ES2646744T3 - Proteínas de unión al antígeno de polisacáridos quitinosos - Google Patents

Abstract

Una proteína de unión al antígeno derivada de un anticuerpo de camélido y que comprende una secuencia de VHH, donde dicha secuencia de VHH es capaz de unirse a un aminopolisacárido.

Description

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DESCRIPCION

Protemas de union al antigeno de polisacaridos quitinosos

La presente invencion se refiere a una protema de union al antfgeno derivada de un anticuerpo de camelido y que comprende una secuencia de VHH, donde dicha secuencia de VHH es capaz de unirse a un aminopolisacaridos, y a sus usos.

Antecedentes y tecnica anterior

Los polisacaridos son estructuras de tipo carbohidrato polimerico, formadas por unidades repetidas de monosacaridos y unidas entre sf mediante enlaces glucosfdicos. Dependiendo de su composicion qmmica, los polisacaridos se dividen ademas en polisacaridos en el sentido estricto, que contienen unicamente grupos de hidroxilo y acetilo, y aminopolisacaridos, que contienen tambien nitrogeno (grupos amino o amido). Los aminopolisacaridos naturales incluyen la quitina y el quitosano (que contiene unicamente grupos hidroxilo, amino y acetilo) y queratinsulfato, acido hialuronico, condroitina, dermatansulfato y heparina, que contienen tambien grupos carboxilo y sulfato.

La quitina es el aminopolisacarido natural mas abunpspdante y esta ampliamente distribuido entre los invertebrados, incluidos los artropodos, nematodos, crustaceos, hongos y algunos protozoos. La quitina es un polfmero de la N- acetil-D-glucosamina. La forma principal de la quitina es la a-quitina, tal como se encuentra en los hongos y los artropodos, y esta caracterizada por una union antiparalela de las cadenas polisacandicas. La forma p, en la cual las cadenas se unen de una manera paralela, es bastante rara y se encuentra en las diatomeas y algunas protistas. El quitosano es el derivado N-desacetilado de la quitina, aunque esta N-desacetilacion casi nunca es completa. La quitina y el quitosano corresponden a una familia de polfmeros con un contenido variable de acetilo, donde el grado de acetilacion determina si el aminopolisacarido se denomina quitina (grado de acetilacion >70%) o quitosano (grado de acetilacion <70%).

La quitina es el segundo biopolfmero mas abundante en la naturaleza despues de la celulosa y, junto con sus derivados, tiene aplicaciones en una amplia variedad de campos, incluidos el medico, farmaceutico, cosmetico, en biotecnologfa, industria alimentaria, agricultura y proteccion medioambiental. A pesar de su enorme produccion anual, la quitina sigue siendo una fuente de biomasa infrautilizada, principalmente debido a su intratable voluminosa estructura. Por lo tanto, resulta sumamente importante determinar la concentracion de polisacaridos quitinosos, asf como tambien identificar su estructura y posibles modificaciones, especialmente para un procesamiento industrial eficaz. Ademas, puede ser importante centrarse en polisacaridos quitinosos espedficos, para eliminarlos de la matriz o para modificar su estructura.

Se ha prestado una especial atencion a las protemas de union a la quitina para aplicaciones de deteccion y purificacion. Las protemas de union a la quitina son bastante comunes y forman un grupo sumamente diverso que incluye, sin caracter limitante, las quitinasas que hidrolizan las uniones p-1,4-glucosfdicas internas de la quitina. Se han detectado protemas de union a la quitina en bacterias (Folders et al., 2000; Joshi et al., 2008), plantas (Iseli et al., 1993), invertebrados (Suetake et al., 2000) y vertebrados (Boot et al., 1995). Las protemas de union a la quitina se caracterizan por tener uno o mas dominios de union a la quitina; estos dominios de union pueden o no estar unidos a un dominio catalftico. Los dominios de union se pueden aislar y fusionar con otros polipeptidos para crear protemas de union a la quitina novedosas.

Los dominios de union a la quitina y las protemas de union a la quitina tienen multiples aplicaciones posibles: ya que la quitina esta ausente en los vertebrados y las plantas, se pueden utilizar los dominios de union a la quitina para detectar la infeccion o contaminacion por parte de organismos que contienen quitina, tal como se divulga en los documentos WO9217786 o WO2005005955. Si se fusiona un dominio de union a la quitina con una protema de interes, dicha protema de interes se puede purificar en un portador de quitina utilizando cromatograffa de afinidad. Ademas, en el documento WO941l5l1 se divulgan las protemas de union a la quitina biocidas que ejercen una actividad antifungica y que se pueden utilizar como agentes antimicrobianos. Joshi et al. (2008) describen una protema de union a la quitina con actividad insecticida. En el documento WO2004031379 se divulgan protemas de fusion que comprenden un dominio de union a carbohidratos capaz de unirse a la celulosa o la quitina, fusionado con un segundo dominio de union, que puede derivarse de un anticuerpo de camelido.

Sin embargo, a pesar de su posible valor, el uso de los dominios de union a la quitina y las protemas de union a la quitina es bastante limitado debido a varios inconvenientes. La mayona de los dominios de union a la quitina muestran reactividad cruzada con otros polisacaridos, lo que limita el valor del dominio de union para la deteccion espedfica de la quitina (Itoh et al., 2002; Guillen et al., 2010). Varios dominios de union a la quitina se unen a la quitina con una afinidad bastante baja (Neeraja et al., 2010b), lo que limita las aplicaciones en todos los campos. Ademas, los dominios de union a la quitina pueden unirse a la quitina de una manera irreversible (Xu et al., 2000; WO03074660), lo que complica el uso en la purificacion por afinidad, debido a que la protema no se puede eluir en condiciones no desnaturalizantes.

Para resolver los problemas, se ha propuesto la introduccion de mutaciones en los dominios de union a la quitina para modular la actividad de union a la quitina y para crear dominios de union a la quitina modificados con

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propiedades de union reversibles (Ferrandon et al., 2003; WO03074660). Sin embargo, aun se necesitan mejores protemas de union a la quitina.

Se sabe que los anticuerpos poseen una elevada afinidad y especificidad. Sin embargo, la produccion de anticuerpos contra los polisacaridos dista de ser evidente, ya que los polisacaridos son apenas inmunogenos. Se han detectado anticuerpos de tipo IgA contra la quitina en el suero de la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad intestinal inflamatoria (WO2009069007; Dotan et al., 2006; Seow et al., 2008; Seow et al., 2009) y despues de una infeccion por Candida albicans (Sendid et al., 2008). Sales et al. (2001) y Martin et al. (2007) describen la generacion de anticuerpos policlonales de conejo contra la quitina; en el documento US5004699 se divulga el uso de un suero de raton que contiene anticuerpos policlonales contra la quitina para detectar hongos y levaduras. Siham Agdour (2007) describe la generacion de anticuerpos monoclonales contra la quitina y el quitosano. Secondino et al (2005) divulga un anticuerpo monoclonal contra la quitina para inmunomarcar insectos. Sin embargo, para los usos previstos, se necesitan anticuerpos monoclonales y, de manera preferente, anticuerpos monocatenarios. En la tecnica no se han divulgado anticuerpos monocatenarios contra la quitina.

En el documento WO94004678 se describen inmunoglobulinas desprovistas de las cadenas ligeras. Esta demostrado que tales protemas de union al antfgeno que comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende 4 regiones de armazon (FR, por sus siglas en ingles) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles) y, de manera mas espedfica VHH, muestran unas caractensticas superiores respecto a los anticuerpos monoclonales ya que son sumamente estables y mantienen la capacidad de union al antfgeno diana a una temperatura elevada (van der Linden et al., 1999) o en condiciones desnaturalizantes (Dolk et al., 2005) y son resistentes a condiciones regeneradoras duras (Saerens et al., 2005). Por lo tanto, dichas protemas de union al antfgeno son especialmente idoneas para su uso en los procesos industriales. Sin embargo, hasta la fecha, no se han descrito tales protemas de union al antfgeno capaces de unirse a los polisacaridos, aunque se ha intentado obtener tales anticuerpos. De hecho, en el documento WO94004678 se divulgaron anticuerpos de camelido contra carbohidratos, pero estos se dirigen contra la variante del antfgeno superficial de Trypanosoma evansi, que es una glucoprotema. En el documento WO94004678 ni se divulgan ni se sugieren anticuerpos contra polisacaridos en el sentido estricto o contra aminopolisacaridos. Ademas, cuando De Simone et al. (2008) analizan la respuesta inmunitaria en llamas inmunizadas con diferentes tipos de antfgenos, es decir, protema, hapteno conjugado o polisacarido (dextransulfato), no se pudo detectar ninguna respuesta inmunitaria contra el dextrano en los animales inmunizados, a diferencia de las evidentes respuestas inmunitarias a los antfgenos de la protema y del hapteno conjugado; si bien resulta relativamente facil generar anticuerpos clasicos contra el dextrano (Cisar et al., 1975; Bona 1993). La ausencia de una respuesta en forma de anticuerpos en las inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras no es inesperada: de hecho las respuestas contra los polisacaridos en los seres humanos estan claramente dominadas por los tipos IgM e IgG1 (Bona, 1993) mientras que los anticuerpos de cadena pesada de los camelidos pertenecen a las clases IgG2 e IgG3 (Hamers-Casterman et al., 1993; Daley et al., 2010). Ademas, existe constancia de que las interacciones entre los polisacaridos y los sitios de union individuales en una protema son normalmente debiles y la potencia y especificidad de union se ven potenciada gracias a las interacciones polimericas entre los polisacaridos y las protemas de union a polisacaridos oligomericos (Mammen et al., 1998). Siendo de manera intrmseca elementos de union estrictamente monomericos (Muyldermans et al., 2001), los VHH no son adecuados en este sentido para unirse a los polisacaridos. Por lo tanto, el experto en la tecnica asumina que es extremadamente diflcil, si no imposible, generar inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras contra polisacaridos quitinosos. Otro factor problematico es la baja solubilidad en agua de los polisacaridos quitinosos, especialmente la quitina, lo que significa que muchas tecnicas estandar utilizadas para asilar anticuerpos que se llevan a cabo en solucion acuosa, no se pueden aplicar.

Para obtener y aislar protemas de union al antfgeno espedficas para los polisacaridos quitinosos, se utilizo una estrategia original e innovadora. Al inmunizar llamas con una mezcla compleja que contiene polisacaridos quitinosos, en vez de con un antfgeno purificado, seleccionar despues protemas de union al antfgeno utilizando quitina solubilizada inmovilizada y cribar finalmente con quitina, preparada directamente en una superficie solida, los autores fueron capaces de aislar protemas de union al antfgeno, de manera mas espedfica protemas de union que comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende 4 regiones de armazon (FR) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR), donde dichas protemas de union al antfgeno son capaces de unirse a los polisacaridos quitinosos. Preferentemente, dichas protemas de union al antfgeno se unen a la quitina.

La presente invencion proporciona una protema de union al antfgeno derivada de un anticuerpo de camelido y que comprende una secuencia de VHH, donde dicha secuencia de VHH es capaz de unirse a un aminopolisacarido. En una realizacion preferida, el aminopolisacarido es quitina o quitosano. En otra realizacion preferida, la protema de union al antfgeno tiene actividad insecticida o antifungica. En otra realizacion preferida, la protema de union al antfgeno comprende una secuencia seleccionada partir del grupo constituido por las SEQ ID N° 1 - SEQ ID N° 4.

En la invencion tambien se proporciona el uso de una protema de union al antfgeno de la invencion para determinar la presencia y/o concentracion de un aminopolisacarido en una muestra.

En la invencion tambien se proporciona el uso de una protema de union al antfgeno de la invencion para aislar o purificar un aminopolisacarido en una muestra.

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En la invencion tambien se proporciona un agente de direccionamiento, capaz de unir un compuesto a un aminopolisacarido, que comprende al menos una protema de union al antfgeno de la invencion.

Tambien se proporciona en la invencion el uso de un agente de direccionamiento de la invencion para dirigir un compuesto a un aminopolisacarido.

Ademas, en la invencion se proporciona una composicion que comprende (i) al menos un agente de direccionamiento de la invencion y (ii) uno o mas compuestos. En una realizacion preferida, la composicion es una composicion agroqmmica.

En la invencion tambien se proporciona un metodo para mejorar la resistencia de una planta contra plagas de insectos y/o enfermedades fungicas, comprendiendo dicho metodo al menos una aplicacion de una composicion de la invencion a la planta o a partes de la planta.

En la invencion tambien se proporciona una planta, transformada con un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico, que codifica una protema de union al antfgeno de la invencion.

Descripcion detallada de la invencion

En la presente se describe una protema de union al antigeno derivada de un anticuerpo de camelido y que comprende una secuencia de VHH, donde dicha secuencia de VHH es capaz de unirse a un aminopolisacarido.

La expresion «protema de union al antigeno», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la totalidad o parte de una molecula proteinacea (protema, similar a protemas o que contiene protemas) que es capaz de unirse utilizando interacciones intermoleculares espedficas a una molecula diana. Una protema de union al antigeno puede ser una molecula de origen natural, se puede derivar de una molecula de origen natural o puede tener un diseno totalmente artificial. Una protema de union al antfgeno puede estar basada en inmunoglobulinas o puede estar basada en dominios presentes en protemas que incluyen, sin caracter limitante, protemas microbianas, inhibidores de proteasas, toxinas, fibronectina, lipocalinas, protemas superenrolladas antiparalelas monocatenarias o protemas con motivos repetidos. Los ejemplos no limitantes de tales protemas de union al antfgeno son las protemas de union al antfgeno de carbohidratos (CBD) (Blake et al, 2006), anticuerpos de cadena pesada (hcAb), anticuerpos monocatenarios (sdAb), minicuerpos (Tramontano et al., 1994), el dominio variable de los anticuerpos de cadena pesada de camelidos (VHH), el dominio variable de los nuevos receptores antigenicos (VNAR), aficuerpos (Nygren,

2008) , alfacuerpos (WO2010066740), dominios repetidos de anquirina disenados (DARPins) (Stumpp et al., 2008), anticalinas (Skerra, 2008), knottinas (Kolmar , 2008) y dominios de CH2 modificados (nanoanticuerpos; Dimitrov,

2009) .

Los «polisacaridos», tal como se utilizan en la presente, son estructuras de carbohidratos polimericos, formados por unidades repetidas de monosacaridos, unidas entre sf mediante enlaces glucosfdicos, incluidos los aminopolisacaridos, y sus derivados. Los «aminopolisacaridos», tal como se utilizan en la presente, se refieren a polisacaridos que contienen nitrogeno (grupos amido o amino) pero excluye los polisacaridos que ademas contienen grupos carboxilo o sulfato. Preferentemente, dichos polisacaridos no estan contaminados por otros compuestos no polisacandicos y tiene una pureza de al menos un 85% p/p, preferentemente un 90% p/p, mas preferentemente un 95% p/p, aun mas preferentemente un 98% p/p y de la manera mas preferida un 99% p/p. Los polisacaridos se distinguen de los oligosacaridos en su tamano, complejidad y grado de polimerizacion. Los polisacaridos, tal como se utilizan en la presente, comprenden al menos 10 unidades monosacandicas, preferentemente al menos 15 unidades monosacandicas.

La expresion «polisacaridos quitinosos», tal como se utiliza en la presente, se refiere a los aminopolisacaridos y sus derivados o modificaciones, que incluyen, sin caracter limitante, la nitracion, fosforilacion, sulfatacion, acilacion, desacetilacion, hidroxialquilacion, alquilacion y/o copolimerizacion de injerto. Preferentemente, dicho polisacarido quitinoso es un aminopolisacarido natural.

La expresion «capaz de unirse a un polisacarido quitinoso», tal como se utiliza en la presente, significa que la protema de union al antfgeno puede formar un complejo estable con un polisacarido quitinoso, preferentemente un polisacarido quitinoso insoluble, donde se puede evaluar la eficacia de la union precipitando el complejo del polisacarido quitinoso/protema de manera similar a la descrita por Folders et al. (2000). Como alternativa, los polisacaridos quitinosos se pueden inmovilizar sobre un portador insoluble que permita capturar la protema de union al antfgeno y evaluar la union.

Preferentemente, las protemas de union al antfgeno descritas en la presente son protemas de union al antfgeno monoclonales. Una «protema de union al antfgeno monoclonal», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una protema de union al antfgeno producida por un unico clon de celulas y, por lo tanto, un unico tipo puro y homogeneo de la protema de union al antfgeno. Mas preferentemente, las protemas de union al antfgeno descritas en la presente estan constituidas por una unica cadena polipeptfdica. De la manera mas preferida, las protemas de union al antfgeno descritas en la presente comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende 4 regiones de armazon y 3 regiones determinantes de la complementariedad, o cualquier fragmento adecuado de estas, y confieren su especificidad de union al polisacarido quitinoso mediante la secuencia de aminoacidos de 3 regiones

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determinantes de la complementariedad o CDR, donde cada una de ellas no es contigua a las otras (denominadas CDR1, CDR2, CDR3), que estan intercaladas entre las 4 regiones de armazon o FR, donde cada una de ellas no es contigua a las otras (denominadas FR1, FR2, FR3, FR4), preferentemente en una secuencia FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4). La delineacion de las secuencias FR y CDR se basan en el sistema de numeracion unico segun Kabat. El experto en la tecnica esta familiarizado con dichas protemas de union al antigeno que comprenden una secuencia de aminoacidos que comprende 4 regiones de armazon y 3 regiones determinantes de la complementariedad y estas se han descrito, como un ejemplo no limitante, en Wesolowski et al. (2009). La longitud del bucle de CDR3 es sumamente variable y puede variar entre 0, preferentemente 1, y mas de 20 residuos aminoaddicos, preferentemente hasta 25 residuos aminoaddicos.

Preferentemente, resulta facil producir dicha protema de union al antigeno descrita en la presente con un rendimiento elevado, preferentemente en un sistema de expresion recombinante microbiano, y resulta conveniente aislarla y/o purificarla posteriormente. Tambien preferentemente, dicha protema de union al antigeno es estable, tanto durante el almacenamiento como durante la utilizacion, lo que significa que la integridad de la protema de union al antfgeno se mantiene en el almacenamiento y/o en las condiciones de utilizacion, que pueden incluir temperaturas elevadas, ciclos de congelacion-descongelacion, cambios en el pH o en la fuerza ionica, irradiacion de UV, presencia de agentes qmmicos daninos y similares. Mas preferentemente, dicha protema de union al antfgeno es estable en una formulacion agroqmmica tal como se define mas adelante. De la manera mas preferida, dicha protema de union a antfgeno sigue siendo estable en una formulacion agroqmmica (tal como se define mas adelante) cuando se almacena a la temperatura ambiente durante un periodo de hasta dos anos o cuando se almacena a 54 °C durante un periodo de al menos dos semanas.

La union de la protema de union al antfgeno a un polisacarido quitinoso se produce preferentemente con una afinidad elevada: normalmente, la constante de disociacion de la union entre la protema de union al antfgeno y la molecula diana polisacandica quitinosa es inferior a 10"5 M, mas preferentemente, la constante de disociacion es inferior a 10"6 M, aun mas preferentemente, la constante de disociacion es inferior a 10"7 M, de la manera mas preferida, la constante de disociacion es inferior a 10"8 M. Preferentemente, la union de la protema de union al antfgeno al polisacarido quitinoso es espedfica, lo que significa que la protema de union al antfgeno se une de manera preferente a un polisacarido quitinoso que esta presente en una mezcla homogenea o heterogenea de diferentes polisacaridos u otros compuestos. La especificidad de union de una protema de union al antfgeno se puede analizar mediante metodos tales como el ELISA, tal como se describe en el ejemplo 3, en el cual se compara la union de la protema de union al antfgeno a su molecula diana con la union de la protema de union al antfgeno a una molecula no relacionada y con una adherencia espedfica de la protema de union al antfgeno al recipiente de reaccion. En ciertas realizaciones, una interaccion de union espedfica discriminada entre antfgenos deseables y no deseables en una muestra, en algunas realizaciones mas de aproximadamente 10 o 100 veces o mas (por ejemplo, mas de aproximadamente 1000 o 10 000 veces). Preferentemente, la union a su molecula diana de la protema de union al antfgeno sigue siendo funcional en condiciones duras, tales como una temperatura baja o elevada, pH bajo elevado, fuerza ionica baja o elevada, irradiacion UV, presencia de agentes qmmicos desnaturalizantes o similares. En una realizacion preferida, dichas condiciones duras se definen mediante un intervalo de pH de 4 a 9, mas preferentemente mediante un intervalo de pH de 3 a 10, aun mas preferentemente mediante un intervalo de pH de 2 a 10, de la manera mas preferida mediante un intervalo de pH de 1 a 11. En otra realizacion preferida, dichas condiciones duras se definen mediante un intervalo de temperatura de 4-50 °C, mas preferentemente un intervalo de temperatura de 0-55 °C, aun mas preferentemente un intervalo de temperatura de 0-60 °C. En otra realizacion preferida mas, dichas condiciones duras se definen como las condiciones predominantes en una formulacion agroqmmica tal como se definen mas adelante.

En una realizacion preferida, el polisacarido quitinoso es la quitina. La «quitina», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un aminopolisacarido natural constituido por una cadena larga de W-acetilglucosamina, con un grado de desacetilacion inferior a un 70%. Es el componente principal de las paredes celulares de los hongos y tambien esta presente en las cicatrices en las celulas madre (bud scars) de las levaduras Saccharomyces, asf como tambien los exoesqueletos de artropodos tales como los crustaceos (por ejemplo, cangrejos, bogavante y gambas) e insectos.

En una realizacion preferida, dicho polisacarido quitinoso, preferentemente dicha quitina, esta comprendida en una superficie solida, tal como una microesfera paramagnetica con quitina o inmovilizada sobre una superficie solida, tal como quitina solubilizada que esta inmovilizada sobre una placa multipocillo inmunosorbente, a modo de ejemplos no limitantes.

En otra realizacion preferida, dicho polisacarido quitinoso, preferentemente dicha quitina, esta comprendida en un artropodo, preferentemente un insecto, o se deriva de este. La expresion «comprendido en», tal como se utiliza en la presente, significa que esta contenido, ubicado o dentro de un artropodo, preferentemente un insecto, o cualquier parte o estructura concreta de este, tal como el intestino de un insecto, a modo de ejemplo no limitante; la expresion «derivado de», tal como se utiliza en la presente, significa preparado, producido o aislado a partir de un artropodo, preferentemente un insecto, o cualquier parte o estructura concreta de este, tal como la concha de un cangrejo o el exoesqueleto de un insecto, a modo de ejemplos no limitantes. Preferentemente, dicho insecto se considera un insecto que es una plaga. La expresion «un insecto que es una plaga», tal como se utiliza en la presente, es un insecto que es nocivo para los seres humanos o para los intereses humanos e incluye, sin caracter limitante, los organismos que son plagas agncolas que incluyen, sin caracter limitante, los afidos, saltamontes, orugas,

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escarabajos, etc., organismos que son plagas domesticas tales como las cucarachas, hormigas, etc., y vectores de enfermedades tales como los mosquitos de la malaria.

En otra realizacion preferida mas, dicho polisacarido quitinoso, preferentemente dicha quitina, esta comprendida o se deriva de un hongo incluidos, sin caracter limitante, las levaduras y hongos filamentosos. La expresion «comprendido en», tal como se utiliza en la presente, significa que esta contenido, ubicado o dentro de un hongo o una levadura, o cualquier parte o estructura concreta de estos, tal como las hifas de los hongos o las cicatrices de las celulas madre, a modo de ejemplo no limitante; la expresion «derivado de», tal como se utiliza en la presente, significa preparado, producido o aislado a partir de un hongo o una levadura, o cualquier parte o estructura concreta de estos, tal como las esporas de un hongo o la pared celular de una levadura, a modo de ejemplos no limitantes. Preferentemente, dicho hongo se considera un organismo que produce una enfermedad fungica Un «organismo que produce la enfermedad fungica», tal como se utiliza en la presente, es un organismo fungico que es nocivo para los seres humanos o los intereses humanos e incluye, sin caracter limitante, las enfermedades fungicas agncolas incluidas, sin caracter limitante, los marchitamientos, carbones, mohos, etc., y las enfermedades fungicas de animales y seres humanos incluidas, sin caracter limitante, las infecciones por Candida albicans.

En otra realizacion preferida diferente, la protema de union al antfgeno que se une a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, tiene actividad insecticida. La expresion «actividad insecticida», tal como se utiliza en la presente, significa que la protema de union al antfgeno es capaz de destruir al insecto, preferentemente el insecto que es una plaga, o es capaz de ralentizar o inhibir el crecimiento, la reproduccion y/o la actividad nociva (tal como la alimentacion en un cultivo) del insecto, preferentemente el insecto que es una plaga. La actividad insecticida de una protema de union al antfgeno descrito en la presente se puede determinar alimentando al insecto con la protema de union al antfgeno descrito en la presente y monitorizando la supervivencia del insecto, la tasa de reproduccion y/o el resultado de la actividad nociva (tal como la cantidad de hojas del cultivo que come el insecto). A modo de ejemplo no limitante, la protema de union al antfgeno descrita en la presente puede interferir con el sistema digestivo del insecto uniendose al recubrimiento con quitina del intestino del insecto y, por lo tanto, reducir o danar completamente la alimentacion del insecto, lo que en ultima estancia conllevara la inanicion.

En otra realizacion preferida mas, la protema de union al antfgeno que se une a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, tiene actividad fungicida. La expresion «actividad fungicida», tal como se utiliza en la presente, significa que la protema de union al antfgeno es capaz de inhibir parcial o totalmente el crecimiento de un hongo o de destruir el hongo, preferentemente el organismo que causa la enfermedad fungica, tal como se ha descrito anteriormente. La actividad fungicida de una protema de union al antfgeno descrito en la presente se puede determinar anadiendo la protema de union al antfgeno descrita en la presente al medio de cultivo de un hongo o levadura y monitorizando las tasas de crecimiento y supervivencia fungicas, utilizando cualquiera de los metodos descritos en el documento WO9411511.

Dichas protemas de union al antfgeno descritas en la presente se derivan de los anticuerpos de camelido de cadena pesada, desprovistos de cadenas ligeras, tales como los dominios variables de los anticuerpos de camelido de cadena pesada (VHH). Preferentemente, dicho VHH comprende, esta constituido preferentemente por una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por las SEQ ID N° 1 - SEQ ID N° 4 o sus homologos. Los homologos, tal como se utilizan en la presente, son secuencias donde cada region de armazon y cada region determinante de la complementariedad muestra al menos un 80% de identidad, preferentemente al menos un 85% de identidad, mas preferentemente al menos un 90% de identidad, aun mas preferentemente un 95% de identidad con la region correspondiente en la secuencia de referencia (es decir, el homologo de FR1 respecto a la FR1 de referencia, el homologo de CDR1 respecto a la CDR1 de referencia, FR2h respecto a FR2r, CDR2h respecto a CDR2r, FR3h respecto a FR3r, CDR3h respecto a CDR3r y FR4h respecto a FR4r) tal como se mide en una alineacion BLASTp (Altschul et al., 1997; definiciones de FR y CDR segun Kabat).

En otra realizacion mas, una secuencia de acido nucleico que codifica cualquiera de las protemas de union al antfgeno anteriores o sus fragmentos funcionales tambien es parte de la presente divulgacion. La divulgacion tambien engloba el uso de cualquier protema de union al antfgeno descrita en la presente para aislar secuencias de aminoacidos que son responsables de la union espedfica a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, para construir dominios de union artificiales basados en dichas secuencias de aminoacidos. Ciertamente, en las protemas de union al antfgeno descritas en la presente, las regiones de armazon y las regiones determinantes de la complementariedad son conocidas y el estudio de los derivados de las protemas de union al antfgeno, que se unen al mismo polisacarido quitinoso, permitira deducir los aminoacidos esenciales que participan en la union al polisacarido quitinoso. Este conocimiento se puede utilizar para construir una protema de union al antfgeno minima y para crear sus derivados.

Ademas, la presente divulgacion tambien contempla vectores de expresion que comprenden secuencias de acido nucleico que codifican cualquiera de las protemas de union al antfgeno anteriores o sus fragmentos funcionales, asf como tambien celulas hospedadoras que expresan tales vectores de expresion. Los sistemas de expresion adecuados incluyen los sistemas de expresion constitutivos e inducibles de bacterias o levaduras, sistemas de expresion de virus, tales como los baculovirus, el virus del bosque Semliki, o la transfeccion transitoria de celulas de insectos o de mairnferos. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen E. coli, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y similares. Los animales hospedadores adecuados

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incluyen HEK 293, COS, S2, CHO, NSO, DT40 y similares. La clonacion, expresion y/o purificacion de las protemas de union al antigeno se puede realizar de acuerdo con las tecnicas que conoce el experto en la tecnica. En consecuencia, la divulgacion engloba metodos de produccion de protemas de union al antigeno descritas en la presente, comprendiendo dicho metodo las siguientes etapas:

(i) clonar las secuencias de acido nucleico que codifican cualquiera de las protemas de union al antigeno descritas en la presente o sus fragmentos funcionales en vectores de expresion adecuados, y

(ii) expresar las protemas de union a antigeno en un hospedador de expresion adecuado; y

(iii) aislar y/o purificar las protemas de union al antigeno a partir del lisado o sobrenadante del hospedador de expresion.

Aunque las colecciones no expuestas al antfgeno o sinteticas de VHH (para consultar ejemplos de tales colecciones remftase a los documentos WO9937681, WO0043507, WO0190190, WO03025020 y WO03035694) pueden contener elementos de union a los polisacaridos quitinosos adecuados, una realizacion preferida de esta divulgacion incluye la inmunizacion de un individuo de una especie de Camelidae con uno o una combinacion de varios polisacaridos quitinosos, para exponer al sistema inmunitario del animal a los polisacaridos quitinosos. Por lo tanto, como se describe en la presente mas adelante, tales secuencias de VHH se pueden generar u obtener preferentemente inmunizando de manera adecuada una especie de Camelidae con uno o una combinacion de varios polisacaridos quitinosos, obteniendo una muestra biologica adecuada a partir de dicha especie de Camelidae (tal como una muestra de sangre o cualquier muestra de linfocitos B) y generando secuencias de VHH dirigidas contra el polisacarido quitinoso deseado a partir de dicha muestra. Tales tecnicas seran evidentes para el experto. Otra tecnica mas para obtener las secuencias de VHH deseadas conlleva inmunizar de manera adecuada a un mairnfero transgenico que sea capaz de expresar anticuerpos de cadena pesada (es decir, de manera que induzca una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra un polisacarido quitinoso), obtener una muestra biologica adecuada partir de dicho marnffero transgenico (tal como una muestra de sangre o cualquier muestra de linfocitos B) y generar a continuacion secuencias de VHH dirigidas contra dicho polisacarido quitinoso partir de dicha muestra, utilizando cualquier tecnica adecuada conocida de por sf Por ejemplo, a este efecto, se pueden utilizar los ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada y los metodos y tecnicas adicionales descritos en los documentos WO02085945 y WO04049794.

En consecuencia, la divulgacion engloba metodos para generar protemas de union al antfgeno descritas en la presente. A modo de ejemplo no limitante, se proporciona un metodo para generar protemas de union al antfgeno que se unen de manera espedfica a los polisacaridos quitinosos, preferentemente a la quitina, que comprende

(i) inmunizar a un animal con una mezcla compleja que contiene polisacaridos quitinosos, y

(ii) seleccionar protemas de union al antfgeno que se unen a la quitina solubilizada inmovilizada sobre una superficie solida; y

(iii) cribar para identificar protemas de union al antfgeno que se unen de manera espedfica a la quitina preparada sobre un portador insoluble.

El cribado para identificar las protemas de union al antfgeno, a modo de ejemplo no limitante, que se unen de manera espedfica a un polisacarido quitinoso se puede llevar a cabo, por ejemplo, cribando un conjunto, agrupacion o coleccion de celulas que expresan los anticuerpos de cadena pesada en su superficie (por ejemplo, linfocitos B obtenidos de un camelido inmunizado de manera adecuada) o bacteriofagos que muestran una fusion del genlll y VHH en su superficie, cribando una coleccion (no expuesta al antfgeno o inmunitaria) de secuencias de VHH o cribando una coleccion (no expuesta al antfgeno o inmunitaria) de secuencias de acido nucleico que codifican secuencias de VHH, todos los cuales cuales se pueden llevar a cabo de una manera conocida de por sf, y el metodo puede comprender ademas de manera opcional una o mas etapas adicionales, tales como, por ejemplo, y sin caracter limitante, una etapa de maduracion de la afinidad, una etapa de expresion de la secuencia de aminoacidos deseada, una etapa de cribado para identificar la union y/o actividad contra el polisacarido quitinoso deseado, una etapa de determinacion de la secuencia de aminoacidos o secuencia de nucleotidos deseada, una etapa de introduccion de una o mas sustituciones de acidos nucleicos, una etapa de formateo en un formato multivalente y/o multiespedfico adecuado, una etapa de cribado para seleccionar las propiedades biologicas y fisiologicas deseadas (es decir, utilizando cualquier ensayo adecuado conocido en la tecnica) y/o cualquier combinacion de una o mas de tales etapas, en cualquier orden.

En la presente tambien se divulga el uso de una protema de union al antfgeno descrita en la presente para determinar la presencia y/o concentracion de un polisacarido quitinoso en una muestra.

El experto en la tecnica esta familiarizado con los metodos para determinar la presencia y/o concentracion de un compuesto utilizando protemas de union al antfgeno y estos incluyen, sin caracter limitante, la inmunoprecipitacion, inmunoensayo fluorescente, radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELlSA) e inmunoensayo magnetico (MIA). La protema de union al antfgeno descrito en la presente se puede marcar para facilitar la deteccion y/o cuantificacion del compuesto. El experto en la tecnica esta familiarizado con el marcaje de protemas de union al antfgeno que incluye el marcaje directo y el marcaje indirecto. En el marcaje directo, la propia

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protema de union al antfgeno se marca con un marcador detectable tal como, sin caracter limitante, un marcador con color, un marcador fluorescente, un marcador radiactivo o una partmula magnetica. Los marcadores fluorescentes son especialmente utiles e incluyen, sin caracter limitante, el isotiocianato de fluorescema (FITC) y otros derivados de la fluorescema, el isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) y otros derivados de la rodamina, la protema fluorescente R-picoeritrina (R-PE) y R-PE:cianina-5 y aloficocianina. Como alternativa, el marcaje se puede llevar a cabo de una manera indirecta. En este caso la protema de union al antigeno descrita en la presente se puede unir a un compuesto secundario detectable o se fusiona o une a una etiqueta, que por sf misma no se puede detectar de manera directa pero que se puede detectar si se une a un compuesto secundario detectable. Resulta obvio para el experto en la tecnica que la deteccion puede ser el resultado de una sucesion de acontecimientos tales como, sin caracter limitante, la union en serie de los compuestos o la activacion de la etiqueta tras la union.

Una «muestra», tal como se utiliza en la presente, es una porcion, trozo o segmento que es representativo del total que se quiere analizar en lo que se refiera a la presencia y/o concentracion de uno o mas polisacaridos quitinosos, preferentemente la quitina. Dicha muestra puede ser una parte que se ha extrafdo del total o puede ser el total medido en un punto representativo en el espacio y/o el tiempo, como es el caso en una muestra medida en lmea por un biosensor durante la fermentacion. A modo de ejemplo no limitante, dicha muestra puede ser una muestra de alimentos, donde es necesario determinar la presencia o concentracion del polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, o modificarla en lo que se refiere a la capacidad alergena de dicho polisacarido quitinoso, o en lo que se refiere a una caractenstica flsica, qmmica o microbiologica deseada o no deseada del polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, para modificar los parametros de calidad de la materia alimentaria, tal como una vida util modificada.

De manera similar, la quitina se utiliza a menudo como un aditivo alimentario, para mejorar la textura del material alimentario, como agente espesante y estabilizante y como potenciador natural del sabor. Se pudo utilizar la quitina para mejorar la calidad nutricional, tal como un aumento de la fibra alimentaria, para obtener un efecto reductor del colesterol, para reducir la adsorcion de lfpidos y como un agente antigastritis (Shahidi et al., 1999). La quitina y el quitosano se utilizan como antimicrobianos (Yalpani et al., 1992). Sin embargo, la presencia de quitina en los alimentos tambien se puede deber a la contaminacion fungica o por levaduras y se ha utilizado la deteccion de la quitina como una medida de tal contaminacion, tal como se divulga en los documentos WO9217786 y US5004699. Se necesita una protema de union al antfgeno espedfica para distinguir entre las posibles fuentes y formas de quitina en los alimentos; las protemas de union al antfgeno descritas en la presente son especialmente adecuadas para este tipo de aplicaciones.

En la presente tambien se describe el uso de una protema de union al antfgeno descrita en la presente para aislar o purificar un polisacarido quitinoso a partir de una muestra.

Se puede utilizar el aislamiento del polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, para purificar dicho polisacarido quitinoso a partir de una mezcla o puede que se utilice para eliminar de una muestra un polisacarido quitinoso contaminante o no deseado. El experto en la tecnica esta familiarizado con los metodos que utilizan las protemas de union al antfgeno para aislar compuestos y estos incluyen, sin caracter limitante, la inmunoprecipitacion y la cromatografla por afinidad. Como alternativa, la protema de union al antfgeno descrita en la presente se puede unir a una membrana, con el fin de utilizarla en la filtracion con membrana o tecnicas similares. Los ejemplos no limitantes de dicho aislamiento y/o purificacion aparecen en el tratamiento de aguas residuales.

Una realizacion preferida del uso de una protema de union al antfgeno descrita en la presente en la purificacion es la purificacion de una protema de fusion, que comprende una protema de union al antfgeno descrita en la presente, de la manera mas preferida un VHH que se une a la quitina. El experto en la tecnica esta familiarizado con las protemas de fusion que consisten en dos o mas protemas, partes de protemas o peptidos que estan unidos entre sf, ya sea por medios qmmicos (tal como la reticulacion o la union covalente) o por metodos de ADN recombinante. El experto en la tecnica esta familiarizado con la inmovilizacion y purificacion de protemas de fusion recombinante, que comprenden un dominio de union a la quitina, en una matriz de quitina y estas se han divulgado en los documentos US5258502 y WO03020745. El reemplazo o la combinacion del dominio de union a la quitina utilizando, respectivamente, una protema de union al antfgeno de la quitina descrita en la presente presenta la ventaja de que la afinidad por la matriz sera mas elevada y/o el perfil de elucion estara mejor definido y/o que el proceso de purificacion sera mas eficaz.

En la presente tambien se describe un kit para detectar la presencia y/o determinar la concentracion de un polisacarido quitinoso en una muestra, que comprende al menos una protema de union al antfgeno descrita en la presente.

Aparte de una protema de union al antfgeno descrita en la presente, que se une a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, el kit puede comprender ademas los reactivos necesarios para marcar y/o detectar y/o cuantificar la protema de union al antfgeno. En una realizacion preferida, el kit se utiliza para fines diagnosticos.

En la presente tambien se describe un biosensor para detectar la presencia y/o determinar la concentracion de un polisacarido quitinoso en una muestra, que comprende al menos una protema de union al antfgeno descrita en la presente.

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Preferentemente, la protema de union al antigeno se inmoviliza en la capa sensible del biosensor; la deteccion de la union puede ser, a modo de ejemplo no limitante, optica, electroqmmica, mediante microequilibrio en cristal de cuarzo, mediante inmunosensores magneticos o mediante inmunosensores basados en voladizos micromecanicos. El experto en la tecnica esta familiarizado con la tecnologfa de la inmovilizacion de la protema de union al antigeno y de la deteccion de la union entre la molecula diana y la protema de union al antigeno y esta ha sido objeto de revision, entre otros por Marquette y Blum (2006), Fritz (2008) y Skottrup et al., (2008).

Tambien se describe en la presente un agente de direccionamiento, capaz de unir un compuesto a un aminopolisacarido, donde dicho agente de direccionamiento comprende al menos una protema de union al antigeno descrita en la presente.

Un «agente de direccionamiento», tal como se utiliza en la presente, es una estructura molecular, preferentemente con un esqueleto peptfdico, que comprende al menos una protema de union al antfgeno descrita en la presente. Un agente de direccionamiento en su forma mas sencilla esta constituido tan solo por una unica protema de union al antigeno; sin embargo, un agente puede comprender mas de una protema de union al antigeno y puede ser monovalente o multivalente y monoespedfico o multiespedfico, tal como se define mas adelante. Ademas de una unica o de multiples protemas de union al antfgeno, un agente de direccionamiento puede comprender ademas otros restos, que se pueden acoplar o fusionar de manera qmmica, ya sea una fusion N-terminal o C-terminal o incluso interna, con la protema de union al antigeno. Dicho otros restos incluyen, sin caracter limitante, uno o mas aminoacidos, incluidos aminoacidos marcados (por ejemplo, marcados de manera fluorescente o de manera radioactiva) o aminoacidos detectables (por ejemplo, detectables con un anticuerpo), uno o mas monosacaridos, uno o mas oligosacaridos, uno o mas polisacaridos, uno o mas lfpidos, uno o mas acidos grasos, una o mas moleculas de bajo peso molecular o cualquier combinacion de los anteriores. En una realizacion preferida, dichos otros restos actuan como espaciadores o conectores en dicho agente de direccionamiento.

Un «compuesto», tal como se utiliza en la presente, puede ser cualquier compuesto, preferentemente una sustancia activa, que incluye, sin caracter limitante, las protemas y complejos proteicos tales como las enzimas o compuestos qmmicos, que incluyen, sin caracter limitante, las sustancias con actividad agroqdmica, tal como se define mas adelante. Preferentemente, un compuesto puede estar comprendido en un portador o sobre este, preferentemente un microportador, donde dicho portador se puede acoplar con uno o mas agentes de direccionamiento que comprenden al menos una protema de union al antfgeno descrita en la presente. La expresion «comprendido en un portador», tal como se utiliza en la presente, significa que esta unido a este o contenido en este por medios tales como, sin caracter limitante, la inclusion, encapsulacion y adsorcion. Preferentemente, el portador es tal que se pueden incorporar, encapsular o incluir el compuesto o los compuestos en el portador, por ejemplo, en forma de una nanocapsula, microcapsula, nanoesfera, microesfera, liposoma o vesmula. Preferentemente, los portadores son tales que poseen unas caractensticas de liberacion inmediata o gradual o lenta, por ejemplo, a lo largo de varios minutos, varias horas, varios dfas o varias semanas. Asimismo, los portadores pueden estar hechos de materiales (por ejemplo, polfmeros) que se rompen o degradan lentamente (por ejemplo, debido a la exposicion prolongada a una temperatura elevada o baja, luz solar, humedad elevada o baja u otras condiciones o factores medioambientales) con el tiempo (por ejemplo, a lo largo de minutos, horas, dfas o semanas) y de esta manera se libera el compuesto del portador.

El agente de direccionamiento descrito en la presente puede ser un agente de direccionamiento «monoespedfico» o un agente de direccionamiento «multiespedfico». Un agente de direccionamiento «monoespedfico» se refiere a un agente de direccionamiento que comprende una unica protema de union al antfgeno o que comprende dos o mas protemas de union a antfgeno diferentes que estan dirigidas cada una de ellas al mismo sitio de union. Por lo tanto, un agente de direccionamiento monoespedfico es capaz de unirse a un unico sitio de union, ya sea mediante una unica protema de union al antfgeno o mediante multiples protemas de union al antfgeno. Un agente de direccionamiento «multiespedfico» se refiere a un agente de direccionamiento que comprende dos o mas protemas de union a antfgeno que estan dirigidas cada una de ellas a diferentes sitios de union. Asf pues, un agente de direccionamiento «biespedfico» es capaz de unirse a dos sitios de union diferentes; un agente de direccionamiento «triespedfico» es capaz de unirse a tres sitios de union diferentes; y asf sucesivamente para los agentes de direccionamiento «multiespedficos». Asimismo, en lo que se refiere a los agentes de direccionamiento descritos en la presente, se utiliza el termino «monovalente» para indicar que el agente de direccionamiento comprende una unica protema de union al antfgeno; el termino «bivalente» se utiliza para indicar que el agente de direccionamiento comprende en total dos protemas unicas de union al antfgeno; el termino «trivalente» se utiliza para indicar que el agente de direccionamiento comprende en total tres protemas unicas de union al antfgeno; y asf sucesivamente para los agentes de direccionamiento «multivalentes».

La expresion «capaz de unir un compuesto a un polisacarido quitinoso», tal como se utiliza en la presente, significa que la union de la protema de union al antfgeno, comprendida en el agente de direccionamiento, al polisacarido quitinoso es lo suficientemente fuerte para unir dicho compuesto a un polisacarido quitinoso. Preferentemente, el compuesto esta comprendido en un portador o sobre este, mas preferentemente un microportador. Preferentemente, dicho agente de direccionamiento se acopla mediante union por afinidad o mediante union covalente a dichos compuestos, aun mas preferentemente a dicho portador que contiene dichos compuestos. Preferentemente, dicho polisacarido quitinoso es la quitina. Preferentemente, dicho polisacarido quitinoso esta comprendido en una superficie solida o inmovilizado sobre una superficie solida.

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El experto en la tecnica esta familiarizado con los metodos para acoplar el compuesto, preferentemente dicho agente potenciador vegetal, y/o portador al agente de direccionamiento y estos incluyen, sin caracter limitante, la union covalente y la union por afinidad. Un ejemplo de la union covalente es una protema de fusion, donde se producen el agente de direccionamiento y un compuesto de naturaleza proteinacea, preferentemente, mediante la expresion de protema recombinante, como una unidad. Una estrategia alternativa a la utilizacion de las protemas de fusion consiste en utilizar la reticulacion qmmica de residuos en el agente de direccionamiento para la union covalente con el compuesto, el cual puede ser una segunda protema u otro compuesto qmmico, utilizando la qmmica de acoplamiento tradicional, por ejemplo, tal como la describe Fipula (2007) y Bioconjugate Techniques, Hermanson, ed. Academic Press Inc., San Diego, CA, EE. UU., (2008). Los residuos aminoaddicos que incorporan grupos de sulfidrilo, tales como la cistema, se pueden unir de manera covalente utilizando un reactivo biespedfico tal como, por ejemplo, el maleimidofenilbutirato de succinimidilo (SMPB, por sus siglas en ingles). Como alternativa, los grupos de lisina ubicados en la superficie proteica se pueden acoplar a los grupos carboxilo activados en la segunda protema mediante el acoplamiento tradicional con carbodiimida utilizando 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y A/-hidroxisuccinimida (NHS). El acoplamiento entre el agente de direccionamiento y el compuesto o portador que comprende el compuesto, puede ser directo o se puede utilizar una molecula espaciadora o de bisagra. Se pueden consultar ejemplos de tales espaciadores en los documentos WO0024884 y WO0140310.

En una realizacion preferida, dicha protema de union al antfgeno comprendida en el agente de direccionamiento descrito en la presente se une a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, que esta comprendido o se deriva de un artropodo, preferentemente un insecto, y/o el agente de direccionamiento resultante es capaz de unir un compuesto a un artropodo, preferentemente un insecto.

En otra realizacion preferida, dicha protema de union al antfgeno comprendida en el agente de direccionamiento descrito en la presente se une a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, que esta comprendido o se deriva de un hongo o levadura, y/o el agente de direccionamiento resultante es capaz de unir un compuesto a un hongo o una levadura.

En otra realizacion preferida diferente adicional, dicho compuesto es una sustancia con actividad agroqmmica, tal como se define mas adelante, con actividad insecticida o antifungica, tal como se ha definido anteriormente.

Tambien se describe en la presente el uso de un agente de direccionamiento descrito en la presente, para dirigir un compuesto a un polisacarido quitinoso.

El termino «dirigir», tal como se utiliza en la presente, significa que el compuesto se suministra en su sitio de accion o cerca de este, donde se puede unir posteriormente a un polisacarido quitinoso mediante una protema de union al antfgeno descrita en la presente que esta comprendida en el agente de direccionamiento. Con el fin de ser capaz de unir, preferentemente retener, un compuesto, preferentemente una sustancia con actividad agroqmmica, a un polisacarido quitinoso, un unico o multiples agentes de direccionamiento se fusionan o se unen al compuesto, preferentemente la sustancia con actividad agroqmmica, mediante un enlace covalente, puentes de hidrogeno, interacciones dipolo-dipolo, fuerzas debiles de Van der Waals o mediante cualquier combinacion de los anteriores. El termino «mezclado», tal como se utiliza en la presente, significa acoplado con, conectado con, anclado con, mezclado con o que cubre. Preferentemente, el compuesto, mas preferentemente la sustancia con actividad agroqmmica, esta comprendido en un portador o sobre este, preferentemente un microportador. Preferentemente, el polisacarido quitinoso, mas preferentemente la quitina, esta comprendido en una superficie solida o inmovilizado sobre una superficie solida.

El direccionamiento de un compuesto o una combinacion de compuestos con el agente de direccionamiento descrito en la presente se puede referir a cualquier direccionamiento que conozca el experto en la tecnica e incluye, sin caracter limitante, dirigir una enzima a su sustrato o dirigir una fragancia o color a matrices que contienen polisacaridos quitinosos. Ciertamente, se sabe que los dominios de union a la quitina desempenan una funcion esencial en la especificidad de las quitinasas; Neeraja et al. (2010a) han demostrado que la actividad y la estabilidad conformacional de la quitinasa se puede mejorar con la fusion a un dominio de union a la celulosa. Se puede obtener un efecto similar fusionando un dominio catalttico que digiere polisacaridos quitinosos (tal como un dominio catalftico de tipo quitinasa) a una protema de union al antfgeno descrita en la presente. Otras aplicaciones, tales como el uso de agentes de ablandamiento, lubricantes polimericos, agentes fotoprotectores, latex, resinas, agentes que fijan tintes, materiales encapsulados antioxidantes, insecticidas, agentes antimicrobianos, agentes que repelen la tierra o agentes que liberan la tierra, asf como tambien otros agentes de eleccion, y los modos y tiempos de adicion de los agentes a una matriz que contienen polisacaridos estan totalmente comprendidos en las competencias del experto en la tecnica.

En una realizacion preferida, dicho compuesto, preferentemente dicha sustancia con actividad agroqmmica, se dirige a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, que esta comprendida o se deriva de un artropodo, tal como se ha definido anteriormente.

En otra realizacion preferida, dicho compuesto, preferentemente dicha sustancia con actividad agroqmmica, se dirige a un polisacarido quitinoso, preferentemente la quitina, que esta comprendida o se deriva de un hongo o levadura. Ciertamente, se sabe que la quitina es parte de la pared celular fungica y se puede utilizar para dirigir un compuesto

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o una combinacion de compuestos al organismo fungico. A modo de ejemplo no limitante, se puede acoplar una protema de union al antigeno de la quitina descrita en la presente a una sustancia con actividad agroqmmica, tal como se define mas adelante, preferentemente con actividad antifungica, como se ha definido previamente, para suministrar de esta manera la sustancia con actividad agroqmmica al hongo sin contaminar, o contaminando mmimamente, el entorno, lo que conlleva en ultima instancia un nivel mas bajo de dicha sustancia con actividad agroqmmica en el cultivo que se esta tratando con la sustancia con actividad agroqmmica dirigida de esta manera.

En otra realizacion preferida diferente adicional, dicho compuesto es una sustancia con actividad agroqmmica, tal como se define mas adelante, con actividad insecticida o antifungica, tal como se ha definido anteriormente.

Tambien se describe en la presente una composicion que comprende (i) al menos un agente de direccionamiento descrito en la presente y (ii) uno o mas compuestos.

Preferentemente, dichos compuestos estan comprendidos o estan sobre un portador adecuado, preferentemente un microportador. Preferentemente, dicho agente de direccionamiento se acopla mediante union por afinidad o mediante union covalente a dichos compuestos, aun mas preferentemente a dicho portador que contiene dichos compuestos. Preferentemente, dicho compuesto o combinacion de compuestos son sustancias con actividad agroqmmica, tal como se define a continuacion.

En una realizacion preferida, dicha composicion es una composicion agroqmmica. Una «composicion agroqmmica», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una composicion para un uso agroqmmico, tal como se define mas adelante, que comprende al menos una sustancia con actividad agroqmmica, tal como se define mas adelante, de manera opcional con uno o mas aditivos que favorecen una dispersion, atomizacion, deposito, humectacion foliar, distribucion, retencion y/o captacion de los agentes agroqmmicos optimos. A modo de ejemplo no limitante, tales aditivos son diluyentes, disolventes, adyuvantes, surfactantes, agentes humectantes, agentes dispersantes, aceites, adhesivos, espesantes, penetrantes, agentes tamponantes, acidificantes, agentes contra la sedimentacion, agentes anticongelantes, fotoprotectores, agentes desespumantes, biocidas y/o agentes de control del arrastre.

La expresion «uso agroqmmico», tal como se utiliza en la presente, no solamente incluye el uso de composiciones agroqmmicas tal como se han definido anteriormente que son adecuadas y/o que estan destinadas para su uso en los campos de cultivo (por ejemplo, agricultura) sino que tambien incluye el uso de composiciones agroqmmicas destinadas a su uso en los cultivos de invernadero (por ejemplo, horticultura/floricultura) o sistemas de cultivo hidroponico o usos en espacios verdes publicos o privados (por ejemplo jardines privados, parques o campos de deporte), para proteger plantas o partes de la planta incluidos, sin caracter limitante, los bulbos, tuberculos, frutos y semillas (por ejemplo, de organismos daninos, enfermedades o plagas), para controlar, preferentemente promover o aumentar, el crecimiento de las plantas; y/o para estimular el rendimiento de las plantas o las partes de la planta que se recolectan (por ejemplo, sus frutos, flores, semillas, etc.) e incluso el uso de composiciones agroqmmicas que son adecuadas y/o que se destinan para usos no relacionados con las plantas tales como usos domesticos (por ejemplo, herbicidas o insecticidas para uso domestico o agentes para proteger las telas o la madera del dano provocado por organismos daninos), o usos industriales (por ejemplo, agentes para prevenir el ensuciado o para proteger los bienes almacenados del dano de los organismos daninos) o usos por parte de operadores del control de las plagas (por ejemplo, para controlar insectos y roedores no deseados, etc.).

La expresion «sustancia con actividad agroqmmica», tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sustancia o principio activo que se puede utilizar para un uso agroqmmico, tal como se ha definido anteriormente. Los ejemplos de tales sustancias con actividad agroqmmica seran evidentes para el experto y pueden incluir, por ejemplo, compuestos que son activos como insecticidas (por ejemplo, insecticidas de contacto o insecticidas sistemicos, incluidos los insecticidas para uso domestico), acaricidas, miticidas, herbicidas (por ejemplo, herbicidas de contacto o herbicidas sistemicos, incluidos los herbicidas para uso domestico), fungicidas (por ejemplo, fungicidas de contacto o fungicidas sistemicos, incluidos los fungicidas para uso domestico), nematicidas (por ejemplo, nematicidas de contacto o nematicidas sistemicos, incluidos nematicidas para uso domestico) y otros pesticidas (por ejemplo, avicidas, molusquicidas, piscicidas) o biocidas (por ejemplo, agentes para destruir bacterias, algas o caracoles); asf como tambien fertilizantes; reguladores del crecimiento tales como hormonas vegetales; micronutrientes, protectores; feromonas; repelentes; cebos (por ejemplo, cebos para insectos o cebos para caracoles); y/o principios activos que se utilizan para modular (es decir, incrementar, disminuir, inhibir, potenciar y/o desencadenar) la expresion genica (y/u otros procesos biologicos o bioqmmicos) en la planta diana o por parte de esta (por ejemplo, la planta que se va a proteger o la planta que se esta controlando). Las sustancias con actividad agroqmmica incluyen los agentes qmmicos pero tambien los acidos nucleicos (por ejemplo, ARN monocatenario o bicatenario, por ejemplo, tal como el utilizado en el contexto de la tecnologfa de iARN), peptidos, polipeptidos, protemas (incluidas las protemas de union al antfgeno) y microorganismos. El termino «microorganismos», tal como se utiliza en la presente, se refiere a bacterias, hongos, levaduras, virus y similares. Los ejemplos de tales sustancias con actividad agroqmmica seran evidentes para el experto y, por ejemplo, incluyen, sin caracter limitante: glifosato, paraquat, metolaclor, acetoclor, mesotriona, 2,4-D, atrazina, glufosinato, sulfosato, fenoxaprop, pendimetalina, picloram, trifluralina, bromoxinilo, clodinafop, fluroxipir, nicosulfuron, bensulfuron, imazetapir, dicamba, imidacloprid, thiametoxam, fipronilo, clorpirifos, deltametrina, lambda-cihalotrina, endosulfano, metamidofos, carbofurano, clotianidina, cipermetrina, abamectina, diflufenicano, espinosad, indoxacarb, bifentrina, teflutrina, azoxistrobina, tiametoxam, tebuconazol, mancozeb, ciazofamid, fluazinam, piraclostrobina, epoxiconazol,

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clorotalonilo, fungicidas de cobre, trifloxistrobina, protioconazol, difenoconazol, carbendazim, propiconazol, tiofanato, azufre, boscalid y otros agroqmmicos conocidos o cualquier combinacion o combinaciones adecuadas de estos. Otros agentes agroqmmicos adecuados seran evidentes para el experto a partir de la divulgacion de la presente y, por ejemplo, pueden ser cualquier agente agroqmmico comercializado y, por ejemplo, incluir cada uno de los compuestos enumerados en Phillips McDougall, AgriService noviembre 2007 V4.0, Seccion de Productos - 2006 Mercado, fndice de Productos pags. 10-20. Dichas sustancias con actividad agroqmmica se pueden presentar en diferentes formas que incluyen, sin caracter limitante, como cristales, como microcristales, como nanocristales, como cocristales, como un polvo, como granulos, como un polvillo, como comprimidos, como gel, como un concentrado soluble, como una emulsion, como un concentrado emulsionable, como una suspension, como un concentrado en suspension, como una suspoemulsion, como una dispersion, como un concentrado en dispersion, como una suspension de microcapsulas o como cualquier otra forma o tipo de formulacion agroqmmica evidente para los expertos en la tecnica. Las sustancias con actividad agroqmmica puede que no solo incluyan sustancias o principios activos listos para usar sino tambien precursores en una forma inactiva que los factores externos puedan activar. A modo de ejemplo no limitante, el precursor se puede activar por medio de cambios en el pH, provocados por las heridas de las plantas tras el dano debido a los insectos, mediante la accion enzimatica provocada por el ataque fungico o mediante los cambios de temperatura o cambios en la humedad.

La composicion agroqmmica descrita en la presente puede estar en una forma lfquida, semisolida o solida y, por ejemplo, se puede mantener como un aerosol, polvo fluido, polvo humectable, granulo humectable, concentrado emulsionable, concentrado en suspension, microemulsion, suspension de capsulas, microcapsula seca, comprimido o gel que se va a suspender, dispersar, emulsionar o colocar en un entorno lfquido adecuado de otra manera (tal como el agua u otro medio acuoso, organico u oleoso adecuado) para el almacenamiento o la aplicacion. La composicion agroqmmica descrita en la presente comprende al menos una, preferentemente mas protemas de union al antfgeno descritas en la presente. La presencia de una o mas protemas de union al antfgeno descritas en la presente en la composicion agroqmmica descrita en la presente, garantiza la union de la sustancia con actividad agroqmmica a su sitio de accion, tal como la planta con la parte de la planta (por ejemplo, el fruto, tuberculo o bulbo), la semilla de la planta u otro material organico derivado de la planta, a la vez que se evita que la sustancia con actividad agroqmmica se adhiera a los envases de almacenamiento y/o al equipo del operador. Opcionalmente, la composicion puede comprender ademas uno o mas componentes adicionales tales como, sin caracter limitante, diluyentes, disolventes, adyuvantes, surfactantes, agentes humectantes, agentes dispersantes, aceites, adhesivos, espesantes, penetrantes, agentes tamponantes, acidificantes, agentes contra la sedimentacion, agentes anticongelantes, fotoprotectores, agentes desespumantes, biocidas y/o agentes de control del arrastre, adecuados para su uso en la composicion descrita en la presente.

En una realizacion preferida, dicha composicion agroqmmica comprende ejercer una actividad antifungica, tal como se ha definido anteriormente.

En otra realizacion preferida, dicha composicion agroqmmica comprende ejercer una actividad insecticida, tal como se ha definido anteriormente.

La presente divulgacion tambien engloba un metodo para producir una composicion, preferentemente una composicion agroqmmica, descrita en la presente, comprendiendo dicho metodo (i) seleccionar al menos uno, preferentemente mas agentes de direccionamiento descritos en la presente y (ii) acoplar dicho agente o agentes de direccionamiento a las semillas a un compuesto, preferentemente una sustancia con actividad agroqmmica, o una combinacion de compuestos y, opcionalmente, (iii) anadir ademas componentes que pueden ser adecuados para tales composiciones, preferentemente para las composiciones agroqmmicas. Preferentemente, dicho compuesto esta comprendido en un portador, mas preferentemente, dicho agente o agentes de direccionamiento estan acoplados al portador, comprenden el compuesto, preferentemente la sustancia con actividad agroqmmica.

En la presente tambien se describe un metodo para mejorar la resistencia de una planta contra plagas de insectos y/o enfermedades fungicas, comprendiendo dicho metodo al menos una aplicacion de una composicion descrita en la presente a la planta o a partes de la planta.

Si es necesario, dicha composicion se disuelve, suspende y/o diluye en una solucion adecuada antes de su uso. La aplicacion a la planta o partes de la planta se lleva a cabo utilizando cualquier tecnica manual o mecanica adecuada o deseada para aplicar una composicion agroqmmica incluida, sin caracter limitante, la pulverizacion, aplicacion con cepillo, revestimiento, goteo, inmersion, recubrimiento, dispersion, aplicacion en forma de microgotas pequenas, como una niebla o un aerosol. La expresion «mejorar la resistencia de una planta», tal como se utiliza en la presente, se refiere a proteger la planta contra el dano o la reduccion de rendimiento provocado por las plagas de insectos (tal como se ha definido anteriormente) o mediante organismos que provocan enfermedades fungicas (tal como se ha definido anteriormente). Ciertamente, ya que la composicion descrita en la presente tiene una actividad insecticida o antifungica, la aplicacion de dicha composicion a la planta puede ayudar a la planta a combatir el dano y, por lo tanto, a prevenir las perdidas de rendimiento, provocadas por las plagas de insectos u organismos que provocan enfermedades fungicas. La expresion «parte de la planta», tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier parte de la planta ya sea la parte de una planta viva o en crecimiento intacta, o aislada o separada de una planta e incluso se puede contemplar el material de una planta muerta. Preferentemente dichas partes de la planta se seleccionan a partir del grupo constituido por hojas, rafces, frutos, conos, flores, semillas, bulbos y tuberculos.

En una realizacion preferida, dicha planta es un cultivo. El termino «cultivo», tal como se utiliza la presente, se refiere a una especie o variedad de plantas que se cultiva para ser recolectada como alimento, forraje para el ganado, materia prima para combustibles o para cualquier otro objetivo economico. A modo de un ejemplo no limitante, dichos cultivos pueden ser el ir^z, cereales tales como el trigo, centeno, cebada y avena, sorgo, arroz, 5 remolacha azucarera y remolacha forrajera, fruta tal como fruta de tipo pomo (por ejemplo, manzanas y peras), fruta cftrica (por ejemplo, naranjas, limones, limas, pomelos o mandarinas), fruta de tipo drupa (por ejemplo, melocotones, nectarinas o ciruelas), frutos secos (por ejemplo, almendras o nueces), frutas del bosque (por ejemplo, cerezas, fresas, moras o frambuesas), la familia Plantaginaceae o las vides, cultivos leguminosos tales como las habas, lentejas, guisantes y soja, cultivos oleaginosos tales como el girasol, cartamo, colza, canola, ricino u olivos, 10 curcubitaceas tales como los pepinos, melones o calabazas, las plantas con fibra tales como el algodon, lino o canamo, cultivos para combustible tales como la cana de azucar, Miscanthus o pasto varilla, hortalizas tales como las patatas, tomates, pepinos, lechuga, espinacas, cebollas, zanahorias, berenjenas, esparragos o repollo, ornamentales tales como las flores (por ejemplo, petunias, Pelargonium, rosas, tulipanes, azucenas o crisantemos), arbustos, arboles latifolios (por ejemplo, alamos o sauces) y de hoja perenne (por ejemplo las comferas), pastos 15 tales como el cesped, hierba o pasto forraje u otras plantas utiles tales como las plantas del cafe, te, tabaco, lupulo, pimienta, caucho y latex.

En la presente tambien se describe una planta, transformada con un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una protema de union al antfgeno descrito en la presente o cualquier fragmento adecuado de esta.

20 Con el fin de transformar una planta con un acido nucleico que comprende la secuencia de acido nucleico de una protema de union al antfgeno descrita en la presente o cualquier fragmento adecuado de esta, el acido nucleico de la protema de union al antfgeno descrita en la presente se clona en primer lugar en un vector de expresion adecuado, que el experto en la tecnica conoce. Posteriormente, el vector de expresion que comprende la secuencia de acido nucleico que codifica la protema de union al antfgeno descrita en la presente, o cualquier fragmento 25 adecuado de esta, se utiliza para transformar, mediante metodos conocidos por el experto en la tecnica que incluyen, sin caracter limitante, la transformacion mediada por Agrobacterium, electroporacion, microinyeccion o bombardeo con partmulas recubiertas con ADN o ARN u otros metodos de este tipo conocidos por el experto en la tecnica, celulas vegetales o tejido vegetal adecuados y, en ultima instancia, se regenera a partir de dichas celulas vegetales o tejido vegetal transformados una planta que incorpora en su genoma la secuencia de acido nucleico que 30 codifica la protema de union al antfgeno descrita en la presente.

En una realizacion preferida, dicha planta es un cultivo, tal como se ha definido anteriormente.

En otra realizacion preferida, dicha planta, preferentemente dicho cultivo, es mas resistente al dano por parte de plagas de insectos o una enfermedad fungica, tal como se ha definido anteriormente. Ciertamente, ya que la planta expresa una protema de union al antfgeno descrita en la presente, que puede tener actividad insecticida o fungicida 35 tal como se ha descrito previamente, la planta puede ser mas capaz de combatir el dano, y por lo tanto prevenir las perdidas de rendimiento, provocado por las plagas de insectos o los organismos que provocan enfermedades fungicas en comparacion con una planta no transformada con una secuencia de acido nucleico que codifica una protema de union al antfgeno descrita en la presente o cualquier fragmento adecuado de esta.

EJEMPLOS

40 Ejemplo 1: Generacion y seleccion de VHH

Inmunizacion de llamas con homogeneizados de insectos - Se diseccionaron escarabajos de la patata de Colorado (Leptinotarsa decemlineata; CPB), se recogieron los exoesqueletos y las alas y se desecho el resto. Los exoesqueletos y las alas se congelaron por separado en nitrogeno lfquido, se molieron en un mortero y se recogieron los polvos finos. Se congelaron las larvas de CPB, afidos del guisante (Acyrthosiphon pisum) y larvas del 45 gusano del capullo del tabaco (Heliothis virescens) en nitrogeno lfquido, se molieron en un mortero y se recogieron los polvos finos. Los materiales recogidos de los insectos se resuspendieron en PBS y se determino la concentracion de protemas total de las suspensiones con el ensayo de protemas de Bradford. La concentracion de protemas total aproximada fue de 4.2, 0.3, 4.2, 2.7 y 2.3 mg/mL para las suspensiones exoesqueletos de CPB, alas de CPB, afidos del guisante, larvas de CPB y larvas del gusano del capullo del tabaco, respectivamente. Se 50 mezclaron las suspensiones de manera que la concentracion de protemas totales fuera igual y se prepararon almuotas, se almacenaron a -80 °C y se utilizaron las suspensiones para la inmunizacion.

Se inmunizaron dos llamas, concretamente Curley Sue y Jean Harlow, a intervalos semanales con 6 inyecciones intramusculares de suspensiones de insectos mixtas utilizando el Adyuvante Incompleto de Freund (FlA, por sus siglas en ingles). Las dosis de las inmunizaciones fueron de 125 |jg de protemas total en los dfas 0 y 6, y 62.5 |jg de 55 protemas total en los dfas 13, 20, 27 y 34. Se recogio el suero de las llamas en el dfa 0 y en el momento de la recogida de los linfocitos de la sangre periferica en el dfa 38.

Construccion de la coleccion - Se genero una coleccion de VHH independiente para cada llama inmunizada. Se aislo el ARN de los linfocitos de la sangre periferica, despues se sintetizo el ADNc utilizando cebadores de

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hexameros aleatorios y Superscript III de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Invitrogen). Se realizo una primera PCR para amplificar los fragmentos de ADN de VHH y VH utilizando una mezcla de cebadores directos [relacion 1:1 de call001 (5'-gtcctggctgctcttctacaagg-3') y call001b (5'-cctggctgctcttctacaaggtg-3')] y cebador inverso call002 (5'-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3'). Despues de la separacion de los fragmentos de ADN de VH y VHH mediante electroforesis en gel de agarosa y la purificacion de los fragmentos de ADN de VHH a partir del gel, se llevo a cabo una segunda PCR con ADN de VHH para introducir sitios de restriccion apropiados para la clonacion utilizando el cebador directo A6E (5'-gatgtgcagctgcaggagtctggrggagg-3') y el cebador inverso 38 (5'-

ggactagtgcggccgctggagacggtgacctgggt-3'). Se digirieron los fragmentos de la PCR utilizando las enzimas de restriccion PstI y Eco91I (Fermentas) y se ligaron en direccion 5' respecto al gen pIII en el vector pMES3. Los productos de la ligacion se precipitaron con etanol y se hicieron precipitar de acuerdo con los protocolos estandar, se resuspendieron en agua y se utilizaron para electroporar celulas TG1. Los tamanos de las colecciones fueron de al menos 1E+08 clones independientes para cada coleccion. Se realizo una PCR de colonia unica en clones elegidos al azar a partir de las colecciones para evaluar los porcentajes de insercion de las colecciones. Las colecciones «Curley Sue» y «Jean Harlow» tuvieron unos porcentajes de insercion de clones completos > 80%. Las colecciones se numeraron 44 y 35 para las llamas «Curley Sue» y «Jean Harlow», respectivamente. Se generaron fagos a partir de cada una de las colecciones utilizando el fago auxiliar VCSM13 de acuerdo con los procedimientos habituales.

Seleccion de fagos contra la quitina - Para las selecciones contra la quitina, se recubrieron placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) con quitina de calidad practica (Sigma). Se disolvio la quitina con una concentracion de 10 mg/mL en acido fosforico al 85% agitando en un agitador vorticial durante aproximadamente 3 horas hasta que se disolvieron todas las partfculas. Se prepararon diluciones en serie con un factor de 5 en PBS, la quitina precipitada se elimino centrifugando a 20 000 g durante 5 minutos y se utilizaron los sobrenadantes para recubrir las placas de ELISA (Maxisorp, Nunc). Se recubrieron los pocillos con 100 pL por pocillo de las soluciones de quitina a 4 °C durante toda la noche o durante todo el fin de semana. Se utilizo el suero de las llamas Curley Sue y Jean Harlow para determinar la concentracion optima de quitina para recubrir en un ELISA de tttulo del suero realizado de acuerdo con procedimientos habituales. Se utilizaron soluciones de quitina diluidas 25 veces y 3125 veces para las selecciones. Se lavaron los pocillos 3 veces con PBS/0.05% de Tween-20 y se bloquearon con un 5% de leche desnatada en PBS (MPBS al 5%). Se suspendieron los fagos en MPBS al 2.5% y se utilizaron aproximadamente 1E+12 cfu para cada pocillo. Despues de la union a los pocillos a la temperatura ambiente durante 2 horas, se eliminaron los fagos que no se habfan unido lavando exhaustivamente con PBS/0.05% de Tween-20 y PBS. Se eluyeron los fagos unidos a la temperatura ambiente con 0.1 mg/mL de tripsina (Sigma) en PBS durante 30 minutos. Se transfirieron los fagos eluidos a una placa de 96 pocillos de polipropileno (Nunc) que contema un exceso del inhibidor de la tripsina AEBSF (Sigma). Se compararon los tftulos de los fagos recubiertos con la diana con los tftulos de los fagos de los pocillos blanco para evaluar el enriquecimiento. Se amplificaron los fagos utilizando celulas TG1 frescas de acuerdo con los procedimientos habituales. El enriquecimiento en la ronda de seleccion 1 fue de aproximadamente 10 veces para las dos librenas, 44 y 45. El enriquecimiento en la ronda de seleccion 2 fue de 5 y > 3E+03 veces para las librenas 44 y 45, respectivamente.

Recogidas de colonias unicas a partir de las lecturas de la seleccion - Se infectaron celulas TG1 frescas con fagos eluidos diluidos en serie y se colocaron en placas con agar LB; 2% de glucosa; 100 pg/mL de ampicilina. Se recogieron colonias unicas en placas de 96 pocillos que conteman 100 pL por pocillo de 2xTY; 10% de glicerol; 2% de glucosa; 100pg/mL de ampicilina. Se incubaron las placas a 37 °C y se almacenaron a -80 °C como placas maestras. Para las selecciones contra la quitina se recogieron 16 clones de las selecciones de la 1.a ronda y se recogieron 30 clones de las selecciones de la 2.a ronda para cada coleccion 44 y 45, en total 92 clones.

Ejemplo 2: caracterizacion de VHH

ELISA de union de punto unico - Se utilizo un ELISA de union de punto unico para identificar los clones que se unen a los extractos vegetales. Se prepararon los extractos que conteman VHH para el ELISA de la siguiente manera. Se inocularon las placas de 96 pocillos que teman 100 pL por pocillo de 2xTY, 2% de glucosa, 100 pg/mL de ampicilina con las placas maestras y se cultivaron a 37 °C durante toda la noche. Se utilizaron 25 pL por pocillo del cultivo de toda la noche para inocular placas nuevas de 96 pocillos con pocillos profundos que conteman 1 mL por pocillo de 2xTY; 0.1% de glucosa; 100 pg/mL de ampicilina. Despues de cultivar a 37 °C en un incubador en agitacion durante 3 horas, se anadio IPTG con una concentracion final de 1 mM y se produjeron VHH recombinantes durante una incubacion adicional de 4 horas. Se sedimentaron las celulas centrifugando a 3000 g durante 20 minutos, se desecharon los sobrenadantes y se almacenaron los sedimentos a -20 °C durante toda la noche. Se descongelaron los sedimentos celulares, se agitaron brevemente en un vortex y se anadieron 125 pL por pocillo de PBS a la temperatura ambiente. Se resuspendieron las celulas en una plataforma agitadora para ELISA a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se centrifugaron las placas a 3000 g durante 20 minutos y se transfirieron 100 pL por pocillo de extracto que contema VHH a una placa de 96 pocillos de polipropileno (Nunc) y se almacenaron a -20 °C hasta un uso posterior. Se analizo la union de los clones de las selecciones con quitina utilizando placas de ELISA recubiertas con 100 pL por pocillo de quitina diluida 25 veces, preparada de manera similar para todas las selecciones. Despues del recubrimiento a 4 °C durante toda la noche y una prolongacion de recubrimiento a la temperatura ambiente durante 1 hora el dfa siguiente, se lavaron las placas 3 veces con PBS/0.05% de Tween-20 y se bloquearon con un 5% de leche desnatada en PBS durante 1.5 horas. Se vaciaron las placas y se rellenaron con 90 pL por pocillo de MPBS al 1%. Se anadieron 10 pL de extracto que contema VHH de cada clon a uno o mas pocillos recubiertos con el antfgeno y un pocillo blanco. Se permitio la adhesion de VHH a

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la temperatura ambiente durante 1 hora y se eliminaron los VHH que no se habfan unido lavando tres veces con PBS/0.05% de Tween-20. Se detectaron los VHH unidos con incubaciones en serie con anticuerpos monoclonales de raton contra la histidina (Abd Serotec) en MPBS al 1%/0.05% de Tween-20 y anticuerpos de conejo de molecula completa contra IgG de raton conjugados con fosfatasa alcalilna (RaM/AP) (Sigma) en MPBS al 1%/0.05% de Tween-20. Se eliminaron los anticuerpos que no se habfan unido lavando tres veces con PBS/0.05% de Tween-20. Se lavaron las placas dos veces mas con PBS y se anadieron 100 pL del sustrato pNPP-disodio hexahidratado (Sigma) a cada pocillo. Se midio la absorbancia a 405 nm y se calculo para cada clon la relacion de VHH unido al pocillo o los pocillos recubiertos con la diana y un pocillo recubierto con un compuesto que no era la diana. De las selecciones contra la quitina 28 de los 92 (30%) clones tuvieron una relacion superior a 2 y se analizaron estos clones adicionalmente por secuenciacion.

PCR de colonia unica y secuenciacion - Se llevo a cabo una PCR de colonia unica y secuenciacion en los clones positivos en el ELISA de la siguiente manera. Se diluyeron 10 veces en agua esteril los cultivos de los pocillos de la placa maestra con clones positivos en el ELISA. Se utilizaron 5 pL de estos clones diluidos como molde para la PCR utilizando el cebador directo MP57 (5'-ttatgcttccggctcgtatg-3') y el cebador inverso GIII (5'-ccacagacagccctcatag-3'). Se secuenciaron los productos de la PCR mediante la secuenciacion de Sanger utilizando el cebador MP57 (VIB Genetic Service Facility, Universidad de Antwerp, Belgica). Se detectaron los clones VHH 15A9, VHH 15D1, VHH 15E4 y VHH 15G2 a partir de las selecciones contra la quitina. Los clones VHH 15E4 y VHH 15G2 son variantes del clon 15D1 con una y dos sustituciones de aminoacidos, respectivamente.

Produccion y purificacion de anticuerpos - Se produjeron VHH en la cepa supresora TG1 o no supresora WK6 de E. coli (Fritz et al., 1988) de acuerdo con los procedimientos habituales. Resumiendo, se generaron colonias aisladas sembrando en estnas y se inocularon cultivos de toda la noche a partir de colonias unicas en 2xTY; 2% de glucosa; 100 pg/mL de ampicilina. Se utilizaron los cultivos de toda la noche para inocular cultivos frescos 1:100 en 2xTY; 0.1% de glucosa; 100 pg/mL de ampicilina. Despues de cultivar a 37 °C en un incubador en agitacion durante 3 horas, se anadio IPTG con una concentracion final de 1 mM y se produjeron VHH recombinantes durante una incubacion adicional de 4 horas. Las celulas se sedimentaron y se resuspendieron en 1/50 del volumen del cultivo original de tampon de extraccion periplasmatico (fosfato 50 mM pH 7; NaCl 1 M; EDTA 1 mM) y se incubaron con una rotacion cabeza sobre cabeza a 4 °C durante toda la noche. Se sedimentaron los esferoplastos centrifugando a 3000 g y 4 °C durante 20 minutos. Se transfirieron los sobrenadantes a tubos nuevos y se centrifugaron de nuevo a 3000 g y 4 °C durante 20 minutos. Se purificaron los VHH etiquetados con hexahistidina del extracto periplasmatico utilizando 1/15 del volumen del extracto de la resina de afinidad con metales TALON (Clontech), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se concentraron los VHH purificados y se sometieron a dialisis con PBS utilizando dispositivos con un valor de corte del peso molecular (MWCO, por sus siglas en ingles) de 5 kDa (Sartorius Stedim), de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Ejemplo 3: VHH que se unen a polisacaridos quitinosos en el ELISA

VHH que se unen a la quitina en el ELISA - Se realizo la titulacion de VHH en placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) recubiertas con quitina. Se disolvio la quitina con una concentracion de 10 mg/mL en acido fosforico al 85% agitando en un agitador vorticial durante aproximadamente 3 horas hasta que se disolvieron todas las partfculas. Se diluyo la quitina disuelta 25 veces en PBS y se elimino la quitina precipitada centrifugando a 20 000 g durante 5 minutos. Se utilizaron 100 pL por pocillo de sobrenadante para recubrir las placas de ELISA (Maxisorp, Nunc). Se recubrieron las placas a 4 °C durante toda la noche y se prolongo el recubrimiento a la temperatura ambiente durante 1 hora el dfa siguiente. Se lavaron las placas 3 veces con PBS/0.05% de Tween-20 y se bloquearon con un 5% de leche desnatada en PBS durante 1 hora. Se preparo una disolucion en serie con un factor de 4 de los VHH purificados en MPBS al 1%/0.05% de Tween-20 en placas de 96 pocillos de polipropileno. Las concentraciones de anticuerpos estuvieron comprendidas entre 3 pg/mL y 12 ng/mL. Se transfirieron las diluciones de los anticuerpos a las placas recubiertas con quitina y se permitio la adhesion de VHH durante 1 hora a la temperatura ambiente. Se detectaron los VHH unidos con incubaciones en serie con anticuerpos monoclonales de raton contra la histidina (Abd Serotec) y anticuerpos de conejo de molecula completa contra IgG de raton conjugados con fosfatasa alcalilna (RaM/AP) (Sigma) en MPBS al 1%/0.05% de Tween-20. Se eliminaron los anticuerpos que no se habfan unido lavando tres veces con PBS/0.05% de Tween-20 despues de cada incubacion con el anticuerpo. Se lavaron las placas dos veces mas con PBS y se anadieron 100 pL del sustrato pNPP-disodio hexahidratado (Sigma) a cada pocillo. Se midio la absorbancia a 405 nm y se represento graficamente en funcion de la concentracion de anticuerpos (remftase a la Tabla 1).

Tabla 1: VHH que se unen a la quitina en el ELISA:

[VHH] (pg/mL)

3.0 0.75 0.19 0.047 0.012 0

[VHH] (nM)

200 50 13 3.1 0.78 0

Quitina

+ + + + + +

1 2 3 4 5 6

5

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40

VHH15A9

A >4.000 2.059 0.640

VHH15D1

B 2.669 1.459 0.392

VHH no relacionado

C 0.089 0.086 0.089

0.225

0.112

0.121

0.089

0.089

0.085

0.090

0.088

0.088

Especificidad de VHH que se une a la quitina en el ELISA

Con el fin de investigar la especificidad de los VHH que se unen a la quitina, se utilizo un ELISA con diferentes recubrimientos. Se estudio la union de VHH 15A9, asf como tambien condiciones de control con otros anticuerpos, a la quitina, pectina y lectina de patata. Se recubrieron las placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) con 100 pL por pocillo de quitina, de manera similar a en el ELISA de titulacion, 100 pg/mL de pectina esterificada de frutas dtricas al 20-34% (Sigma) o lectina de patata (Sigma) en PBS. Se recubrieron las placas a 4 °C durante toda la noche y se prolongo el recubrimiento a la temperatura ambiente durante 1 hora el dfa siguiente. Se lavaron las placas 3 veces con PBS/0.05% de Tween-20 y se bloquearon con un 5% de leche desnatada en PBS durante 1 hora. Se diluyo VHH 15A9 purificado hasta 3 pg/mL en MPBS al 1%/0.5% de Tween y se anadio a la placa recubierta y se permitio la adhesion de VHH durante 1 hora a la temperatura ambiente. Se detectaron los VHH unidos con incubaciones en serie con anticuerpos monoclonales de raton contra la histidina (Abd Serotec) y anticuerpos de conejo de molecula completa contra IgG de raton conjugados con fosfatasa alcalilna (RaM/AP) (Sigma) en MPBS al 1%/0.05% de Tween-20. Se eliminaron los anticuerpos que no se habfan unido lavando tres veces con PBS/0.05% de Tween-20 despues de cada incubacion con el anticuerpo. Se lavaron las placas dos veces mas con PBS y se anadieron 100 pL del sustrato pNPP-disodio hexahidratado (Sigma) a cada pocillo. Se midio la absorbancia a 405 nM y el perfil de union para VHH 15A9 obtenido se comparo con los anticuerpos de control (remttase a la Tabla 2). Se observaron patrones diversos y distintivos para VHH 15A9 y los anticuerpos de control. VHH 15A9 mostro una union espedfica unicamente a la quitina.

Tabla 2: Especificidad de VHH que se une a la quitina en el ELISA

VHH 15A9 que se unen de manera espedfica a la quitina Condicion de control sin VHH Anticuerpo de control que se une de manera espedfica a la pectina Union del anticuerpo de control a la lectina de patata y la pectina

Recubrimiento de quitina

0.846 0.110 0.115 0.114

Recubrimiento de pectina

0.118 0.114 3.171 0.409

Recubrimiento de lectina de patata

0.114 0.112 0.118 3.878

Condicion de control sin recubrimiento

0.109 0.111 0.111 0.116

Ejemplo 4: union de VHH a microesferas de quitina

Union de VHH a microesferas de quitina - Se analizaron VHH contra la quitina para determinar su union a microesferas de quitina paramagneticas (New England Biolabs). Se formaron estas microesferas mediante la qmmica de emulsiones comenzando con quitosano con un peso molecular bajo y la encapsulacion de las partfculas de magnetita durante la formacion de las microesferas. Una vez que se hubieron formado las microesferas, se acetilaron para garantizar que eran microesferas de quitina. Se equilibraron las microesferas con cinco lavados con NaCl 500 mM/Tris-HCl 20 mM/EDTA 1 mM/0.1% de Tween-20 utilizando una centnfuga magnetica Dynamag (Invitrogen) y eliminando el sobrenadante pipeteando. Se dispensaron las microesferas equilibradas y se incubaron con 5 pg/mL de VHH contra la quitina etiquetado con histidina en BSA/PBS al 1% con una rotacion cabeza sobre cabeza a 4 °C durante 2 horas. Las condiciones de control incluyeron incubaciones con VHH no relacionado en BSA/PBS al 1% o con BSA/PBS al 1% solo. Se eliminaron los VHH que no se habfan unido mediante cinco lavados con PBS y se detectaron los VHH mediante incubaciones consecutivas con anticuerpos monoclonales de raton contra la histidina (Abd Serotec) y anticuerpos de conejo de molecula completa contra IgG de raton conjugados con fosfatasa alcalina (RaM/AP) (Sigma). Se diluyeron los anticuerpos en BSA/PBS al 1% y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminaron los anticuerpos que no se habfan unido lavando cinco veces con pBs entre las diferentes incubaciones. Despues de los lavados finales y la eliminacion del sobrenadante, se anadio el sustrato pNPP-disodio hexahidratado (Sigma) a cada condicion y se incubo durante 10 minutos. Los sustratos se transfirieron a una placa optica y se midio la absorbancia a 405 nm. La absorbancia medida fue de 4.0 (saturacion), 4.0 (saturacion), 3.8, 4.0 (saturacion), 0.23 y 0.20 para VHH 15D1, VHH 15E4, VHH 15G2, VHH 15A9, VHH no relacionado e incubacion sin VHH, respectivamente. En estos datos se aprecia que tras seleccionar y llevar a cabo

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los cribados primarios con quitina de grado practico VHH 15D1, VHH 15E4, VHH 15G2 y VHH 15A9 se unen realmente a la quitina.

Ejemplo 5: Union de microcapsulas acopladas a VHH al polisacarido quitinoso inmovilizado

Con el objetivo de generar microcapsulas de poliurea funcionalizadas con VHH, se acoplaron los VHH a microcapsulas con un nucleo de un 1.5% de Uvitex OB (Ciba) en benzoato de bencilo y una cubierta con lisina incorporada para exponer en la superficie los grupos carboxilo. Se utilizo un nucleo de un 1.5% de Uvitex OB (Ciba) en benzoato de bencilo para la visualizacion fluorescente de las microcapsulas. Despues de la produccion de las microcapsulas, estas se lavaron con agua y se almacenaron como suspensiones de capsulas en agua. Antes del acoplamiento de los VHH; se lavaron las microcapsulas con tampon MES/NaCl (MES 0.1 M/NaCl 0.5 M pH 6) utilizando una placa de filtracion de 96 pocillos con pocillos profundos (Millipore) y un colector de vado (Millipore). Se sometio a dialisis en el tampon MES/NaCl un conjunto de VHH, se anadio hasta una concentracion final de 1070 |jM y se incubo con las microcapsulas durante 15-30 minutos. Se disolvio clorhidrato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) (Pierce) en tampon MES/NaCl y se anadio rapidamente hasta una concentracion de 50 mM. Se acoplaron los VHH incubando con una mezcla continua a la temperatura ambiente durante 2 horas. Se detuvieron las reacciones de acoplamiento anadiendo glicina o tampon Tris pH 7.5 hasta una concentracion final de 100 mM y se incubo a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se recogieron los VHH que no se habfan unido utilizando un formato con placa de filtracion utilizando una placa colectora con pocillos profundos. Se lavaron las microcapsulas tres veces con PBS, se resuspendieron en PBS y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Se utilizo un formato de ensayo de tipo ELISA para evaluar la interaccion de las microcapsulas acopladas con VHH a las superficies que conteman polisacaridos quitinosos. Se recubrieron con quitina los pocillos de una microplaca en la que la mitad del area era de union elevada (Greiner Bio-One). Se realizo el recubrimiento con quitina tal como anteriormente para los ELISA de titulacion y especificidad. Como condicion de control se recubrio con 100 jg/mL de lectina de patata en PBS. Se lavaron las microplacas tres veces con PBS con 0.05% de Tween-20 y se bloquearon con un 5% de leche desnatada en PBS durante 2 horas. Se diluyeron las microcapsulas acopladas con VHH que conteman un trazador fluorescente hasta la densidad apropiada en un 1% de leche desnatada en PBS con un 0.05% de Tween-20. Se anadieron las microcapsulas en una dilucion en serie a los pocillos recubiertos con quitina o de control y se permitio la adhesion durante 1 hora. Se eliminaron las microcapsulas que no se habfan unido lavando cinco veces con PBS con un 0.05% de Tween-20. Se analizo el fondo de los pocillos de la placa de ELISA para determinar la fluorescencia utilizando un lector de microplacas multimodo (Tecan) para detectar las microcapsulas unidas (remttase a la Tabla 3).

Tabla 3: Uso de VHH para unir microcapsulas a polisacaridos quitinosos inmovilizados Se realizo un barrido en el fondo para analizar las microcapsulas con trazador fluorescente unidas a la quitina o las superficies recubiertas con el antfgeno de control.

Cantidad de microcapsulas Microcapsulas con trazador fluorescente con VHH 15A9 Microcapsulas blanco sin VHH

Recubrimiento de quitina

100% 10621 2101

Recubrimiento de quitina

20% 985 356

Recubrimiento de quitina

4% 262 142

Recubrimiento de lectina de patata

100% 837 3206

Recubrimiento de lectina de patata

20% 581 645

Recubrimiento de lectina de patata

4% 157 212

Ejemplo 5: union de microcapsulas, acopladas con VHH, a microesferas de quitina

Se estudio la union de las microcapsulas acopladas con VHH a las microesferas magneticas de quitina con microesferas paramagneticas de quitina (New England Biolabs). Se equilibraron las microesferas con cinco lavados con NaCl 500 mM/Tris-HCl 20 mM/EDTA 1 mM/0.1% de Tween-20 utilizando una centnfuga magnetica Dynamag (Invitrogen) y eliminando el sobrenadante pipeteando. Se dispensaron cantidades de microesferas de 1 mg y se calculo la concentracion apropiada de microesferas a partir del diametro de las microesferas (0 50-70 jm). Se incubaron las microesferas de quitina con un exceso de 100 veces de microcapsulas (0 10 jm) respecto al numero de microesferas de quitina en un 1% de BSA en PBS y se permitio la adhesion durante 1 hora con una rotacion

cabeza sobre cabeza a la temperatura ambiente. Las condiciones de control incluyeron incubaciones con microcapsulas blanco que no estaban acopladas con VHH. Se realizaron cinco lavados con PBS utilizando una rotacion cabeza sobre cabeza para cada lavado y utilizando la centnfuga magnetica Dynamag para recoger las microesferas entre cada etapa de lavado. Finalmente, se resuspendieron en un pequeno volumen las microesferas 5 con microcapsulas unidas, se transfirieron a un microportaobjetos con 18 pocillos (Ibidi) y se analizaron para detectar microcapsulas unidas en un sistema de microscopio con macro zoom (Nikon). Se contaron las microcapsulas utilizando un software de analisis de imagenes Volocity (Perkin Elmer). Se utilizo un filtro DAPI para visualizar las microcapsulas Uvitex. Se detectaron 2.2E+03 microcapsulas en 1 mg de las microesferas de quitina con microcapsulas acopladas con VHH 15D1. Unicamente se detectaron 7.1E+02 microcapsulas en 1 mg de 10 microesferas de quitina con microcapsulas blanco a las que no se les habfa acoplado VHH. Se obtuvo una union conveniente a las microesferas magneticas de quitina con las microcapsulas con VHH acoplado que se une a la quitina.

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Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una protema de union al antigeno derivada de un anticuerpo de camelido y que comprende una secuencia de VHH, donde dicha secuencia de VHH es capaz de unirse a un aminopolisacarido.
2. 2. La protema de union al antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicho aminopolisacarido es la quitina o el quitosano.
3. 3. La protema de union al antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicha protema de union al antigeno tiene actividad insecticida o fungicida.
4. 4. La protema de union al antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicha protema de union al antigeno comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID N° 1 - SEQ ID N° 4.
5. 5. El uso de una protema de union al antigeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para determinar la presencia y/o concentracion de un aminopolisacarido en una muestra.
6. 6. El uso de una protema de union al antigeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para aislar o purificar un aminopolisacarido a partir de una muestra.
7. 7. Un agente de direccionamiento, capaz de unir un compuesto a un aminopolisacarido, donde dicho agente de direccionamiento comprende al menos una protema de union al antigeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
8. 8. El uso del agente de direccionamiento de acuerdo con la reivindicacion 7 para dirigir un compuesto a un aminopolisacarido.
9. 9. Una composicion que comprende (i) al menos un agente de direccionamiento de acuerdo con la reivindicacion 7 y (ii) uno o mas compuestos.
10. 10. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 9, donde dicha composicion es una composicion agroqmmica.
11. 11. Un metodo para mejorar la resistencia de una planta contra plagas de insectos y/o enfermedades fungicas, comprendiendo dicho metodo al menos una aplicacion de una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-10 a la planta o a partes de la planta.
12. 12. Una planta, transformada con un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una protema de union al antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.