HUT73740A - Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants - Google Patents
Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants Download PDFInfo
- Publication number
- HUT73740A HUT73740A HU9600285A HU9600285A HUT73740A HU T73740 A HUT73740 A HU T73740A HU 9600285 A HU9600285 A HU 9600285A HU 9600285 A HU9600285 A HU 9600285A HU T73740 A HUT73740 A HU T73740A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- leu
- val
- seq
- branching
- ser
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Növényekben amilopektin keményítő elágazási fokát változtató enzimek és az azokat kódoló DNS szekvenciák
A találmányban olyan DNS szekvenciák kerülnek leírásra, melyek a kódoló szálon növényi elágazásbontó enzimeket kódolnak, melyeknek transzgenikus növényekben létrehozott transzkriptjei elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező új proteineket kódolnak, mely enzimek a transzgenikus növényekben az amilopektin keményítő elágazási fokát csökkentik. Leírásra kerülnek olyan DNS szekvenciák is, melyek a kódoló szálon olyan növényi elágazásbontó enzimeket kódolnak, melyeknek transzgenikus növényekben létrehozott transzkriptjei megakadályozzák az elágazást megszüntető enzimek enzimatikus tulajdonságával rendelkező proteinek szintézisét, melyek a transzgenikus növényekben az amilopektin keményítő elágazási fokát növelik, valamint olyan plazmidok is leírásra kerülnek melyeken ezek a DNS szekvenciák lokalizálódnak és melyek a növényi sejtekbe és növényekbe juttathatók.
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
S.B.G. & κ.
Nemzetközi U Szabadalmi Iroda ,686/SZE f:’?62 *udaP«t. Andrassy út 113
Telefon: 34-24-950. Fax: 34-24-323
Növényekben amilopektin keményítő elágazási fokát változtató enzimek és az azokat kódoló DNS szekvenciák
Leírásra kerül egy olyan folyamat is, melynek segítségével olyan genetikailag manipulációval módosított növények hozhatók létre, melyek amilopektin keményítőjét módosítjuk és a módosított keményítő ezekből a növényekből kinyerhető.
A NÖVÉNYEKBEN ELŐFORDULÓ AMILOPEKTIN KEMÉNYÍTŐ ELÁGAZÁSI FOKÁNAK MEGVÁLTOZTATÁSÁRA KÉPES
ELÁGAZÁST MEGSZÜNTETŐ ENZIMEK ÉS AZ EZEKET KÓDOLÓ DNS SZEKVENCIÁK,
A jelen találmány olyan DNS szekvenciákkal kapcsolatos melyek a kódoló szálon növényi elágazásbontó enzimeket kódolnak, melyeknek transzgenikus növényekben létrehozott transzkriptjei elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező új proteineket kódolnak, mely enzimek a transzgenikus növényekben az amilopektin keményítő elágazási fokát csökkentik, valamint olyan DNS szekvenciák, melyek a kódoló szálon olyan növényi elágazásbontó t
enzimeket kódolnak, melyek transzgenikus növényekben létrehozott transzkriptjei megakadályozzák az elágazásbontó enzimek enzimatikus tulajdonságával rendelkező proteinek szintézisét, melyek a transzgenikus növényekben az amilopektin keményítő elágazási fokát növelik, valamint olyan plazmidokkal, melyeken ezek a DNS szekvenciák lokalizálódnak és melyek a növényi sejtekbe és növényekbe juttathatók.
A találmány kapcsolatos egy olyan folyamattal is, melynek segítségével olyan genetikailag manipulációval módosított növények hozhatók létre, melyeknek amilopektin keményítőjét módosítjuk és a módosított keményítő ezekből a növényekből kinyerhető.
A poliszacharidok, mint a keményítő, az olajok, zsírok és proteinek mellett, a növényekből kinyerhető alapvető fontosságú felhasználható nyersanyagok.
A felhasználható nyersanyagok alkalmazásának útjában álló döntő tényező az olyan anyagok hiánya, melyek a forma, szerkezet vagy más fiziko-kémiai paraméterek tekintetében pontosan megfelelnek a vegyipar követelményeinek. Ahhoz, hogy a felhasználható nyersanyagokat a lehető legtöbb módon fel lehessen használni, különösen fontos, hogy nagy anyag diverzitást tudjunk biztosítani. A poliszacharidokat tekintve ez azt jelenti, hogy például a keményítőből annyi formát biztosítsunk amennyit csak lehetséges. Ez szükségessé teszi, hogy figyelembe vegyük a nagy felületaktívitási kémiai tulajdonsággal rendelkező erősen elágazó formákat, valamint a gyengén elágazó formákat, melyek erős szerkezeti uniformitással különböztethetők meg. A szerkezeti uniformitás a nagyon hatékony reakció szabályozás fontos előfeltétele a kémiai szintézis során.
Bár a keményítő egy kémiailag egységes alap vegyületböl - glükóz molekulákból - áll, nagyon eltérő molekula formák komplex keveréke, melyek különböznek polimerizációs fokukban és a glükóz láncokon előforduló elágazásokban is. így a keményítő nem egy egységes nyersanyag. Részletesebben, különbség tehető az amilóz keményítő - alfa-1,4 glikozid kötésekkel összekapcsolt glükóz molekulákat tartalmazó alapjában véve elágazásmentes polimer - és az amilopektin keményítő - mely eltérő elágazási! glükóz láncokat tartalmazó komplex keverék - között. Az elágazások a további alfa-1,6 glikozidos kötések megjelenésén keresztül jönnek létre.
A keményítő termelésre használt tipikus növényekben - mint például a kukoricában vagy a burgonyában - a keményítő két formája durván 25 rész amilóz : 75 rész amilopektin arányban fordul elő.
Az alapanyagok, mint például a keményítő uniformitását figyelembe véve az ipari szektorban való felhasználáshoz, olyan növényekre van szükség, melyek például csak az amilopektin komponenst tartalmazzák, vagy olyanokra, melyek csak az amilózt. A nyersanyag keményítő sokfélesége szempontjából olyan növényekre van szükség, melyek eltérően jellemzett elágazási! amilopektin formákat mutatnak. így nagy az érdeklődés a keményítő anyagcsere olyan enzimjei iránt, melyek módosítani képesek a keményítő molekulák elágazási fokát, vagy az olyan gének iránt, melyek felhasználhatók a növények olyan genetikai módosítására, mellyel ezeket képessé teszik a növényekben levő keményítő különböző formáinak szintetizálására.
Ismeretes, hogy bizonyos növényfajok esetében - például a kukoricánál olyan típusok hozhatók létre mutagenezeissel - melynek során a növény egyedi génjeit inaktiváljuk - mely növények csak amilopektint tartalmaznak. A burgonya
I esetében, egy haploid vonal felhasználásával (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, Theor. Appl. Génét. 75:217-221) kémiai mutagenezissel egy amilózt létre nem hozó genotípust hoztak létre. Az ezekből létrehozott haploid vonalak, vagy a homozigóta diploid vagy tetraploid vonalak azonban a mezőgazdaságban nem használhatók fel. A mutagenezises technika nem alkalmazható a mezőgazdasági szempontból fontos heterozigotikusan tetraploid vonalak esetében, mivel technikailag nem lehetséges a gén összes kópiájának inaktiválása a jelen lévő négy különböző genotípus kópia miatt. Visser és munkatársai (1991, Mól. Gén. Génét. 225:289) révén ismert, hogy erősen tiszta amilopektin keményítőt létrehozó formák létrehozhatók a keményítő granulumhoz kötött keményítő szintetáz gén antisense gátlásával burgonya esetében.
A burgonya elágazási enzimje a WO 92/14827 számú szabadalomból ismert. Ez az enzim a Solanum tuberosum Q enzimjeként ismert. Az is ismert, hogy - a WO 92/14827 számú szabadalomban leírt burgonya elágazást létesítő enzim számára információt hordozó DNS szekvenciák segítségével - olyan transzgenikus növények termelhetök, melyekben a keményítő amilóz/amilopektin aránya módosított.
Míg számos Q-enzim előfordulása ismert más fajok, például kukorica esetében (Singh & Preiss, 1985, Plánt Physiol. 79:34-40), az nem ismeretes, hogy a WO 92/14827 számú szabadalomból ismert burgonya elágazás létesítő enzim mellett más enzimek is részt veszenk-e a burgonyában levő elágazó keményítő szintézisében. A Q-enzimeken kívül, melyek elágazóvá teszik a keményítőt, a növényekben olyan enzimek is előfordulnak, melyek feloldják az elágazásokat. Ezeket a proteineket, melyeket elágazásbontó enzimekként is ismernek, három csoportra osztják szubsztrát specifitásuk alapján:
A pullulanázok - melyek a pullulánon kívül az amilopektint is felhasználják mikroorganizmusokban, például Klebsiellá-ban és növényekben fordulnak elő. Növényekben ezeket R-enzimeknek is nevezik.
Az izoamilázok - melyek nem működnek pullulánnal, de glikogénnel és amilopektinnel igen - hasonlóképpen mikroorganizmusokban és növénykeben fordulnak elő. A kukorica egy izoamilázát Manners & Rowe (1969, Carbohydr. Rés. 9:107), és a burgonya egy izoamilázát Ishizaki és munkatártsai (1983, Agric. Bioi. Chem. 47:771-779) írták le.
Az amilo-1,6-glükozidázokat emlősökben és élesztőgombákban írták le és szubsztrátként korlátozó dextrineket használnak.
Az öt endo- és két exoamiláz mellett Li és munkatársai (1992, Plánt. Physiol. 98:1277-1284) csupán egy pullulanáz típusú elágazásbontó enzimet detektáltak cukorrépában. Ez az enzim, mely kb. 100 kDa méretű és pH optimuma 5,5 körül van a kloroplasztiszban helyezkedik el.
Ludwig és munkatársai (1984, Plánt Physiol. 74:856-861) egy spenótból származó elágazást megszüntető enzimet írtak le, mely pullulánt használ fel szubsztrátként, azonban amilopektinnel szemben háromszor gyengébb aktivitást mutat.
A mezőgazdasági szempontból fontos keményítőt raktározó termeszeit növény, a burgonya, esetében az elégazásbontó enzim aktivitását 1951-ben Hobson és munkatársai írták le (1951, J. Chem. Soc. 1451). Azt mutatták be, hogy a megfelelő enzim, a Q-enzimektől eltérően, nem rendelkezik lánc-kinyújtó aktivitással, és csupán hidrolizálja az alfa-1,6 glükozidos kötéseket. Azonban, nem volt lehetőség sem az enzim pontosabb jellemzésére, sem az elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező proteint kódoló DNS szekvenciák leírására.
Eddig, nem ismeretes olyan DNS szekvencia, mely egy növényekből származó elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező proteint kódol, mely, ha a növényi genomba juttatjuk oly módon változtatja meg a növény metabolizmusát, hogy az amilopektin keményítő elágazási fokát növeli vagy csökkenti.
A jelen találmány célja olyan DNS szekvenciák bizosítása, melyek a kódoló szálon elágazásbontó enzimeket kódolnak, olyan plazmidok biztosítása, melyekkel ezek a DNS szekvenciák a növényi sejtekbe vagy növényekbe juttathatók, valamint olyan növényi sejtek biztosítása, melyekből az egész növény regeneráltatható, valamint olyan növények biztosítása, melyek lehetővé teszik a megnövekedett vagy csökkent elágazással rendelkező amilopektin keményítő termelését.
Már leírásra került az elágazást megszüntető enzimek azonosítása és tisztítása, valamint az ezen enzimek peptid szekvenciái és ezek olyan DNS szekvenciák leírására való alkalmazása, mely DNS szekvenciák a transzgenikus növényekben olyan transzkripteket hoznak létre, melyek az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező proteineket kódolnak, vagy melyek a transzgenikus növényekben olyan transzkripteket hoznak létre, melyek megakadályozzák a elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező proteinek szintézisét, valamint leírásra kerültek ezen transzgenikus növények termeléséhez való plazmidok és növényi sejtek is.
Leírásra kerültek olyan transzgenikus növények is, melyek az amilopektin keményítő elágazási fokát csökkentő elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező proteineket kódoló DNS szekvenciákat tartalmaznak, valamint olyan transzgenikus növények, melyek az amilopektin keményítő elágazási fokát növelő elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező proteinek szintézisét megakadályozó DNS szekvenciákat tartalmaznak.
a) először, az elágazásbontó enzimek aktivitásával rendelkező proteineket homogén állapot eléréséig tisztítjuk (lásd az 1. példát)
b) a tisztított enzimből protein szekvenálással megállapítjuk a pepiid szekvenciát (lásd a 2. példát),
c) ezeket a peptid szekvenciákat egy cDNS könyvtárból származó cDNS szekvenciák klónozására használjuk, immunológiai és molekuláris genetikai módszerek is felhasználásra kerülnek (lásd a 3. és a 4. példákat), és/vagy
d) ezeket a peptid szekvenciákat egy genom könyvtárból származó genom DNS szekvenciák klónozására használjuk molekuláris biológiai módszerek segítségével (lásd az 5. példát) és végül
e) a c) és/vagy d) lépések DNS szekvenciáit olyan plazmidokba juttatjuk, melyek lehetővé teszik növényi sejtek transzformálását, valamint a transzgenikus növények regenerálást (lásd a 6. példát).
A példák között, a burgonyára (Solanum tuberosum) vonatkozó példákon keresztül leírt DNS szekvenciák egy növényi elágazásbontó enzimet kódolnak, mely enzim a növényekben természetesen előforduló amilopektin keményítő elágazási fokát módosítja oly módon, hogy az amilopektin keményítő elágazási foka tetszés szerint nő vagy csökken.
Az alábbiakban bemutatott szekvenciák közül legalább egy szekvenciával rendelkező elágazásbontó enzimek protein szekvenciáit a kódoló DNS szekvenciák kódolják:
1. számú szekvencia
Arg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asp Ser Asp Asp Val Lys Pro Glu Gly Gly Asp Asn Leu Gin
5 10 1520
2. számú szekvencia
Arg Leu Ser Ser Alá Gly Ile Thr His Val His Leu Leu Pro Thr Tyr Gin Phe Alá Gly
5 10 1520
3. számú szekvencia
Gly Ser Glu Val Leu Met His Asp Gly Lys
510
4. számú szekvencia
Ser Pro Ser Glu Alá Asp Pro Val Glu Ile Val Gin Leu Lys
5. számú szekvencia
Asp Cys Ile Gin Val Gly Met Alá Alá Asn Asp Lys
6. számú szekvencia
Lys Leu Gin Leu His Pro Val Gin Met Asn
510
7. számú szekvencia
Glu Leu Asp Gly Val Val Trp Ser Alá Glu
510
8. számú szekvencia
Ser Leu Leu Asn Ser Leu Ser Thr Glu Lys
510
9. számú szekvencia
Alá Asn Val Glu Arg Met Leu Thr Val Ser Lys
1510
10. számú szekvencia
Leu Glu Gin Thr Asn Tyr Gly Leu Pro Gin Gin Val He Glu Lys
1015
11. számú szekvencia
Tyr Gly Leu Pro Val Gin Val Phe Glu vagy
12. számú szekvencia
Arg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asn Ser Asp Asp Val Lys
5 10
Megnövekedett vagy csökkent elágazási fokú amilopektin keményítőt tartalmazó transzgenikus növények hozhatók létre egy olyan eljáráson keresztül, mely a következő lépésekkel jellemezhető:
a) Egy DNS szekvenciát hozunk létre a következő rész szekvenciákból:
i) egy promóter, mely növényekben aktív, és mely biztosítja egy RNS keletkezését a tervezett cél szövetben vagy cél sejtekben, ii) egy struktúr DNS szekvencia, mely lehetővé teszi a transzgenikus növényekben az elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező új protein szekvenciát kódoló RNS transzkripcióját, vagy mely lehetővé teszi egy olyan RNS transzkripcióját, mely transzgenikus növényekben megakadályozza az elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező protein szintézisét, iii) ha szükséges, egy 3’-nem-transzlált szekvencia, mely növényi sejtekben a transzkripció befelyezéséhez, valamint az RNS 3'-végéhez poli-A gyökök hozzáadásához vezet,
b) a struktúr DNS szekvencia egy növényi sejt genomba való transzferálása és beépítése, előnyösen rekombináns plazmidokat használva, és
c) az intakt, egész növény regenerálása a transzformált növényi sejtekből.
Előnyösen a ii) pontban megnevezett elágazásbontó enzim protein szekvenciája tartalmazza az 1. - 12. számú szekvenciák egyikét, ezek közül többet, vagy mindegyiket. A b) lépésnek megfelelően a rekombináns plazmidok tartalmazzák
azokat a DNS szekvenciákat, melyek a kódoló szálon kódolják a növényi elágazásbontó enzimeket, vagy ezek fragmentjeit, ezért a DNS szekvenciákból származó transzkriptek a transzgenikus növényekben hatással vannak az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező új proteinek szintézisére, melyek a transzgenikus növényekben csökkentik az amilopektin keményítő elágazási fokát, vagy a DNS szekvenciákból származó transzkriptek a transzgenikus növényekben megakadályozzák az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező endogén proteinek szintézisét, melyek transzgenikus növényekben növelik az amilopektin keményítő elágazási fokát. Ez utóbbi elérhető ko-szupresszióval vagy anti-sense RNS-sel is (Inouye, 1988, Gene 72:25-34; Flavell, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:3490-3496).
A megnövekedett vagy csökkentett elágazási fokkal rendelkező amilopektin keményítővel rendelkező, és a fenti folyamattal előállítható transzgenikus növények szintén a találmány tárgyát képezik. Azok közé a növények közé, melyek esetében az eljárás alkalmazásra kerül haszon növények tartoznak, mint például a kukorica, búza és burgonya.
A találmány vonatkozik az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező proteinekre, melyek az 1. - 12. számú szekvenciák közül eggyel vagy többel rendelkeznek, molekulasúlyuk 50-150 kDa, specifikusabban 70-130 kDa még specifikusabban 90-110 kDa között van. A proteinek olyan növényekből származnak mint például a Solanum tuberosum.
Egy az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező protein szintéziséhez információt tartalmazó, vagy az elágazást megszüntető enzimek endogén aktivitása létrejöttének szupresszálásához információt tartalmazó új struktúr DNS szekvencia azonosításához burgonya növényekből protein kivonatokat nyerünk a példákban leírt módon. Az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásának detektálásához - az 1. példában leírtak szerint - egy szín tesztet alkalmazunk. Amikor a burgonya növény protein extraktumait nem-denaturálódó, amilopektint tartalmazó poliakrilamid gélekben (PAAG) szeparáljuk, egy keményítő módosító aktivitással rendelkező proteint lehet detektálni az ezt követő jódos festéssel. Míg az el nem ágazó amilóz forma kék színű komplexet képez a jóddal, az amilopektin pirosasibolyás színeződést ad. A jóddal pirosas-ibolya színűre változó amilopektint tartalmazó PAAG-kben, azokon a helyeken, ahol elágazásbontó aktivitás található a gél elszíneződésében egy kék szín felé való eltolódás fordul elő, mivel a pirosasibolyás elszíneződést adó amilopektin elágazásait az enzim megszünteti.
A protein más proteinektől való szeparálásával - progresszív ammónium szulfátos kicsapatás és ezt követő immobilizált β-ciklodextrinen való affinitás kromatográfia segítségével - a proteint homogén állapot eléréséig tisztítjuk a találmánynak megfelelően. A peptid szekvenciákat a tiszta proteinekből határozzuk meg (lásd a 2. példát). Ennek eredményeként egy növényi elágazábontó enzimek peptid szekvenciái az első alkalommal állnak rendelkezésre. Az elágazásbontó enzim pepetid szekvenciái jellegzetes területeken mikrobiális elágazásbontó enzimekkel mutatnak bizonyos homológiát, ez azonban nem igaz a protein összes doménjére. A Solanum tuberosum-ból származó új elágazásbontó enzim így egy korábban ismeretlen típusú elágazásbontó enzimet képvisel. Az elágazásbontó enzim peptid szekvenciája a találmány szerint növényekben előforduló olyan DNS szekvenciák azonosítására szolgál, melyek elágazásbontó enzim aktivitásával rendelkező peptidet kódolnak. Immunológiai eljárás alkalmazható (lásd a 3. példát), vagy molekuláris genetikai módszerek is felhasználhatók (lásd a 4. és 5. példákat).
Ha az új elágazásbontó enzimet kódoló DNS szekvenciákat meghatároztuk, ezek baktériumban vektor plazmidokba való klónozással megsokszorozhatok. A vektorokra példák a pBR322, a pUC-sorozat, az m13mp-sorozat és a hasonló vektorok. Az új elágazásbontó enzimet kódoló DNS szekvencia olyan kötőkkel is biztosítható, melyek lehetővé teszik a más plazmidokba való egyszerű újraklónozást. A növényekbe való bejuttatás céljaira (lásd a 6. példát) bináris plazmidok - melyek például az Escherichia coli és az Aqrobacterium tumefaciens baktériumokhoz való replikációs szignált tartalmaz - előnyösen, de nem kizárólagosan használhatók. Ha ezek a bináris plazmidok T-DNS elemeket tartalmaznak az új elágazásbontó enzim DNS szekvenciájának kétszikű növények genomjába való transzferálása különösen egyszerű. Azonban más módszerek is rendelkezésre állnak, például a ballisztikuis eljárások segítségével történő transzformáció, melyet az egyszikűek transzformálására használunk (vesd össze, Potrykus, 1991, Ann. Rév. Plánt Mól. Bioi. Plánt Physiol. 42:205-225).
A genetikailag megváltoztatott növényekben való transzferált transzgén expressziójának biztosításához az új elágazásbontó enzim cDNS szekvenciáját egy promoter szekvenciához fúzionáltatjuk. Az összes növényekben aktív promótert figyelembe vesszük elméletileg. Az előnyben részesített promóterek azok, melyek a transzformálandó növény keményítő raktározó szerveiben aktívak. így kukorica esetében, ez a kukorica granulumokat, míg burgonya esetében ez a gumót jelenti.
A gumó specifikus B33 promoter (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8:23-29) előnyösen, de nem kizárólag alkalmazható a burgonya transzformálására. A transzgén által létrehozott RNS stabilizálásához ha szükséges egy terminációs és egy poliadenilációs szignál is hozzátehető az elágazást megszüntető enzimet kódoló
DNS szekvenciához. Ez lehet például az Aqrobacterium tumefaciens-böl származó oktopin szintetáz gén terminációs szignálja.
A promóter, a struktúr DNS szekvencia és ha szükséges egy terminációs szignál fúziójával olyan forma hozható létre, mely megfelelő plazmidokba integrálható a növények transzformálása céljából. Ezek a rekombináns plazmidok szintén a találmány tárgyát képezik.
A rekombináns plazmidok olyan növényi sejtek transzformálására használhatók, melyekből egész növények regeneráltathatók. A találmány szerinti DNS szekvenciákat tartalmazó ilyen növényi sejtek szintén a találmány tárgyát képezik. A rekombináns plazmidok felhasználhatók az elágazásbontó enzimet kódoló nukleinsav szekvenciák azonosítására is.
Egy promótert, az új elágazásbontó enzim kódoló régióját és egy terminációs/poliadenilációs szignált tartalmazó DNS szekvencia transzferálása a transzgenikus növényekben egy olyan RNS keletkezését eredményezi, mely mátrixként szolgálhat az új elágazásbontó enzim szintéziséhez, vagy mely egy elágazásbontó enzim endogén mRNS-ével való reakción keresztül szupresszálja annak szintézisét. A transzgén által átírt RNS típusa az új elágazásbontó enzim DNS szekvenciájának promóterhez viszonyított orientációjától függ. Ha az új elágazásbontó enzim DNS szekvenciájának 5' vége a promóter 3' végéhez fúzionált egy olyan transzlálható mRNS jön létre, mely az új elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező protein szintéziséhez szolgál mátrixként. Ha másrészt viszont az új elágazásbontó enzim DNS szekvenciájának 3' vége van a promóter 3' végéhez fúzionálva egy olyan anti-sense RNS jön létre, mely az elágazásbontó enzim endogén mRNS-ének transzlálhatóságát szupresszálja.
Az első esetben, a növényben rendelkezik az elágazásbontó enzim egy további enzimatikus aktivitásával. Ennek az az eredménye, hogy a transzgenikus növény által létrehozott amilopektin elágazási foka kisebb. Ezáltal a keményítő hozzáférhetővé válik, mely - a természetben előforduló típussal összehasonlítva egy sokkal jelentősebb elrendezésű térbeli szerkezettel valamint megnövekedett uniformitással különböztethető meg, melynek előnyös következményei vannak különösen a film-képzési tulajdonságokban.
A második esetben, az elágazásbontó enzim endogén enzimatikus aktivitása szupresszált. Ez a transzgenikus növényekben egy jelentősen elágazó keményítő képződéséhez vezet. A jelentősen elágazó amilopektin különösen nagy felszínnel rendelkezik és így megfelelő kopolimer bizonyos mértékig. Az elágazás jelentős foka az amilopektin vízben való oldódásának javulásához vezet. Ez a tulajdonság bizonyos technikai alkalmazásások esetében nagyon kedvező. A burgonya különösen jól használható az erősen elágazó amilopektin termelésében, a találmány szerint az új elágazásbontó enzim DNS szekvenciájának felhasználásával, azonban a találmány alkalmazása nem korlátozódik a burgonyára.
A transzgenikus növényekben létrehozott módosított keményítő a növényekből, vagy a növényi sejtekből általánosan használt módszerekkel izolálható, és tisztítás után feldolgozható élelmiszeripari és ipari termékek létrehozása céljából.
Az elágazásbontó enzimet kódoló DNS szekvenciák szintén felhasználhatók más növény fajokból származó homológ cDNS izolálásához, vagy genom szekvenciák izolálásához, standard módszereket használva.
• · ·
Az ábrák leírása
1. ábra az elágazásbontó enzim Solanum tuberosum-ból való tisztítását mutatja.
Az ábrán látható jelölések jelentése:
O = a Solanum tuberosumból származó gumó szövet homogenizátum protein kivonata
Áthaladás = a protein kivonat affinitás kromatográfián való áthaladása immobilizált β-ciklodextrinnél β-ciklodextrin = az affinitás kromatográfiát sorrendben 1 mg/ml és 10 mg/ml koncentrációban levő oldott β-ciklodextrinnel eluáljuk
DBE = a Solanum tuberosumból származó elágazásbontó enzim
DE = a Solanum tuberosumból származó aránytalanító (disproportionating) enzim
2. ábra a pB33-R plazmidot mutatja, mely a pBIN19 plazmid egy származéka (Bevan, M., 1984, NUcl. Acids Rés. 12:8711-8721).
Az ábrán látható jelölések jelentése a következő:
A = a Solanum tuberosum B33 génje promóter régiójának Dral/Dral fragmentje (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8:23-29),
B = a cDNS Notl/Notl fragmentje a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének kódoló régiójával az A fragmenthez viszonyítva sense orinetációban
C = a pTiACHő plazmid T-DNS-e 3-as génjének poliadenilációs szignálja (Gielen et al., EMBO J. 3:835-846) - a 11749 - 11939 nukleotidok - melyet a pAGV40 plazmidból izoláltak Pvull/Hindlll fragmentként (Herrera-Estrella et al., 1983, Natúré 303:209-213) és az
Sphl kötő hozzáadása után a pBIN19 plazmid Sphl és Hindlll vágási pontjai közötti Pvull vágási helyre kerül klónozásra.
3. ábra a pB33-R-anti plazmidot mutatja, mely a pBIN19 plazmid (Bevan, M., 1984, Nucl. Acids Rés. 12:8711-8721) egy származéka.
Az ábrán létható jelölések jelentése a következő:
A = a Solanum tuberosum B33 génje promóter régiójának Dral/Dral fragmentje (-1512 - 14 pozíció) (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8:23-29),
B = a cDNS Notl/Notl fragmentje a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének kódoló régiójával az A fragmenthez viszonyítva anti-sense orinetációban
C = a pTiACH5 plazmid T-DNS-e 3-as génjének poliadenilációs szignálja (Gielen et al., EMBO J. 3:835-846) - a 11749 - 11939 nukleotidok - melyet a pAGV40 plazmidból izoláltak Pvull/Hindl11 fragmentként (Herrera-Estrella et al., 1983, Natúré 303:209-213) és az Sphl kötő hozzáadása után a pBIN19 plazmid Sphl és Hindlll vágási pontjai közötti Pvull vágási helyre kerül klónozásra.
1. példa
A Solanum tuberosumban levő új elágazásbontó enzim izolálása
A Solanum tuberosum növényi protein kivonatait a gumó szöveteiből nyerjük. Ehhez, 820 g gumó szövetet homogenizálunk 1500 ml 50 mM nátrium acetátot pH=6,0 - 2,5 mM 1,4-ditio-DL-treitolt, 1,5 mM merkapto-etanolt, 0,4 mM PMSF-et és nátrium biszulfit, nátrium szulfit és aszkorbinsav nyomnyi mennyiségeit (mindegyik esetben egy késhegynyi mennyiségeket) tartalmazó pufferben.
···· ·
A homogenizátumból 50 μΙ mennyiséget elkülönítünk (lásd az 1. ábra 1. nyomát) PAAG-ben. A gél 7,5 % akrilamidot (pH=8,6) tartalmaz, mely keresztkötésben van metilén bis-akrilamiddal 1:75 arányban, valamint 1 % amilopektinnel. Az elektroforézishez való puffer rendszer tris/glicin-t tartalmaz (pH=8,9). A gélfuttatás után a gélt 50 mM tris/citrát (pH=7,0), 2 mM aszkorbinsav elegyével ekvilibráljuk 22 C° hőmérsékleten 4 órán keresztül. A gél megfestését lugol oldattal végezzük 15 percig. A festés eredménye az 1. ábrán látható az 1-es nyomnál. A piros elszíneződés mellett, mely egy elágazásokat létesítő enzim aktivitására vezethető vissza, egy erősen kék elszíneződést mutató sáv is észlelhető. A kék elszíneződés az amilopektin alfa-1,6 glikozidos elágazásainak enzimatikus lebontásának köszönhető, és ez a felelős a pirosas vagy ibolyás elszíneződésért.
2. példa
A Solanum tuberosumból származó elágazásbontó enzim tisztítása és a peptid szekvenciák meghatározása
Az 1. példa szerint nyert Solanum tuberosum gumó szövetéből származó protein kivonathoz folyamatos keverés mellett 4 C° hőmérsékleten ammónium szulfátot adunk a telítödési koncentráció kb. 40 %-ának eléréséig. A proteinek részleges precipitációját két órán keresztül folytatjuk keverés mellett. Ezután a kicsapódott proteineket centrifugálással szeparáljuk. A felülúszó folyadékhoz ammónium szulfátot adunk a fentiekben leírtak szerint a telítödési koncentráció 50 % térfogatáig, a proteineket ismét kicsapatjuk. Ezt a protein frakciót centrifugálással szeparáljuk, majd tovább frakcionáljuk.
A csapadék 20 ml acetát pufferben (lásd az 1. példát) való feloldása után, majd pedig 12 óráig tartó kétszeresen desztillált vízzel szembeni dialízis után a •·»· ··
- 19 protein oldatot kromatográfiának vetjük alá. A frakcionált ammóniumszulfát csapadékból 500 mg proteint 30 ml töltet mennyiségenként Sepharose 6B oszlopra helyezzük, melyhez β-ciklodextrin-t cstlakoztatunk. Az acetát pufferrel való mosást addig folytatjuk, míg az eluátum 280 nm hullámhosszon mutat abszorpciót. A stacioner fázissal szemben alacsony affinitással rendelkező protein frakciót ezután 1 mg/ml acetát buffer β-ciklodextin oldatával eluáljuk, melyet eltávolítunk. 10 mg/ml ciklodextrin koncentrációjú acetát pufferrel a burgonya elágazást megszüntető enzimjét eluáljuk (vesd össze az 1. ábra *-os nyomával).
Az elágazást megszüntető enzimben erősen feldúsított eluátum frakciót elektroforézisnek vetjük alá denaturáló PAAG-ben Laemmli utasításainak megfelelően (1970, Natúré, 227:680-685). A most denaturált proteint levágjuk a gélről. A peptid szekvenciákat standard eljárásokkal határozzuk meg.
A Solanum tuberosumból származó elágazásbontó enzim peptid szekvenciáit az 1. - 12. számú szekvenciákban reprodukáljuk.
3. példa
A Solanum tuberosum egy elágazásbontó enzimje cDNS szekvenciáinak izolálása immunológiai módszerek segítségével.
A 2. példa szerint tisztított proteint használjuk nyulak immunizálásához. Az immunizált nyulak szérumainak segítségével a Solanum tuberosum gumó szöveteiinek transzkriptjeit képviselő cDNS könyvtárakat a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjét kódoló szekvenciákat tartalmazó cDNS kiónok utáni szkríneléshez használjuk. Ehhez, a Solanum tuberosum gumó szövetéből teljes RNS-t preparálunk Logemann és munkatársai szerint (1987, Anal. Biochem. 163:1620). A standard módszerekkel poliadenilált mRNS-t a teljes RNS-böl állítjuk elő, és a
Gubler & Hoffmann (1983, Gene 25:263) által leír eljárásnak megfelelően használjuk a cDNS szintéziséhez. A cDNS-t a kereskedelemben beszerezhető EcoRI/Notl adapterekkel ligáljuk, majd a lambda ZAPII expressziós rendszer EcoRI hasítási pontjához ligáljuk. A lambda fág DNS tág fejbe való burkolása után E. coli XL1-Blue sejteket fertőzünk meg, majd petri csészében levő tápközegre szélesztjük 25000/75 cm^ sűrűségben. Körülbelül 3 órás inkubálás után nitrocellulóz szűrőpapírokat nedvesítünk meg 10 mM IPTG oldattal, és ezeket a lizált baktérium tenyészetekre fektetjük, majd újabb 3 óra után eltávolítjuk. A szűrőpapírokat egy immunológiai vizsgálathoz használjuk fel, melyet az 5. példában leírt Western lenyomat technikával végzünk. pBluescript plazmidokat nyerünk a három vizsgálati ciklus után a fág fajokból való in vivő kimetszéssel, melyek tartalmazzák a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének cDNS szekvenciáját. A cDNS szekvenciáját Sanger és munkatársai (1977, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) módszerét használva határozzuk meg. Az inzertet megfelelő restrikciós enzimekkel való hasítással lehet izolálni a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének szekvenciáját tartalmazó pBluescript plazmidból, majd standard eljárásokkal bináris plazmidokba klónozhatok növények transzformálásának céljával (lásd a 6. példát).
4, példa
A Solanum tuberosum új elágazásbontó enzimjét kódoló cDNS szekvenciák izolálása molekuláris genetikai módszerek segítségével
A 2. példa szerint nyert peptid szekvenciákat az oligonukleotid szekvenciák származtatására használjuk, mely - a genetiai kód degeneráltságát figyelembe véve - a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimje DNS szekvenciájának extraktumait hozza létre. A származtatott oligonukleotid szekvenciáknak megfelelően szintetikus
oligonukleotidokat szintetizálunk standard módszerekkel. Ezeket a cDNS könyvtárak megvizsgálásához használjuk, melyek a Solanum tuberosum gumó szövet transzkriptjeinek képviselői.
Először, egy cDNS könyvtárat hozunk létre úgy, hogy a Solanum tuberosum gumó szövetből teljes RNS-t preparálunk Logemann és munkatársainak (1987, Anal.
Biochem. 163:16-20) leírása szerint. Standard módszerekkel poliadenilált mRNS-t preparálunk a teljes RNS-böl és a Gubler & Hoffmann (1983, Gene, 25:263) által leírt eljárásnak megfelelően használjuk a cDNS szintéziséhez. A cDNS-t a kereskedelemben beszerezhető EcoRI/Notl adapterekhez ligáljuk majd a lambda ZAP II fág DNS-ének EcoRI hasítási pontjához ligáljuk. A lambda fág DNS fág fejbe való burkolása után E. coli XL1-Blue sejteket fertőzünk meg, majd pedig petri csészében levő tápközegre szélesztjük 25000 sejt/75 cm^ sűrűségben. Körülbelül 9 óráig tartó inkubálás után nylon membránokat fektetünk a lizált baktérium tenyészetekre és 1 perc múlva eltávolítjuk. A szűrőpapírokat 1 percig 250 mM HCIben, 5 percig 0,5 M NaOH-ban, 1,5 M NaCI-ben, majd 5 percig 1 M tris/HCI (pH=7,5) elegyében inkubáljuk. Szárítás és 80 C° hőmérsékleten való 1 órás fixálás után a szűrőpapírokat 4 órán keresztül a következőket tartalmazó pufferben inkubáljuk:
2-szeres SSC (nátrium klorid/nátriuum citrát)
10-szeres Denhardt-féle oldat
0,1 % SDS (nátrium dódecil szulfát) mM EDTA (etilén diamin tetraecetsav) mM di-nátriuum foszfát
250 pg/ml hering sperma DNS pg/ml tRNS ί
2 a radiokatívan, terminálisán jelölt oligonukleotidok hozzáadása előtt. 12 óráig tartó hibridizáció után a szűrőpapírokat 2-szeres SSC/0,5 % SDS-ben mossuk majd autoradiográfiának vetjük alá.
A szűrőpapírok hibridizációs és a mosási hőmérsékletét a következők szerint számítjuk ki:
T+15 = 16,6 x [Na+] + 0,41 x % GCqL|qoNUKLEOTID + 81,5 - 675/hosszúságQL|GONljKLEoT|D
A megfelelő oligonukleotid szekvenciákat a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének 1. vagy a 2. számú szekvenciájában reprodukált peptid szekvenciákból számíthatjuk ki. A lehető legmagasabb hibridizációs hőmérséklet eléréséhez - mely a hibrid képződés megfelelő specifitását garantálja - a lehető leghosszabb oligonukleotidokat kell használni. Azonban a hosszúság növekedésével a degeneráltság foka is nő, azaz a különböző szekvencia kombinációkkal rendelkező oligonukleotidok száma is nő. A degeneráltság foka 6000-ig elfogadható. Az 1. számú szekvenciában megadott peptid szekvencia esetében egy 26 bázispár hosszúságú szekvenciát használunk az oligonukleotid próbához. Az oligonukleotid degeneráltsági foka 3072 61 %-os maximális és 38 %-os minimális GC tartalom mellett. így 56 C° hőmérsékletű maximális hibridizációs hőmérsékletet kapunk.
Az 1. számú szekvencia:
Asp Ser Asp Asp Val Lys Pro Glu Gly mRNS: GAU UCN GAU GAU GUN AAA CCN GAA GG 3'
CAG C C G G próba: 3’ CTA AGN CTA CTA CAN TTT GGN CTT CC 5’
Három próbálási ciklusban a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének cDNS szekvenciáját tartalmazó fágokat izoláljuk és egy pBluescript plazmid standard módszerekkel való in vivő kimetszéséhez használjuk. Egy pBluescript plazmid inzertálásaként a cDNS szekvenciát Sanger és munkatársainak módszere (1977, proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467) szerint határozzuk meg. A cDNS-t standard módszerekkel izoláljuk (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY USA) a pBluescript származékból az EcoRI-gyel vagy a Notl-gyel való emésztés után, és standard módszerekkel bináris plazmidokba klónozhatok növények transzformálásának céljából (lásd a 6. példát).
5. példa
A Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjét kódoló genom DNS szekvenciák izolálása molekuláris genetikai móódszerekkel
A 2. példa szerint nyert pepiid szekvenciákat használjuk az olyan oligonukleotid szekvenciák származtatására, melyek - a genetikai kód degeneráltságát figyelembe véve - a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimje DNS szekvenciájának extraktumait hozza létre. A származtatott oligonukleotid szekvenciák szerint szintetikus oligonukleotidokat szintetizálunk standard módszerekkel. Ezeket a Solanum tuberosum genomját képviselő genom DNS könyvtárak vizsgálatához használjuk.
Először, egy genom DNS könyvtárat hozunk létre Liu és munkatársainmak leírása (1991, Plánt Mól. Bioi. 17:1139-1154) szerint. Ezután E. coli P 2392-es sejteket fertőzünk meg a genom DNS fragmenteket tartalmazó tagokkal, majd petri csészékben levő tápközegre kiszélesztjük 30000 sejt/cm^ sűrűségben. Körülbelül 8
- 24 óráig tartó inkubálás után nitrocellulóz membránokat fektetünk a lizált baktérium rétegre, majd 1 perc után eltávolítjuk. A szűröket ezután 2 percig 0,2 M NaOH-ban,
1,5 M NaCI-ben, 2 percig 0,4 M tris/HCI (pH=7,5) elegyében, majd 2 percig 2-szeres SSC-ben inkubáljuk. Szárítás után a DNS UV rögzítését keresztkötödésen keresztül hajtjuk végre. Ezután a szűröket 3 órán keresztül a következőket tartalmazó pufferben inkubáljuk:
2-szeres SSC (nátrium klorid/natriuum cifrát)
10-szeres Denhardt-féle oldat
0,15 % SDS (nátrium dódecil szulfát) mM EDTA (etilén diamin tetraecetsav) mM di-nátriuum foszfát
250 pg/ml hering sperma DNS a radiokatívan, terminálisán jelölt oligonukleotidok hozzáadása előtt. 12 óráig tartó hibridizáció után a szűrőpapírokat 0,2-szeres SSC/0,1 % SDS-ben mossuk majd autoradiográfiának vetjük alá.
A szűrőpapírok hibridizációs és a mosási hőmérsékletét a következők szerint számítjuk ki:
16,6 x [Na+] + 0,41 x [% GCqL|GqNUKLE0TID j + 81,5 - 675/hosszúságOL|GONUKLEOTID - 15 = T
A megfelelő oligonukleotid szekvenciákat a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének 1. vagy a 6. számú szekvenciájában reprodukált peptid szekvenciákból számíthatjuk ki. A lehető legmagasabb hibridizációs hőmérséklet eléréséhez - mely a hibrid képződés megfelelő specifitását garantálja - a lehető leghosszabb oligonukleotidokat kell használni.
Azonban a hosszúság növekedésével a degeneráltság foka is nö, azaz a különböző szekvencia kombinációkkal rendelkező oiigonukleotidok száma is nö.
A degeneráltság foka 10000-ig elfogadható. Ha egy proteinből származó számos pepiid szekvenciát ismerünk ennek megfelelően kiszámíthatók az oiigonukleotidok és felhasználhatók a hibrid képzéshez egy oligonukleotid keverékkel együtt. Ez a hibrid képződés hatékonyságét megnövelheti. Az 1. számú szekvenciában megadott peptid szekvencia esetében egy 26 bázispár hosszúságú szekvenciát használunk az oligonukleotid próbához. Az oligonukleotid degeneráltsági foka 3072 61 %-os maximális és 38 %-os minimális GC tartalom mellett. így 56 C° hőmérsékletű maximális hibridizációs hőmérsékletet kapunk. A 6. számú szekvenciában megadott peptid szekvenciához egy 20 bázispár hosszúságú szekvenciát használunk az oligonukleotid próbához. Az oligonukleotid degeneráltsági foka 384 55 %-os maximális és 50 %-os minimális GC tartalom mellett. Az ebből kiszámítható maximális hibridizációs hőmérséklet 60 C°. A két oligonukleotid próbát keverékként 54 C° hőmérsékleten használjuk a hibridizációhoz.
A próbák szintéziséhez való bázis szekvencia a következő:
1. számú peptid szekvencia:
Asp Ser Asp Asp Val Lys pro Glu Gly mRNS: 5' GAU UCN GAU GAU CUN AAA CCN GAA GG 3'
CAG C C G G próba: 3’ CTA AGN CTA CTA CAN TTT GGN CTT CC 5’
GTC G G C C • · ♦ « « * ·
6. számú szekvencia:
lleGIn Val Gly Met Alá Alá mRNS: 5' AUU CAA GU-GG-AUG GC-GC 3’
C G
A próba: 3' TAA GTT CAI CCI TAC CGI CG 5'
G C
T
Három próbálási ciklusban a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjének genom DNS szekvenciáját tartalmazó fágokat izoláljuk.A genom DNS inzertációkat a pozitív kiónokból megfelelő restrikciós enzimek segítségével izoláljuk és gél elektroforézissel szeparáljuk. A lambda DNS-t a genom DNS szekvenciától elkülönítjük majd standard módszerekkel izoláljuk (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY USA) és egy pBluescript plazmidba klónozzuk és E. coli DH5-alfa sejtekbe transzformáljuk. Mivel az 5. példa szerint létrehozott genom DNS átlagosan 8 - 15 kb hosszúságú, 500 bázispártól 3,5 kB hosszúságú szubfragmenteket hozunk létre standard módszerekkel megfelelő restrikciós enzimek segítségével és a pBluescript plazmidba szubklónozzuk. A különböző pBluescript plazmidok inzertált DNS szekvenciáját Sanger és munkatársainak módszere (1977, proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:54635467) szerint határozzuk meg.
A Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjét kódoló szekvenciákat a megfelelő enzimekkel való restrikciós emésztés után izoláljuk és standard módszerekkel bináris plazmidokba klónozhatok növények transzformálásának céljából (lásd a 6. példát).
6. példa
Bináris plazmidok megszerkesztése Aqrobacterium_____trumefaciens transzformálásához, valamint növények Aqrobacterium trumefaciensszel való genetikai módosításához
A növény transzformáláshoz a 3. vagy a 4. példa szerint nyert cDNS-t egy pBluescriptben levő inzertként egy a pBIN19 plazmidból (Bevan, 1984 Nucl. Acids Rés. 12:8711-8720) származó bináris vektorba klónozzuk. így két szerkezetet kapunk, egyrészt a pB33-R plazmidot, másrészt viszont a pB33-R-anti plazmidot (vesd össze a 2. és a 3. ábrával). A két szerkezet egy transzgént, növényekben való expresszálásához való protmótert - a Solanum tuberosum B33 promóterét tartalmazza (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8:23-29). Míg a pB33-R a cDNS-t sense orientációban tartalmazza, azaz egy transzlálható RNS keletkezéséhez vezet transzgenikus növényekben, a pB33-R-anti egy az endogén gén expresszálásának gátlására szolgáló antisense szerkezetet képvisel. A szerkezeteket a következők szerint hozzuk létre.
pB33: A Solanum tuberosum B33 génjének promóterét egy Dral fragmentként (-1512 - +14 Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8:23-29) a túllógó végek polimeráz ll-vel való lebontása után a pUC19 plamzid Sacl hasítási helyére klónozzuk. EcoRI/Smal fragmentként a promóter régiót a pBIN19 bináris vektorba klónozzuk, mely vektor az Aqrobacterium trumefaciens oktopin szintetáz génjének terminációs szignálját egy polilinkert tartalmazó M13mp19 közvetlen közelében tartalmazza. A pB33 plazmid jön létre a folyamat során. A 3. vagy a 4. példa szerint izolált cDNS töltött Notl fragmentjét a pB33 Smal hasítási helyére klónozzuk a promóterhez viszonyított sense orientációban (a cDNS 5' vége a promóter 3' végéhez képest). A folyamat során a pB33-R plazmid jön létre.
pB33-R-anti: A 3. vagy a 4. példa szerinti cDNS töltött Notl fragmentjét a pB33 bináris vektorba klónozzuk a promóterhez viszonyított antisense orientációban (a cDNS 3' vége a promoter 3' végével szemben). A folyamat során a pB33-R-anti jön létre.
A pB33-R és a pB33-R-anti szerkezeteknek megfelelően olyan plazmidokat szerkesztünk meg, melyek a cDNS helyett egy a Solanum tuberosum elágazásbontó enzimjét kódoló genom DNS szekvenciát tartalmaznak. Ehhez, a kódoló DNS szekvenciát az 5. példa szerint izoláljuk a pBluescript plazmidból megfelelő restrikciós enzonukleázok segítségével, a túllógó végeket feltöltjük és a kapott DNS fragmenteket a pB33 Smal hasítási helyére klónozzuk sense vagy antisense orientációban.
Az Aqrobacterium trumefaciens transzformációjához a bináris plazmidot a sejtekbe direkt transzformációval juttatjuk be Höfgen & Willmitzer módszerének (1988, Nucl. Acids Rés. 16:9877) megfelelően. A transzformált agrobaktériumok plazmid DNS-ét Bimbóim és munkatársai módszerével (1979, Nucl. AAcids Rés. 7:1513-1523) izoláljuk és gél elektroforézissel analizáljuk a megfelelő restrikciós hasítás után. Például burgonya transzformálásához steril tenyészet 10 kis levelét szikével metszük le - fektetjük például 10 ml 2 % szacharózt tartalmazó MS tápközegbe, mely Aqrobacterium trumefaciens egy éjszakán át szelekció alatt tenyésztett tenyészetének 30-50 pl mennyiségét is tartalmazza. 3-5 percig tartó enyhe rázás után a petri csészéket 25 C° hőmérsékleten inkubáljuk sötét helyen. Két nap után a leveleket 1,6 % glükózt, 2 mg/l zeatin ribózt, 0,02 mg/l naftil ecetsavat, 0,02 mg/l gibberellinsavat, 500 mg/l Claforant, 50 mg/l kanamicint és 0,8 % baktoagart tartalmazó MS tápközegre fektetjük. Egy hétig tartó inkubálás után (25 C° hőmérséklet, 3000 lux) a tápközegben levő Claforan koncentrációt a felére csökkentjük. A további tenyésztést a Rocha-Sosa és munkatársai (1989, EMBO J. I 8:29) által leírtak szerint végezzük.
A növények genetikai módosítása sikerének tesztelése a teljes RNS analízisén keresztül valósítható meg, az elágazásbontó enzimet kódoló mRNS jelenlétére vonatkozóan (a pB33-R plazmiddal való transzformáció esetében), vagy az endogén mRNS eltűnését figyelembe véve a pB33-R-anti plazmiddal való transzformálás esetében. A növényi teljes RNS izolálását Logemann és munkatársai (1987, Anal Biochem 163:16-20) szerint végezzük. Az analízishez, teljes RNS-ek 50 pg mennyiségeit ellenőrizzük Northern-féle lenyomatok segítségével a transzkriptek jelenlétére vagy hiányára.
Növényekben az elágazásbontó enzim jelenlétének teszteléséhez a növényi szövetből származó teljes proteint extraháljuk, majd Western lenyomat technikával analizáljuk a 3. példában leírt nyúl antiszérummal. Ehhez, a protein kivonatokat gél elektorforézissel szeparáljuk SDS-PAAG-ben molekulasúlyuknak megfelelően. Az SDS PAAG elektroforézis (PAGE) után a proteines géleket 15-30 percig ekvilibráljuk 48 g/i trist, 39 g/l glicerint, 0,0375 % SDS-t és 20 % metanolt tartalmazó transzfer pufferben grafit elektódákhoz, majd 4 C° hőmérsékleten 1,3 mA/cm^-es nitrocellulóz szűrőpapírra helyezzük 1-2 órára. A szűrőpapírt 30 percig telítjük 20 mM tris/HCI-t (pH=7,5), 500 mM NaCI-t tartalmazó TBS pufferben levő 3 %-os zselatinnal. Ezután a szűrőpapírt 2 óráig egy megfelelő higítású (1:1000 - 10000, TBS pufferben) antiszérummal inkubáljuk szobahőmérsékleten. A szűrőpapírt ezután egyenként 15 percig mossuk TBS-sel, TTBS-sel (TBS puffer 0,1 % polioxi-etilén - (20)-szorbitán monolaurát) és TBS pufferrel. Mosás után a szűrőpapírt 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáljuk alkalikus foszfatázzal kötött kecske-anti-nyúl (GAR) antitestekkel (1:7500 TBS-ben). Ezután a szűrőpapírt a fentiek szerint mossuk, és 100 mM tris/HCI-t q _ ’ · · ······· (pH=9,5), 100 mM NaCI-t, 5 mM MgCl2-öt tartalmazó AP pufferben ekvilibráljuk. Az alkalikus foszfatázos reakció 50 ml Ap pufferben levő 70 pl 4-nitrotetrazolium (NBT) oldatot (50 mg/ml NBT 70 %-os dimetil-formamidban) és 35 pl 5-bróm-4-klór-3indolil foszfátot (BCIP) (50 mg/ml BCIP dimetilformamidban) tartalmazó szubsztrát hozzáadásával indul meg. Öt perc után szabályként az első jelek megfigyelhetők.
A transzgenikus burgonya növényekben levő keményítő amilóz/amilopektin tartalmazának meghatározásához 10 mm átmérőjű kis leveleket áztatunk 14 órán keresztül folyamatos megvilágítás mellett 6 % szacharóz oldatban. A kis ievéldarabok erősen megnövekedett keményítő képződését ez a fényben vakló inkubálás indukálja. Inkubáció után az amilóz és amilopektion koncentrációkat Hovenkamp-Hermelink és munkatársainak leírása (1988, Potato Research 31:241246) szerint határozzuk meg. A keményítő szemcsék elágazási fokának (alfa-1,6 glükozidos kötések), lánc hosszúságának és méretének meghatározását Morrison és munkatársai (1990, Methods in Plánt Biochemistry Academic Press Ltd. 2:323-352) szerint végezzük.
• · · * • « • *
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. A kódoló szálon levő növényi elágazásbontó enzimeket kódoló DNS szekvenciák, azzal jellemezve, hogy a transzgenikus növényekben levő szekvenciák által létrehozott transzkriptek új, az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező proteineket hoznak létre, mely enzimek csökkentik a transzgenikus növényekben levő amilopektin keményítő elágazási fokát.
- 2. A kódoló szálon levő növényi elágazásbontó enzimeket kódoló DNS szekvenciák, azzal jellemezve, hogy a transzgenikus növényekben levő szekvenciák által létrehozott transzkriptek megakadályozzák az elágazásbontó enzimatikus aktivitással rendelkező proteinek szintézisét, mely enzimek a transzgenikus növényekben az amilopektin keményítő elágazási fokát növelik.
- 3. Az 1. és 2. igénypontok szerinti DNS szekvenciák, azzal jellemezve, hogy legalább a peptid szekvenciák egyikével (1. - 12. számú szekvenciák) rendelkező elágazásbontó enzimek protein szekvenciáját ezek kódoló szála kódolja:1. számú szekvenciaArg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asp Ser Asp Asp Val Lys Pro Glu Gly Gly Asp Asn Leu Gin1 5 10 15 202. számú szekvenciaArg Leu Ser Ser Alá Gly Ile Thr His Val His Leu Leu Pro Thr Tyr Gin Phe Alá Gly3. számú szekvenciaGly Ser Glu Val Leu Met His Asp Gly Lys1 510
- 4. számú szekvenciaSer Pro Ser Glu Alá Asp Pro Val Glu He Val Gin Leu Lys1 510
- 5. számú szekvenciaAsp Cys He Gin Val Gly Met Alá Alá Asn Asp Lys1 510
- 6. számú szekvenciaLys Leu Gin Leu His Pro Val Gin Met Asn1 510
- 7. számú szekvenciaGlu Leu Asp Gly Val Val Trp Ser Alá Glu1 510
- 8. számú szekvenciaSer Leu Leu Asn Ser Leu Ser Thr Glu Lys
- 9. számú szekvenciaAlá Asn Val Glu Arg Met Leu Thr Val Ser Lys1 510
- 10. számú szekvenciaLeu Glu Gin Thr Asn,Tyr Gly Leu Pro Gin Gin Val Ile Glu Lys 15 1015
- 11. számú szekvenciaTyr Gly Leu Pro Val Gin Val Phe Glu vagy
- 12. számú szekvenciaArg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asn Ser Asp Asp Val Lys1 5104. A kódoló szálon levő növényi elégazásbontó enzim vagy annak egy fragmentjét kódoló DNS szekvenciákkal rendelkező rekombináns plazmidok, azzal jellemezve, hogy a transzgenikus növényekben levő DNS szekvenciákból származó transzkriptek befolyásolják az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező új proteinek szintézisét, melyek a transzgenikus növényekben az amilopektin keményítő elágazási fokát csökkentik.5. A kódoló szálon levő növényi elágazásbontó enzim vagy annak egy fragmentjét kódoló DNS szekvenciákkal rendelkező rekombináns plazmidok, azzal jellemezve, hogy a transzgenikus növényekben levő DNS szekvenciákból származó transzkriptek megakadályozzák az elágazásbontó enzimek enzimatikus aktivitásával rendelkező endogén proteinek szintézisét, melyek enzimek a transzgenikus növényekben az amilopektin keményítő elágazási fokát növelik.6. A 4. vagy az 5. igénypont szerinti rekombináns plamzidok, azzal jellemezve, hogy a protein szekvenciák közül (1.-12. számú szekvencia) legalább egyet a kódoló szál kódol:1. számú szekvenciaArg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asp Ser Asp Asp Val Lys Pro Glu Gly Gly Asp Asn Leu Gin1 5 10 15202. számú szekvenciaArg Leu Ser Ser Alá Gly Ile Thr His Val His Leu Leu Pro Thr Tyr Gin Phe Alá Gly1 5 10 15203. számú szekvenciaGly Ser Glu Val Leu Met His Asp Gly Lys1 5104. számú szekvenciaSer Pro Ser Glu Alá Asp Pro Val Glu He Val Gin Leu Lys1 5105. számú szekvenciaAsp Cys He Gin Val Gly Met Alá Alá Asn Asp Lys • 99 9 • ·6. számú szekvenciaLys Leu Gin Leu His Pro Val Gin Met Asn1 5107. számú szekvenciaGlu Leu Asp Gly Val Val Trp Ser Alá Glu1 5108. számú szekvenciaSer Leu Leu Asn Ser Leu Ser Thr Glu Lys1 5109. számú szekvenciaAlá Asn Val Glu Arg Met Leu Thr Val Ser Lys1 51010. számú szekvenciaLeu Glu Gin Thr Asn Tyr Gly Leu Pro Gin Gin Val Ile Glu Lys11. számú szekvenciaTyr Gly Leu Pro Val Gin Val Phe Glu1 5 vagy ·»·* *··12. számú szekvenciaArg Thr Leu Leu Val Asn Leu Asn Ser Asp Asp Val Lys1 5 107. Megnövelt vagy csökkentett elágazási fokú amilopektin keményítővel rendelkező transzgenikus növények termelésére való eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépésekből áll:a) egy DNS szekvenciát a következő rész-szekvenciákból állítunk elő:i) egy a növényekben aktív promóterböl, mely a célul kitűzött célszövetben vagy célsejtekben egy RNS képződését biztosítja, ii) egy szerkezeti DNS szekvenciából, mely a transzgenikus növényekben egy elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező új protein szekvenciát kódoló RNS transzkripcióját teszi lehetővé, vagy mely a transzgenitkus növényekben egy elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkező protein szintézisét megakadályozó RNS transzkripcióját lehetővé teszi, iii) ha szükséges, egy 3'-nem transziáit szekvenciából, mely növényi sejtekben a transzkripció befejezéséhez , valamint a poli-A gyökök RNS 3'végéhez való hozzáadását teszi lehetővé,b) A struktúr DNS szekvenciát egy növényi sejt genomjába transzferáljuk és építjük be, előnyösen rekombináns plazmidokat használva, ésc) az intakt, egész növényeket a transzformált növényi sejtekből regeneráljuk.8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) pontban megnevezett elágazásbontó enzim protein szekvenciája az 1. - 12. számú szekvenciákból legalább egy protein szekvenciát magába foglal.···· *··«9. Növényi sejtek, azzal jellemezve, hogy az 1. - 3. igénypontok bármelyike szerinti DNS szekvenciát tartalmazza.10. A 9. igénypont szerinti növényi sejt felhasználása, azzal jellemezve, hogy az amilopektin keményítő megnövekedett vagy csökkent elágazási fokával rendelkező növények előállítására használjuk.11. Az amilopektin keményítő megnövekedett vagy csökkent elágazási fokával rendelkező transzgenikus növények, azzal jellemezve, hogy a 7. vagy 8. igénypontok szerinti eljárással kinyerhetők.12. A 11. igénypont szerinti növények, azzal jellemezve, hogy a felhasználható növényeket a burgonya, a kukorica és a búza képviseli.
- 13. Az 1-3 igénypontok bármelyike szerinti DNS szekvencia felhasználása, azzal jellemezve, hogy az amilopektin keményítő megnövekedett vagy csökkent elágazási fokával rendelkező növények előállítására használjuk.
- 14. A 4. - 6. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns plazmidok felhasználása, azzal jellemezve, hogy olyan növényi sejtek transzformálására használjuk, melyekben az amilopektin keményítő elágazási fokát megnöveljük vagy csökkentjük.
- 15. Az 1. - 3 igénypontok bármelyike szerinti DNS szekvenciák felhasználása, azzal jellemezve, hogy az elágazásbontó enzimeket kódoló nukleinsav sszekvenciák azonosítására használjuk.
- 16. Módosított elágazási fokú amilopektin keményítő, azzal jellemezve, hogy a 11. vagy 12. igénypontok szerinti növényekből izolálhatok.
- 17. Módosított elágazási fokú amilopektin keményítő, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerinti növényi sejtekből izolálhatok.A “ 3 Ο
- 18. Keményítő felhasználása a 16. vagy 17. igénypontok szerint, azzal jellemezve, hogy élelmiszer ipari és ipari termékek létrehozására használjuk.
- 19. Proteinek, azzal jellemezve, hogy egy elágazásbontó enzim enzimatikus aktivitásával rendelkeznek, az 1-12 száámú szekvenciák közül egy vagy több pepiid szekvenciát tartalmaznak, valamint molekulasúlyuk 50 kd és 150 kd közé esik.
- 20. A 19. igénypont szerinti proteinek, azzal jellemezve, hogy molekulasúlyuk 70 kd és 130 kd közé esik.
- 21. A 19 és 20. igénypontok szerinti proteinek, azzal jellemezve, hogy molekulasúlyuk 90 kd és 110 kd közé esik.
- 22. a 19 - 21 igénypontok szerinti proteinek, azzal jellemezve, hogy növényből származnak.
- 23. A 19-22. igénypontok szerinti proteinek, azzal jellemezve, hogy a Solanum tuberosum (burgonya) növényből származnak.A meghatalmazott ifj. Szentpéteri Aüam \ s?aba4ahni( ügy vivő \ v azS.B.G.(& «.''Nemzetközi '* v Mabedálnú-lKSía tagjaH-1062 Budapest, Andrássy út 1131 <11: 34-24-950, Fax: 34-24-323
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4327165A DE4327165A1 (de) | 1993-08-09 | 1993-08-09 | Debranching-Enzyme und deren kodierende DNA-Sequenzen, geeignet zur Veränderung des Verzweigungsgrades von Amylopektin - Stärke in Pflanzen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9600285D0 HU9600285D0 (en) | 1996-04-29 |
HUT73740A true HUT73740A (en) | 1996-09-30 |
Family
ID=6495072
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9600285A HUT73740A (en) | 1993-08-09 | 1994-08-08 | Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6001628A (hu) |
EP (1) | EP0713531A1 (hu) |
JP (1) | JPH09501052A (hu) |
AU (1) | AU693469B2 (hu) |
CA (1) | CA2169174A1 (hu) |
DE (1) | DE4327165A1 (hu) |
HU (1) | HUT73740A (hu) |
IL (1) | IL110583A0 (hu) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4330960C2 (de) * | 1993-09-09 | 2002-06-20 | Aventis Cropscience Gmbh | Kombination von DNA-Sequenzen, die in Pflanzenzellen und Pflanzen die Bildung hochgradig amylosehaltiger Stärke ermöglichen, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und die daraus erhaltbare modifizierte Stärke |
DE19608918A1 (de) | 1996-03-07 | 1997-09-11 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Mais codieren |
DE19618125A1 (de) | 1996-05-06 | 1997-11-13 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Kartoffel codieren |
US7812221B2 (en) | 2003-06-30 | 2010-10-12 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived therefrom |
WO2010075966A1 (de) | 2008-12-29 | 2010-07-08 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zur verbesserten nutzung des produktionspotentials genetisch modifizierter pflanzen |
CN102361555B (zh) | 2009-03-25 | 2014-05-28 | 拜尔农作物科学股份公司 | 具有杀昆虫和杀螨特性的活性化合物结合物 |
CN102448305B (zh) | 2009-03-25 | 2015-04-01 | 拜尔农作物科学股份公司 | 具有杀昆虫和杀螨虫特性的活性成分结合物 |
CN102395271A (zh) | 2009-03-25 | 2012-03-28 | 拜尔农作物科学股份公司 | 具有杀虫和杀螨特性的活性化合物结合物 |
CN102448304B (zh) | 2009-03-25 | 2015-03-11 | 拜尔农作物科学股份公司 | 具有杀昆虫和杀螨特性的活性成分结合物 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4454161A (en) * | 1981-02-07 | 1984-06-12 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith |
US4886678A (en) * | 1988-11-04 | 1989-12-12 | National Starch And Chemical Corporation | Method for manufacture of jelly gum confections |
US5349123A (en) * | 1990-12-21 | 1994-09-20 | Calgene, Inc. | Glycogen biosynthetic enzymes in plants |
IE913215A1 (en) * | 1990-09-13 | 1992-02-25 | Gist Brocades Nv | Transgenic plants having a modified carbohydrate content |
DE4104782B4 (de) * | 1991-02-13 | 2006-05-11 | Bayer Cropscience Gmbh | Neue Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen, die Veränderungen der Karbohydratkonzentration und Karbohydratzusammensetzung in Pflanzen hervorrufen, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen enthaltend dieses Plasmide |
EP0529894A1 (en) * | 1991-08-16 | 1993-03-03 | A.E. Staley Manufacturing Company | Fragmented, debranched amylopectin starch precipitate as fat replacer |
KR930011983A (ko) * | 1991-12-16 | 1993-07-20 | 원본미기재 | 셀프-탠너 화장제 조성물 |
-
1993
- 1993-08-09 DE DE4327165A patent/DE4327165A1/de not_active Ceased
-
1994
- 1994-08-08 AU AU75352/94A patent/AU693469B2/en not_active Expired
- 1994-08-08 JP JP7506224A patent/JPH09501052A/ja not_active Withdrawn
- 1994-08-08 CA CA002169174A patent/CA2169174A1/en not_active Abandoned
- 1994-08-08 IL IL11058394A patent/IL110583A0/xx unknown
- 1994-08-08 US US08/596,257 patent/US6001628A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-08 HU HU9600285A patent/HUT73740A/hu unknown
- 1994-08-08 EP EP94925439A patent/EP0713531A1/en not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-08-06 US US09/370,644 patent/US6433253B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6001628A (en) | 1999-12-14 |
DE4327165A1 (de) | 1995-02-16 |
US6433253B1 (en) | 2002-08-13 |
EP0713531A1 (en) | 1996-05-29 |
IL110583A0 (en) | 1994-11-11 |
HU9600285D0 (en) | 1996-04-29 |
AU693469B2 (en) | 1998-07-02 |
CA2169174A1 (en) | 1995-02-16 |
AU7535294A (en) | 1995-02-28 |
JPH09501052A (ja) | 1997-02-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6716612B2 (en) | DNA molecules coding for debranching enzymes derived from plants | |
WO1995004826A1 (en) | Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants | |
EP0719338B1 (en) | Combination of dna sequences which enable the formation of modified starch in plant cells and plants, processes for the production of these plants | |
US6762346B2 (en) | Nucleic acid molecules coding for debranching enzymes from maize | |
AU740492C (en) | Novel nucleic acid molecules from maize and their use for the production of modified starch | |
AU724164B2 (en) | Nucleic acid molecules coding for debranching enzymes from potato | |
US6791010B1 (en) | Nucleic acid molecule coding for beta-amylase, plants synthesizing a modified starch, method of production and applications | |
US6794558B1 (en) | Nucleic acid module coding for αglucosidase, plants that synthesize modified starch, methods for the production and use of said plants, and modified starch | |
JP3797624B2 (ja) | デンプン合成に関わる酵素をコードするdna分子、ならびに該dna分子を含むベクター、細菌、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物体 | |
WO1996003513A2 (en) | Isoamylase gene from flaviobacterium sp., compositions containing it and methods using it | |
CZ299374B6 (cs) | Molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy SST, SST, transgenní rostlinná bunka, rostlina, rostlinný rozmnožovací materiál a zpusob prípravy 1-kestózy, nys | |
WO1995007355A1 (en) | Combination of dna sequences which enable the formation of modified starch in plant cells and plants, processes for the production of these plants and the modified starch obtainable therefrom | |
HUT73740A (en) | Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants | |
US6469230B1 (en) | Starch debranching enzymes | |
JP2003500060A (ja) | 目的の組換えポリペプチドを含有するデンプン顆粒、それを得る方法、及びその用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: HOECHST SCHERING AGREVO GMBH, DE |
|
DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |