲノムからのデンプン合成酵素ＩＩ（ＳＳＩＩ）遺伝子は、糖−顆粒タンパク質（Ｓｔａｒｃｈ Ｇｒａｎｕｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＳＧＰ−１）としても知られている１００−１０５ｋＤａのポリペプチドをコードする。ＳＳＩＩ（ＳＧＰ−１）は、それぞれ染色体７Ｂ、７Ａおよび７Ｄ（Ｄｅｎｙｅｒ他、１９９５年；ＹａｍａｍｏｒｉおよびＥｎｄｏ１９９６年）短腕上遺伝子の相同的集合によってコードされるおよその分子量が１００、１０４および１０５ｋＤａである３つのポリペプチドからなる。Ｙａｍａｍｏｒｉ他（２０００年）は、タンパク質電気泳動による分析で、Ａ、ＢおよびＤゲノムの特異的なＳＧＰ−１タンパク質の形態を欠いている系統を交配することによってＳＧＰ−１ヌル小麦を生産した。ＳＧＰ−１ヌルな種子の検査は、突然変異がアミロペクチン構造の変化をもたらし、アミロース含有量を上昇させ、デンプン顆粒を変形させることを示した（Ｙａｍａｍｏｒｉ他、２０００年）。そのうえ、成熟した穀粒についての電気泳動実験では、顆粒結合ＳＢＥＩＩ（ＳＧＰ−２）とＳＳＩ（ＳＧＰ−３）のレベルがかなり減少することが分かった。ＳＧＰ−１ヌル系統をもたらす突然変異（複数可）の分子的基礎は知られていなかった。
我々は、さらに、成熟穀粒からのデンプン顆粒において完全にＳＧＰ−１を欠いている小麦系統を特徴付けるために実験を行った。ＳＳＩＩ遺伝子がＳＧＰ−１ヌルな小麦のＡ、ＢおよびＤゲノムの各々に存在するかどうか決定するために、ＤＮＡをＳＧＰ−１ヌルな小麦と野生型（対照）ｃｖ中国春小麦から抽出し、Ｂゲノムについてはプライマーの組合せｓｓＩＩａ（５'−ＣＣＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＧＡＡＣＧＣ−３'［配列番号２９］およびｓｓＩＩｂ（５'−ＣＧＧＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＣ−３'［配列番号３０］を用いたＰＣＲによって、ＡおよびＤゲノムについてはｓｓＩＩａとｓｓＩＩｃ（５'−ＣＡＴＧＴＧＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＧＣＣＣ−３'［配列番号３１］を用いたＰＣＲによって分析した。増幅した領域は、ｗＳＳＩＩＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５５２１７）またはｗＳＳＩＩＢまたはｗＳＳＩＩＤの対応する領域である位置２４７２〜２８２１ｂｐの間にあった。Ａ、ＢおよびＤゲノム産物の明確な識別が可能であったので、増幅した領域はエキソン８の部分を構成して選ばれた。増幅は、９４℃で３０秒、６０℃で１分および７０２℃で２分の３５サイクルを用いて行った。ＳＧＰ−１ヌルな小麦のＡ、ＢおよびＤゲノム産物から生産されるＰＣＲ断片は、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｐｒｉｎｇから作り出した対応する断片と同じサイズであった。イソアミラーゼとＳＳＩ遺伝子（それはＳＳＩＩに最も密接に位置するデンプン生合成支配遺伝子であって、ＳＳＩＩ（Ｌｉ他、２００２年）の両側に位置する）の遺伝子セグメントのＰＣＲ増幅は、これらの遺伝子がＳＧＰ−１ヌルな小麦のＡ、ＢおよびＤゲノムの各々について増幅され得ることを示した。したがって、ＳＧＰ−１ヌルなフェノタイプは、染色体７短腕上でこれら遺伝子のいずれの欠失にも起因しなかった。
走査型電子顕微鏡によって調べた場合、ＳＧＰ−１ヌルな発育中種子からのデンプン顆粒は、開花後１０日から成熟まで明らかに変形した。キャピラリー電気泳動法によって調べた場合、変異体中の脱分枝したデンプンの鎖長分布は、より短いチェーン（重合度８まで）の比率の増加を示す一方、重合度９−２２の比率の減少を示す。
ＳＧＰ−Ｉ胚乳におけるデンプン合成酵素の発現と分枝酵素
デンプン顆粒中におけるデンプン合成酵素と分枝酵素の発現を、ＳＧＰ−１ヌルにおいて調べ、野生型栽培品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇのそれらと比較した。ＳＧＰ−１ヌル系統では、種子発育のステージに関係なく、ＳＳＩＩ（図１４）の欠如に加え顆粒中のＳＢＥＩＩとＳＳＩの量においてほぼ９０％〜９６％の顕著な低減があった。特異的抗体の使用は、顆粒から得られるＳＢＥＩＩバンドがＣｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇではおよそ１：３の比率のＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂを含むことを示した。ＳＧＰ−１ヌル変異体においては、量があまりにも低かったため、相対的な比率を、抗体を用いて測定することはできなかった。また、穀粒成長の初期からＧＢＳＳ Ｉレベルの低減があった。ＳＧＰ−１変異体においては、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂを含むデンプン顆粒結合ポリペプチドのレベル低減があることは、明らかである。デンプン−顆粒結合ポリペプチド（ＳＢＥＩＩおよびＳＳＩ）の低減は、ＳＧＰ−１ヌル（Ｙａｍａｍｏｒｉ他、２０００年）を産生するのに用いられる小麦系統の穀粒では観察されなかった、影響が特にＳＳＩＩの欠如に起因することを示唆している。
分枝酵素とデンプン合成酵素は、胚乳を成長させる溶液段階でも分析した。溶解性ＳＢＥＩＩｂの相対量はＣｈｉｎｅｓｅ ＳｐｒｉｎｇとＳＧＰ−１ヌル系統で同様であり、変異体の溶解段階にあるＳＢＥＩＩａの量の低減があった（図１５）。しかし、これはＳＧＰ−１ヌルな系統の系図に部分的に原因したものでもよい。
これらのデータは、ＳＢＥＩＩａ活性がＳＳＩＩ遺伝子中の突然変異によって多形質発現的に減少し得ることを証明する。ＳＳＩＩのみの突然変異が、デンプン中の相対的アミロースレベルを５０％未満にさせるが、それはＳＢＥＩＩａ以外の遺伝子の突然変異がＳＢＥＩＩ突然変異と組合せ可能であり、アミロースレベルを増やし、変化したデンプンを生じることを示唆する。
＜実施例１２．ＳＢＥＩのノックアウト−多数のアイソフォーム＞
陰イオン交換クロマトグラフィーを通しての小麦デンプン分枝酵素の精製は、活性を３つのピークに分解した（図１６、Ｍｏｒｅｌｌ他、１９９７年）。栽培品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ（ＣＳ）からの胚乳抽出は、ポリクローンナル抗体である抗−ＷＢＥ−１（タンパク質のピーク１（図１６Ｂ）のＮ末端配列に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して誘導されたもの）を用い、非変性ＰＡＧＥ上で４つのＳＢＥＩポリペプチドの存在を明らかにした。ＣＳヌルの同染色体−四染色体系統の分析では、これらのポリペプチドが染色体７上にコード化されていることが分かった。免疫ブロットの上のバンドはＡ（Ａバンド）、Ｂ（Ｂバンド）とＤ（ＤｉとＤｉｉバンド）ゲノムに割り当てられ、それぞれ、活性はＡ−メジャー活性、Ｂ−メジャー活性およびＤ−メジャー活性と名付けられた。陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られる活性なピークを表している精製画分の免疫ブロット分析では、最初のピークがＳＢＥＩ ＡメジャーおよびＤメジャー活性を含み、第２のピークはＳＢＥＩ Ｂ−メジャー活性を含むことが分かった（図１６Ｃ）。
染色体７上で大きなＳＢＥＩ活性をコードする遺伝子の位置は、３つのよく特徴が分かっている関連した遺伝子、ｗＳＢＥＩ−Ｄ２、ｗＳＢＥＩ−Ｄ３およびｗＳＢＥＩ−Ｄ４の決定された位置と一致している。ＳＢＥＩ−メジャーの推定したタンパク質配列は、それがこれらの遺伝子の最後にコードされていることを示した（ｗＳＢＥＩ−Ｄ４（Ｒａｈｍａｎ他、１９９７年、Ｓｕｚｕｋｉ他、２００３年）。第４のＳＢＥＩ遺伝子の存在は、サザンブロットハイブリダイゼーションデータ（Ｓｕｚｕｋｉ他、２００３年）に基づいて提案された。
ＳＢＥＩメジャーのヌル変異体の特定
１つまたは複数のアイソフォームの発現が欠如しているヌル変異体を同定するため、非変性ゲル電気泳動の後、ＳＢＥＩ−メジャー免疫ブロット検出によって小麦生殖細胞質のコレクションをスクリーニングした。上述の抗ｗＳＢＥＩ抗体を用いた。分析した１８２のオーストラリア６倍体小麦のアクセッションのうち、ＳＢＥＩ−Ｄメジャーを発現しない１３系統、ＳＢＥＩ−Ｂメジャーを欠く１６系統、ＳＢＥＩ−Ａを欠く１０系統、およびＡとＢアイソフォームの両方ともを欠く２つ（ＢｉｎｄａｗａｒｒａとＶｅｃｔｉｓ）が同定された。これらの系統は、それぞれのゲノムＳＢＥＩ遺伝子のヌル変異を有すると考えられる。ＳＢＥＩ−メジャー遺伝子のヌル変異の頻度（〜２３％）はＧＢＳＳ遺伝子（２２％）（Ｂｏｇｇｉｎｉ他、２００１年）のそれと同様だった。
ＳＢＥＩ−メジャー三重ヌル系統の生成
免疫ブロット分析から、栽培品種ＢｉｎｄｗａｒｒａとＶｅｃｔｉｓがＡ−メジャーおよびＢ−メジャーＳＢＥＩ活性を欠いていることは明らかであり、栽培品種ＣａｄｏｕｘがＤ−メジャーＳＢＥＩ活性を欠くものとして同定された。Ｖｅｃｔｉｓ×Ｃａｄｏｕｘの交配から得られる１８５系統のＦ２子孫集団を、イムノブロッティングでスクリーニングした。しかし、３つの活性のすべてを欠いている系統は得られず、そのような子孫は生存能力が低いか、あるいは、ゲノム間に何等かの相互作用があることが示唆された。そこで、Ｂ−メジャーおよびＤ−メジャー活性を欠いている子孫系統ＶＣ３．１．１１を、Ａ−メジャー活性を欠き遺伝子操作したＣｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ（ＣＳ７ＡＬ−１５）と交配した。二重ハプロイド系統をプライマーＡＲＢＥ１ＣＦ（５'−ＧＧＧＣＡＡＡＣＧＧＡＡＴＣＴＧＡＴＣＣ−３'）［配列番号３２］およびＡＲＡ９Ｒ（５'−ＣＣＡＧＡＴＣＧＴＡＴＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧ−３'）［配列番号３３］を用いてＰＣＲとイムノブロッティングの両方でスクリーニングを行い、１６０のうち２系統（Ａ１１３とＤ１３）は、非変性ゲル類の上でイムノブロッティングによって判断すると、ＳＢＥＩメジャー活性を完全に欠いていた。図１７は、Ａ１１３（レーン６）を含む倍加半数体系統の代表的分離パターンを示す。
系統Ａ１１３の胚乳に残存ＳＢＥ活性がないか調べた。野生型小麦変種（Ｄ２８）は、ＳＢＥＩ活性の２つのピークを示した。一方、Ａ１１３抽出物は、最初のピークは与えたが、活性の第２のピークは完全に欠いていた。この活性を含む精製画分から得られるアミノ酸配列は、Ａ１１３中ではタンパク質のＳＢＥＩタイプの存在を示した。しかし、この画分は、非変性ジェル中では抗ＷＢＥＩ抗体との反応を示さなかった。Ａ１１３中での枝分れ活性は、ＳＢＥＩＩタイプ酵素のものであり得る約８０ｋＤａのタンパク質に対応する（それはポテトＳＢＥとトウモロコシＳＢＥＩＩ抗体で交差反応した）。
これらのデータは、ＳＢＥＩ変異体系統が小麦で発生し得ることを示す。ＳＢＥＩＩａと状況に応じてＳＢＥＩＩｂ突然変異によるＳＢＥＩ突然変異の組合せは、穀粒デンプン中に非常に高いアミロースレベルを有する小麦植物を生産する。
＜実施例１３．ＳＢＥＩＩ遺伝子中に突然変異を有する染色体２Ａを含む変異体小麦の識別＞
ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子中に突然変異を有する小麦系統を特定するべく、２４００の６倍体小麦アクセッションをＡ、ＢまたはＤゲノム中、ＳＢＥＩＩｂのヌル変異についてスクリーニングした。プライマーＡＲ２ｂｌ９ｃＦ／ＡＲ２ｂ２３ｃＲを各系統の小麦植物のゲノムＤＮＡ試料へのＰＣＲ反応で使用し、ＲｓａＩで増幅産物の消化を行いゲル電気泳動した。このマーカーはイントロン３領域（小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子（図２）のヌクレオチド位置２０８５〜２３３６）を増幅して、ＳＢＥＩＩｂに特異的だった。上の実施例で記載したように、このスクリーニングでは３つのＤゲノムＳＢＥＩＩ−ヌル変異体と２つのＢゲノムＳＢＥＩＩ−ヌル変異体の識別がなされた。ＳＢＥＩＩｂと対応しているＡゲノムバンドを欠いた変異体系統は検出されなかった。これは、変異体ＳＢＥＩＩｂ遺伝子を有する染色体２Ａを含む小麦系統が自然に存在しないことを示唆した。
Ｔｏｎｙ ＰｒｉｏｒとＲｏｈｉｔ Ｍａｇｏ（ＣＳＩＲＯ）によって生成されたガンマ系統線（６０Ｃｏ源）誘導変異体小麦集団を用いて小麦ＳＢＥＩＩ中の誘発突然変異をスクリーニングした。小麦集団は、Ｇａｂｏ１ＢＬ．１ＲＳとＶｅｅｒｙ ３とを交配させたＦ２子孫から生成した。この集団からの合計２６９４粒の変異体種を、プライマーＡＲ２ｂｌ９ｃＦとＡＲ２ｂ２３ｃＲを用い先に述べたようにＰＣＲ反応でスクリーニングした。１本の植物に由来し、ＳＢＥＩＩｂ Ａゲノムアレルを欠く２個の種子（ＭＬＴ２Ｂ８およびＭＬＴ２Ｄ１と命名）が同定された（図１８）。集団内の種子で、ＢまたはＤゲノム中にＳＢＥＩＩｂのヌル変異を含むものは特定されなかった。
上の実施例で示すように、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ遺伝子は、小麦では染色体２の長腕上で密接に結合している。したがって、我々は、プライマーＳｒ９１３Ｆ／Ｅ６Ｒを用いたＰＣＲ反応で、ＡゲノムＳＢＥＩＩａ遺伝子の有無についてこれらの種子からのＤＮＡを調べた。これらのプライマーはｗＳＢＥＩＩ−Ｄ１のイントロン５（ヌクレオチド位置２９５９〜３１８９、図１［配列番号１］）領域を増幅する。増幅後、産物を５％のシークエンシングジェル（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡシーケンサー）上で電気泳動にかけた。蛍光ラベリングした産物を、ソフトウェアＧｅｎｅｓｃａｎを用いて分析した。走査プロフィールは変異体種子ＭＬＴ２Ｂ８およびＭＬＴ２Ｄ１の両方についての増幅産物がＡゲノムＳＢＥＩＩａ遺伝子に対応している産物を欠いていることを示し、両方の種子がＳＢＥＩＩｂに加えてＡゲノムＳＢＥＩＩａについてヌルなアレルを有することを示した。
これらの種子において、ＳＢＥＩＩａに特異的なＡゲノムマーカーであるＡＲＩＩａＡＦ（５'−ＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＧＡＧＣ−３'）［配列番号３４］およびＡゲノムＳＢＥＩＩａ遺伝子の遺伝子産物のみを増幅するＡＲＩＩａＡＲ（５'−ＣＴＴＣＣＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＣＡＣ−３'）［配列番号３５］を用いてヌル変異をさらに確認した（３１３１ ｗＳＢＥ ＩＩ−ＤＡ１（図１）へのヌクレオチド位置３０２４）。この一組のプライマーは変種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇからの植物材料から１１０ｂｐ産物を増幅する一方、この産物は２粒の推定上の変異体種には明らかに欠けていた。これは陰性対照ｄｔ２ＡＳ（それは染色体２Ａの長腕の欠けているＣｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇの染色体操作系統である）に関してと同じである。ＳＢＥＩＩａ遺伝子とＳＢＥＩＩｂ遺伝子が染色体２の長腕に置かれるので、この系統は両方の遺伝子のＡゲノムアレルを欠いており、それゆえに、陰性対照（図１９）として用いることができた。
変異体種子ＭＬＴ２Ｂ８およびＭＬＴ２Ｄ１（ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂに対するＡゲノム変異体として識別される）からの胚を育てて植物とする。これら植物由来の種から得られるデンプンは、アミロース含有量、鎖長および他の特性がＡゲノム上のＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ両方のヌル変異がデンプン特性に影響を及ぼすかどうか決定するために分析される。
先に述べたように、ＢとＤゲノムの両方にＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ遺伝子の突然変異を有する５系統が発生した。これらのうち、系統ＢＤ ２１９とＢＤ ６３６は、温室で成長して、Ａヌル変異体系統ＭＬＴ２Ｂ８ とＭＬＴ２Ｄとが交配される。倍加半数体集団は、ホモ接合の三重ヌル変異体植物を提供するために、これらの交配のＦ１種子から生成される。そのような三重ヌル変異体植物は、８に１の頻度で、倍加半数体集団内に生じるはずである。Ａゲノムヌル変異は、類似の交配によってＢゲノム突然変異またはＤゲノム突然変異と生み合わせることができる。さらなる交配において、ヌルなアレルのいずれかを農学的または他の特徴のために、任意の適当な遺伝的バックグラウンドにも導入することができる。
以下の交配は、ＡゲノムＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂに突然変異を有するデュラム小麦（例えば品種Ｗｏｌｌａｒｏｉ）を産生するために実行される：
１）Ｗｏｌｌａｒｏｉ×ＭＬＴ２Ｂ８またはＭＬＴ２Ｄ１（ＷｏｌｌａｒｏｉバックグラウンドにおいてＡ−ゲノム ＳＢＥＩＩａ／ＳＢＥＩＩｂヌルデュラムを生じるため）
２）Ａ−ゲノムヌルなデュラム（Ｗｏｌｌａｒｏｉ）×Ｂ−ゲノムヌルＳＢＥＩＩａ／ＳＢＥＩＩｂ小麦系統（ＡＢ２倍ヌルＳＢＥＩＩａ／ＳＢＥＩＩｂデュラム（Ｗｏｌｌａｒｏｉ）を生じるため）
あるいは、
１）Ｗｏｌｌａｒｏｉ×Ｂ−ゲノムヌル小麦系統（Ｂ−ゲノムヌルなデュラムを生じるために）（Ｗｏｌｌａｒｏｉ）
２）Ｂ−ゲノムヌルなＷｏｌｌａｒｏｉ×Ａヌル小麦系統（ＡＢ２倍のヌルＳＢＥＩＩａ／ＳＢＥＩＩｂデュラムを生じるために）。
これらの交配は、高アミロース６倍体小麦のそれと類似している健康に有利な特定の最終用途を有する高アミロースデュラムコムギの生成をもたらす。
＜実施例１４．穀粒中の高アミロース含有量のセファロース２Ｂカラム分別法による確認＞
ＳＢＥＩＩａ／ＳＢＥＩＩｂ阻害遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニック小麦植物の穀粒におけるデンプンのアミロース含有量をセファロースカラム分別法により決定する。この方法では、デンプン分子は、その分子量に基づいてカラム上で分離した。次いで、分離した画分を、デンプン分析キット（Ｓｉｇｍａ社）を利用し供給元の説明書に従って分析した。
デンプンおよそ１０ｍｇを、３７℃で３０分間、インキュベーションすることにより、３．０ｍｌの１ＮＮａＯＨ（脱ガス後）に溶解した。未溶解成分を落とすため１５分遠心処理した。上清を、１ｍｌ／分のポンプ速度でセファロースＣＬ２Ｂカラムにロードした。緩衝液として１０ｍＭ ＮａＯＨを用い、各２．５ｍｌ５０画分を集めた。画分９〜５０のｐＨは、１ＭＨＣ１の３５μｌで４．５に調整した。各試料のアリコート（２５０μｌ）を管に移し、２５０μｌのデンプン試薬（デンプン分析評価キット、Ｓｉｇｍａ）を添加した。対照は以下のものを含んでいた。デンプン試薬（２５０μｌ）と水（２５０μｌ）のみを含むブランクのデンプン分析評価試薬、５００μｌの水のみを含むブランクのブドウ糖分析評価試薬、２５０μｌデンプン試料と２５０μｌ水のみを含むブランク試料と２５０μｌのデンプン試薬と２５０μｌデンプン試料のみを含む試料テスト。試料と対照は６０℃で６０分、次いで、各２００μｌを新しい管に移し、その後、１ｍｌのブドウ糖試薬（デンプン分析評価キット、Ｓｉｇｍａ）を添加して３０分間、３７℃でインキュベートする。デンプンの量（ｍｇ）を測定するのには、各画分においてキット添付の説明書に従って３４０ｎｍの吸光度を用いた。
デンプン試料のクロマトグラムは、セファロースカラムから溶出する２つのピークを明らかにした。各試料のアミロース含有量（第２のピーク）を、両方のピークの範囲内のデンプンの総量のパーセンテージとして計算した。
この方法を用い、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統Ａｃｃ．１４４０８７のアミロース含有量（それは導入遺伝子についてはホモ接合性であることが示された）は７８％になるように計算され、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統Ａｃｃ．１４４００８（イベントＩＩｂ １１０．１６ｂからのホモ接合のトランスジェニック系統）のそれは２３％であると見積った（図２０）。比較において、８８．４７％および２７．２９％のこれらの系統に対してヨード還元的定法によりアミロース含有量を求めた（表１０）。
糊化温度、ペースト粘度および膨潤体積などのデンプンなどの機能的な特性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、Ｒａｐｉｄ Ｖｉｓｃｏ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＲＶＡ）およびデンプン膨潤力試験によってそれぞれ測定した。これらのデンプンの構造は、Ｘ線結晶学と粒度分析によって分析される。
表１０．ヨード還元的定法により評価した小麦トランスジェニック系統のアミロース含有量
Figure 0005562295
＜実施例１５．鎖長分布分析＞
デンプン試料の鎖長分布は、デンプンのイソアミラーゼ脱分枝後、蛍光ラベル糖鎖電気泳動（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＦＡＣＥ）により測定した。トランスジェニック種子から由来のデンプン中のうち重合度６−１１、重合度１２−３０および重合度３１−６０からの鎖長のパーセンテージを、非トランスジェニックの対照と比較して表１１に示す。高アミローストランスジェニック系統由来のデンプンについて正規化した鎖長分布を同遺伝子型の非形質転換対照由来のデンプンについて正規化した鎖長分布から差し引いたモル差を、図２１に示す。
表１１．小麦トランスジェニック系統由来のイソアミラーゼ脱分枝デンプンの鎖長分布
Figure 0005562295
ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック種由来のデンプンにおける重合度４−１２の鎖長は、非形質転換種子またはｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック種子由来のデンプンと比較して顕著に低い比率であった。重合度＞１３の鎖長の比率は、他と比較してｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック種子でより高かった。これらの結果は、ＳＢＥＩＩａが小麦デンプンにおいて重合度４−１２のより短い鎖の合成に選択的に関与しているという可能性を示唆する。しかし、ＳＳＩＩａ変異体由来のデンプンにおいては、より短い鎖長の比率がアミロースで増加していた。
＜実施例１６．トランスジェニック小麦由来のデンプンの特性＞
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａおよびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統からの糊化温度を含むデンプンの物性を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｄｉａｍｏｎｄ示差走査熱量計を使って分析した。各デンプンおよそ２０ｍｇを、１：２の比率で水に混合し、すなわち、含水率６６．７％として、ＤＳＣパンに封入した。１分当たり１０℃の加熱速度を用いて、０から１５０℃まで試験試料と参照試料を加熱した。データは、装置で利用できるソフトウェアを使用して分析した。
各デンプンについてサーモグラムＤＳＣトレースにおいて２つの吸熱ピークが観察された。最初のピークは、デンプンの糊化の間の結晶構造の崩壊を意味した。第２のピークは、アミロース−脂質解離の吸熱を表した。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統からのデンプンの糊化ピーク温度は非形質転換対照デンプンについてのピーク温度と比較しておよそ７〜１０℃の増加を示し、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統からのデンプンと比較しておよそ３〜７℃増加した。
表１２．示差走査熱量計（ＤＳＣ）で測定したトランスジェニック小麦デンプンの熱的性質
Figure 0005562295
これらの系統では、非形質転換対照およびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統と比較して、およそ１６〜１９℃の糊化（最初のピーク）終了温度の著しい増加が観察された。糊化の開始温度は、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統で対照またはｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統より早く現れた。Ｎｇ他（１９９７年）は、アミロース増量（ａｅ）トウモロコシデンプンの糊化開始温度が通常のトウモロコシデンプンのそれと類似していると報告したが、ａｅデンプンでは正常のデンプンと比較してピークの糊化温度が顕著に増加していた。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統からのデンプンの糊化エンタルピーは、対照およびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ系統のそれより顕著に低かった。これは、糊化ピーク面積の顕著な低下（これはｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統におけるアミロペクチン量の低減を表している）を反映しているようである。アミロース−脂質分離ピークでは、トランスジェニック系統のいずれでも著しい変化は観察されなかった。したがって、我々は、この新しい一揃いの特性を有するデンプンを得た。
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Claims (22)

  1. 小麦植物から得られる穀粒であって、（ｉ）デンプン、（ｉｉ）野生型穀粒と比べて低レベルの、胚乳のＳＢＥＩＩａタンパク質、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方、ならびに（ｉｉｉ）２種のＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異を含み、
    前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも３０％である穀粒。
  2. 前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも４０％または少なくとも５０％である請求項１に記載の穀粒。
  3. 平均重量が少なくとも３６ｍｇである請求項１に記載の穀粒。
  4. 穀粒から得たデンプン粒のうちの少なくとも５０％が偏光下で観察すると非複屈折性に見える、請求項１に記載の穀粒。
  5. 前記デンプンの示差走査熱量計で測定した糊化温度が、野生型穀粒から得たデンプンと比べて上昇している請求項１に記載の穀粒。
  6. 殻のない状態での前記穀粒のデンプン含有量は、少なくとも２５％（ｗ／ｗ）または少なくとも３５％（ｗ／ｗ）である請求項１に記載の穀粒。
  7. 全粒、製粉した穀粒、粉砕した穀粒、精白した穀粒、圧扁した穀粒、粗挽きした穀粒、パーボイルドした穀粒、または挽き割りにした穀粒である、請求項１に記載の穀粒。
  8. 野生型小麦穀粒と比べて低レベルの胚乳のＳＢＥＩＩｂタンパク質、ＳＢＥＩＩｂ酵素活性、またはその双方をさらに含む、請求項１に記載の穀粒。
  9. 野生型小麦穀粒と比べて低レベルのＳＢＥＩタンパク質、ＳＢＥＩ酵素活性、またはその双方をさらに含む、請求項１に記載の穀粒。
  10. Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｓｓｐ．ａｅｓｔｉｖｕｍである小麦植物から得られる請求項１に記載の穀粒。
  11. 前記ＳＢＥＩＩａ遺伝子が染色体２Ａの長腕から欠けている変異を含むか、あるいは染色体２Ａの長腕上のＳＢＥＩＩａ遺伝子が、ヌル変異を含む、請求項１に記載の穀粒。
  12. 前記ヌル変異がＢゲノムおよびＤゲノム上にある請求項１または請求項１０に記載の穀粒。
  13. 前記ヌル変異が、ホモ接合性である請求項１に記載の穀粒。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の穀粒を結実することができる小麦植物。
  15. 小麦デンプンと、野生型小麦デンプン粒と比べて低レベルのＳＢＥＩＩａタンパクとを含み、小麦デンプン中のアミロース比率が少なくとも３０％である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の穀粒から得られる小麦デンプン粒。
  16. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の穀粒、請求項１から１３のいずれか一項に記載の穀粒から得た小麦粉、全粒小麦粉、セモリナ粉、またはデンプン粒、またはこれらの任意の組合せを含む製品。
  17. ｉ）１種のＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異を含む親小麦植物または小麦種子の突然変異誘発のステップと、
    ｉｉ）２種のＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異を有するとともに穀粒を結実することのできる小麦植物の子孫の植物または親小麦植物の種子または種子を同定するステップとを含み、
    前記穀粒は、（ｉ）デンプン、（ｉｉ）野生型穀粒と比べて低レベルの、胚乳のＳＢＥＩＩａタンパク質、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方、ならびに（ｉｉｉ）２種のＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異を含み、前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも３０％である、請求項１４に記載の小麦植物を作製する方法。
  18. ｉ）１種の第一のＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異を含む第一の小麦植物を同定するステップと、
    ｉｉ）前記第一の小麦植物と１種の第二のＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異を有する第二の小麦植物とを交配するステップと、
    ｉｉｉ）ヌル変異と結実した穀粒との両方を含む子孫の植物または種を同定するステップとを含み、
    前記穀粒は、（ｉ）デンプン、（ｉｉ）野生型穀粒と比べて低レベルの、胚乳のＳＢＥＩＩａタンパク質、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方、ならびに（ｉｉｉ）２種のＳＢＥＩＩａ遺伝子のヌル変異を含み、前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも３０％である、請求項１４に記載の小麦植物を作製する方法。
  19. 前記小麦植物がＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｓｓｐ．ａｅｓｔｉｖｕｍである請求項１７または請求項１８に記載の小麦植物を作製する方法。
  20. （ｉ）小麦植物を栽培するステップと、（ｉｉ）前記小麦植物から穀粒を収穫するステップとを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の穀粒を製造する方法。
  21. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の穀粒を得るステップと、前記穀粒からデンプンを抽出するステップとを含む、改変された小麦デンプンを製造する方法。
  22. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の穀粒を得るステップと、前記穀粒を製粉するステップとを含む、製粉した製品を製造する方法。
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