DE4327165A1

DE4327165A1 - Debranching-Enzyme und deren kodierende DNA-Sequenzen, geeignet zur Veränderung des Verzweigungsgrades von Amylopektin - Stärke in Pflanzen

Info

Publication number: DE4327165A1
Application number: DE4327165A
Authority: DE
Inventors: Jens Dr Kosmann
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1993-08-09
Filing date: 1993-08-09
Publication date: 1995-02-16
Also published as: IL110583A0; AU7535294A; JPH09501052A; AU693469B2; US6001628A; CA2169174A1; EP0713531A1; HUT73740A; HU9600285D0; US6433253B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die auf dem kodogenen Strang pflanzliche Debranching-Enzyme kodieren, deren in transgenen Pflanzen gebildeten Transkripte neue Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, die in transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke reduzieren und DNA-Sequenzen, die auf dem kodogenen Strang pflanzliche Debranching-Enzyme kodieren, deren in transgenen Pflanzen gebildeten Transkripte die Synthese von Proteinen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen verhindern, was in den transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke steigert, sowie Plasmide, auf denen diese DNA-Sequenzen lokalisiert sind, die in Pflanzenzellen und Pflanzen eingebracht werden können.

Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur Herstellung von gentechnisch veränderten Pflanzen, deren Amylopektin-Stärke modifiziert ist, und die aus diesen Pflanzen erhaltbare modifizierte Stärke.

Polysaccharide wie Stärke sind neben Ölen, Fetten und Proteinen die wesentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen.

Ein entscheidender Faktor, der der Verwendung von nachwachsenden Rohstoffen im Wege steht, ist der Mangel an Stoffen, die in Form, Struktur oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern den Erfordernissen der chemischen Industrie genau entsprechen. Um eine Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es insbesondere wichtig, eine große Stoffvielfalt zu erreichen. Bezogen auf Polysaccharide bedeutet dies, daß beispielsweise möglichst viele unterschiedliche Stärkeformen bereitgestellt werden müssen. Hierbei ist sowohl an stark verzweigte Formen zu denken, die in ihren chemischen Eigenschaften durch eine hohe Oberflächenreaktivität gekennzeichnet sind, wie auch an gering verzweigte Typen, die sich durch eine hohe Einheitlichkeit im Aufbau auszeichnen. Einheitlichkeit im Aufbau ist eine wichtige Voraussetzung für hocheffiziente Reaktionsführung bei chemischen Synthesen.

SEQ ID NO: 1
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Peptid
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Solanum tuberosum
EIGENSCHAFTEN: Debranching-Enzym
SEQ ID NO: 1
SEQUENCE TYPE: amino acid
SEQUENCE LENGH: 21 amino acids
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: peptide
ORIGINAL SOURCE
ORGANISM: Solanum tuberosum
PROPERTIES: debranching enzyme

SEQ ID NO: 2
ART DER SEQUENZ: Aminosäure
SEQUENZLÄNGE: 20 Aminosäuren
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Peptid
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Solanum tuberosum
EIGENSCHAFTEN: Debranching-Enzym
SEQ ID NO: 2
SEQUENCE TYPE: amino acid
SEQUENOE LENGH: 20 amino acids
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: peptide
ORIGINAL SOURCE
ORGANISM: Solanum tuberosum
PROPERTIES: debranching enzyme

Obwohl die Stärke ein Polymer aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glukosemolekülen, darstellt, ist sie ein komplexes Gemisch aus sehr unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glukoseketten unterscheiden. Stärke stellt daher keinen einheitlichen Rohstoff dar. Insbesondere unterscheidet man die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4 glykosidisch verknüpften Glukosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unterschiedlich verzweigten Glukoseketten darstellt. Die Verzweigungen kommen durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6 glykosidischen Verknüpfungen zustande.

In typischen Pflanzen für die Stärkeproduktion, wie zum Beispiel Mais oder Kartoffel, kommen die beiden Stärkeformen in einem Verhältnis von etwa 25 Teilen Amylose zu 75 Teilen Amylopektin vor.

Im Hinblick auf die Einheitlichkeit eines Grundstoffes wie Stärke für seine Anwendung im industriellen Bereich werden Pflanzen benötigt, die beispielsweise nur noch die Komponente Amylopektin enthalten oder Pflanzen, die nur noch die Komponente Amylose enthalten. Im Hinblick auf die Vielseitigkeit des Rohstoffs Stärke werden Pflanzen benötigt, die unterschiedlich stark verzweigte Amylopektin- Formen bilden. Es besteht daher ein großes Interesse an Enzymen des Stärkestoffwechsels, die den Verzweigungsgrad der Stärkemoleküle modifizieren können, bzw. an Gensequenzen, die zur genetischen Veränderung von Pflanzen genutzt werden können, um in Pflanzen unterschiedliche Stärkeformen synthetisieren zu können.

Es ist bereits bekannt, daß für bestimmte Pflanzenspezies, beispielsweise den Mais, durch Mutagenese, bei der einzelne Gene der Pflanze inaktiviert werden, Sorten erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin enthalten. Für Kartoffel wurde durch chemische Mutagenese bei einer haploiden Linie ebenfalls ein Genotyp erzeugt, der keine Amylose bildet (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, Theor Appl Genet 75 : 217-221). Haploide Linien, bzw. die daraus entwickelten homozygoten diploiden oder tetraploiden, sind landwirtschaftlich aber nicht einsetzbar. Für die landwirtschaftlich interessanten heterozygot tetraploiden Linien ist die Mutagenese- Technik nicht anwendbar, da wegen des Vorliegens von vier verschiedenen Erbgutkopien eine Inaktivierung aller Kopien eines Gens technisch nicht möglich ist. Aus Visser et al. (1991, Mol Gen Genet 225 : 289) ist bekannt, daß durch antisense- Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene-Stärkesynthase in Kartoffelsorten erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke bilden.

Aus der WO 92/14827 ist ein Verzweigungsenzym der Kartoffel bekannt. Dieses Enzym wird als Q-Enzym von Solanum tuberosum bezeichnet. Weiterhin ist bekannt, daß mit Hilfe von DNA-Sequenzen, die die Information für das in der WO 92/14827 beschriebene Verzweigungsenzym der Kartoffel enthalten, transgene Pflanzen hergestellt werden können, bei denen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der Stärke verändert ist.

Während für andere Spezies, z. B. Mais das Vorkommen mehrerer Q-Enzyme bekannt ist (Singh & Preiss, 1985, Plant Physiol 79 : 34-40), ist nicht bekannt, ob neben dem aus der WO 92/14827 bekannten Verzweigungsenzym der Kartoffel weitere Enzyme an der Synthese von verzweigter Stärke in Kartoffel beteiligt sind.

Neben den Q-Enzymen, die Verzweigungen in Stärkemoleküle einführen, kommen in Pflanzen Enzyme vor, die Verzweigungen auflösen. Diese auch als Debranching- Enzyme bekannten Proteine werden je nach Substratspezifität in drei Gruppen eingeteilt:
Die Pullulanasen, die neben Pullulan auch Amylopektin nutzen, kommen bei Mikroorganismen, z. B. Klebsiella, und Pflanzen vor. In Pflanzen werden sie auch als R-Enzyme bezeichnet.
Die Isoamylasen, die nicht mit Pullulan, wohl aber mit Glykogen und Amylopektin arbeiten, kommen ebenfalls bei Mikroorganismen und Pflanzen vor. Eine Isoamylase von Mais wird von Manners & Rowe (1969, Carbohydr. Res. 9 : 107) beschrieben, eine Isoamylase von Kartoffel beschreiben Ishizaki et al. (1983, Agric Biol Chem 47: 771-779).
Die Amylo-1,6-Glukosidasen sind bei Säugern und Hefen beschrieben und nutzen Grenzdextrine als Substrat.

In Zuckerrübe konnte von Li et al. (1992, Plant Physiol 98 : 1277-1284) neben fünf Endo- und zwei Exoamylasen nur ein Debranching-Enzym des Pullulanase-Typs nachgewiesen werden. Dieses Enzym, das eine Größe von ca. 100 kDa und ein pH-Optimum von 5,5 aufweist, ist im Chloroplasten lokalisiert.

Ein Debranching-Enzym aus Spinat, das Pullulan als Substrat nutzt, bei der Reaktion mit Amylopektin jedoch eine dreifach geringere Aktivität aufweist, beschreiben Ludwig et al. (1984, Plant Physiol 74 : 856-861).

Bei der landwirtschaftlich wichtigen stärkespeichernden Kulturpflanze Kartoffel wurde die Aktivität eines Debranching-Enzyms 1951 von Hobson et al. (1951, J Chem Soc 1451) untersucht. Es gelang der Nachweis, daß das entsprechende Enzym anders als das Q-Enzym keine kettenverlängernde Aktivität besitzt und lediglich α-1,6 glykosidische Bindungen hydrolysiert. Das Enzym konnte jedoch weder genauer charakterisiert werden, noch gelang die Beschreibung von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren.

Es sind bisher keine DNA-Sequenzen bekannt, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms aus Pflanzen kodieren, die bei Einführung in das pflanzliche Genom den Stoffwechsel der Pflanze derart verändern, daß der Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke gesteigert oder reduziert ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, DNA-Sequenzen, die auf dem kodogenen Strang Debranching-Enzyme kodieren, Plasmide, mit denen diese DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen bzw. Pflanzen eingeführt werden können Pflanzenzellen, aus denen ganze Pflanzen regeneriert werden können und Pflanzen, die die Herstellung von Amylopektin-Stärke mit gesteigertem oder reduziertem Verzweigungsgrad ermöglichen, bereitzustellen.

Es werden nun die Identifikation und Reinigung von Debranching-Enzymen sowie Peptidsequenzen dieser Enzyme und deren Verwendung zur Beschreibung von DNA-Sequenzen, die in transgenen Pflanzen Transkripte bilden, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, oder die in transgenen Pflanzen Transkripte bilden, die die Synthese von Proteinen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen verhindern und Plasmide und Pflanzenzellen zur Herstellung dieser transgenen Pflanzen beschrieben.

Es werden ferner transgene Pflanzen, die DNA-Sequenzen enthalten, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, die den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke reduzieren und transgene Pflanzen, die DNA-Sequenzen enthalten, die die Synthese von Proteinen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen verhindern, was den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke steigert, beschrieben.

Es werden

a) zunächst Proteine mit der Aktivität eines Debranching-Enzyms bis zur Homogenität aufgereinigt (s. Ausführungsbeispiel 1),
b) von dem gereinigten Enzym Peptidsequenzen durch Proteinsequenzierung ermittelt (s. Ausführungsbeispiel 2),
c) diese Peptidsequenzen zur Klonierung von cDNA-Sequenzen aus einer cDNA-Bibliothek genutzt, wobei sowohl immunologische als auch molekulargenetische Methoden zum Einsatz kommen (s. Ausführungsbeispiel 3 und 4) und schließlich
d) diese DNA-Sequenzen in Plasmide eingeführt, die eine Transformation von Pflanzenzellen und die Regeneration von transgenen Pflanzen ermöglichen (s. Ausführungsbeispiel 5).

Die in den Ausführungsbeispielen exemplarisch anhand der Kartoffel (Solanum tuberosum) beschriebenen DNA-Sequenzen kodieren für ein pflanzliches Debranching-Enzym, das den Verzweigungsgrad natürlich in Pflanzen enthaltener Amylopektin-Stärke dahingehend modifiziert, daß der Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke, je nach Bedarf, gesteigert oder reduziert wird.

Von den kodogenen DNA-Sequenzen werden Protein-Sequenzen von Debranching- Enzymen mit mindestens einer der Sequenzen
Seq ID No. 1

oder Seq ID No. 2

kodiert.

Transgene Pflanzen mit gesteigertem oder reduziertem Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke können über ein Verfahren hergestellt werden, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

a) Herstellung einer DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen:
- i) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA in vorgesehenen Zielgeweben oder Zielzellen sicherstellt,
- ii) einer Struktur-DNA-Sequenz, die die Transkription einer RNA erlaubt, die in transgenen Pflanzen eine neue Protein-Sequenz mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms kodiert, oder die die Transkription einer RNA erlaubt, die in transgenen Pflanzen die Synthese eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms verhindert,
- iii) eine 3′-nicht-translatierte Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3′-Ende der RNA führt,
b) Transfer und Einbau der Struktur-DNA-Sequenz in das Genom einer Pflanzenzelle, unter Verwendung rekombinanter Plasmide und
c) Regeneration von intakten, ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

In der unter ii) genannten Protein-Sequenz des Debranching-Enzyms sind vorzugsweise die Protein-Sequenzen Seq ID No. 1 und Seq ID No. 2 enthalten.

Rekombinante Plasmide gemäß Verfahrensstufe b) enthalten die DNA-Sequenzen, die auf den kodogenen Strängen pflanzliche Debranching-Enzyme oder Fragmente davon kodieren, wobei die von den DNA-Sequenzen abgeleiteten Transkripte in transgenen Pflanzen die Synthese von neuen Proteinen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen bewirken, die in den transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke reduzieren oder die von den DNA-Sequenzen abgeleiteten Transkripte in transgenen Pflanzen die Synthese endogener Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen verhindern, was in transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke steigert.

Die durch das Verfahren erhältlichen transgenen Pflanzen mit gesteigertem oder reduziertem Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Pflanzen, auf die das Verfahren zur Anwendung kommt, sind Nutzpflanzen wie z. B. Mais, Weizen und Kartoffel.

Zur Identifikation einer neuen Struktur-DNA-Sequenz, enthaltend die Information zur Synthese eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität eines Debranching-Enzyms oder zur Unterdrückung der Bildung einer endogenen Aktivität eines Debranching- Enzyms, wurden exemplarisch Proteinextrakte von Kartoffelpflanzen gewonnen. Für den Nachweis der enzymatischen Aktivität des Debranching-Enzyms, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurde ein Färbetest ausgenutzt. Wenn Proteinextrakte von Kartoffelpflanzen in nicht-denaturierenden, amylopektinhaltigen Polyacrylamid-Gelen (PAAG) aufgetrennt werden, läßt sich durch anschließende Jodfärbung ein Protein mit einer stärkemodifizierenden Aktivität nachweisen. Während unverzweigte Amylose mit Jod einen blaufarbenen Komplex bildet, ergibt Amylopektin eine rötlich-violette Färbung. In amylopektinhaltigen PAAG, die mit Jod rötlich-violett färben, kommt es an Orten, an denen eine Debranching-Aktivität lokalisiert ist, zu einer Farbverschiebung hin zu einer Blaufärbung des Gels, da die Verzweigungen des violettfärbenden Amylopektins vom Enzym abgebaut werden.

Durch Abtrennung des Proteins von anderen mit Hilfe stufenweiser Ammonium sulfat-Fällung und anschließender Affinitätschromatographie an immobilisiertem β-Cyclodextrin wird das Protein erfindungsgemäß bis zur Homogenität gereinigt. Von dem reinen Protein werden Peptidsequenzen bestimmt (s. Ausführungsbeispiel 2). Dadurch werden erstmals Peptidsequenzen eines pflanzlichen Debranching-Enzyms zugänglich. Die Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms zeigen in einzelnen Bereichen eine gewisse Homologie zu mikrobiellen Debranching-Enzymen, dies gilt aber nicht für alle Domänen des Proteins. Das neue Debranching-Enzym aus Solanum tuberosum repräsentiert daher einen bisher unbekannten Typus von Debranching-Enzymen.

Die Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms dienen erfindungsgemäß zur Identifikation von DNA-Sequenzen in Pflanzen, die ein Peptid mit der Aktivität eines Debranching-Enzyms kodieren. Hierbei können immunologische Verfahren angewendet werden (s. Ausführungsbeispiel 3) oder es können molekulargenetische Methoden zum Einsatz kommen (s. Ausführungsbeispiel 4).

Nachdem die DNA-Sequenzen, die ein neues Debranching-Enzym kodieren, identifiziert sind, können sie durch Klonierung in Vektorplasmide in Bakterien vermehrt werden. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, m13mp-Serien usw. Die DNA Sequenz, die das neue Debranching-Enzym kodiert, kann mit linkern versehen werden, die ein einfaches Umklonieren in andere Plasmide erlauben. Zum Zwecke der Einführung in Pflanzen (s. Ausführungsbeispiel 5) können bevorzugt, aber nicht ausschließlich, binäre Plasmide verwendet werden, die ein Replikationssignal beispielsweise für Escherichia coli und für Agrobacterium tumefaciens enthalten. Wenn diese binären Plasmide T-DNA-Elemente enthalten, ist eine Übertragung der DNA-Sequenz eines neuen Debranching-Enzyms in das Genom von dikotylen Pflanzen besonders einfach. Es stehen jedoch auch andere Methoden zur Verfügung, beispielsweise die Transformation mit Hilfe ballistischer Verfahren, die zur Transformation von Monokotylen eingesetzt wird (vgl. Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42 : 205-225).

Um eine Expression des übertragenen Transgens in genetisch veränderten Pflanzen sicherzustellen, wird die cDNA Sequenz des neuen Debranching-Enzyms an eine Promotorsequenz fusioniert. Dabei kommen grundsätzlich alle Promotoren in Betracht, die in Pflanzen aktiv sind. Präferentiell werden Promotoren eingesetzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. So sind es beim Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Transformation der Kartoffel kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, der knollenspezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J 8 : 23-29) eingesetzt werden. Zur Stabilisierung der vom Transgen gebildeten RNA wird an die das Debranching-Enzym kodierende DNA Sequenz noch ein Terminations- und Polyadenylierungssignal angehängt. Dies kann beispielsweise das Terminations signal des Octopinsynthase Gens aus Agrobacterium tumefaciens sein.

Durch Fusion von Promotor, Struktur-DNA-Sequenz und Terminationssignal entstehen Konstrukte, die zur Transformation von Pflanzen in geeignete Plasmide integriert werden. Diese rekombinanten Plasmide sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die rekombinanten Plasmide werden zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet, aus denen ganze Pflanzen regeneriert werden können. Diese Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die rekombinanten Plasmide können darüberhinaus zur Identifikation von Nukleinsäure-Sequenzen, die Debranching-Enzymen kodieren, verwendet werden.

Infolge der Übertragung einer DNA-Sequenz, die aus Promotor, Kodierregion eines neuen Debranching-Enzyms und Terminations-/Polyadenylierungssignal besteht, kommt es in den transgenen Pflanzen zur Bildung einer RNA, die als Matrize für die Synthese eines neuen Debranching-Enzyms dienen kann, oder die durch Wechselwirkung mit einer endogenen mRNA eines Debranching-Enzyms dessen Synthese unterdrückt. Welche Art von RNA vom Transgen transkribiert wird, hängt von der Orientierung der DNA Sequenz des neuen Debranching-Enzyms relativ zum Promotor ab. Wenn das 5′ Ende der DNA Sequenz des neuen Debranching-Enzyms an das 3′ Ende des Promotors fusioniert ist, wird eine translatierbare mRNA gebildet, die als Matrize für die Synthese eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität eines neuen Debranching-Enzyms dient. Wenn dagegen das 3′ Ende der DNA Sequenz des neuen Debranching-Enzyms an das 3′ Ende des Promotors fusioniert wird, entsteht eine antisense RNA, die die Translatierbarkeit der endogenen mRNA des Debranching-Enzyms unterdrückt.

Im ersten Fall liegt in der Pflanze eine zusätzliche enzymatische Aktivität eines Debranching-Enzyms vor. Dies führt dazu, daß der Verzweigungsgrad des von der transgenen Pflanze gebildeten Amylopektins reduziert wird. Dadurch wird eine Stärke zugänglich, die sich gegenüber der natürlich vorkommenden durch eine stärker geordnete Raumstruktur sowie eine gesteigerte Einheitlichkeit auszeichnet, was insbesondere günstige Auswirkungen auf die Filmbildungseigenschaften hat.

Im zweiten Fall wird eine endogene enzymatische Aktivität eines Debranching- Enzyms unterdrückt. Dies führt zur Bildung von stark verzweigter Stärke in transgenen Pflanzen. Stark verzweigtes Amylopektin hat eine besonders große Oberfläche und eignet sich dadurch als Kopolymer in besonderem Maße. Ein starker Verzweigungsgrad führt außerdem zu einer Verbesserung der Löslichkeit des Amylopektins in Wasser. Diese Eigenschaft ist für bestimmte technische Anwendungen sehr günstig. Besonders geeignet für die Produktion von stark verzweigtem Amylopektin unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen des neuen Debranching-Enzyms ist Kartoffel, die Anwendung der Erfindung ist aber nicht auf Kartoffel beschränkt.

Die in den transgenen Pflanzen gebildete modifizierte Stärke kann mit gängigen Methoden aus den Pflanzen oder aus den Pflanzenzellen isoliert und nach der Reinigung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten verarbeitet werden.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Aufreinigung des Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum.

Dabei bedeuten:
0 = Proteinextrakt eines Homogenats von Knollengewebe aus Solanum tuberosum.
Durchlauf = Durchlauf einer Affinitätschromatographie des Proteinextrakts an immobilisiertem β-Cyclodextrin.
β-Cyclodextrin = Elution der Affinitätschromatographie mit gelöstem β-Cyclodextrin in den Konzentrationen 1 mg/ml bzw. 10 mg/ml.
DBE = Debranching-Enzym aus Solanum tuberosum.
DE = Disproportionierendes Enzym aus Solanum tuberosum.

Fig. 2 zeigt das Plasmid pB33-R, bei dem es sich um ein Derivat des Plasmids pBIN19 (Bevan, M.,1984, Nucl Acids Res 12 : 8711-8721) handelt. Dabei bedeuten:
A = DraI/DraI-Fragment (Position -1512 bis +14) der Promotorregion des B33 Gens von Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., EMBO J 8 : 23-29).
B = NotI/NotI-Fragment der cDNA mit der Kodierregion des Debranching- Enzyms von Solanum tuberosum in sense-Orientierung zum Fragment A.
C = Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J 3 : 835-846), Nukleotide 11749 bis 11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera- Estrella et al., 1983, Nature 303 : 209-213) isoliert und nach Addition eines SphI-Linkers an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und die HindIII-Schnittstelle des Polylinkers von pBIN 19 kloniert wurde.

Fig. 3 zeigt das Plasmid pB33-R, bei dem es sich um ein Derivat des Plasmids pBIN19 (Bevan, M. ,1984, Nucl Acids Res 12 : 8711-8721) handelt.

Es bedeuten:
A = DraI/DraI-Fragment (Position -1512 bis +14) der Promotorregion des B33 Gens von Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., EMBO J 8 : 23-29).
B = NotI/NotI-Fragment der cDNA mit der Kodierregion des Debranching- Enzyms von Solanum tuberosum in antisense-Orientierung zum Fragment A.
C = Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. , EMBO J 3 : 835-846), Nukleotide 11749 bis 11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nature 303 : 209-213) isoliert und nach Addition eines SphI- Linkers an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und die HindIII- Schnittstelle des Polylinkers von pBIN 19 kloniert wurde.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei die Identifikation und Reinigung von Debranching- Enzymen am Beispiel des Branching-Enzyms der Kartoffel (Solanum tuberosum) sowie die Isolation von cDNA-Sequenzen, die Debranching-Enzyme kodieren, und die Konstruktion von binären Plasmiden, die für die Einführung der DNA-Sequenzen in die Pflanze verwendet werden, gezeigt werden.

In analoger Verfahrensweise können auch Nutzpflanzen wie z. B. Mais und Weizen transformiert werden.

Ausführungsbeispiel 1 Identifikation eines neuen Debranching-Enzyms in Solanum tuberosum

Von Pflanzen der Spezies Solanum tuberosum werden Proteinextrakte aus Knollengewebe gewonnen. Hierzu werden 820 g Knollengewebe in 1500 ml eines Puffers aus 50 mM Natriumacetat pH 6,0; 2,5 mM 1,4-Dithio-DL-threitol; 1,5 mM Mercaptoethanol; 0,4 mM PMSF und Spuren von Natriumbisulfit, Natriumsulfit und Ascorbinsäure (jeweils Spatelspitzen) homogenisiert.

Von dem Homogenat (s. Spur 1 in Fig. 1) werden 50 µl in einem PAAG aufgetrennt. Das Gel enthält 7,5% Acrylamid pH 8,6, das mit Methylenbisacrylamid bis zu einem Grad von 1 : 75 vernetzt wird, sowie 1% Amylopektin. Das Puffersystem für die Elektrophorese enthält Tris/Glycin pH 8,9. Nach dem Gellauf wird das Gel in 50 mM Tris/Citrat pH 7,0; 2 mM Ascorbinsäure bei 22°C für 4 Stunden äquilibriert. Die Färbung des Gels erfolgt mit Lugol′scher Lösung für 15 Minuten. Das Ergebnis der Färbung ist in Fig. 1, Spur 1 gezeigt. Neben einer rötlich gefärbten Bande, die auf die Aktivität eines Verzweigungen einführenden Enzyms (Branching-Enzym bzw. disproportionierendes Enzym) zurückgeht, ist eine stark blau gefärbte Bande zu erkennen. Die Blaufärbung kommt durch den enzymatischen Abbau von α-1,6 glykosidischen Verzweigungen des Amylopektins zustande, die für dessen rötliche bzw. violette Farbe verantwortlich sind.

Ausführungsbeispiel 2 Reinigung eines Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum und Bestimmung von Peptidsequenzen

Einem nach Ausführungsbeispiel 1 gewonnenen Proteinextrakt aus Knollengewebe von Solanum tuberosum wird bei 4°C unter Rühren kontinuierlich Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 40% der Sättigungskonzentration zugesetzt. Die hierbei einsetzende partiale Präzipitation von Proteinen wird unter Rühren für zwei Stunden fortgesetzt, anschließend werden präzipitierte Proteine durch Zentrifugation abgetrennt. Dem Überstand wird wie oben beschrieben Ammoniumsulfat bis zu einem Wert von 50% der Sättigungskonzentration zugesetzt, wobei wiederum Proteine ausgefällt werden. Diese Proteinfraktion wird durch Zentrifugation abgetrennt und anschließend weiter fraktioniert.

Nach Auflösen des Präzipitats in 20 ml Acetatpuffer (s. Ausführungsbeispiel 1) und 12 stündiger Dialyse gegen bidestilliertes Wasser wird die Proteinlösung einer Chromatographie unterzogen. Auf eine Sepharose 6B-Säule, an die β-Cyclodextrin gekoppelt wurde, werden pro 30 ml Bettvolumen 500 mg Protein aus der fraktionierten Ammonsulfatfällung aufgetragen. Anschließend wird mit Acetatpuffer gewaschen, bis das Eluat keine Absorption bei 280 nm aufweist. Dann wird mit einer β-Cyclodextrin-Lösung von 1 mg/ml Acetatpuffer eine Proteinfraktion mit geringer Affinität zur stationären Phase eluiert, die verworfen wird. Bei einer Cyclodextrin- Konzentration von 10 mg/ml Acetatpuffer wird das Debranching-Enzym von Kartoffel eluiert (vgl. Fig. 1, Spur *).

Die an Debranching-Enzym hoch angereicherte Fraktion des Eluats wird einer Elektrophorese in einem denaturierenden PAAG entsprechend der Vorschrift von Laemmli (1970, Nature 227 : 680-685) unterzogen. Das nun denaturierte Protein wird aus dem Gel ausgeschnitten. Nach Standardverfahren werden Peptidsequenzen bestimmt.

Die Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms aus Solanum tuberosum sind in Seq-ID No. 1 und Seq-ID No. 2 wiedergegeben.

Ausführungsbeispiel 3 Isolation von cDNA Sequenzen, die ein Debranching-Enzym von Solanum tuberosum kodieren, mit Hilfe immunologischer Methoden

Das entsprechend Ausführungsbeispiel 2 gereinigte Protein wird zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Mit Hilfe der Seren von immunisierten Kaninchen werden cDNA Bibliotheken, die für Transkripte des Knollengewebes von Solanum tuberosum repräsentativ sind, nach cDNA Klonen durchmustert, die Sequenzen enthalten, die für das Debranching-Enzym von Solanum tuberosum kodieren. Hierzu wird aus Knollengewebe von Solanum tuberosum Gesamt-RNA nach Logemann et al. (1987, Anal Biochem 163 : 16-20) präpariert. Von der Gesamt-RNA wird nach Standardverfahren polyadenylierte mRNA präpariert, die nach dem von Gubler & Hoffmann (1983, Gene 25 : 263) beschriebenen Verfahren zur Synthese von cDNA eingesetzt wird. Die cDNA wird mit käuflichen EcoRI/NotI Adaptern ligiert und dann in die EcoRI Schnittstelle des Expressionssystems Lambda ZAP II ligiert. Nach Verpacken der Lambda-Phagen DNA in Phagenköpfe werden E. coli Zellen des Stammes XL1-Blue infiziert und auf Medium in Petrischalen in einer Dichte von 25 000 pro ca. 75 cm² ausplattiert. Nach ca. 3 stündiger Inkubation werden in 10 mM IPTG-Lösung getränkte Nitrozellulosefilter auf den lysierten Bakterienrasen aufgelegt, die nach weiteren 3 Stunden abgenommen werden. Die Filter werden für eine immunologische Sondierung nach entsprechend der in Ausführungsbeispiel 5 beschriebenen Western-Blot-Technik verwendet. Von den nach drei Sondierungszyklen erhaltenen Phagenspezies, die die cDNA Sequenz des Debranching-Enzyms von Solanum tuberosum enthalten, werden durch In-vivo- Excision pBluescript-Plasmide erhalten. Die Sequenz der cDNA wird nach der Methode von Sanger et al. (1977, Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463-5467) bestimmt. Aus dem pBluescript-Plasmid, das die Sequenz des Debranching-Enzyms von Solanum tuberosum enthält, kann die Insertion durch Schneiden mit entsprechenden Restriktionenzymen isoliert und nach Standardverfahren in binäre Plasmide mit dem Ziel der Transformation von Pflanzen umtransformiert werden (s. Ausführungsbei spiel 5).

Ausführungsbeispiel 4 Isolation von cDNA Sequenzen, die ein Debranching-Enzym von Solanum tuberosum kodieren, mit Hilfe molekulargenetischer Methoden

Die entsprechend Ausführungsbeispiel 2 gewonnen Peptidsequenzen werden zur Ableitung von Oligonukleotidsequenzen verwendet, die unter Berücksichtigung der Degeneriertheit des genetischen Codes Auszüge der DNA-Sequenz des Debranching-Enzyms von Solanum tuberosum wiedergeben. Entsprechend den abgeleiteten Oligonukleotidsequenzen werden synthetische Oligonukleotide nach Standardverfahren synthetisiert. Diese werden zur Durchmusterung von cDNA Bibliotheken, die für Transkripte des Knollengewebes von Solanum tuberosum repräsentativ sind, eingesetzt.

Zunächst wird eine cDNA Bibliothek erstellt, indem aus Knollengewebe von Solanum tuberosum Gesamt-RNA nach Logemann et al. (1987, Anal Biochem 163 : 16-20) präpariert wird. Von der Gesamt-RNA wird nach Standardverfahren polyadenylierte mRNA präpariert, die nach dem von Gubler & Hoffmann (1983, Gene 25 : 263) beschriebenen Verfahren zur Synthese von cDNA eingesetzt wird. Die cDNA wird mit käuflichen EcoRI/NotI Adaptern ligiert und dann in die EcoRI Schnittstelle der DNA des Phagen Lambda Zap II ligiert. Nach Verpacken der Lambda-Phagen DNA in Phagenköpfe werden E. coli Zellen des Stammes XL1-Blue infiziert und auf Medium in Petrischalen in einer Dichte von 25 000 pro ca. 75 cm² ausplattiert. Nach ca. 9 stündiger Inkubation werden Nylonmembranen auf den lysierten Bakterienrasen aufgelegt, die nach 1 Minute abgenommen werden. Die Filter werden für 1 Minute in 250 mM HCl inkubiert, für 5 Minuten in 0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl, dann für 5 Minuten in 1 M Tris/HCl ph 7,5. Nach Trocknung und Fixierung bei 80°C für 1 Stunde werden die Filter 4 Stunden lang in einem Puffer aus
2fach SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat)
10fach Denhardts Lösung
0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat)
5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
50 mM Di-Natrium-Phosphat
250 µg/ml Heringsperma-DNA
50 µg/ml tRNA
inkubiert, bevor die radioaktiv endmarkierten Oligonukleotide zugesetzt werden. Nach 12stündiger Hybridisierung werden die Filter in 2fach SSC/0,5% SDS gewaschen und anschließend autoradiographiert.

Die Temperatur für Hybridisierung und Waschen der Filter berechnet sich wie folgt:
T+15 = 16,6×[Na+]+0,41×%GC_{OLIGONUCLEOTID}+81,5 -675/Länge_{OLIGONUCLEOTID}.

Aus den in Seq-ID No 1 bzw. Seq-ID No 2 wiedergegebenen Peptidsequenzen des Debranching-Enzyms von Solanum tuberosum lassen sich geeignete Oligonukleotidsequenzen berechnen. Um eine möglichst hohe Hybridiserungstemperatur zu erhalten, die eine ausreichende Spezifität der Hybridbildung gewährleistet, sollen möglichst lange Oligonukleotide verwendet werden. Mit zunehmender Länge steigt jedoch der Degeneriertheitsgrad, d. h. die Anzahl von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Sequenzkombinationen. Degeneriertheitsgrade von bis zu 6000 können akzeptiert werden. Für die in Seq-ID No 1 angegebene Peptidsequenz wurde die Sequenz für eine Oligonukleotidsonde der Länge 26 bp abgeleitet. Das Oligonukleotid hat einen Degeneriertheitsgrad von 3072 bei einem GC-Gehalt von maximal 61% und minimal 38%. Dadurch ergibt sich eine maximale Hybridisierungstemperatur von 56°C. Die Sequenzvorlage für die Synthese der Sonde lautet:

In drei Sondierungscyclen werden Phagenspezies, die die cDNA Sequenz des Debranching-Enzyms von Solanum tuberosum enthalten, vereinzelt und für die in vivo Excision eines pBluescript Plasmids nach Standardverfahren eingesetzt. Als Insertion eines pBluescript-Plasmids wird die Sequenz der cDNA nach der Methode von Sanger et al. (1977, Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463-5467) bestimmt. Die cDNA wird nach Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY USA) aus dem pBluescript-Derivat nach Verdauen mit EcoRI bzw. NotI isoliert und kann nach Standardverfahren in binäre Plasmide mit dem Ziel der Transformation von Pflanzen umtransformiert werden (s. Ausführungsbeispiel 5).

Ausführungsbeispiel 5 Konstruktion von binären Plasmiden zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens und zur genetischen Veränderung von Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium

Für die Pflanzentransformation wurde die cDNA, die entsprechend Ausführungsbeispiel 3 bzw. 4 als Insertion in pBluescript erhalten wurde, in einen binären Vektor, der sich von pBIN19 (Bevan (1984) Nucl Acids Res 12 : 8711-8720) ableitet, umkloniert. Dabei wurden zwei Konstruktionen erstellt: zum einen das Plasmid pB33-R, zum anderen das Plasmid pB33-R-anti (vgl. Fig. 2 und Fig. 3). Die beiden Konstrukte enthalten als Promotor für die Expression eines Transgens in Pflanzen den B33 Promotor von Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., EMBO J 8: 23-29). Während pB33-R die cDNA in sense Orientierung enthält, also zur Bildung einer translatierbaren RNA in transgenen Pflanzen führt, stellt pB33-R-anti eine antisense-Konstruktion zur Inhibition der Expression des endogenen Gens dar. Die Konstrukte wurden wie folgt erstellt:

pB33-R: Der Promotor des B33 Gens von Solanum tuberosum wurde als DraI Fragment (Position -1512 bis +14 nach Rocha-Sosa et al., EMBO J 8 : 23-29) nach Abbau überstehender Enden mit Polymerase II in die SacI Schnittstelle des Plasmids pUC19 kloniert. Als EcoRI/SmaI Fragment wurde die Promotorregion in den binären Vektor pBIN19 kloniert, der das Terminationssignal des Octopinsynthase Gens aus Agrobacterium tumefaciens in direkter Nachbarschaft zu einem Polylinker aus M13mp19 enthält. Hierbei entstand pB33. In die SmaI-Schnittstelle von pB33 wurde das aufgefüllte NotI Fragment der cDNA entsprechend Ausführungsbeispiel 3 bzw. 4 in sense Orientierung bezogen auf den Promotor (5′ Ende der cDNA an das 3′ Ende des Promotors) kloniert. Dabei entstand pB33-R.

pB33-R-anti: in den binären Vektor pB33 wurde das aufgefüllte NotI Fragment der cDNA in antisense Orientierung bezogen auf den Promotor (3′ Ende der cDNA an das 3′ Ende des Promotors) kloniert. Dabei entstand pB33-R-anti.

Zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens wird das binäre Plasmid durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucl Acids Res 16 : 9877) in die Zellen eingeführt. Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim et al. (1979) Nucl Acids Res 7 : 1513-1523 isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert. Zur Transformation z. B. von Kartoffelpflanzen werden beispielsweise 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthält. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln werden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen werden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wird die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J I 8 : 29 beschrieben.

Die Überprüfung des Erfolgs der genetischen Veränderung der Pflanzen ist durch Analyse der Gesamt-RNA bezüglich des Auftretens einer mRNA, die das Debranching-Enzym kodiert (im Falle der Transformation mit pB33-R), bzw. bezüglich des Verschwindens der endogenen mRNA bei Transformation mit pB33-R-anti möglich. Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgt nach Logemann et al. (1987) Anal Biochem 163 : 16-20. Für die Analyse werden je 50 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit bzw. Abwesenheit des Transkripts untersucht.

Zur Überprüfung des Vorhandenseins des Debranching-Enzyms in transgenen Pflanzen erfolgt eine Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe und anschließend eine "Western blot Analyse" mit dem in Ausführungsbeispiel 3 beschriebenen Antiserum aus Kaninchen. Hierzu werden Proteinextrakte mittels Gelelektrophorese in SDS-PAAG nach Molekulargewicht getrennt. Nach SDS-PAAG - Elektrophorese (PAGE) werden Proteingele für 15-30 Minuten in Transfer-Puffer für Graphitelektroden (48 g/l Tris, 39 g/l Glycin, 0,0375% SDS, 20% Methanol) äquilibriert und anschließend bei 4°C auf Nitrozellulose-Filter mit 1,3 mA/cm² für 1-2 Stunden transferiert. Das Filter wird für 30 Minuten mit 3% Gelatine in TBS-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 500 mM NaCl) abgesättigt. Anschließend wird das Filter für 2 Stunden mit dem Antiserum in geeigneter Verdünnung (1 : 1000-10 000 in TBS Puffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird das Filter jeweils für 15 Minuten mit TBS-, TTBS- (TBS-Puffer mit 0,1% Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonolaurat) und TBS-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wird das Filter für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Alkalische-Phosphatase konjugierten Goat-anti-Rabbit (GAR)- Antikörpern (1 : 7500 in TBS) inkubiert. Anschließend wird das Filter wie obenstehend beschrieben gewaschen und in AP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) äquilibriert. Die Alkalische-Phosphatase Reaktion wird durch Substratzugabe von 70 µl 4-Nitrotetrazolium (NBT)-Lösung (50 mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid) und 35 µl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP) (50 mg/ml BCIP in Dimethylformamid) in 50 ml AP-Puffer gestartet. Nach 5 Minuten können in der Regel erste Signale beobachtet werden.

Zur Bestimmung des Amylose/Amylopektin-Gehalts in der Stärke transgener Kartoffelpflanzen werden Blattstückchen mit einem Durchmesser von 10 mm unter Dauerlicht auf 6%iger Saccharoselösung 14 Stunden lang flotiert. Durch diese Lichtinkubation wird eine stark erhöhte Stärkebildung in den Blattstückchen induziert. Nach der Inkubation wird die Amylose- und Amylopektin-Konzentration nach Hovenkamp-Hermelink et al. (1988, Potato Research 31 : 241-246) bestimmt. Die Bestimmung des Verzweigungsgrades (α-1,6 glykosidische Bindungen), der Kettenlänge sowie der Größe der Stärkekörner erfolgt nach Morrison et al. (1990, Methods in Plant Biochemistry Academic Press lmtd. 2 : 323-352).

Claims

1. DNA-Sequenzen, die auf dem kodogenen Strang pflanzliche Debranching- Enzyme kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Sequenzen in transgenen Pflanzen gebildeten Transkripte neue Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen kodieren, die in den transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke reduzieren.

2. DNA-Sequenzen, die auf dem kodogenen Strang pflanzliche Debranching- Enzyme kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Sequenzen in transgenen Pflanzen gebildeten Transkripte die Synthese von Proteinen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen verhindern, was in den transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke steigert.

3. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß von deren kodogenen Strängen Protein-Sequenzen von Debranching-Enzymen mit der Peptidsequenz (Seq ID No. 1) kodiert werden.

4. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß von deren kodogenen Strängen Protein-Sequenzen von Debranching-Enzymen mit der Peptidsequenz (Seq ID No. 2) kodiert werden.

5. Rekombinante Plasmide mit DNA-Sequenzen, die auf dem kodogenen Strang ein pflanzliches Debranching-Enzym oder Fragmente davon kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß die von den DNA-Sequenzen abgeleiteten Transkripte in transgenen Pflanzen die Synthese von neuen Proteinen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen bewirken, die in transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke reduzieren.

6. Rekombinante Plasmide mit DNA-Sequenzen, die auf dem kodogenen Strang ein pflanzliches Debranching-Enzym oder Fragmente davon kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß die von den DNA-Sequenzen abgeleiteten Transkripte in transgenen Pflanzen die Synthese endogener Proteinen mit der enzymatischen Aktivität von Debranching-Enzymen verhindern, was in transgenen Pflanzen den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke steigert.

7. Rekombinante Plasmide gemäß den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß vom kodogenen Strang die Protein-Sequenz (Seq ID No. 1) kodiert wird.

8. Rekombinante Plasmide gemäß den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß vom kodogenen Strang die Protein-Sequenz (Seq ID No. 2) kodiert wird.

9. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigertem oder reduziertem Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der unter ii) genannten Protein-Sequenz des Debranching-Enzyms die Proteinsequenzen Seq ID No. 1 oder Seq ID No. 2 enthalten sind.

11. Pflanzenzellen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4.

12. Verwendung von Pflanzenzellen gemäß Anspruch 11 zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem oder reduziertem Verzweigungsgrad der Amylopektin- Stärke.

13. Transgene Pflanzen mit gesteigertem oder reduziertem Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke, erhältlich durch das Verfahren gemäß den Ansprüchen 9 und 10.

14. Pflanzen gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nutzpflanzen Kartoffel, Mais und Weizen sind.

15. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem oder reduziertem Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke.

16. Verwendung von rekombinanten Plasmiden gemäß den Ansprüchen 5 bis 8 zur Transformation von Pflanzenzellen mit dem Ziel, den Verzweigungsgrad der Amylopektin-Stärke in den Zellen zu steigern oder zu reduzieren.

17. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Identifikation von Nukleinsäure-Sequenzen, die Debranching-Enzyme kodieren.

18. Amylopektin-Stärke mit modifiziertem Verzweigungsgrad, isolierbar aus Pflanzen gemäß den Ansprüchen 13 und 14.

19. Amylopektin-Stärke mit modifiziertem Verzweigungsgrad, isolierbar aus Pflanzenzellen gemäß Anspruch 11.

20. Verwendung der Stärke gemäß den Ansprüchen 18 und 19 zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten.