JP5458249B2 - 分枝酵素活性を変化させたオオムギ、並びにアミロース含有量の増加した澱粉および澱粉含有製品 - Google Patents
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Description
当業者は、本明細書に記載された本発明が、具体的に記載された以外の変更および修正に供されるものであることを認識されよう。本明細書に記載された本発明が、このような変更および修正を包含することを理解すべきである。本発明にはまた、本明細書に言及され表示されたこのようなすべての工程、特徴、組成物および化合物は、個々にまたは組み合わせとして含まれ、またこのような工程または特徴の2つ以上のいかなる組合せも含まれ、すべての組合せも含まれる。
第1の態様で、本発明は、オオムギ植物から得られる穀物粒であって、胚乳中のSBEIIa酵素活性のレベルが低下しているとともに、前記穀物粒の澱粉が少なくとも40%(w/w)の相対アミロース含有量を有するものにあるということができる。相対アミロース含有量は、好ましくは50%または75%より高く、穀物粒は萎縮(shrunken)していないことが好ましい。
本発明は、オオムギの胚乳でのSBEIIa活性が低下することにより、澱粉産生に改変がもたらされ、特に、オオムギ穀物粒中に高いアミロースの蓄積がもたらされるという知見に基づく。この意外な結果は、トウモロコシおよび米における、SBEIIaの変異によりアミロペクチンのプロファイルが変わることはなかった(Blauthら、2001、Nakamura、2000)、という知見とは対照的である。1つまたは複数のその他の澱粉生合成酵素活性に変更があることが好ましく、SBEIIaのみならずSBEIIbにも減少があることがより好ましい。また、このオオムギ植物の穀物粒が萎縮していないことが好ましい。
1つの態様において、本発明は、オオムギの胚乳中で澱粉分枝酵素IIa(SBEIIa)の活性を減少させる方法を提供するものである。活性の減少は、非改変(対照)のオオムギの胚乳中の活性レベルと比較して、少なくとも40%またはおそらく少なくとも50%であってもよく、少なくとも75%であることがより好ましく、少なくとも90%または95%であることがさらに好ましい。この方法は、オオムギのSBEIIa遺伝子の発現に変更をもたらすことを含むか、またはオオムギでのSBEIIa遺伝子の変異(それによって胚乳中のSBEIIa活性が低下する)を含む。
また別の態様において、本発明は、穀物粒の成長する少なくともいくつかの段階で、胚乳中のSBEIIa活性のレベルが低下したオオムギ(Hordeum vulgare)植物を提供するもので、このオオムギ植物は、高い相対アミロース含有量を有する穀物粒を産することができる。好ましくは、野生型と比べて、胚乳中のSBEIIaのレベルが、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも90%または95%減らされる。用語「野生型」は、遺伝学の分野における通常の意味を有し、本明細書で示したような改変がなされていない栽培品種または遺伝型が含まれる。
本発明はまた、野生型と比べて改変された澱粉を含むオオムギ穀物粒を提供するものである。この改変された澱粉は、オオムギ穀物粒の胚乳の成長時に少なくとも部分的にSBEIIa活性が低下した結果である。この穀物粒は、野生型(約25%のアミロースと75%のアミロペクチンを含む)と比べて、全澱粉に対するパーセンテージとしてのアミロースレベルが上昇し、アミロペクチン含有量が減少している。胚乳の成長時に、SBEIIaとSBEIIbの両活性が低下することが好ましい。SBEIの活性も減少することがさらに好ましい。アミロースレベルは、当技術分野に公知の方法で測定したところ、全澱粉の少なくとも50%が好ましく、少なくとも60%がより好ましく、少なくとも65%、70%、75%、80%または90%がさらにより好ましい。アミロースレベルの上昇は、光学顕微鏡下またはその他の方法で観察した際の、異常な澱粉粒の形態または粒子の複屈折の消失によっても立証され得る。好ましくは、アミロースのレベルはヨウ素滴定法で測定され、また分光光度法(たとえば、MorrisonおよびLaignelet、1983)あるいは高速液体クロマトグラフ(HPLCたとえば、BateyおよびCurtin、1996)で測定されてもよい。
別の態様において、本発明は、上記に記載したような、胚乳のSBEIIa活性レベルが低下したオオムギ植物の穀物粒から得られる澱粉であって、アミロース含有量が高く、アミロペクチン含有量が低下した澱粉を提供するものである。SBEIIaとSBEIIb活性の両方が低下していることが好ましく、SBEI活性も低下していることがより好ましい。別の態様において、本発明は、少なくとも50%のアミロース、好ましくは少なくとも60%のアミロース、さらにより好ましくは、少なくとも65%、70%、75%、80%または90%のアミロースを含むオオムギ植物の穀物粒から得られる澱粉を提供するものである。精製された澱粉が、タンパク質、油および繊維からの澱粉の分離を含む製粉工程、例えば湿潤粉砕工程で得られてもよい。製粉工程の初期産物は、澱粉顆粒の混合物または組成物であり、したがって本発明は、このような顆粒も包含する。この顆粒の澱粉は、少なくとも50%、好ましくは70%、75%または80%のアミロースを含む。
SBEIIa活性、場合によっては他の澱粉生合成または変更遺伝子は、遺伝的変異を植物中に、トランスジーンをオオムギ植物中に導入するというような手段で、導入することで変えることが好ましい。「遺伝的変異」とは、この状況では、SBEIIaの活性に影響を与えるゲノム中のどんな変更をも意味し、この変異には、トランスジーンの導入のみならず、点変異、置換、逆位、転位、好ましくは、欠失、などの変異が含まれる。本明細書で言及される「トランスジーン」とは、生物工学の技術分野での通常の意味を有し、組み換えDNAまたはRNA技術によって製造または変更された遺伝子配列、目的の生物または細胞中に導入された遺伝子配列が含まれる。トランスジーンはその生物または細胞由来の遺伝子配列、たとえば、アンチセンス配列を含んでいてもよい。トランスジーンは典型的には、その生物または細胞に由来しない外因性核酸を含む。「トランスジェニック」とは、トランスジーンを含む生物または細胞を指す。「非トランスジェニック」とは、ゲノム中にトランスジーンが存在しないことを指す。トランスジーンは、遺伝的継承が安定的になされるために、生物または細胞のゲノム中に一体化していることが好ましい。
植物において遺伝子活性を変更、特に特異的に減少させるための公知の遺伝子工学またはトランスジーン手法は、当技術分野では公知である。遺伝的変異をオオムギ植物に導入するこれらの方法は、目的遺伝子のRNAと相補的であってRNAとハイブリダイゼーションできる適切なアンチセンス分子の発現を含む。アンチセンス分子は、目的遺伝子のmRNAの翻訳、プロセシングまたは安定化を阻害し、これによってmRNAの発現を不活性化すると思われる。アンチセンス配列を用いる方法は、当技術分野では公知で、これらの例は米国特許第5190131号、欧州特許明細書第0467349号−A1、欧州特許明細書第0223399号−A1、および欧州特許明細書第0240208号(これらは本明細書において参照されている)に見つけることができる。植物でのアンチセンス法の使用は、Bourque(1995)およびSenior(1998)によって紹介されている。Bourqueは、遺伝子不活性化の方法として、どのようにしてアンチセンス配列が植物系に利用されてきたか、その例を数多く挙げている。彼女はまた、部分的阻害でも系内に測定可能な変化を予想以上にもたらすので、どんな酵素活性も100%阻害する必要はないようだと述べている。Senior(1998)は、アンチセンス方法は、遺伝子発現を操作するために今のところ非常によく確立された技法であると述べている。
使用され得る別の分子生物学的手法には、共抑制がある。共抑制のメカニズムはよく知られていないが、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)が関与しているものと思われ、この点で多くのアンチセンス抑圧の事例と非常に類似している。これは、遺伝子の余分のコピーまたはその断片を植物に、その発現用プロモーターに対してセンス方向で導入することを含む。センス断片のサイズ、目的遺伝子領域との対応性、および目的遺伝子との相同性の程度は、上記に記載されたアンチセンス配列についてと同じである。遺伝子配列の追加コピーが目的の植物遺伝子の発現を阻害する例もある。共抑制の手法を実行する方法については、特許明細書国際公開第97/20936号および欧州特許明細書第0465572号を参照のこと。
遺伝的変異をオオムギ植物に導入するために採用され得るまた別の方法は、二重または二本鎖RNAが介在する遺伝子サイレンシングである。この方法にもPTGSが関与する。この方法では、少なくとも部分的に二本鎖のRNA産物の合成を指示するDNAが導入される。したがってこのDNAは、センスおよびアンチセンスの配列を含み、RNAに転写されると、ハイブリダイズして二本鎖RNA領域を形成できる。好ましい実施態様では、センスおよびアンチセンスの配列は、RNAに転写される際にスプライシングで除去されるイントロンを含むスペーサ領域によって分離される。こうした配置が、より有効性の高い遺伝子サイレンシングをもたらすことがわかってきた。二本鎖領域は、1つまたは2つのDNA領域から転写された1つまたは2つのRNA分子を含んでいてもよい。二本鎖分子の存在が引き金となって内在性植物系の反応を引き起こされ、二本鎖RNAおよび目的植物遺伝子由来の相同なRNA転写物の両方を破壊して、有効に目的遺伝子の活性を減少または排除する。この技法と実行方法については、オーストラリア特許明細書第99/292514号−Aおよび特許明細書国際公開第99/53050号を参照のこと。ハイブリダイズするセンスおよびアンチセンス配列の長さは、各々少なくとも連続する19ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも、100、200、500または1000ヌクレオチドである。遺伝子転写物全体に対応する完全長配列を使用してもよい。この長さは、最も好ましくは、100から2000ヌクレオチドである。センスおよびアンチセンス配列の目的転写物に対する相同の程度は、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95〜100%である。このRNA分子は、もちろん、分子を安定化させるために働く無関係の配列を含んでいてもよい。
リボザイムを使用して、オオムギにおける所望の遺伝子発現の不活性化に関与する遺伝的変異を導入してもよい。リボザイムは、他のRNA分子を1つ、または多くの場合2つのハイブリダイズ配列によって規定される特異的部位で切断できる酵素的または触媒的作用を有するRNA分子である。RNAの切断によって、目的遺伝子の発現が不活性化される。リボザイムは、アンチセンス分子としても作用し、遺伝子の不活性化に貢献し得る。リボザイムは、ハイブリダイズする配列の間に、1つまたは複数の、好ましくはハンマーヘッドまたはヘアピンタイプの触媒ドメインを含む。RNAseP、グループIまたはIIイントロン、および肝炎デルタウイルスタイプを含む他のリボザイムのモチーフを使用してもよい。欧州特許明細書第0321201号および米国特許第6,221,661号を参照のこと。トランスジェニック植物での遺伝子不活性化に対するリボザイムの使用は、たとえば、Wegenerら(1994)によって実証されている。
本発明はまた、遺伝子阻害分子をコードするRNAおよび好ましくはDNAを含む、単離した核酸分子を提供するものである。この核酸分子は、オオムギSBEIIa遺伝子配列をターゲットとするアンチセンス、センス(共抑制)、二本鎖RNAまたはリボザイム分子をコードし、オオムギ穀物粒の胚乳における発現を不活性化するのに効果があることが好ましい。本発明はまた、単離した核酸分子を含む遺伝子構築物を提供する。この構築物には、プロモーター、エンハンサーおよび転写ターミネータまたはポリアデニル化配列などの1つまたは複数の調節要素を含む。このような要素は当技術分野に公知である。この遺伝子構築物は、植物、特にオオムギなどの単子葉植物においてトランスジーンの発現を助けるイントロン配列を含んでいてもよい。用語「イントロン」は、通常の意味で使用され、これは、転写されるが、タンパク質をコードしておらず、翻訳の前にRNAからスプライシングで除去される遺伝子セグメントを意味する。イントロンは、もしトランスジーンが翻訳産物をコードしているなら5'−UTRまたはコード領域に、また、コードしていないなら転写領域のどこに取り入れられてもよい。
本発明のトランスジーンまたは他の遺伝子構築物は、オオムギの胚乳で、組織的または構造的な発現をもたらす転写開始領域(プロモーター)を含んでいてもよい。このプロモーターは、組織特異的であって、胚乳で選択的または排他的発現をもたらす。プロモーターは、胚乳特異的プロモーター(高分子量グルテニンプロモーター、コムギSSIプロモーター、コムギSBEIIプロモーター、コムギGBSSプロモーターなど)と胚乳非特異的プロモーター(ユビキチンプロモーターまたはCaMV35Sあるいはエンハンスト35Sプロモーターなど)とのいずれかから選択され得る。プロモーターは、温度、光またはストレスなどの要因によって調整される。普通、プロモーターは、発現すべき遺伝子配列の5'に提供される。構築物には、nos3'ポリアデニル化領域、ocs3'ポリアデニル化領域、または転写ターミネータなどの、転写を高める他の要素を含んでいてもよい。例示されたDNAの領域は、適切な選択可能なマーカー遺伝子配列および他の要素を含むベクター中か、これらの配列を含むベクターと共形質転換されるベクター中に取り込まれることになる。
外因性核酸の導入によって植物に遺伝的変異を導入するため、またプロトプラストまたは未成熟の植物胚から植物の再生をするために、オオムギなどの単子葉植物を形質転換するための方法は、当技術分野に公知である。たとえば、WanおよびLemaux(1994)、Tingayら(1997)、Nehraによるカナダ特許出願第2092588号、カナダの国立研究委員会によるオーストラリア特許出願第61781/94号、日本タバコ産業によるオーストラリア特許第667939号、モンサント社による国際特許出願第PCT/US97/10621号、米国特許第5589617号参照のこと、および他の方法は特許明細書国際公開第99/14314号に記載されている。所望のヌクレオチド配列または遺伝子構築物および選択可能なマーカーを保持するベクターが、組織培養された植物または外植片あるいはプロトプラストなどの適切な植物系の再生可能なオオムギ細胞中に導入されてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、抗菌性または殺菌剤耐性をオオムギ細胞に付与し、あるいは、マンノースなどの基質の利用を可能にし得る。選択可能なマーカーによって、好ましくはハイグロマイシン耐性がオオムギ細胞に付与される。再生可能なオオムギ細胞は、未成熟胚、成熟胚の胚盤、これらに由来するカルスまたは分裂細胞に由来することが好ましい。
オオムギ胚乳中のSBEIIa酵素の活性または他の酵素の活性低下をもたらす遺伝的変異の導入は、関連する遺伝子内または遺伝子の調節配列内を適切に変異させて達成してもよい。遺伝子が阻害される程度は、作られる澱粉の特性を決定する程度とする。変異は欠落(truncation)またはヌル(null)変異であってもよく、これらは、澱粉の性質に重篤な影響を与えることが知られている。しかし、アミロペクチン構造の変更は、漏出変異の結果得られることもあり、これによってオオムギの澱粉または穀物粒に目的の特性を与えるアミロペクチンの合成酵素活性が著しく減少する。他の染色体を再配置することもまた効果的であり、これらには、欠失、逆位、重複または点変異が含まれてもよい。
別の態様において、本発明は、食品生産に有用なオオムギを提供するものである。そのオオムギの穀物粒は、成長時に穀物粒の胚乳中のSBEIIa活性のレベルが低下したオオムギ植物から得られ、この穀物粒中の澱粉は比較的高いアミロース含有量と、低いアミロペクチン含有量を有する。本発明のオオムギ植物は、食品生産、特に市販の食品生産に有用な穀物粒を有するものであることが好ましい。このような食品生産には、市販の食品生産の成分となるような穀粉または他の産物を作ることが含まれよう。
オオムギ中のβ−グルカンレベルは多様で、オオムギの、重量で約4%〜約18%の範囲で広範にわたっていることが知られるが、より一般的には4%〜約8%(たとえば、Izydorcykら、2000)である。改良オオムギ品種が開発されており、例えば、β−グルカンを重量で約15%〜約18%有するがモチ性表現型を有するものがある。
糊化は、粒子の膨潤、結晶の融解、複屈折の喪失、粘性の発生、および澱粉の溶解化などの、同時に起こるとともにとともに不可逆的な特性の変化を伴う澱粉顆粒内の分子秩序の崩壊(破壊)である。トウモロコシのae(アミロース増量)変異体由来の高アミロース澱粉は、通常のトウモロコシよりも高い糊化温度を示した(Fuwaら1999、Kruegerら、1987)。一方、澱粉合成酵素IIa活性を欠くオオムギsex6変異体由来の澱粉は、より低い糊化温度を有していて、糊化のピークのエンタルピーは対照植物のエンタルピーと比較したところ、低かった(Morellら、2003)。
澱粉はまた、野生型澱粉と比較した、熱した過剰の水の中での膨潤率で特徴付けられる。膨潤体積は典型的には、澱粉または穀粉を過剰の水と混合し、加熱により一般的に90℃より高い温度まで上昇させて測定する。次にサンプルを遠心分離で集め、沈降物質の質量をサンプルの乾燥量で割り算することで膨潤体積を表す。低膨潤性は、食品調製物、特に含水食品調製物の澱粉含有量を増やしたい場合に有用である。
本発明の選択形態のオオムギの澱粉構造はまた、オオムギから単離された通常の澱粉と比較すると、結晶度が減少している点で異なる。澱粉の結晶度の低下は官能特性の向上に関係し、滑らかな口ざわりに貢献するとも思われる。したがって、1つまたは複数のアミロペクチン合成酵素の活性レベルの低下により、澱粉の結晶性の低下がさらにもたらされる。結晶性は一般的にX線結晶学によって調べる。
アミロペクチン構造の変化は、澱粉の鎖長の分布または重合度で測定する。鎖長分布は、イソアミラーゼによる分枝を行った後、蛍光ラベル糖鎖電気泳動(Fluorophore−assisted carbohydrate electrophoresis:FACE)を使用して測定する。本発明の澱粉のアミロペクチン鎖長分布は5〜60の範囲にあり、これは分枝後の野生型植物由来の澱粉の分布よりも大きい。長い鎖長を有する澱粉はまた、分枝頻度が対応したレベルで低下することになる。したがって、この澱粉はまた、アミロペクチン中にまだ存在している長いアミロペクチン鎖長の分布を有している。
澱粉はヒト食餌中の炭水化物の主要供給源であり、本発明の穀物粒およびその穀物粒より得られる産物は食品を調製するために使用できる。食品はヒトまたは動物によって、たとえば、家畜飼料またはペットフードの形で消費される。改変オオムギ植物由来の穀物粒は、食品加工手段に容易に使用できるので、本発明には、粉にされ、すりつぶされ、粗挽きされ、精白され、または延ばされ(rolled)た穀物粒、あるいは上記に言及したオオムギ植物の加工された穀物粒または全粒穀物粒(whole grain)から得られる産物(穀粉など)が含まれる。これらの産物は、多種多様の食品、たとえば、パン、ケーキ、ビスケットなどの粉状製品、または増量材、結合材などの食品添加物に、あるいは、麦芽その他のオオムギ飲料、ヌードルおよびインスタントスープにするために使用し得る。本発明の穀物粒由来の穀物粒または産物は、特に朝食シリアルに望ましい。本発明の高アミロース澱粉は、お菓子業界に有用であり、あるいは成型および硬化時間を減少させる高強度のゲルを形成するために使用できる。これらはまた、たとえば、よくたっぷりの油で揚げたポテトまたは他の食品で油の吸着を減らす被覆剤として使用してもよい。
本明細書において食物繊維は、炭水化物、および健康なヒトの小腸で吸収されないで大腸に入る炭水化物の消化による生産物である。これにはレジスタントスターチ、β−グルカンおよび他の可溶性および不溶性の炭水化物ポリマーが含まれる。大腸でその腸在菌によって少なくとも部分的に発酵性となった炭水化物の部分を含むことを意図する。
レジスタントスターチは、健康なヒトの小腸に吸収されないで大腸に入る澱粉と澱粉の消化産物の合わさったものであると定義される。したがって、レジスタントスターチには小腸で消化吸収された産物は入らない。レジスタントスターチは物理的に接近不能な澱粉(RS1型)、難消化性顆粒(RS2)、老化澱粉(RS3)、および化学修飾澱粉(RS4)が含まれる。
血糖指数(GI)は、血糖濃度の変移に与えるテスト食品の影響と白パンまたはグルコースの影響とを比較するものである。血糖指数は、食事後の血清グルコース濃度に与える食品の予想される影響の目安であり、血中グルコースのホメオスタシスに対するインスリン需要の目安である。高アミロースおよび場合によっては高β−グルカン含有の結果として本発明が提供する1つの重要な産物は、低い糖指数を有する低カロリー製品である。低いカロリー製品は、オオムギ穀物粒を製粉して産生される穀粉の含有物がベースになると思われる。しかし、当初は、穀物粒を精白して、おそらく重量で10%または20%の穀物粒を除去し、これによってアリューロン層を取り除き、もっと削減される場合には胚芽までも取り除くことが望まれていた。この精白工程の作用は、脂肪含有量を減らすことであり、したがって食品のカロリー値は低下する。このような食品は、低カロリー食品を提供するのみならず、満腹効果を有し、腸の健康を増進し、食事後の血清グルコースおよび脂肪濃度を減らす効果を有する。このように精白された製品を使用すると、アリューロン層および胚芽によって提供される栄養学的利点が減る結果となる。精白製品から生産される穀粉は、見た目が改善されるようだ。これは、このように作製された産物がより白くなる傾向があるからである。
本発明は、高レベルのアミロースを有し、アミロペクチンレベルの減少した改変または改良された澱粉を提供するものであって、その特性は、多種多様のどんな工業的要求をも満足させる。澱粉は、紙、繊維、波形成形(corrugating)、接着剤業界を含めた非食品業界に広く使用されている(Young、1984)。非修飾澱粉の物理的特性により、その有用性はいくつかの用途に限られており、高価なまたは他の欠点を生じるおそれのある化学的改良をしばしば余儀なくされていた。本発明は、他の物理的特性と併せて、特にアミロペクチン含有量を減らすことによって、収穫後の改変の必要性が少なくてよい澱粉を提供するものである。たとえば、澱粉および本発明穀物粒から作製された産物の糊化(pasting)温度、せん断ストレスに対する耐性、膜強度、および/または耐水性は改変し得る。澱粉はまた、生物分解可能なゆるい充填梱包材料を調製するために使用してもよく、この充填梱包材料はポリスチレンの代替として使用することが可能である。
カルス誘導培地
Dicamba(2.5mg/l)を含むBCI−DM培地を使用してオオムギ胚からカルス誘導を行った。培地1リットルの組成は:
MS salt Macro(10x stock): 100ml
MS micro (100x stock): 10ml
鉄(200x stock): 5ml
EDTA(200x stock): 5ml
マルトース: 15.0g
チアミン−HCl(1mg/ml): 1ml
Myo−イノシトール: 250mg
カゼイン加水分解物: 1g
Dicamba(1mg/ml): 2.5ml
プロリン: 345mg
pHを5.8に調整し、3.5g/lのphytagelを添加した。培地をオートクレーブにかけた後、150mg/lのチメンチン(Timentin)および50mg/lのハイグロマイシンを添加した。
オオムギのカルスをBAP(1mg/l)含有FHG培地で再生する。
FHG−I Macro(10x stock): 100ml
FHG−II Micro (100x stock): 10ml
チアミン−HCl(1mg/ml): 1ml
鉄(200x stock): 5ml
EDTA(200x stock): 5ml
BAP(1mg/ml): 1ml
イノシトール: 100mg
グルタミン: 730mg
マルトース: 62g
pHを5.8に調整し、3.5g/lのphytagelを添加した。培地をオートクレーブにかけた後、150mg/lのチメンチン(Timentin)および20mg/lのハイグロマイシンを添加した。
澱粉をオオムギ穀物粒からSchulmanら(1991)の方法を使用して単離した。澱粉含有量をメガザイム(Megazyme:Bray,Co Wicklow,アイルランド共和国)によって供給された全澱粉分析器キットを使用して測定した。次にこの澱粉含有量を対照植物と比較した。全穀物粒重量から澱粉重量を差し引くと穀物粒中の全非澱粉分の全量が与えられ、全重量の減少が澱粉含有量の減少に起因しているかどうかが決定される。
DSCは、アミロースおよびアミロペクチンの比率を変えることで澱粉中に生じた糊化温度に対する変化を測定するものである。糊化はPyris 1示差走査熱分析器(パーキンエルマー、Norwalk CT,USA)により測定した。澱粉と水を、水2部:澱粉1部の比率で混合し、この混合物(実測重量40〜50mg)をステンレス製天秤皿に置きシールした。サンプルを10℃、1分、20℃〜140℃で空のステンレス製天秤皿を基準として使用してスキャンした。糊化温度およびエンタルピーをPyrisソフトウエアを使用して決定した。
粘度をラピッドビスコアナライザー(RVA:Newport Scientific Pty Ltd,Warriewood,Sydney)でBateyら(1997)が報告した条件を使用して、全粒粉について測定した。α−アミラーゼを阻害するために、硝酸銀をすべての分析に12mM濃度で使用した。測定されたパラメータは、最高粘度(最大熱糊化粘度)、保持強度、最終粘度および糊化温度であった。
粉の膨潤体積をKonik−Roseら(2001)の方法に従って決定した。水の取り込みの増大を、規定温度で水にサンプルを混合し、その後糊化した物質を採集する前及び後のサンプルの重量を測定することにより測った。
オオムギcDNAおよびゲノムライブラリーの構築
オオムギcDNAおよびゲノムライブラリーを、ファージベクター中で標準的な方法(Sambrookら、1989)により作製した。cDNAライブラリーは、ZipLoxベクター(Life Technology)中に、試薬と共に提供されたプロトコールにしたがって作製した。ライブラリーの力価は、大腸菌の菌株Y1090(ZL)によってテストし、2×106pfuであった。E.Lagudah(CSIRO)から入手したオオムギのゲノムライブラリーは、Morex品種由来のDNAから作製した。このDNAをMboIで消化し、EcoRI/BamHIで消化したEMBL3コスベクターに連結した。クローンした断片をSalI消化で分泌させることができた。
ライブラリースクリーニングは、25%ホルムアミド、5×SSC、0.1%SDS、10×デンハルト溶液、100μg/mlのサケ精子DNA、42℃、16時間の条件下でのハイブリダイゼーションで行い、その後2×SSC、0.1%SDS、65℃で1時間洗浄(中程度の厳密さ)を3回行った。SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子を含むクローンまたはその実質部分を単離してシークエンスした。DNA配列を表1に掲載された登録番号の配列と比較して、目的の両遺伝子がオオムギから単離されたことを確認した。また、SBEIIaおよびSBEIIbのcDNA配列も、特異的プライマーで逆転写−PCR(RT−PCR)を使用して得てもよい。この技法は当技術分野で公知である。オオムギSBEIIaおよびSBEIIbのcDNA配列は図1および2に示し、コムギSBEIIaおよびSBEIIbゲノム配列は図3および4に示す。
オオムギSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子のどちらかの発現を減らすために、重複RNA(dsRNA)構築物を作製した。このような構築物には、発現されたRNAが塩基対を作ることができる相補配列を含んでいて重複または二本鎖RNAを形成するように、SBEIIaまたはSBEIIb遺伝子の部分に対応する目的の核酸配列が、プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス方向の両方にあるようにした。センスとアンチセンス配列との間のスペーサ領域にはイントロン配列が含まれ、これが形質転換された植物でRNAの部分として転写されると、スプライシングで除去されて堅く締まったヘアピン重複構造を形成することになる。イントロンが含まれていることによって、重複RNA構築物によって与えられる遺伝子のサイレンシング効果が高まることがわかってきた(Smithら、2000)。目的の核酸は、高分子量のグルテン(HMWG)プロモーター配列(DX5サブユニット遺伝子のプロモーター、登録番号第X12928号、Andersonら、1989)およびアグロバクテリア(nos3')のノパライン合成酵素遺伝子由来のターミネータ配列と連結した。
アグロバクテリウム ツムファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)により仲介された、または遺伝子銃によるオオムギを形質転換する方法は(Tingayら、1997;Wanら、1994)に記載されており、トランスジェニック植物を生じるDNA構築物を形質転換するために使用することができる。本実施例では、上記に記載したように作製された二元べクター中の遺伝子構築物を、高感染性のアグロバクテリア株に3親結合(tri−parental conjugation)によって導入し、これを使用して、阻害遺伝子(ds−SBEIIaまたはds−SBEIIb)を含むT−DNAおよび選択可能なマーカー遺伝子(ヒグロマイシン耐性をコードし、CaMV35Sプロモーターから発現される)を、未成熟のオオムギ胚の胚盤の再生可能な細胞中に、次のように導入した。
オオムギ植物またはその子孫の種子または植物でのトランスジーンの有無を、PCR法またはサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって決定または確認した。DNAを形質転換したと推定された植物の葉のサンプルから標準法によって調製した。
ds−SBEIIaトランスジーンの存在をスクリーニングするために使用された順方向および逆方向のプライマーは、それぞれBX17 3'(5'−CAA CCA TGT CCT GAA CCT TCA CC−3'):配列番号5およびAR2akpnR(5'−GGT ACC CCA TCT CCT GGT TTT GGG ACA AC−3'):配列番号6であった。このプライマー対は、ds−SBEIIaトランスジーンを含む植物由来の、トランスジーンのHMWGプロモーター配列内のある位置から図3のヌクレオチド位置2219までに対応する569bpの産物を増幅した。ds−SBEIIbトランスジーンの存在をスクリーニングするために使用されたプライマーは、それぞれBX17 3'(上記記載のとおり)およびAR2bkpnR(5'−GGT ACC GTC CAT TTC CCG GTG GTG GCA G−3'):配列番号7であった。このプライマー対は、ds−SBEIIbトランスジーンを含む系由来の、HMWGプロモーター内のある位置から図4のヌクレオチド位置1768までに対応する571bpの産物を増幅した。PCR増幅は、2.5単位のHotstar Taq、1.5mMのMgCl2、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTPs)を各0.125mMずつ、順方向および逆方向のプライマー各1μM、および100ngのDNAを含む酵素を供給された1×緩衝液を含む20μlの反応液中で行った。PCRのプログラムは、95℃で5分の初期変性ステップ、続いて95℃で30秒、および59℃で1分、および72℃で2分の36サイクル、最後に72℃で5分であった。
PCRの結果を確認するため、サザンブロットハイブリダイゼーション分析を、ds−SBEIIaおよびds−SBEIIbトランスジェニック植物およびその子孫のDNAについて行った。標準法でこの植物から調製した、EcoRIで消化したDNAを1%アガロースゲル上で電気泳動し、ハイボンド(Hybond)N+ナイロン膜(アマーシャム)上にブロットした。放射線活性標識したプローブをSBEIIa(位置2220〜2731、図3参照)およびSBEIIb(位置2019〜2391、図4参照)遺伝子のイントロン3領域から作製した。これらのセグメントはそれぞれds−SBEIIaおよびds−SBEIIb構築物(実施例3)の一部であり、メガプライム(Megaprime)DNA標識システム(アマーシャムファーマシアバイオテク、イギリス)を使用して放射線活性標識し、ハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションは25%(v/v)のホルムアミド、5×SSC、0.1%SDS、10×デンハルト溶液、100μg/mlサケ精子DNA中で42℃、16時間行い、2×SSC、0.1%SDS中で65℃で1時間を3回行った。膜のオートラジオグラフィにより、植物に対応するレーン中に構築物に対して陽性である陽性ハイブリダイゼーションバンドが明示された(図7)。内在性オオムギSBEIIaおよびSBEIIb遺伝子断片は、使用されたコムギイントロン3プローブの配列の相違のため、ハイブリダイゼーションで検出されなかった。
形質転換植物におけるオオムギSBEIIaおよびSBEIIb遺伝子発現へのds−SBEIIaおよびds−SBEIIbトランスジーンの影響を調べるために、発育中の穀物粒の胚乳組織中での特異的なタンパク質発現を、非変性PAGEおよびウェスタンブロット分析により検出した。T1種子(T0植物からの種子)は、トランスジーンを隔離すると期待されるので、開花以降20日目にそれぞれのT0植物から個別に発育中の10個のT1穀物粒のそれぞれからの胚を、SBEIIaおよびSBEIIbタンパク質発現について分析した。T1植物を保存するため、胚を発育中の穀物粒から取り出し、培養してT1植物を再生した。すべての成熟組織(0.2g)から切断された胚乳を、5mMのEDTA、20%グリセロール、5mMのDTT、および1mMのPefablocを含む50mMのKPi緩衝液(42mMのK2HPO4および8mMのKH2PO4)(pH7.5)の600μlでホモジネートした。すりつぶされたこのサンプルを、13,000gで10分遠心分離し、上澄み液をアリコットして、使用するまで−80℃で凍結した。タンパク質のレベルをCoomassie試薬によりBSAを標準にして測定した。各胚乳から抽出した全可溶性タンパク質(20μgに相当)をレーンに充填し、0.34MトリスHCl(pH8.8)、アクリルアミド(8.0%)、過硫酸アンモニウム(0.06%)およびTEMAD(0.1%)を含む8%の非変性ポリアクリルアミドゲル中を電気泳動させた。電気泳動に続いて、タンパク質をニトロセルロース膜に、Morellら(1997)に従って移し、SBEIIaまたはSBEIIb特異的抗体と免疫反応させた。SBEIIaの検出用に使用した抗体は、合成ペプチドAASPGKVLVPDESDDLGC:配列番号8(SBEIIaのN末端由来の配列)に対して生じたラビット由来の3KLHであり、1:5000に希釈して使用した。SBEIIbの検出用に使用した抗体は、合成ペプチドAGGPSGEVMIGC:配列番号9(SBEIIbのN末端に由来する推定配列)に対して生じたR6であり、使用前に1:6000に希釈した。使用した2次抗体はGAR−HRP結合体(1:3000希釈)で、免疫反応性バンドがアマーシャムのECL検出システムを使用して示された。
穀物粒の成分および含有量、特に澱粉については、実施例1に記載したような標準技法を使用して測定することができる。
プール品1:著しい澱粉顆粒変形を示した、トランスジェニック系IIa4.1のT1種子7個
プール品2:多少の澱粉顆粒変形を示した、トランスジェニック系IIa4.1のT1種子6個
プール品3:正常な外観を示す顆粒を有する、トランスジェニック系IIa4.1のT1種子7個
プール品4:著しい澱粉顆粒変形を示した、トランスジェニック系IIa4.2.5のT2種子6個
プール品5:著しい澱粉顆粒変形を示した、IIa4.2.5とIIb4.3.8との交配物(ds−SBEIIbトランスジェニック系)由来のF1種子5個
対照:オオムギSSIIa変異体M292(Morelら、2003)、ヒマラヤ品種およびSSIIaコムギ変異体(Yamamoriら、2000)
オオムギにおけるSBEIIaの非発現を導くためのSBEIIa遺伝子の変異は、ガンマ線による照射またはたとえばエチルメタンスルホン酸(EMS)による化学変異を経て行われる。ガンマ線に誘導された変異では、種子が60Co放射線源(ZikiryaevaおよびKasimov、1972)から投与量20〜50kRで照射される。EMS変異は、Mullinsら(1999)に従って、種子をEMS(0.03%、v/v)で処理して行う。変異穀物粒はアミロース含有量の増加または澱粉穀物粒形態の変化に基づいて同定し、上記方法によって確認する。SBEIIaの変異体は、2ラウンド目に再変異させることができ、変異を結合して胚乳にSBEII活性を実質的に欠く非トランスジェニックなオオムギ品種を作るために、SBEIIaに加えてSBEIIb活性の損失についてもスクリーニングされた子孫か、またはSBEIIaの変異体を、SBEIIb変異体と交配することができる。
SBEI遺伝子の単離は、プローブをオオムギcDNAまたはゲノムライブラリーにハイブリダイゼーションすることまたはPCR法により達成する。PCRプライマーの設計は、コムギ由来の相同遺伝子、たとえばGenBank AF076679に記載のDNA配列を基礎としてもよい。使用するプライマーは:
5'ACGAAGATGCTCTGCCTCAC3':配列番号10および5'GTCCAACATCATAGCCATTT3':配列番号11であってもよい。これにより、約1015bpのPCR産物がもたらされる。
ds−SBEIIaについてトランスジェニックであってSBEIIa活性の減少した植物を、オオムギ系M292(SSIIa変異体)およびハイアミロースグレーシャー(HAG)と交配させた。次の交配系を確立した。
1)系IIa4.1.10×HAG
2)系IIa4.1.16×HAG
3)系IIa4.1.20×M292
4)系IIa4.1.19×HAG
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Claims (17)
- オオムギ植物から得られる穀物粒であって、
前記オオムギ植物はデンプン分岐酵素IIa(Starch branching enzyme IIa(SBEIIa))の酵素活性および澱粉分岐酵素IIb(SBEIIb)の酵素活性に影響を及ぼす遺伝的変異を含む改変がなされたものであって、前記遺伝的変異が前記SBEIIaの酵素活性の阻害物質である二本鎖RNAをコードするトランスジーンであり、前記阻害物質が前記SBEIIa遺伝子、RNA又はその両方を標的とするセンス配列およびアンチセンス配列を含み、
前記オオムギ植物の胚乳での前記SBEIIaの酵素活性および前記SBEIIbの酵素活性のレベルが、前記トランスジーンを欠いているオオムギ植物の前記SBEIIa酵素活性および前記SBEIIb酵素活性のレベルと比較して低下しており、
前記穀物粒の澱粉は、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において、少なくとも50%(w/w)のアミロース含有量を有している穀物粒。 - 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも60%(w/w)である請求項1に記載の穀物粒。
- 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも70%(w/w)である請求項2に記載の穀物粒。
- 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも80%(w/w)である請求項3に記載の穀物粒。
- 前記穀物粒は粉にされ、すりつぶされ、精白され、延ばされ、粗挽きされ、破砕されたかあるいは全粒穀物粒(whole
grain)である請求項1ないし請求項4のいずれか一項に記載の穀物粒。 - 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも75%(w/w)である請求項3に記載の穀物粒。
- 請求項1ないし請求項6のいずれか一項に記載の穀物粒から得られる穀粉(flour)または全粒粉(wholemeal)。
- デンプン分岐酵素IIa(Starch branching enzyme IIa(SBEIIa))の酵素活性および澱粉分岐酵素SBEIIb(SBEIIb)の酵素活性に影響を及ぼす遺伝的変異を含む改変がなされ、それにより前記オオムギ植物の胚乳での前記SBEIIaの酵素活性および前記SBEIIbの酵素活性レベルが非改変のオオムギ植物の胚乳の前記SBEIIa酵素活性および前記SBEIIbの酵素活性レベルと比較して低下しているオオムギ植物であって、
前記遺伝的変異が前記SBEIIaの酵素活性の阻害物質である二本鎖RNAをコードするトランスジーンであり、前記阻害物質が前記SBEIIa遺伝子、RNA又はその両方を標的とするセンス配列およびアンチセンス配列を含むものであり、
前記オオムギ植物の穀物粒における澱粉は、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも50%(w/w)のアミロース含有量を有しているオオムギ植物。 - 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも60%(w/w)である請求項8に記載のオオムギ植物。
- 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも70%(w/w)である請求項9に記載のオオムギ植物。
- 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも75%(w/w)である請求項10に記載のオオムギ植物。
- 前記澱粉のアミロース含有量が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも80%(w/w)である請求項11に記載のオオムギ植物。
- ヨウ素滴定法による測定において少なくとも50%のアミロースを含む澱粉を有する穀物粒を生産することができるオオムギ植物の作成方法であって、前記方法が、
a)親オオムギ植物又は種子へトランスジーンを導入する工程であって、前記トランスジーンがデンプン分岐酵素IIa(starch branching enzyme IIa(SBEIIa))の活性の阻害物質である二本鎖RNAをコードし、前記阻害物質がSBEIIa遺伝子、RNA又はその両方を標的とするセンス配列およびアンチセンス配列を含むものである工程;および
b)工程a)の前記親オオムギ植物又は種子の子孫植物又は種子を同定する工程、を含み、
前記子孫植物又は種子の胚乳の前記SBEIIa活性およびSBEIIb活性が、前記親オオムギ植物又は種子の胚乳の前記SBEIIa酵素活性および前記SBEIIb酵素活性のレベルと比較して低下しており、前記子孫植物又は種子からなる穀物粒の澱粉が、馬鈴薯アミロースおよびアミロペクチンの標準サンプルとの比較によってアミロース含有量を測定するヨウ素滴定法において少なくとも50%のアミロース含有量を有しているオオムギ植物作成方法。 - 請求項1ないし請求項6のいずれか一項に記載のオオムギ穀物粒、および
請求項7に記載の穀粉(flour)もしくは全粒粉(wholemeal)、
のうちのいずれかを含む食品。 - 前記食品はパン、ケーキ、ビスケット、増粘剤、結合剤、麦芽入り飲料、オオムギを含んだ飲料、麺類、即席スープ、シリアル、菓子類、ポテトフライからなるグループから選択される請求項14に記載の食品。
- 食品の製造のための使用であって
請求項1ないし請求項6のいずれか一項に記載のオオムギ穀物粒、および
請求項7に記載の穀粉(flour)もしくは全粒粉(wholemeal)、
のうちのいずれかの食品の製造のための使用。 - 前記食品はパン、ケーキ、ビスケット、増粘剤、結合剤、麦芽入り飲料、オオムギを含んだ飲料、麺類、即席スープ、シリアル、菓子類、ポテトフライからなるグループから選択される請求項16に記載の使用。
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