JP5638736B2 - 腸の健康を改善する方法および手段 - Google Patents

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Description

本発明は、改変小麦を含む食事の使用により、人類を含めた哺乳類の健康を改善する方法に関する。本発明は、腸の健康を改善する、難消化性澱粉を増量し、あるいは高いアミロース含有率を有する特性を備えた小麦産物にも関する。
食事および生活習慣と関係する重度の非感染性慢性病は、豊かな工業国および豊かさを増した新興国においても罹患および致死の主因である。このような慢性病には、冠動脈性心疾患、憩室疾患、ある種の癌（特に結腸癌および直腸癌）、糖尿病などが挙げられる。穀類には、このような病態の危険性を低下させることにより、人間の健康を改善する相当程度の潜在力がある。その恩恵は、全粒、または複合糖質、すなわち澱粉および非澱粉多糖類（ＮＳＰ，食物繊維の主成分）を含む、その成分を含有する加工食品の消費により、得ることができる。ＮＳＰは人体小腸酵素による消化がし難く、そのことが、糞量の増加および便秘の緩和におけるＮＳＰの有効性を説明する助けとなっている（Ｔｏｐｐｉｎｇ＆Ｃｌｉｆｔｏｎ、２００１年）。澱粉は人体小腸において消化できる（理論的には完全に）が、その一部は大腸へと素通りする。この部分が難消化性澱粉（ＲＳ）であり、割合が変動的なＮＳＰと共に、大腸のミクロフローラにより代謝される（Ｔｏｐｐｉｎｇ＆Ｃｌｉｆｔｏｎ、２００１年）。
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、この発酵による主要な最終生成物であり、大腸機能の重要な特徴、すなわち液体および電解質吸収の刺激、筋肉収縮および内臓灌流の調節を促進する（Ｔｏｐｐｉｎｇ＆Ｃｌｉｆｔｏｎ、２００１年）。主要なＳＣＦＡの１種である酪酸は、結腸細胞において正常な表現型を促進し、正常に制御された結腸細胞の増殖を強化し、結腸直腸癌の危険性を低下させる役割を演じ得る。後者の悪性度が、豊かな工業国における早期罹患の実質的な原因である。小腸での澱粉消化性の低下によるさらなる結果は、循環血中へのグルコースの取込速度を低下させる可能性と、それによるインスリン要求性の低下である。これは、罹患危険性の実質的要因として明らかになりつつある血糖指数（ＧＩ）として測定される。食物繊維に起因する作用の多くは、実際にはＲＳによるらしいということも明らかになりつつある（Ｔｏｐｐｉｎｇ＆Ｃｌｉｆｔｏｎ、２００１年）。ＲＳの摂取は富裕病の危険性が高い集団では低く、ＲＳの含量および作用を高めるためのコンビニエンスフードの改良は、その集団レベルでの保健のために栄養を改善する有効な手段であるとみなされている。この改良は、元来ＲＳが豊富な豆や全粒米（玄米）などの特定食品の消費を促すことにより、実行し得る。別の手法は、コンビニエンスフードを添加成分としてのＲＳで強化することである。
小麦は多くの国において主食であり、全世界人口にとって食物キロジュールの約２０％を供給している。小麦の加工特性のために、小麦は、パン、パスタ、麺類などの大部分の穀物系加工製品にとって好ましい基礎材料となっている。小麦の消費量は、豊かさが増すと共に世界的に増加しつつある。パン小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）は３種の異なるゲノムＡ、ＢおよびＤを有する６倍体であり、小麦中にある既知の遺伝子の大部分は、三重に各ゲノム上に１個ずつ存在している。パン小麦ゲノムの６倍体性のために、３種のゲノムの各々に遺伝子変異を見つけ出し、組み合わせることは難題である。３種のゲノムの存在は、２倍体種における特定がより容易な変異とは対照的に、個々のゲノム中の変異を覆い隠すことによる緩衝作用を示す。小麦の澱粉構造の公知の変異は、トウモロコシまたは米で利用できる変異に比べ限られてきた。この制限に対する別の寄与要因は、小麦の形質転換効率が他の穀類よりこれまで劣っていたことである。
高等植物の内胚乳における澱粉の合成は、主要な４段階を触媒する１組の酵素によって実行される。第１に、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼが、Ｇ−１−ＰおよびＡＴＰからのＡＤＰグルコースの合成を介して澱粉の単量体前駆体を活性化する。第２に、活性化グルコシル供与体のＡＤＰグルコースが、澱粉シンターゼによって、既存のα１−４結合の非還元末端に転移される。第３に、澱粉分枝酵素が、α１−４結合グルカン領域の開裂に続き、その開裂鎖の受容体鎖への転移によって分枝点を導入し、新たなα−１，６結合を形成する。澱粉分枝酵素は、α−ポリグルカン中にα−１，６結合を導入できる唯一の酵素であり、したがってアミロペクチンの形成に必須の役割を演じる。最後に、澱粉脱分枝酵素が分枝結合の一部を除去するが、その作用機構は未解明である（Ｍｙｅｒｓほか、２０００年）。
高等植物での正常な澱粉顆粒の合成には、このような少なくとも４種の活性が必要であることは明らかであるが、この４種の活性それぞれの多重アイソフォームが高等植物の内胚乳に見出されており、個々のアイソフォームに対する特定の役割が、変異分析に基づいて（Ｗａｎｇほか、１９９８年、Ｂｕｌｅｏｎほか、１９９８年）、または遺伝子移入手法を用いる遺伝子発現量の改変により（Ａｂｅｌほか、１９９６年、Ｊｏｂｌｉｎｇほか、１９９９年、Ｓｃｗａｌｌほか、２０００年）、提案されてきた。しかし、各活性の各アイソフォームが果たす、澱粉生合成に対する厳密な寄与はなお不明であり、このような寄与が種同士の間で顕著に異なるか否かは不明である。穀物の内胚乳には、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼのアイソフォームが２種、アミロプラスト内に１フォーム、および細胞質中に１フォーム存在する（Ｄｅｎｙｅｒほか、１９９６年、Ｔｈｏｒｂｊｏｒｎｓｅｎほか、１９９６年）。各フォームは２種のサブユニット型からなる。トウモロコシにおけるしわ型（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）（ｓｈ２）変異体および脆性（ｂｒｉｔｔｌｅ）（ｂｔ２）変異体は、各々大サブユニットおよび小サブユニットにおける病変である（ＧｉｒｏｕｘおよびＨａｎｎａｈ、１９９４年）。穀物の内胚乳には、澱粉シンターゼが４クラス見出されており、それらは、もっぱら澱粉顆粒内にあるアイソフォームである顆粒結合澱粉シンターゼ（ＧＢＳＳ）、顆粒と可溶性分画との間で分配されている２種のフォーム（ＳＳＩ、Ｌｉほか、１９９９年ａ、ＳＳＩＩ、Ｌｉほか、１９９９年ｂ）、および可溶性分画中にもっぱらある第４フォームのＳＳＩＩＩ（Ｃａｏほか、２０００年、Ｌｉほか、１９９９年ｂ、Ｌｉほか、２０００年）である。ＧＢＳＳはアミロース合成に必須であることが示されており（Ｓｈｕｒｅほか、１９８３年）、ＳＳＩＩおよびＳＳＩＩＩにおける変異は、アミロペクチン構造を変化させることが示された（Ｇａｏほか、１９９８年、Ｃｒａｉｇほか、１９９８年）。ＳＳＩ活性の役割を規定する変異については、記載がなされていない。
穀物の内胚乳には、分枝酵素が３フォーム、分枝酵素Ｉ（ＳＢＥＩ）、分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）および分枝酵素ＩＩｂ（ＳＢＥＩＩｂ）が発現する（ＨｅｄｍａｎおよびＢｏｙｅｒ、１９８２年、ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９７８年、Ｍｉｚｕｎｏほか、１９９２年、Ｓｕｎほか、１９９７年）。ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列の特性は、米（ＮａｋａｍｕｒａおよびＹａｍａｎｏｕｃｈｉ、１９９２年）、トウモロコシ（Ｂａｂａほか、１９９１年；Ｆｉｓｈｅｒほか、１９９３年；Ｇａｏほか、１９９７年）および小麦（Ｒｅｐｅｌｌｉｎほか、１９９７年；Ｎａｉｒほか、１９９７年；Ｒａｈｍａｎほか、１９９７年）について決定された。配列を整列すると、ヌクレオチド、アミノ酸の両レベルで高度の配列類似性が明らかとなり、ＳＢＥＩ、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂの各クラスへの群別が可能となる。ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは、一般に、特にその遺伝子の中心領域において、相互に約８０％の配列同一性を示す。ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは、その発現パターンによって識別することもできる。トウモロコシにおけるＳＢＥＩＩｂは内胚乳に特異的に発現するが、ＳＢＥＩＩａはこの植物のあらゆる組織中に存在する。
小麦内内胚乳では、ＳＢＥＩ（Ｍｏｒｅｌｌほか、１９９７年）はもっぱら可溶性分画に見出されるが、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは、可溶性分画、澱粉顆粒結合分画の双方に見出される（Ｒａｈｍａｎほか、１９９５年）。トウモロコシおよび米では、高アミロース表現型が、アミロース増量（ａｅ）遺伝子としても知られているＳＢＥＩＩｂ中の病変から生じることが示された（ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９８１年、Ｍｉｚｕｎｏほか、１９９３年；Ｎｉｓｈｉほか、２００１年）。このようなＳＢＥＩＩｂ変異体では、内胚乳澱粉顆粒は異常形態を示し、アミロース含量は有意に増加し、残存アミロペクチンの分枝頻度は減少し、短鎖の比率（＜ＤＰ１７、特にＤＰ８〜１２）が低下していた。さらに、澱粉のゲル化温度が増加した。その上、アミロースとアミロペクチンとの「中間産物」と規定される物質が、相当量蓄積していた（Ｂｏｙｅｒほか、１９８０年、Ｔａｋｅｄａほか、１９９３年ｂ）。それとは対照的に、変異誘発（Ｍｕ）挿入因子に起因し、そのためＳＢＥＩＩａタンパク質発現を欠いている、ＳＢＥＩＩａ遺伝子におけるトウモロコシ植物変異体は、内胚乳澱粉の分枝度が野生型植物と識別できなかった（Ｂｌａｕｔｈほか、２００１年）が、葉の澱粉は変化していた。同様に、ＳＢＥＩＩａ活性を欠いた稲は、内胚乳におけるアミロペクチン鎖のプロファイルに有意な変化を示さなかった（Ｎａｋａｍｕｒａほか。２００２年）。トウモロコシ、米の双方で、ＳＢＥＩＩａ遺伝子およびＳＢＥＩＩｂ遺伝子はゲノム中で連鎖していない。
小麦のＳＢＥＩＩａもしくはＳＢＥＩＩｂにおける変異、またはこのような変異を保持した小麦系の表現型は、報告されていない。小麦の既知変異体は、ワクシー遺伝子（ＧＢＳＳ、ＺｈａｏおよびＳｈａｒｐ、１９９８年）と、タンパク質電気泳動でアッセイした場合ＳＧＰ−１（ＳＳＩＩ）タンパク質のＡ、ＢおよびＤゲノム特異的な形態を欠いている、系統間の交雑により産生したＳＧＰ−１タンパク質（Ｙａｍａｍｏｒｉほか、２０００年）をまったく欠いた変異体とを対象にしている。ＳＳＩＩ非産生種子の検査によって、その変異により、アミロペクチン構造の変化、澱粉顆粒の変形、および野生型に対して約８％の増量に相当する、澱粉中アミロース含有率の約３０〜３７％への増加が起こった（Ｙａｍａｍｏｒｉほか、２０００年）。アミロースの測定は、比色測定、電流滴定（両法ともヨウ素結合量に対して）およびコンカナバリンＡ法で行った。ＳＳＩＩ非産生変異体の澱粉は、相当する非変異体植物の澱粉と比べ、ゲル化温度の低下を示した。澱粉含有率は、野生型の６０％からＳＳＩＩ非産生穀粒中の５０％未満へ低下した。
トウモロコシでは、ｄｕｌｌ１変異によって、その変化度が遺伝的背景に依存する、内胚乳中の澱粉含有率の減少およびアミロース量の増加と、残存アミロペクチン中の分枝度の増加が引き起こされる（ＳｈａｎｎｏｎおよびＧａｒｗｏｏｄ、１９８４年）。この変異に対応する遺伝子は、トランスポゾン変異誘発因子（Ｍｕ）を用いるトランスポゾンタグ付け戦略によって、同定、単離されており、澱粉シンターゼＩＩ（ＳＳＩＩ）と称する酵素をコードすることが示された（Ｇａｏほか、１９９８年）。この酵素は、穀物におけるＳＳＩＩＩファミリーの一員として現在認識されている（Ｌｉほか、２００３年）。変異体の内胚乳は、ｄｕｌｌ１変異に付随する減少レベルのＳＢＥＩＩａ活性を有していた。他の穀類には、対応する変異が報告されていない。このような知見が他の穀類、例えば小麦に関係あるか否かは不明である。
２種の脱分枝酵素が高等植物には存在し、基質特異性に基づいて規定されているが、それらは、イソアミラーゼ型脱分枝酵素およびプルラナーゼ型脱分枝酵素である（Ｍｙｅｒｓほか、２０００年）。トウモロコシおよび米におけるＳｕｇａｒｙ−１変異は、両方の脱分枝酵素の欠損と関係している（Ｊａｍｅｓほか、１９９５年、Ｋｕｂｏほか、１９９９年）が、原因となる変異は、イソアミラーゼ型脱分枝酵素の遺伝子と同じ位置にマッピングされる。穀類からクローニングした遺伝子の代表的な澱粉分枝酵素配列は、表１に列挙してある。
Figure 0005638736
澱粉組成、特に高アミロース含量を伴い得る難消化性澱粉と称する形態は、腸の健康、特に大腸の健康に対して重要な関わりを持っている。難消化性澱粉の有益な作用は、栄養分を大腸に供給することから生じると考えられており、そこでは腸のミクロフローラに、発酵によってとりわけ短鎖脂肪酸を形成するエネルギー源が与えられる。このような短鎖脂肪酸は、結腸細胞に栄養分を供給し、大腸からのある種の栄養分の取込みを高め、結腸の生理活動を促進する。一般に、難消化性澱粉または他の食物繊維が供給されないと、結腸の代謝活動は相対的に弱い。
化学的または他法による加工澱粉は、非加工澱粉では通常得られない機能性をもたらす食品に利用できるが、このような加工処理には、貴重な他の成分を変化させるか、または加工に伴う工程のために不快感を持ち込む傾向がある。したがって、食品中で非加工形態で使用できる成分源を供給することが好ましい。
トウモロコシおよび大麦の高アミロース品種は知られているが、このような穀類由来の製品には、小麦が好ましい穀物である製品、例えばパン、パスタまたは麺類用の超高アミロース小麦と比較して欠点がある。したがって、難消化性澱粉を増加させ、食事中に入れると血糖指数を低下させ得る小麦澱粉の改変によって、腸の健康および代謝健康を含めた公衆の健康を大規模に改善する機会が存在する。
回腸から通過する際、難消化性澱粉は、多糖類の加水分解および異化に必要な酵素を産生する、盲腸および結腸の嫌気性ミクロフローラによって代謝される。分解は、偏性草食動物の第１胃に見出される細菌種に酷似した細菌種により行われ、酷似した産物、すなわち二酸化炭素、メタン、水素などのガス、および短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）が得られる。形成される主要なＳＣＦＡは、大まかなモル比が６０：２０：２０の酢酸、プロピオン酸および酪酸である。この３種の酸が全結腸ＳＣＦＡの大体８０〜９０％を占め、残りは、食事性および内因性タンパク質の分解で形成される分枝鎖および他種の脂肪酸である。難消化性澱粉を餌として与えられた動物は、より多量の結腸ＳＣＦＡと、場合によっては結腸中の細菌塊の増加を示した。結腸中での難消化性澱粉の作用の多くは、恐らくＳＣＦＡを介している。
単なる便秘の予防および管理における食物繊維の役割は、疑問の余地がない。繊維は、腸機能に対する効果を変える。不溶性ＮＳＰが多いふすま、米ぬかなどの穀物ぬかは、移動時間の短縮、保水量の増加による便の軟化、細菌および未消化／非発酵性物質の形態の便体積および重量の増加によって、便通の問題を軽減する上で最も有効なようである。
便量の点だけでふすまなどの多繊維食品の作用を説明するのは便利であるが、これがまったく正しいとはいえない。しかし、混食をする人々の糞便量の増加は、非澱粉多糖類含量から予測されるものより相当に高い、すなわち「炭水化物ギャップ」がある（Ｓｔｅｐｈｅｎ（１９９１）Ｃａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：１１６−２０）。澱粉は、発酵基質（グルコースおよびＳＣＦＡの両方）を供給するだけでなく、物理的な体積ももたらすことによって、このギャップを埋め、細菌増殖を介して糞便量の増加に寄与すると考えられる。
非消化性炭水化物の発酵による微生物量の増加は、便重量の大きな部分を占める便体積に直接寄与する。細菌は、約８０％が水分であり、脱水に対して抵抗力を有しており、したがって糞便物質中の保水に寄与する。人糞中の細菌数は、約４×１０１１〜８×１０１１／ｇ乾燥糞便であり、西洋食を取る対象において糞便固形物の約５０％までを占める。結腸発酵によるガス産生は、便体積にもある程度の影響を及ぼすことができる。ガスの捕捉は、体積の増加および糞便の移動時間の減少に寄与できる。
発酵の代謝最終産物、すなわちガス、ＳＣＦＡおよび増加したミクロフローラは、結腸中での非消化性炭水化物の生理的作用と、結腸中での局所作用および全身作用に対する関わりにおいて、中心的な役割を演じている。バクテロイドなどの偏性嫌気種、クロストリジウム菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）のいくつかの非病原種および酵母、嫌気性球菌ならびに乳酸菌のいくつかの種による発酵で産生するガスは、主に鼓腸として放出され、または吸収された後、肺を通して体から消失する。しかし、このようなミクロフローラから産生する水素および二酸化炭素の一部は、メタン細菌によりメタン（ＣＨ４）にさらに代謝され、したがって腸内ガス圧を低下させ得る。このような嫌気性微生物のうちで、クロストリジウム菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、真正細菌および嫌気性球菌は、ガス産生が最も活発である一方、ビフィズス菌は、ガスをまったく産生しない唯一の群の腸内常在ミクロフローラである。
難消化性澱粉は消化または吸収されないので、ビフィズス菌、乳酸菌などの有益細菌の生物前駆体として役立つ。有益細菌の増殖によって結腸内ｐＨレベルが低下し、その環境は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの潜在的有害細菌にとって棲めないものとなる。有益細菌の増殖によって、消化の促進および乳糖不耐性の改善、エストロゲンなどの化合物の再利用促進、ビタミン、特にＢ群ビタミンの合成、免疫刺激性化合物の産生、有害細菌の増殖抑制、毒素および発癌物質の生成減少、抗生物質療法中の正常腸内細菌の回復、および病原性腸内細菌数の増加と通常関係する幾種かの病状の可能性減少を含めた、相当な健康効果が得られる。このような病状には、強直性脊椎炎および関節リウマチなどの自己免疫病、ある種の癌、酵母の過剰増殖、膣炎、尿管感染症、肝硬変、食中毒、抗生物質起因性下痢、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患、壊死性の全腸炎および回盲腸炎、食物アレルギーおよび不耐性、腸内ガスおよび膨満、過敏性腸症候群が挙げられる。
発酵で生成する主要なＳＣＦＡは、酢酸、プロピオン酸および酪酸であり、それらで、約６０〜１５０μｍｏｌ／Ｌの範囲にある大腸内全ＳＣＦＡ濃度の８３〜９５％を占めている。これらの酸濃度は、ミクロフローラの濃度も最高である場所、すなわち盲腸および右結腸または横行結腸で最高となる。このような酸濃度の増加に対応して、ｐＨも横行結腸で通常最低であり（５．４〜５．９）、遠位結腸を通って次第に６．６〜６．９へ増加する。ｐＨが低下するにつれて、結腸環境は、大腸菌、クロストリジウム菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、ある種の酵母などの毒素産生／健康障害促進性のミクロフローラにとって、それだけ不利となる。
人体結腸における消化物のｐＨ範囲を確定する必要があるが、高繊維食事を取る豚では、その範囲は、近位結腸での約６から遠位結腸での＞７に及んでいる。短鎖脂肪酸のｐＫａは＜４．８であるため、結腸中でそれらは主に陰イオンとして存在している。ＳＣＦＡは、非イオン形で吸収された後、細胞内ｐＨでＨ＋およびＳＣＦＡにイオン化され、それらのイオンは、次いで管腔内のＮａ＋およびＣｌ−と各々交換される。ＳＣＦＡの一部は、ＨＣＯ３へも代謝され、それも塩素イオンと交換される。したがって、ＳＣＦＡは、代謝で重要な役割を演じるイオンの輸送を促進する上で有益である。
したがって、ＳＣＦＡは、浸透圧負荷にはさほど寄与せず、結腸管腔からナトリウムおよび水分を除去することにより、下痢を改善し得る。しかし、ＳＣＦＡは主に陰イオンとして存在するので、その吸収は相対的に遅い。この理由と糞便中での存在のために、ＳＣＦＡは下痢を起こすと推定されていた。その見解はもはや支持されておらず、下痢の発生は、結腸中での単純および複合炭水化物の浸透圧のために、液体積が過剰に増加し、しかも細菌が炭水化物を十分速やかに分解できない場合だけであると考えられている。事実ＳＣＦＡは、結腸細胞の増殖を刺激し、それにより結腸の能力を増加させることによって、より長期の予防作用を示し得る。
疫学データによれば、食物繊維量は腸癌の発生率と逆相関することが示されており、多数の研究のメタ分析によれば、繊維は５０％を超える研究において保護作用のあることが示された。有効であったＮＳＰまたは食物のタイプを識別することは、不可能である。Ｃａｓｓｉｄｙ他による研究（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ６９；９３７−９４２（１９９４））では、澱粉は保護的役割を演じることが示された。
結腸粘膜の完全状態を維持する上での繊維の役割は、不完全に理解されている。豚などの動物モデルを用いた実験によれば、結腸の重量および厚さは、繊維の多い食事により増加する、すなわち、さらなる細胞の増殖と整合することが示された。ＧｏｏｄｌａｄおよびマザーズＭａｔｈｅｒｓ（（１９９０）Ｂｒｉｔ Ｊ Ｎｕｔｒ．６４；５６９−５８７）は、難消化性澱粉の多い食事を与えられたラットの後腸で類似の増加を得たので、この効果は繊維に限らない。ラットを用いた他の研究によれば、不活性な糞便膨張剤（カオリン）は粘膜増殖を刺激しなかったので、この増加は、おそらく消化物の増量によるものではないことが示された。同じ実験では、短鎖脂肪酸の結腸内注入で結腸細胞の増殖が促進されたので、脂肪酸は栄養剤であることを示唆することが示された（Ｓａｋａｔａ、Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ １９８６；３２：３５５−３６２）。プロピオン酸および酪酸だけがこのような作用に関与しているらしい。プロピオン酸は、多分血流の刺激により結腸運動性を高めることが知られている（ＫｖｉｅｔｉｓおよびＧｒａｎｇｅｒ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ（１９８１）；８０：９６２−９６９）。酪酸は、結腸細胞の細胞生物学において極めて決定的な役割を演じると考えられており、その酸化的燃料として酢酸およびプロピオン酸より好ましい（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｇｕｔ（１９８１）２２：７６３−７７９）。酪酸は、ＤＮＡ合成の阻害を介し、Ｇ１期における細胞の分裂停止し、ヒト結腸由来の悪性細胞の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する。細胞分化の誘導も実証されており、これは、細胞が分化すると増殖能を失うという事実と一致する観察である。酪酸は、結腸細胞のＤＮＡ損傷修復能も高める（Ｓｍｉｔｈ、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９８６）７：４２３−４２９）。このような作用はすべて、この酸の実際の存在を必要とし、ｉｎ ｖｉｖｏで結腸に見出される酪酸濃度に類似の濃度で実現される。特に興味深い点は、人糞の接種で澱粉が酪酸に発酵されるという証拠があり（Ｐｉｌｃｈ（編）食物繊維の生理的効果および健康への影響。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡ：ＦＡＳＥＢ １９８７）、このような産生が、繊維は必ずしも保護作用を示さないが、植物性食物が有益である疫学データの不整合を説明し得るらしいことである。
動物モデルでのいくつかの研究によれば、食事を繊維で補助すると、ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）、アゾキシメタン（ＡＯＭ）、３，２−ジメチル−４−アミノビフェニル（ＤＭＡＢ）などの化学的発癌物質で誘発される腫瘍に対して保護されることが示された。米国実験生物学会連合（ＦＡＳＥＢ）（Ｐｉｌｃｈ（１９８７）上記参照）によるこのような研究のメタ分析によれば、化学的発癌物質で誘発される病変形成の減少において、ふすまはペクチンまたはセルロースより有効であることが示された。このようなデータは、可溶性ＮＳＰが、ふすまより多量にＳＣＦＡに発酵されると予想し得ることを考慮すると、逆説的である。しかし、ラットによる研究によれば、ふすまは、可溶性ＮＳＰより相対的に高濃度の酪酸を後腸消化物中に産生することが示されている。その上、ふすまは、化学的発癌物質と結合し、その結腸濃度を低下させるようであり、動物モデル系でもそのように作用しているらしい。実験的な発癌に対する小麦の保護作用は、否定することはできない。
酪酸は、正常細胞の増殖を促進するが、感受性細胞に対しては抗腫瘍作用を及ぼし得るものであり、ヒト結腸癌細胞の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで有意に遅延させると考えられている（Ｋｉｍほか、Ｉｎ ＭａｌｔおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（編）結腸の発癌。Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＭＴＰ Ｐｒｅｓｓ、（１９２）；Ｆａｌｋ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ３１：３１７−３２３）。腺腫ポリープ患者の糞便では、酪酸のモル比率が有意に低いことを示した最近の研究（Ｗｅａｎｅｒほか、Ｇｕｔ（１９８８）；２９：１５３９−１５４３）は、短鎖脂肪酸の産生が異常であることを示唆するので、特に興味深い。ポリープ症患者における給食試験では、ふすまの補助食品がポリープの個数およびサイズを減少させるように思われた（ＤｅＣｏｓｓｅほか、Ｊ Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（１９８９）；８１：１２９０−１２９７）。これも非常に有望な研究であり、不溶性ＮＳＰが保護作用を示し得ることを示唆している。ある不溶性ＮＳＰ（乳汁分泌も促進する）が保護作用を示したというこの研究における事実は、特に興味深い。この状況は可溶性ＮＳＰであって、難消化性澱粉は不明である。
管腔内ＳＣＦＡが欠如すると、短期的には筋短縮、長期的には「栄養性結腸炎」を起こすことが示唆されている。これは、糞便流の完全な迂回後に発症し、結腸直腸の連続性回復後に治まる、迂回性結腸炎において特に明白である。ＳＣＦＡで２〜３週間洗浄すると、炎症が消散した、潰瘍性結腸炎も、酪酸浣腸を用いて首尾よく治療することができた。（Ｓｃｈｅｐｐａｃｈほか、（１９９２）Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ；１０３：５１−５６）。一般に、抗炎症薬の使用などの抗炎症手段には、副作用が必ず伴われ、特に、大用量を用いることにより、薬が結腸に到達する前に、小腸内で受ける自然分解を克服する場合にそうなる。他方で、ＳＣＦＡの使用は、それが天然物であり、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、他の抗炎症薬などの抗炎症薬の使用を代替するので、特に有益であるとみなされる。
一般事項
当業者であれば、本明細書に記載の発明が、明記された以外の変更や改変を受けることは認識されよう。本明細書に記載の発明には、このような変更／改変がすべて含まれるものと理解されたい。本発明には、本明細書に個別または包括的に言及または指示した、すべてのこのようなステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに前記ステップまたは特徴のいずれか２つ以上のありとあらゆる組合せも包含される。
本明細書全般にわたって、文脈上別途必要のない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、明記した完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくはステップまたは１群の完全体もしくはステップの包含を意味するが、他の任意の完全体もしくはステップまたは１群の完全体（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）もしくはステップの除外を意味しないものと理解されよう。本発明は、本明細書に記載し、例示目的だけを意図している特定の実施形態によって、範囲を限定すべきものではない。機能的に等価な生成物、組成物および方法は、本明細書に記載するように、本発明の範囲に入ることは明らかである。
本明細書中で本発明者等が言及した刊行物の書誌事項の詳細は、本詳細説明の最後にまとめてある。本明細書に記載の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込んである。１つまたは複数の任意の先行技術文書を含めた、本明細書における先行技術の言及は、前記先行技術が、オーストラリアにおける一般常識、またはオーストラリアにおける一般常識の一部をなすとの認識または示唆とみなすべきではない。
本明細書で使用する場合、用語「に由来（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」とは、特定の完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）または１群の完全体（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）が、明示した種を起源としたが、その明示起源から直接得られたとは限らないことを示すものとする。
本明細書で言及するヌクレオチド残基の名称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により勧告されたものであり、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミジンを表す。
発明の概要
本発明は、改変した小麦植物から得られる穀粒から作製した製品が、十分な難消化性澱粉および／または低下した血糖指数を有することにより、食品または飲料品中に取り入れるか、あるいは哺乳動物の消化管へ送達することのできる量を摂取した場合、健康上の利益を提供するという知見から得られている。健康上の利益は、腸の健康もしくは代謝健康またはその双方に関係し得る。
第１の態様では、本発明は、哺乳動物における腸の健康または代謝健康の１種または複数の指標を改善する方法であって、小麦植物の穀粒の形態で、または当穀粒に由来する改変小麦澱粉の有効量を前記動物の消化管へ送達するステップを含み、穀粒の澱粉中のアミロース比率が少なくとも３０％であり、ならびに／あるいは、前記穀粒は、野生型穀粒に比して減少レベルのＳＢＥＩＩａ酵素活性を含んでいる方法を提供する。
哺乳動物は、非反芻性または単胃性、例えばヒトであってもよい。一実施形態では、穀粒は、野生型穀粒に比して内胚乳中のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性またはその双方のレベル減少を起こす遺伝的変異であって、ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異またはＳＢＥＩＩａ遺伝子発現の阻害剤をコードする導入核酸を含んだ遺伝的変異を含む。改変小麦澱粉は、難消化性澱粉を少なくとも２％、少なくとも２．５％、または少なくとも３％含み得る。
小麦植物は、野生型穀粒に比して、減少レベルのＳＢＥＩＩａ酵素活性またはＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ酵素活性を有してもよく、穀粒の澱粉中でのアミロースの比率は、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％または少なくとも５５％であってもよい。小麦植物は、さらに、野生型穀粒に比して、減少レベルのＳＢＥＩのタンパク質、酵素活性またはその双方を含んでもよい。小麦植物は、さらに、野生型穀粒に比して、改変レベルの酵素であって、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＢＳＳ、ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、ホスホリラーゼ、イソアミラーゼ型の脱分枝酵素もしくはプルラナーゼ型の脱分枝酵素、またはこれらの任意の組合せである前記酵素を含んでもよい。改変レベルは、増加レベルまたは減少レベルであってもよい。
穀粒のアミロペクチンは、アミロペクチンのイソアミラーゼ脱分枝後に測定した場合、野生型のアミロペクチンに対して、減少比率の４〜１２ｄｐ鎖長分画を含むことを特徴とし得る。
小麦植物または改変小麦澱粉は、本明細書に記載のフォームのいずれか１つまたは複数であってもよい。改変小麦澱粉の少なくとも一部は、難消化性澱粉であると考えられる。改変小麦澱粉は、穀粒、粉、全粒、精製澱粉の形態もしくは他形態の非改変小麦澱粉と、または非小麦澱粉もしくは他の食物成分とブレンドしてもよい。
改変小麦澱粉を少なくとも１０ｇ、１日当たり１人に与えてもよいが、そのレベルは、１日当たり１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５ｇより多いのが好ましい。しかし、本発明は、１日当たり少なくとも１、２もしくは５ｇもの低い送達レベル、または、１日当たり少なくとも６０、７０、８０もしくは１００ｇなどの高い送達レベルも包含し得る。
改変小麦澱粉は、哺乳類、特に人間に経口的に送達するのが好ましい。澱粉は、全粒、または製粉、挽き割り、精白、ロール、粗挽き、パーボイルもしくは荒挽きをした粒の形態で、あるいは分離澱粉または澱粉粒として送達してもよい。別法として、澱粉は、調味料の場合もある食品または飲料の一部として送達してもよい。さらなる別法では、澱粉は、経口摂取に適切な医薬製剤の形態で送達してもよい。経口摂取は好ましいが、本発明は、改変小麦澱粉を結腸に送達する他の手段も包含することは、理解されよう。
改変澱粉を化学的に加工することも、有利になり得る。化学的加工には、エーテル化、エステル化、酸性化、または例えば酸もしくは酵素での細片化および二官能性試薬を用いた交差結合による、酵素感受性の低下などが含まれる。物理的加工には、加熱、結晶化などが含まれる。このような加工によって、難消化性澱粉の量が増加し得る。
改善された腸の健康の指標は、必ずしもそれだけとは限らないが、
ｉ）腸内容物のｐＨ低下、
ｉｉ）腸内容物中の全ＳＣＦＡ濃度または全ＳＣＦＡ量の増加、
ｉｉｉ）腸内容物中の１種または複数のＳＣＦＡの濃度または量の増加、
ｉｖ）糞便体積の増加、
ｖ）下痢を伴わない、腸または糞便の全水分体積の増加、
ｖｉ）便通の改善、
ｖｉｉ）プロバイオティック細菌の１種または複数種の個数または活性の増加、
ｖｉｉｉ）糞便胆汁酸排泄の増加、
ｉｘ）腐敗性産物の尿濃度の減少、
ｘ）腐敗性産物の糞便含量の減少、
ｘｉ）正常な結腸細胞の増殖量増加
ｘｉｉ）腸炎個体の腸における炎症の低下、
ｘｉｉｉ）尿毒症患者における糞便または大腸での、尿素、クレアチニンおよびリン酸のいずれか１種の量の低下、あるいは
ｘｉｖ）前記項目の任意の組合せ
を含んでもよい。
腸内容物のｐＨは、少なくとも０．１ｐＨ単位、好ましくは少なくとも０．２ｐＨ単位低下してもよい。１種または複数のＳＣＦＡは、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸またはそれらの分枝形から選択してもよいが、好ましくは酢酸、プロピオン酸および酪酸のうちの１種、より好ましくは酪酸である。
プロバイオティック細菌の中で、ビフィズス菌種が最も重要である。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどの乳酸菌が、同様に含まれる。
改善された代謝健康の指標は、必ずしもそれだけとは限らないが、
ｉ）食後のグルコース変動の安定化、
ｉｉ）改善された（低下した）血糖反応、
ｉｉｉ）食後の血漿インスリン濃度の低下、
ｉｖ）改善された血液脂質プロファイル
ｖ）血漿ＬＤＬコレステロールの低下、
ｖｉ）尿毒症患者における尿素、クレアチニンおよびリン酸の１種または複数の血漿濃度の低下、
ｖｉｉ）異常血糖反応の改善、または
ｖｉｉｉ）前記項目の任意の組合せ
を含んでもよい。
本発明は、腸の健康もしくは代謝健康の指標またはその双方のいずれか１つまたは複数における、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％の変化を含む。
本方法は、以下の状態：便秘、下痢、過敏性腸症候群、クローン病、結腸直腸癌、憩室疾患、潰瘍性大腸炎、高血液ＬＤＬコレステロール、腎疾患もしくは他の疾患に起因する尿毒症、または糖尿病のいずれか１つまたは複数に罹っている人の治療に特に有益となり得る。あるいは、本方法は、人間においてこのような状態のいずれか１つまたは複数を予防し、またはその危険性を低下させる。
腸内容物における減少は、好ましくは少なくとも０．１ｐＨ単位であるが、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、または少なくとも０．５ｐＨ単位であってもよい。ｐＨの変化は、糞便中、または体内の例えば、盲腸中、近位結腸中もしくは遠位結腸中で測定してもよい。
その濃度または全量が変化し得る短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸またはそれらの分枝形のいずれか１種または複数であってもよい。好ましくは、ＳＣＦＡは、酢酸、プロピオン酸および酪酸のうちの１種または複数、最も好ましくは酪酸である。あるいは、濃度または全量の変化は、全ＳＣＦＡ、またはＳＣＦＡの１種もしくは複数の選択群の合計値である。濃度変化は、糞便中または体内で測定した場合でもよく、盲腸、近位結腸、遠位結腸もしくはこれらの任意の組合せで測定してもよい。腸内容物の体積が経時的に増加する場合、全量は増加し得るが、濃度は同じままか、増加さえもする。したがって、ＳＣＦＡ含量は、盲腸、近位結腸、遠位結腸のいずれか、またはこれらの２箇所以上の組合せにおける、１種または複数のＳＣＦＡの全量の尺度である。この濃度または量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％の増加を示してもよいだろう。
糞便体積は、主として、盲腸および結腸中で養われる細菌数の増加の結果として増加する。その体積は、糞便量の増加により測定してもよく、あるいは盲腸、近位結腸または遠位結腸の内容物体積を、別々に、またはこれらの２つ、もしくはこれらの３つすべての組合せとして見積もることにより、その場で測定してもよい。体積の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％でもよいだろう。
腸または糞便の水分体積は、主として、細菌数の増加の結果として増加する。水分含量は、糞便または腸内容物の湿重量を乾燥後の乾重量と比較することによって測定でき、水分体積は、この重量減少から計算することができる。この水分体積の増加は、盲腸、近位結腸または遠位結腸において、個別、組み合わせとして、これらの２つ、もしくはこれらの３つすべての組合せであってもよい。この体積増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％でもよかろう。
便通は、腸からの固形分の通過と関係しており、定量的および／または定性的な排便の測定を伴う。排便頻度は便通の一態様であり、したがって排便頻度は少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加してもよかろう。定性的な一尺度は、便秘とは対照的に通過が容易となるが、下痢になるほどに便が柔らかくも緩くもない便の硬さと関係する。この尺度は、糞便の水分体積と関係するとみなしてもよいと思われ、これらは５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％増加してもよい。
プロバイオティック細菌は、非感染性であり、その発酵活性の結果として有益な代謝物質を産生するので、腸の健康にとってよいと思われる細菌であると、一般に考えられている。プロバイオティック細菌の中で、ビフィズス菌種が最も重要である。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどの乳酸菌が、同様に含まれる。個々の種または属の数は、個別または包括的に少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも５０％増加してもよかろう。また、大腸に潜在的に有害な作用を及ぼす細菌種の数が減少してもよい。このような多くの種は、プロバイオティック微生物と比較して、エネルギー源としての難消化性澱粉の利用能がないか、または劣っている。このような有害細菌の例には、いくつかのクロストリジウム菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などが挙げられる。
好ましくは、難消化性澱粉は、糞便の胆汁酸排泄を促進する。糞便の胆汁酸排泄量の増加により、肝臓が、胆汁酸の産生における基質としてコレステロールを利用して、より多くの胆汁酸を産生するように誘導される。肝臓は、胆汁酸合成のために血液からコレステロールを得て、血中コレステロール濃度を低下させることができる。あるいは、これを腸活動および胆汁消失の汎用マーカーとして単に使用してもよい。胆汁酸の蓄積は、腸の病因と少なくとも相関関係があるとも考えられている。この増加量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％でもよかろう。血漿ＬＤＬコレステロール濃度の類似する減少が示される場合もある。
好ましくは、難消化性澱粉は、腐敗性産物の尿中および糞便中含量、または腐敗性産物の指標も減少させる。これは、結腸または盲腸中の腐敗細菌による発酵量の減少を示唆する。その上、このようなことは、小腸の過成長の低下を示唆し得る。これらの化合物の含量は、例えばＨＰＬＣまたは他の技法によって測定できる。これらの化合物の多くは、タンパク質またはアミノ酸分解の代謝産物または副産物である。化合物は、尿素、アンモニアおよび他の老廃窒素産物、または硫化物および硫化水素ガスを含めた含硫化合物であってもよい。検査し得る特定の化合物には、それだけには限らないが、フェノール、インドール、スカトールおよびアンモニア、ｐ−クレゾール、４−エチルフェノール、尿素、ケトン類、アミン類などが含まれる。この減少量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％であってもよい。
腸炎の減少量は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％でもよかろう。
腎不全では、糸球体ろ過量が減少し、腎臓は血液の恒常性を維持することができない。水分、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび他の塩類の恒常性平衡は、もはや不可能となり、含窒素老廃物が排泄されない。水分保持のために浮腫が起こり、水素イオン濃度が増加するにつれ、アシドーシスが発症する。含窒素老廃物は蓄積し、尿毒症と称する病状が、血液および組織中に現れる。尿毒症毒素の例には、それだけには限らないが、アンモニア、尿素、クレアチニン、フェノール類、インドール類、中分子量分子などが挙げられる。リン酸も蓄積する場合がある。
腎機能の低下は、半透膜としても作用するため、小分子を腸管から血流中に通過させ、それより大きな分子が循環血に入るのを防止する腸壁によって、ある程度補償される。尿素、クレアチニン、尿酸などの含窒素老廃物は、幾種かの他の低分子量および中分子量化合物と共に、腸内に流入し、腸上皮を横断して平衡化する。本発明は腸の能力を高め、したがって腸を横断して老廃物の除去を促進する。したがって、この腸機能の強化は、健常者に与えられる利益の他に、尿毒症患者においては非常に重要な第２の機能を有している。強化機能の能力は、尿毒症患者に付随する尿中の老廃化合物、例えば、尿素、クレアチニン、リン酸などの減少量によって測定できる。これらの濃度減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％であってもよい。このような化合物の同程度に減少した血漿濃度が、本発明の好ましい実施形態における尿毒症患者において示される場合もある。
食物の摂取後、血糖濃度の初期変動が一般に起こるが、その増加速度は摂取した食物に依存する。健常者では１〜２時間かけて、血糖濃度は、インスリンの産生および機能のために概して高いある濃度まで低下する。しかし、健常者だけでなく糖尿病またはインスリン欠乏症（ＩＤ）の人ならなお更、血糖の増加速度が低下し、ピーク濃度も下がると同時に、その増加が長期間まで伸長することが望ましい。しばしば、特に夜間に見られる低血糖症に対処するために、特に糖尿病患者では、腸からの炭水化物の吸収が伸長されることも望ましい。相対的に難消化性のために、本発明の澱粉または小麦の改変産物により、健常者および特に糖尿病患者では血糖調節が促進される。したがって、本発明の一利点は、効果的に低い炭水化物含量と、消化が遅くなった澱粉を有する組成物が提供されることである。
グルコース吸収が遅くなると、インスリン放出も遅くなり、食後に上昇していく血ブドウ糖濃度に応じる過剰インスリン反応が低下する。これは、身体によるグルコースの検出、吸収および代謝の初期にわたってグルコース負荷、グルコース負荷速度の双方を低下させることにより、インスリンのすい臓分泌にとって有益である。したがって、グルコース負荷速度の低下により、グルコース上昇に対するインスリン反応に通常伴う、β細胞に対するストレスが低下する。その上、グルコース吸収が遅くなるか、緩和されると、正常な糖代謝経路をインスリンが刺激する時間を増すことができる。その結果、インスリン依存機構にとって、腸からの糖類の到達に備える時間が増える。グルコース吸収のこの緩和によって、肝臓、筋肉および脂肪組織における短期的なインスリン調節が改善される。
血糖の測定は任意数の方法によりなし得る。任意の血糖検査にとって、その時機が重要となり得るのであり、本発明では、空腹時血糖濃度および特に食後血糖濃度の測定を想定している。一般に、望ましい空腹時ブドウ糖濃度（食前）は８０〜１２０ｍｇ／ｄＬであり、非糖尿病者は１１０ｍｇ／ｄＬ未満の食前ブドウ糖濃度を有している。望ましい食後濃度は１００〜１４０ｍｇ／ｄＬであり、非糖尿病者は１２０ｍｇ／ｄＬ未満の就寝時糖濃度を有している。米国糖尿病標準的治療法勧告に従えば、空腹時血糖濃度が１４０ｍｇ／ｄＬを超えているか、食後血糖濃度が１６０ｍｇ／ｄＬを超えている場合、追加の処置が推奨されている。
好ましい形態では、本発明による食物摂取後の食後糖濃度は、約１６０ｍｇ／ｄＬ未満、より好ましくは約１５５、１５０、１４５、１４０または１３０ｍｇ／ｄＬ未満である。
本発明の改変された小麦または澱粉を利用した際に生じる血糖反応（ピーク濃度）は、グルコースまたはデキストロースを使用した際と比較して、好ましくは５０％以下、より好ましくは１２％以下であるが、血糖反応（濃度／時間曲線下の面積）は、グルコースまたはデキストロースを使用した際に生じるその血糖反応の７５％以下、好ましくは３０％以下、より一層好ましくは１０％以下である。血糖反応（ピーク）は、食前濃度からピーク濃度（普通、食後１時間以内に起こる）までの血糖濃度の上昇量を、等価量のグルコースまたはデキストロースを摂取した際に認められる上昇量のパーセントで表したものと定義される。
同様に、食後血漿インスリン濃度は、非改変小麦または澱粉を使用した際と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％低下してもよい。
血液中の脂質プロファイルは、その個体における脂質の合成および輸送の障害を反映し得る。異常脂質血症の名でも知られている血液脂質プロファイルの異常パターンは、以下の事項：総コレステロールおよび低密度リポタンパク（ＬＤＬ）−コレステロールの濃度上昇、トリグリセリド（ＴＧ）の濃度上昇、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）−コレステロールの低濃度、高ＬＤＬ／ＨＤＬ比、またはＦＦＡ（遊離脂肪酸）の濃度上昇の１つまたは複数を特徴とし得る。糖尿病に罹患しているか、または症候群Ｘを有する個体では、脂質の不均衡も表れることがある。全血漿コレステロール（Ｃ）、ＬＤＬ−Ｃ、ならびにその濃度上昇が健康上の危険性と関係する、超低密度リポタンパクトリグリセリド（ＶＬＤＬ−トリグリセリド）およびＴＧを低下させる一方で、「健康」リポタンパクとみなされるＨＤＬ−Ｃの血清濃度を上昇させることが、一般に望ましい。好ましい形態の本発明は、これらの血液濃度の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％の変動を示す。
本発明は、人間の治療または予防に特に有用となり得る一方、それだけに限らないが、ウシ、ヒツジ、ブタなどの農業動物、イヌやネコなどの家畜動物、ウサギやマウス、ラット、ハムスターのようなげっ歯類などの実験動物、またはスポーツに用い得るウマなどの動物を含めた非人間動物にも適用できると理解されたい。本法は、非反芻哺乳類または単胃哺乳類などの動物に特に適用できることがある。本発明は、他の農業動物、例えばニワトリ、ガチョウ、アヒル、シチメンチョウもしくはウズラを含めた家禽類、または魚類にも適用できることがある。
動物、特に人間を治療する方法は、その動物に改変小麦の粒、粉または澱粉を１回または複数回の用量で、腸の健康または代謝指標の１つまたは複数のレベルが改善される量および期間、投与するステップを含んでよい。この指標は、ｐＨ、ＳＣＦＡ濃度の上昇、グルコースの食後変動などの指標のいくつかの場合などでは、非改変小麦澱粉もしくは小麦もしくはその製品の消費と比較して、数時間以内に変化し得るか、あるいは糞便体積の増加もしくは便通の改善の場合などには数日間、または正常結腸細胞の酪酸促進増殖を測定する場合などには数週間もしくは数カ月間などのより長い期間を要する場合もある。改変された澱粉または小麦または小麦製品の投与を一生続けることが、望ましいこともあり得る。しかし、改変澱粉を比較的気軽に投与できるのであれば、治療中の個体が投与遵守をする見込みが良好である。
投与量は、治療または予防するその状態に応じて変化し得るが、人間に対しては改変澱粉１日当たり少なくとも１ｇ、より好ましくは１日当たり少なくとも２ｇ、好ましくは１日当たり少なくとも１０ｇまたは２０ｇと想定されている。１日当たり約１００グラムを超えて投与すると、相当大きな送達体積が必要となり、コンプライアンスが低下する恐れがある。最も好ましくは、人間に対する投与量は、改変澱粉１日当たり５〜６０ｇ、または成人であれば１日当たり５〜１００ｇである。
本発明の改変小麦澱粉は、正常食において通常摂取される量を食物または飲料中に容易に取り入れることができる。１日当たり少なくとも約１０ｇの摂取は、測定可能に有益であると思われるが、より好ましくはその摂取量が、改変小麦澱粉１日当たり少なくとも約２０〜３０グラムである。通常の場合、人間は、パンやパスタなどの澱粉質食品の少なくとも１００〜２００ｇの１日摂取量を有するが、これは、その食品中の改変澱粉量が少なくとも５〜１０％であれば、通常有益な効果をもたらすことを意味している。それより少ない、例えば１％という少ない量でも、即座に測定可能か否かは不明だが、有益な効果を示すであろうと提案されている。
したがって、本発明の第２の態様は、小麦植物の穀粒の形態で、または前記穀粒に由来する改変小麦澱粉を少なくとも１％（ｗ／ｗ）含む食物、飲料または医薬製剤であって、穀粒澱粉中のアミロース比率が少なくとも３０％であり、および／または前記穀粒が、野生型穀粒に比して減少レベルのＳＢＥＩＩａ酵素活性を含むものを提供する。一実施形態では、改変小麦澱粉は、少なくとも２％（ｗ／ｗ）の難消化性澱粉、好ましくは少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、または少なくとも１０％の難消化性澱粉を含むが、その含量はより高く、恐らく少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％であってもよい。別の実施形態では、穀粒に由来する改変小麦澱粉中のアミロース比率は、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％である。
食物、飲料または医薬製剤は、その穀粒澱粉中のアミロース比率が少なくとも５０％である、小麦植物の穀粒に由来する難消化性小麦澱粉を少なくとも１％（ｗ／ｗ）含んでいてもよい。
小麦植物は、野生型穀粒に比して、減少レベルのＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ酵素の活性を有してよく、その穀粒澱粉中のアミロース比率が少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％であってもよい。小麦植物は、野生型穀粒に比して、減少レベルのＳＢＥＩのタンパク質、酵素活性またはその双方をさらに含んでもよい。小麦植物は、野生型穀粒に比して、改変レベルの１種または複数の酵素をさらに含んでもよく、前記酵素は、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＢＳＳ、ＳＳＩ、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩｂ、ＳＳＩＩＩ、ホスホリラーゼ、イソアミラーゼ型脱分枝酵素またはプルラナーゼ型脱分枝酵素であってもよい。改変レベルは、増加レベルまたは減少レベルであってもよい。
穀粒のアミロペクチンは、アミロペクチンのイソアミラーゼ脱分枝後に測定した場合、野生型穀粒のアミロペクチンに比して、減少比率の４〜１２ｄｐ鎖長分画を有してよい。
食物または飲料は、改変型または難消化性の小麦澱粉を少なくとも２％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％有してもよい。
食品の加熱または焼き上げは、冷却時に澱粉の老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）が増加し、その結果、難消化性澱粉量も増加し得るので、好ましいと考えられている。一実施形態では、穀粒、粉、全粒もしくは他形態の澱粉、またはその澱粉を含む食物、飲料もしくは医薬製剤は、その食物、飲料もしくは医薬製剤の調製の前または間のいずれでもよいが、少なくとも６０℃、少なくとも１０分間、１回または複数回加熱した後、冷却することにより、澱粉顆粒の分解、結晶化を共に進める。その澱粉または飲食品は、比較的高い温度、好ましくは少なくとも約７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、または少なくとも１００℃で、おそらく加圧もしている状態で加熱するのが好ましい。
改変澱粉は、直接粉末として、または難消化性澱粉および水、難消化性澱粉および食材、食品中の難消化性澱粉、飲料中の難消化性澱粉、もしくは難消化性澱粉および調味料を含んだ可食性組成物として食してもよい。改変澱粉は、マーガリンやショートニングなどの油脂製品、サラダドレッシング、マヨネーズなどの卵製品、ミルク、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、トウモロコシ粉や小麦粉などの穀類製品、果汁、他の食品もしくは食材中に取り入れてもよく、または改変澱粉は、パン、ケーキ、ビスケット、朝食用シリアル、パスタ、ヌードルもしくはソースなどの飲料または食物中に加工してもよい。他の食品には、例えばパンケーキやケーキミックスなどのプレパックミックスなどが挙げられる。あるいは、改変小麦澱粉は、例えば錠剤、カプセル、顆粒剤、散剤、シロップ、懸濁剤などの、好ましくは経口投与向けの医薬製剤として提供してもよい。あるいは、これらのものを非経口的に投与してもよい。
パンまたは他の食物中に取り入れる場合、改変小麦澱粉は、穀粒、粉、全粒または精製澱粉の形態をとってもよい。澱粉は、非改変小麦形態の一部代替物として使用してもよいし、従来の配合物中に使用する非改変形態の少なくとも５％（ｗ／ｗ）、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれより高い比率を代替してもよい。パンについては、その代替率は、好ましくは１０〜１００％、または５０〜１００％の範囲である。これにより、焼き上げ処置に対する影響を最小限に抑える一方で、１００〜２００グラムの通常の１日摂取量を取った際に、改変小麦澱粉を十分に送達することを補助してよい。あるいは、パンに取り入れるその粉を改変小麦だけから得てもよい。
食物または飲料または医薬製剤は、直ぐに販売できるように、またはバルク形態で包装してもよい。
本発明は、本発明の食物、飲料または医薬製剤を調製する方法、およびそのような食物または飲料を調製するためのレシピまたは指示も提供する。この方法またはレシピもしくは指示は、少なくとも１０分間、１回または複数回、改変澱粉成分またはその製品を少なくとも６０℃へ、あるいは好ましくは、少なくとも１００℃、少なくとも１２０℃、少なくとも１４０℃、少なくとも１８０℃、少なくとも２００℃、または少なくとも２２０℃へ加熱するか、または焼くステップを含み得る。方法は、直ぐに販売できるように、その製品を包装するステップを含み得る。
発明の詳細な説明
本発明は、改変小麦の産生および動物、特に哺乳類の食事中へのその導入により、いくつかの指標で測定した場合、腸が改善されるという知見に基づいている。さらに、その改変小麦で作製した食品は、難消化性澱粉（ＲＳ）量の増加、血糖指数（ＧＩ）の低下などの特質を示したので、食品の消費により代謝健康も改善される。その小麦植物は、澱粉生合成が、特に穀粒澱粉中のアミロース比率を高めるように改変されている。
本明細書では、小麦植物は、小麦属のある種の任意の植物と定義され、その種は商業的な栽培種であり、例えばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通またはパン小麦）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍの他の亜種、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ（マカロニまたは硬質小麦としても知られるデュラム小麦）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（栽培される１粒または小スペルト品種）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉ ｓｓｐ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｄｉｃｏｃｃｏｎ（栽培されるエンマー品種）、およびＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍの他の亜種（Ｆｅｌｄｍａｎ）が含まれる。小麦は、ＡＡＢＢＤＤ型ゲノムを有する６倍体小麦、またはＡＡＢＢ型ゲノムを有する４倍体小麦であってもよい。本発明による小麦の遺伝的変異は、交配によってライ麦および大麦を含めた特定の関連種に移入できるので、本発明は、パン小麦とライ麦の雑種であるライ小麦を含め、こうして形成される交配種の使用も包含する。特定の実施形態では、小麦植物は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍであり、好ましくはａｅｓｔｉｖｕｍ亜種である。あるいは、変異または移入遺伝子をＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍからデュラム小麦へ容易に移入できるので、別の実施形態では、小麦はＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍである。
小麦植物は、本発明に従って改変されることにより、その穀粒中に改変澱粉を産生する。本明細書では、「澱粉」とは、α−グルコピラノース単位で本質的に構成される多糖類と定義される。澱粉は、小麦中の主要な貯蔵炭水化物であり、アミロプラスト中で合成され、発生途上の穀粒中にある顆粒内に形成され、貯蔵される。それには、本質的に線状（分枝点が＜０．１％）のα−１，４−Ｄ−グルコピラノースポリマーのアミロースと、α−Ｄ−グルコピラノース単位からなる短鎖が、α−１，６結合分枝と主にα−１，４結合により結合されているアミロペクチンとが含まれる。野生型植物からの小麦澱粉は、約２０〜３０％までのアミロースおよび約７０〜８０％のアミロペクチンを含む。アミロースとアミロペクチンとのさらなる相当な差異は、ポリマーの分子量にある。アミロースが分子量１０４〜１０６ダルトンのらせん状立体配座を有する一方、アミロペクチンは約１０７〜１０８ダルトンの分子量を有する。最近の研究によれば、アミロースには最大で約０．１％のα−１，６−グリコシド性分枝部位が出現し得るため、「本質的に線状」と表現されることが示された。本明細書では、「アミロース」とは、α−１，４結合グルコシド（グルコピラノース）単位の本質的に線状の分子、およびアミロース様長鎖アミロペクチン（「中間物質」または「アミロース様アミロペクチン」と称することもある。Ｔａｋｅｄａほか、１９９３年ｂ；Ｆｅｒｇａｓｏｎ、１９９４年）を包含すると定義する。本明細書で定義する場合の澱粉中のアミロース比率は、重量／重量（ｗ／ｗ）基準、すなわち穀粒からの全澱粉重量のパーセントで示すアミロース重量である。アミロース含量は、例えば９０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ中でのサイズ排除ＨＰＬＣ、コンカナバリンＡ法（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔ、アイルランド）を含めた当分野で既知の方法のいずれか、または好ましくは、例えば実施例１に記載のヨウ素滴定法により決定し得る。ＨＰＬＣ法は、澱粉の脱分枝を必要とする場合（ＢａｔｅｙおよびＣｕｒｔｉｎ、１９９６年）も、脱分枝を必要としない場合もある。穀粒重量およびアミロース含量から、１粒当たりの堆積アミロース量を計算し、改変系および対照系に対してそれを比較することができる。
本発明による小麦植物の改変は、内胚乳にある澱粉生合成酵素の活性や量の１つまたは複数の変化を包含する。本明細書で使用する場合の「内胚乳」とは、当分野で既知の通常の意味を有し、発生途上の穀粒における澱粉の合成および堆積の主要部位であり、アリューロンおよび胚を取り出すための、成熟粒の製粉の主要生成物となる組織である。一実施形態では、前記変化は、小麦内胚乳における澱粉分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）の量および／または活性の減少を含み、その結果、小麦成熟粒の澱粉中でアミロース比率が増加する。別の実施形態では、前記改変は、ＳＢＥＩＩａ活性だけでなくＳＢＥＩＩｂ活性の減少も含む。小麦におけるこの２種の活性をコードする遺伝子の変異は、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂが、トウモロコシおよび米における非連鎖とは対照的に、小麦においては密接に連鎖しているという驚くべき発見によって、促進される。さらなる実施形態では、改変は、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂおよびＳＢＥＩの全３種の減少を含む。上記酵素のいずれかとの組合せで変化し得る他の澱粉生合成酵素には、澱粉シンターゼＩ（ＳＳＩ）、澱粉シンターゼＩＩ（ＳＳＩＩ）、澱粉シンターゼＩＩＩ（ＳＳＩＩＩ）、ホスホリラーゼ、またはイソアミラーゼやプルラナーゼの澱粉脱分枝酵素が挙げられる。変化は、例えば活性の増加、活性の減少、活性の局在性または発現時期の変化であってもよい。これらの酵素のいくつかにおける変化が組み合わさると、アミロース含有率以外の澱粉特性も変化することがある。一実施形態では、改変小麦は、好ましくはＳＢＥＩＩａ活性の減少を含めた、小麦内胚乳における多数の澱粉生合成酵素の活性変化を含むことにより、穀粒澱粉中のアミロース比率が増加する。さらなる実施形態では、１種または複数の澱粉生合成酵素の活性は、内胚乳以外の植物組織中で変化し、例えば、ＳＢＥＩまたはＳＢＥＩＩの活性が葉内で増加することにより、主に内胚乳での発現を意図した、ＳＢＥＩＩａ阻害分子をコードする移入遺伝子が引き起こす活性の減少を補償することがある。酵素活性の変化は、量的な増減または発現時機の変化であってもよい。澱粉合成は、ＳＢＥＩＩａの減少と組み合わさった１種または複数の澱粉生合成酵素の過剰発現によって、さらに改善し得る。このような酵素をコードする遺伝子は、多様な起源のいずれでも、例えば小麦以外の細菌源または他の起源から得られてもよく、その触媒特性の変化、例えば酵素の温度依存性の変化を起こすために改変されてもよい（例えば、ＷＯ９４／０９１４４号を参照）。
高アミロース表現型は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子またはＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂ両遺伝子の発現の部分的または完全な阻害によって、実現し得る。本明細書で使用する場合の「高アミロース」表現型または「穀粒澱粉中の高アミロース含量」などは、穀粒から得られる総澱粉が少なくとも３０％のアミロースを有することを指す。１種または複数の遺伝子の阻害程度が、小麦粒中で作られる澱粉の特性をある程度決定するであろう。改変小麦内胚乳から抽出したタンパク質に関して実行する、ある範囲の電気泳動技法のいずれによっても、ＳＢＥＩＩａおよび／またはＳＢＥＩＩｂ活性に対する改変の性質および範囲が明らかになろう。改変は、ＳＢＥＩＩａおよび／またはＳＢＥＩＩｂ活性の減少、酵素活性の完全な消失、あるいは内胚乳内でのＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他酵素の分布の変化として起こり得る。例えば、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他酵素の活性は、澱粉顆粒に結合する酵素量の低下などの、内胚乳内での酵素の分布に影響を及ぼすことによって減少し得る。このようなパターンは、ｄｕｌｌ１遺伝子座の変異体であるトウモロコシにおいて、ＳＢＥＩＩａについて認められた。このような試験を実施するには、小麦内胚乳から澱粉を抽出し、例えばＲａｈｍａｎほか、１９９５年に概説されるように、その中のタンパク質を分析してもよい。可溶性分画および澱粉顆粒分画についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロットなどの当分野で周知の技法を実行し、その結果を用いて、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他酵素に改変が起こった植物または穀粒を同定する。
澱粉生合成酵素活性の変化は、小麦植物中に１つまたは複数の遺伝的変異を導入することにより、実現し得る。すなわち、遺伝的変異は、穀粒発生中の内胚乳において、直接的または間接的に酵素活性の変化を起こし、その結果、本明細書に記載の澱粉改変を起こす。ＳＢＥＩＩａまたは他酵素の活性のレベル低下は、その酵素をコードする１種または複数の遺伝子における発現量の減少によって実現し得るもので、その発現減少は、変異、変異の組合せ、または１種もしくは複数の核酸の導入、例えば阻害分子をコードする移入遺伝子によって実現し得る。阻害分子の例には、アンチセンス、共サプレッション、リボザイムまたは二重鎖のＲＮＡ分子が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「改変すること（ａｌｔｅｒｉｎｇ）」、「増加すること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増加された（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「低下させること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「阻害された（ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）」などの用語は、比較的な用語、すなわち野生型または未改変状態との比較で考えられている。「タンパク質のレベル」とは、特定のタンパク質、例えばＳＢＥＩＩａの量を指し、例えばウェスタンブロット分析や他の免疫学的手段などの、当分野で既知の任意の手段によって測定し得る。「酵素活性のレベル」とは、酵素アッセイで測定される特定酵素の量を指す。酵素活性のレベルは、変異体において、活性の増減したタンパク質が産生される場合に変化し得るが、そのタンパク質自体の発現レベル（量）ではないことが認識されよう。反対の場合、タンパク質量は変化し得るが、その活性（単位タンパク質当たり）は同じままである。量、活性双方の低下も、例えば、その酵素をコードする遺伝子の発現が、転写段階または転写後段階で低下する場合のように可能である。ある種の実施形態では、タンパク質または活性のレベル低下は、非改変小麦の内胚乳におけるタンパク質または活性のレベルと比較して、少なくとも４０％または少なくとも６０％、あるいは少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。タンパク質もしくは酵素活性または遺伝子発現のレベル低下は、穀粒の発生における任意の時期、特に、発生途上の内胚乳において澱粉が合成されつつある実入り期の間、または成熟までの穀粒発生の全時期に起こり得る。さらなる実施形態では、ＳＢＥＩＩａまたは他酵素のレベルは、野生型と比較して少なくとも５０％内胚乳において低下する。本明細書で使用する場合の用語「野生型」は、遺伝学分野での通常の意味を有し、本明細書で教示するような改変を受けていない、小麦の栽培品種または遺伝子型を包含する。
小麦内胚乳におけるＳＢＥＩＩａなどの酵素の量または活性は、例えば免疫検出法、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイなどの、当分野で既知の任意の方法を用いて測定してもよいし、あるいは対応するｍＲＮＡのレベルをノーザンブロットハイブリッド形成分析や逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの方法によって測定してもよい。内胚乳における特定のタンパク質または酵素活性がレベル変化をした小麦植物または小麦粒は、そのタンパク質または酵素の減少レベルに基づいてスクリーニングまたは選択をしてもよいし（直接アッセイ）、あるいはアミロース比率の増加やアミロペクチン比率の減少などの小麦植物の粒の表現型、または視覚的表現型、例えばしわ型穀粒や澱粉顆粒の特性の変化に基づいて、スクリーニングまたは選択をしてもよい。本明細書で使用する場合の澱粉特性が変化した小麦植物は、当分野で既知の方法のいずれかを用いて、直接的に澱粉特性を決定するか、または、例えばその植物や穀粒の遺伝的変異の存在を間接的に検出して同定し得る。植物は、例えば小麦育種におけるなどのある小麦植物集団の一植物であってもよい。
本明細書で使用する場合の「小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子」などは、小麦中の澱粉分枝酵素ＩＩａをコードするヌクレオチド配列を指すが、その酵素は、当業者によってＳＢＥＩＩｂまたは他のタンパク質と容易に識別できる。この遺伝子は、パン小麦のＡ、ＢおよびＤゲノムがコードするものを含め、小麦中に存在する遺伝子の天然変異体、ならびに遺伝子改変の当業者が作製し得る非天然変異体を包含する。その例を表１に示す。好ましい実施形態では、小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子は、小麦中に存在するか、それから単離され、またはそれに由来してもよい核酸分子であって、配列番号１に示すｗＳＢＥＩＩａ−Ｄ１遺伝子のコード領域との同一性が少なくとも８０％である配列を有するヌクレオチドを含む、核酸分子を指す。同様に、本明細書で使用する場合の「小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子」は、小麦中の澱粉分枝酵素ＩＩｂをコードするヌクレオチド配列を指す。Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍからの小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子の部分配列（ｗｂｅ２ｂゲノム性）を図２に示す（配列番号２）。小麦ＳＢＥＩＩｂのｃＤＮＡ配列は図９に示す。
同様にして、本明細書で使用する場合の「小麦ＳＳＩＩａ遺伝子」などは、小麦中の澱粉シンターゼＩＩａをコードするヌクレオチド配列を指すが、その酵素は、当業者によって他の澱粉シンターゼまたは他のタンパク質と容易に識別できる。この遺伝子は、パン小麦のＡ、ＢおよびＤゲノムがコードするものを含め、小麦中に存在する遺伝子の天然変異体、ならびに遺伝子改変の当業者が作製し得る非天然変異体を包含する。その例は、ＷＯ ００／６６７４５号に報告されている。好ましい実施形態では、小麦ＳＳＩＩａ遺伝子は、小麦中に存在するか、それから単離され、またはそれに由来してもよい核酸分子であって、ＷＯ ００／６６７４５号に示されているｗＳＳＩＩａ遺伝子のコード領域との同一性が少なくとも８０％である配列を有するヌクレオチドを含む、核酸分子を指す。
ＳＢＥ活性は、直接酵素アッセイにより、例えばホスホリラーゼ刺激アッセイ（ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ、１９７８年）により測定し得る。このアッセイでは、グルコース １−リン酸のメタノール不溶性ポリマー（α−Ｄ−グルカン）へのホスホリラーゼａによる取り込みのＳＢＥによる刺激を測定する。ＳＢＥ活性は、ヨウ素染色アッセイにより測定でき、このアッセイでは、グルカンポリマーの分枝から生じる、グルカン−ポリヨウ素複合体の吸光度の減少を測定する。ＳＢＥ活性は、イソアミラーゼ消化の後、基質としての還元アミロースからの還元性末端の生成量を測定する、分枝結合アッセイによってもアッセイできる（Ｔａｋｅｄａほか、１９９３年ａ）。好ましくは、この活性は、ＳＢＥＩ活性またはＳＢＥＩＩｂ活性のない状態で測定される。ＳＢＥのアイソフォームは異なる基質特異性を示し、例えば、ＳＢＥＩはより高い活性をアミロースの分枝に示すが、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂは、より高い分枝率をアミロペクチン基質で示す。これらのアイソフォームは、移動を受けるグルカン鎖の長さに基づいても識別し得る。ＳＢＥタンパク質は、本明細書に記載の抗体などの特異抗体を用いても測定し得る。ＳＢＥＩＩ活性は、発生途上の内胚乳における粒発生中に、あるいはそのタンパク質が、同等であるが、未変化の粒中になお存在している成熟粒において測定してもよく、免疫学的方法によってアッセイできる。澱粉シンターゼ活性は、内胚乳からタンパク質を抽出することにより測定し、実施例１に記載のようにアッセイし得る。
一実施形態では、改変澱粉を有する改変小麦は、粒澱粉中に少なくとも３０％までの増加した比率のアミロースを有する。普通６倍体およびデュラム小麦では、澱粉中のアミロース比率は約１８〜約３０％（ｗ／ｗ）の範囲に入る。この実施形態では、改変小麦は１つまたは複数の遺伝的変異を含み、その変異が少なくとも３０％のアミロースを含む粒内澱粉を生じる。本明細書で定義する場合の澱粉中のアミロース比率は、重量／重量（ｗ／ｗ）基準、すなわち粒からの総澱粉重量のパーセントで表したアミロース重量である。さらなる実施形態では、澱粉中のアミロース比率は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である（各々ｗ／ｗ）。本発明のさらなる実施形態では、本法は、少なくとも８０％または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のアミロース比率をもたらす。
本発明で使用するための本明細書に記載の小麦植物には、改変を導入した親小麦植物の遺伝子型および／または表現型上の所望特性を有する子孫植物が含まれる。小麦植物は、前記した小麦植物と交配できる他の遺伝的背景または他の種における、遺伝的な変異または変異も包含する。改変された親植物は、より望ましい遺伝的背景を含んだ植物と交配してもよい。初回交配の後、適正数の戻し交配を行うことにより、さほど望ましくない背景を除いてもよい。所望の遺伝的背景には、商業的収量をもたらす遺伝子の適切な組合せ、および農業経済的性能や非生物的ストレス耐性などの他の特性が含まれる。遺伝的背景には、他の改変澱粉生合成または改変遺伝子、例えば、その原因遺伝子不明のしわ型内胚乳を有する他の小麦系からの遺伝子も含んでよかろう。小麦の所望の遺伝的背景は、農業経済的収量および他の特性に関する考慮を含んでもよい。このような特性には、冬型、春型のいずれの小麦が望ましいか、農業経済的性能、病気耐性、非生物的ストレス耐性などが挙げられよう。オーストラリアでは、改変澱粉形質をＢａｘｔｅｒ、Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｊａｎｚ、Ｆｒａｍｅ、Ｒｏｓｅｌｌａ、Ｃａｄｏｕｘ、Ｄｉａｍｏｎｄｂｉｒｄまたは他の汎用栽培変種などの小麦栽培品種に交配させることが望まれよう。ここに示した例はオーストラリアの生産地域に特有であり、他の栽培地域には他の変種が適当であろう。本発明の小麦変種は、少なくともいくつかの栽培地域で、対応する野生型変種の８０％以上、より好ましくは９０％以上、一層より好ましくは９５％以上の収量をもたらすことが好ましい。その収量は、管理された圃場試験で容易に測定することができる。
一実施形態では、改変小麦植物は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子が染色体２Ａの長腕に欠如しているか、または染色体２Ａの長腕上にあるＳＢＥＩＩａ遺伝子が、その粒の内胚乳におけるＳＢＥＩＩａ酵素活性レベルを野生型粒に比して低下させる変異を含むような、変異を含んでいる。登録数２４００点の小麦を広範にスクリーニングしたにも関わらず、本発明者等はこのような天然植物を見出せず、したがって、２ＡＬ上の機能的ＳＢＥＩＩａ遺伝子の保持に対する選択が、自然界では起こっているらしきことが示唆された。しかし、このような植物は、変異誘発後に産生し、特定することができた。このような植物は非トランスジェニックであり、それは一部の市場では望ましい。このような植物は、パン小麦、デュラム小麦または他の小麦であってもよい。好ましい実施形態では、小麦植物は、ＳＢＥＩＩａ遺伝子の少なくとも一部の欠失を含み、その欠失は２ＡＬ染色体上でＳＢＥＩＩｂ遺伝子の少なくとも一部まで延在する場合がある。当分野で理解されているように、パン小麦などの６倍体小麦は、通常Ａ、ＢおよびＤゲノムと称する３つのゲノムを含む一方、デュラム小麦などの４倍体小麦は、通常ＡおよびＢゲノムと称する２つのゲノムを含む。各ゲノムは、当分野で周知のように、減数分裂中に細胞学的方法により観察し、したがって特定し得る７対の染色体を含む。各染色体は動原体を有し、第２染色体ではそれが非対称に配置されている。そのため、第２染色体の両腕は、「短腕」および「長腕」と呼称される。本明細書では、「第２Ａ染色体の長腕」は、その用語の標準的意味に従って、動原体と長腕沿いの先端との間にあるその第２Ａ染色体の領域と定義する。「第２Ｂ染色体の長腕」および「第２Ｄ染色体の長腕」という用語は、その長腕が、小麦の各々ＢまたはＤゲノムの第２染色体に関することを別とすれば、同様にして定義される。
本発明者等は、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ遺伝子が、小麦中で第２染色体上に共に存在することを見出した。特定の実施形態では、小麦植物は２ＡＬの過半量（＞５０％）を含み、その染色体の腕は、少なくともＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異を含む。すなわち、染色体２ＡＬは、本質的に存在しており、Ａゲノムの少なくともＳＢＥＩＩａ遺伝子中に変異を含む。２ＡＬの存在は、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法などの細胞学的技法により、または２ＡＬ特異的分子マーカーの使用により決定し得る。好ましい実施形態では、小麦植物は前記変異に対してホモ接合である。変異はヌル変異であってもよい。変異は欠失変異であってもよい。
改変小麦植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであってもよい。本発明は、小麦植物から産生される穀粒、および所望の特性を有する植物を作製するために使用できる、小麦植物の任意の繁殖用材料、例えば培養した組織または細胞にも及ぶ。本発明は、明らかに、このような小麦植物、またはこのような植物により産生される穀粒を作製または特定する方法に及んでいる。
本明細書に記載の改変小麦植物、特に植物から得られる穀粒、またはその穀粒から得られる改変小麦澱粉を含んだ生成物は、動物、好ましくは哺乳動物、特に人間による消費、またはそのような対象への投与を目的とする食物、飲料または医薬製剤の製造に使用してもよい。食物、飲料または医薬製剤は、改変小麦粒またはそれ由来の改変澱粉を含んだ生成物を含む。
改変穀粒
本発明は、本明細書に記載の小麦植物から得られる、改変小麦粒またはそれ由来の改変澱粉で製造した食物、飲料または医薬製剤も提供する。本明細書では、穀粒は、本質的に成熟した穀粒と定義する。これには、商業的施設で収穫した穀粒も含まれる。一実施形態では、改変澱粉は、少なくとも部分的には、小麦粒の内胚乳の発生中にＳＢＥＩＩａ活性が低下した所産である。穀粒は、総澱粉のパーセントとして増加した比率のアミロースを含み得る。これは、野生型植物の穀粒と比較した際、澱粉中でのアミロペクチン比率の減少として決定してもよい。野生型小麦澱粉は、約１８〜３０％のアミロースおよび７０〜８０％のアミロペクチンを有する。本発明に使用するための穀粒は、少なくとも３０％のアミロースを含み、好ましくは少なくとも５０％（ｗ／ｗ）のアミロースを含んだ澱粉を含む。さらなる実施形態では、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂ双方の活性が、内胚乳の発生中に減少する。アミロース含量の増加は、光学顕微鏡下で観察した際の異常な澱粉顆粒形態もしくは顆粒の複屈折の減少、または当分野で既知の他の方法により証明し得る。特定の実施形態では、穀粒の澱粉中アミロース比率は、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬａｉｇｎｅｌｅｔ（１９８３年）の方法などの分光法とし得るヨウ素滴定法により、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、例えばＢａｔｅｙおよびＣｕｒｔｉｎ、１９９６年）により測定される。
穀粒は、しわ型でも非しわ型でもよいが、好ましくは非しわ表現型を有する。本明細書で使用する場合の「非しわ型」は、過半数の穀粒、好ましくは個々の穀粒の少なくとも９０％が、膨らんだ、または充満した表現型を示す場合と定義する。これは、普通、正常または準正常なレベルの澱粉蓄積に伴う。対照的に、本明細書で使用する場合の「しわ型」は、過半数の穀粒、特に穀粒の少なくとも９０％の澱粉蓄積が、減少していることを指す。各々野生型穀粒と比較して、ややしわ型の穀粒とは、平均澱粉含量の少なくとも３０％の減少を指し、中程度のしわ型穀粒とは、平均澱粉含量の少なくとも５０％の減少を指し、高度のしわ型穀粒とは、平均澱粉含量の少なくとも７０％の減少を指す。しわの程度は、成熟粒重量のパーセントとして澱粉含有率によって測定してもよい。改変されていない圃場栽培小麦粒が約６５％の澱粉含有率を有するのに対し、しわ型の穀粒の澱粉含有率は、５０％未満に減少する。
さらなる実施形態では、穀粒は、少なくとも３６ｍｇまたは４０ｍｇの平均重量を有する。穀粒の平均重量は、その穀粒バッチの代表試料となる既知数の穀粒の重量を測定し、その全重量を穀粒数で割ることによって決定される。澱粉含量、平均重量、非しわ型表現型などの野生型レベルに近い穀粒の特性は、その穀粒の商業生産に望ましいことは認識されよう。さらなる実施形態では、穀粒の澱粉含有率は、少なくとも約２５％、３５％、４５％、または５５％から６５％（ｗ／ｗ）である。商業栽培されている野生型小麦は、その栽培品種にある程度依存するが、普通５５〜６５％の範囲の澱粉含有率を有する。あるいは、本発明の穀粒は、同等であるが、非改変の小麦からの穀粒に対して、少なくとも９０％の澱粉含有率を有する。野生型より低い澱粉含有率は、恐らくアミロペクチン含量の減少の結果である。低澱粉含有率であっても、高アミロース製品の価値が相対的に高いため、穀粒は、商業的な食品生産のためになお有用となり得る。他の望ましい特性には、穀粒の製粉能力、特に粒子硬度が含まれる。小麦植物の価値を上げそうな別の態様は、穀粒からの澱粉抽出度であり、抽出率が高いほど有用性が増す。粒形状も植物の商業的有用性に作用できる別の特徴であり、すなわち粒形状は、穀粒を製粉できる容易度などに作用できる。例えば、細長い粒形態では製粉および加工が困難になり得る。
穀粒に膨らみがあるほど、収量増加の実現上望ましいと思われ、高アミロース含量の澱粉生産、あるいは鎖長分布の変化した澱粉などの本発明の特定の利益が、実現し得よう。したがって、穀粒は、好ましくは非しわ型表現型を有する。しかし、本発明の他の態様は、膨らみの少ない穀粒ほど、それだけ良好に実現し得る。したがって、アリューロン層または胚またはタンパク質の澱粉に対する比率は、膨らみの少ない穀粒中ほど高くなり、それにより、アリューロン層またはタンパク質という有益成分が高まった小麦粉または他の製品が得られる場合がある。したがって、高アリューロン層製品では、葉酸などの特定のビタミンが増加し、またはカルシウムなどの特定のミネラルが増加し、それが難消化性澱粉の含量増加と相俟って、大腸におけるミネラル取込量の向上などの相乗作用が得られよう。
本発明は、穀粒から、またはそれを用いて作製される粉、食事、練り粉または他の製品の使用も提供する。このようなものは、未加工でも、例えば分別や漂白により、加工してもよい。本発明はさらに、本発明の小麦植物から得られる、食品製造に有用な小麦粒も提供する。その上、本発明は、他の方法で加工した穀粒であって、製粉、挽き割り、ロール、精白、粗挽きもしくは荒挽き、または例えばクスクスとしてパーボイル（ポレンタ）を施したとも思われる穀粒も包含する。
改変澱粉
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の小麦植物の穀粒から得られる改変小麦澱粉であって、アミロース比率が増加し、アミロペクチン比率が減少した澱粉を用いて製造した食物、飲料または医薬製剤を提供する。本明細書で使用する場合、用語「澱粉」とは、穀粒の総澱粉、またはアミロース対アミロペクチン比を変える何らかの分別をする前の澱粉を指す。澱粉は、少なくとも部分的に精製されていてもよく、すなわち、穀粒の少なくとも１つの他成分から分離されたものである。本明細書で使用する場合、「実質的に精製された澱粉」とは、その組成物の乾重量の少なくとも９５％（ｗ／ｗ）が澱粉であることを意味する。精製澱粉は、製粉工程、例えば、澱粉をタンパク質、油および繊維から分離することを含む湿式製粉工程により、穀粒から得てもよい。製粉工程の初期生成物は、澱粉顆粒の混合物または組成物であり、したがって本発明は、本明細書に記載の改変澱粉を含むこのような顆粒を包含する。
さらなる実施形態では、改変澱粉は、例えば、ゲル化温度の増減、ゲル化中またはその後の膨潤特性の変化、粘度変化、アミロペクチンの鎖長分布の変化、またはこれらの組合せなどの変化した物理特性を有する。ゲル化は、過剰の水中で澱粉顆粒内の分子秩序が熱で崩壊（破壊）し、顆粒膨潤、結晶子溶融、複屈折減少、粘度発現、澱粉可溶化などの特性変化が同時および不可逆に起こることである。トウモロコシのａｅ（アミロース増量）変異体からの高アミロース澱粉は、通常のトウモロコシより高いゲル化温度を示した（Ｆｕｗａほか、１９９９年、Ｋｒｕｅｇｅｒほか、１９８７年）。それに対し、澱粉シンターゼＩＩａ活性を欠く大麦ｓｅｘ６変異体からの澱粉は、より低いゲル化温度を有し、ゲル化ピークのエンタルピーが、対照植物からの澱粉と比較して減少した（Ｍｏｒｅｌｌほか、２００３年）。野生型小麦澱粉のゲル化温度は、示差走査熱量計で測定した場合、開始温度と定義される第１ピーク温度が通常約６１℃（Ｒａｈｍａｎほか、２０００年）である。ゲル化温度の増減は、ゲル化第１ピーク、第２ピークまたはその双方に表れる場合がある。例えばゲル化エンタルピーなどの澱粉の１つまたは複数の特性は、変化しないこともある。澱粉は、ゲル化温度の増減、好ましくはゲル化温度の増加を示し得る。例えば、本発明者等は、ＳＢＥＩＩａ減量小麦から得た澱粉はゲル化温度の増加を示すのに対し、ＳＳＩＩａ減量小麦の澱粉はゲル化温度の減少を示すことを認めた。示差走査熱量計で測定した場合のゲル化第１ピーク（頂点）温度は、野生型からの対応澱粉の第１ピーク温度と比較して、少なくとも３℃または５℃、好ましくは少なくとも７℃または８℃、より好ましくは少なくとも１０℃増加または減少し得る。特定の実施形態では、その増減は３℃〜１２℃の範囲である。特に注目すべきことは、ゲル化温度が、第１ピークの開始温度の減少とピーク頂点温度の増加との組合せとなり得ることである。前記実施形態と相互に排他的ではない別の実施形態において、澱粉では、ＤＳＣで測定した場合、第１ピークのゲル化温度は変化するが、アミロース−脂質解離に相当する第２ピーク温度は実質的に変化しないことを示す。さらなる実施形態では、澱粉は、対応する野生型小麦澱粉と比較して、例えば少なくとも２５％または少なくとも４０％の減少などの、ゲル化中のエンタルピー減少を示す。
澱粉の特性は、野生型澱粉と比較した、過剰の加熱水中での膨潤率によっても決定し得る。膨潤体積は、澱粉、粉のいずれかを過剰の水と混合し、高温に、通常は９０℃を超えるまで加熱することにより、通常測定される。次いで、その試料を遠心分離により集め、沈殿物の質量を試料の乾重量で割ったものとして、膨潤体積を表す。調製食品、特に含水調製食品の澱粉含量を増加させることが望ましい場合、低膨潤特性が有用である。
本発明の選択形小麦の澱粉構造は、小麦から分離した通常の澱粉と比較して、結晶化度が低下している点でも異なり得る。澱粉の結晶化度低下は、官能特性の増強とも関係すると考えられ、より滑らかな口当たりに寄与している。したがって、澱粉は、１種または複数のアミロペクチンシンターゼの活性度低下の結果として起こる、結晶化度の低下をさらに示してもよい。結晶化度は、通常、Ｘ線結晶解析により調べられる。
変化したアミロペクチン構造の尺度の一つは、澱粉の鎖長分布または重合度である。鎖長分布は、イソアミラーゼ脱分枝の後、蛍光プローブ炭化水素電気泳動（ＦＡＣＥ）を用いて決定し得る。本発明の澱粉のアミロペクチンは、５〜６０の範囲の鎖長分布を有し得るもので、脱分枝時の野生型植物澱粉の鎖長分布より大きい。澱粉の鎖長が長くなると、それに応じて分枝頻度も減少することになろう。したがって、澱粉は、なお存在するアミロペクチン中でより長いアミロペクチン鎖長の分布も有し得る。
別の実施形態では、澱粉は、特定の物理特性で示される変化構造を有する、増加量の難消化性澱粉を含む。このような特性は、澱粉顆粒の形態変化、相当量の澱粉結合脂質の存在、結晶化度の変化、アミロペクチン鎖長分布の変化、またはこれらの組合せに起因し得る、消化酵素に対する物理的接近不能を包含し得る。アミロースの高比率も難消化性澱粉の含量に寄与する。
本発明は、好ましくは増加した量の難消化性澱粉との組合せで、増加した量の食物繊維を含む、例示小麦植物の穀粒由来の澱粉も提供する。この増加も、少なくとも部分的には高アミロース含有率の結果である。
本発明は、明らかに本明細書に記載の小麦澱粉を製造する方法に及ぶ。一実施形態では、本法は、本明細書に記載の小麦粒を得るステップおよびその粒から澱粉を抽出するステップを含む。小麦粒は、本明細書に記載の小麦植物を栽培し、その穀粒を収穫することにより、あるいは穀粒の生産者または穀粒の輸入業者から得てもよい。
食物、飲料および医薬品
本発明は、好ましくはＳＢＥＩＩａ活性の低下した小麦植物から得られる、本明細書に記載の改変小麦または改変澱粉で製造される食物、飲料および医薬製剤も包含する。一実施形態では、小麦植物では、ＳＢＥＩＩａ以外の少なくとも１種の澱粉生合成酵素が変化、好ましくは減少している。ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ活性の低下した植物は、ＳＢＥＩＩａ活性の低下した植物とＳＢＥＩＩｂ活性の低下した植物との交配、またはＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂ両遺伝子の発現を阻害する分子をコードする移入遺伝子の導入によって作製し得る。本明細書で明らかなように、小麦中でのＳＢＥＩＩａ遺伝子とＳＢＥＩＩｂ遺伝子との密接な連鎖のために、両活性の低下した植物は、小麦ゲノムの１つがコードするＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂアイソフォームを欠いた変種を特定し、このような変種の交配により、少なくとも２つのゲノムがコードするアイソフォームの減少した植物を作製することによっても、作製し得る。このような食物製造には、粉、練り粉、または商業的食品製造の成分となりそうな他の製品の製造が含まれよう。
澱粉は、大部分の人間の食事における主要な炭水化物源であり、本発明の穀粒およびそれ由来の製品は、食物を調製するために使用できる。その食物は、人間または動物、特に哺乳動物により、例えば、家畜生産中に、またはペットフード中で消費されてもよい。本明細書で使用する場合、「哺乳類」または「哺乳類の」とは、哺乳綱の任意の動物を指す。改変小麦植物由来の穀粒は、食品加工操作で容易に使用でき、したがって本発明は、製粉、挽き割り、粗挽き、精白もしくはロールをした穀粒、または粉を含め、上記した小麦植物の加工粒もしくは全粒から得た製品を包含する。次いで、このような製品は、多様な食品、例えば、パン、ケーキ、ビスケットなどの澱粉質製品、または増粘剤や結合剤などの食品添加物において、あるいは飲物、ヌードル、パスタまたは即席スープを作るために使用してもよい。本発明の穀粒または穀粒由来の製品は、朝食用シリアル中で、または押出し製品として特に望ましい。本発明の高アミロース澱粉は、製菓産業で有用な高強度ゲルの形成、または成形および硬化時間の短縮のためにも使用できる。澱粉は、例えば、たっぷりの油中で揚げたポテトや他の食物の吸油を減らすための衣としても使用できる。
食物繊維
本明細書では、食物繊維とは、健常者の小腸で吸収されずに大腸に移動する炭水化物および炭水化物消化物である。これには、難消化性澱粉、β−グルカン、ならびに他の可溶性および不溶性炭水化物ポリマーが含まれる。それは、大腸中で常在ミクロフローラにより、少なくとも部分的に発酵できるような部分の炭水化物を含むと考えられている。
本発明の澱粉は、相対的に高含量の食物繊維、より詳細にはアミロースを含有するのが好ましい。本発明の穀粒の食物繊維含量は、内胚乳のアミロース含有率の増加だけから生じる場合もあれば、そうでない場合もある。
本発明の態様は、高含量の食物繊維と相俟って、アリューロン層および胚の組合せからも生じよう。具体的には、これは、穀粒中に存在するアリューロンまたは胚の含有率が増加すると生じ得る。小麦粒がややしわ型である場合、内胚乳の存在量が減少し、アリューロン層および胚の存在量は相対的に増加する。したがって、その小麦には、相対的に高含量のある種の有益な要素またはビタミンが、増加した難消化性澱粉と共に存在する。このような要素には、二価陽イオン（生体利用可能なＣａ＋＋を含めて）および葉酸などのビタミンまたはトコフェロールやトコトリエノールなどの酸化防止剤が含まれる。製粉生成物の特定の一形態は、アリューロン層が製粉生成物中に含まれる形態であろう。特定の製粉工程を行うことにより、製粉生成物中のアリューロン層が増量されよう。したがって、アリューロン層および胚を含めるように、製粉または他の加工をした穀粒に由来する任意の製品は、別の供給源からこのような要素を添加することを必要とせずに、追加の栄養的利点を有することになろう。
難消化性澱粉
難消化性澱粉とは、健常者の小腸で吸収されずに大腸中に移動する、澱粉および澱粉消化物の総称と定義される。したがって、難消化性澱粉は、小腸中で消化、吸収される生成物を除外する。難消化性澱粉には、物理的接近不能澱粉（ＲＳ１形）、難消化性顆粒（ＲＳ２形）、老化澱粉（ＲＳ３形）および化学修飾澱粉（ＲＳ４形）が含まれる。本発明の澱粉の改変澱粉構造および特に高アミロース含量のため、食物中で消費する際、難消化性澱粉が増加する。この澱粉は、消化するにはやや接近し難いＲＳ１形であってもよい。Ｖ複合体結晶化度で測定した場合の澱粉−脂質会合も、難消化性澱粉の含量に寄与するようである。食物または他の製品中に存在する難消化性澱粉の含量は、実施例１３に記載のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで、または実施例１６に記載のようにｉｎ ｖｉｖｏで測定するのが好ましい。
本発明の一利点は、特別な栄養的利点のある製品が提供されることであり、しかも小麦粒の澱粉または他の成分を変性する必要なしに、その製品が提供されることであると理解されよう。しかし、その穀粒の澱粉または他の成分を変性することが望ましいこともあり、本発明は、そのような変性成分を包含する。変性の方法は周知のことであり、従来法による澱粉または他の成分の抽出、および難消化性形態を増加させるための澱粉変性を含む。澱粉は、熱および／または水分による処理、物理処理（例えば、ボールミル処理）、酵素処理（例えば、αまたはβ−アミラーゼ、プルラナーゼなどを用いる）、化学加水分解（液体試薬または気体試薬を用いる湿式または乾式）、酸化、二官能性試薬による交差結合（例えば、トリメタリン酸ナトリウム、オキシ塩化リン）、エステル化またはカルボキシメチル化によって、変性し得る。
血糖指数
血糖指数（ＧＩ）は、澱粉を含む食物の消化速度に関係しており、血糖濃度の変動に対して、試験食物の効果と白パンまたはグルコースの効果とを比較したものである。血糖指数は、食後の血清糖濃度および血糖恒常性を得るためのインスリン要求に対する、対象食物の効果見込みの尺度である。本発明の食物が提供する重要な一特性は、血糖指数の減少である。さらに、食物は、低い最終消化率を有し、その結果相対的に低キロジュールとなり得るものであり、または低エネルギー密度食物と表現してもよい。低カロリー製品は、製粉した小麦粒から製造される粉を含有することに基づくであろう。このような食物は、満腹、腸健康の促進、グルコースおよび脂質の食後血清濃度の減少、ならびに低代謝エネルギー食品の提供という作用を有し得る。
パン
パンにおいては、粉または全粒形態の改変小麦澱粉は、非改変の粉または全粒を１０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは少なくとも３０％、一層より好ましくは非改変の粉または全粒を少なくとも５０％代替し得る。したがって、その配合は、例えば、粉９０部、改変小麦澱粉１０部、脂肪２部、塩２部、改良剤１部、酵母２．５部となろう。パンの製造は、迅速パン生地法、または当業者に公知の他の技法によってでもよい。
パスタ製品
改変小麦澱粉は、澱粉質系パスタ製品中に取り入れてもよい。パスタ組成物に用いる改変小麦澱粉の量は、澱粉質材料の全重量に対して１０〜４０％（ｗ／ｗ）、またはそれより高い範囲、より特別には１５〜３５％の範囲とし得る。適当な他の澱粉質材料は、当業者によって容易に選択されよう。
他の材料、例えば乾燥卵もしくは液卵（黄身、白身もしくは両方）、または乳タンパクもしくは魚タンパクなどの高タンパク物質も、その組成物に添加してもよい。ビタミン、ミネラル、カルシウム塩、アミノ酸、リン酸水素二ナトリウムなどの緩衝剤、シーズニング、ガムまたはグリセリルモノステアレートも添加してもよい。
パスタの調製では、その成分が均一に分散するまで、まず乾式混合してもよい。次いで、その乾式混合物に攪拌を続けながら水を加えると、最終的に、シート状にするか、押出しをするのに十分な可塑性を示すが、凝集するのに十分な引き締まりを示す練り粉が得られる。このパスタ配合物は、乾燥澱粉質材料約７５部および水約２５部を通常含んでいよう。このような比率は、用いる粉の種類、グルテン品質、タンパク質含量、粉の初期水分、粉の粒径などの要因に応じて変化するであろう。このパスタは、当分野で公知の方法を用いて、成形し、次いで好ましくは澱粉成分をゲル化していない形態で乾燥してもよい。
医薬品
経口送達用組成物は、例えば錠剤、トローチ剤、水性または油性懸濁液、顆粒、散剤、乳濁液、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、シロップ、またはエリキシル剤の形態であってもよい。経口投与組成物は、１種または複数の任意選択の作用物質、例えば、フルクトース、アスパルテーム、サッカリンなどの甘味剤、はっか油、ウィンターグリーン油、チェリーなどの香味剤、着色剤および保存剤を含むことにより、医薬として口当たりのよい製剤を得てもよい。その上、錠剤または丸剤形態の場合、組成物をコーティングすることにより、消化管中での崩壊および吸収を遅らせ、その結果長期間にわたり持続作用を示してもよい。浸透活性な推進化合物を囲む選択透過膜も、本発明の経口投与化合物にとって適切である。このような後半の基台（ｐｌａｔｆｏｒｍ）においては、カプセルを囲む環境からの液体が、推進化合物により吸収され、その化合物は膨潤して、作用物質または作用物質組成物を開口部を介して押しのける。このような送達基台（ｐｌａｔｆｏｒｍ）は、即時放出製剤のスパイク状プロファイルとは反対に、本質的にゼロ次の送達プロファイルを示すことができる。グリセロールモノステアレートやグリセロールステアレートなどの時間遅延物質も使用してもよい。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な媒体を含むことができる。このような媒体は、好ましくは医薬等級である。
遺伝子活性の減少法
ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他の澱粉生合成もしくは修飾遺伝子の発現および／または活性は、小麦植物中に１つまたは複数の遺伝的変異を導入することによって、変化し得る。本明細書で使用する場合、「遺伝的変異」とは、小麦植物のゲノムにおける任意の遺伝的変化を意味しており、その変化が、この文脈では対象遺伝子の発現または活性に影響する。遺伝的変異には、点変異、挿入、置換、反転、複製、転位、好ましくは欠失などの変異、および１種または複数の移入遺伝子のゲノム中への導入が含まれる。
本明細書で使用する場合の「核酸分子」および「核酸配列」という句は、一本鎖または二本鎖でもよいヌクレオチドのポリマーを指す。それには、例えば、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡなどのＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せが含まれる。小麦細胞に導入するために、核酸分子は、送達または安定性を改善するために化学修飾をしてもよく、あるいはウィルスベクターなどのベクターの一部として保護してもよい。核酸分子は、クローニング法によって得てもよく、または当分野で周知の技法によって合成してもよい。核酸分子は、コード鎖もしくは非コード鎖（アンチセンス）、または例えば、逆方向反復構築体におけるようなこれらの組合せを含んでもよい。遺伝子に「対応する」核酸配列に関しては、「対応する」という用語は、そのヌクレオチド配列が、基準遺伝子またはその指示部と同じヌクレオチド配列を有し、または通常のワトソン−クリック塩基対形成においてまったく相補的なヌクレオチド配列を有し、またはこのような配列のＲＮＡ等価物、例えばｍＲＮＡであり、またはその遺伝子のｍＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡであるような、ヌクレオチド配列の関係を指す。
本明細書では、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの標準的１文字略語を用いて、５'から３'方向の一本鎖配列により提示されている。「相補的」とは、塩基対形成によってアニーリングする２つの一本鎖核酸分子間または配列間の関係を示す。例えば、５'−ＧＡＣＴ−３'はその相補体５'−ＡＧＴＣ−３'と対を形成する。「相同」または「相同の」とは、この文脈によれば、２種以上のヌクレオチド配列または２種以上のポリペプチド配列間の配列類似性または同一性を指す。ヌクレオチド配列に適用した場合の「同一率（％）」とは、標準化アルゴリズムを用いて整列させた２種のヌクレオチド配列間のヌクレオチド一致率を指すが、そのようなアルゴリズムは、例えば、全米バイオテクノロジー情報センターからインターネット上のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手できるＣＬＵＳＴＡＬ ＶアルゴリズムまたはＢｌａｓｔｎもしくはＢＬＡＳＴ ２配列プログラムであって、好ましくはデフォルトパラメーターに設定されているものである。同様に、「同一率（％）」がポリペプチド配列を指すこともある。
ＳＢＥＩＩａ、ＳＳＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂもしくは他の澱粉生合成遺伝子を含む「遺伝子」、またはアンチセンス、共抑制、リボザイム、二重鎖ＲＮＡ分子などをコードする遺伝子に関する本明細書での言及は、できる限り広い文脈で理解すべきであり、プロモーター、転写ターミネーターすなわちポリアデニル化配列などの調節領域と結合した転写領域を有する古典的ゲノム遺伝子を包含する。転写領域には、転写されるが翻訳されない配列（非翻訳配列、ＵＴＲ）が含まれ、場合によっては、タンパク質コード領域、もしくは成熟ＲＮＡを形成するためにスプライシングにより除外されるイントロン、またはこれらの任意の組合せが含まれてもよい。「遺伝子」には、エキソンに対応したｃＤＮＡから得られる形態、およびＲＮＡゲノム上に見出されるようなＲＮＡ遺伝子が含まれる。「遺伝子」という用語は、機能的産物の全部または一部をコードする合成分子または融合分子を記述するためにも使用される。
細胞中、好ましくは小麦細胞中に存在するとき、「遺伝子」は、ＲＮＡまたはポリペプチドの場合がある、「生物活性」分子または「遺伝子産物」の「発現」を誘導する。この過程は、最も普遍的には、ＲＮＡを産生する転写およびタンパク質を産生する翻訳によりなされる。このような産物は、細胞中でその後修飾を受けることがある。ＲＮＡは、例えばポリアデニル化、スプライシング、キャッピング、ヌクレオチド２１〜２３個の断片へのダイシング、または核からの搬出によって、あるいはタンパク質との共役結合または非共役結合的相互作用によって、修飾を受けることがある。タンパク質は、例えばリン酸化、グリコシル化または脂質化によって、修飾を受けることがある。こうした過程はすべて、本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現」という用語などによって包含される。
本明細書で使用する場合、「小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子」および「小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子」という用語、ならびに関連用語は、小麦から同定された遺伝子で、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ酵素をコードする各遺伝子、および他の小麦変種中に存在する相同遺伝子を指す。このような遺伝子には、それだけに限らないが、表１に列挙した遺伝子配列が含まれる。様々な小麦変種に由来するＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ遺伝子の配列には、天然の変異があることは理解されよう。このような相同遺伝子は、当業者によって容易に認識可能である。相同なＳＢＥＩＩａ遺伝子またはタンパク質間の配列同一性の程度は、少なくとも８０％であると考えられており、ＳＢＥＩＩｂ遺伝子またはタンパク質についても同様である。類似の定義は、「小麦ＳＳＩＩａ遺伝子」などにも当てはまる。
本発明に使用する遺伝子は、標準的な組換え技法により、天然のＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他の澱粉生合成遺伝子から誘導してもよい。本明細書で使用する場合、「組換え核酸分子」または類似用語は、天然には存在しない配列を指し、または、２個以上の離れていた配列断片の人工的組合せにより作られる配列を有する。この人工的組合せは、化学合成によって、またはより普遍的には、核酸の孤立断片同士の人工的操作、例えば当分野で周知の遺伝子操作法によって形成し得る。「組換え」という用語は、核酸の一部の付加、置換または欠失だけで改変された核酸を包含する。組換え核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結された核酸配列を含み得ることが多い。このような組換え核酸は、例えば細胞の形質転換に使用されるベクターの一部をなしてもよい。
一般に、遺伝子は、変異誘発を受けることにより、例えばコドン改変などの、単一または多重のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を生じ得る。このような遺伝子のヌクレオチド挿入誘導体は、単一または多重ヌクレオチドの５'および３'末端融合ならびに配列内部挿入を含む。ヌクレオチド挿入配列変異体は、ヌクレオチド配列の所定部位に１個または複数のヌクレオチドが導入されているものであるが、生成した産物の適当なスクリーニングによってランダム挿入も可能である。欠失変異体は、配列から１個または複数のヌクレオチドが除去されていることを特徴とする。置換ヌクレオチド変異体は、その配列中少なくとも１個のヌクレオチドが除去されており、別のヌクレオチドがその場所に挿入されているものである。このような置換は、そのコドンが規定するアミノ酸が置換で変化しないため「サイレント」の場合がある。あるいは、保存的置換は、１種のアミノ酸を作用類似の別のアミノ酸に変更するように設計される。典型的な置換は、次表に従ってなされる置換である。
保存的なアミノ酸置換に適する残基
元の残基 置換例
Ａｌａ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｇｌｎ；Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ；Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
移入遺伝子
ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他の澱粉生合成もしくは修飾遺伝子の発現および／または活性は、１種または複数の移入遺伝子を小麦植物に導入することによって変更し得る。本明細書で言及する場合の「移入遺伝子」は、生物工学分野での通常の意味を有しており、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術により産生または変更され、しかも対象とする生物または細胞、好ましくは小麦細胞中に導入された遺伝子配列を包含する。移入遺伝子は、生物または細胞由来の遺伝子配列、例えばアンチセンス配列を包含し得る。移入遺伝子は、通常、前記生物または細胞に由来しない外因性核酸を含む。「トランスジェニック」とは、移入遺伝子、あるいはその生物もしくは細胞またはその前駆体に導入された遺伝子配列を含んだ、生物または細胞を指す。「非トランスジェニック」とは、ゲノム中に移入遺伝子がまったく存在しないことを指す。移入遺伝子は、好ましくは、安定な遺伝のために生物または細胞のゲノム中に組み込まれる。
当業者であれば、遺伝子またはその相補配列が細胞内で発現するには、前記遺伝子がプロモーター配列と作動可能に連結されていることが必用であることを認識されよう。本目的のためのプロモーターの選択は、必要とする発現量および／または発現させようとする組織、器官および生物種に応じて変化し得るものであり、好ましくは、小麦の発生途上の内胚乳で優先的に発現する内胚乳特異的プロモーターである。
核酸分子をプロモーター配列の調節制御下に置くとは、そのプロモーター配列に発現が制御されるように前記分子を配置することを意味している。プロモーターは、必ずというわけではないが、通常、調節される核酸分子の上流または５'末端に配置される。さらに、プロモーターを含む調節要素は、その遺伝子の転写開始部位から２ｋｂ以内に普通配置される。プロモーター／構造遺伝子の異種組合せの構築では、そのプロモーターと自然状態でその制御を受ける遺伝子（すなわち、そのプロモーターが由来した遺伝子）との距離とほぼ同じ遺伝子転写開始部位からの距離に、そのプロモーターを配置するのが一般に好ましい。当分野で公知であるように、この距離のある程度の変動は、プロモーター機能を損なわずに受け容れることができる。同様に、制御しようとする異種遺伝子に対する調節配列要素の好ましい配置は、その要素の自然状態（すなわち、その要素が由来した遺伝子）での配置によって規定される。やはり当分野で公知であるように、この距離のある程度の変動も起こることができる。
本発明の遺伝子構築体に使用するのに適切なプロモーターの例には、ウィルス、酵母、カビ、細菌、昆虫、鳥類、哺乳類および植物の遺伝子、好ましくは植物細胞中で機能できる遺伝子、より好ましくは小麦の内胚乳中で発現できる遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。プロモーターは、発現が起こる組織に関して、構成的または差別的に発現を調節し得る。あるいは、発現が起こる発生段階に関して、または生理的ストレスなどの外部刺激または温度に反応して、発現が差別的となり得る。
ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂまたは他の澱粉生合成遺伝子の活性を減少させる方法は、小麦の再生可能細胞中に移入遺伝子を導入し、その形質転換細胞からトランスジェニック小麦植物を再生するステップを含み得る。アミロペクチンの合成に関わる分枝酵素には、ＳＢＥＩ、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂが含まれ、本発明は、単独での、またはＳＢＥＩＩｂもしくはＳＢＥＩ発現の変化と組み合わさったＳＢＥＩＩａ発現の減少を包含する。したがって、移入遺伝子（複数も）は、こうした遺伝子の複数種を不活性化し得る。その上、ＳＢＥＩＩｂおよび／またはＳＢＥＩの不活性化は、移入遺伝子（例えば、二重鎖ＲＮＡ、アンチセンスまたはリボザイムＲＮＡをコードするもので、下記を参照されたい）がＳＢＥＩＩｂまたはＳＢＥＩ遺伝子発現を直接標的とするために、直接的であってもよいし、あるいはＳＢＥＩＩｂまたはＳＢＥＩの発現を間接的に変化させてもよい。例えば、移入遺伝子ＲＮＡは、配列同一性または塩基対形成からすればＳＢＥＩＩａ遺伝子／ＲＮＡだけを標的とするが、内胚乳中でのタンパク質の安定性または分布を変えることによって、ＳＢＥＩＩｂまたはＳＢＥＩ活性の低下も起こし得る。さらに、本発明の形態は、ＳＢＥＩＩａ活性の変化と、１種または複数の他のアミロペクチンシンターゼの変化との組合せにあり、その酵素には、ＳＳＩ、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩｂ、ＳＳＩＩＩ、ホスホリラーゼおよびイソアミラーゼやプルラナーゼなどの脱分枝酵素を含み得る。以上のいずれかまたはすべての発現が、移入遺伝子の導入によって変化し得る。
小麦中のアミロペクチン合成遺伝子に対しては、いくつかのＤＮＡ配列が知られており、そのいずれもが、小麦中の遺伝子を不活性化する移入遺伝子を設計するための基礎となり得る。こうしたものには、ＳＢＥＩＩａ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１１２８２、ＡＦ３３８４３１およびＡＦ３３８４３２）およびＳＢＥＩＩｂ（ＷＯ ００／１５８１０、ＷＯ ０１／６２９３４）が含まれる。小麦のＳＢＥＩ遺伝子は、Ｒａｈｍａｎほか（１９９７年）およびＲａｈｍａｎほか（１９９９年）に記載されている。小麦ＤゲノムＳＢＥＩ遺伝子に高い相同性を示す、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔａｕｓｃｈｉｉのＳＢＥＩ配列は、特許公開明細書のＷＯ ９９／１４３１４に見出すことができる。小麦ＳＢＥＩに対するｃＤＮＡ配列は、受入番号ＡＦ０７６６７９でＧｅｎＢａｎｋデータベース中に見つけることができる。大麦または他の近縁種から得た、他のアミロペクチン合成遺伝子の相同体も、小麦における遺伝子発現量を変えるために使用することができる。このような遺伝子またはその断片は、ＰＣＲ増幅または標識プローブへのハイブリッド形成を含めた当分野で周知の方法により、得ることができる。
本明細書で使用する場合の「厳密なハイブリッド形成条件」とは、プローブと標的配列との間に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性がある場合に、ハイブリッド形成が一般に起こる見込みであることを意味している。厳密なハイブリッド形成条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、およびサケ精子ＤＮＡなどの変性せん断担体ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌを含んだ溶液中で終夜インキュベーションの後、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でハイブリッド形成支持体を洗浄することである。他のハイブリッド形成および洗浄条件は、よく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、「分子クローニング：実験マニュアル、第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）の特に第１１章に例示されている。
移入遺伝子構築体の調製に使用される相同体の領域（複数も）は、対応する小麦の遺伝子または遺伝子領域と少なくとも８５％の同一性、適当な領域中の好ましくは少なくとも９０％、さらに一層好ましくは９５〜１００％の同一性を有すべきである。移入遺伝子は、小麦の内胚乳中に発現するアミロペクチン合成遺伝子を特異的に標的とし、その植物中の他所ではアミロペクチン合成に対する効果がより少ないか、最小限であることも好ましい。これは、移入遺伝子中にある内胚乳特異的プロモーターなどの適切な調節配列の使用によって、実現し得る。
アンチセンス
小麦などの植物中の遺伝子活性を変更する、特に特異的に減少させるための遺伝子操作手法は、当分野で周知である。こうした方法には、標的遺伝子のＲＮＡの少なくとも一部と配列が相補的であり、それとハイブリッドを形成できる、ヌクレオチドを含んだ適切なアンチセンス分子を発現させるための遺伝子構築体の導入が含まれる。アンチセンス分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳もしくはプロセッシングまたは安定性を妨害し、それによって遺伝子の発現を不活性化すると考えられている。アンチセンス配列を考案する方法は、当分野で周知であり、こうした方法の例は、米国特許第５１９０１３１号、欧州特許明細書第０４６７３４９−Ａ１号、欧州特許明細書第０２２３３９９−Ａ１号および欧州特許明細書第０２４０２０８号に見出すことができるが、これらのものは参照により本明細書に組み込まれている。植物におけるアンチセンス法の使用は、Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５年）およびＳｅｎｉｏｒ（１９９８年）により総説された。Ｂｏｕｒｑｕｅは、植物系においてアンチセンス配列を用いた遺伝子不活性化の多数の例を列挙している。彼女は、酵素活性の部分的阻害でその系の測定可能な変化がおそらく起こると見込まれるので、１００％の阻害達成は必要とはいえないとも明言している。Ｓｅｎｉｏｒ（１９９８年）は、アンチセンス法は今や植物中での遺伝子発現を操作する非常によく確立された技法であると明言している。
小麦ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂ、ＳＢＥＩまたは他の澱粉生合成もしくは修飾遺伝子に対するアンチセンス分子は、小麦ｍＲＮＡ配列に基づくか、または他の種、例えば大麦から得られる相同のＤＮＡもしくはｍＲＮＡ配列から誘導できる。アンチセンス配列は、こうした遺伝子のいずれかの転写物のすべてまたは一部に対応してもよいし、あるいはその発現を制御する配列、例えばスプライシング配列に対応してもよい。アンチセンス配列は、小麦ＳＢＥＩＩａまたは他の遺伝子の標的コード領域、あるいは５'非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３'−ＵＴＲまたはこれらの組合せに対応してもよい。その配列は、転写中またはその後のスプライシングで除去し得るイントロン配列に一部相補的でもよく、好ましくは標的遺伝子のエキソン配列だけに相補的でもよい。ＵＴＲの概して相対的に大きな分岐を考慮すると、こうした領域を標的にすることで、遺伝子阻害の特異性が増加する。特定の実施形態では、アンチセンス配列の長さは、遺伝子ＲＮＡ配列の相補体に対応して、少なくとも１９個の連続ヌクレオチド、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、または少なくとも１０００個のヌクレオチドである。完全な遺伝子転写物に相補的な全長配列を使用してもよい。特定の一実施形態では、アンチセンス配列の長さは１００〜２０００個のヌクレオチドである。さらなる実施形態では、標的転写物の相補体に対するアンチセンス配列の配列同一度は、少なくとも８５％、少なくとも９０％または９５〜１００％である。アンチセンスＲＮＡ分子が、その分子を安定化させるように機能し得る無関係な配列を含み得ることは当然である。
共抑制
使用し得る別の分子生物学的手法は、共抑制である。共抑制の機構は十分に理解されていないが、転写後遺伝子発現抑制（ＰＴＧＳ）を伴うと考えられており、その点でアンチセンス抑制の多数の例と酷似し得る。それには、遺伝子またはその断片の余分なコピーを、その発現用プロモーターに関してセンス方向に植物中へ導入することが含まれる。そのセンス断片の大きさ、標的遺伝子領域との対応度、および標的遺伝子との配列同一度は、アンチセンス配列に対して前記した通りである。いくつかの例では、遺伝子配列の余分なコピーは、標的植物遺伝子の発現を妨害する。共抑制手法を実施する方法に関しては、ＷＯ ９７／２０９３６の特許明細書および欧州特許明細書第０４６５５７２号を参照されたい。
二本鎖ＲＮＡ媒介遺伝子発現抑制（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）
小麦植物中に遺伝子変異を導入するために用いられそうなさらなる方法は、二重鎖または二本鎖ＲＮＡ媒介遺伝子発現抑制である。この方法にもＰＴＧＳが伴われる。この方法では、不活性化しようとする標的遺伝子と相同な少なくとも一部が二本鎖のＲＮＡ産物（複数も）の合成を誘導する、ＤＮＡが導入される。したがって、ＤＮＡはセンス、アンチセンスの両配列を含んでおり、両配列は、ＲＮＡに転写されると、ハイブリッド形成により二本鎖ＲＮＡ領域を形成できる。好ましい実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、ＲＮＡに転写されるとスプライシングで除去されるイントロンを含む、スペーサー領域によって隔てられている。この配置は、遺伝子発現抑制の効率を高めることが示された。前記二本鎖領域は、ＤＮＡ領域１つまたは２つから転写された１個または２個のＲＮＡ分子を含み得る。この二本鎖分子が存在するために、その二本鎖ＲＮＡだけでなく、標的植物遺伝子由来の相同ＲＮＡ転写物も破壊する、植物内因系からの反応が誘発され、標的遺伝子の活性が効果的に低減または消去される。この技法を実施する方法に関しては、オーストラリア特許明細書第９９／２９５１４−Ａ号およびＷＯ ９９／５３０５０の特許明細書を参照されたい。特定の実施形態では、ハイブリッド形成するセンスおよびアンチセンス配列の長さは、少なくとも１９個の連続ヌクレオチド、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、または少なくとも１０００個のヌクレオチドである。全遺伝子転写物に対応する全長配列を使用してもよい。特定の一実施形態では、その長さはヌクレオチド１００〜２０００個の範囲である。さらなる実施形態では、標的転写物に対するセンスおよびアンチセンス配列の配列同一度は、少なくとも８５％、少なくとも９０％または９５〜１００％である。ＲＮＡ分子が、その分子を安定化させるように機能し得る無関係な配列を含み得ることは当然である。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターの制御下で発現してもよい。後者の例には、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡのプロモーターが含まれる。二本鎖ＲＮＡ分子は、連結した複数の遺伝子からの配列を含み、それにより多重遺伝子を標的としてもよい。
リボザイム
小麦中での遺伝子発現の所望する不活性化を担う遺伝子変異は、１個または複数のリボザイムをコードする核酸分子を含んでもよい。リボザイムは、１個またはしばしば２個のハイブリッド形成配列により規定される特定部位で、他のＲＮＡ分子を切断できる酵素機能または触媒機能を有するＲＮＡ分子である。そのＲＮＡ分子の切断で、標的遺伝子の発現が不活性化される。リボザイムは、遺伝子不活性化に寄与し得るアンチセンス分子としても作用し得る。リボザイムは、ハイブリッド形成配列間に１個または複数の触媒ドメイン、好ましくはハンマーヘッド型またはヘアピン型のドメインを含有する。ＲＮＡｓｅＰ、Ｉ群またはＩＩ群イントロン、および肝炎δウィルスの各型を含めた、他のリボザイムモチーフを使用してもよい。欧州特許明細書第０３２１２０１号および米国特許第６２２１６６１号を参照されたい。トランスジェニック植物において遺伝子を不活性化するためのリボザイムの使用は、例えばＷｅｇｅｎｅｒほか（１９９４年）によって示された。
遺伝子構築体／ベクター
本発明は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、好ましくはＤＮＡを含み、遺伝子阻害分子をコードする分離核酸分子も提供する。ある種の実施形態では、核酸分子は、アンチセンス、センス（共抑制）、二本鎖ＲＮＡまたはリボザイム分子をコードし、分子は、小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子配列を標的とし、小麦粒の内胚乳中でその発現を不活性化する。本発明は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターまたはポリアデニル化配列などの１種または複数の調節要素を含んだ、単離核酸分子を含む、またはコードする遺伝子構築体も提供する。このような要素は当分野で周知である。遺伝子構築体は、植物、特に小麦などの単子葉植物において、移入遺伝子の発現を補助するイントロン配列も含んでもよい。用語「イントロン」は、転写されるが、タンパク質をコードせず、翻訳前にスプライシングによりＲＮＡから除去される遺伝子断片を意味するものとして、通常の意味で使用される。イントロンは、移入遺伝子が翻訳産物をコードする場合は、５'−ＵＴＲまたはコード領域中に組み入れてもよく、そうでない場合は、転写領域中のいずれにあってもよい。
本発明は、遺伝子構築体を含んだベクター、例えばプラスミドベクターも提供する。用語「ベクター」には、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの発現ができる発現ベクター、および１種の細胞または生物から他のものに移入できる形質転換ベクターが含まれる。ベクターは、細胞中、例えば大腸菌やアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの原核細胞中で複製される配列を含む。特定の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列により規定され、小麦細胞中に導入できるＴ−ＤＮＡ配列を含む二元ベクターである。本発明は、ベクターを含んだ細胞、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、または未熟胚の胚盤細胞などの再生可能細胞の場合もある小麦細胞をさらに提供する。あるいは、細胞は、移入遺伝子を含む形質転換小麦細胞の場合もある。
プロモーター／ターミネーター
別の実施形態では、本発明の移入遺伝子または他の遺伝子構築体は、小麦の内胚乳で調節的または構成的発現を起こし得る転写開始領域（プロモーター）を含んでいる。プロモーターは組織特異的であり、内胚乳中で選択的または排他的に発現を起こし得る。プロモーターは、内胚乳特異的（高分子量グルテニンプロモーター、小麦ＳＳＩプロモーター、小麦ＳＢＥＩＩプロモーター、小麦ＧＢＳＳプロモーターなど）、または内胚乳に非特異的なプロモーター（ユビキチンプロモーター、またはＣａＭＶ３５Ｓもしくは強化３５Ｓプロモーター）のいずれから選択してもよい。プロモーターは、温度、光、ストレスなどの因子によって調節し得る。通常であれば、プロモーターには、発現しようとする遺伝子配列の５'が提供されよう。構築体は、ｎｏｓ３'やｏｃｓ３'ポリアデニル化領域または転写ターミネーターなどの、転写を高める他の要素も含んでもよい。例示したこのようなＤＮＡ領域は、適切な選択マーカー遺伝子配列および他の要素を含むベクター、またはこうした配列を含むベクターと同時形質転換を受けるベクター中に組み込まれることになろう。
小麦の形質転換法
小麦などの単子葉植物の形質転換法、すなわち外因性核酸の導入によりその植物に遺伝子変異を導入し、プロトプラストまたは未熟植物胚から植物を再生する方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｂｅｃｋｅｒほか、１９９４年、Ｃｈｅｎｇほか、１９９７年、Ｈｅほか、１９９４年、Ｈｅｓｓほか、１９９０年、Ｎｅｈｒａほか、１９９４年、Ｖａｓｉｌほか、１９９２年、Ｖａｓｉｌほか、１９９３年、Ｗｅｅｋｓほか、１９９３年、Ｗｅｉｒほか、２００１年、オーストラリア特許出願第７５４６０／９４号、欧州特許出願第７０９４６２号、国際特許公報 ＷＯ９３／０４１７８、ＷＯ８９／１２０１２、ＷＯ９４／１３８２２およびＷＯ９９／１４３１４を参照されたい。所望のヌクレオチド配列または遺伝子構築体と選択マーカーを担持するベクターは、組織培養した植物もしくは外植片の再生可能小麦細胞、またはプロトプラストなどの適切な植物系の中へ導入してもよい。選択マーカー遺伝子は、小麦細胞に抗生物質または除草剤耐性を賦与し、あるいはマンノースなどの基質の利用を可能とする場合がある。選択マーカーは、小麦細胞にアスラム、ジェネティシンまたはハイグロマイシン耐性を賦与するのが好ましい。再生可能小麦細胞は、好ましくは、未熟胚の胚盤、成熟胚、これら由来のカルス、または分裂組織から得られる。
形質転換植物は、選択マーカー遺伝子を含有してもよいし、あるいはこのような遺伝子は、例えば、選択マーカー遺伝子をゲノムから切除することにより、または選択マーカー遺伝子をＳＢＥＩＩａ阻害移入遺伝子から分離することにより、再生中またはその後で除去してもよい。
移入遺伝子または変異を染色体中に組み込まれた植物は、例えば、移入遺伝子に特異的な適切な核酸プローブまたは表現型の観察を用いて、スクリーニングできる。いくつかの方法のいずれでも、形質転換植物の存在を判定するために使用することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより、形質転換植物に独特の配列を増幅し、増幅産物をゲル電気泳動または他の方法で検出してもよい。従来法を用いてＤＮＡを植物から抽出し、形質転換植物と非形質転換植物との識別をする見込みのあるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を実行し得る。例えば、その構築体に読み込んで、形質転換ベクターからのＤＮＡのある領域を増幅する見込みのあるプライマーを設計し、対象とする遺伝子から逆方向プライマーを設計してもよい。こうしたプライマーは、その植物が首尾よく形質転換された場合、ある断片だけを増幅するであろう。陽性の形質転換体を確認する代替法は、当分野で周知のサザンブロットハイブリッド形成によるものである。形質転換体または変異体の植物は、例えば、選択マーカー遺伝子の存在により、または免疫学的方法による特定タンパク質の存在により、あるいは、あるタンパク質の不在、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロット分析で検出した場合の、内胚乳中でのＳＢＥＩＩａタンパク質の不在により賦与される表現型によっても、非形質転換植物または野生型植物から特定、すなわち識別してもよい。このような植物をスクリーニングする際の指示は、穀粒の表現形質の観察、例えば、しわ型穀粒の目視検査もしくは測定、またはアミロース含量の増加試験、または複屈折率の存在に対する顕微鏡検査による指示でもよかろう。
変異
小麦内胚乳においてＳＢＥＩＩａ酵素または他の澱粉生合成酵素の活性低下を起こす遺伝子変異の導入は、個々の遺伝子内またはその遺伝子の調節配列内での適当な変異によっても実現し得る。本願に関しては、「誘発変異」とは、化学的、放射線的または生物学的な変異誘発、例えばトランスポゾンもしくはＴ−ＤＮＡの挿入の結果ともいえる、人工的に誘発した遺伝子変異である。遺伝子の阻害度は、産生する澱粉の特性をある程度決定するであろう。変異は、切断またはヌル変異の場合もあり、このような変異は、澱粉の性質に相当程度の影響を及ぼすことが知られているが、澱粉構造の変化は、アミロペクチンシンターゼ活性を十分に低下させることにより、小麦の澱粉または穀粒において注目すべき特性をもたらす、漏出変異体からも生じるであろう。他の染色体再配置も有効となり得るものであり、こうしたものには、挿入、欠失、反転、複製または点変異を含めてよかろう。本明細書で使用する場合の「ヌル変異」とは、例えば、遺伝子活性がもはや検出できない場合のような、対象遺伝子の完全な、またはほぼ完全な活性喪失を生じる変異を指す。
ＳＢＥＩＩａ遺伝子は、第２染色体の長腕上に位置している。遺伝子または他の遺伝子に対する変異、特に欠失変異は、対象遺伝子、例えばＳＢＥＩＩａ遺伝子に局在化されているか、または二重変異体の場合は、連結しているＳＢＥＩＩｂ遺伝子へ恐らく伸長していることが好ましい。これに関する遺伝子には、転写領域だけでなく、プロモーター領域およびターミネーター／ポリアデニル化シグナルも含まれる。転写領域には、タンパク質コード領域（複数も）と、ｍＲＮＡの５'非翻訳領域および３'非翻訳領域、ならびに存在し得る任意のイントロン領域が含まれる。遺伝子に対する変異は、その遺伝子の任意の領域または領域同士の組合せに起こってもよく、１個だけのヌクレオチドの変化、例えば、コード領域におけるフレームシフト変異から、遺伝子全体の欠失にまでわたってもよかろう。遺伝子変異については、ホモ接合の植物が好ましい。
欠失については、大きさを百または数百キロ塩基、おそらく５００キロ塩基程度に制限し得る。ある種の実施形態では、欠失は、数千キロ塩基未満、または５千キロ塩基未満まで伸長される。本発明は、各ゲノムの第２染色体の長腕を大きく占める大型の欠失を包含し得るが、第２染色体の長腕上には局在した他のいくつもの遺伝子が存在し、そのため小麦植物の活力に影響するので、このような欠失は好ましくない。したがって、大きな欠失が起こると、植物の活力およびその結果、商業的実現性に悪影響を及ぼすので、第２染色体の長腕の少なくとも過半は存在することが望ましい。好ましい実施形態では、第２Ａ染色体の長腕の過半が存在する。
変異誘発は、化学的手段または放射線手段、例えば、種子のＥＭＳもしくはナトリウムアジド（ＺｗａｒおよびＣｈａｎｄｌｅｒ、１９９５年）処理、またはγ線照射により実現できる。変異体の分離は、変異誘発した植物または種子のスクリーニングで実現し得る。例えば、穀粒中の高アミロース含量および／または正常より長いアミロペクチン鎖長分布、またはＥＬＩＳＡによるＳＢＥＩＩａタンパク質の減少、あるいは穀粒形態の変化について、小麦の変異誘発集団をスクリーニングしてもよい（Ｇｒｅｅｎほか、１９９７年）。スクリーニングは、ＳＢＥ活性の１つをすでに欠いている小麦遺伝子型、例えば、ＳＢＥＩＩｂ陰性背景において行うのが好ましい。あるいは、ＥＭＳなどの薬品で変異誘発した集団において、「耕作（ｔｉｌｌｉｎｇ）」などの技法を用いてその変異を特定してもよい（Ｓｌａｄｅほか、２００５年）。次いで、その変異体を遺伝的背景が望ましい植物と交配し、適当な回数の戻し交配を行うことにより、元々望ましくない親背景を交配で除くことによって、このような変異を所望の遺伝的背景の中に導入してもよい。
別の実施形態では、変異は、小麦におけるＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂ両遺伝子の発現または活性に影響する。このような変異の特定は、トウモロコシや米とは対照的に、小麦ではその両遺伝子が密接に連鎖しているという予想外の知見によって促進される。一方の遺伝子における欠失は、他方の遺伝子に容易に拡張され、両遺伝子にヌル対立遺伝子（ヌル変異）をもたらし得る。この知識のために、小麦の少なくとも１ゲノム上の両遺伝子において変異体である、天然変異体のスクリーニングも促進され、また、２または３ゲノム中での両遺伝子で変異が組み合わさった小麦を産生するためのスクリーニングも、簡易化が可能となる。このような小麦は、小麦粒およびそれからの製品の非トランスジェニック高アミロース源となる。
アミロペクチン合成に関与するＳＢＥＩＩａまたは他の酵素をコードする遺伝子の変異によって、アミロース含量比率が一般に増加するであろう。穀粒１個当たりのアミロース量は、炭素流がアミロペクチンからアミロースへと逸れる結果、増加し得るか、または粒当たりの澱粉産生が有意に減少すれば、その量が減少し得る。いずれの場合も、澱粉に対するアミロースの相対的比率（％）は増加する。
澱粉顆粒の形が歪んだ種子が、高アミロース大麦（Ｍｏｒｅｌｌほか、２００３年）および澱粉中約９０％のアミロースを有する（Ｓｉｄｅｂｏｔｔｏｍほか、１９９８年）低アミロペクチン（ＬＡＰＳ）トウモロコシにおいて報告された。
複屈折は、光を二方向に屈折する物質の能力である。これによって、偏光顕微鏡で見たとき、各澱粉顆粒上に「マルタ十字架」と呼ばれる薄黒い十字架が生じる。複屈折は、顆粒内でのこのポリマーの規則的な構造組織度の指標である（ＴｈｏｍａｓおよびＡｔｗｅｌｌ、１９９９年）。澱粉顆粒での複屈折の減少は、アミロース含量の増加と概して良好に相関している。
本発明の態様に関して多様な指示がなされたが、本発明は、本発明の２つ以上の態様の組合せで存在し得ることは、理解されよう。
実施例
実施例１．材料と方法
炭水化物の定量および分析
澱粉は、Ｓｈｕｌｍａｎほか（１９９１年）の方法を用いて小麦穀粒より単離した。澱粉含有量は、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｂｒａｙ、Ｃｏ Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド共和国）から得た総澱粉分析キットを用いて定量した。
澱粉試料のアミロース含有量は、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬａｉｇｎｅｌｅｔ（１９８３年）の比色法（ヨード滴定）を以下のようにわずかに変更して測定した。約２ｍｇの澱粉を、蓋内にゴム製ワッシャーを取り付けた２ｍｌのネジ蓋付チューブ中に正確（０．１ｍｇまで）に秤量した。脂質を除去するために、８５％（ｖ／ｖ）メタノール１ｍｌを澱粉に混合し、チューブを６５℃の水浴中で１時間ときどき渦流攪拌しながら加熱した。１３，０００ｇ、５分間の遠心分離後、上清を注意深く除去し、抽出工程を繰り返した。次いで澱粉を６５℃で１時間乾燥し、尿素−ジメチルスルホキシド溶液（ＵＤＭＳＯ；１容量の６Ｍ尿素に対し９容量のジメチルスルホキシド）中に澱粉２ｍｇ（前述と同様に秤量）当たりＵＤＭＳＯ１ｍｌを用いて溶解した。混合物を直ちに激しく渦流攪拌し、澱粉を完全に溶解させるため、断続的に渦流攪拌しながら９５℃の水浴中で１時間インキュベートした。澱粉−ＵＤＭＳＯ溶液の一定分量（５０μｌ）を、水１ｍｌ当たりヨウ素２ｍｇおよびヨウ化カリウム２０ｍｇを含有する２０μｌのＩ２−ＫＩ試薬で処理した。混合液を水で全量１ｍｌとした。２００μｌをマイクロプレートに移し、Ｅｍａｘ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を使用して吸光度を読み取ることにより、混合液の６５０ｎｍでの吸光度を測定した。アミロース０〜１００％およびアミロペクチン１００〜０％を含有する標準試料は、ジャガイモアミロースおよびトウモロコシ（またはジャガイモ）アミロペクチン（Ｓｉｇｍａ）から作製し、測定試料と同様に処理した。アミロース含有量（アミロース百分率）は、標準試料の吸光度から導かれる回帰式を使用して吸光度値から決定した。非脱分枝澱粉のアミロース／アミロペクチン比の分析は、Ｃａｓｅほか（１９９８年）の方法に従うか、またはＢａｔｅｙおよびＣｕｒｔｉｎ（１９９６年）により記述された脱分枝澱粉を分離するためのＨＰＬＣ法によって実施してもよい。
澱粉における鎖長の分布は、澱粉試料の脱分枝後に、Ｍｏｒｅｌｌほか（１９９８年）に従ってキャピラリー電気泳動装置を使用する蛍光ラベル糖鎖電気泳動（ＦＡＣＥ）により分析した。澱粉試料のゲル化温度プロフィールはＰｙｒｉｓ １示差走査熱量計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、コネチカット州、米国）により測定できる。澱粉溶液の粘度は、Ｒａｐｉｄ−Ｖｉｓｃｏ−Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＲＶＡ、Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ、シドニー）上で、例えばＢａｔｅｙほか、１９９７年により報告された条件を使用して測定できる。測定しうるパラメーターとしては、ピーク粘度（高温ペーストの最大粘度）、保持強度、最終粘度およびペースト化温度が挙げられる。小麦粉または澱粉の膨潤量は、Ｋｏｎｉｋ−Ｒｏｓｅほか（２００１年）の方法に従って測定できる。吸水量は、小麦粉または澱粉試料を所定の温度で水に混合する前後にその試料を秤量し、ゲル化物質を回収することにより測定する。
酵素アッセイ
内胚乳中の総澱粉シンターゼ活性は、タンパク質の抽出およびＬｉｂｅｓｓａｒｔほか（１９９９５）またはＣａｏほか（１９９９年）が記載した方法による分析により測定できる。分析には１４ＣラベルＡＤＰＧ基質を使用し、単量体の澱粉ポリマー中への取り込みを測定する。抽出液中の澱粉シンターゼの個々のアイソフォームは、以下の通りゲル電気泳動で分離し、ゲル中でアッセイ（ザイモグラム）し得る。発生中の種子からの抽出液は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、１０μＭペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）および０．０５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用して調製し得る。緩衝液中で種子をパルプ状になるまで粉砕した後、混合物を１４，０００ｇで４℃、１５分間遠心分離し、上清を抜き出す。上清中のタンパク質濃度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ蛋白試薬または他の標準的な方法を使用して測定することもできる。タンパク質抽出物を未変性ゲルにかける場合は抽出液の保存は−８０℃で行う。変性ゲル電気泳動のためには、１００μｌの抽出液をＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールと混合し、混合液を沸騰水で４分間インキュベートしタンパク質を変性させる。電気泳動は、４．５％ポリアクリルアミド濃縮ゲルを上部に重ねた８％ポリアクリルアミド分離ゲルを使用する標準的な変性ポリアクリルアミドゲルで行われる。電気泳動後、タンパク質は、ゲルを４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に、緩衝液交換の度に少なくとも１００ｍｌの緩衝液を使用して３０分ごとに緩衝液を交換しながら最低２時間浸すことにより再生できる。非変性ゲルの場合は、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを使用する変性過程は省略し、ゲル中のＳＤＳも省略する。トリス−グリシン（２５ｍＭトリス、０．１９Ｍグリシン）、０．１３３Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ６７０μｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび１ｍＭ ＡＤＰＧ基質を含む澱粉シンターゼアッセイ緩衝液を使用して澱粉シンターゼバンドを検出した後、澱粉産物を検出するために２％ＫＩ、０．２％Ｉ２ヨウ素溶液で染色することもできる。
別に、澱粉シンターゼまたは他の澱粉生合成酵素は特異抗体を使用して（ＥＬＩＳＡ）種子抽出物中から検出することもできる。
実施例２．小麦ＳＢＥＩＩＡおよびＳＢＥＩＩＢ発現を改変するための遺伝子構築
小麦のＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子のどちらかの発現を低減すべく二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構築体を作成した。そのような構築体において、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子の一部に相当する好ましい核酸配列は、発現したＲＮＡが塩基対合可能で二重または二本鎖ＲＮＡを形成し得る相補領域を含むように、プロモーターに対しセンスおよびアンチセンス方向の両方に見出された。センスおよびアンチセンス配列間のスペーサー領域は、形質転換植物中のＲＮＡの一部として転写されると、スプライシングにより除かれて締まった「ヘアピン」二重構造を形成すると思われるイントロン配列を含有していた。イントロンを含有することは、二重鎖ＲＮＡ構築体によって与えられる遺伝子発現抑制の効率を増すことが分かってきた（Ｓｍｉｔｈほか、２０００年）。好ましい核酸を、高分子量グルテニン（ＨＭＷＧ）プロモーター配列（Ｄｘ５サブユニット遺伝子のプロモーター、受入番号Ｘ１２９２８、Ａｎｄｅｒｓｏｎほか、１９８９年）およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来ノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ３'）のターミネーター配列に連結した。これにより、ｄｓＲＮＡ配列の内胚乳特異的発現が提供された。
ＳＢＥＩＩａ二重鎖ＲＮＡ構築体は、小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ３３８４３１、図１参照）からＰＣＲによって増幅された１５３６塩基対のヌクレオチド配列を含んでいた。配列は、エキソン１および２の全体ならびにエキソン３の一部（図１のヌクレオチド位置１０５８〜１３３６、１６６４〜１７６１および２０３８〜２２１９）を含み、各端にＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限部位がある４６８塩基対配列（断片１）と、ＳＢＥＩＩａのエキソン３および４の一部ならびにイントロン３の全部（図１のヌクレオチド位置２２２０〜２７３１）からなり、各端にＫｐｎＩとＳａｃＩ部位がある５１２塩基対配列（断片２）と、ＳＢＥＩＩａの完全なエキソン１、２および３（図１のヌクレオチド位置１０５８〜１３３６、１６６４〜１７６１および２０３８〜２２７９）からなり、各端にＢａｍＨＩおよびＳａｃＩの部位がある５２８塩基対配列（断片３）とを含有していた。断片３の配列が断片１に対してアンチセンス方向で断片２に連結されるように断片１、２および３を連結した。二重鎖ＲＮＡ構築体は最初、ＨＭＷＧプロモーター配列およびｎｏｓ３'ターミネーターを含むベクターｐＤＶＯ３０００内に生成した。ベクターｐＤＶＯ３０００中の遺伝子構築体をｐＤＶＯ３−ＩＩａと名付け、二重鎖ＲＮＡ遺伝子をｄｓ−ＳＢＥＩＩａと名付けた。
ＳＢＥＩＩｂ二重鎖ＲＮＡ構築体についての戦略も同様とした。ＳＢＥＩＩｂ構築体は、小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子（配列は図２で概説）からＰＣＲによって増幅された１６０７塩基対の断片を含んでいた。構築体は、エキソン１および２の全体ならびにエキソン３の一部（図２のヌクレオチド位置４８９〜６４０、７８９〜９３４および１５９８〜１７６９）を含み、各端にＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限部位がある４７１塩基対配列（断片１）と、ＳＢＥＩＩｂのエキソン３および４の一部ならびにイントロン３の全部（図２のヌクレオチド位置１７７０〜２３６４）からなり、各端にＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位がある５８９塩基対配列（断片２）と、ＳＢＥＩＩｂの完全なエキソン１、２および３（図２のヌクレオチド位置４８９〜６４０、７８９〜９３４および１５９８〜１８２７）からなり、各端にＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位がある５２８塩基対断片（断片３）とを含有していた。断片３の配列が断片１に対してアンチセンス方向で断片２に連結されるように断片１、２および３を連結した。ベクターｐＤＶＯ３０００中のＳＢＥＩＩｂ二重鎖ＲＮＡ遺伝子構築体をｐＤＶＯ３−ＩＩｂと名付け、二重鎖ＲＮＡ遺伝子はｄｓ−ＳＢＥＩＩｂと名付けた。構築体を図３に模式的に示す。
次いで、ｄｓ−ＲＮＡ発現カセットの各々を制限酵素ＸｈｏＩで切り出し、バイナリー形質転換ベクターｐＧＢ５３およびｐＢＩＯＳ３４０に挿入した。ｐＧＢ５３は、米アクチンプロモーターによって調節されるアスラム耐性（ｓｕｌ）をコードする遺伝子を、目的遺伝子の導入のためにＴ−ＤＮＡ右側境界に隣接する固有のＸｈｏＩ部位を残すように導入してｐＳＢｌｌから作成（Ｋｏｍａｒｉほか、１９９６年）された。同様に、ｐＢＩＯＳ３４０は、米アクチンプロモーターによって調節されるカナマイシンおよびジェネティシン耐性をコードするｎｐｔＩＩ遺伝子の導入によってｐＳＢｌから作成（Ｋｏｍａｒｉほか、１９９６年）され、ここでも右側境界に隣接する固有のＸｈｏＩ部位は残された。ｐＧＢ５３およびｐＢＩＯＳ３４０中のＳＢＥＩＩａ構築体はそれぞれｐＣＬ５１およびｐＣＬ５９と名付け、ｐＧＢ５３およびｐＢＩＯＳ３４０中のＳＢＥＩＩｂ構築体はそれぞれｐＣＬ５４およびｐＣＬ６０と名付けた。
実施例３．小麦の形質転換
ｖｉｒプラスミドｐＡＬ４４０４およびｐＳＢ１を有する無害化したアグロバクテリウムトゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に小麦の形質転換のための遺伝子構築体をエレクトロポーレーションによって導入し、続いてスペクチノマイシンを含む培地上で選択した。形質転換されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を、２７℃、２日間ＹＥＰ固化培地上でインキュベートした。次いで細菌を回収し、小麦接種のため、６５０ｎｍにおける光学密度２．４に４００ｍＭアセトシリンゴンを含むＴＳＩＭ１（１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１０ｇ／ｌグルコース、５０ｍｇ／ｌ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．５であるＭＳ培地）に再懸濁した。
小麦植物（品種ＮＢ１、春小麦品種、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ Ｓｅｅｄｓ Ｌｔｄ、Ｒｏｔｈｗｅｌｌ、Ｌｉｎｃｓ．から入手）を、温室内で温度２２／１５℃ 日／夜で１日１６時間の日照とするために明かりを補って栽培した。開花後約１４日（胚長さ約１ｍｍ）で５０ｃｍのひこばえ茎を含むようにひこばえを収穫した。次いで、止め葉以外のすべての葉をひこばえから取り除き、止め葉はカビ胞子による汚染を除くために清浄化した。次いで、各小穂の苞穎および最初の２個の小花からの外穎を慎重に取り除いて未熟種子を露出させた。概して、各小穂でこのような種子２粒のみを露出させた。この手順を、開花期の全期にわたり実行した。次いで、穂には簡単な表面殺菌として７０％ＩＭＳを吹き付けた。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液（１μｌ）を、１０μｌハミルトン注射器を使用して未熟種子内のほぼ胚盤：内胚乳の界面の位置に接種し、露出させた種子すべてについて接種した。次いで、ひこばえを水中に置き、種の乾燥を防ぐために半透明のプラスチック製袋で覆い、明かりをつけたインキュベーター中に２３℃、３日間、１日当たり１６時間、４５Ｅｍ−２ｓ−１ＰＡＲで置いた。同時培養３日後、接種された未熟種子を取り除き、７０％エチルアルコール（３０秒間）、次いで２０％漂白剤（Ｄｏｍｅｓｔｏｓ、２０分間）で表面を殺菌し、滅菌蒸留水で完全に洗浄した。未熟な胚を無菌的に単離し、Ｗ３培地（ＭＳに２０ｇ／ｌショ糖および２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを補い、６ｇ／ｌ Ｔｙｐｅ Ｉアガロース（Ｓｉｇｍａ）で固めたもの）に１５０ｍｇ／ｌタイメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）を加えた培地（Ｗ３Ｔ）上に、胚盤（プレート当たり２０胚）を一番上となるように移植した。培養物は、２５℃で照明（１日１６時間の日照、８０Ｅｍ−２ｓ−１ＰＡＲ）に置いた。胚上の胚軸の発育を単離の約５日後に評価し、カルス生産を改善するために必要な場合軸を取り除いた。胚は、単離２週間後には新しい培地に移して４週間Ｗ３Ｔ上で維持され、胚形成能力を評価された。
４週間成長後、接種された胚に由来するカルスは、Ｗ３Ｔ培地上に移植した非接種胚から得られた対照カルスと非常に類似していた。細菌の存在が、接種された胚に由来するカルスの胚形成能力を実質的に低減させることは観察されなかった。胚形成カルスを、２ｍｇ／ｌアスラム（ｐＧＢ５３誘導体を使用した）または２５ｍｇ／ｌジェネティシン（ｐＢＩＯＳ３４０誘導体）および１５０ｍｇ／ｌタイメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）（Ｗ３２ＡＴ）を含むＷ３培地に移した。カルスをさらに２週間、培地上で維持し、次いで、各カルスを２ｍｍサイズの小片に分け、Ｗ３２ＡＴ上に再移植した。バイナリーベクター構築体を含有しないＬＢＡ４４０４接種に由来する対照胚は、選択培地上で形質転換カルスを産生しなかった。
さらに２週間培養後、すべての組織を胚形成性カルスの発育について評価した：４週後に選択培地上で継続的な発育の徴候を示しているすべてのカルスを再生培地（４０ｇ／ｌマルトースおよび１５０ｍｇ／ｌタイメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）を含むＲＭＴ−ＭＳ、ｐＨ５．８、６ｇ／ｌアガロース、Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ Ｉで固化）に移植した。芽は培地上で４週間以内に再生し、次いで、芽の伸長および発根のために１５０ｍｇ／ｌタイメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）を含むＭＳ３０に移植した。次いで、幼若植物を土壌混合物に移植し、噴霧ベンチで２週間保持し、最後に温室に移した。
ｐＣＬ５４またはｐＣＬ６０（ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ）を使用した合計３２１７個の胚およびｐＣＬ５１またはｐＣＬ５９（ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ）を使用した２０１０個の胚を方法によって処理し、６１体の植物がＩＩｂ形質転換のためのカルスから再生し、３１体の植物がＩＩａ形質転換のためのカルスから再生した。選択培地上で生存していたことから、植物が遺伝子構築物によって成功裏に形質転換されていることが示唆された。選択マーカー遺伝子により形質転換された植物の大多数（すべてではない）には、ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ阻害遺伝子が組み込まれたと期待されよう。このような植物は、以下の実施例に記載する通り容易に識別することができた。
上記実験で良好な再生能力を伴う多重の安定な組み込みイベントが回収されたことは、本明細書で用いられる種子接種形質転換法が小麦について報告された他の方法と同様に効率的であることを示した。ＡＧＬ１株などの代替アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株、またはハイグロマイシン抵抗性をコードする遺伝子などの選択マーカーも、本方法に用いることができる。
実施例４．小麦形質転換体の分析
形質転換は、以下の１種または複数の方法で測定した：１個または複数の移入遺伝子についてのＰＣＲ分析。ＰＣＲ分析は、ＳｔａｃｅｙおよびＩｓｓａｃ（１９９４年）によって記載されたミニプレップ法を使用し、新鮮葉試料１〜２ｃｍ２から抽出されたゲノムＤＮＡについて行った。ＰＣＲ反応は、例えば、ＳＢＥＩＩａ遺伝子からの断片（４６２塩基対）を増幅すべく設計されたプライマーＳＢＥＩＩａ−Ｆｏｒ：５'−ＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＴＴＴＧ−３'［配列番号４］およびＳＢＥＩＩａ−Ｒｅｖ：５'−ＧＡＣＴＡＣＣＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣ−３'［配列番号５］を用いて、またはＳＢＥＩＩｂ（５０５塩基対）についてのＳＢＥＩＩｂ−ＤｕｐＦｏｒ５'−ＡＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧ−３'［配列番号６］およびＳＢＥＩＩｂ−ＤｕｐＲｅｖ５'−ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣ−３'［配列番号７］を用いて行った。反応条件は以下の通りであった。すなわち、「ホットスタート」（９４℃、３分間）の後、変性（９５℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７３℃、２分間）を３０サイクル後、７３℃（５分間）を１サイクル行った。
サザンブロットハイブリッド形成分析は、凍結乾燥した粉砕組織からの大規模（９ｍｌ）抽出物から得たＤＮＡについて行った（ＳｔａｃｅｙおよびＩｓｓａｃ、１９９４年）。ＤＮＡ試料は０．２ｍｇ／ｍｌに調節し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩのような制限酵素で消化した。制限酵素消化、ゲル電気泳動および真空ブロットはＳｔａｃｅｙおよびＩｓｓａｃ（１９９４年）の記載の通り行った。ｄｓ−ＳＢＥＩＩ構築体のイントロン３領域を含有するジゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）標識プローブは、ＭｃＣｒｅｅｅｙおよびＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ（１９９４年）の方法に従ってＰＣＲにより製造された。サザンブロットでのプローブのハイブリッド形成および化学発光による検出は、ＭｃＣｒｅｅｅｙおよびＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ（１９９４年）の方法に従って行った。
ＰＣＲ分析の結果を表２に要約してある。ＰＣＲによって示したように移入遺伝子が陽性だった植物は、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａについて形質転換の２７独立イベントおよびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂについて６１独立イベントを含んでいた。
Figure 0005638736
実施例５．二重鎖ＲＮＡ構築体で形質転換した植物由来の穀粒の分析
澱粉顆粒形態
Ｔ０形質転換小麦植物から得た成熟Ｔ１種子由来澱粉顆粒の形態を、光学顕微鏡法によって観察した。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａで独立に形質転換した２５本のＴ０植物およびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂで独立に形質転換した１２本の植物の各々からのそれぞれ１０個の穀粒を分析した。各内胚乳を澱粉顆粒を放出させるために軽く押しつぶし、それを水中に分散させて、光学顕微鏡の下で視覚化した。分析したｄｓ−ＳＢＥＩＩａの２５系統のうち、１２個は変形顆粒を含む穀粒を有していたが、視覚的観察では種子ごとに変形レベルは様々であった。これに対し、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂの１２系統はいずれも、光学顕微鏡法下で観察した場合、内胚乳中の澱粉顆粒の顕著な変形は観察されなかった。
偏光下で澱粉顆粒を観察すると、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ穀粒の変形顆粒では、複屈折の著しい低下が明らかとなった。複屈折の低下は系統５０．ｌｂからの種子では顆粒の９４％で観察され変形表現型と相関していたが、一方同じ系統の別の種子からの正常な顆粒は完全な複屈折を示した。正常な顆粒を有する種子は、移入遺伝子が欠失している分離個体であり、したがって表現型は正常であると推定される。
光学顕微鏡観察の結果は、澱粉顆粒の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって確認した。このために、精製した澱粉を金とスパッタリングし、室温、１５ｋＶで走査した。
穀粒重量
温室内で等しい条件下で生育させたｄｓ−ＳＢＥＩＩａ形質転換植物からの個々の穀粒を秤量した（表３）。植物５０．１ｂ、５８．２ａ、６１．２ａおよび１０９からのひどく変形した顆粒を有する穀粒は、同じ条件下で生育した野生株植物の穀粒と比較して平均重量で顕著な低下はなかった。したがって、澱粉生産は高度に変形した澱粉顆粒を有する種子においてでも実質的に低減する様子は見られなかった。このデータは、内胚乳中のＳＢＥＩＩａ活性が低下した野外生育小麦の収穫量がほぼ正常であることも示唆する。
Figure 0005638736
Ｔ２トランスジェニック小麦内胚乳中のＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂタンパク質の分析
独立に形質転換した５系統からなるｄｓ−ＳＢＥＩＩａ形質転換Ｔ１植物１３体、および独立に形質転換した３系統からなるｄｓ−ＳＢＥＩＩａ形質転換植物９体からの種子（Ｔ２）に対して、内胚乳中のＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂタンパク質発現を非変性ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。先に記載の通り、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ植物はすべて異常な澱粉顆粒形態を有する系統からのものであり、一方ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ系統はすべて正常の顆粒形態を有するものであった。ＳＢＥＩＩａ検出のために用いた抗体は、ウサギ由来の３ＫＬＨであり、これは、成熟ＳＢＥＩＩａのＮ末端配列に相当するアミノ酸配列ＡＡＳＰＧＫＶＬＶＰＤＥＳＤＤＬＧＣ［配列番号８］を有する合成ペプチドに対して誘導されたものであり、使用の際に１：５０００に希釈した。ＳＢＥＩＩｂの検出のために用いた抗体はＲ６であり、これは、成熟ＳＢＥＩＩｂのＮ末端推定配列に相当するアミノ酸配列ＡＧＧＰＳＧＥＶＭＩＧＣ［配列番号９］を有する合成ペプチドに対して誘導されたものであり、使用の前に１：６０００に希釈した。使用した二次抗体は、ＧＡＲ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体であった（１：３０００希釈）。免疫反応バンドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ検出システムを用いて検出した。
いくつかの植物は移入遺伝子についてヘテロ接合であると期待されたため、２２本のＴ１植物各々由来の７粒の発育中穀粒（開花後１５日）のそれぞれについて内胚乳を分析した。１３本のｄｓ−ＳＢＥＩＩａ植物のうちの１２本は、内胚乳中でＳＢＥＩＩａタンパク質レベルの低下を示すＴ２子孫を生じた。１系統（５０．３ｘ．９）からの７粒の種子はすべてＳＢＥＩＩａを完全に欠失しているようであり、他の４本の植物からの７粒の種子はすべてＳＢＥＩＩａの発現の明らかな低下を示した。これらは移入遺伝子についてホモ接合である系統を表すことができる。７系統はＳＢＥＩＩａが存在しないかまたはＳＢＥＩＩａレベルが低減している、もしくは場合によってはタンパク質が明らかには低下してないことで分離されており、系統は恐らく移入遺伝子についてのヘテロ接合体を表している。１３系統（５０．３ｘ．６）は野生型発現についてホモ接合性だった。
調べたｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック９系統のうち、３系統（１１０．１６ｂ．２、１１０．１６ｂ．５および１１０．１６ｂ．１９）は一様に７粒の子孫種子それぞれにおいてＳＢＥＩＩｂ発現を示さなかったが、２系統は一様に野生型の発現であり、残る４系統は発現なし、発現低下または野生型に分離した。種子からの胚を移入遺伝子に関してＴ２種子の遺伝状態を確認するためにＰＣＲおよびタンパク質発現分析によりスクリーニングされるＴ２植物およびＴ３種子を製造するように成長させる（胚レスキュー）ことができる。
データは、二重鎖ＲＮＡ構築体が小麦内胚乳中のＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ遺伝子発現の低下に関して効果的であったことを示す。データはまた、ＳＢＥＩＩｂ発現だけの低下は澱粉顆粒形態を実質的に変化させなかったことも示す。
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ移入遺伝子を含有しＳＢＥＩＩａタンパク質が欠如しているトランスジェニック種子中のＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現、およびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂを含有する種子中のＳＢＥＩＩａ遺伝子の発現も、ウェスタンブロット法により分析した。予想外にも、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａを含有するトランスジェニック種子において、ＳＢＥＩＩｂが大きく低下していた。しかし、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂのトランスジェニック種子において、逆の影響は観察されなかった。ＳＢＥＩＩｂがｄｓ−ＳＢＥＩＩｂによって完全にサイレンスにされた種子においてはＳＢＥＩＩａ発現は変化しなかった。ＳＢＥＩＩｂの発現は、二重鎖構築体のために使用された領域の遺伝子間の配列相同性のためにｄｓ−ＳＢＥＩＩａ構築体によって抑制された可能性もあり、ＳＢＥＩＩｂ活性は、いくつかの他のメカニズムによってｄｓ−ＳＢＥＩＩａ移入遺伝子によって低下された可能性もある。
ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現レベルはノーザンハイブリッド形成またはＲＴ−ＰＣＲ法などの標準的な技術によって、例えば、非保存領域由来のプローブを用いるか、または遺伝子の一方にはあるが、他方にはない、例えば３'非翻訳領域中の特有の部位にハイブリダイズするプライマー対を用いて、ｍＲＮＡレベルにおいても明確に決定することができる。そのような領域または部位は両遺伝子配列を比較することにより容易に同定できる。
実施例６．形質転換小麦の澱粉分析
トランスジェニック小麦穀粒中のアミロースおよびアミロペクチンレベル
６個のプールしたＴ１種子試料由来の澱粉中アミロース含有量を実施例１に記載した通り定量した。プールした種子試料は、以下の通りトランスジェニック小麦系統から得た：
プール１−変形澱粉顆粒を有したｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統８５．２ｃの種子
プール２−正常顆粒を有したｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統８５．１ａからの種子
プール３−正常顆粒を有したｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統１１０．１８ａの種子
プール４−変形顆粒を有し、一緒にプールしておいたｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統５８．１ａ、５８．２ａおよび６１．２ａからの種子
プール５−正常顆粒を有したｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統８３．１ｂの種子
プール６−正常顆粒を有したｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統７５．３ｘの種子
各々の分析は、澱粉試料の複製４個を用いて行った。これらの分析において吸光度をアミロース含有率に変換するのに用いた回帰式は、Ｙ＝５７．５４８ｘ−８．７９３であり、ここで、Ｙはアミロース含有率（％）であり、ｘは吸光度である。結果を下記の表に示す。変形澱粉顆粒の存在は、明らかにアミロース含有率の増加を伴っていた。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統（プール１および４）からの変形顆粒を有する穀粒由来の澱粉は、５０％を超えるアミロース含有率を有していたのに対し、正常な澱粉顆粒を有する穀粒に由来する他の澱粉プールは２１〜２６％の範囲のアミロース含有率を有していた。これにはＳＢＥＩＩｂの発現が低下したＩＩｂ １１０．１８ａ系統からの澱粉も含まれており、このことは、小麦中のＳＢＥＩＩｂの失活だけでは、穀粒澱粉中のアミロース含量が実質的に増加しないことを示唆した。
Figure 0005638736
分析の第２セットは、プール４からの試料ならびにＳＳＩＩが欠如している小麦（Ｙａｍａｍｏｒｉほか、２０００年）およびＳＳＩＩａの変異体である大麦系統Ｍ２９２からの澱粉を用いてヨード滴定法により行った。プール４小麦種子（ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統）からの澱粉について定量したアミロース含有率は、小麦ＳＳＩＩ変異体および大麦からの澱粉の含有率より相当に高かった。
このことは、穀粒澱粉中のアミロペクチン含有率が、野生株の約７５％から５０％未満またはさらに２０％未満まで相当に低下していることを示唆していた。
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａおよびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ移入遺伝子の両方を含有する系統は、既記載のトランスジェニック植物を交配することにより作製された。そのような子孫の穀粒澱粉中のアミロース含有率は、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａ遺伝子が雌親からおよびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ遺伝子が雄親からＦ１植物に導入された場合にｄｓ−ＳＢＥＩＩａだけを含有する植物由来の澱粉と比較して同程度まで、セファロースカラム法（実施例８）による測定で７５〜８０％の範囲で上昇していた。さらに低いアミロース含量（５５〜６０％）が相反交雑のＦ１子孫で観察された。この相違は、母系ゲノムを２コピーおよび父系ゲノムを１コピー含有する三倍体の内胚乳の性質によるものであろう。結果はｄｓ−ＳＢＥＩＩａ遺伝子のコピー数がアミロース含量の上昇程度に影響を与えていることを示しており、ヘテロ接合体よりもホモ接合体においてアミロース含量がより高いことと一致した。
考察
植物においてアミロース含有量を増加させる既知の機構が３種ある。ｉ）ＧＢＳＳ活性の増大、例えば、ＧＢＳＳの過剰発現がアミロース含有率の増加した米澱粉をもたらすことが近年報告された（Ｉｔｏｈほか、２００３年）。ｉｉ）澱粉シンターゼおよびイソアミラーゼの活性を抑制することによりアミロペクチンの合成を減少させ、アミロースの正味含有率を増加させる方法、例えばトウモロコシｓｕｇａｒｙ−２、ｓｕ１およびｄｕ−１（Ｇａｏほか、１９９８年）についておよび小麦Ｓｇｐ−１（Ｙａｍａｍｏｒｉほか、２０００年）変異体について３５〜４５％のアミロース含有量が、またはＳＳＩＩａ活性を欠失した大麦品種（Ｍｏｒｅｌｌほか、２００３年）において７０％より多いアミロースが報告された。本明細書に示す通り、アミロース含有量を増加させる第３の機構は、澱粉分枝酵素の活性を抑制するものであり、小麦中のＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂの減少によりアミロース含有率が＞７０％である澱粉となり、澱粉顆粒形態、澱粉組成、および澱粉の微細構造が同時に変化した。この結果は、ＳＢＥＩＩｂの減少が高アミロース澱粉に必要とされたトウモロコシ（Ｇａｒｗｏｏｄほか、１９７６年）および米（Ｍｉｚｕｎｏほか、１９９３年）における以前の知見と対照的であった。前記のｈｐ−ＳＢＥＩＩａ構築体の結果は、穀粒中の少なくともＳＢＥＩＩａを含む澱粉分枝酵素の活性を抑制することで、高アミロース表現型が得られることを実証した。
実施例７．小麦のＳＢＥＩＩＡ遺伝子の変異
ＳＢＥＩＩａの活性低下を引き起こす小麦ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異は、変異誘発、例えばガンマ線照射またはエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）などの薬剤を使用する化学的変異誘発のいずれかによって達成することができる。ガンマ線変異誘発のために、種子に６０Ｃｏ源から２０〜５０ｋＲの線量の照射をしてもよい（ＺｉｋｉｒｙａｅｖａおよびＫａｓｉｍｏｖ、１９７２年）。ＥＭＳ変異誘発は、Ｍｕｌｌｉｎほか（１９９９年）によれば種子をＥＭＳ（０．０３％、ｖ／ｖ）で処理することにより行ってもよい。Ｂ＋Ｄ二重ヌル背景においては、変異体穀粒はアミロース含有量の増加または澱粉顆粒形態の変化に基づいて同定され、前記の方法によって確認することもできる。ＳＢＥＩＩｂ活性を保持するＳＢＥＩＩａの変異体は再び変異誘発することができ、子孫はＳＢＥＩＩａに加えてＳＢＥＩＩｂ活性の欠失についてスクリーニングできる、またはＳＢＥＩＩａ変異体はＳＢＥＩＩｂ変異体と交配して変異を組み合わせることにより内胚乳において実質的にＳＢＥＩＩ活性が欠失した非トランスジェニック小麦品種を生産することができる。
ＳＢＥＩＩａまたはＳＢＥＩＩｂ遺伝子中に変異を有する小麦系統を同定するための試みとして、受入番号２４００点の６倍体小麦をＡ、ＢまたはＤゲノム中のＳＢＥＩＩｂのヌル変異についてスクリーニングした。プライマーＡＲ２ｂｌ９ｃＦ／ＡＲ２ｂ２３ｃＲを各系統の小麦植物のゲノムＤＮＡ試料へのＰＣＲ反応で使用し、次いで増幅産物をＲｓａＩで消化しゲル電気泳動した。マーカーはイントロン３領域（小麦ＳＢＥＩＩｂ遺伝子のヌクレオチド位置２０８５〜２３３６、図２）を増幅し、ＳＢＥＩＩｂに特異的であった。前記の実施例で記載の通り、スクリーニングでは３個のＤゲノムＳＢＥＩＩ−ヌル変異体および２個のＢゲノムＳＢＥＩＩ−ヌル変異体の同定がなされた。ＳＢＥＩＩｂに対応するＡゲノムバンドを欠失した変異体系統は検出されなかった。これは、変異体ＳＢＥＩＩｂ遺伝子を有する染色体２Ａを含む小麦系統は自然には存在しないことを示唆した。
Ｔｏｎｙ Ｐｒｉｏｒ ａｎｄ Ｒｏｈｉｔ Ｍａｇｏ（ＣＳＩＲＯ）によって生成されたガンマ線（６０Ｃｏ源）誘導変異体小麦個体群を用いて小麦ＳＢＥＩＩの誘発変異をスクリーニングした。小麦個体群は、Ｇａｂｏ１ＢＬ．１ＲＳ ｘ Ｖｅｅｒｙ ３で交配させたＦ２子孫から生成した。個体群からの合計２６９４粒の変異体種子を、プライマーＡＲ２ｂｌ９ｃＦおよびＡＲ２ｂ２３ｃＲを用いるＰＣＲ反応で前記のようにスクリーニングした。１本の植物に由来する、ＭＬＴ２Ｂ８およびＭＬＴ２Ｄ１と命名された２粒の種子は、ＳＢＥＩＩｂ Ａゲノム対立遺伝子を欠失していると同定された。個体群内の種子で、ＢまたはＤゲノム中にＳＢＥＩＩｂのヌル変異を含有するものは同定されなかった。
ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ遺伝子は小麦染色体２の長腕上で密接に連結していることから、プライマーＳｒ９１３Ｆ／Ｅ６Ｒを用いたＰＣＲ反応で、ＡゲノムＳＢＥＩＩａ遺伝子の有無について種子のＤＮＡを検査した。これらのプライマーはｗＳＢＥＩＩ−Ｄ１のイントロン５領域（ヌクレオチド位置２９５９〜３１８９、図１［配列番号１］）を増幅する。増幅後、生成物を５％配列分析ゲル（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で電気泳動した。蛍光標識生成物を、ソフトウェアＧｅｎｅｓｃａｎを用いて分析した。走査プロフィールは、変異体種子ＭＬＴ２Ｂ８およびＭＬＴ２Ｄ１の両方についての増幅産物がＡゲノムＳＢＥＩＩａ遺伝子に対応する生成物を欠いていることを示し、それにより、両種子がＳＢＥＩＩｂに加えてＡゲノムＳＢＥＩＩａに対してもヌル対立遺伝子を有することが示された。
これらの種子のヌル変異について、ＳＢＥＩＩａに対するＡゲノム特異的マーカーであるＡＲＩＩａＡＦ（５'−ＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＧＡＧＣ−３'）［配列番号１０］およびＡゲノムＳＢＥＩＩａ遺伝子の産物（ｗＳＢＥＩＩ−ＤＡ１のヌクレオチド位置３０２４〜３１３１、図１）のみを増幅するＡＲＩＩａＡＲ（５'−ＣＴＴＣＣＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＣＡＣ−３'）［配列番号１１］を用いてさらに確認した。この一対のプライマーはＣｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ変種由来の植物材料からの１１０ｂｐ産物を増幅したが、変異体と推定される２個の種子においてはこの産物が明らかに欠失していた。これは、染色体２Ａの長腕が欠失している、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇの染色体操作系統である陰性対照ｄｔ２ＡＳの場合と同様であった。ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ遺伝子は染色体２の長腕に位置することから、この系統はこれら両遺伝子のＡゲノム対立遺伝子を欠いておりこのため陰性対照として用いることができた。
ＢおよびＤゲノムのＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ遺伝子の両方に変異を有する５系統が産生された。これらのうち、ＢＤ２１９およびＢＤ６３６などの系統をＡヌル変異体系統と交配することもでき、倍加半数体個体群をホモ接合の三重ヌル変異体植物を提供するためにこれらの交配のＦ１種子から産生することもできる。このような三重ヌル変異体植物は、１／８の頻度で倍加半数体個体群内に生じるはずである。Ａゲノムヌル変異は、類似交配によってＢゲノム変異またはＤゲノム変異のどちらかと組み合わせることができる。さらなる交配において、農学的または他の形質のために、ヌル対立遺伝子のいずれかを任意の適切な遺伝的背景に導入することができる。
ＳＢＥＩＩ活性を欠失したデュラム小麦を産生するために、ＡゲノムまたはＢゲノムのＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂに変異を、もしくはＡおよびＢゲノムの両方に両遺伝子の変異を有するデュラム小麦（例えばＷｏｌｌａｒｏｉ品種など）を産生するための交配を行うこともできる。
デュラム小麦は非トランスジェニックであり、健康上の恩恵を提供する高アミロース６倍体小麦と同様の高アミロース表現型を有する。
実施例８．穀粒中高アミロース含有量のセファロース２Ｂカラム分離法による確認
ＳＢＥＩＩａ／ＳＢＥＩＩｂ阻害遺伝子構築体を含有するトランスジェニック小麦植物の穀粒における澱粉中アミロース含有量をセファロースカラム分離法により定量した。方法において、澱粉分子はその分子量に基づいてカラム上で分離された。次いで、分離した画分をＳｔａｒｃｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて製造者の説明書に従ってアッセイした。
澱粉約１０ｍｇを３．０ｍｌ １Ｎ ＮａＯＨ（脱ガス）に、３７℃、３０分間インキュベーションすることにより溶解した。澱粉溶液は未溶解成分を沈殿させるため１５分間遠心分離した。上清を１ｍｌ／分のポンプ速度でセファロースＣＬ２Ｂカラム上に載せた。緩衝液として１０ｍＭ ＮａＯＨを用いてカラムを展開し、各２．５ｍｌの５０画分を回収した。画分９〜５０のｐＨを、３５μｌ １Ｍ ＨＣｌで４．５に調整した。各試料の一定分量（２５０μｌ）をチューブに移し、次いで２５０μｌの澱粉試薬（Ｓｔａｒｃｈ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。各対照には以下のものが含まれていた：澱粉試薬（２５０μｌ）および水（２５０μｌ）のみを含む澱粉アッセイ試薬ブランク、水５００μｌのみを含むグルコースアッセイ試薬ブランク、澱粉試料２５０μｌおよび水２５０μｌのみを含む試料ブランク、澱粉試薬２５０μｌおよび澱粉試料２５０μｌのみを含む試料テスト。試料および対照を６０℃、６０分間インキュベートし、次いでそれぞれから２００μｌを新しいチューブに移し続いて１ｍｌのグルコース試薬（ｓｔａｒｃｈ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ）を添加して３７℃、３０分間インキュベートした。各画分の澱粉量（ｍｇ）を定量するために３４０ｎｍの吸光度をキット添付の説明書に従って用いた。
澱粉試料のクロマトグラムはセファロースカラムから溶出する２個のピークを明らかにした。各試料のアミロース含有率（第２ピーク）を、両ピークに含まれる総澱粉量に対する百分率として計算した。
方法を用い、移入遺伝子がホモ接合性であることが示された、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統受入番号１４４０８７のアミロース含有率は７８％であると計算され、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統受入番号１４４００８（イベントＩＩｂ １１０．１６ｂからのホモ接合性トランスジェニック系統）のそれは２３％であると計算された。比較として、ヨード滴定法によるこれらの系統のアミロース含有率はそれぞれ８８．４７％および２７．２９％だった。
ゲル化温度、ペースト粘度および澱粉膨潤体積などの機能的な特性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、Ｒａｐｉｄ Ｖｉｓｃｏ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＲＶＡ）および澱粉膨潤力検査によってそれぞれ分析する。これらの澱粉の構造はＸ線結晶解析と粒径分析によって分析される。
Figure 0005638736
実施例９．鎖長分布分析
澱粉試料の鎖長分布は澱粉をイソアミラーゼで脱分枝後、蛍光ラベル糖鎖電気泳動（ＦＡＣＥ）により測定した。トランスジェニック種子由来の澱粉におけるＤＰ６−１１、ＤＰ１２−３０およびＤＰ３１−６０の鎖長の百分率を、非トランスジェニックの対照と比較して表６に示す。
Figure 0005638736
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック種子由来の澱粉における鎖長ＤＰ４〜１２の割合は、非形質転換種子またはｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック種子由来の澱粉と比較して顕著に低かった。鎖長＞ＤＰ１３の割合は、他と比較してｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック種子においてより高かった。この結果は、ＳＢＥＩＩａが小麦澱粉中のＤＰ４〜１２の短鎖の合成に選択的に関与している可能性を示唆する。しかし、ＳＳＩＩａ変異体由来の澱粉においては、アミロース中の短鎖長の比率が増加していた。
実施例１０．ＳＢＥＩＩＡ改変小麦由来澱粉の特性
ｄｓ−ＳＢＥＩＩａおよびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統由来の澱粉のゲル化温度を含む物性を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｄｉａｍｏｎｄ示差走査熱量計を用いて分析した。各澱粉約２０ｍｇを、１：２の比率で、すなわち含水率６６．７％で、水に混合し、ＤＳＣ ｐａｎに封入した。１分間当たり１０℃の加熱速度で、０から１５０℃まで試験および対照試料を加熱した。データは装置で利用できるソフトウェアを使用して分析した。
各澱粉についてのサーモグラムＤＳＣトレースにおいて２個の吸熱ピークが観察された。第１ピークは、澱粉がゲル化する間の結晶構造の破壊を表した。第２ピークは、アミロース−脂質解離の吸熱を表した。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統由来澱粉のゲル化ピーク温度は、非形質転換対照澱粉のピーク温度と比較して約７〜１０℃の上昇を示し、ｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統由来澱粉と比較して約３〜７℃上昇していた。
Figure 0005638736
系統では、非形質転換対照およびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統の両方と比較して、約１６〜１９℃のゲル化（第１ピーク）終了温度の顕著な上昇が観察された。ゲル化開始温度はｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統において、対照またはｄｓ−ＳＢＥＩＩｂトランスジェニック系統よりも早く現れた。Ｎｇほか（１９９７年）は、アミロース増量（ａｅ）トウモロコシ澱粉のゲル化開始温度は通常のトウモロコシ澱粉のそれと同様であったが、ａｅ澱粉では通常の澱粉と比較してゲル化ピーク温度が顕著に上昇していたと報告した。ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統由来の澱粉のゲル化エンタルピーは対照およびｄｓ−ＳＢＥＩＩｂ系統両方のそれより顕著に低かった。これは、ｄｓ−ＳＢＥＩＩａトランスジェニック系統におけるアミロペクチン量の低下を表すゲル化ピーク面積の顕著な減少を反映していると考えられる。アミロース−脂質解離ピークについてはいずれのトランスジェニック系統においても著しい変化は観察されなかった。したがって我々はこの新規な１組の特性を有する澱粉を得た。
前記した小麦高アミロース澱粉は、高アミローストウモロコシ澱粉と類似しているが、同一ではない構造的および機能的特性を有していた。主たる相違が２点認められた。第１に、高アミロース小麦におけるピークゲル化温度の上昇は、対照トウモロコシとアミロース増量トウモロコシ澱粉との比較において以前観察された相違ほどには異ならなかった。第２にアミロース増量トウモロコシ系統においては澱粉含有量が約３０％低下したが（Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙほか、１９９７年）、高アミロース小麦では澱粉含有量は９％低下しただけだった。小麦中のアミロース含有量の追加的増加は、ｈｐ−ＳＢＥＩＩａおよびｈｐ−ＳＢＥＩＩｂ構築体をＳＢＥＩヌル背景に転移させることにより得ることもできる。
実施例１１．動物実験
動物の飼育
若年成体の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。ラットは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入し、Ａｎｉｍａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｔ ｏｆ ＣＳＩＲＯ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎにおいて、気温（２２±１℃）および照明（０８００〜２０００時に点灯）を制御した室内で底部が金網製の標準的なケージ内で群別に飼育した。
食飼および給飼
到着後ラットは７日間非精製の市販の食飼に慣れさせた。その後体重を量り、無作為に６匹ずつ、平均体重が同じになるように、食飼処置用の２群に分け、精製食飼に移行させた。ＡＩＮ９３Ｇ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１９９３年）仕様書に基づいて標準的な材料から調製した基礎食飼の成分を表８に示す。食飼は、主要栄養素についてバランスをとり、タンパク質２００ｇ／ｋｇ、炭水化物５５０ｇ／ｋｇ（４５０ｇの澱粉および１００ｇのショ糖として）、脂質７０ｇ／ｋｇおよび非澱粉性多糖（ＮＳＰ）９０ｇ／ｋｇを含んでいた。加工した小麦のふすま、サフラワーオイルおよびカゼインを好ましい主要栄養素プロフィールを得るために使用した。低アミローストウモロコシ澱粉を２種の食飼の澱粉含有量を等量（４５ｇ／１００ｇ）にするために使用した。高アミロース小麦食飼は５７６ｇ／ｋｇの新規（高アミロース）小麦を全粒として含有していた。他の処置食飼は３２％〜４８％の間の全粒（低アミロース小麦）または澱粉（低アミロースまたは高アミローストウモロコシ）をそれぞれ含有していた。食飼は様々な成分を少量の水と共に遊星型ミキサーを使用して混合することにより調製することもできる。次いで混合物は、押出成形によりペレット（例えば直径８ｍｍで長さ１〜２ｃｍ）にし、４０℃、１６時間乾燥し、密封した容器に入れて４℃で保存することもできる。他方、本実験で実施したように食飼は粉状に調製し、飲料水と同様に自由に摂食できるようにした。
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ラットは１３日間は処置食飼および飲料水の摂取に制限をされなかった。最後の９日間は、食飼および水の摂取量の正確な見積もりのためおよび分析のために保存する排泄物を全量回収するために動物は１匹用代謝ケージで飼育された。ラットは毎日観察され週に一度体重を計測された。１匹ずつ代謝ケージで飼育した際はラットの食飼消費量を毎日記録し、排泄物重量も同様にした。
飼料摂取量および体重増加
初期体重は群相互の違いはなかった（総平均１９３ｇ；ｎ＝１２、プール後のＳＥ＝３）。食飼は良好に摂食され、この時期のラットに適正な食物消費および体重増加（平均６．５ｇ／日）の速度を維持した。食飼処置は、低および高アミロース小麦においてそれぞれ平均２７８ｇ（ＳＥ＝７、ｎ＝６）および２８２ｇ（ＳＥ＝６、ｎ＝６）であった最終体重に影響を及ぼさなかった。代謝ケージ試験期中の１日当たり食物摂取量は、２群のそれぞれにおいて平均２０ｇ／日（Ｐ＞０．０５）だった。
大腸組織および消化物重量
ラットをハロタンで麻酔し、腹腔を開き、盲腸および結腸の内容物を回収、秤量し、分析まで−２０℃で保存した。盲腸内消化物の湿潤物はその一部の一定量を凍結乾燥し、乾燥の前後で秤量することにより定量した。実験から得られた以下のデータを１群当たり６匹の観察で、平均±標準誤差（ＳＥ）で示した。それらはｔ−検定により分析され、Ｐ＜０．０５の値を有意性の基準値として採用した。
大腸組織の重量は、高アミロース小麦を与えられたラットの方が全般に大きかったが、その効果は盲腸においてのみ有意に近かった（Ｐ＜０．０７）。その内臓では、重量が低アミロース小麦および高アミロース小麦に対して、各々０．９２ｇ（ＳＥ＝０．１８、ｎ＝６）および１．２３ｇ（ＳＥ＝０．３９、ｎ＝６）であった。したがって、高アミロース小麦食飼は組織量を増大させる傾向があった。消化物の平均湿潤重量は新規小麦を与えられたラットにおいて大きく、大腸の各部分において増大している傾向だったが、しかし効果が統計的に有意であったのは、低アミロース小麦食飼を与えられたラットのものより２．１倍より大きかった盲腸においてのみだった（表９）。高アミロース食飼の摂食により通常湿った内腔内容物となるがそれだけでなく、消化物の乾燥重量もまた高アミロース処置により相当に増大していた。
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大腸ＳＣＦＡおよびｐＨ
消化物および排泄物試料をＳＣＦＡ分析用に特定体積の内部標準（ヘプタン酸）と共に希釈し、標準的ガラス電極を使用するｐＨ測定のために完全に混合した。次いでスラリーはさらなる分析を待つため凍結保存した。合計および主要な個々のＳＣＦＡを分析するために、スラリーを融解し、遠心分離し、気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）による定量のため低温、真空での微量蒸留により濃縮した。
盲腸についてのデータを表１０および１１に示す。高アミロース小麦は盲腸内容物のｐＨ値を低下させた（表１０）。合計または個々の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）濃度には有意差がなかった（表１０）一方で、合計および個々の酸についての盲腸消化物貯量は対照と比較して高アミロース小麦食飼を与えられたラットにおいてすべて有意に高かった（表１１）。排泄物中の合計ＳＣＦＡ排泄量もまた、高アミロース小麦を与えられたラットは平均値４６．１（ＳＥ＝５）μｍｏｌ／日であり標準小麦を与えられたラットの２４．７（ＳＥ＝５）μｍｏｌ／日と比較して有意に高かった（Ｐ＜０．０２）。
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本実験は高アミロース澱粉を含有する改変小麦が哺乳動物の胃腸管に明確な変化を導いたことを示した。変化は、改変小麦中の難消化性澱粉（ＲＳ）含量が増大したことと一致し、これにより説明可能であった。重要な結果は、アミロース含量の増大が好ましい生理学的特質に転換されることを確認したことである。したがって、改変小麦は著しい健康上への恩恵を食物を通じて多数の消費者に与える可能性を有する。
食物摂取量および体重増加量は低および高アミロース小麦処置群間において異ならなかったことが観察され、トランスジェニック高アミロース小麦を与えられた動物の成長および動作に不利な影響があったとする証拠はなかった。このことは、体重減少を起こした既知の毒素、レクチンＧａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ凝集素（ＧＮＡ）を含有する生のトランスジェニックジャガイモ澱粉を与えられ、ラットにおける以前の報告（ＥｗｅｎおよびＰｕｓｚｔａｉ、１９９９年）と対照的であった。
穀粒量の制限から前記の実験はラットにおいて比較的短期間で実施される必要があった。にもかかわらず、データは、大腸発酵の指標が標準小麦を与えられたものと比較して高アミロース小麦を与えられたラットにおいて、ＲＳ含量の上昇と一致して、すべて有位に高かったことを決定的に示している。したがって大腸消化物の湿重量およびＳＣＦＡ貯量ならびに排泄物ＳＣＦＡ排出量は、改変小麦を与えられたラットにおいて対照食飼を与えられたものと比較してすべて約１００％大きかった。ｐＨ値もまた有意に低く、これも発酵の増大と一致する。差異は、ＮＳＰではなく、澱粉に帰することが食飼中の繊維量を等しくすることにより確実にされた。このことは大腸機能の促進において酪酸塩のみかけの重要性を考慮していくらか興味深い。総体的にデータは、難消化性澱粉が高く低ＧＩである食物を製造するための高アミロース小麦の可能性を支持する。データは、特に加工食品において、食事を通じて多数の消費者に顕著な健康上の恩恵を与える重要な新規の機構として高アミロース小麦の健康上の可能性を提示する。
実施例１２．パンの製造
高アミロース小麦のような穀粒を食事の中に最も効果的に普及させる方法の１つはパンを通じてである。高アミロース小麦が容易にパンに混合できることを示すため、およびパン製造品質の保持を可能とする要因を検討するために、小麦粉試料を製造し、分析し、パンを焼くことに使用した。最初は少量だけの高アミロース穀粒が入手可能であったため、パン生地の混合および焼き上げは小規模（１０〜１５ｇ）に実行した。このような方法は十分量の穀粒が入手可能の際は容易に商業レベルの規模に拡大することができる。
方法：
小麦穀粒は一晩、水分量１６．５％に調整し、ＢＲＩ Ｌｔｄ、オーストラリアの実験用Ｂｕｈｌｅｒ製粉機またはＱｕａｄｒｏｍａｔ Ｊｕｎｉｏｒ製粉機を使用して製粉し、続いて篩に掛けて最終粒径１５０μｍを得た。試料のタンパク質および水分含有量は、赤外線反射率（ＮＩＲ）によりＡＡＣＣ Ｍｅｔｈｏｄ ３９−１１（１９９９年）に従って、またはＤｕｍａｓ法およびエアオーブンによりＡＡＣＣ Ｍｅｔｈｏｄ ４４−１５Ａ（ＡＡＣＣ、１９９９年）に従って測定された。
ミクロＺアーム混合
小麦粉の最適水分吸収値は、ミクロＺアームミキサーで混合当たり４ｇの小麦粉試料を用いて定量された（Ｇｒａｓほか、２００１年；Ｂｅｋｅｓほか、２００２年）。一定の角速度（高速および低速ブレードに対する軸速度はそれぞれ９６および６４ｒｐｍ）がすべての混合において使用された。混合は３回ずつ、１回当たり２０分間実施された。小麦粉に水を加える前に固体内容物のみで攪拌しベースラインを自動的に記録（３０秒間）した。水の添加は自動水ポンプを使用して一段階で実行された。以下のパラメーターを個々の混合実験から平均をとることにより定量した。ＷＡ％−吸水量は５００Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ Ｕｎｉｔ（ＢＵ）において定量した；パン生地稠度；パン生地形成時間（ＤＤＴ）：ピーク抵抗時間（秒）。
ミキソグラム
改変小麦粉を用いて最適パン生地混合パラメーターを測定するために、ミクロＺアームミキサーで決定した吸水量に対応する様々な吸水量の試料をＣＳＩＲＯ １０ｇミキソグラフ試作機中でパン生地の全質量を一定に保って混合した。各小麦粉試料のそれぞれに対し、以下のパラメーターを記録した：ＭＴ−混合時間（秒）；ＰＲ−ミキソグラフピーク抵抗（任意単位、ＡＵ）；ＢＷＰＲ−ピーク抵抗でのバンド幅（任意単位、ＡＵ）；ＲＢＤ−抵抗破壊率（％）；ＢＷＢＤ−バンド幅破壊率（％）；ＴＭＢＷ−最高バンド幅時間（ｓ）；およびＭＢＷ−最高バンド幅（任意単位、Ａ．Ｕ．）
ミクロ伸長検査
パン生地伸長性パラメーターを以下の通り測定することもできる：パン生地を１０ｇミキソグラフ試作機でパン生地形成ピークまで混合することができる。１ｃｍ／ｓでの伸長検査は、形状改良Ｋｉｅｆｆｅｒ式パン生地／グルテン伸長性装置を備えたＴＡ．ＸＴ２ｉテクスチャ分析機で行ってもよい（Ｍａｎｎほか、２００３年）。伸長検査用パン生地試料（〜１．０ｇ／検査）は、Ｋｉｅｆｆｅｒ成形機で成形し、３０℃、９０％ＲＨで４５分間放置した後、伸長検査をし得る。Ｒ＿ＭａｘおよびＥｘｔ＿Ｒｍａｘは、Ｅｘｃｅｅｄ Ｅｘｐｅｒｔソフトウェア（Ｓｍｅｗｉｎｇ、１９９５年；Ｍａｎｎ、２００２年）の補助を得てデータから決定し得る。
使用した調理法は、１４ｇ小麦粉を１００％として以下の通りである。小麦粉１００％、塩２％、ドライイースト１．５％、植物油２％および食品添加物１．５％（アスコルビン酸１００ｐｐｍ、真菌アミラーゼ１５ｐｐｍ、キシラナーゼ４０ｐｐｍ、大豆粉０．３％、Ｇｏｏｄｍａｎ Ｆｉｅｌｄｅｒ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、オーストラリアから入手）。水の添加量は、完全な配合物に合わせたミクロＺアーム吸水値に基づいた。小麦粉（１４ｇ）および他の成分は３５ｇミキソグラフでピークパン生地発達時間まで混合された。成形および調理は４０℃、８５％ＲＨで２段階発酵手順で行った。焼き上げは、Ｒｏｔｅｌオーブン内で１９０℃、１５分間で行った。パン塊体積（種子（ナタネ）置換法で定量された）および重量測定は棚で２時間冷やした後に行った。実質水分消失量は、規定時間外にパン塊を秤量することにより測定した。
小麦粉または全粒は、好ましいパン生地品質、およびパン製造上または栄養上の品質を得るために、非改変小麦由来の小麦粉または全粒と、あるいは大麦のような他の穀物と混合することもできる。例えば、ＣｈａｒａまたはＧｌｅｎｄａ品種由来の小麦粉はパン生地強度が高く、一方Ｊａｎｚ品種由来では中程度のパン生地強度である。特に、小麦粉中の高分子量および低分子量グルテニンサブユニットの含量は、パン生地強度と正に相関しており、存在する対立遺伝子の性質からさらに影響を受ける。本実施例においては、高アミロース小麦粉は対照非形質転換系統、ＮＢ１由来の小麦粉と混合した。
結果
改変小麦から得た小麦粉の吸水特性を測定した（図４）。この高アミロース粉を割合の様々な対照粉と混合することにより、高アミロース小麦粉は対照粉よりも高い吸水性を有し、このことは、５０．３ｘ／６／（６０．１％アミロース）と８５．２ｃ（８１．０％アミロース）との比較で認識されるように、澱粉中のアミロース含量と正に相関していた。この結果は、澱粉顆粒径および形状の変化が吸水特性に影響を与えたことを反映し得るが、しかし、非澱粉性多糖含有量の変化などの高アミロース穀粒における他の変化もまた吸水量に影響を与えることもできると考えられる。
０：１００から１００：０までの割合で混合した高アミロース粉と対照粉との混合物の比体積も決定しており、そのデータを図５に示す。結果は、高アミロース小麦の添加はパン塊体積を減少させる傾向があることを示す。しかし、高アミロース小麦粉を５０％まで含むパンは、十分に許容できるパン塊体積を有し、標準的白パンの用途に使用することができた。５０％より多い高アミロース小麦粉を含有するパンはパン塊体積が低下した塊となり、全粒パンや混粒パンなどの重質パンに適していた。さらなる食品添加物の操作、グルテンの添加、および／または小麦系統の遺伝的背景の変更によりパン塊体積の観察された低下は恐らく改良されると考えられた。
高アミロースおよび対照小麦粉混合物から製造されたパン生地の最適混合時間を測定し（図６）、混合時間が商業的パン製造への適用に受容できると考えられる範囲内にあったことが示された。
研究は、受容可能なパン構造、食感および外観を含む商業化の可能性を有するパンが高アミロース小麦粉試料を用いて得られたことを示した。さらに高アミロース小麦は、大腸および代謝的健康を改善するための特異的な用法および栄養効能を有する範囲の製品を提供するために好ましい遺伝子背景特徴（例、好ましい高および低分子量グルテニン）、グルテン、アスコルビン酸塩または乳化剤のような食品添加物を添加すること、あるいは異なるパン製造形態（例、スポンジおよび生地パン製造、発酵パン種、混粒、全粒）を使用することと組み合わせて使用することもできる。
実施例１３．食物試料の血糖指数（ＧＩ）および難消化性澱粉（ＲＳ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ測定
実施例１２に記載の通りに製造されたパンを含む食物試料の血糖指数（ＧＩ）を以下の通りｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。
食物試料はＺｙｌｉｓｓ混合機で完全に均一にした。約５０ｍｇ炭水化物に相当する一定量の試料を１２０ｍｌプラスチック試料容器中に秤量し、α−アミラーゼを含まない１００μｌの炭酸緩衝液を加えた。炭酸緩衝液を加えた後約１５〜２０秒後に、５ｍｌペプシン溶液（６５ｍｇペプシン（Ｓｉｇｍａ）を６５ｍｌ ０．０２Ｍ ＨＣｌ、ｐＨ２．０に溶解した。使用当日に調製）を加え、混合物を往復振盪水浴で７０ｒｐｍ、３７℃、３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、試料を５ｍｌ ＮａＯＨ（０．０２Ｍ）で中和し、２５ｍｌ ０．２Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６．０を加えた。その後、２ｍｇ／ｍｌパンクレアチン（α−アミラーゼ、Ｓｉｇｍａ）および２８Ｕ／ｍｌ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ、Ｓｉｇｍａ）を酢酸Ｎａ緩衝液（０．２０Ｍ塩化カルシウムおよび０．４９ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０）に溶解した酵素混合液５ｍｌを加え、混合液を２〜５分間インキュベートした。各フラスコから溶液１ｍｌを１．５ｍｌチューブに移し、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し冷凍庫で保存した。各試料の残りをアルミホイルで覆い、容器を３７℃、５時間水浴でインキュベートした。さらに溶液１ｍｌを各フラスコから回収し、遠心分離し、上清を上記と同様に移した。この試料も吸光度を読み取ることができるまで冷凍庫で保存した。
すべての試料を室温に融解し、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。試料は必要に応じて希釈し（１対１０希釈で通常は十分）、各試料から１０μｌの上清を９６穴マイクロタイタープレートに２回または３回重複させて移した。各マイクロタイタープレートに対する標準曲線はグルコース（０ｍｇ、０．０６２５ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇおよび１．０ｍｇ）を使用して作製した。２００μｌグルコースＴｒｉｎｄｅｒ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｔｒａｃｅ Ｎｏｂｅｌ Ｐａｒｋ、ビクトリア州）を各穴に加え、プレートを室温で約２０分間インキュベートした。各試料の吸光度を５０５ｎｍでプレートリーダーを使用して測定し、標準曲線を参照してグルコース量を算出した。
実施例１２に記載の通り製造されたパンを含む食物試料中の難消化性澱粉（ＲＳ）レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで以下の通り測定した。本方法は試料の調製および、通常の摂食と同様の、食物中の澱粉のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化を記載する。方法は２項を有する：第１に、食物中の澱粉は模倣した生理学的条件下で加水分解された；第２に、副生成物を洗浄により除去し、試料を均一化および乾燥した後に残留澱粉を定量した。消化処理の最後に定量された澱粉は食物中の難消化性澱粉含有量を表していた。
１日目、食物試料は、消費を模倣した方法で、例えば、台所包丁で咀嚼により得られるような稠度に均一化することによって処理した。均一化後、５００ｍｇまでの炭水化物に相当する一定量の食物を１２５ｍｌ三角フラスコ中に秤量した。炭酸緩衝液を、ＮａＨＣＯ３ １２１ｍｇおよびＫＣｌ １５７ｍｇを約９０ｍｌの純水に溶解し、１Ｍ ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ溶液１５９μｌおよび０．４９Ｍ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ４１μｌを加え、０．３２Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを７から７．１に調整し、体積を１００ｍｌに合わせることにより調製した。緩衝液は４℃で５日間まで保存した。１ｍｌ炭酸緩衝液当たり２５０単位のα−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ−３１７６ Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂブタすい臓由来）を含有する人工唾液溶液を調製した。食物の重量とほぼ同量の一定量の人工唾液溶液をフラスコに加えた。唾液を加えてから約１５〜２０秒後に５ｍｌのペプシン塩酸溶液（０．０２Ｍ ＨＣｌ ｐＨ２．０中に１ｍｇ／ｍｌペプシン（Ｓｉｇｍａ）、使用日に調製）を各フラスコに加えた。アミラーゼおよびその後のペプシンの混合は嚥下前のヒトの食物咀嚼を模倣した。混合物は３７℃、３０分間、８５ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。その後混合物を０．０２Ｍ ＮａＯＨ ５ｍｌで中和した。２５ｍｌ酢酸緩衝液（０．２Ｍ ｐＨ６）ならびに、酢酸緩衝液ｐＨ６中に２ｍｇ／ｍｌのパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ、ブタすい臓４ｘ ＵＳＰ活性）および２８Ｕのクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ、Ｓｉｇｍａ）を含むパンクレアチン酵素混合液５ｍｌを各フラスコに加えた。各フラスコはアルミホイルで蓋をし、３７℃、１６時間、８５ｒｐｍに設定した往復振盪水浴でインキュベートした。
２日目、各フラスコの内容物を定量的に５０ｍｌポリプロピレン製チューブに移し、２０００×ｇ、１０分間、室温で遠心分離した。上清を廃棄し、各沈殿を２０ｍｌの水で、各洗浄ごとに穏やかにチューブを渦流攪拌し沈殿を破砕した後に遠心分離することにより３回洗浄した。最終洗浄水５０μｌをＧｌｕｃｏｓｅ Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬を用いて遊離グルコースが存在しないことを検査した。その後各沈殿を約６ｍｌの純水に再懸濁し、Ｓ２５Ｎ−８Ｇ分散器具付きのＵｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ ＴＰ１８／１０を使用して１０秒間、３回均一化した。内容物を定量的に２５ｍｌメスフラスコに移し、その体積に合わせた。内容物を完全に混合し、ポリプロピレン製チューブに戻した。各懸濁液から試料５ｍｌを２５ｍｌ培養試験管に移し、直ちに液体窒素で殻状に凍結し、凍結乾燥した。
３日目、各試料の総澱粉量をＭｅｇａｚｙｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｔａｒｃｈ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅキットから供給される試薬を使用して測定した。標準澱粉（Ｒｅｇｕｌａｒ Ｍａｉｚｅ Ｓｔａｒｃｈ、Ｓｉｇｍａ Ｓ−５２９６）およびアッセイ試薬ブランクを調製した。試料、対照および試薬ブランクは、８０％エタノール０．４ｍｌで湿らせることにより分散を促進した後、渦流攪拌した。直ちに、ＤＭＳＯ ２ｍｌを加え渦流攪拌により溶液を混合した。チューブを沸騰水浴中に５分間置き、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０、５ｍＭ ＣａＣｌ２および０．０２％アジ化ナトリウムを含むに溶解した３ｍｌ耐熱性α−アミラーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）を直ちに加えた。溶液を、３分間ごとに渦流攪拌しながら、さらに１２分間沸騰水浴中でインキュベートした。その後チューブを５０℃の水浴に置き、４ｍｌ酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ４．５、０．０２％アジ化ナトリウムを含む）および３００Ｕ／ｍｌアミログルコシダーゼ０．１ｍｌを加えた。混合液は、１０分間ごとに穏やかに攪拌しながら５０℃、３０分間インキュベートした。メスフラスコ中で体積を２５ｍｌに調整し十分に攪拌した。一定分量を２０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清５０μｌ中のグルコース量をＧｌｕｃｏｓｅ Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬１．０ｍｌを用いて、チューブを最短１８分間、最長４５分間室温で遮光してインキュベートした後に５０５ｎｍでの吸光度を測定することにより定量した。
結果
高アミロース小麦粉（＞３０％アミロース（ｗ／ｗ））で製造されたパンのＧＩおよびＲＳ含有量を定量した。対照として、Ｓｕｎｃｏ系統とＳＧＰ−１三重ヌル変異体との交配から得られた小麦系統（Ｙａｍａｍｏｒｉほか）からもまたパンを製造した。倍加半数体植物を、交配の子孫から得て、３個のＳＧＰ−１変異対立遺伝子について分離したホモ接合系統個体群を供給するために栽培した。各系統における変異対立遺伝子の存在は、各系統から単離されたＤＮＡについての遺伝子特異的（ＳＳＩＩａ遺伝子）ＰＣＲ反応により決定された。したがって、ゲノムＡ、ＢおよびＤ上のＳＳＩＩａ遺伝子に対するそれぞれのヌル対立遺伝子の寄与が、個別におよび可能な組合せそれぞれについてアッセイ可能であった。各系統由来の穀粒を前記の小規模法によるパン製造に使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＩおよびＲＳ測定の結果を図７および図８に示す。
高アミロース小麦粉を０％、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％または１００％使用し、対照の低アミロース小麦粉と混合して製造したパンのＧＩおよびＲＳもまた測定した。データを図７および図８に示す。ＲＳ含量は高アミロース小麦粉の割合が増大するにつれ、アミロース含有量の増加と共に直線的に増大した。完全にトランスジェニック高アミロース小麦からなる小麦粉から製造したパンは、非常に高い難消化性澱粉レベルを示し、トランスジェニック系統８５．２ｃは５０．３系統よりも実質的に高いＲＳ含量を有した（それぞれ６．２対４．５ｇ ＲＳ／１００ｇパン）。したがって、パン製造のために対照（低アミロース）小麦を高アミロース小麦に代えることは、ＲＳの増大と正の相関を示した。
高アミロース小麦澱粉で作られるＲＳ含量は、配合物中に１０％使用される高アミローストウモロコシ澱粉（「Ｈｉ−Ｍａｉｚｅ」）を含有する市販のパン（ワンダーホワイト（Ｗｏｎｄｅｒｗｈｉｔｅ））よりはるかに高く、このパンは＜１％のＲＳを含有していた。さらに、品質に影響を与えることなくパンに混合することができるトウモロコシ澱粉の最高レベルは約１０〜１２％に限られる。したがって、パン製造における高アミロース小麦の使用によって、実現可能なＲＳ含量を含む重要な利点が得られた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ澱粉加水分解速度は野生株小麦を用いて製造したパンと比較して改変小麦を用いて製造したパンにおいて低下していた。高アミロース小麦粉の百分率が３０％に増えるまでの間ではＧＩはわずかに減少しただけだったが、しかしその後高い割合の高アミロース小麦が添加されるとさらに急速に減少した。ＧＩ低下についての最大の利益は、少なくとも５０％の高アミロース小麦粉を用いて製造した食物において観察された。高アミロース小麦８５．２ｃ系統を使用して製造したパンは、５０．３系統を用いて製造したパンよりもｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定でわずかに低いＧＩを示した。
考察
小腸において消化され、または消化されないと予想される食品中の澱粉量を推定する際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは有用であった。それにより、食物のｉｎ ｖｉｖｏでのＧＩおよびＲＳ含有量を正確で確実に予測するとみなされる値が得られた。重要なことには、食物は「消費時点」として分析されたものであるが、この消費時点は、食物加工法がＲＳ含量に有害な低下効果を及ぼし得ることを考慮すると重要である。改変小麦のパンの場合は、生理的な機能性（特に高ＲＳおよび低ＧＩ）が調理および保存中に破壊されなかったこと、および消費時点でも恐らくその機能性が存在していると思われることが、その結果より示された。
大部分の澱粉性加工食物は、ＲＳの含有量が非常に少ない。野生株小麦粉と、従来の配合物および焼き上げ工程とを使用して製造したパンは、ＲＳを＜１％含有していた。対照的に、同様の工程および保存条件を使用して焼き上げるが、改変高アミロース小麦を含有するパンは１０倍高いＲＳ含量を有していた。人間の食事において数少ない豊富なＲＳ源であるマメは、通常＜５％のＲＳ含量を有する。したがって、通常成人により消費される量の高アミロース小麦のパン（例、２００ｇ／日）の消費で、少なくとも５〜１２ｇのＲＳが容易に供給されよう。したがって、食品中に高アミロース小麦を混合することは、ＲＳの１日当たりの平均摂取量が約５ｇだけと推定される先進国において食物性ＲＳの摂取に相当の貢献をする可能性を有する。
小腸での消化に抵抗性の澱粉は大腸に入り、そこでは主に細菌叢との相互作用で大腸の生理学および機能に有益な影響を有する。
澱粉が加水分解されるおよび小腸において吸収される速度はその代謝特性をかなりの程度決定する。ＧＩは食物をその食後血糖反応に従って評価する。急速に消化される（高ＧＩ）澱粉性食品は、糖尿病、肥満および恐らく特定のガンに対するリスクを増大させることを含む健康に有害な帰結を有する。改変小麦粉（トランスジェニック）から製造されたパンは、特に改変小麦粉の比率がパン配合物中の粉成分の少なくとも５０％を占める場合、低ＧＩ（＜５５）を有することが示された。澱粉以外の改変穀粒中の成分、例えば非澱粉性多糖類（ＮＳＰ）なども、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した際の澱粉消化性の低下に寄与する可能性もあった。データは、改変小麦から製造されたこれらの製品は慢性疾患のリスクを低減する可能性を有し、血中グルコースの食後上昇を遅延させることにより、２型糖尿病を予防または制御することに特に有用となり得ることを示唆した。
さらに改変小麦中に存在する澱粉はさらに遅くおよび広範囲でなく消化されたことから、新規小麦から製造された食物はエネルギー密度が減少しており飽満を促進できる。したがって、食物は肥満の予防および管理に有効となり得る。食物は特定の疾患および病状の治療または制御における用途、例えば大腸の健康および機能を促進する経腸製剤、１型糖尿病または疾患のリスクのある人の血糖制御を補助する栄養製品としての用途を有し得る。
実施例１４．病状の治療または予防
血糖代謝異常
腸の健康改善以外に、本発明は、正常血糖の促進、および血糖調節障害の治療、予防またはリスク低下に適すると考えられる方法および組成物を提供する。これは改変小麦澱粉を含む食物の潜在的血糖指数の低下が観察されたことに基づく。これは、例えば競技者のような健康な対象においておよび外科手術または化学療法を受けている患者など易感染性の個人の両方において有用であることができる。特に、日中または夜間に最適な血糖レベルを維持する方法を求めている糖尿病患者において非常に有用となり得る。個人の血糖レベルは、運動、薬物または外科的治療によって、疾患または多数の疾患を含む症候群もしくは代謝障害によって乱れるまたは変化し得る。実施例は、競技者、化学療法で衰えた患者、絶食患者およびグルコース代謝の乱れまたは変化による疾患または障害を受けている患者、もしくはこれらのおよび他の疾患または障害を治療中の患者を含む。さらに実施例はヒトの他に例えばペット、家畜または競走馬などのような動物を含む。
方法および配合は、血糖制御の改善、すなわち血糖レベルを安定させることおよび非健康的高および低血糖レベル間の変動を軽減することのために使用してもよい。血糖制御の欠如は、糖尿病性網膜症、糖尿病性ケトアシドーシスまたはいわゆる糖尿病性昏睡などが発症する血管損傷に特に関連している。
既存の治療方法は、あるレベルの難消化性澱粉を提供する未調理のトウモロコシ澱粉を使用するものである。しかし、長期間毎日消費することに適する快い食味および食感を有する未調理のトウモロコシ澱粉の配合物を調製することは困難であり、したがって承諾に影響がでている。したがって、難消化性澱粉を含有し、夜間または短時間ごとの摂食が不可能である他の時間帯に糖尿病患者の血中グルコースを許容可能なレベルに保持するための緩効性炭水化物源として、当明細書記載の改変小麦澱粉を投与することによる糖尿病性低血糖の治療には利益がある。
したがって、澱粉は小腸において可溶性である配合で投与されてもよい。改変小麦澱粉の配合に含まれる好ましい物質はアラビアゴム、アルギン酸カリウム、グアーガム、メチルセルロース、エチルセルロース、液体油、液体および固形脂質ならびにパラフィン、水素添加綿実油、蜜蝋およびカルナバロウのようなワックスなどの多量体を含む。
尿毒症
腎不全では、糸球体ろ過速度の低下がおこり、腎臓が血液のホメオスタシスを維持することができない。水分の保持は浮腫を引き起こし、水素イオン濃度が増大することもあり、アシドーシスが発症することもあり、窒素性老廃物が蓄積することもあり、血液および組織において尿毒症と呼ばれる状態が発生することもある。尿毒症の例には、アンモニア、尿素、クレアチニン、フェノール、インドール、ならびにより大きな分子が挙げられる。血清クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、尿酸、およびＮ−メチルグアニジン（ＮＭＧ）、グアニジノこはく酸（ＧＳＡ）などのグアニジン化合物の濃度は有意に変化する。
尿素、クレアチニン、尿酸などの窒素性老廃物は、他のいくつかの低および中程度の分子量の化合物と共に小腸に流入し、多数の治療努力は腸を腎臓機能の代用として使用することに基づいてきた。ローカスビーンガム（ｌｏｃｕｓ ｂｅａｎ ｇｕｍ）のように、多数の吸収性化合物がこの目的に使用されてきた。排泄物体積およびＳＣＦＡの生成を増大させることによりそのような有益な影響を生じることができるとも考えられる。短鎖脂肪酸は腸の内容物を酸性化し、浸透機能を通じて腸内腔へ水分を流入させて緩下効果を提供し、過度の成長を予防し、アンモニアおよび他の窒素性老廃物の排出（ｅｌｅｍｉｎａｔｉｏｎ）を促進する。これにより排泄物中の生物体量の増加を生じ、その際、尿素およびアンモニアは微生物のタンパク質合成またはアンモニウムイオンへの転換のため捕らえられる。微生物の増殖および発酵への刺激を通じて、高アミロース澱粉などのプレバイオティクス化合物もまた大腸の性質に影響を与え、穏やかに緩下的である。
したがって、本発明は、低価格のサプリメントとしてあるいは腎不全、肝不全、先天性尿素代謝異常もしくは胃腸障害または疾患に対する治療において使用されることもできる改変小麦澱粉を提供する。改変小麦澱粉により提供された効果の簡便な測定は血清クレアチニンレベルを確定することにより定量できる。
実施例１５．改変小麦から製造した食物の血糖指数の定量
ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化試験および動物食飼供給試験は、改変小麦澱粉から製造された食物は消化時に比較的遅くグルコースを放出すること示した。人間の場合もこれが当てはまるかを確証するためには、食物のＧＩを測定しその値を野生株澱粉から製造した対応する食物の値と比較する食事供給試験を志願者について実行することになろう。ＧＩは、炭水化物を含む人間の食物を食後の血糖反応に応じて重量比較に基づいてランク付けする。これは、世界的に十分認知されている相当な臨床的および実用的有用性を有する。本研究の特定の目的は、改変全粒を使用して製造した２種の一般的なパン食品、パンおよびマフィンの血糖指数（ＧＩ）を決定することである。本研究では、対照炭水化物と比較して改変食物が志願者の血糖値を上昇させる程度を評価し、これを標準小麦粉を使用して製造された同種のパン食品のＧＩ値と比較することになろう。
標準小麦および高アミロース小麦を製粉し、得られた全粒粉でパンおよびマフィンを焼くことになろう。すべての食物は商業的製造者によって産業標準に従って製造されよう。代表試料中の有効炭水化物量を定量することになろう。食物中の炭水化物量を定量する通常の方法は「差引による」、すなわち残りの成分（タンパク質、脂質、水分、灰分および繊維）の合計を１００から差し引くことにより定量する。しかし、この手法は直接分析によって得られる値と比較して元来信頼性に劣る。そこで、我々は検査食物中の有効炭水化物を算出するために、一般に認められた分析技術（ＡＯＡＣ）を使用して検査食物の近似的組成を定量することになろう。
１４名の被験者が募集されよう。ＧＩは１０名以上の被験者を含むデータセットを使用して算出され、したがって志願者が４名余分に参加する試験を開始することは、起こり得る中止および異常値の除外を考慮するのに十分なはずである。予定される志願者は本試験の目的、手順および危険性を通知され、同意書を用意することを求められよう。
志願者は１６から６５歳であり、糖尿病ではなく、または血友病、腎疾患や肝疾患にも罹患しておらず、既知の食物アレルギー、穀物性食物に対する過敏症や不耐性（例、腹腔（Ｃｅｌｉｃ）スプルー）もなく、グルコース耐性に影響することが知られている薬剤（経口避妊薬は除外する）を摂取しておらず、空腹時血糖値が３．５から６．０ｍｍｏｌ／ｌの間であることが必要である。これらの見地から、志願者は正常であり、健康である。調査者により、本研究の手順を理解し、またはそれに従う意志、見込みまたは能力がないとみなされる人々は排除されようが、他の調査研究に本提案研究開始に先立つ３０日以内で参加していた人々も同様に排除されよう。予定される志願者は、空腹時血糖値が３．５から６．０ｍｍｏｌ／ｌの間であることに基づいて予備選抜されよう。空腹時血糖値が異状に高い被験者は、グルコース負荷試験を受け、医師に相談することを勧める通知書を受け取ることになろう。
被験者は空腹状態で診療所に来ることを要請される。被験者は少なくとも各検査の１０時間前からは食物または水以外の飲料を摂取することを許可されず、前日の夜はアルコールおよびマメを摂ってはならず、検査の直前および検査中は激しい運動をしてはならない。血液試料２点を５分以内の間隔で採取し、グルコースについて分析し、その平均結果が血糖濃度の基準値として採用されよう。検査の度に毛細血管（指刺し）の全血を採取することになろう。
特定量の食物を被験者に与えることになろう。４種の小麦主体食物を検査することになろう。すなわち、改変小麦または標準小麦（どちらも全粒として）からそれぞれ製造したパンおよびマフィンである。検査および参照食物は無作為順に与えられよう。グルコースが参照食物となり、それは５０ｇ無水グルコース粉末を２５０ｍｌの水に溶解し、炭水化物量を検査食物１回分と厳密に等量としたものである。参照食物は各被験者について３回ずつ、パンおよびマフィンでの検査の付近３カ月間以内のそれぞれ別の日に検査する。検査食物は５０ｇのグルコース性（有効な）炭水化物を含有し、志願者は食物を１２分間から１５分間以内に摂食するように指導される。被験者はすべての検査食物および参照食物を１２分間から１５分間以内で均等な速度で摂取する。被験者は食物を摂取するために水２５０ｍｌを与えられよう。検査中は被験者は安静にする。
続く２時間における血糖濃度の変化を、ＦＡＯ／ＷＨＯ（１９９８年）より出版された方法に基づくＧＩを検査するための標準的な手順に従って記録する。血液試料は食物の最初の一口を摂った直後から開始し、１５、３０、４５、６０、９０および１２０分後に採取する。試料はグルコースについて２回ずつ検査し、２回の検査値は０．３ｍｍｏｌ／ｌより多い変化があってはならずＣＶが＜３％であるために追加の血液試料を必要としてもよい。血中グルコースは、標準溶液でのアッセイ間の係数変化が＜３．０％である分光光学技術を使用して定量する。
ＧＩを血糖反応として定量し、標準量の検査食物（通常５０または２５ｇの炭水化物、本治験では５０ｇ）を摂取した後の血糖反応曲線下での増加面積として測定し、同被験者が別の機会に参照食物（グルコース）から摂取した同量の炭水化物についての平均血糖反応（ＩＡＵＣ）に対する百分率として表す。
計算
血糖反応曲線（濃度対時間）を描き、曲線下の面積を台形規則を適応して幾何学的に算出する。空腹時濃度より下方の面積はＧＩ算出においては無視する。グルコースを参照食物として用い、定義によりそのＧＩは１００である。
個々の被験者における検査食物のＧＩ＝
（検査食物に対する血糖反応曲線の積分面積）／（対照に対する血糖反応曲線の積分面積）×１００
検査食物のＧＩ＝志願者１０名以上の平均ＧＩ。
改変小麦から製造した食物が有意に低いＧＩを有するかどうかを決定するために分散分析を使用する。標準小麦から製造した全粒粉食物は非常に高いＧＩ（＞７０）を有すると期待されることから対応する改変小麦を含有する食物は、６９以下、最も可能性が高くは６０より低い低ＧＩを記録すると期待される。
実施例１６．ヒト志願者におけるシリアル製品中の難消化性澱粉含有量の定量
難消化性澱粉（ＲＳ）は、上部腸での消化に抵抗性で大腸に進行する澱粉である。量的に、それは大腸細菌叢の主な発酵基質源であり、そこで澱粉を大腸壁の健康および代謝保護に決定的だと考えられている代謝産物に転換する。特に、特定型の難消化性澱粉の細菌発酵は、機能不良となった細胞を排除することにより大腸ガンを予防することもできるプログラムされた細胞死および関連する過程を促進するその能力によって考慮すべき注目を引いている主要な有機酸である酪酸塩のようなＳＣＦＡの生成に助力する。
アミロースが増大した改変小麦が上部腸において消化分解を受けにくいかどうか検査するために、摂食治験をヒトで回腸人工肛門保有者において実行する。特に、研究により高アミロース小麦粉から調製された典型的な食物中の難消化性澱粉含有量を正確に定量する。ヒト（ｉｎ ｖｉｖｏ）において食物中の難消化性澱粉を測定する唯一の効果的な方法は永久的で機能良好な回腸人工肛門を有する志願者を利用することである。大腸人工肛門モデル技術は、食物構成要素の上部腸での消化吸収を分析するための確実な方法であると広く考えられている。
その手順は簡単であり、単純に多数の健康な回腸人工肛門保有者に高アミロース小麦または対照として対応する低アミロース小麦から製造される種々の検査食物を与えることを含む。小腸からの澱粉および澱粉加水分解物の回収率は総澱粉量についての標準的な分析技術を使用して定量される。
志願者は事前に募集された既存の被験者プールからまたは地域病院の人工肛門担当看護婦を通じて募集される。治験に含まれ得る被験者は、年齢２０〜８０歳、男性または女性、小腸の機能を調整する可能性のあるまたは調査者の意見により本研究に影響を与えるとされる薬物治療を受けていない者、酒または薬物乱用の既往のない者、本研究開始前の３０日以内にいかなる実験薬物をも使用していない者、胃腸、腎臓、肝臓の疾患または腸の炎症を有しない者である。被験者は最小回腸末端切除（＜１０ｃｍ）の経験を有し、通常の機能良好な恒久回腸人工肛門を有しなければならない。被験者は本研究における酒および食事の制限について承諾する意志がなければならない。
排除基準は以下を含む：大腸機能に影響を与えることもある形式を問わない薬物療法または治療あるいは定期的な補助薬の使用、確定または推測される澱粉または他の食物に対しての有害事象または不耐性の個人既往暦または家族暦、妊娠している女性または性的活動があり妊娠の可能性があり不適切な避妊法を実行している女性被験者、調査者により研究手順および制限を理解し、またはそれに従う意志、見込みまたは能力がないとみなされる人々、要求の通り回腸排出物を回収する意志または能力がない人々および研究パラメーターに影響を与えうる補助剤を摂取した被験者。被験者は適切な情報を提供された後同意書の提出を依頼される。
少なくとも８名の志願者を募集する。統計学上の計算により、基準値（α＝０．０５）を超える回腸澱粉排出の２００％の増加を８０％の確率で検出すべき場合は最小６名の被験者が必要であることが明らかである。１日目の基礎澱粉排出は恐らく約０．５ｇである。改変穀物から製造され、４％の難消化性澱粉を含有する穀物製品の標準給仕量（〜６０ｇ）の摂取により追加的に２．４ｇの澱粉が回腸末端で得られると期待される。したがって、２日目に、総澱粉回収量は約３ｇ近く、基準値から５倍増大することが予想される。
研究開始前に、志願者には本研究についての詳細な説明がなされよう。志願者は自身の自宅で各研究を実行する。研究は３週間にわたり３回の４８時間摂食治験からなる。志願者は連続する２日間（通常火曜日および水曜日）低澱粉食となりその間志願者は特定の間隔で回腸人工肛門用袋から全内容物を以下に詳細を記載する通り回収する。基礎食は、低難消化性澱粉となるように栄養士により設計され、個人の要求を満たすように仕立てられる。したがって、検査食物以外の全穀粒粉パン、バナナ、朝食用シリアル、マメおよび難消化性澱粉を含む他の食物のような食物は回避される。第２日において、被験者は検査食物のうちの１つを摂取することも要求される。約５０〜１００ｇの穀物性食物（およそ中から大給仕量）が２日目の午前７時３０分に摂食される。
研究で摂食される食物は地域のスーパーマーケットを源とし、各研究の開始に先立って志願者に配達される。志願者は彼等自身の食事を詳細な説明に従って調製する。改変穀物製品は商業的穀物製品製造業者により製造される。液体（アルコール以外、水、茶、コーヒー）は志願者により自由に摂取されてよい。要求された食物の摂取は研究の活動期においては厳密に観察される。エネルギーおよび主要栄養素の摂取は研究期の間測定され、食物日記から推定される。以下の計画に従って、食事は摂られ、回腸人工肛門袋は完全に空にされ内容物は回収される。
１日目。基礎食
回腸人工肛門袋の内容物を午前７時に回収しドライアイス上で凍結する。基礎食の食物を朝食（午前７時３０分）、モーニングティー（午前１０時３０分）、昼食（午後１２時３０分）、アフタヌーンティー（午後３時３０分）および夕食（午後６時３０分）として摂る。回腸人工肛門の内容物を午前７時から午後１１時まで２時間ごとに回収し、凍結する。
２日目。基礎食に検査食物を加えた朝食。検査食物（５０〜１００ｇ）を等量の基礎食の代用とすることを除き同一様式で続ける。
３日目。回腸人工肛門袋内容物の午前７時回収。各試料回収時点において、志願者は彼等の回腸人工肛門袋から全内容物を適切に表示した容器内に回収し、次いでその容器を密封し、直ちにドライアイスを入れた断熱保冷庫内に置く。試料は志願者の自宅から毎日回収され分析まで凍結保存（−２０℃）される。
回腸消化物について実行されるアッセイは：各試料の湿重量および日排出量としての排出量、水分含有量、澱粉含有量、麦芽糖含有量、グルコース含有量、ＳＣＦＡ含有量およびｐＨ。澱粉加水分解物（遊離グルコースおよび麦芽糖）は、それらが澱粉由来であるが消化を免れ、したがって難消化性澱粉画分の構成要素であることから、分析される。
短鎖脂肪酸およびｐＨは、遠位小腸の代謝活性細菌叢についての全般的な情報を提供する。各被験者個人における回腸細菌活性は澱粉消化性の多様性の可能性源である。
基礎食の一例は以下の通り：
栄養素（全日程の平均）
エネルギー：８５９５．１９ｋＪ 炭水化物：２３２．２９ｇ
澱粉：５８．６５ｇ タンパク質：９７．９４ｇ
食物繊維：１９．１１ｇ
総脂質：８４．０６ｇ 総糖類：１６８．６９ｇ
エネルギー割合（全日程の平均）
タンパク質：２０％ 脂質：３７％
炭水化物：４４％ アルコール：０％
脂質割合（全日程の平均）
ポリ：１２％ モノ：３８％ 飽和：５１％
Figure 0005638736
考察
摂食された種々の割合の澱粉は上部消化器官において分解されない。非消化（レジスタント）澱粉は、それにより多数の恩恵があるとされる結腸（大腸）に進行し、腸の領域に存在する細菌複合集団の作用を通じて大きな影響をもたらす。利用される澱粉については、結腸の細菌は、種々の決定的な健康関連機能を提供する有機酸を作り上げる。機能には、腸に並ぶ細胞にさらに必要なエネルギー源を提供し、腸粘膜の成長を促進および制御し、および腫瘍性形質転換を受けた細胞の増殖を停止することが含まれる。この食事を摂る個人は、結腸直腸ガンおよび大腸の特定の他の重篤な変性疾患について高リスクであると考えられ、恩恵的細菌性代謝産物はたびたび供給不足である。個体群研究は澱粉消費の増大に伴い（および難消化性澱粉の含有により）大腸ガン退縮の証拠を示す。見地における難消化性澱粉の予防効果は食物繊維のそれより大きいようである。全身の健康にも難消化性澱粉による恩恵が見られるが、この場合の恩恵は小腸における生理学的な作用を通じてもたらされる。難消化性澱粉に富む食物を摂取することにより、エネルギー摂取量および血糖指数が減少する。体重減少もまた難消化性澱粉が誘導した基礎代謝率の増加を通じて促進されることができる。
人間においては、小腸での消化が、澱粉同化の律速段階であると思われ、それはいくつかの重要な生理的要因により本質的に支配されているが、最も重要な要因は咀嚼および小腸内消化物移行である。難消化性澱粉は明確に生理的存在であり、協調して作用する種々の生理過程の産物である。したがって、それは澱粉性食物に固有の物質的構成要素ではない。
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Claims (29)

  1. 哺乳動物の腸の健康または代謝健康の１種または複数の指標を改善するために前記動物の消化管に送達される、食品または医薬品の調製のための小麦植物由来の穀粒の使用であって、
    前記小麦植物が、（ｉ）内胚乳中の、ＳＢＥＩＩａタンパク質およびＳＢＥＩＩｂタンパク質、ＳＢＥＩＩａ酵素活性およびＳＢＥＩＩｂ酵素活性、またはその双方のレベル減少と、（ｉｉ）野生型小麦胚乳に比して、内胚乳中のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベル減少を起こす遺伝子変異とを含み、
    前記遺伝子変異が、（ｉｉｉ）ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異、または（ｉｖ）ＳＢＥＩＩａ遺伝子発現を阻害するアンチセンス分子または二重鎖ＲＮＡ分子である導入核酸、を含み、
    前記穀粒の澱粉中のアミロース比率が少なくとも５０％であり、
    内胚乳中の前記ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂタンパク質、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ酵素活性、またはその双方のレベルの低下が、野生型の小麦植物の胚乳中のタンパク質または活性のレベルと比較して少なくとも４０％である使用。
  2. 前記穀粒の澱粉中のアミロース比率が少なくとも６０％である、請求項１に記載の使用。
  3. 前記穀粒のアミロペクチンが、アミロペクチンのイソアミラーゼ脱分枝後に測定した場合に、野生型穀粒のアミロペクチンに比して、減少比率の４〜１２ｄｐ鎖長分画を有する、請求項１または請求項２に記載の使用。
  4. 前記穀粒の澱粉が、示差走査熱量計で測定した場合、野生型穀粒の澱粉に比してゲル化温度の増加を示す、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
  5. 前記穀粒の澱粉が、示差走査熱量計で測定した場合、野生型穀粒の澱粉に比してゲル化温度の減少を示す、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
  6. 前記穀粒の澱粉が、少なくとも２％の難消化性澱粉を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
  7. 前記小麦植物が、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｓｓｐ．ａｅｓｔｉｖｕｍまたはＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍと交配できる小麦属の一員である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
  8. 前記食品または医薬品のうち少なくとも一部は、全粒、または製粉、挽き割り、精白、ロール、粗挽き、パーボイルもしくは荒挽きをした粒の形態で前記動物に供給される請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
  9. 前記食品または医薬品は、前記穀粒に由来する、粉、全粒小麦、セモリナ、または実質的に精製されたデンプンである成分を含む食品又は飲料の形で動物に供給される請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
  10. 前記食品または医薬品は、別の供給源からの、粉、全粒小麦、セモリナ、または澱粉を含む食品または飲料の形態で前記動物に提供される請求項１ないし９に記載の使用。
  11. 前記食品または医薬品は、食物または飲料の形態で前記動物に供給され、かつ、前記デンプンを前記食物または飲料の調製前もしくは調製中に、少なくとも６０℃の温度に１０分間加熱する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
  12. 前記食品または医薬品は、経口的に送達される請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用。
  13. 前記動物が人間である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用。
  14. 消化管に送達される穀粒由来の澱粉の量が１日当たり少なくとも１０ｇである、請求項１３に記載の使用。
  15. 腸の健康の１つまたは複数の改善指標が、
    ｉ）腸内容物のｐＨ低下、
    ｉｉ）腸内容物中の全ＳＣＦＡ濃度または全ＳＣＦＡ量の増加、
    ｉｉｉ）腸内容物中の１種または複数のＳＣＦＡの濃度または量の増加、
    ｉｖ）糞便体積の増加、
    ｖ）腸または糞便の全水分体積の増加、
    ｖｉ）便通の改善、
    ｖｉｉ）プロバイオティック細菌の１種または複数種の活性の個数の増加、
    ｖｉｉｉ）糞便中への胆汁酸排泄の増加、
    ｉｘ）腐敗性産物の尿濃度の減少、
    ｘ）腐敗性産物の糞便含量の減少、
    ｘｉ）正常な結腸細胞の増殖量増加
    ｘｉｉ）腸炎のある個体の腸における炎症の低下、
    ｘｉｉｉ）尿毒症患者における、糞便または大腸での、尿素、クレアチニンおよびリン酸のいずれか１種の量の低下、あるいは
    ｘｉｖ）前記項目の任意の組合せ
    を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用。
  16. １つまたは複数の前記改善指標が、
    ｉ）腸内容物のｐＨ低下、
    ｉｉ）腸内容物中の全ＳＣＦＡ濃度または全ＳＣＦＡ量の増加、
    ｉｉｉ）腸内容物中の１種または複数のＳＣＦＡの濃度または量の増加、
    ｉｖ）糞便体積の増加、
    ｖ）腸または糞便の全水分体積の増加、
    からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
  17. 代謝健康の１つまたは複数の改善指標が、
    ｉ）食後のグルコース変動の安定化、
    ｉｉ）改善された血糖反応、
    ｉｉｉ）食前の血漿インスリン濃度の低下、
    ｉｖ）改善された血液脂質プロファイル
    ｖ）血漿ＬＤＬコレステロールの低下、
    ｖｉ）尿毒症患者における尿素、クレアチニンおよびリン酸の１種または複数の血漿濃度の低下、
    ｖｉｉ）異常血糖反応の改善、あるいは
    ｖｉｉｉ）前記項目の任意の組合せ
    を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の使用。
  18. 治療または予防するために前記食品または医薬品を使用する際の１つ又は複数の状態が、便秘、下痢、過敏性腸症候群、クローン病、結腸直腸癌、憩室疾患、潰瘍性大腸炎、高血液ＬＤＬコレステロール、腎疾患もしくは他の疾患に起因する尿毒症、または糖尿病である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用。
  19. 前記動物が人間であり、前記食品または医薬品中の澱粉の送達量が１日当たり５〜３０グラムである、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の使用。
  20. 小麦植物の穀粒に由来する、少なくとも１％の難消化性小麦澱粉を含む食物、飲料または医薬製剤であって、
    前記小麦植物が、（ｉ）内胚乳中の、ＳＢＥＩＩａタンパク質およびＳＢＥＩＩｂタンパク質、ＳＢＥＩＩａ酵素活性およびＳＢＥＩＩｂ酵素活性、またはその双方のレベル減少と、（ｉｉ）野生型小麦の胚乳に比して、内胚乳中のＳＢＥＩＩａ遺伝子発現、ＳＢＥＩＩａ酵素活性、またはその双方のレベル減少を起こす遺伝子変異と、を含み、
    前記遺伝子変異が、（ｉｉｉ）ＳＢＥＩＩａ遺伝子の変異、または（ｉｖ）ＳＢＥＩＩａ遺伝子発現を阻害するアンチセンス分子または二重鎖ＲＮＡ分子である導入核酸、を含み、
    前記穀粒の澱粉中のアミロース比率が少なくとも５０％であり、
    内胚乳中の前記ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂタンパク質、ＳＢＥＩＩａとＳＢＥＩＩｂ酵素活性、またはその双方のレベルの低下が、野生型の小麦植物の胚乳中のタンパク質または活性のレベルと比較して少なくとも４０％である食物、飲料または医薬製剤。
  21. 腸の健康または代謝健康の１つまたは複数の指標を改善するために、哺乳動物の消化管へ送達するために使用する際の、請求項２０に記載の食物、飲料または医薬製剤。
  22. 前記穀粒に由来する少なくとも２％の難消化性澱粉を含む、請求項２０または２１に記載の食物、飲料または医薬製剤。
  23. 前記難消化性小麦澱粉を少なくとも３％含む、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の食物、飲料または医薬製剤。
  24. 前記澱粉を少なくとも６０℃で少なくとも１０分、１回または複数回加熱し、その加熱を前記食物、飲料または医薬製剤の調製前または調製中に行う、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の食物、飲料または医薬製剤。
  25. パン、ケーキ、ビスケット、朝食用シリアル、麺類、ソース、スープ、パスタ、即席麺、およびパンケーキやケーキミックスなどのプレパックミックスからなる群から選択される食物である、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の食物、飲料または医薬製剤。
  26. 医薬として許容可能な賦形剤をさらに含む医薬製剤である、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の食物、飲料または医薬製剤。
  27. 錠剤、カプセル、顆粒剤、散剤、シロップおよび懸濁剤からなる群から選択される形態の経口投与に適した、請求項２６に記載の医薬製剤。
  28. 前記澱粉を粉、全粒小麦または穀粒の形態でパンの調製中に添加し、粉、全粒小麦または穀粒の形態の非改変小麦澱粉と混合したパンであり、
    食物、飲料または医薬製剤中の全澱粉の少なくとも５％が、内胚乳中の、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂタンパク質、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ酵素活性、または双方のレベル低下と、遺伝子変異とを含む穀粒由来である請求項２５に記載の食物、飲料または医薬製剤。
  29. 直ちに販売できるように、またはバルク形態で包装されている、請求項２０から２８のいずれか一項に記載の食物、飲料または医薬製剤。
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