RO131871A2 - Polidispersii de colagen pentru tratarea seminţelor de cereale, şi procedeu de realizare - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un produs pentru tratarea seminţelor de cereale, şi la un procedeu de obţinere a acestuia. Produsul conform invenţiei este pe bază de polidispersii de colagen, având masa moleculară de 4000...6000 Da, cu o populaţie cu ponderea de 60% particule cu dimensiuni de 1...10 nm şi două populaţii cu ponderea de 14%, şi, respectiv, 26%, cu dimensiunea de 100...1000 nm şi, respectiv, de 1000...5000 nm, un indice de polidispersitate de 0,6 şi un conţinut de 6...10% aminoacizi liberi. Procedeul conform invenţiei constă în hidroliza termo-enzimatică compactă a deşeurilor de piele, în care, într-o primă fază, are loc denaturarea termică a colagenului şi extragerea gelatinei, iar în a doua fază are loc fragmentarea polipeptidelor prin hidroliza catalizată de enzime şi reducerea masei moleculare, cu punerea în libertate de aminoacizi, inclusiv aminoacizi esenţiali.

Description

Invenția se refera la un produs pe baza de polidispersii de colagen utilizat pentru tratarea semințelor de cereale in vederea stimulării creșterii, reducerea aportului de pesticide si procedeul de realizare a acestuia.

Se cunosc deja produse pe baza de hidrolizate proteice din resurse vegetale si animale pentru fertilizarea plantelor la nivel foliar si radicular in sistem ecologic. De asemenea sunt cunoscuți fertilizantii foliari cu continui de aminoacizi de sinteza sau din hidrolizate de colagen (Brevet RO 123026 Bl) care stimulează nutriția si creșterea plantelor.

Problema pe care o rezolva prezentul brevet de invenție este realizarea unei polidispersii de colagen pentru tratarea semințelor de cereale, in vederea creșterii stării de nutriție si sanatate a semințelor si de reducere a cantitatii de pesticide folosite pentru tratarea acestora. Efectele ecologice si economice ale aplicării noului produs sunt mari avand in vedere cerința pentru produse ecologice, conservarea solului si reducerea cantitatilor de pesticide de tip imidacloprid and tebuconazol.

Sunt cunoscute metode de tratare a semințelor de cereale cu chitosan (US Patent 4886541 A) pentru creșterea producției de plante, grosimea rădăcinii si rezistenta tulpinii. De asemenea se cunoaște procedeul de tratare a semințelor de cereale cu polizaharide inclusiv pectina in amestecuri peliculogene cu efect de proiecție împotriva fungilor si insectelor (US Patent 20130225403 Al). De asemenea sunt brevetate compoziții complexe pe baza de hidrocarburi condensate, lignine si taninuri (EP Patent 2473034 A2) cu efecte asupra a cel puțin unei caracteristici privind germinația, rasarirea, dezvoltarea rădăcinii, vigoarea si creșterea răsadului, scăderea mortalitatii, producția de clorofila, rezistenta la frig, rezistenta la seceta, absorbția nutrientilor, comparativ cu semințele netratate. Dezavantajele acestor metode de tratare constau in complexitatea materialelor utilizate si a compozițiilor, informațiile incomplete privind nivelul de testare al acestora si reproductibilitatea rezultatelor obținute.

Prezenta invenție rezolva problema tratării semințelor de cereale prin realizarea unui singur produs cu proprietăți nutritive prin conținutul de aminoacizi liberi, ușor asimilabili, naturali, care asigura protecția prin formarea unui film polimeric de colagen pe suprafața semințelor cu capacitate de absorbitie a apei datorita caracterului amfoter si de eliberare in timp a aminoacizilor din structura oligopeptidelor si a polipeptidelor.

Testarea in laborator si in câmp experimental a semințelor de grâu de toamna tratate cu polidispersii colagenice a demonstrat următoarele avantaje:

1/8 a 2015 00859

18/11/2015

Creșterea acidului giberelic, precursor hormonal de creștere cu 30-40% după 18 si 24 de ore de la răsărire;

Creșterea densității de răsărire cu 6-12%;

Creșterea biomasei cu 5 -10%;

- Scăderea numărului de semințe anormale cu 4-8%;

- Posibilitatea reducerii concentrației de pesticide cu 50-70%;

- Stimularea creșterii plantelor in condiții de sol nefavorabile, la pH-uri extreme (6,0 si 8,9). Principalele caracteristici ale polidispersiilor de colagen brevetate sunt: masa moleculara de

4000-6000 Da, compoziția formata dintr-o populație cu ponderea de 60% particule cu dimensiuni de 1-10 nm si doua populații cu ponderea de 14% si 26% cu dimensiunea de 100-1000 nm si respectiv de 1000-5000 nm. Indicele de polidispersitate este de 0,6. Concentrația de aminoacizii liberi este de 6-10% si conține metionina, glutamina, alanina, glicina, leucina etc, cu rol in metabolismul plantelor si in mecanismele de adaptare la condiții de clima nefavorabile.

Procedeul de realizare a polidispersiei de colagen, denumita hidrolizat de colagen, pentru tratarea semințelor, permite obținerea de componente cu mase moleculare medii in limite controlate, din subproduse de piele bovina semiprelucrata, prin cataliza termo-enzimatica.

In momentul de fata exista o paleta bogata de biopolimeri - materiale pe baza de proteine extrase din colagen si materiale cu matrice colagenica, utilizate in special in domeniul alimentar, medical, farmaceutic si in cosmetica, pentru a căror realizare se folosesc resurse primare de colagen [1,2], Ca alternativa la resursele primare de proteine exista resursele secundare, cum sunt deseurile de piele netabacita din industria pielăriei, care nu sunt valorificate, deși pot conduce la performante similare cu resursele principale si exclud riscurile contaminării, deoarece acestea au trecut deja prin prelucrări chimice suficient de severe pentru dezactivarea bacteriilor si a virușilor. De asemenea, pentru extragerea proteinelor utilizate in domeniul agricol, resursele secundare de colagen, cum sunt subprodusele din industria de prelucrare a pieilor naturale, reprezintă o alternativa viabila. Cea mai mare parte a cercetărilor din ultimii ani s-au axat pe extragerea colagenului din deșeuri de piele [3, 4] si utilizarea acestor extracte in fertilizarea culturilor agricole [5, 6], ca alternativa pentru aminoacizii de sinteza utilizați in formulele fertilizantilor [7, 8], Alte cercetări recente sunt axate pe exploatarea proprietăților bio-active ale acestor extracte colagenice, in tratarea semințelor, pentru sporirea potențialului germinativ si protecția împotriva dăunătorilor [9, 10], Exista cercetări recente in care s-a studiat posibilitatea folosirii colagenului recuperat din industria pielăriei, ca amendament pentru soluri agricole [11], acestea avand in vedere valorificarea colagenului din deșeuri de piele netabacita. Totuși, exista si o alta resursa de colagen, constituita din deseurile de piele tăbăcită.

Fata de cercetările de pana acum, axate pe recuperarea colagenului din piele fara continui de crom, prin invenția de fata se propune recuperarea colagenului, inclusiv din deșeuri de piele tăbăcită

2/8

a 2015 00859

18/11/2015 cu crom (III), resursa evitata in mod sistematic, datorita impactului psihologic generat de termenul „crom”, in general asociat cu noțiunile de „metal greu”, „toxicitate”, „cancerigen”, fara a se lua in considerare faptul ca începând cu ultimii 20 ani, industria de pielărie respecta bunele practici in care nu se folosește si nu se evacueaza crom hexavalent, generator al efectelor toxice extreme. Cercetări anterioare [6, 12] au demonstrat ca diverse combinații de procese pentru extragerea colagenului din aceste deseuri/subproduse, pot avea o eficacitate foarte ridicata in separarea cromului, astfel incat conținutul acestuia in polidispersiile colagenice sa fie limitat la un nivel admisibil (de ordinul 10 ppb) in raport cu aplicațiile carora se adreseaza, sub valorile (de ordinul 10 ppm) raportate in alte lucrări [13].

Se cunosc procedee prin care deșeurile de piele tăbăcită cu crom se hidrolizeaza in mediu alcalin (US Patent 4483829, US Patent 4100154), sau prin intermediul preparatelor enzimatice (US Patent 5094946, Brevet RO 126673 A2), pentru a separa proteinele de compușii minerali in vederea folosirii lor in formule de suplimente nutritive pentru alimentația animalelor, ca îngrășăminte, precum si in compoziția unor preparate cosmetice. Alte procedee mai recente, propun ca materie prima pentru obținerea hidrolizatului de colagen, faina de oase (CN Patent 103243143-A) din care colagenul se extrage la presiune ridicata prin hidroliza alcalino-enzimatica, sau din piele de porc (CN Patent 104673863-A). Exista si un procedeu care folosește apa carbonatata (JP Patent 2013245198-A) pentru extragerea colagenului destinat aplicațiilor in cosmetica si a gelatinei folosita ca agent de dispersare a sarcinilor electrice in dispozitive electronice.

Aceste procedee prezintă următoarele dezavantaje:

- deșeurile de piele folosite ca materie prima necesita in prealabil operații mecanice de fragmentare;

- temperatura de hidroliza alcalina este de peste 90°C, aproape de temperatura de reflux;

- hidrolizatele proteice obținute au un conținut de crom de ordinul 10 ppm la ρΗ<11;

- hidrolizatele proteice destinate folosirii ca fertilizanti au un conținutul scăzut de aminoacizi liberi;

- procesele nu sunt concepute in scopul obținerii de hidrolizate de colagen cu mase moleculare medii mici care garanteaza un continui de aminoacizi liberi esențiali liberi, recunoscuti pentru contribuția importanta pe care o au in metabolismul plantelor, mai ales in condiții de stres;

- procesele se desfasoara in mai multe etape, necesitând operații de filtrări intermediare si condiționări finale, ceea ce implica manopera si energie suplimentara;

- extracțiile din faina de oase se desfasoara la presiuni ridicate;

folosirea ca materie prima a pielii de porc implica operații suplimentare pentru eliminarea substanțelor grase;

3/8 a 2015 00859

18/11/2015

- asigurarea apei carbonatate este un demers incomod in condițiile specifice tabacariilor si procesul de extracție necesita o durata mai mare decât alte procese.

Problema tehnica pe care o rezolva invenția consta din obținerea de extracte de colagen cu polidispersitate larga, formata din polipeptide, oligopeptide si aminoacizi liberi, inclusiv aminoacizi esențiali, prin elaborarea unui procedeu de hidroliză termo-enzimatica compacta a deșeurilor de piele semiprelucrata, tăbăcite sau nu. In prima faza a procesului are loc denaturarea termica a colagenului si extragerea gelatinei, iar in faza a doua are loc fragmentarea polipeptidelor prin hidroliză catalizata de enzime si reducerea masei moleculare medii, când are loc punerea in libertate de aminoacizi, inclusiv aminoacizi esențiali.

Ambele faze ale procesului se desfasoara in vase de reacție închise, echipate cu sistem de agitare si cu sistem de incalzire-racire prin manta, cu izolație, termostatat.

Ca materie prima se pot folosi: fragmente reziduale de piele tăbăcită in crom care au un continui de substanțe volatile de 50-60 % si se caracterizează printr-un continui de substanța dermica de min. 85% (raportat la produsul liber de substanțe volatile), crom exprimat ca oxid de crom min. 3,5% (raportat la produsul liber de substanțe volatile), restul fiind constituit din săruri provenite din faza de pregătire a suportului colagenic pentru tabacire; piele semiprelucrata netabacita, cu denumirea specifica de piele gelatina cu următoarele caracteristici: materii volatile 65-75%, substanța dermica de min. 95% (raportat la produsul liber de substanțe volatile), restul fiind constituit din săruri provenite din faza de deparare si decalcificare pentru pregătirea suportului colagenic.

Fragmentele de deșeuri de piele (ca atare daca sunt tăbăcite sau tocate daca sunt netabacite) analizate din punct de vedere al conținutului de substanțe volatile, azot total, substanța dermica, eventual crom, sunt dispersate in apa intr-un raport solid/lichid de 1/4 se supun unui regim termic, sub agitare. Daca materia prima consta in fragmente de piele tăbăcită cu crom, aceasta faza se desfasoara in prezenta de oxid de calciu, care are rolul de a coagula ionii sulfat sub forma de sulfat de calciu si de a precipita cromul eliberat sub forma de hidroxid de crom, coprecipitarea celor doi compuși contribuind la separarea eficace a hidroxidului de crom din dispersia rezultata in urma hidrolizei. Daca materia prima o reprezintă deseurile de piele gelatina, nu este necasara dozarea oxidului de calciu. Faza de extracție a gelatinei se desfasoara sub agitare continua, la temperatura de

70.. .85°C, pe o durata de 3...5 ore. Pentru faza a doua a procesului, respectiv hidroliză, se verifica pH-ul si se corectează cu acid sulfuric diluat 1:10, pana la o valoarea cuprinsa in intervalul 8,5.....9,0 si sub agitare continua, se dozeaza preparatul enzimatic lichid Alcalase 2,4L, intr-o cantitate echivalenta pentru un raport de 2,5.....4,5 unitati enzimatice/gram azot total, se menține la temperatura de 63 °C ± 2°C pe o durata de 3....5 ore, sub agitare continua, după care se încălzește la

80.. .90 °C pentru dezactivarea enzimei.

4/8

a 2015 00859

18/11/2015

Dispersia calda se filtrează sub vid pe un filtru Nuce cu un material filtrant cu porozitatea de 2-4 pm. Filtratul care este format din hidrolizatul de colagen cu o masa moleculara medie de 4000-6000 Daltoni, este supus analizei pentru determinarea conținutului de azot total si azot aminic, precum si pentru stabilirea pH-ului. Conținutul de azot aminic oferă indicii asupra nivelului la care se situează masa moleculara medie a polidispersiei obținute. Scindările lanțurilor peptidice care au loc in timpul hidrolizei enzimatice in faza a doua a procesului, asigura diversificarea conținutului de aminoacizi, inclusiv aminoacizi esențiali, in polidispersiile de colagen, pentru aplicații in tratarea sistemica a semințelor de cereale.

Procedeul de realizare a polidispersiilor de colagen din deșeuri de piele din industria de pielărie, conform invenției, elimina dezavantajele menționate anterior prin aceea ca:

- este versatil si poate fi folosit cu adaptari minore, atat pentru deșeuri de piele netabacita cat si pentru deșeuri de piele tăbăcită;

- este compact si nu necesita filtrări intermediare;

- folosește fragmente reziduale de piele, rezultate după operația de egalizare a pieilor tăbăcite cu săruri bazice de crom, cu umiditatea de 55.....60%, cu un continui de 85.....90% substanța dermica (raportat la produsul liber de substanțe volatile) si 4,0.....5,0% oxid de crom (raportat la produsul liber de substanțe volatile), fara a fi necesare operații mecanice de fragmentare;

- este adaptabil pentru deșeuri de piele netabacita, fragmentarea fiind posibil de realizat simplu, prin tocare in mașini similare celor din industria alimentara;

- folosește in prima faza extracția termica la un raport solid/lichid de 1/4, cu 8-12% oxid de calciu, la temperatura de 70.....85°C, pe o durata de 3 5 ore, sub agitare continua, daca se folosesc drept materie prima deșeuri de piele tăbăcită cu crom, sau fara oxid de calciu, in aceleași condiții, daca se folosește ca materie prima deșeuri de piele netabacita.

- folosește in a doua faza hidroliză enzimatică, cu Alcalase 2,4L (sau produse similare), la temperatura de 63 °C ± 2°C, pe o durata de 3 5 ore, cu agitare continua, asigurând fragmentarea polipeptidelor si reducerea masei moleculare medii a extractului de colagen, cu efecte in diversificarea conținutului de aminoacizi, inclusiv aminoacizi esențiali;

- in acest mod se asigura extragerea componentei proteice cu randamente de 85.....95%;

- polidispersiile de colagen obținute prin acest procedeu permit acoperirea semințelor de cereale intr-un film care le asigura atat un aport imediat de aminoacizi liberi care stimulează germinația, cat si un aport treptat de aminoacizi care hrănesc plantulele, conferindu-le o rezistenta sporita ceea ce permite reducerea cantitatii de materiale de sinteza de tip pesticide consacrate in tratamentele contra insectelor si a fungilor.

5/8

£ a 2015 00859

18/11/2015

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

• se recuperează cu randamente mari componenta proteica din deșeurile de piele semiprelucrata, cu toate consecințele favorabile legate de eliminarea acestora, respectiv reducerea spatiilor necesare pentru depozitare, reducerea costurilor si a emisiilor generate de transport, respectarea legislației de mediu in vigoare, conservarea resurselor naturale prin valorificarea avansata;

• se pune in valoare o resursa alternativa de aminoacizi levogiri, disponibili asimilării de către plante fara consum energetic suplimentar, pentru sporuri de producție in agricultura, reducând consumul de aminoacizi de sinteza care prezintă dezavantajul conținutului de enantiomeri, aspect inca nerezolvat de cercetările ultimilor ani [14];

• se convertește un deseu dintr-un sector industrial, intr-un subprodus util pentru creșterea ecoeficientei in bio-economie (prin înlocuirea parțiala sau totala a aminoacizilor de sinteza, care necesite resurse financiare mai mari, directe, pentru producție si indirecte, pentru protecția mediului);

• se incurajeaza dezvoltarea unor materiale si practici in sprijinul agriculturii ecologice (organice, biologice) in care se interzice folosirea oricărei substanțe obținute prin procese chimice de sinteza.

• procedeul compact de obținere a extractelor de colagen sub forma de hidrolizate conform invenției este simplu, eficace, economic, reproductibil;

• gama de hidrolizate de colagen poate fi diversificata in funcție de necesitați;

• utilizarea polidispersiilor de colagen in tratarea semințelor de cereale, oferă o alternativa de accelerare a germinației, creșterea rezistentei plantelor si sporirea producțiilor agricole, cu un consum mai redus de substanțe de sinteza pentru tratamentele de compensare a carențelor hidro-nutritionale si de combatere a dăunătorilor, fungilor etc.;

Se dau in continuare doua exemple de realizare a invenției:

Exemplul 1

Fragmente reziduale de piele cromata, rezultate după operația de egalizare a pieilor tăbăcite cu săruri bazice de crom, analizate pentru determinarea conținutului de crom, de azot total ai de substanța dermica, sunt dispersate intr-un volum de apa echivalent raportului solid/lichid de 1/4, intr-un vas de reacție prevăzut cu manta de incalzire-racire si izolație, sistem de agitare si sistem automat de control al temperaturii, sunt tratate cu 8-12% oxid de calciu (cantitatea echivalenta precipitării complete a cromului continui). Masa de reacție se încălzește pana la 70.....85°C si se menține sub agitare continua la temperatura respectiva pe o durata de 3.....5 ore, apoi se lașa in repaos pana a doua zi, timp in care procesul hidrolitic continua, datorita inerției si datorita faptului ca temperatura 6/8

a 2015 00859

18/11/2015 se menține ridicata multe ore după decuplarea încălzirii datorita stratului izolant al vasului de reacție.

In acest timp fragmentele de piele sunt dezagregate, cromul este precipitat sub forma de hidroxid de crom si componenta proteica trece in soluție in proporție 85.....95 %. A doua zi masa de reacție se agita, se verifica pH-ul hidrolizatului de colagen si daca este cazul se corectează cu acid sulfuric diluat 1:10, astfel incat sa aiba valoarea cuprinsa in intervalul 8,5.....9,0, se încălzește la 63°C ± 2°C si sub agitare continua se dozeaza preparatul enzimatic Alcalase 2,4L intr-o cantitate echivalenta pentru un raport de 2,5.....4,5 unitati enzimatice/gram azot total, se menține la temperatura de 63°C ±

2°C pe o durata de 3....5 ore, sub agitare continua, după care se încălzește la 85...90 °C pentru dezactivarea enzimei. Dispersia se evacueaza din vas, se lașa la decantare pana a doua zi, când se filtrează decantatul printr-un filtru sub vid (filtru tip Nuce), iar filtratul este supus analizei pentru determinarea conținutului de azot total si azot aminic, care va indica o masa moleculara medie de 4000-6000 Daltoni. Se verifica conținutul de crom.

Exemplul 2

Fragmente reziduale de piele netabacita, analizate pentru determinarea conținutului de azot total si de substanța dermica, sunt tocate apoi dispersate intr-un volum de apa echivalent raportului solid/lichid de 1/4, intr-un vas de reacție prevăzut cu manta de incalzire-racire si izolație, sistem de agitare si sistem automat de control al temperaturii, se încălzește pana la 70.....85°C si se menține sub agitare continua la temperatura respectiva pe o durata de de 3.....5 ore, după care, se verifica pHul si daca este cazul se corectează cu acid sulfuric (diluat 1:10), astfel incat pH-ul dispersiei sa ajunga la o valoarea cuprinsa in intervalul 8,5.....9,5 si sub agitare continua, se răcește masa de reacție la 63°C ± 2°C, apoi se dozeaza preparatul enzimatic Alcalase 2,4L intr-o cantitate echivalenta pentru un raport de 2,5.....4,5 unitati enzimatice/gram azot total, se menține la temperatura de 63°C ±

2°C pe o durata de 3....5 ore, apoi static pana a doua zi, timp in care procesul hidrolitic continua, datorita inerției si datorita faptului ca temperatura se menține ridicata multe ore după decuplarea încălzirii, datorita stratului izolant al vasului de reacție. A doua zi se agita 15 min. si se încălzește sub agitare continua, la 85...90 °C pentru dezactivarea enzimei. Dispersia calda se filtrează pe un filtru sub vid (tip Nuce), iar filtratul este supus analizei pentru determinarea conținutului de azot total si azot aminic, care indica o masa moleculara medie de 4000-6000 Daltoni.

Claims (4)

REVENDICĂRI

1. Polidispersie de colagen pentru tratarea semințelor de cereale caracterizata prin aceea ca reprezintă un amestec de polipeptide, oligopeptide si aminoacizi cu masa moleculara medie de 4000-6000 Da, conține 60% particule cu dimensiuni de 1-10 nm, 26% particule cu dimensiuni 1000-5000 nm, indice de polidispesie de 0,6, concentrație in aminoacizi liberi de 6-12%, cu efecte in stimularea creșterii si protecției semințelor si plantelor de cereale.

2. Procedeu de extragere a polidispersiilor de colagen, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca folosește fragmente reziduale de piele tăbăcită cu săruri bazice de crom, cu umiditatea de 55.....60%, cu un continui de 85.....90% substanța dermică (raportat la produsul liber de substanțe volatile) si 4,0.....5,0% oxid de crom (raportat la produsul liber de substanțe volatile), sau folosește deșeuri de piele netabacita, cu umiditatea de 55.....60% si un conținut de 85.....90% substanța dermică (raportat la produsul liber de substanțe volatile).

3. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea ca pentru extragerea polidispersiilor de colagen din fragmente reziduale de piele tăbăcită cu săruri bazice de crom se folosesc procese hidrolitice termo-chimice in sistem compact, constând in prima faza in hidroliză la un raport solid/lichid de 1/4, cu 8-12% oxid de calciu, la temperatura de 70...85°C, pe o durata de 3.....5 ore, sub agitare continua, urmata in a doua faza de hidroliză enzimatica, cu Alcalase 2,4L in concentrație de 2,5.....4,5 unitati enzimatice/gram azot total, la temperatura de 63°C ± 2°C, cu agitare continua pe o durata de 3.....5 ore, apoi in regim static fara aport termic, pana a doua zi, asigurând extragerea componentei proteice cu randamente de 85.....95%, sub forma de polidispersii de colagen cu masa moleculara medie 4000-6000 Da si continui de aminoacizi liberi, oligopeptide si polipeptide, destinate tratării semințelor de cereale.

4. Procedeul conform revendicărilor 2 si 3, caracterizat prin aceea ca pentru pentru extragerea polidispersiilor de colagen din reziduurile de piele netabacita se folosește in prima faza efectul termic, prin încălzirea dispersiei de piele cu un raport solid/lichid de 1/4, pana la 70....85°C pe o durata de 3.....5 ore, cu agitare continua, urmata de a doua faza, constând in hidroliză enzimatica, cu Alcalase 2,4L in concentrație de 2,5.....4,5 unitati enzimatice/gram azot total, la temperatura de 63°C ± 2°C, cu agitare continua pe o durata de 3....5 ore, apoi in regim static fara aport termic, pana a doua zi, asigurând extragerea componentei proteice cu randamente de 85.....95%, sub forma de polidispersii de colagen cu masa moleculara medie de 4000-6000 Da si continui de aminoacizi liberi, oligopeptide si polipeptide, destinate tratării semințelor de cereale.