TWI396695B - 有害動物之控制 - Google Patents
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Description
本發明係關於其包含與表現於囓齒類動物之蛋白質結合的抗體(或其抗原-結合片段),且尤其是與表現於囓齒類動物胃腸(GI)道之蛋白質結合的抗體或抗原-結合片段之新穎囓齒類動物控制劑,以及關於製造新穎囓齒類動物控制劑之方法。本發明進一步擴張至用於囓齒類動物控制之新穎抗體與抗原-結合片段,以及透過使用此類抗體、抗原結合片段與新穎囓齒類動物控制劑來控制囓齒類動物之方法。
囓齒類動物長久以來已被認為是有害動物,且引起各種不同的問題。彼等常從預定供作人類與馴養動物消費之食物中覓食,因此其不僅會對成長中之作物,亦對儲藏的糧食造成損害及污染(以其尿液、糞便與疾病)。囓齒類動物亦已知為許多種疾病的帶原者,包括(例如)旋毛蟲病、鉤端螺旋體病、霍亂、腹股溝淋巴結炎、斑疹傷寒、痢疾、漢他病毒、沙門菌病、巴斯德菌病、弓形體病及鼠咬熱,其可能經由直接(例如透過咬傷)或間接(例如透過由糞便、尿液與/或唾液產生之塵粒,及/或生長於囓齒動物上或由其傳播出之昆蟲)與人類及/或其他哺乳類接觸而散播疾病。而且,囓齒類動物常經由啃咬及挖洞而對房屋、設備與裝置造成物理性損害。
因此多年來已研發出控制囓齒類動物之方法,且此等方法一般可分成三類:i)設陷捕捉;ii)經由暴露至化學藥劑殺害;及iii)使囓齒類動物不孕或降低其生育能力。此三種方法皆具有一或多種缺陷。
例如,經設計用於捕捉及/或殺死囓齒類動物之機械陷阱,其本質上之用途受限於可捕獲的動物數量有限,亦即其可能只能夠一次捕捉一隻動物,然後需要由人類再重新設陷。當人們考量到囓齒類動物之高生殖速率(以平均一窩大小為6-8隻,且每年生10至12窩來計算,單一對大鼠一年可生產多達15000隻後代)時,可想見設陷捕捉並不適用於大量群襲。而且設陷捕捉相對上較費力,需要定期人為檢視與重設,且此不僅增加用於有害動物控制之成本,亦可能嚇跑欲設陷捕捉之標靶囓齒類動物。
使用化學性殺囓齒類動物藥劑係目前用於都市與農業環境中,針對特定囓齒類動物控制計畫的主要方法。化學性殺囓齒類動物藥劑之作用一般為急性或慢性,亦即該化學藥品在被囓齒類動物攝入有效劑量後,會快速或緩慢地引發毒性反應。急性殺囓齒類動物藥劑包括磷化鋅、磷化三鋅、紅海蔥(活性成份紅海蔥苷)、(單)氟乙酸鈉、氟乙醯胺、阿伐氯醛糖與硫酸鉈。某些殺囓齒類動物化學劑,例如鈣化固醇、溴甲林及氟鼠啶(flupropadine)可描述為次急性殺囓齒類動物藥劑,其中致死劑量為最早24小時內攝入,但發生重複進食且死亡一般會延遲數天,然而急性與次急性作用之殺囓齒類動物藥劑間的區分通常並不清楚。雖然急性殺囓齒類動物藥劑好處在於其作用非常快速,但彼等一般是非常毒的化學藥劑,在使用時有安全性與環境上之顧慮。而且,急性毒物誘餌之倖存者可能變得對誘餌非常小心,而因此減低此種囓齒類動物控制方法的整體功效。
慢性殺囓齒類動物藥劑係藉由作用為抗凝血劑而執行其作用,實例包括第一代抗凝血劑羥基香豆素(hydroxycoumarin,例如華法令(warfarin)、氯殺鼠滅(coumachlor)、克滅鼠(coumafuryl)、殺鼠醚(coumatetrayl))與茚烷-二酮類(例如鼠完(pindone)、敵鼠(diphacinone)、氯鼠酮(chlorphacinone));及第二代抗凝血劑溴敵隆(bromadiolone)、溴鼠靈(brodifacoum)、鼠得克(difenacoum)、氟鼠靈(flocoumafen)與噻鼠靈(difethialone)。第二代殺囓齒類動物藥劑已被普遍使用歷時至少二至三十年,而第一代抗凝血劑甚至更久(三至五十年),因此囓齒類動物族群已經有充分的時間對此種控制方法產生抗性,且已有在各種囓齒類動物族群及/或品種中針對上述各活性成份產生抗性/耐性之報導(參見Kerrins等人,2001,“於英國1995-98年間對於抗凝血劑殺囓齒類動物藥劑之抗性分布”,會議記錄pp 149-159,脊椎動物類有害動物管制II之發展,第二屆歐洲脊椎動物類有害動物管制委員會,Braunschweig,德國)。
第二代抗凝血劑之另一項缺點源自其在廣泛使用時,其作用係非-種特異性作用模式。多年來已有對會對攝食帶有抗凝血劑殘餘物之肉食性與腐食性哺乳動物及鳥類造成二次毒害之疑慮。在英國溴鼠靈與氟鼠靈已被限制使用於室內,因認為彼等若被用於戶外會發生無法接受高度的二次毒害危險。然而,對於較廣泛使用之鼠得克與溴敵隆之普遍抗性,可能激發錯誤使用被限用於室內的更有效抗凝血劑。最近已在許多保育類非標靶物種,例如貓頭鷹、鼬、鼬鼠、臭鼬及茶隼中觀察到低度殘餘物,及此等殘餘物之致死衝擊。
第三種已被提出(但尚未達到任何實際商業成功)之囓齒類動物控制方法,係仰賴減低囓齒類動物生育率。生殖抑制劑(例如避孕劑與殺配子劑)之使用,以及生物與化學不孕劑之使用皆未經研究。然而,各項方法均有某種缺點。例如,雖然使用化學或固醇類化合物作為抗生育劑,已被證實可成功用於受監禁動物,但彼等卻更加困難用於範圍不定之有害動物族群。該等化合物並不美味,而因此難以確保囓齒動物能夠獲得足夠劑量。殺配子劑3-氯-1,2-丙二醇已上市作為一種毒物-不孕劑,然而,其在不同物種體內具有不同的作用,且在高劑量下具有毒性(導致多達50%死亡)。最近之研究已測試免疫避孕法作為囓齒類動物控制方法(參見例如,美國專利申請案第2005/0009188;Moore & wong 1997,Reporduction Fertility & Development 9:125-9;Smith等人,1997,Reproduction Fertility & Development,9:85-9)。然而,當投藥途徑為口服時,由於口服耐受性的問題,且可能需要佐劑,而難以達成功效。
因此有需要可解決目前之囓齒類動物控制方法所面臨的某些缺點之新穎的囓齒類動物控制劑(亦即能夠例如透過殺死囓齒類動物,或藉由調節齒類類族群之生育能力而控制囓齒類動物族群的藥劑)。本發明鑑於此需要遂提供其包含可結合至表現於囓齒類動物之蛋白質(此類蛋白質於本文中稱為標靶蛋白質)的胞外抗原決定基之抗體組成的新穎囓齒類動物控制劑。
因此,於本發明之第一方面,係提供其包含可結合至表現於囓齒類動物之蛋白質的胞外抗原決定基之抗體成分的囓齒類動物控制劑。
藉由將囓齒類動物控制劑靶定至,囓齒動物體內之特別蛋白質及/或特定組織,例如表現於囓齒類動物胃腸組織/囓齒類動物GI道中之蛋白質,相對於非特異性囓齒類動物控制劑(其僅通過胃腸而不透過特異性結合滯留),可增加該新穎囓齒類動物控制劑與囓齒類動物腸胃接觸的時間。此可接著促使有效增加新穎囓齒類動物控制劑之功效,而因此能使其以較傳統非特異性殺囓齒類動物藥劑(例如抗凝血劑)殺囓齒類動物藥劑更低之濃度使用。
較佳地,該抗體成分可使新穎囓齒類動物控制劑對於囓齒類動物,而非對於非-標靶動物(例如人類、鳥類、寵物、農場動物及非有害動物之野生動物)具有選擇性。此針對囓齒類動物組織/囓齒類動物蛋白質,而非對於非-標靶物種之選擇性,具有另一項優點在於其似乎可減少對於解毒劑之需求,且可能減低新穎囓齒類動物控制劑對於非-標靶物種之環境衝擊。
若抗體成分可辨識一種在囓齒類動物執行非-必須性功能之標靶蛋白質,則該囓齒類動物控制劑有需要進一步包含有毒成分或避孕成分。
因此於本發明之一項具體態樣中,提供一種包含鍵聯至有毒成分,或避孕成分之抗體成分的囓齒類動物控制劑。此類新穎囓齒類動物控制劑可呈現融合蛋白之形式,其中有毒成分或避孕成分係直接或間接(亦即經由連接肽)藉由肽鍵與抗體成分鍵聯的蛋白質或肽類部份,或呈現蛋白質共軛物之形式,其中有毒成分或避孕成分為小分子(亦即非-蛋白質、化學的實體)或為直接以化學方式與抗體成分共軛之蛋白質或肽類部份。
若抗體成分可辨識一種在囓齒類動物執行必須性功能之標靶蛋白質(例如,於囓齒類動物之GI道中執行必須性功能的蛋白質),則該抗體成分可達成囓齒類動物控制功能,而作為唯一具功能性藥劑。此類囓齒類動物控制劑會藉由該抗體成分結合至必須標靶蛋白,且因此阻斷或抑制該必須蛋白之功能的功效而執行其作用。因此於本發明之另一項具體態樣中,提供一種包含結合至表現於囓齒類動物之蛋白質的胞外抗原決定基之抗體成分的囓齒類動物控制劑,其中該蛋白係於囓齒類動物執行一項必須功能。可與根據本發明此方面之抗體成分結合(且因此可用於製造根據本發明此方面之抗體成分)的適宜標靶蛋白之實例包括囓齒類動物Sox10基因產物、囓齒類動物內皮素-B受體(EDNRB)、囓齒類動物內皮素-3配體(EDN3)、囓齒類動物CFTR(參見下表1及實施例之詳述)、囓齒類動物IL-2、囓齒類動物IL-10、囓齒類動物T細胞受體阿伐與/或貝他鏈、囓齒類動物第II類主要組織相容性複合物之組成要素。習於該項技藝人士應瞭解,某些上述基因產物/蛋白質在囓齒類動物之上皮細胞表面不容易接近,而因此需要在彼等能夠介導其活性之前先內在化。於此類情況,可希望將對抗上述其中一種蛋白之抗體成分,與另一靶定用抗體成分(其可增加內在化之機率)組合。因此可將二或多種抗體成分(其中一種對抗上述其中一種蛋白質,而第二種作用為對抗用以增進內在化之適宜上皮標靶物的靶定用抗體)經由共軛作用,或藉由如下所述之融合蛋白效用鍵聯。
術語“抗體成分”用於本文意指,可與表現於囓齒類動物之蛋白質的胞外抗原決定基結合之抗體或其抗原-結合片段。較佳地該抗體成分所結合至之抗原決定基具有僅在囓齒類動物蛋白中發現的胺基酸序列,亦即該抗體結合至囓齒類動物特異性抗原決定基或RSE。囓齒類動物特異性抗原決定基(RSE)(其可用於產生供用於本發明囓齒類動物控制劑之抗體成分且與本發明之囓齒類動物控制劑結合)形成了本發明所述之第二方面。與RSE結合之抗體成分被認為係本發明所述的第三方面。
RSE應為胞外分子,以助於抗體(或抗體結合片段)接近其結合部位。較佳地,該提供RSE之標靶蛋白會表現於囓齒類動物上皮表面(包括例如鼻、口、眼、胃腸道、生殖-泌尿道與表皮)之中或其上。最佳地,該蛋白將表現於囓齒類動物胃腸道上皮細胞之中(或之上)。
於一項具體態樣中,RSE係以連續(亦即順序性)肽序列(亦即抗原決定基之第一個胺基酸殘基,將直接經由肽鍵與該抗原決定基之第二個胺基酸殘基鍵聯,該抗原決定基之第二個胺基酸殘基,將直接經由肽鍵與該抗原決定基之第三個胺基酸殘基鍵聯,以此類推)提供。此類連續性肽抗原決定基,於本文稱作囓齒類動物特異性肽抗原決定基或RSPE。與本發明之抗體成分結合,且可因此用於產生本發明之抗體成分(以及囓齒類動物控制劑)的RSPE,可藉由針對經文獻與資料庫資訊指示表現於所希望標靶組織/細胞層中之蛋白質進行比較性生物訊息分析,隨後再進行確定性免疫學分析而測定得。RSPE(如同RSE)係於自然界中僅發現存在於囓齒類動物蛋白質。RSPE於本文定義為一種標靶蛋白之寡肽片段,其中該寡肽序列與得自非標靶(亦即非-囓齒類動物,例如人類)動物同源蛋白質之相對應線形肽序列,表現60%或更少同一性百分比的胞外連續肽抗原決定基。
術語“寡肽片段”用於本文意指標靶蛋白之片段,該片段係由至少約4且最多約50個胺基酸所組成。較佳地該寡肽片段之長度係介於9至30(包含)個胺基酸。於特別具體態樣中,該該寡肽片段之長度為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、24或44個胺基酸。
較佳地RSPE與非標靶蛋白質之同一性百分比,係可使本發明之抗體成分具有對於RSPE之高特異性與親合性,且不會與RSPE所衍生自之相同綱/科非囓齒類動物蛋白質發生交叉反應。於較佳具體態樣中,RSPE與非標靶蛋白質間,特別是RSPE與來自非標靶動物之同源蛋白的相對應線形(亦即連續或順序性)肽序列間之同一性百分比,係少於或等於50%、45%、40%、35%、30%或25%。
較佳地RSPE在所有標靶囓齒類動物物種間具有高度保守性,特別是於大鼠與小鼠之間,尤其在Rattus rattus
、Rattus norvegicus
及Mus musculus
/Mus domesticus
其中二或多者間為高度保守。具有高度保守性意指,得自一種囓齒類動物之RSPE與,得自第二種囓齒類動物之相對應RSPE間的同一性百分比很高。較佳地,兩種囓齒類動物RSPE間之同一性百分比為至少75%。更佳地同一性百分比係大於或等於80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%或99%。最佳地,二或多種囓齒類動物間之RSPE為100%相同。
雖然,如上所述二或多種囓齒類動物間之RSPE較佳地為高度保守,但若無法觀察到所希望之保守程度時,則可使用源自二或多種囓齒類動物之蛋白質(為同源或相異)的不同RPSE,來產生不同抗體成分,然後可如下所述將其組合於囓齒類動物控制劑中(例如將各種鍵聯至一種毒性/避孕成分之抗體成分組合,使囓齒類動物控制劑因此包含多種不同抗體-毒物/避孕分子,或者囓齒類動物控制劑包含一種毒性/避孕成分,鍵聯至二或多種相異的抗體成分,其中各二或多種抗體成分辨識得自不同種囓齒類動物之蛋白質的RSPE)。於一項特別具體態樣中,辨識小鼠MDR1(SEQ ID NO:8)之抗體成分可與辨識大鼠MDR1(SEQ ID NO:9)之抗體成分,組合於本發明之囓齒類動物控制劑。
與本發明之抗體成分結合,且其可用於製造或鑑定本發明抗體成分之標靶蛋白,的實例列示於表1。此表亦提供可衍生自例舉性蛋白質之特別RSPE實例。習於該項技藝人士應瞭解列於表1中之蛋白質,或衍生自所列蛋白質之RSPE皆不具排他性。可於所給予蛋白質(皆表現於GI道中)內鑑定得其他RSPE,且亦可使用例如得自諸如鼻部上皮、口腔上皮、表皮、生殖-泌尿道之上皮、與眼部上皮等其他標靶組織的其他蛋白質,製造本發明之抗體成分。
用於本發明之較佳標靶蛋白實例為,大鼠寡肽轉運蛋白PepT1、大鼠CD155、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠CATB(0)+、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠OATP-B、大鼠ENT1、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL及大鼠SCAB。
本發明較佳之RSPE具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、26、27、28、29、31、32與34。
用於本發明之尤其較佳標靶蛋白為大鼠寡肽轉運蛋白PepT1、大鼠CD155、大鼠CFTR、大鼠CNT2、小鼠GLUT7、大鼠GCC、大鼠PLB及大鼠LPH。
本發明尤其較佳之RSPE具有SEQ ID NO:1、3、5、6、11及27、28與29。
習於該項技藝人士應瞭解,抗體辨識三級蛋白結構,且抗原決定基可包含分布於整個蛋白質一級胺基酸序列,而在結構上彼此互相靠近之胺基酸殘基。因此於另一具體態樣中,本發明之抗體成分(及所成之囓齒類動物控制劑)可辨識非連續性胞外RSE。
用於本發明之抗體可為多株或單株抗體。此類抗體可藉由將動物以如上所述之RSPE致免疫,或藉由將動物以完整囓齒類動物標靶蛋白致免疫而獲得。本發明之多株抗體可得自此類經致免疫之動物之血清,參見例如實施例2。其辨識RSPE或囓齒類動物標靶蛋白,但不辨識源自非標靶動物之同源蛋白的多株抗體,可使用標準免疫學技術(例如藉由ELISA,及/或透過對抗適當組織來源之免疫組織化學)鑑定得。
用於本發明之單株抗體可藉由,從已經RSPE或囓齒類動物標靶蛋白致免疫之動物脾臟分離出B-淋巴細胞,及以此類淋巴細胞製造融合瘤細胞系而獲得。然後對該等融合瘤細胞系篩檢出,其分泌可辨識RSPE或囓齒類動物標靶蛋白,但不辨識源自非標靶動物之同源蛋白的抗體者,參見例如下述實施例。
用於本發明之較佳多株與單株抗體,經描述於本文實施例中。
用於本發明之抗體及抗原結合片段,亦可分離自抗體或抗原結合片段之噬菌體展現文庫(原初(naive)或免疫(immune)),或得自抗體或抗原結合片段之類似的酵母或細菌文庫,或得自抗體或抗原結合片段之核糖體展現文庫。代表性地,對此類展現文庫進行篩檢,以鑑定出與RSPE或囓齒類動物標靶蛋白結合之所展現蛋白質。習於該項技藝人士熟悉用於篩檢此類文庫、鑑定存在該文庫中之結合-配對者、及後續分離出此類成員之方法。可用於進行篩檢之抗體與抗原結合片段文庫,及其構築方法經描述於先前技藝中(參見例如:國際專利公開案號WO 01/90190與WO 93/19172;美國專利案號5,759,808與6,517,829;回顧見於Hoogenboom 1997,生物技術之趨勢15(2):62-70;Dooley等人,2003分子免疫學40:25-33;Nutall等人,2001分子免疫學2001,38:313-326;及Hanes等人,1998美國國家科學院議事記錄95:14130-14135)。再次地,會對以此方法鑑定得之抗體或抗原結合片段進行檢查,確定彼等不會與源自非標靶動物之同源蛋白結合。
用於本發明之抗體可為任何一類免疫球蛋白,例如彼等可為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。較佳地本發明之抗體為IgG抗體。本發明之抗體可為包含重鏈與輕鏈之免疫球蛋白分子,或彼等可為單鏈抗體。術語“單鏈抗體”用於本文包含,僅由單一類型鏈所組成之天然抗體,例如缺乏輕鏈之Camelid或Chondricthyes(鯊魚型)衍生之抗體,以及僅由單一多肽鏈組成之經設計抗體。此類經設計抗體之實例包括(例如)經描述於國際專利公開案號WO94/09817之單鏈抗體或“迷你抗體”,及單鏈可變片段(scFv)。本發明之抗體較佳為單鏈抗體。於一項較佳具體態樣中,抗體為scFv。於另一項較佳具體態樣中,抗體為缺乏輕鏈之單鏈抗體,最佳地為Camelid衍生之抗體(例如於國際專利公開案號WO94/04678中所述)。
用於本發明之抗原結合片段包括,免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、VH
功能域、VL
功能域、Fv、Fab、二-Fab、Fab’、F(ab’)2
、VH H
功能域、IgNAR V功能域及CDR。習於該項技藝人士應非常熟習諸如免疫球蛋白輕鏈與重鏈、VH
與VL
功能域、Fv、Fab、二-Fab、Fab’、F(ab’)2
與CDRs等抗原結合片段,及其製備方法。VH H
功能域為Camelid抗體之可變功能域。VH H
功能域及其分離描述於該項技藝,參見例如國際專利公開案號WO 94/04678、國際專利公開案號WO 01/90190及其中所包含之參考文獻。IgNAR抗體為得自缺乏輕鏈(與Camelid抗體相同)之鯊魚型的單鏈抗體(參見Greenberg等人,1995自然374:168-173)。此等抗體之抗原結合區域,IgNAR可變功能域(IgNAR V功能域)已經描述於該項技藝,參見例如Dooley等人,2003(分子免疫學40:25-33)及其中所引用之參考文獻。於某些具體態樣中,用於本發明之抗體成分為辨識前述較佳標靶蛋白質其中之一的Camelid抗體或VH H
功能域。尤其,以與SEQ ID NO 1、3、5、6、11或27任一者結合之Camelid抗體或VH H
功能域為較佳,而以與SEQ ID NO 5、6、11或27任一者結合之VH H
功能域為較佳。
用於本發明之抗原結合片段亦可經設計以增加其安定性,例如,彼等可藉由雙硫鍵橋安定化(參見例如Reiter等人,1996,自然生物技術14(10):1239-1245)。
如上所述,可藉由使用完整囓齒類動物蛋白或RSE(該術語包括RSPE),作為抗原或用於篩檢適合的抗體/抗原結合片段(其已因與得自非標靶(亦即非囓齒類動物例如人類)動物之同源蛋白質具有低同一性百分比而被選用)而獲得抗體成分。本發明抗體成分與得自非標靶物種之同源蛋白質發生交叉反應的可能性因此而降低。於是,於本發明之較佳具體態樣中,抗體成分(及因此所成之囓齒類動物控制劑)對於標靶蛋白上之抗原決定基,而不會對源自非標靶動物之同源蛋白質上的相對應抗原決定基呈現選擇性。換言之,本發明之較佳抗體成分係藉由與一RSE(或與該RSE所衍生自之囓齒類動物蛋白質)以較其與源自非標靶動物之同源蛋白質上的相對應抗原決定基(或該同源蛋白)更高的親和力結合,而顯示其對該RSE之選擇性。非標靶動物包括人類、鳥類、寵物、農場動物及非有害動物之野生動物。
本發明之抗體成分較佳地會呈現減低,且甚至不與來自人類之同源蛋白結合。甚至更佳地,本發明之抗體成分不僅會呈現減低(或不)與來自人類之同源蛋白結合,亦會呈現減低(或不)與來自至少一種其他非標靶動物之同源蛋白結合。
為免除疑惑,術語“結合”用於本文係描述本發明之抗體成分與抗原決定基或蛋白質,以定性或定量方式的相互作用。
若術語特異性以定性方式使用,對標靶蛋白、RSE或RSPE之結合的“特異性”,可表示為抗體成分可與標靶蛋白、RSE或RSPE以可置換方式結合之能力,其中抗體結合之置換係因存在有找出或篩檢出該抗體成分的抗原(以下稱作“特異性抗原”)所致。若未觀察到此類標靶蛋白/RSE/RSPE-特異性抗體成分與非標靶蛋白(或源自非標靶蛋白之相對應抗原決定基)的結合,或若觀察到其與非標靶蛋白(或源自非標靶蛋白之相對應抗原決定基)有某些結合,而該結合無法被特定抗原置換,則抗體成分被視為顯示對標靶蛋白、RSE或RSPE(若適當)具有選擇性,因為該抗體成分以較其與得自非標靶蛋白或與源自非標靶蛋白之相對應抗原決定基更高的親和力結合至該標靶蛋白/RSE/RSPE。因此特異性與選擇性可經由適當組織樣本之免疫組織化學分析,及/或經由與適當樣本進行之ELISA而測定得。
若術語“結合”以定量方式敘述,此意指抗體成分對於與其相互作用之抗原決定基或蛋白質具有親和力為至少10- 6
M。較佳地親和力為至少10- 7
M,更佳地為至少10- 8
M,更佳地為至少10- 9
M,甚至更佳地為至少10- 1 0
M且最佳地為至少10- 1 1
M或更高。因此,若抗體成分與一種RSE或RSPE(或從其衍生出該RSE或RSPE之蛋白質)結合,則其具有親和力為至少10- 6
M,而於另一具體態樣中,其具有親和力為至少10- 7
M,至少10- 8
M,至少10- 9
M及至少10- 1 0
M。於較佳具體態樣中,抗體成分不會與得自一或多種非標靶物種(較佳為人類)之同源蛋白質上的相對應抗原決定基結合,亦即抗體成分對於得自非標靶物種之同源蛋白質的親和力將少於10- 6
M,或者對其呈現較低的結合力,亦即抗體成分對於得自非標靶物種之同源蛋白質的親和力,會較對於該標靶囓齒類動物蛋白質之親和力少至少10-倍。因此,於較佳具體態樣中,若本發明之抗體成分對於一種RSE或RSPE(或從其衍生出該RSE或RSPE之蛋白質)具有親和力至少為10- 6
M,則抗體成分對於得自非標靶物種之同源蛋白質的親和力將少於10- 6
M,且較佳地少於10- 5
M或更低;若本發明之抗體成分對於一種RSE或RSPE(或從其衍生出該RSE或RSPE之蛋白質)具有親和力至少為10- 7
M,則抗體成分對於得自非標靶物種之同源蛋白質的親和力將為10- 6
M或更低;若本發明之抗體成分對於一種RSE或RSPE(或從其衍生出該RSE或RSPE之蛋白質)具有親和力至少為10- 8
M,則抗體成分對於得自非標靶物種之同源蛋白質的親和力將為10- 7
M或更低,且較佳為10- 6
M或更低;若本發明之抗體成分對於一種RSE或RSPE(或從其衍生出該RSE或RSPE之蛋白質)具有親和力至少為10- 9
M,則抗體成分對於得自非標靶物種之同源蛋白質的親和力將為10- 8
M或更低,且較佳為10- 6
M或更低。
抗體成分對於標靶及非標靶蛋白質(以及得自其之抗原決定基)的親和力,可使用任何適當技術測定;例如,經由使用表面電漿共振(例如以BLAcoreT M
)。
於本發明之一項具體態樣中,囓齒類動物控制劑係呈融合蛋白形式,其中該融合蛋白包含第一蛋白成分與第二蛋白成分,該第一蛋白成分為如前所述之抗體成分,而第二蛋白成分係選自由毒素、免疫原與激素所組成的群組。
第一蛋白成分可直接與第二蛋白成分鍵聯,然而,較佳地將該二成分間接地經由連接肽鍵聯。一般連接肽具有足以供第一成分與第二成分進行所希望功能,而不使其中一組成不利地影響另一者功能(例如因立體遮蔽所致)的長度。一般適用於本發明此方面之連接肽實例為(Gly4
Ser)n
連接肽,其中"n"為大於或等於1之整數。代表性地n為係大於或等於3。較佳地,係將連接肽設計為可在嚴厲水解及熱環境中保持安定。此可藉由移除或突變存在連接肽中,作用為供經由(例如)蛋白水解機制處理該連接肽之辨識部位的殘基而達成。其他適合之連接肽實例為該等由Gustavsson等人,2001(蛋白質設計14:711-715)、Hennecke等人,1998(蛋白質設計11:405-410)及Huston等人,1991(酵素學方法302:46-88)所描述者。
於另一項具體態樣中,可希望將特別不安定性設計入連接肽中,以使可於該融合蛋白遞送至適當區域時,能執行該二蛋白之受控分離/第二蛋白成分成分之釋出,例如一旦融合蛋白已被內在化後,第二蛋白成分可於細胞內釋出。所希望的分離之控制可作用以增進某些融合蛋白之活性。
如上所述,於融合蛋白之一種具體態樣中,第二蛋白成分係毒素。毒素授與融合蛋白殺囓齒類動物之活性:其經由外在或內部介導之作用模式而執行對抗所靶定囓齒動物細胞的毒性。適用於本發明此方面之毒素包括(尤其是),破壞細胞膜之蛋白、核糖基轉移酶、絲胺酸蛋白酶、鳥苷醯基環化酶活化劑、涉及ATP-ase所介導之離子轉運的蛋白質、鈣調蛋白-依賴性腺苷醯基環化酶、RNA糖苷酶及核糖核酸酶。適宜毒素之特別實例列於下表2中。習於該項技藝人士應瞭解,有些列於表2之毒素為毒素分子家族之代表例,而該家族中任一成員亦可用於本發明。
用於本發明具體態樣中之較佳毒素包括粒酶B、cyt2A、β-嘌呤硫素、VIP2A、白樹素及顆粒體溶素。尤其較佳之毒素係選自粒酶B、cyt2A、β-嘌呤硫素、VIP2A與顆粒體溶素。
可將上述之蛋白毒素完整的併入本發明之融合蛋白中。或者,若此類毒素之功能域或片段可提供毒素活性,則可利用該功能域或片段作為融合蛋白之第二蛋白成分。
於另一具體態樣,本發明融合蛋白中之第二蛋白成分為免疫原,亦即能夠於囓齒動物體內引發免疫反應之多肽或寡肽。於較佳具體態樣中,本發明之免疫原-融合蛋白將能作用為免疫避孕劑,而因此將作用為藉由防止生殖之囓齒類動物控制劑。於是,精子或卵特異性抗原,例如乳酸去氫酶C、精子抗原PH-20(Primakoff等人,1988自然335:543-6)、fertilin(PH-30)、透明區抗原為適用於作為本發明融合蛋白中之第二蛋白成分的免疫原。
又於另一具體態樣,本發明融合蛋白中之第二蛋白成分,為激素或蛋白質激素模擬物。於此具體態樣中,該第二蛋白成分會干擾且預防囓齒動物生殖,而因此融合蛋白係經由防止生育,而作用為囓齒類動物控制劑。可用於本發明此具體態樣之激素實例,包括促性腺素釋放激素。
於另一具體態樣,如上所述之融合蛋白可包含至少一種其他蛋白成分。此一或多種其他蛋白成分可為,如上所述之毒素、免疫原、激素或蛋白質激素模擬物。於是,可構築包含抗體成分與至少兩種其他蛋白成分之融合蛋白,其中各該其他蛋白成分成分使融合蛋白具有囓齒類動物控制(亦即毒性或避孕性,或該二種)功能。第二種的與其他的蛋白成分成分可各具有相同,或相異的囓齒類動物控制功能(亦即彼等可各獨立地為毒性或避孕性),且若彼等具有相同功能,則其可各具有相同,或相異的作用模式。若額外之蛋白成分具有相同的囓齒類動物控制功能,且其中至少一種額外蛋白成分成分具有,與該第二蛋白成分不同之作用模式,則可能增加囓齒類動物控制劑之功效(相對於包含單一種供給囓齒類動物控制活性之蛋白成分的囓齒類動物控制劑)。例如,其中第二種蛋白成分為細胞破壞性毒素(例如選自由產氣莢膜溶素O、α-溶血素、鞘磷脂酶、δ-溶血素、α毒素、cyt毒素、顆粒體溶素、蜂毒素、穿孔素、equinatoxin、李斯特菌溶素、氣單胞菌溶素、溶血素A、變形蟲穿孔肽、EI Tor溶血素、美人魚弧菌溶血素、肺炎球菌溶血素、鏈球菌溶血素O、金川毒素、鉤端螺旋體溶血素、cry毒素、VIP3、硫素與β-嘌呤硫素所組成之群組)且其他蛋白成分可為需要內在化於細胞中以執行其活性之毒素(例如選自由粒酶B、白喉毒素、霍亂內毒素、VIP2、輔助腸毒素、大腸桿菌素E1、CTX IV、第2型核糖體-失活化蛋白例如蓖麻毒蛋白、炭疽毒素、假單胞菌外毒素A、芽孢桿菌核酸酶、第1型核糖體-失活化蛋白,例如白樹素所組成之群組)之融合蛋白,因由該第二蛋白成分所提供之膜破壞活性,可藉由助於其他蛋白成分成分接近囓齒類動物細胞內部,而輔助其他蛋白成分執行其具功能活性,而係特別有效囓齒類動物控制劑。於較佳具體態樣中,融合蛋白將包含至少一種選自由cyt 2A、β-嘌呤硫素與顆粒體溶素所組成之群組之毒素成分;及至少一種選自由粒酶B、VIP2A與白樹素所組成之群組之毒素成分。
可構築得本發明之融合蛋白,以使第一蛋白成分(抗體成分)位於第二蛋白成分之N-端,或者所構築得者中第二蛋白成分係位於第一蛋白成分之N-端。如前所述及,於某些具體態樣可希望藉由連接肽將該二種蛋白成分間接地鍵聯。因此本發明之融合蛋白從N至C端可包含第一蛋白成分,經由肽鍵結合至連接肽,其接著經由肽鍵與第二蛋白成分結合,或者彼等從N至C端可包含第二蛋白成分,經由肽鍵結合至連接肽,其接著經由肽鍵與第一蛋白成分結合。
若融合蛋白包含額外蛋白成分,則此可接至第一成分之N-端,亦即該額外蛋白成分係直接經由其C-端殘基,以肽鍵與第一蛋白成分之N-端殘基鍵聯,或間接藉由連接肽(或另一個蛋白成分)鍵聯至第一蛋白成分之N-端殘基。於另一具體態樣中,額外蛋白成分係接至第二蛋白成分之N-端,亦即該額外蛋白成分直接經由其C-端殘基,以肽鍵與第二蛋白成分之N-端殘基鍵聯,或間接藉由連接肽(或另一個蛋白成分)鍵聯至第二蛋白成分之N-端殘基。於又另一具體態樣中,額外蛋白成分可:i)接至第一成分之C-端,亦即該額外蛋白成分係直接經由其N-端殘基,以肽鍵與第一蛋白成分之C-端殘基鍵聯,或間接地藉由連接肽(或另一個蛋白成分),鍵聯至第一蛋白成分之C-端殘基;或者ii)接至第二蛋白成分之C-端,亦即該額外蛋白成分直接經由其N-端殘基,以肽鍵與第二蛋白成分之C-端殘基鍵聯,或間接地藉由連接肽(或另一個蛋白成分),鍵聯至第二蛋白成分之C-端殘基。
本發明之抗體成分及/或融合蛋白可藉由將編碼彼等之核酸,於任何適宜之蛋白質表現系統中進行表現而製得。因此,另一方面,本發明提供編碼本發明融合蛋白之核酸。可藉由編碼第一蛋白成分的核酸與編碼第二蛋白成分之核酸以符合讀框之方式選殖在一起而獲得編碼本發明融合蛋白之核酸。若第一與第二蛋白成分係間接以連接肽鍵聯,則分離出編碼該連接肽之核酸,並符合讀框地與融合蛋白之該二蛋白成分連結。
編碼抗體成分之核酸可使用標準分子生物學技術,從表現本發明抗體之融合瘤分離得。或者,可再次使用標準分子生物學技術,從編碼本發明抗體或抗原結合片段之噬菌體展現文庫,或其他文庫選殖株獲得編碼抗體成分之核酸。
編碼第二蛋白成分(毒性或避孕性成分)之核酸序列可於該項技藝中取得,參見例如列於表2之EMBL資料庫文獻。
編碼連接肽之核酸可例如,自編碼該連接肽序列之寡核苷酸從頭合成得。
為使抗體成分或融合蛋白可經表現於適宜蛋白質表現系統,遂將編碼融合蛋白之核酸可操作地與適宜啟動子,及視需要地適宜之轉錄終結子鍵聯。一般,編碼融合蛋白之核酸所可操作地鍵聯至之啟動子,為任何能夠於該核酸所導入至的宿主細胞中驅動融合蛋白表現之啟動子。因此,若希望抗體成分或融合蛋白於細菌細胞中表現,則該啟動子於細菌細胞中係可操作的。同樣,若希望抗體成分或融合蛋白經表現於真菌表現系統中,則該啟動子於真菌細胞中係可操作的,而若欲將構築體導入哺乳動物細胞培養物表現系統或植物表現系統時,亦符合相同的邏輯定義範圍。當欲使抗體成分或融合蛋白表現於植物細胞及/或植物中時,尤其可希望使用種子-特異性啟動子。若本發明之核酸經操作性鍵聯至適宜轉錄終結子區域,則此將於其中欲表現本發明抗體成分或融合蛋白之宿主細胞中介導轉錄作用終結。適用於此目的之轉錄終結子區域描述於該項技藝中。
適於本發明抗體成分或融合蛋白表現之表現系統包括微生物表現系統,例如細菌(如大腸桿菌、桿菌屬表現系統)與真菌系統例如酵母(如釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬),及其他真菌表現系統(例如衍生自曲霉屬、木霉與粗糙脈孢菌之絲狀真菌表現系統);哺乳動物表現系統例如CHO細胞、及植物表現系統。用於表現本發明融合蛋白之較佳植物與植物細胞包括大麥、小麥、玉米、高粱、燕麥、稻米及粟米。習於該項技藝人士應熟習此等表現系統,其經完整描述於該項技藝中。
本文所述之新穎囓齒類動物控制劑,亦可呈蛋白共軛物之形式。因此,於本發明之另一方面係提供包含如本文所述之本發明抗體成分,經化學共軛至毒性成分或避孕性成分的蛋白共軛物。於一具體態樣中,毒性成分或避孕性成分為小的化學實體,而於另一具體態樣中,毒性成分或避孕性成分為如前文關於本發明融合蛋白所述之蛋白質或肽類。若毒性成分為小的化學實體,則適用於本發明此方面之毒性化合物的實例包括秋水仙素;阿黴素;刺孢霉素;非類固醇消炎藥(NSAID)類之分子;松胞菌素;抗凝血劑例如溴鼠靈、鼠得克、溴敵隆、氟鼠靈、噻鼠靈、羥基香豆素、茚烷-二酮類;鈣化固醇;溴甲林;氟鼠啶;磷化鋅;紅海蔥苷;(單)氟乙酸鈉;氟乙醯胺;阿伐氯醛糖;硫酸鉈。
若避孕性成分為小的化學實體,則適用於本發明此方面之激素與類激素化合物包括,例如孕酮與雌激素(人為合成與天然)及diazacon(亦即20,25二氮膽固醇)。
蛋白共軛物之抗體成分可如先前所述獲得,且可直接以化學方法與毒性成分或避孕性成分共軛。代表性地此共軛作用將涉及使用,導致如該項技藝所述之雙硫鍵或硫醚鍵聯的異雙官能劑(參見例如,Hermanson,G.T.“生物共軛技術”學院出版,倫敦,1996,對於與使用交聯劑相關之標準方法學)。
於另一具體態樣,若毒性或避孕性成分為小的化學實體,可將毒性化合物、激素或類激素化合物包封於膠囊,並將該膠囊與本發明之抗體或抗原結合片段連結。於一項特別具體態樣中,可藉由如上所述之化學共軛作用將膠囊連結。於另一項特別具體態樣中,可將本發明之抗體或抗原結合片段以化學方法共軛(或經由肽鍵融合)至與膠囊結合之第二種結合成分。例如,本發明之抗原結合片段可用於提供雙特異性,或甚至多特異性結合分子中的特異性,其中第二(或另一種)特異性係針對膠囊,且此第二(或另一種)特異性係由可特異性結合至該膠囊之分子(例如抗原結合片段)所提供。
於另一方面,本發明之蛋白質共軛物的抗體成分係以化學方法共軛至二或多種毒性或避孕性成分。另一毒性或避孕性成分可呈蛋白質或肽部份之形式,或呈小的化學實體之形式。若至少一種其他毒性或避孕性成分為蛋白質或肽部份,則另一組成可為如先前所述之毒素、免疫原、激素或蛋白質激素模擬物。若至少一種其他毒性或避孕性成分為小化學實體,則另其可為如前文所述之毒性化合物或激素或類激素化合物。
於本發明此方面之某些具體態樣中,係產生包含如本文所述之抗體的蛋白質共軛物,該抗體經化學方法與至少兩種其他成分(其各提供該蛋白共軛物一種囓齒類動物控制功能,亦即毒性或避孕性,或二者)共軛。第二種其他成分(與另一成分)可(各)具有,與第一種其他成分相同或相異之囓齒類動物控制功能,且若其具有相同功能,則其可具有相同或相異(獨立地相異)之作用模式,如上關於本發明融合蛋白之描述。於一項特別具體態樣中,蛋白共軛物將包含如前所述之抗體成分,以化學方法共軛至一或多個第二毒性或避孕性成分分子。共軛部位將取決於用於共軛反應之化學。若希望將兩種不同其他成分共軛至第一(抗體)成分,則可能期望對於個別其他成分使用不同化學共軛方法,以確保不同其他成分不會相互競爭與位於第一成分上的相同部位進行共軛。
於本發明又另一方面,係提供包含如前所述之融合蛋白或蛋白共軛物的囓齒類動物控制劑,其中該融合蛋白或蛋白共軛物包含至少兩種抗體成分。於一項具體態樣中,各抗體成分結合至相同標靶蛋白,因此而增加囓齒類動物控制劑與其標靶組織結合的可能性,亦有效地增加囓齒類動物控制劑之結合活性。於此類具體態樣中,抗體成分可為相同或相異。若抗體成分相異,則此包含與標靶蛋白中之同一種RSE或RSPE結合的不同抗體成分,或更佳地其中各抗體成分係與同一種標靶蛋白中之不同RSE或RSPE結合的相異抗體成分。於一項具體態樣中,囓齒類動物控制劑會包含與至少兩種不同標靶蛋白結合之抗體成分。包含與同一種標靶蛋白中之不同RSE或RSPE結合的相異抗體成分,及/或包含與不同標靶蛋白結合之抗體成分的具體態樣,尤其可用於延緩開始對囓齒類動物控制劑產生抗性,或可抵消對其中一有效標靶位置之抗性。
本發明之抗體、抗原結合片段、融合蛋白及蛋白共軛物可用於控制囓齒類動物,例如彼等可用於殺死囓齒類動物之方法,或防止囓齒類動物生育之方法中。因此於另一方面,係提供包含或由如本發明所述之抗體、抗原結合片段、融合蛋白及蛋白共軛物組成的囓齒類動物控制劑。
本發明之融合蛋白及蛋白共軛物(其中第二蛋白成分為毒素,或其中抗體或抗原結合片段係經共軛至毒性化合物或蛋白質/肽類毒素)將藉由殺死囓齒類動物而達到囓齒類動物控制(亦即此類融合蛋白及蛋白共軛物之作用模式為殺囓齒類動物)。若抗體或抗原結合片段辨識經表現於囓齒類動物GI道上皮細胞中之蛋白質,則融合蛋白或蛋白共軛物會與該上皮細胞結合。視存在融合蛋白/蛋白共軛物中之毒素或毒性化合物類型而定,該毒素或毒性化合物可破壞細胞膜。因此傷害GI道上皮細胞之完整性,而於GI道中發生損傷終將導致囓齒類動物死亡。或者,若毒素或毒性化合物係透過細胞內作用模式介導毒性作用,則已結合之融合蛋白或蛋白共軛物仰賴經由胞飲作用達成之內在化。一旦融合蛋白或蛋白共軛物進入細胞後,毒素或毒性化合物便能夠介導毒性作用,其最終導致囓齒類動物死亡。
其中第二蛋白成分為免疫原之融合蛋白,亦需要被攝入囓齒類動物細胞中。一旦存在於囓齒類動物細胞內部,即引發對抗該免疫原之免疫反應。因此若免疫原為卵或精子特異性抗原,則此導致產生防止生殖作用發生的免疫反應。融合蛋白之抗體或抗原結合片段會有利地增加被吸收入囓齒類動物(透過胞飲作用)之免疫原量,亦可作用為佐劑而因此增加引發適宜免疫反應的機會。
其中第二種蛋白或所共軛成分為激素或類激素組成之本發明融合蛋白及蛋白共軛物,同樣需要被攝入囓齒類動物細胞中。一旦存在於囓齒類動物細胞內部,該激素/類激素組成會干擾生殖作用之激素調控,而因此藉由防止生育來控制囓齒類動物。
本文所述融合蛋白及蛋白共軛物之抗體/抗原結合部份之囓齒類動物特異性,對本發明之囓齒類動物控制劑提供數項優點。對於囓齒類動物組織之高特異性意指,囓齒類動物控制劑專一地靶定一種囓齒類動物組織,而因此有助於毒性/致免性/激素性組成之攝入/活性。其次此特異性靶定意指,似乎需要較少囓齒類動物控制劑即可達有效控制,較少囓齒類動物控制劑存在環境中,以及存在環境中者對非標靶物種不具特異性,而因此似乎較不會被該物種吸收且造成傷害。
本發明之囓齒類動物控制劑可經調配呈一種組成物,其包含本發明融合蛋白或蛋白共軛物作為有效成份,與至少一種添加劑、稀釋劑及/或載體組合。適宜之添加劑包括例如,作用為對囓齒類動物之吸引物的化合物、使組成物對囓齒類動物更可口之化合物、額外囓齒類動物控制劑及作為安定或保護囓齒類動物控制劑之化合物。適宜之吸引性化合物包括食物材料,例如小麥、大麥、玉米、高粱、燕麥、稻米與粟米。用於本發明之適宜的可口增進化合物包括甜味劑(例如乙醯舒泛-K、阿力甜(alitame)、阿斯巴甜、布拉齊因(brazzein)、環己胺基磺酸鹽、糖精、蔗糖素(sucralose)、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、沙馬丁、莫尼林、異麥芽糖及異麥芽酮糖)、植物或動物油(例如玉米油、大豆油與花生油、魚油)及乾燥酵母。適宜之安定性增進/保護性化合物包括,可保護或預防囓齒類動物控制劑在由囓齒類動物消化時不會進行蛋白分解或水解之化合物,例如anatacids及可用於形成pH釋放膠囊之化合物。
適用於本發明組成物之稀釋劑與載體包括,該等與已知囓齒類動物控制劑使用作為稀釋劑與/或載體者,例如臘,及黏著劑例如纖維素醚、澱粉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、瓜爾豆膠、鹿角菜膠、明膠、刺梧桐膠、黃多醣膠、阿拉伯膠、槐樹豆膠、黃耆膠、果膠及聚丙烯酸酯。
本發明組成物除了任一前述添加劑、稀釋劑或載體外,尚可包含額外囓齒類動物控制劑,例如前文於發明背景中所述者及/或以其取代任一前述添加劑、稀釋劑或載體。尤其,本發明亦包括含一或多種本文所述新穎囓齒類動物控制劑,與至少一種第一代抗凝血劑及/或至少一種第二代抗凝血劑組合之混合物。用於本發明此方面之較佳第一代抗凝血劑包括羥基香豆素與茚烷-二酮類,其中以華法令、氯殺鼠滅、克鼠靈與殺鼠醚為特別較佳之羥基香豆素,而鼠完、敵鼠及氯鼠酮為特別較佳之茚烷-二酮類。用於本發明此方面之較佳第二代抗凝血劑包括溴敵隆、溴鼠靈、鼠得克、氟鼠靈與噻鼠靈。
本發明亦包含至少兩種如前所述之新穎囓齒類動物控制劑之混合物,以及包含此類混合物之組成物(如前所述)。例如,若囓齒類動物控制劑為一種與表現於囓齒類動物之蛋白質的胞外抗原決定基結合之抗體成分(亦即抗體成分本身為具功能性囓齒類動物控制劑),則可將此與一或多種其他囓齒類動物控制劑組合,其中該其他囓齒類動物控制劑包含抗體成分,與一或多種毒性或避孕性成分(亦即一或多種囓齒類動物控制劑為如本文所述之融合蛋白或蛋白共軛物)。於其他具體態樣中,混合物包含二或多種如本文所述之融合蛋白及/或蛋白共軛物。
於一項具體態樣中,本發明之融合蛋白係於植物中製造,且該含有經表現融合蛋白之植物材料係用作為囓齒類動物控制之誘餌。較佳地,生產融合蛋白之植物材料為能夠作用為囓齒類動物食物來源者,例如小麥、大麥、玉米、高粱、燕麥、稻米與粟米皆為適於根據本發明此方面,表現本發明融合蛋白之植物。於一項具體態樣中,特別較佳地係將融合蛋白表現於植物種子中。以此方式,可直接利用得自表現本發明融合蛋白之植物的穀物作為誘餌。
如前所述,本發明組合物(以及含有本發明融合蛋白之植物或穀物)可用作為囓齒類動物控制劑。因此於另一方面,本發明提供殺死囓齒類動物之方法,其包含將囓齒類動物控制劑放置於囓齒類動物常出沒區域,以使該囓齒類動物控制劑被囓齒類動物攝入時,可殺死該囓齒類動物。習於該項技藝人士應瞭解,本發明亦提供防止囓齒類動物生育之方法,其包含將囓齒類動物控制劑放置於囓齒類動物常出沒區域,以使該囓齒類動物控制劑被囓齒類動物攝入時,可抑制該囓齒類動物之生殖能力。
為測試本發明囓齒類動物控制劑之功效,可進行各種活體外及活體內研究。一項適宜之活體外測試為由Heylings於1991(Toxicol.Appl.Pharmacol.107:482-293)及於實施例9所描述之腸套圈分析。
用於活體內評估本發明囓齒類動物控制劑之殺囓齒類特性的代表性策略,係以下列需求為基礎:1)使用於試驗之動物數量減至最少,2)維持在少花費,3)快速產生有用的資訊,4)不排除具有前途之活性物質。
通常於實驗室進行最初測試,因為可小心地控制測試條件。使用進階式(cascade)試驗步驟。此進階方式可使活性物質能藉由使用連續性決定程序而被接受或排除。通常之試驗標的為Norway大鼠、Rattus norvegicus
及家鼠(Mus domensticus
)。Roof大鼠為另一種重要的試驗標的,但不易以實驗室品種取得,而僅在評估計畫之較晚期階段進行測試。亦可於實驗室計畫之較晚期階段,使用對抗凝血劑具抗性之囓齒類品種,以測試對抗此類動物的功效。
然後可將於實驗室測試中具有活性,且顯示有成功希望之本發明囓齒類動物控制劑於田間進行評估。進行田間試驗對抗所有存在各種自然環境中的重要有害囓齒類動物品種。
習於該項技藝人士可參照容易取得,且針對殺囓齒類動物劑於實驗室中(EPPO/OEPP.1999.用於評估殺囓齒類動物劑及殺囓齒類動物製劑之毒性與可接受度;OEPP/EPPO PP 1/113(2):89-101)及於田間(EPPO/OEPP.1999.對於有效評估植物保護產品之指導方針:對抗synanthropic囓齒類Mus musculus
、Rattus norvegicus
、R.rattus
之田間試驗;OEPP/EPPO PP 1/114(2):102-113)進行之必然測試程序所列述的指導文件。亦可取得滿足英國(不具名.2005.對於核准非農業殺有害動物劑產品殺囓齒類動物劑之有效數據要求的指南。健康與安全執行部,Bootle,英國30 pp)、歐盟(不具名.2002.為關於將生物產品行銷市場之歐盟會議與審評會的指令98/8/EC之附件VI所辯護之指導方針的技術註解。產品授權與與註冊之一般原則及實施程序)及美國的安全性管理要求之測試程序。
可於實驗室中依循以分析本發明囓齒類動物控制劑之功效的代表性漸進試驗流程可包括,口服灌食試驗、無選擇餵食試驗及選擇餵食試驗。以下進一步列述此等試驗之細節。
口服灌食:用於確定活性物質功效之初步試驗包含,將活性物質(攜帶於惰性液體例如聚乙二醇中)使用管飼法直接遞送至測試個體之胃部。以此方式可遞送確實的劑量,以測定致死劑量統計百分比例。該試驗提供關於活性物質於標的物種胃腸內之條件中仍保持活性的能力,及關於其運送通過胃腸膜之資訊。該試驗亦提供關於活性物質實際毒性之資訊。
無選擇餵食試驗:實際上所有市售殺囓齒類動物劑皆以經調配之誘餌呈現。下一階段試驗涉及製備含有活性物質(於此係指本發明之囓齒類動物控制劑)的誘餌。首先進行“無選擇”試驗(其中僅將實驗誘餌呈現予各籠測試標的動物),以確定活性物質在以可食誘餌形式遞送時是否具活性。將測試誘餌於正常下無限量供食。除了類似於口服灌食試驗所或得之資訊外,無選擇餵食試驗亦提供關於活性物質可藉由標的物種之消化過程而從誘餌移出的能力之資訊。
選擇餵食試驗:為能夠受存在經調配誘餌中之活性物質控制,囓齒類動物必須在存在替代天然食物下,消耗足夠量誘餌以獲得致死劑量。因此,活性物質(亦即本發明之囓齒類動物控制劑)之可口性為評估的一重要層面。進行選擇試驗,其中係將所測量濃度之活性物質添加至誘餌基材。然後使個別囚禁之測試標的對含有活性物質之誘餌與不含活性物質之相同誘餌有選擇。進行一系列此類試驗,以確定活性物質會被測試標的偵測到之濃度。正常,係藉由對含有活性物質之誘餌產生厭惡而證明此類偵測。評估之一項重要考量為,被測試標的偵測到(且產生明顯厭惡)之濃度,較以測試誘餌遞送致死劑量所需之濃度低。
針對於商業調配物研發期間所製得之實驗誘餌,進行進一步選擇試驗。此等選擇試驗涉及實驗調配物與“挑戰飲食”之呈現。組成挑戰飲食使其呈現取代實驗調配物之理論上可口的替代品。用於此試驗之代表性“挑戰飲食”為“EPA穀粉”。此為一種包含固定量燕麥、玉米粒、粗麵粉、糖、與油之調配物。正常實施下,其所消耗之實驗調配物最少為組合型挑戰飲食之30%,且由測試標的消耗之實驗調配物應被認為供田間試驗之有效候選者。
在實驗室測試後,可於田間環境試驗有效性。囓齒類動物具有複雜且高度適應之習性,其僅在自然狀況下完全呈現出來。因此,可進行田間試驗以分析殺囓齒類動物劑活性物質與所調配產品於天間條件下之有效性。正常地,係於各種於其中可能施予實際囓齒類動物控制處理之自然環境中,完成對抗多種標靶物種的田間試驗。
田間試驗可於產品研發之早期階段,使用實驗調配物(非欲用於商品化)進行,以研究當其以含有活性物質之代表性誘餌呈現時,在標靶囓齒類物種中的行為過程。
亦可於後續針對商業誘餌產品進行田間試驗,以證明其於實際狀況下的功效。
本發明之各方面及聚體實施態樣,將以實施例之方式更詳細例舉說明。應了解可在不偏離本發明範圍下進行細節之修改。
為免除疑慮,於本申請案內文中所引用之參考文獻、專利申請案或專利案,係以該引用文獻之全文納入本文作為參考。
藉由文獻與生物資訊管道鑑定得存在於囓齒類胃腸上皮細胞上之可能蛋白標靶物。基於下列判斷標準確定出位於此等蛋白中之囓齒類動物特異性肽抗原決定基(RSPE):小鼠與大鼠序列之間具有高度序列同一性(較佳地介於80至100%同一性),而囓齒類動物與人類之間具有低序列同一性(較佳地介於0至40%同一性),且使用BLAST排列比對與其他物種無顯著符合;彼等之親水性分布(為位於表面可能性之指標);撓性與二級結構之預測。用於預測親水性、撓性與二級結構之比對,係由DNAstar與Vector NT1套裝軟體中之程式所提供。
一旦已確定得適宜之RSPE後,使用Fmoc固相合成法合成肽類,並經純化至純度大約為90%。已合成得列示於表3中之肽類。
若適宜,將N-端半胱胺酸加至序列以使能與載體蛋白進行共軛。或者(且若適當),合成得具有N-端胺基酸保持未封阻之序列,以使能與載體蛋白進行共軛。當不需要進行共軛時,藉由醯化作用將N-端胺基酸封阻。此外將C-端胺基酸以醯胺基封阻。
使用異雙官能性交聯劑m-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯,將含有N-端半胱胺酸殘基之肽類與BSA偶合。偶合作用係經由位於BSA之賴胺酸殘基上的一級胺,與位於該肽之半胱胺酸上的硫氫基,以如Kitagowa&Aikawa,生物化學期刊Vol 79:pp233-236(1976)所述之方法達成。
於0.2M磷酸鈉,pH 7.0中製備得25mg/ml之BSA(Sigma,Poole,多塞特郡)溶液,及於二甲基甲醯胺(Sigma)中製得25mg/ml之MBS(Perbio,契斯郡)溶液。將30μl MBS溶液伴隨混合逐滴加至1ml BSA溶液中,並於室溫下培育於黑暗中達45分鐘。然後將經活化之BSA溶液向下通過已預先以0.2M磷酸鈉,pH 7.0平衡之PD10凝膠過濾管柱(GE HEALTHCARE,布金漢郡)。藉由於280nm下之吸光值確定含有BSA之流份,並將其匯集。將2mg肽類溶解於1ml 50mM磷酸鈉,pH 7.5中。將足量經活化之BSA溶液加至該肽類,而達到30:1莫耳比之肽:BSA。將此培育於室溫下4小時,然後伴隨攪拌於4℃下培育於黑暗中過夜。將經共軛之肽類儲放於-20℃。
使用2-步驟戊二醛方法將於N-端含有賴胺酸或一級胺之肽類與BSA偶合。偶合作用係於BSA與肽類中之一級胺基間,基於生物共軛技術,學院出版1996,pp 583-584所述之方法達成。
於0.1M磷酸鈉,0.15M氯化鈉pH 6.8中製備得10mg/ml之BSA溶液。將戊二醛(Sigma)加入使最終濃度為1.25%,並將混合物伴隨混合於室溫下培育12小時。將經活化之BSA溶液向下通過已預先以PBS平衡之PD10凝膠過濾管柱。藉由於280nm下之吸光值確定含有BSA之流份,並將其匯集。將2mg肽類溶解於1ml 0.5M碳酸鈉,pH 9.5中,並將足量經活化之BSA溶液加至該肽類,而達到至少10:1莫耳比之肽:BSA。將混合物於4℃下培育過夜。藉由添加40μl之1M乙醇胺(Sigma)將過多之具反應性部位封阻。將經共軛之肽類儲放於-20℃。
使用如實施例1中已合成得且共軛至BSA之肽,產生與表現於囓齒類動物之蛋白的胞外抗原決定基結合之抗體。
使用紐西蘭白兔製造多株抗體。將兔子以100μg蛋白質經皮下投藥進行致免疫,於第一劑使用弗氏完全佐劑(Sigma)。接著於第28、56及84天,以包含於弗氏不完全佐劑(Sigma)之100μg蛋白質經皮下投藥進行三次促升。於開始致免疫之前先採收前血,於第三次劑量後10-14天採集測試血液,並於第四次劑量後10-14天採集收穫血液。
對於各下列RSPE,致免疫兩隻兔子並產生多株抗體血清:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15。
對於各下列RSPE,致免疫一隻兔子:SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34。
使用小鼠與倉鼠製造單株抗體,且將其以20μg蛋白質經皮下投藥進行致免疫,第一劑係包含於弗氏完全佐劑(Sigma)。接著於第28及56天經皮下投藥施予20μg蛋白質進行致免疫。於第28天劑量係於弗氏不完全佐劑投藥,而於第56天係於磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中投藥。於第3劑後7天採集測試血液。在第三次劑量後至少6週後,將小鼠以存在PBS之20μg蛋白質經靜脈內投藥進行促升。於4天後採收脾臟以用於融合。
已將小鼠以各下列RSPE免疫,並產生多株抗體:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29。
使用以Kohler G.& Milstein C.自然256,495-497(1975)為基礎之方法產生單株抗體。從所採收得之脾臟以杜氏經修改伊格氏培養基(DMEM,Invitrogen,貝斯里),使用20-規格針頭沖洗出淋巴細胞。將NS0骨髓瘤細胞(歐洲細胞培養物收藏所(European Collection of Cell Culture),Porton Down,Salisbury)於37℃下於5% CO2
,培養於含有10%(v/v)胎牛血清(PAA,Yeovil,Somerset)、2mM L-谷胺醯胺、1xHT補充物及50單位/ml青霉素與50單位/ml鏈霉素(皆購自Invitrogen)之DMEM中,至密度達5×105
/ml。將得自單一脾臟之淋巴細胞(大約2×108
)與5×107
NS0骨髓瘤細胞混合。待於2000×g下離心4分鐘後,將細胞沈澱溫和地再懸浮,並藉由歷時一分鐘逐滴加入1ml之50%(w/v)聚乙二醇(1500)存於75mM HEPES緩衝液pH8(Roche,Lewes,東薩西克斯郡)進行融合。歷時數分鐘緩慢加入補充以H1選殖補充物(Roche)之完全培養基(如上所述),達最終體積為50ml。將所成之融合溶液以100μl/孔,於37℃下於5% CO2
,培養於五個滅菌微量培養細胞培養盤(Nunclon,Fisher,Loughborough,萊斯特郡)中4小時,之後添加100μl/孔含有4%(v/v)1×HAT選擇培養基(Invitrogen)之完全培養基。於融合後十四天,使用以Engvall E.與Perlmann P.免疫化學8,871-874(1971);Harlow E.等人,抗體-實驗室手冊,冷泉港實驗室,1988 pp182-183所述方法為基礎之抗體捕獲酵素-聯結免疫吸附分析(ELISA),分析培養物上清液是否存在肽特異性抗體。通過至少兩回以限制稀釋及隨後之再分析的選殖,收集經選擇出的融合瘤,以確保該等融合瘤之純株性與安定性。於由10%(v/v)DMSO(Sigma,Poole,多塞特郡)存在於胎牛血清所組成之冷凍培養基製備冷凍融合瘤庫,冷凍速率為1℃/分鐘進行80分鐘,隨後儲放於液態氮中。藉由放大組織培養製造所選擇之單株抗體。
已使用得自經SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6與SEQ ID NO:27致免疫之小鼠脾臟的淋巴細胞獲得融合瘤融合體。已分離、生長並冷凍4株生產對抗源自小鼠GLUT7之RSPE(SEQ ID NO:11)的抗體之安定單株細胞系。已分離得4株生產抗源自大鼠CFTR之RSPE(SEQ ID NO:5)的抗體之安定單株細胞系。已分離、生長並冷凍七株生產抗源自大鼠RepT1之RSPE(SEQ ID NO:1)的抗體之安定單株細胞系。
藉由化學合成製備得供篩檢原初Llama glama
VH H
M13絲狀噬菌體展現所有組成成份之RSPE,並接著如於前述實施例1.2共軛至BSA。依照已建立之程序,例如該等由McCafferty & Johnson(於“肽類與蛋白質之噬菌體展現”,pg 98-100,Kay,Winter與McCafferty編著,1996,學院出版股份有限公司)所述者,進行噬菌體所展現之免疫結合功能域所有組成成份的篩檢。藉由塗布存在50mM碳酸氫鈉pH 9.6緩衝液濃度為100μg/ml並經過夜培育,而將RSPE::BSA共軛物黏附於Maxisorb免疫管(Nunc)之內表面上。藉由於PBS中清洗三次而將游離態RSPE::BSA去除,然後添加PBS/2%脫脂牛奶蛋白(PBSM),及於37℃下培育兩小時而封阻表面。在將該免疫管以所需之RSPE敏化後,藉由添加101 2
至101 3
個噬菌體存在4ml PBSM並於室溫培育兩小時下進行“淘選”。於此步驟後,將該管內容物抽乾,並將管使用PBS/0.1% Tween 20清洗二十次,隨後再以PBS清洗二十次。然後藉由添加1ml 100mM甘胺酸pH 3.0達10分鐘,將與免疫管結合之噬菌體(代表大多數為RSPE::BSA特異性VH H
結合者)溶析出。將溶液轉換至含有0.5ml 1M Tris-HCl pH 7.4之新管中進行中和。然後將溶析出之噬菌體用於藉由混合及培養於37℃下30分鐘,以感染對數期TG1大腸桿菌細胞,接著將其塗散於24×24cm 2×TY/2%葡萄糖/100μg/ml苄青霉素平板(Nunc BioAssay培養皿)上,然後於37℃培育過夜。次日將平板上含有對RSPE::BSA共軛物具有結合特異性之序列的細胞(其代表已富集、增加之噬菌粒選殖株族群)刮出。為進一步從此族群篩檢/選擇出展現對RSPE具高度親合性之純株,遂藉由添加輔助噬菌體,例如M13-KO7獲VCS-M13“拯救”噬菌體顆粒。簡言之,係將得自最後步驟之細胞接種入存在250ml錐形燒瓶之50ml 2×TY/2%葡萄糖/100μg/ml苄青霉素中,並培育於30℃下直到OD6 0 0
值達約0.5。然後將輔助噬菌體加入以使輔助噬菌體對細菌之比例為1:1(代表性地2×101 0
pfu/50ml),典型為2 x 101 0
pfu/50ml,隨後於37℃下培育一小時。接著,於3000g下離心10分鐘將細胞沈降,丟棄上清液,將細胞沈澱再懸浮並用於接種至2升燒瓶:500ml 2×TY/100μg/ml苄青霉素/50μg/ml肯納霉素(不含葡萄糖)之新鮮培養基中。將此培養物於30℃下伴隨劇烈搖晃培育過夜,然後藉由於4℃下添加100ml 20% PEG/2.5M NaCl達30分鐘採收噬菌體-VH H
顆粒。然後於4000g下離心10分鐘以收集沈澱之噬菌體,並再懸浮於5ml PBS中預備用於下回篩檢。可藉由減低用於在各回合淘選時敏化免疫管之RSPE::BSA共軛物量,增進選擇方法之有效性。此外,可調整選擇方法而包括偏向選擇其呈現特定物理-化學特徵(例如蛋白溶解安定性)之噬菌體-VH H
顆粒的步驟。例如,已知M13噬菌體對由某些蛋白分解酵素,例如胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶進行之蛋白分解作用具有抗性(Schwind等人,1992,Eur.J.Biochem.210:431-436),且此特性可被利用於噬菌體展現,供選擇結構上安定之變異體(Kristensen & Winter,1998,折疊與設計,3:321-328)。
為選擇出呈現對於RSPE之所希望親和性與選擇性,遂挑揀生長於2×TY/2%葡萄糖/100μg/ml苄青霉素平板上之獨特菌落(從經於淘選步驟後所溶析出之噬菌體感染的TG1大腸桿菌經系列稀釋之樣本獲得),並排列於含有每孔150μl之2×TY/2%葡萄糖/100μg/ml苄青霉素的96孔培養區塊中,伴隨震盪培育於30℃下直到OD6 0 0
值達約0.5。然後將輔助噬菌體加入以使輔助噬菌體對細菌之比例為1:1,隨後伴隨震盪再於37℃下培育一小時。於3000g下離心使細胞沈降,然後去除培養基,並置換以1.5ml 2×TY/100μg/ml苄青霉素/50μg/ml肯納霉素(不含葡萄糖),接著於30℃下伴隨劇烈搖晃培育過夜。然後使用20% PEG/2.5M NaCl於4℃下達30分鐘,隨後於4000g下離心並再懸浮於PBS中,而從各孔採收噬菌體顆粒。將此等純株噬菌體樣本用於使用抗-噬菌體抗體-HRP複合物,以測定對於固定化RSPE之相對結合親和力的ELISA分析,或者用於藉由將非-琥珀(amber)抑制子大腸桿菌宿主(例如HB2151菌株)以該噬菌體感染,而表現可溶性VH H
。然後可利用IPTG誘導96孔培養物及表現可溶性、分泌型VH H
之表現,並將粗製培養基(含有可溶性VH H
)或經IMAC-純化(藉由所包含六個組胺酸標籤之效用)之VH H
,用於ELISA分析以測定與固定化RSPE之結合。適用於此方面之偵測抗體為9E10-HRP(Roche Molecular Biochemicals),其可偵測存在可溶性VH H
蛋白上之c-Myc標籤。
起初以下列呈RSPE::BSA共軛物之RSPE對如上述之原初Camelid噬菌體展現文庫進行篩檢:具有SEQ ID NO:5之RSPE、具有SEQ ID NO:6之RSPE、具有SEQ ID NO:11之RSPE及具有SEQ ID NO:27之RSPE。然後將從此項篩檢鑑定得之VH H
純株用於製造本文所述之融合蛋白及抗體共軛物。
為例舉產生單鏈抗體(更特別地是scFv)之方法,使用得自融合瘤HB-8766(美國模式培養物收藏所(American Type Culture Collection))之SV63小鼠單株抗體(MAb)(辨識源自由某些結腸直腸腫瘤表現之人類鹼性磷酸酶的細胞表面抗原決定基)作為模式細胞-表面抗原結合蛋白。為從此IgG1 MAb衍生得scFv分子,便使用RT-PCR將Fv序列從該融合瘤選殖出,其中囓齒類Fv及恆定功能域-特異性引子組係如文獻中所述(例如Dubel等人1994,免疫學方法期刊175:89-95;McCafferty & Johnson於“肽類與蛋白質之噬菌體展現”,pg 95,Kay,Winter與McCafferty編著,1996,學院出版股份有限公司),對於該文獻中所特定之各個別引子加以修飾。用於本實施例之引子序列係列於下表4。
將融合瘤細胞(107
)離心並再懸浮於1ml之TrizolT M
及200μl氯仿中。將樣本於室溫下劇烈混合15分鐘,然後於4℃於12000g下離心15分鐘。將水層移除並加入等量異丙醇。將樣本於4℃下於12,000rpm離心15分鐘沈澱RNA,將其於70%乙醇漂洗然後再懸浮於不含RNase之水中。
藉由以不含RNase之DNase於含有5μl RNA、0.1U不含RNase之DNase I(Ambion)與1U RNasin之反應中處理,將微量基因組DNA從RNA去除。將混合物至於37℃下30分鐘,隨後培育於80℃下5分鐘。
然後將經DNase I處理之RNA用於在製造廠商標準條件(1.5μl RNA、50μl總反應體積、寡-dT引子)下進行之Accuscript(Stratagene)反應而製得第一股cDNA。
使用1μl經寡-dT引子引發,衍生自SV63 RNA之第一股cDNA作為模板,及寡核苷酸RoPro-9(SEQ ID NO:37)與RoPro-28(SEQ ID NO:38)完成PCR反應。
使用Roche GC-RICH PCR系統,其含有濃度為0.5M之GC-RICH解析緩衝液,反應總體積為25μl。
反應係於Stratagene Robocycler中完成,其循環條件如下:
從此反應或得之PCR產物的產率非常低。因此,進行第二次PCR反應以進一步擴增所製得之分子。
使用2μl得自上述反應之PCR產物作為模板,設定兩種使用下列寡核苷酸引子對之反應:i)RoPro-6(SEQ ID NO:39,特異性較RoPro-9(SEQ ID NO:37)低與RoPro-25(SEQ ID NO:40),3’嵌套)及ii)RoPro-9(SEQ ID NO:37)與RoPro-28(SEQ ID NO:38)。如上所述完成PCR。
當上述反應之樣本於1%瓊脂糖/TBE凝膠上進行電泳,並以溴化乙錠染色時,該二PCR皆含有大約400 bp之DNA片段。使用Geneclean Spin套組將從上述反應2產生之PCR產物分離與純化,並選殖入pCRTOPO BluntII(Invitrogen)中。
藉由DNA定序完全特徵化八個TOPO選殖株,此等其中一純株具有以BLASTP分析UniProt/IPI資料庫時所確定之代表性(但獨特的)VH
序列之特徵。
使用2μl經寡-dT引子引發,衍生自SV63 RNA之第一股cDNA作為模板,及寡核苷酸RoPro-3(SEQ ID NO:41)與RoPro-4(SEQ ID NO:42)完成PCR反應。使用StratagenePfu Ultra DNA聚合酶於反應體積為50μl,並於MJ Research Dyad熱循環器中,使用下列循環條件完成反應:95℃,1分鐘然後[95℃,1分鐘;52℃,1分鐘;68℃,3分鐘]進行40次循環,接著最終延長68℃,10分鐘。
將上述反應之樣本於1%瓊脂糖/TBE凝膠上進行分析,並以溴化乙錠染色,觀察到大約350 bp之片段。使用QiaQuick(Qiagene)凝膠溶析將此PCR產物分離與純化,並選殖入pCRTOPO BluntII(Invitrogen)中。
藉由DNA定序完全特徵化五個TOPO選殖株,此等純株其中四株相同,且具有以BLASTP分析UniProt/IPI資料庫時所確定之代表性(但獨特的)VL
序列之特徵。五選殖株其中一株含有與MOPC21卡巴(κ)輕鏈可變序列(Swissprot:P01634)相同的序列,其為從用於產生融合瘤之骨髓瘤融合夥伴擴增得的不相關序列。
使用PCR-重疊延展(亦已知稱作“剪接-重疊延展”;SOE)產生兩種方向之SV63 scFv:(i)VH
-[Gly4
Ser3
]3
連接肽-VL
與(ii)VL
-[Gly4
Ser3
]3
連接肽-VH
,各含有N-端PelB引導序列及C-端FLAG與六-組胺酸標籤,存在大腸桿菌表現載體pDGF(衍生自NEB載體pMALc-2,pDGF含有pMALc-2之所有特性,除了編碼麥芽糖結合蛋白之序列以外,其已被切除)與pIMS147(Hayhurst & Harris,1999,蛋白質表現與純化15:336-343)中。下表5列示所使用之寡核苷酸引子及其目的。
為產生VL
-[Gly4
Ser3
]3
連接肽-VH
scFv序列,以兩步驟進行PCR反應。第一步驟係由兩種使用i)scFv寡1與2(分別為SEQ ID NO:43與44)及pCRTOPOBluntII SV63 VL
純株作為模板,擴增該構築體之5’半部;ii)scFv寡3與4(分別為SEQ ID NO:45與46)及pCRTOPOBluntII SV63 VH
純株作為模板,擴增該構築體之3’半部的反應所組成。第二步驟使用SOE以藉由黏合得自(i)與(ii)之兩片段的互補3’與5’末端(分別地)將其連結,並藉由添加聚合酶而延展至全長,並接著使用scFv寡1與4(分別為SEQ ID NO:43與46)進行擴增。
以相同之製程產生生VH
-[Gly4
Ser3
]3
連接肽-VL
scFv序列。第一步驟由兩種使用i)scFv寡5與6(分別為SEQ ID NO:47與48)及pCRTOPOBluntII SV63 VH
純株作為模板,擴增該構築體之5’半部;ii)scFv寡7與8(分別為SEQ ID NO:49與50)及pCRTOPOBluntII SV63 VL
純株作為模板,擴增該構築體之3’半部的反應所組成。第二步驟使用SOE以藉由黏合得自(i)與(ii)之兩片段的互補3’與5’末端(分別地)將其連結,並藉由添加聚合酶而延展至全長,並接著使用scFv寡5與8(分別為SEQ ID NO:47與50)進行擴增。
使用Roche GC RICH套組及製造廠商之條件,以濃度為0.5M之GC-RICH解析緩衝液,反應總體積為25μl完成第一步驟反應。反應係於Stratagene Robocycler中進行,其循環條件如下:
將上述反應之樣本於1%瓊脂糖/TBE凝膠上進行分析,並以溴化乙錠染色,而此等結果顯示已製得所有四種所預期之DNA片段。
藉由將適當片段對,以大約相等量混合於Roche GC RICH套組反應中,使用製造廠商之條件,以濃度為0.5M之GC-RICH解析緩衝液,反應總體積為25μl完成第二步驟反應。反應係使用下列2步驟循環條件進行:-循環1-2
94℃ 30秒65℃ 30秒72℃ 60秒
此反應作用為製造全長融合體之引子延展反應。然後將寡核苷酸引子加入,使用下列循環條件進行PCR擴增全長分子。
當上述SOE反應之樣本於1%瓊脂糖/TBE凝膠上進行電泳,並以溴化乙錠染色時,該二反應皆顯示含有大約750 bp(所預期大小)之DNA片段。
使用Geneclean Spin套組將SOE產物分離與純化,並選殖入pCRTOPO BluntII(Invitrogen)中。對於各SOE產物(VH
->VL
及VL
->VH
)藉由DNA定序完全特徵化一個TOPO選殖株。然後藉由使用Nde
I與Eco
RI將scFv序列從pCRTOPOBluntII切出,並接著黏接至經類似方法製備得之pDGF載體骨架DNA中,而產生pDGF表現構築體(pDGF-SV63-VHVL及pDGF-SV63-VLVH)。亦藉由使用NcoI與EcoRI將scFv序列從pCRTOPOBluntII切出,並接著黏接至經類似方法製備得之pIMS147載體骨架DNA中。將黏接反應物依照製造商指示轉型入大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen),並鑑定轉型株。藉由DNA序列分析鑑定正確的pIMS147-SV63 scFv與pDGF-SV63 scFv,以確認讀框之維持及序列之正確性。
依照由Charlton(於“抗體工程:方法與提案”pg 245-254,B.K.C.Lo編著,Humana出版,2004)所述之指示,測試pIMSSV63-scFv大腸桿菌TOP10選殖株之可溶性scFv蛋白的表現。簡言之,係使用所選擇純株之過夜培養物接種至500ml 2TY(amp/glu)(1升含16g Bacto-蛋白腖/5g酵母抽出物/5g NaCl/2%(w/v)葡萄糖,pH 7.5+100μg/ml苄青霉素)於2.51燒瓶中,然後將其於37℃及250rpm下培育直到OD6 0 0
值達約0.8。此時,藉由於3000g下離心採收細胞,並轉換至500ml新鮮2TY(amp/scu)(1升含16g Bacto-蛋白腖/5g酵母抽出物/5g NaCl/0.4M蔗糖,pH 7.5+100μg/ml苄青霉素)於2.51燒瓶中。然後於30℃及250rpm下培育1小時,之後添加IPTG達最終濃度為1mM。接著再進行培育16小時,採收細胞與培養基,並使用SDS-PAGE與Western轉漬程序分析是否有重組scFv存在。Western分析使用抗-FLAG M2-HRP抗體(Sigma)與BM POD呈色受質溶液(Roche)組合,指示對於兩種方向之scFv,在可溶性細胞溶解產物及培養基樣本中,重組蛋白皆有良好的表現程度(所預期分子量大小為約30kDa)。
使用IMAC管柱層析術純化重組scFv蛋白,並藉由於使用Caco2Bbe1細胞(CRL-2102,美國模式培養物收藏所)之免疫細胞化學分析中,和親本SV63 MAb競爭與抗原之結合而測試其功能性。觀察到兩種方向之scFv皆可抑制親本SV63 MAb與細胞表面之結合,表示在經設計製得之scFv中仍維持抗原結合表面。
為從多株血清中純化得肽-特異性抗體,遂製造肽親和性管柱。視肽類之N-端殘基而定,使用兩種管柱製備方法之其一。此等方法使用SulfoLink或AminoLink偶合凝膠作為親和性基材。
SulfoLink偶合凝膠(Perbio)係使含有硫氫基之肽類能共價固定至瓊脂糖凝膠撐體上,以供用於親和性純化製程。使用由製造商所提供及列述於下文之程序,將RSPE與此凝膠偶合。
將10ml SulfoLink凝膠漿液(5ml凝膠底層體積)平衡至室溫。將凝膠漿液倒入管柱,並以20ml偶合緩衝液(50mM Tris,5mM EDTA pH8.5)(Sigma)平衡。將1mg合成肽溶解於5ml偶合緩衝液中並將其加至管柱。將管柱密封並伴隨倒轉混合培育於室溫下15分鐘,然後將凝膠靜置沈降達30分鐘。將過量之緩衝液倒乾,之後將管柱以15ml偶合緩衝液沖洗。將非特異性結合部位以5ml溶於偶合緩衝液之50mM L-半胱胺酸鹽酸鹽(Sigma)封阻。將管柱密封,並如上所述於有或無混合下進行培育。將管柱以30ml 1M氯化鈉(Sigma)沖洗,並藉由加入10ml含有0.05%疊氮化鈉(Sigma)之脫氣PBS pH7.2製備用於儲存。將經偶合之管柱儲放於4℃。
AminoLink偶合凝膠(Perbio)係經由一級胺使肽類能共價固定至瓊脂糖凝膠撐體上,以供用於親和性純化製程。使用由製造商所提供及列述於下文之程序,將RSPE與此凝膠偶合。
將10ml AminoLink凝膠漿液(5ml凝膠底層體積)平衡至室溫。將凝膠漿液倒入管柱,並以20ml偶合緩衝液(0.1M磷酸鈉,pH7.5,0.05%疊氮化鈉)平衡。將1mg合成肽溶解於5ml偶合緩衝液中。然後將250μl於0.01M氫氧化鈉(Sigma)中製得之1M氰基硼氫化鈉加至該肽類溶液,將其倒入管柱中。將管柱密封並伴隨倒轉混合於室溫下培育6小時。令管柱靜置沈降然後將上清液移除。將5ml 1M Tris-HCl pH7.4(Sigma)及250μl於0.01M氫氧化鈉(Sigma)中製得之1M氰基硼氫化鈉加入。將管柱密封,並伴隨倒轉混合於室溫下培育30分鐘。將管柱以30ml 1M氯化鈉(Sigma)沖洗,並藉由加入10ml含有0.05%疊氮化鈉之脫氣PBS製備用於儲存。將經偶合之管柱儲放於4℃。
將多株兔子血清於2500×g下離心10分鐘,使用0.45微米濾膜過濾,然後以PBS 1:1稀釋。令肽親和性管柱達室溫,然後以4倍管柱體積之PBS平衡。將所製備得之血清溶液加至管柱,並重複將流通液再次加樣至管柱。將管柱以6倍管柱體積之PBS沖洗。藉由將0.1M甘胺酸-HCl pH3.0(Sigma)加至管柱,將肽-特異性抗體溶析出,並收集1ml流份於含有0.1ml 1M Tris-HCl pH8.0之管中。然後藉由於280nm下之吸光值確定含有蛋白質之流份,並將其匯集。使用具有10,000分子量截斷之Slide-a-Lyser卡匣(Perbio),將經純化之抗體透析入PBS中,並儲放於-20℃。同時,以3倍管柱體積之0.1M甘胺酸-HCl pH2.5,隨後再以8倍管柱體積之PBS將管柱進行再生。
從培養物上清液,藉由使用HiTrap蛋白G HP 1ml管柱(GE HEALTHCARE)之蛋白G親和性層析術,純化得單株IgG。將培養物上清液於2500×g下離心10分鐘,並於使用前先使用0.45微米濾膜過濾。最大流速為1ml/分鐘流通。將管柱以10倍管柱體積之PBS pH7平衡,並將樣本加入。將管柱以10倍管柱體積之PBS沖洗。藉由將0.1M甘胺酸-HCl pH3.0(Sigma)加至管柱而將抗體溶析出,並收集1ml流份於含有0.1ml 1M Tris-HCl pH8.0之管中。然後藉由於280nm下之吸光值確定含有蛋白質之流份,並將其匯集。使用具有10,000分子量截斷之Slide-a-Lyser卡匣(Perbio),將經純化之抗體透析入PBS中,並儲放於-20℃。同時,將管柱以10倍管柱體積之0.1M甘胺酸-HCl pH2.5進行再生,隨後再以10倍管柱體積之PBS沖洗,並於4℃下儲放於20%乙醇中。
將得自經肽共軛物致免疫之兔子、小鼠或倉鼠的血清,以酵素-聯結免疫吸附分析(ELISA)進行分析,基於由Engvall E.與Perlmann P.免疫化學8,871-874(1971);Harlow E.等人,抗體-實驗室手冊,冷泉港實驗室,1988 pp182-183所述方法,測定抗體反應之相對量值。
濃度為2 μ g/ml溶於35mM碳酸氫鈉,15mM碳酸鈉pH9.5之肽溶液,以100 μ l/孔加至96-孔微量滴定平盤中,並於4℃下培育至少4小時。將平盤以PBS,0.05% Tween 20(PBST)清洗三次。將剩餘之結合部位以200 μ l/孔含有1%脫脂奶粉(Marvel,Premier食品公司,聖亞邦斯)之PBS,於室溫下進行封阻30分鐘。待經上述清洗後,將PBST以100 μ l/孔加至該平盤。將最初血清稀釋加至第1欄之重複兩孔,然後以兩倍系列稀釋依序加至該平盤,而留下第12欄僅含有PBST。將平盤培育於室溫下2小時。再經如上述清洗後,將平盤與經於PBST稀釋至1/10,000之適當抗-物種共軛抗體培育於室溫下1小時。兔子血清樣本係與山羊抗-兔子IgG辣根過氧化酶(HRP)共軛物(Sigma)培育;倉鼠血清與兔子抗-Syrian倉鼠IgG HRP共軛物(Stratec,Soham,劍橋郡)培育;而小鼠血清樣本係與兔子抗-小鼠IgG HRP共軛物(Sigma)及山羊抗-小鼠IgG Fc片段HRP共軛物(Sigma)培育。藉由將一錠含有1mg 3,3',5,5'四甲基聯苯胺二氫氯化物(Sigma)之藥片稀釋於10ml 24mM檸檬酸、60mM磷酸鈉pH 5.0中,並添加2 μ l之30%過氧化氫溶液(Sigma),而製備得受質溶液。待進一步清洗後,將現配受質溶液以100 μ l/孔加至平盤,並於暗室於室溫下靜置30分鐘。藉由添加50 μ l/孔之3M硫酸終止呈色反應。然後於450nm下使用微量滴定平盤記讀機,讀取於450nm下之光學密度。
藉由如上實施例4.1所述之肽ELISA,分析採自第三次劑量後經源自以下列標靶蛋白:大鼠寡肽轉運蛋白PepT1、大鼠CD155(PVR-脊髓灰質炎病毒報導子;Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GTR5、大鼠OATP-B、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL、與大鼠SCAB之RSPE(參見上述實施例2.1)致免疫的兔子之血清。藉由對其致免肽類之滴定,分析得自各兔子之測試與前-免疫血清。藉由計算50%結合力價值(欲使最大訊號減至50%所需之稀釋度),評估免疫反應。結果歸納列於下表6。
如實施例3.2所述從各測試血液親和性純化出血清,然後以前述之ELISA進行測試。結果列於下表7。
亦將得自經源自大鼠CNT2核苷轉運蛋白之RSPE致免疫的兔子之收穫血液進行親和性純化及以ELISA分析。得自兔子1之收穫血液係溶析於36.5ml,濃度為0.86 mg/ml,且經分析其50%結合力價為1/47,000。得自兔子2之收穫血液係溶析於27.5ml,濃度為0.57 mg/ml,且經分析其50%結合力價為1/44,000。
使用蛋白A管柱(Amersham)進一步純化經親和性純化之得自兔子1的多株抗體,對磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)透析並藉由ELISA進行測試。此產生13ml經進一步純化之抗CNT2所衍生RSPE(SEQ ID NO:6)的多株IgG,其具有濃度為1.97 mg/ml,及50%結合力價為1/90,000。
藉由如上實施例4.1所述之肽ELISA,分析採自第三次劑量後經源自下列標靶蛋白之RSPE(參見上述實施例2.2)致免疫的小鼠血清:大鼠寡肽轉運蛋白PepT1、大鼠CD155(PVR-脊髓灰質炎病毒;Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GCC、大鼠PLB與大鼠LPH。藉由對其致免肽類之滴定,分析得自各小鼠之測試血清。藉由計算50%結合力價值(欲使最大訊號減至50%所需之稀釋度),分析免疫反應。結果歸納列於下表8。
將40ml得自各別七株製造對抗具有SEQ ID NO 1之RSPE的抗體之陽性單株細胞系(參見以上實施例2.3)之培養上清液,以如於實施例3.2所述進行親和性純化,然後藉由如上述實施例4.1之ELISA進行測試。藉由對其致免肽類(SEQ ID NO 1)之滴定,分析經純化得之單株抗體。藉由計算50%結合力價值(欲使最大訊號減至50%所需之稀釋度)分析免疫反應。結果歸納列於下表9。
顯然,融合瘤細胞系1645.142.002、1644.112.040與1647.372.245製造可辨識具有SEQ ID NO 1之RSPE(其衍生自大鼠PepT1)的單株抗體。
將40ml得自各別四株製造對抗具有SEQ ID NO 11之RSPE的抗體之陽性單株細胞系(參見以上實施例2.3)之培養上清液,以如於實施例3.2所述進行親和性純化,然後藉由如上述實施例4.1之ELISA進行測試。藉由對其致免肽類(SEQ ID NO 11)之滴定,分析經純化得之單株抗體。藉由計算50%結合力價值(欲使最大訊號減至50%所需之稀釋度)分析免疫反應。對於該四株抗-GLUT7單株抗體其中二種的結果歸納列於下表10。
將大鼠胃腸組織置於液態氮中急速冷凍,並於使用前儲放於-80℃下。所有組織皆於設定為-20℃之低溫恆溫器上切片,並將組織放置於帶正電荷之玻片上,於冰冷丙酮中固定10分鐘並令其風乾。將玻片儲放於-20℃,並於製成切片1個月內使用。於開始免疫組織化學之前,令所有玻片溫熱至室溫。然後將其加樣至Sequenza上以進行手動IHC。藉由於室溫下施予過氧化酶阻斷劑(附於Dako Envision套組中)6分鐘,以封阻所有玻片之內在過氧化酶。然後將玻片於含有tween 20(0.1%)之TRIS-緩衝食鹽水(10mM)中漂洗5分鐘。藉由添加5%牛奶蛋白(MarvelT M
)於室溫下30分鐘而阻斷非特異性蛋白。將玻片於TBST中漂洗5分鐘。施予一級抗體(製備於含有1% MarvelT M
之TBST,稀釋度列於表中),並將玻片於室溫下培育1小時。然後將玻片於TBST中漂洗(2×5分鐘)。施予Envision兔子聚合物,並於玻片上於室溫下培育30分鐘。將玻片於TBST中漂洗(2×5分鐘)。於室溫下施予DAB達5分鐘。將玻片於蒸餾H2
O中漂洗,經過系列乙醇與二甲苯脫水,然後架設於DPX中。
使用阻斷肽分析特異性染色。將一級抗體(於可提供最適染色之稀釋度下)與10倍過量肽於室溫下,於含有1% MarvelT M
之TBS中培育2小時,之後施於玻片上,以下程序如上所述。結果歸納列於上表11。
將編碼251胺基酸白樹素蛋白之基因(參見Nolan等人,1993,基因134:223-227)與pelB
引導序列及C-端六-組胺酸標籤一起經密碼子最適化於大腸桿菌表現,並選殖入受雜合型tac
啟動子控制下之大腸桿菌表現載體(pDGF-衍生自NEB載體pMALc-2,pDGF含有pMALc-2之所有特性,除了編碼麥芽糖結合蛋白之序列以外,其已被切除)中。將重組載體轉型入大腸桿菌株TOP10中。
藉由將經轉型之TOP10細胞生長於LB培養基,並加以於28℃下使用1mM IPTG誘導20小時而達成白樹素之表現。在採收大腸桿菌細胞後,使用French壓碎器(Constant Systems;於20,000psi下破壞)於1×PBS/30mM咪唑中將細胞破壞。將可溶性萃取物加樣至GraviTrap管柱(GE HEALTHCARE),並經15ml 1×PBS/30mM咪唑沖洗後,將白樹素溶析於1×PBS/500mM咪唑中。作為第二純化步驟,將溶析液脫鹽至20mM磷酸鈉緩衝液pH 8.0,並加樣至Resource S陽離子交換管柱,以0至1M鹽類梯度溶析。
為測定重組白樹素是否具活性(具功能性),遂將經純化之白樹素蛋白於使用T7螢光素酶DNA作為受質之蛋白轉譯抑制分析(TNT T7快速偶合轉錄/轉譯系統,Promega)中進行測試。使用環己亞醯胺作為陽性對照組。此證明經純化之重組白樹素會抑制T7螢光素酶DNA的轉譯。
將編碼464胺基酸VIP2A蛋白之基因(參見美國專利5,849,870)與C-端六-組胺酸標籤一起經密碼子最適化於大腸桿菌表現,並選殖入pET24a表現載體(Novagen)中。將重組載體轉型入大腸桿菌株BL21(DE3)。
藉由將經轉型之BL21(DE3)細胞生長於LB培養基,並加以於28℃下使用1mM IPTG誘導20小時而達成VIP2A之表現。在採收細胞後,使用如實施例5.1所述之French壓碎器將細胞破壞。將可溶性萃取物加樣至HisTrapHP管柱(GE HEALTHCARE),並經5倍管柱體積之PBS/20mM咪唑沖洗後,將VIP2A蛋白以達到500mM咪唑之梯度溶析。
可溶性萃取物及經純化得之樣本的SDS-PAGE分析,呈現位置對應經重組製得之加組胺酸-標籤VIP2A所預期大小處的條帶。
人為合成編碼228胺基酸大鼠成熟粒酶B之基因(其序列資料參見Genbank編號M34097)(DNA片段050031),並將其選殖入pCR-Script中而得質體p050031。採用嵌套式PCR(nested PCR)程序將粒酶B編碼序列導入表現載體pET32a(+)(Novagen)中。
使用引子RoPro070 petEK/rGrzB F1(SEQ ID NO:51)與RoPro067 rGrzB R(SEQ ID NO:52),從p050031以PCR擴增成熟粒酶B編碼序列,導入一段與存在pET32a(+)之融合標籤中的腸激酶部位具同源性之5'尾端。將所成之PCR產物用作為進行嵌套式PCR第二部份之模板,該部份係使用引子RoPro076 petEK/rGrzB F2(SEQ ID NO:53)與RoPro067 rGrzB R(SEQ ID NO:52)完成,而導入5'Kpn
I切位。
將最終PCR產物以KpnI/NotI消化並黏接至經同樣消化處理之pET32a(+)中,而得表現載體pET32a(+)::rGrzB。此導致源自宿主載體之N-端表現標籤與重組粒酶B編碼序列間清楚融合,因此可藉由於表現後以腸激酶處理而活化重組粒酶B。可將最終表現載體pET32a(+)::rGrzB轉型至任何適宜的大腸桿菌表現宿主(例如RosettaGami(DE3))中。
用於構築pET32a(+)::rGrzB之引子序列如下(所有引子序列皆以5'至3'表示):RoPro070 PetEK/rGrzB F1(SEQ ID NO:51)GGTACCGACGACGACGACAAGATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAGCCAC;RoPro067 rGrzB R(SEQ ID NO:52)AGCTGGCGGCCGCCTAGGAC;RoPro076 petEK/rGrzB F2(SEQ ID NO:53)AGATCTGGGTACCGACGACGACGAC。
所選擇用以達成此製程之策略,係將抗體以交聯劑SPDP(N-琥珀亞醯胺基3-[2-吡啶二硫基]丙酸酯;Pierce Chemical Co.)活化,其會與經硫醇化之毒素形成雙硫鍵聯。所使用的方法參照Hermanson,1996“生物共軛技術”(學院出版pp.509),其指出該共軛作用不會干擾毒素白樹素(30kDa)之活性。使用白樹素對於抗-CNT2多株抗體為5:1及10:1之莫耳比例,獲得最有效的反應混合物。
將1ml分裝的經蛋白A純化之兔子1多株IgG(參見實施例4.2.1,得自兔子1之收穫血液經親和性純化,然後使用蛋白A管柱純化得)使用具有10kDa截斷之centricon離心濃縮器濃縮。將所成之160 μ l於PBS 10mM EDTA pH 8製備成10mg/ml溶液。將6 μ l SPDP(3mg/ml於DMF)加至200 μ l抗體溶液中,並於室溫下培育30分鐘。將反應混合物加樣至以PBS+10mM EDTA pH 8平衡之PD10脫鹽管柱。收集全部3.5ml樣本體積,並使用centricon濃縮器濃縮,而得最終濃度為3.6mg/ml之經SPDP-處理的抗-CNT2抗體。
白樹素係得自Aczon SpA,呈一種從白樹Gelonium multiflorum
種子純化得之5mg凍乾蛋白質。起初將樣本溶解於PBS濃度達5mg/ml。將300 μ l此溶液於centricon濃縮器中濃縮,體積減至55 μ l。然後將此稀釋於50mM三乙醇胺10mM EDTA pH 8中,而得10 mg/ml白樹素溶液。將2-免疫噻烷(2-immunothiolane)溶解於蒸餾水中而得20mg/ml溶液。將10.5 μ l之2-免疫噻烷溶液加至該150 μ l白樹素溶液中,並將混合物於冰上培育1小時。將經活化之白樹素加樣至以PBS+10mM EDTA pH 8平衡之PD10脫鹽管柱。收集全部3.5ml樣本體積,並使用centricon濃縮器濃縮,而得最終濃度為3mg/ml之硫醇化白樹素。
為達白樹素對於抗-CNT2抗體為5:1莫耳比,需要0.5mg經硫醇化之白樹素與0.5mg抗-CNT2抗體反應。於是,將138 μ l經SPDP-處理的抗-CNT2抗體加至167 μ l經硫醇化之白樹素。
亦完成以白樹素對於抗-CNT2抗體為10:1莫耳比之反應(333 μ l之1mg經硫醇化白樹素加至138 μ l之0.5經SPDP-處理的抗-CNT2抗體)。各反應係於氮氣下密封,並於4℃下培育20小時。之後藉由將碘化乙醯胺加至終濃度為2mM,而阻斷任何未反應的硫氫基殘基。
將各反應混合物以MALDI-TOF質譜儀、SDS-PAGE與ELISA進行分析。從反應混合物之SDS-PAGE分離及質譜儀所得的數據(未示)顯示,各共軛反應成功,且鑑定出以1、2及3分子與單一抗體分子共軛之白樹素的物種。雖然雖然質譜儀數據顯示有一些未經共軛之抗體存在,其量已不足以在經考馬氏藍染色之SDS-PAGE凝膠上觀察到。該2反應比例在共軛效果上並無差異。
以如前述之ELISA對各反應混合物進行分析,以分析該抗體之結合活性是否受到共軛反應影響。所得數據歸納列於下表12。
可見,結合已受到添加SPDP聚連接物,以及與白樹素之共軛影響。然而,經共軛之抗體反應混合物仍呈現顯著的結合。此可歸因於已共軛與未共軛之抗體。因為未共軛抗體之含量低,故推測所觀察到之良好結合比例係因已共軛之抗體所致。
使如上實施例6.1所述相同之策略適用於將重組型白樹素(如上實施例5所述製得)共軛至多株抗-CNT2抗體。使用5:1白樹素對抗-CNT2多株抗體莫耳比例以獲得最有效的反應混合物。
將3.75mg經蛋白A純化之兔子1多株抗體,呈10mg/ml溶於PBS/10mM EDTA pH 8之溶液與11.25 μ l SPDP(3mg/ml於DMF)混合,並於室溫下培育30分鐘。將反應混合物通過以PBS+10mM EDTA pH 8預平衡之Zeba脫鹽管柱(Pierce Chemical Co.)。
將3.75mg重組白樹於50mM三乙醇胺10mM EDTA pH 8中製備成10mg/ml。將2-免疫噻烷(Traut氏試劑;Sigma-Aldrich)溶解於經除氣及通以氮氣之去離子水中而得20mg/ml溶液。將26.5 μ l此溶液加至該白樹素溶液中,並將氮大氣下於冰上培育一小時。將經硫醇化之白樹素通過以PBS+10mM EDTA pH 8預平衡之Zeba脫鹽管柱(Pierce Chemical Co.)。
將經SPDP-反應之抗體溶液與經硫醇化之重組白樹素溶液混合,使達到等量之各蛋白成分,而得白樹素對抗體為5:1莫耳比。將反應於氮氣下密封,並於4℃下培育20小時。
之後藉由添加碘化乙醯胺至終濃度為2mM,隨後於室溫下培育最少一小時,而阻斷任何未反應的硫氫基殘基。
使用以PBS之凝膠過濾法將未共軛之白樹素分子與共軛物分離。使用Akta FPLC單元(Amersham-Pharmacia)將10/300 Superdex 200管柱(Amersham-Pharmacia)於3倍管柱體積(CV)之PBS中平衡。藉由PC進行Unicon軟體(Amersham-Pharmacia)控制層析術之進行,其注射入樣本後將流速維持於0.5ml/min,在0.1 CV已溶析出後,控制0.5ml流份收集入96孔區塊內。令溶析進行1.4 CV。
將所選擇之流份於非還原性SDS-PAGE凝膠(4-12% bis-tris NuPage於MOPS緩衝液;Invitrogen),如製造商所述進行分析。將凝膠使用SimplyBlue考馬氏染色(Invitrogen)如製造商所述進行染色。將經測定出含有共軛物之流份匯集,並進行下一純化步驟。
存在於重組型白樹素分子上之六-組胺酸C-端尾部,可使應用固定化金屬螯合親合性層析術(IMAC),能作為共軛物純化中的第二層析術步驟。於未共軛抗體(其在經凝膠過濾後仍存在共軛物流份中)上缺乏六-組胺酸基序,使能夠從含有六-組胺酸之共軛物除去游離態抗體。因此,將於上述6.2.4中獲得之所匯集流份通過接至受PC進行Unicorn軟體(Amersham生物科學)控制之Akta FPLC單元的HisTrap HP 1ml鎳-親和性管柱(預先以5 CV之PBS/15mM咪唑平衡;Amersham Bioscience)。加樣並使用作為加樣/沖洗緩衝液之PBS/15mM咪唑進行5 CV沖洗。施予15mM至500mM咪唑(存在PBS)梯度,歷經20 CV進行含有六-組胺酸蛋白質之溶析。將流份以0.5ml體積收集於96孔區塊中。
將所選擇之流份於非還原性SDS-PAGE凝膠(4-12% bis-tris NuPage於MOPS緩衝液;Invitrogen),如製造商所述進行分析。將凝膠使用SimplyBlueT M
考馬氏染色(Invitrogen)如製造商所述進行染色。
凝膠顯示藉由IMAC步驟,共軛物已實質上與游離態抗體純化分開。將含有共軛物之流份匯集,並使用具有10kDa截斷之VivaSpin 20ml離心濃縮器脫鹽入PBS中。
使用MALDI-TOF質譜儀分析所匯集已共軛樣本相對於未共軛抗-CNT2抗體之組成。所得之質量光譜(未示)指出在匯集得之已共軛流份(Pool B)中存在三種1:1、1:2與1:3比例之抗體:白樹素共軛物。未觀察到帶單一電荷之未共軛抗體物種,然而於光譜上鑑定出與帶雙電荷未共軛抗體物種相關的波峰。因此,即使大部分未共軛抗體與已共軛抗體被純化分開(如同以SDS-PAGE分析及IMAC純化所指示者),仍可能暗示有非常小量的未經共軛抗體殘留在所匯集之純化樣本中。
藉由ELISA(用於測定共軛作用對抗體結合之影響),及藉由試管內轉譯抑制分析(用於測定白樹素之功能活性已是否受到共軛作用影響),分析於經IMAC-純化之匯集樣本中共軛物的功能活性。
ELISA(數據未示)揭露與該等對於市售所提供白樹素(上述實施例6.1.4)之共軛作用所觀察到者相似的結果:抗體結合受到添加SPDP聚連接物,以及受到與重組白樹素之共軛影響,但是經共軛之抗體反應混合物仍呈現與大鼠CNT2 RSPE的顯著結合。雖然質譜儀分析指出甚至在經過IMAC純化後,仍有些未共軛抗體殘留,但於經IMAC純化樣本中之未共軛之抗體量,較存在天然白樹素/抗-CNT2抗體經IMAC純化後之共軛反應混合物中的量少。於是,所觀察到之抗體結合可能主要係由抗-CNT2抗體-重組白樹素共軛物所致。
使用TNT快速偶合轉錄/轉譯系統(Promega),依製造商所指示測定於得自IMAC純化得所匯集含共軛物之樣本中,與抗-CNT2抗體共軛之重組白樹素是否保留核糖體-抑制能力。結果顯示於圖2。由存在經IMAC純化所匯集樣本中之共軛物呈現的轉譯抑制作用,與由原始重組白樹素(r白樹素)呈現的相等。因此於共軛作用後仍保留核糖體-抑制能力。
所選擇用以達成此共軛作用之策略,係使用具有大間隔臂的TFCS交聯劑(Pierce),以儘可能多暴露至相對上較小(5kDa)之β-嘌呤硫素分子。TFCS於一端具有NHS酯基,其與位於抗體上之胺基結合,而另一端為受保護之胺基,其用於在pH值調升至8時與經適當處理之β-嘌呤硫素反應。位於嘌呤硫素上之羧基與EDC反應,而形成不安定之胺基反應活性中間物,然後將其與磺基-NHS反應而提供更安定的鍵聯。接著將經EDC/磺基-NHS處理之β-嘌呤硫素與TFCS連結物之胺基末端結合。
將1ml分裝經蛋白A純化之兔子1多株IgG(參見實施例4.2.1,得自兔子1之收穫血液經親和性純化,然後使用蛋白A管柱純化得)使用具有10kDa截斷之centricon離心濃縮器濃縮。將所成之樣本體積增至5mg/ml 0.1M磷酸鈉0.15M NaCl pH 7.2。將15 μ l TFCS(3mg/ml於DMF)加至每500 μ l抗體中,並於室溫下培育1小時。將反應混合物加樣至以0.1M磷酸鹽緩衝液pH 8預平衡之PD10脫鹽管柱。收集全部3.5ml樣本體積,並使用centricon濃縮器濃縮,而得最終濃度為10mg/ml之經TFCS-處理的抗-CNT2抗體。
將得自小麥胚乳之凍乾β-嘌呤硫素(Takara)溶解於5mg/ml 0.1M磷酸鈉0.15M NaCl pH 7.2,至最終濃度為10mg/ml。將EDC加入而得最終濃度為2mM,以及磺基-NHS達最終濃度為5mM,並混合物置於室溫下反應15分鐘。藉由添加2-巰基乙醇至最終濃度為20mM而終止反應。將經活化之β-嘌呤硫素加樣至以0.1M磷酸鈉0.15M NaCl pH 7.2預平衡之聚丙烯醯胺脫鹽管柱(大小排阻限制為1,800 Da;Pierce)。收集流份並以OD280檢視該毒素之存在。
將經TFCS-處理之抗體與EDC/磺基-NHS處理之β-嘌呤硫素混合,而得30:1莫耳比之β-嘌呤硫素:抗-CNT2抗體,並令其於4℃下反應過夜。之後藉由添加羥基胺至最終濃度為10mM而終止反應。然後將反應混合物加樣至大小排阻層析管柱,以將游離態β-嘌呤硫素與抗體-β-嘌呤硫素共軛物分離。匯集含有共軛物之流份。
使用MALDI-TOF質譜儀分析所匯集共軛物樣本相對於未共軛抗-CNT2抗體之組成。所得之質量光譜(未示)指出在匯集得之共軛物流份中存在1:1、1:2與1:3比例之抗體:β-嘌呤硫素共軛物物種。亦觀察到有些帶單一電荷之未共軛抗體物種。
藉由如前述之ELISA分析於所匯集樣本中共軛物的功能活性。計算得共軛物之50%結合力價為0.067 μ g/ml,相較於未共軛抗-CNT2抗體的為0.041 μ g/ml。
使用抗-CNT2::β-嘌呤硫素共軛物樣本進行大鼠胃腸組織之免疫組織化學分析(方法參見實施例4.2)。結果歸納列於上表13。
構築介於辨識細胞表面抗原之scFv與三種不同蛋白毒素,白樹素、粒酶B及cyt2A之融合蛋白表現載體。用於本實施例之scFv為經描述於上述實施例2.5之SV63 scFv。皆遵循用於質體製備、限制酵素分解、黏接作用、大腸桿菌轉型等之標準分子生物學技術。
以人為合成得編碼251胺基酸白樹素蛋白之基因(參見Nolan等人,如前述),其5'經設計以允許符合讀框地融合至源自SV63抗體之VH
(促成人為基因054014)或VL
(促成人為基因054013)編碼序列,並將其次選殖入pCR-Script中,而得兩種構築體p054013與p054014。
將質體p054013以Spe
I與Not
I消化,將所產生編碼白樹素之片段純化出,並黏接至經同樣消化之pDGF-SV63-VHVL,而得載體pDGF-SV63-VHVLrGel。此產生介於SV63 scFv之N-端經由單一Gly4
Ser連接肽鍵聯至重組白樹素之符合讀框融合。因此於pDGF-SV63-VHVLrGel中之表現卡匣以5’至3’方向,包含下列組成:tac
啟動子、PelB
引導序列、SV63 VH
編碼序列、[Gly4
Ser]3
連接肽、SV63 VL
編碼序列、Gly4
Ser連接肽、重組白樹素編碼序列。
若希望,可容易地將SV63 VH
編碼序列、[Gly4
Ser]3
連接肽、SV63 VL
編碼序列、Gly4
Ser連接肽與重組白樹素編碼序列,切出呈Nco
I/Eco
RI片段,並黏接入其他表現/選殖載體,例如接入pIMS147或pET32a中。
將質體p054014以BseRI與NotI消化,將所產生編碼白樹素之片段純化出,並黏接至經同樣消化之pDGF-SV63-VLVH,而得載體pDGF-SV63-VHVLrGel。此產生介於scFv之N-端經由單一Gly4
Ser連接肽鍵聯至重組白樹素之符合讀框融合。因此於pDGF-SV63-VHVLrGel中之表現卡匣以5’至3’方向,包含下列組成:tac
啟動子、PelB
引導序列、SV63 VL
編碼序列、[Gly4
Ser]3
連接肽、SV63 VH
編碼序列、Gly4
Ser連接肽、重組白樹素編碼序列。
若希望,可容易地將SV63 VL
編碼序列、[Gly4
Ser]3
連接肽、SV63 VH
編碼序列、Gly4
Ser連接肽與重組白樹素編碼序列,切出呈Nco
I/Eco
RI片段,並黏接入其他表現/選殖載體,例如接入pIMS147或pET32a中。
製得兩種構築體,各攜帶以N-端與SV63 scFv融合之粒酶B:pET32a::rGrzB::SV63 VHVL及pET32a::rGrzB::SV63 VLVH。
使用pET32a(+)::rGrzB(上述實施例5.3)作為模板,結合引子重疊延展策略,將編碼成熟粒酶B之序列與SV63 scFv,以VH
VL
方向(N至C-端)藉由單一Gly4
Ser連接肽融合,構築得質體pET32a::rGrzB::SV63 VHVL。
(i)藉由使用pET32a(+)::rGrzB作為模板,與pET F(SEQ ID NO:54)及RoPro 071 G4S/rGrzB R1(SEQ ID NO:55)引子進行PCR,而將編碼單一Gly4
Ser連接肽3’端之序列加至成熟粒酶B編碼序列。
(ii)使用pDGF-SV63-VHVL作為模板,與RoPro 074 rGrzB/G4S/VHVL F(SEQ ID NO:56)及RoPro 075 pET/VHVL R(SEQ ID NO:57)引子進行PCR,將編碼單一Gly4
Ser連接肽與部分粒酶B編碼序列之5’端之序列加至SV63 VHVL編碼序列。
純化出得自上述(i)與(ii)之產物,並於進行無引子延展前先以等莫耳量混合,接著使用pETF(SEQ ID NO:54)及RoPro 075 pET/VHVL R(SEQ ID NO:57)擴增全長融合產物,使用獨一之SfuI及NotI切位將其選殖入pET32a(+)中。
亦使用使用pET32a(+)::rGrzB(上述實施例5.3)作為模板,結合引子重疊延展策略,將編碼成熟粒酶B之序列與SV63 scFv,以VL
VH
方向(N至C-端)藉由單一Gly4
Ser連接肽融合,構築得質體pET32a::rGrzB::SV63 VLVH。
(i)如前文(i)所述,將編碼單一Gly4
Ser連接肽3’端之序列加至成熟粒酶B編碼序列。
(ii)使用pDGF-SV63-VLVH作為模板,與RoPro 072 rGrzB/G4S/VLVH F(SEQ ID NO:58)及RoPro 073 VLVH/pET R(SEQ ID NO:59)引子進行PCR,將編碼單一Gly4
Ser連接肽與部分粒酶B編碼序列之5’端之序列加至SV63 VLVH編碼序列。
純化出得自上述(i)與(ii)之產物,並於進行無引子延展前先以等莫耳量混合,接著使用pET F(SEQ ID NO:54)及RoPro 073 VLVH/pET R(SEQ ID NO:59)擴增全長融合產物,使用獨一之Sfu
I及Not
I切位將其選殖入pET32a(+)中。
用於構築粒酶B-scFv融合構築體之引子序列係如實施例5.3所述及如下所列(所有引子序列皆以5'至3'表示):pETF(SEQ ID NO:54)TCGGTGATGTCGGCGATATAG;RoPro 071 G4S/rGrzB R1(SEQ ID NO:55)ACTACCTCCGCCACCGGACTTCTTCATAGTTTTCTTGATCCAGG;RoPro 074 rGrzB/G4S/VHVL F(SEQ ID NO:56)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGG;RoPro 075 pET/VHVL R(SEQ ID NO:57)TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTACTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCCACCGAACG;RoPro 072 rGrzB/G4S/VLVH F(SEQ ID NO:58)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAGCAATC;RoPro 073 VLVH/pET R(SEQ ID NO:59)TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTATGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC。
為產生SV63 scFv與Cyt2A序列之符合讀框融合,遂遵照Gurkan & Ella(2003蛋白質表現純化29(1):103-16)之實例。以人為合成得編碼最先237個胺基酸的Cyt2Aa1之基因(EMGL:BTCYTTBG),其含有經設計以產生於C-端符合讀框地加入14胺基酸Xpress抗原決定基(Invitrogen)之3'序列。此經人為合成得之Cyt2A-Xpress抗原決定基序列稱作051072,並將其次選殖入pCR-Script中,而得p051072。將質體pDGF-SV63-VHVL(參見實施例2.5)以兩步驟進行改變。首先,設計並製造出會藉由含有SV63 VL之部份3’端序列、(Gly4
Ser)3
連接肽與部分成熟Cyt2Aa1蛋白之5’端序列(如由Gurkan & Ella,如前述,所描述),而產生一段接連片段的人為合成序列(命名為p054247)。使用Spe
I(5’)與Eco
RI(3’)將該片段從p054247切出,並黏接入經同樣方式製備得之pDGF-SV63-VHVL(參見實施例2.5)中。然後將所成之質體藉由以Sfu
I及Bam
HI切割,及導入該得自p051072大約520bpSfu
I/Bam
HI片段(代表成熟Cyt2Aa1序列之3’端加Xpress抗原決定基)而做進一步修飾。所成之質體(pDGF-SV63-VHVL::Cyt2A)包含SV63 VH
VL
scFv經由柔性連接肽鍵聯至活性(成熟)形Cyt2Aa1(胺基酸37至237)隨後接Xpress抗原決定基之完整符合讀框的融合。
類似地,將質體pDGF-SV63-VLVH(參見實施例2.5)以兩步驟進行改變而導入Cyt2Aa1序列。首先,設計並製造出會藉由含有SV63 VH之部份3’端序列、(Gly4
Ser)3
連接肽與成熟Cyt2Aa1蛋白之部分5’端序列(如由Gurkan & Ella,如前述,所描述),而產生一段接連片段的人為合成序列(命名為054248)。將該人為序列次選殖入pCR Script中,而得質體p054248。使用Bse
RI(5’)與Eco
RI(3’)將此片段從p054248切出,並黏接入經同樣方式製備得之pDGF-SV63-VLVH中。然後將所成之質體藉由以Sfu
I及Bam
HI切割,及導入該得自p051072大約520bpSfu
I/Bam
HI片段(代表成熟Cyt2Aa1序列之3’端加Xpress抗原決定基)而做進一步修飾。所成之質體(pDGF-SV63-VLVH::Cyt2A)包含SV63 VL
VH
scFv經由柔性連接肽鍵聯至活性(成熟)形Cyt2Aa1(胺基酸37至237)隨後接Xpress抗原決定基之完整符合讀框的融合。
將攜帶SV63 scFv-白樹素融合基因(參見前述實施例7.1)之載體轉型入大腸桿菌TOP10細胞中。藉由將經轉形之細胞生長於2×YT/2%葡萄糖培養基中,然後於20℃或15℃下於補充以1mM IPTG之2×YT培養基中誘導16小時,進行試驗性表現研究。採小量樣本(10ml)離心,並將各細胞沈澱再懸浮於1ml溶解緩衝液(PBS)中。將樣本超音波震盪、於室溫下於13,000rpm再離心5分鐘。並將上清液(可溶性部份)倒出。將沈澱(不可溶性部份)再懸浮於1ml溶解緩衝液中。
將可溶性與不可溶性部份以Western墨點法,使用對抗六-組胺酸標籤之抗體進行分析。該項分析顯示,從該二表現載體(亦即,其中scFv係以VH
VL
位向者,與其中scFv係以VL
VH
位向者),皆可製造scFv-白樹素融合蛋白。然而,呈VL
VH
位向之scFv產生較高產率的可溶性蛋白。
完成更大規模生長及培育,並經由於Gravitrap管柱進行純化,進一步從可溶性部份純化得scFv-白樹素融合蛋白。
藉由使用經分離大鼠十二指腸切段,測量黏膜對非可吸收性標記物(甘露糖醇)之通透性,而分析本發明之蛋白共軛物及融合蛋白造成上胃腸道損傷的能力。將於活體外分離得之組織,使用修改過的先前已發表之方法(Heylings,1991,Toxicol.Appl.Pharmacol.107:482-493),暴露至此等囓齒類動物控制劑。
簡言之,在人道死亡後快速地從成年雄性Alderley Park品系大鼠(Ap:Akf
SD)取出10cm之胃腸道切段(位於緊鄰胃部末梢處)。將此組織置於充氧TC199培養基中,並小心地使用TC199培養基,從距離胃部之最遠端將食物碎屑沖出腸道。製備兩段十二指腸(長度各為2.5公分),即前段(緊接於胃部之後)與末段(緊接於膽囊入口之後)。
藉由結紮的方式,將切段小心地緊繃接附至兩個連結至儲存罐之玻璃管開口端。此可使經分離黏膜之內腔(黏膜)面與血液面(絨毛膜)表面能浸潤於分開的溶液。在各黏膜室中介於玻璃棒末端的間隙為12mm。裝置之示意圖與列示於Heylings 1991(如前述)圖1上半部者類似。將附有黏膜之小室用充氧TC199培養基潤洗數次,以除去附於該組織內腔面上之過量黏膜。將內腔(黏膜)面充以4ml含有20mg甘露糖醇/ml之TC199培養基(TC199-M),並檢查黏膜是否滲漏。將黏膜小室浸於充40ml經95% O2
:5% CO2
通氣之TC199培養基(絨毛膜面溶液)的外部杯型玻璃容器中。將小室放置於適當位置以避免於兩浸浴間產生流體靜壓梯度。以外包連接外在幫浦之水流套管的方式,將該二溶液維持於37±0.1℃。經10分鐘預先培育期後,將黏膜小室取出並以TC199-M培養基充分洗淨以去除任何黏膜堵塞,最後將內腔面充以4ml含有濃度為5×105
dpm/ml之1 4
C-甘露糖醇(其為不易被胃腸道吸收的非電解質)之TC199-M培養基,並再置回玻璃小室中。
為測量經分離之十二指腸黏膜對甘露糖醇之通透性,遂於將加至黏膜面後10、20、30、60、120、180及240分鐘採集二重複150 μ l分裝絨毛膜面溶液。藉由液體閃爍計讀測定甘露糖醇被吸收之量。作為陽性對照組,係將百草快(paraquat)(40mg百草快離子/ml),為一種已知之胃腸道局部刺激物,於開始培育後30分鐘加至黏膜小室,以證明該模式能夠偵測黏膜損傷。將囓齒類動物控制劑(融合蛋白或蛋白共軛物,參見前述實施例6至8)於開始培育後30分鐘直接添加小體積至黏膜小室,並監測甘露糖醇吸收之時間過程圖譜。將其與同時進行之陰性對照組比較,對於大鼠十二指腸之前段與末段平行進行測試。
上述方法係使用十二指腸組織,然而,可替代以胃腸道之其他區域,並使用與前述相同的程序進行測試。
藉由灌食對小鼠(總共18隻,每組9隻)施予口服劑量:i)蛋白共軛物或融合蛋白(參見尤其前述實施例6至8;第1組小鼠),或ii)惰性載劑(例如聚乙二醇;第2組小鼠)。將動物於施予劑量後24、48及72小時犧牲,於研究期間同時規律地進行臨床觀察。在動物犧牲後,將十二指腸、空腸、迴腸與結腸組織於形式緩衝食鹽水(formal buffered sa1ine)進行固定,經加工及包埋入蠟中並以H&E染色以進行病理學分析。
所使用融合蛋白/蛋白共軛物之測試濃度(以mg之化合物每kg體重表示)如下:8mg/kg、5mg/kg及3mg/kg。
圖1由重組白樹素對螢光素酶轉譯作用之抑制。
圖2由抗-CNT2多株抗體-重組白樹素共軛物對螢光素酶轉譯作用之抑制。匯集A(Pool A)樣本相當於從IMAC純化匯集得,經測定含有游離態抗體之流份。匯集B(Pool B)樣本相當於從IMAC純化匯集得,經測定含有抗體-毒素共軛物之流份。
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<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠GTR2之RSPE
<400> 4
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠CFTR氯化物轉運蛋白之RSPE
<400> 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠CNT2核苷轉運蛋白之RSPE
<400> 6
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自CATB(0+)結腸胺基酸轉運蛋白之RSPE
<400> 7
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠MDR1之RSPE
<400> 8
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自小鼠MDR1之RSPE
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶之RSPE
<400> 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自小鼠GLUT7之RSPE
<400> 11
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自小鼠GLUT7/大鼠GTR5之RSPE
<400> 12
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠Npt2a之RSPE
<400> 13
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠OATP-B之RSPE
<400> 14
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠OATP-B之RSPE
<400> 15
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠ASBT之RSPE
<400> 16
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠CaT1之RSPE
<400> 17
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠OATP3之RSPE
<400> 18
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠ABCG8之RSPE
<400> 19
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠GTR8之RSPE
<400> 20
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠MRP1之RSPE
<400> 21
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠CNT1之RSPE
<400> 22
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠UT-B之RSPE
<400> 23
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠DRA1之RSPE
<400> 24
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自小鼠ENT1之RSPE
<400> 25
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠ENT1之RSPE
<400> 26
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠GCC之RSPE
<400> 27
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠PLB之RSPE
<400> 28
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠LPH之RSPE
<400> 29
<210> 30
<211> 44
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自小鼠LPH之RSPE
<400> 30
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠AMPN之RSPE
<400> 31
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠MCDL之RSPE
<400> 32
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠SCAB之RSPE
<400> 33
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠SCAB之RSPE
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠KCV2之RSPE
<400> 35
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 源自大鼠CATB(0+)結腸胺基酸轉運蛋白之RSPE
<400> 36
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro-9引子
<400> 37
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro-28引子
<400> 38
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro-6引子
<400> 39
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro-25引子
<400> 40
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro-3引子
<400> 41
<210> 42
<211> 32
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro-4引子
<400> 42
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡1引子
<400> 43
<210> 44
<211> 57
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡2引子
<400> 44
<210> 45
<211> 56
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡3引子
<400> 45
<210> 46
<211> 76
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡4引子
<400> 46
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡5引子
<400> 47
<210> 48
<211> 58
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡6引子
<400> 48
<210> 49
<211> 55
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡7引子
<400> 49
<210> 50
<211> 76
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> scFv寡8引子
<400> 50
<210> 51
<211> 49
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro070 petEK/rGrzB F1引子
<400> 51
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro067 rGrzB R引子
<400> 52
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro076 petEK/rGrzB F2引子
<400> 53
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> pET F引子
<400> 54
<210> 55
<211> 44
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro 071 G4S/rGrzB R1引子
<400> 55
<210> 56
<211> 54
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro 074 rGrzB/G4S/VHVL F引子
<400> 56
<210> 57
<211> 55
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro 075 pET/VHVL R引子
<400> 57
<210> 58
<211> 55
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro 072 rGrzB/G4S/VLVH F引子
<400> 58
<210> 59
<211> 53
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> RoPro 073 VLVH/pET R引子
<400> 59
Claims (25)
- 一種殺囓齒類動物控制劑,其包含與囓齒類動物之胃腸道中的囓齒類動物特異性肽抗原決定基(RSPE)結合的抗體,該RSPE由表現於囓齒類動物之蛋白質的寡肽片段所組成,其中該寡肽片段序列代表與源自非標靶動物之同源蛋白質之相對應線形肽序列具有60%或更少同一性百分比的胞外連續肽抗原決定基,其中該抗體成分係鍵聯至毒性成分。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其包含融合蛋白,該融合蛋白包含第一蛋白成分與第二蛋白成分,該第一蛋白成分為抗體成分而該第二蛋白成分係選自由毒素、及免疫原所組成的群組。
- 根據申請專利範圍第2項之囓齒類動物控制劑,其中該第一與第二蛋白成分係經由連接肽而彼此鍵聯。
- 根據申請專利範圍第3項之囓齒類動物控制劑,其中該連接肽包含至少三段(Gly4 Ser)基序。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其包含蛋白共軛物,該蛋白共軛物包含根據申請專利範圍第1項之抗體成分,其經化學共軛至毒性成分。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其中該毒性成分為蛋白毒素。
- 根據申請專利範圍第6項之囓齒類動物控制劑,其中該毒素為a)選自列於第1組的蛋白質群組之全長蛋白質,其中第1組係由破壞膜之蛋白質、核糖基轉移酶、絲 胺酸蛋白酶、鳥苷醯基環化酶活化劑、涉及ATPase所介導之離子轉運的蛋白質、鈣調蛋白-依賴性腺苷醯基環化酶、及核糖核酸酶所組成,或為b)選自第1組之蛋白質的毒性功能域。
- 根據申請專利範圍第6項之囓齒類動物控制劑,其中該毒素為a)全長RNA糖苷酶或為b)RNA糖苷酶之毒性功能域。
- 根據申請專利範圍第7項之囓齒類動物控制劑,其中該毒素為a)全長β-嘌呤硫素(purothionin)或選自列於第2組的蛋白質群組之全長蛋白質,其中第2組係由產氣莢膜溶素(Perfingolysin)O、α-溶血素(haemolysin)、鞘磷脂酶、δ-溶血素、粒酶B、α毒素、cyt毒素、白喉毒素、顆粒體溶素(Granulysin)、蜂毒素、穿孔素、霍亂內毒素、熱安定性腸毒素、Equinatoxin、李斯特菌溶素(Listeriolysin)、VIP2、輔助腸毒素、氣單胞菌溶素、BinA、BinB、大腸桿菌素E1、溶血素A、CTX IV、蓖麻毒蛋白、變形蟲穿孔肽、EI Tor溶血素、美人魚弧菌(Vibrio damsela )溶血素、肺炎球菌溶血素、鏈球菌溶血素O、金川(Kanakawa)毒素、鉤端螺旋體(Leptospira)溶血素、Cry毒素、炭疽毒素、假單胞菌外毒素A、芽孢桿菌核酸酶與VIP3所組成,或為b)β-嘌呤硫素之毒性功能域或選自第2組之蛋白質的毒性功能域。
- 根據申請專利範圍第8項之囓齒類動物控制劑,其中該毒素為白樹素(gelonin)。
- 根據申請專利範圍第5項之囓齒類動物控制劑,其中該毒性成分為選自由秋水仙素;阿黴素;刺孢霉素(calicheamicin);非類固醇消炎藥(NSAID)化合物;松胞菌素;抗-凝血劑;鈣化固醇;溴甲林;氟鼠啶(flupropadine);磷化鋅;紅海蔥苷;(單)氟乙酸鈉;氟乙醯胺;阿伐氯醛糖;硫酸鉈所組成的群組之毒性化合物且該抗-凝血劑係選自由溴鼠靈(brodificoum)、鼠得克(difenacoum)、溴敵隆(bromadiolone)、氟鼠靈(flocoumafen)、噻鼠靈(difethialone)、羥基香豆素(hydroxycoumarin)及茚烷-二酮類所組成的群組。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其中該抗體成分與其結合之蛋白質為經表現於囓齒類動物胃腸上皮細胞之蛋白質。
- 根據申請專利範圍第12項之囓齒類動物控制劑,其中該蛋白質係選自由大鼠PEP T1、大鼠CD155、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠CATB(0)+、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GTR5、大鼠Npt2A、大鼠OAT-B、大鼠ASBT、大鼠CAT1、大鼠OATP3、大鼠ABCG8、大鼠GTR8、大鼠MRP1、大鼠CNT1、大鼠UT-B、大鼠DRA1、小鼠ENT1及大鼠ENT1、大鼠CATB(0)+、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、小鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL、大鼠SCAB及大鼠KCV2所組成的群組。
- 根據申請專利範圍第13項之囓齒類動物控制劑,其中該胞外抗原決定基係由選自由SEQ ID NO:1-26所組 成的群組之胺基酸序列所提供。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其中該抗體成分為抗體或其抗原-結合片段。
- 根據申請專利範圍第15項之囓齒類動物控制劑,其中該抗體為a)包含輕鏈與重鏈之免疫球蛋白或b)單鏈抗體。
- 根據申請專利範圍第16項之囓齒類動物控制劑,其中該單鏈抗體為scFv。
- 根據申請專利範圍第17項之囓齒類動物控制劑,其中該單鏈抗體缺少輕鏈。
- 根據申請專利範圍第18項之囓齒類動物控制劑,其中該單鏈抗體係衍生自駱駝科或衍生自Chondricthyes。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其中該抗體成分係選自由免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、VH 功能域、VL 功能域、Fv、Fab、二-Fab、Fab’、F(ab’)2 、VHH 功能域、IgNAR V功能域及CDR所組成的群組。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其中該抗體成分呈現可置換結合至囓齒類動物蛋白之胞外抗原決定基,但不呈現可置換結合至:1)源自非標靶動物之同源蛋白質,或ii)源自得自非標靶動物之同源蛋白質的相對應抗原決定基。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其係呈進一步包含至少一種添加劑之組成物形式。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑, 其進一步包含至少一種添加劑,該添加劑選自由根據申請專利範圍第1至22項中任一項之囓齒類動物控制劑、第一代抗凝血劑及第二代抗凝血劑所組成之群組的囓齒類動物控制劑。
- 根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑,其進一步包含至少一種添加劑,該添加劑具有使該組成物對於囓齒類動物為可口的功能。
- 一種殺死囓齒類動物之方法,其包含將根據申請專利範圍第1項之囓齒類動物控制劑放置於囓齒類動物常出沒區域,以使該囓齒類動物控制劑被囓齒類動物攝入時,可殺死該囓齒類動物。
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