JP5032458B2 - 有害生物防除 - Google Patents

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Description

本発明は、げっ歯動物で発現されるタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片、特にげっ歯動物の消化管（ＧＩ）で発現されるタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む新規げっ歯動物防除剤（ｒｏｄｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ）、ならびにかかる新規げっ歯動物防除剤の製造方法に関する。本発明はさらに、げっ歯動物防除に使用される新規抗体および抗原結合断片、ならびにかかる抗体、抗原結合断片および新規げっ歯動物防除剤の使用によりげっ歯動物を防除する方法に関する。
げっ歯動物は昔から、有害生物であり種々の問題を引き起こすと考えられている。それらはしばしば、ヒトや家畜動物が消費するはずの食物をあさり、成長している穀物のみでなく保存食料にも害を与え汚染（尿、糞、および疾病）させる。げっ歯動物はまた、広範囲の種々の疾患のキャリアーであることが知られており、例えば旋毛虫病、レプトスピラ症、コレラ、腺ペスト、チフス、赤痢、ハンタウイルス症、サルモネラ症、パスツレラ症、トキソプラズマ症、および鼠咬症があり、これらは直接（例えば咬むこと）または間接（例えば、便、尿、および／または唾液から発生するほこり、および／またはげっ歯動物に頼って生きているかまたはこれらから食料を得る昆虫を介して）にヒトおよび／または他の哺乳動物に接触することにより広まる。さらにげっ歯動物はしばしば、かじったり掘ったりすることにより、土地、建物、設備に物理的損傷を与える。
げっ歯動物を防除する方法は年月とともに進化してきたが、これらは一般に３つに分類される：ｉ）捕獲；ii）化学物質への暴露による屠殺；およびiii）げっ歯動物の繁殖能力をなくすかまたは低下させる。これらのすべての３つの方法は、１つまたはそれ以上の欠点がある。
例えばげっ歯動物を捕獲したり殺したりするための機械的わなは、本質的に処理できる動物の数によりその使用が限定され、すなわちヒトが介入して再度設定するまでは１匹の動物しか扱うことができない。げっ歯動物が繁殖できる速い速度（一回に生む子供の数が６〜８匹で、年に１０〜１２回生まれるため、一つがいのラットは年に１５，０００匹の子孫を生む）を考えると、この大発生にはわなは適当ではない。さらにわなは比較的手間がかかり、ヒトの介入が必要であり、このため有害生物防除にコストが上昇するのみでなく、わなの標的であるげっ歯動物が怖がって近づかない。
化学的殺鼠剤は現在、近郊の農業地区の実用的げっ歯動物防除計画の主要な方法である。一般に化学的殺鼠剤はその作用が急性または慢性であり、すなわち化学物質は、げっ歯動物により有効量が摂取された後、急速またはゆっくり毒性を引き起こす。急性の殺鼠剤には、亜リン酸亜鉛、亜リン酸３亜鉛、海葱（ｒｅｄ ｓｑｕｉｌｌ）（活性成分シリロシド）、（モノ）フルオロ酢酸ナトリウム、フルオロアセトアミド、アルファクロラロース、および硫酸タリウムがある。いくつかの殺鼠剤化学物質（例えばカリシフェロール（ｃａｌｉｃｉｆｅｒｏｌ）、ブロメタリン、およびフルプロパジン）は、致死量が最初の２４時間で摂取されるが、繰り返し摂取が置きて、死亡は数日間遅れるため亜急性殺鼠剤とされるが、急性と亜急性殺鼠剤の区別は必ずしも明確ではない。急性殺鼠剤は、作用が迅速である点で有用であるが、一般に毒性が強い化学物質であり、その使用について安全性および環境への心配が有る。さらに急性中毒を生き延びた動物はえさを恐がり、従ってこのげっ歯動物防除方法の全体的な有効性は低下する。
慢性の殺鼠剤は、抗凝固剤として作用してその活性を示し、その例には、第１世代抗凝固剤であるヒドロキシクマリン類（例えば、ワーファリン、クマクロル、クマフリル、クマテトラリル）およびインダンジオン類（例えば、ピンドン、ジファシノン、クロルファシノン）；および第２世代抗凝固剤であるブロマジオロン、ブロジファクム、ジフェナクム、フロクマフェン、およびジフェチアロンがある。第２世代殺鼠剤の使用は最近２０〜３０年間で広まっており、第１世代抗凝固剤についてはさらに長い（３０〜５０年間）。すなわちげっ歯動物群は、この防除方法に対する耐性を獲得するのに充分な時間が有り、上記活性成分のそれぞれに対する耐性／寛容が種々のげっ歯動物群および／または種で報告されている（Ｋｅｒｒｉｎｓら、２００１、「英国での抗凝固剤殺鼠剤に対する耐性の分布、１９９５〜９８年」、１４９〜１５９頁、議事録、脊椎動物の有害生物管理の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）II、第２回ヨーロッパ脊椎動物有害生物管理会議（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、ブラウンシュベイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、ドイツを参照）。
第２世代抗凝固剤のさらなる欠点は、その使用の普及とあいまった非種特異的作用に起因する。長年の間、抗凝固剤の残留物を持っているげっ歯動物を食べる捕食性の腐肉食性の哺乳動物や鳥の二次中毒に対する心配がある。ブロジファクムやフロクマフェンは屋外で使用すると二次中毒の危険性が極めて高いため、英国では屋内での使用に限定されている。しかしより広く使用されているジフェナクムやブロマジオロンに対する耐性の広がりは、使用が屋内に限定されているより強力な抗凝固剤の誤使用を促進するかも知れない。さらに低レベルの残渣およびかかる残渣の致死的作用が、保存の重要性のある広範囲の非標的種で観察されている［例えば、メンフクロウ（Ｂａｒｎ Ｏｗｌ）、オコジョ（Ｓｔｏａｔ）、イタチ（Ｗｅａｓｅｌ）、ケナガイタチ（Ｐｏｌｅｃａｔ）、およびチョウゲンボウ（Ｋｅｓｔｒｅｌ）］。
提唱されてはいるがまだ商業的に成功していないげっ歯動物防除の第３の方法は、げっ歯動物の出生率を低下させることに依存する。繁殖阻害物質（例えば避妊薬や生殖体撲滅薬）の使用ならびに生物学的および化学的滅菌剤の使用が、研究されている。しかし各アプローチは何らかの欠点を有する。例えば化合物またはステロイド化合物の避妊薬としての使用は捕獲動物で成功しているが、自由に動いている有害生物で使用することは困難である。これらの化合物はまずく、げっ歯動物が充分な量を摂取することは困難であろう。生殖体撲滅薬であるアルファクロロヒドリンは有毒殺菌剤として販売されているが、異なる種により作用が異なり、高用量では毒性である（最大５０％の死亡率）。さらに最近の研究では、げっ歯動物防除方法として免疫避妊が研究されている（例えば、米国特許出願第２００５／０００９１８８号；ＭｏｏｒｅとＷｏｎｇ、１９９７、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９：１２５−９；Ｓｍｉｔｈら、１９９７，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９：８５−９を参照）。しかし投与経路が経口の場合は経口寛容の問題のため効力に問題があり、補助剤が必要な場合がある。
従って現在のげっ歯動物防除方法の欠点のいくつかを克服する新規げっ歯動物防除剤（すなわち、例えばげっ歯動物を死亡させるかまたはげっ歯動物が繁殖する能力を制御することにより、げっ歯動物の数を抑制できる物質）に対するニーズがある。本発明は、げっ歯動物で発現されるタンパク質（かかるタンパク質はここで標的タンパク質と呼ぶ）の細胞外エピトープに結合する抗体成分を含む新規げっ歯動物防除剤を提供することにより、このニーズに取り組む。すなわち本発明の第１の態様において、げっ歯動物で発現されるタンパク質の細胞外エピトープに結合する抗体成分を含むげっ歯動物防除剤が提供される。
げっ歯動物防除剤をげっ歯動物の特定のタンパク質および／または特定の組織、例えばげっ歯動物の内蔵組織／消化管で発現されるタンパク質、に標的化することにより、新規げっ歯動物防除剤がげっ歯動物の内蔵に接触している時間が、内蔵中を通過するのみで特異的結合により遅延することがない非特異的げっ歯動物防除剤と比較して長くなる。これは次に、新規げっ歯動物防除剤の効力を有効に上昇させ、こうして抗凝固剤殺鼠剤のような従来の非特異的殺鼠剤より低濃度で使用することが可能になる。
好ましくは抗体成分は、非標的動物（例えば、ヒト、鳥、ペット動物、農場動物、および有害生物ではない野生動物）よりげっ歯動物に対する選択性を、新規げっ歯動物防除剤に付与する。非標的種よりげっ歯動物組織／げっ歯動物タンパク質への選択性は、抗体に対する必要性を低下させ、非標的種への新規げっ歯動物防除剤の環境的影響を小さくする能力を有するため、さらに有利である。
抗体成分が、げっ歯動物中で必須ではない機能を果たす標的タンパク質を認識する場合、げっ歯動物防除剤が毒性成分または避妊成分をさらに含むことが必要であろう。
すなわちある実施態様において本発明は、毒性成分または避妊成分に結合した抗体成分を含むげっ歯動物防除剤を提供する。かかる新規げっ歯動物防除剤は融合タンパク質（この場合毒性成分または避妊成分は、直接またはペプチド結合を介して間接に抗体成分に結合したタンパク質もしくはペプチド成分である）の形であるか、またはタンパク質結合体［この場合毒性成分または避妊成分は、抗体成分に直接化学的に結合した小分子（すなわち、非タンパク質性、化学的物質）であるかまたはタンパク質もしくはペプチド成分である］の形でもよい。
抗体成分がげっ歯動物の必須機能を果たす標的タンパク質（例えば、げっ歯動物の消化管中の必須機能を果たすタンパク質）を認識する場合、抗体成分は唯一の機能性物質としてげっ歯動物防除機能を果たすことがある。かかるげっ歯動物防除剤は、必須標的タンパク質への抗体成分の結合によりその作用を仲介し、こうして必須タンパク質の機能を阻止または阻害する。すなわちさらなる実施態様において本発明は、げっ歯動物で発現されるタンパク質の細胞外エピトープに結合する抗体成分を含むげっ歯動物防除剤であって、タンパク質はげっ歯動物で必須機能を果たすことを特徴とするげっ歯動物防除剤を提供する。本発明のこの態様の抗体成分が結合する適当な標的タンパク質の例（従って本発明のこの態様に従って抗体成分を産生するのに使用される）には、げっ歯動物Ｓｏｘ１０遺伝子産物、げっ歯動物エンドセリン＿Ｂ受容体（ＥＤＮＲＢ）、げっ歯動物エンドセリン−３リガンド（ＥＤＮ３）、げっ歯動物ＣＦＴＲ（下記表１参照、さらなる詳細については実施例参照）、げっ歯動物ＩＬ−２、げっ歯動物ＩＬ−１０、げっ歯動物Ｔ細胞受容体アルファおよび／またはベータ鎖、クラスII主要組織適合遺伝子複合体のげっ歯動物成分がある。当業者は、上記遺伝子産物／タンパク質のいくつかはげっ歯動物の上皮表面にはなく、その活性を仲介できる前にインターナリゼーションが必要な場合があることを理解できるであろう。かかる場合に、上記タンパク質の１つに対する抗体成分をさらなるターゲティング抗体成分と組合せて、インターナリゼーションの確率を増強させることが好ましい。すなわち２つまたはそれ以上の抗体成分（１つは上記タンパク質の１つに対するものであり、第２のものは抗体を適当な上皮標的へのターゲティング抗体として作用してインターナリゼーションを増強する）が、結合体形成によりまたは後述される融合タンパク質により、結合してもよい。
本明細書において用語「抗体成分」は、げっ歯動物で発現されるタンパク質の細胞外エピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を意味する。好ましくは抗体成分が結合するエピトープは、げっ歯動物タンパク質でのみ見つかるアミノ酸配列を有し、すなわち抗体はげっ歯動物特異的エピトープ（ｒｏｄｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅ）すなわちＲＳＥに結合する。本発明のげっ歯動物防除剤で使用される抗体成分の作成に使用され、本発明のげっ歯動物防除剤が結合するげっ歯動物特異的エピトープ（ＲＳＥ）は、本明細書に記載の本発明の第２の態様を形成する。ＲＳＥに結合する抗体成分は、本明細書に記載の本発明の第３の態様と見なされる。
ＲＳＥは細胞外にあり、その結合部位への抗体（またはその抗原結合断片）の接近を容易にする。好ましくはＲＳＥを提供する標的タンパク質は、げっ歯動物の上皮表面（例えば、鼻、口、目、消化管、尿生殖器および表皮）中またはその上で発現される。最も好ましくはタンパク質は、げっ歯動物の消化管上皮中（上）で発現される。
ある実施態様においてＲＳＥは、連続的（すなわち続きの）ペプチド配列により提供される（すなわち、エピトープの第１のアミノ酸残基はペプチド結合を介してエピトープの第２のアミノ酸残基に直接結合し、エピトープの第２のアミノ酸残基はペプチド結合を介してエピトープの第３のアミノ酸残基に直接結合しているなど）。かかる連続的ペプチドエピトープは、本明細書においてげっ歯動物特異的ペプチドエピトープ（ｒｏｄｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ）またはＲＳＰＥと呼ぶ。本発明の抗体が結合し、本発明の抗体成分（およびげっ歯動物防除剤）を作成するのに使用されるＲＳＰＥは、文献やデータベース情報により示される所望の標的組織／細胞層中で発現されるタンパク質の比較バイオインフォマティクス分析と、次に確認免疫学的分析により決定される。ＲＳＥと同様にＲＳＰＥは、天然にはげっ歯動物タンパク質中にのみ見つかる。本明細書においてＲＳＰＥは標的タンパク質のオリゴペプチド断片として定義され、ここでオリゴペプチド配列は、非標的（すなわち、非げっ歯動物、例えばヒト）動物の同種のタンパク質からの対応する線状ペプチド配列とは６０％以下の同一性を有する細胞外連続的ペプチドエピトープである。
本明細書において用語「オリゴペプチド断片」は標的タンパク質の断片を意味し、該断片は少なくとも約４で最大約５０アミノ酸からなる。好ましくは該オリゴペプチド断片は、９〜４５アミノ酸の長さであり、さらに好ましくは該オリゴペプチド断片は９〜３０アミノ酸の長さである。具体的な実施態様において該オリゴペプチド断片は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２４または４４アミノ酸の長さである。
好ましくはＲＳＰＥと非標的タンパク質との同一性パーセントは、本発明の抗体成分がＲＳＰＥに対して高い特異性と親和性とを有し、そこからＲＳＰＥが得られる同じクラス／ファミリーの非げっ歯動物タンパク質と交差反応しないものである。好適な実施態様においてＲＳＰＥと非標的タンパク質との同一性、特にＲＳＰＥと非標的動物からの同種のタンパク質の対応する線状（すなわち連続的または続きの）ペプチド配列との同一性パーセントは、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、または２５％未満であるかまたは等しい。
好ましくはＲＳＰＥは、すべての標的げっ歯動物種間で高度に保存され、特にラットとマウス、特にクマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、およびハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／マウス（Ｍｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の２つまたはそれ以上の間で高度に保存されている。高度に保存されているとは、あるげっ歯動物種からのＲＳＰＥと第２のげっ歯動物種からのＲＳＰＥとの同一性パーセントが高いことを意味する。好ましくは２つのげっ歯動物ＲＳＰＥ間の同一性パーセントは少なくとも７５％である。さらに好ましくは同一性パーセントは８０％、８５％、９０％、または９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より大きいかまたは等しい。最も好ましくはＲＳＰＥは２つまたはそれ以上のげっ歯動物種間で１００％同一である。
ＲＳＰＥ間の同一性パーセントは上記の２つまたはそれ以上の種の間で高度に保存されていることが好ましいが、所望の高レベルの保存が観察されない場合は、２つまたはそれ以上のげっ歯動物種のタンパク質（同種または異種）からの異なるＲＳＰＥを使用して異なる抗体成分を作成し、次にこれを後述のげっ歯動物防除剤と一緒にする（例えば、各抗体成分は毒性成分／避妊成分に結合し、従ってげっ歯動物防除剤は複数の異なる抗体−毒素／避妊分子を含むか、またはげっ歯動物防除剤は、２つまたはそれ以上の異なる抗体成分に結合した毒性成分／避妊成分を含み、２つまたはそれ以上の抗体成分のそれぞれは異なるげっ歯動物種からのタンパク質のＲＳＰＥを認識する）。具体的な実施態様において、本発明のげっ歯動物防除剤において、ＭＤＲ１（配列番号８）を認識する抗体成分がラットＭＤＲ１（配列番号９）を認識する抗体成分と一緒にされる。
本発明の抗体成分が結合し本発明の抗体成分を産生または同定するのに使用される標的タンパク質の例を、表１に示す。この表はまた、例示したタンパク質から得られる特異的ＲＳＰＥの例を示す。表１に示したタンパク質のリストもそこから得られるＲＳＰＥのリストも包括的でないことを当業者は理解するであろう。さらにあるタンパク質（そのすべては消化管中に発現される）内で適当なＲＳＰＥが同定され、さらなるタンパク質（例えば、他のげっ歯動物の標的組織、例えば鼻上皮、頬上皮、表皮、尿生殖器の上皮、および目の上皮）は、本発明の抗体成分を産生するのに使用される。
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本発明で使用される好適な標的タンパク質の例は、ラットオリゴペプチドトランスポーターＰｅｐＴ１、ラットＣＤ１５５、ラットＧＴＲ２、ラットＣＦＴＲ、ラットＣＮＴ２、ラットＣＡＴＢ（０）＋、ラットＭＤＲ１、マウスＭＤＲ１、ラットスクラーゼ−イソマルターゼ、マウスＧＬＵＴ７、ラットＯＡＴＰ−Ｂ、ラットＥＮＴ１、ラットＧＣＣ、ラットＰＬＢ、ラットＬＰＨ、ラットＡＭＰＮ、ラットＭＣＤＬ、およびラットＳＣＡＢである。
本発明の好適なＲＳＰＥは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２６、２７、２８、２９、３１、３２および３４を有する。
本発明での使用に特に好適な標的タンパク質は、ラットオリゴペプチドトランスポーターＰｅｐＴ１、ラットＣＤ１５５、ラットＣＦＴＲ、ラットＣＮＴ２、マウスＧＬＵＴ７、ラットＧＣＣ、ラットＰＬＢ、およびラットＬＰＨである。
本発明の特に好適なＲＳＰＥは、配列番号１、３、５、６、１１および２７、２８および２９を有する。
抗体は３次タンパク質構造を認識し、エピトープは互いに構造が近接したタンパク質の一次アミノ酸配列に分布しているアミノ酸残基を含むことを当業者は理解するであろう。すなわちさらなる実施態様において本発明の抗体成分は（および従ってげっ歯動物防除剤も）、不連続な細胞外ＲＳＥを認識してもよい。
本発明で使用される抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでもよい。かかる抗体は、動物を上記のようなＲＳＰＥで免疫するか、または動物を無傷のげっ歯動物標的タンパク質で免疫することにより得られる。本発明のポリクローナル抗体は、かかる免疫動物の血清から得られる（例えば実施例２を参照）。ＲＳＰＥまたはげっ歯動物標的タンパク質を認識するが非標的動物からの同種のタンパク質は認識しないポリクローナル抗体は、標準的免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、および／または適切な組織源に対する免疫組織化学試験）を使用して同定される。
本発明で使用されるモノクローナル抗体は、ＲＳＰＥまたはげっ歯動物標的タンパク質で免疫した動物の脾臓からＢリンパ球を単離し、かかるリンパ球を用いてハイブリドーマ細胞株を作成することにより得られる。ハイブリドーマ細胞株は次に、ＲＳＰＥまたはげっ歯動物標的タンパク質を認識するが非標的動物からの同種のタンパク質は認識しない抗体を分泌するものについてスクリーニングされる（例えば実施例を参照）。
本発明で使用される好適なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、実施例に記載される。
本発明で使用される抗体および抗原結合断片はまた、抗体または抗原結合断片のバクテリオファージ表示ライブラリー（投薬経験無し、または免疫）から、または抗体または抗原結合断片の同様の酵母もしくは細菌表示ライブラリーから、または抗体または抗原結合断片のリボゾーム表示ライブラリーから単離される。典型的にはかかる表示ライブラリーは、ＲＳＰＥまたはげっ歯動物標的タンパク質に結合する表示されたタンパク質を同定するためにスクリーニングされる。当業者は、かかるライブラリーをスクリーニングし、ライブラリー中の結合パートナーを同定し、次にかかるメンバーを単離する方法を周知しているであろう。抗体および抗原結合断片は、スクリーニングに使用されるライブラリーを表示し、その構築は当該分野で記載されている（例えば、国際特許公報ＷＯ０１／９０１９０号およびＷＯ９３／１９１７２号；米国特許第５，７５９，８０８号および６，５１７，８２９号；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍの総説、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（２）：６２−７０；Ｄｏｏｌｅｙら、２００３ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：２５−３３；Ｎｕｔａｌｌら、２００１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００１、３８：３１３−３２６；およびＨａｎｅｓら、１９９８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ９５：１４１３０−１４１３５を参照）。こうして同定される抗体または抗原結合断片は、再度非標的動物からの同種のタンパク質に結合しないことを確認するためにチェックされる。
本発明で使用される抗体は任意の免疫グロブリンクラスでもよく、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体でもよい。好ましくは本発明の抗体はＩｇＧ抗体である。本発明の抗体は、重鎖と軽鎖とを含む免疫グロブリン分子であるか、または１本鎖抗体でもよい。本明細書において用語「１本鎖抗体」は、軽鎖が無い単一の型の鎖（例えばカメリッド（Ｃａｍｅｌｉｄ）またはコンドリクチエス（Ｃｈｏｎｄｒｉｃｔｈｙｅｓ）（サメ）由来抗体）からなる天然に存在する抗体も、単一のポリペプチド鎖のみからなる工学作成した抗体も含む。かかる工学作成した抗体の例には、１本鎖抗体または「ミノボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｈｉｅｓ）」（国際特許公報ＷＯ９４／０９８１７号に記載されている）および１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）がある。本発明の抗体は好ましくは１本鎖抗体である。ある好適な実施態様において抗体はｓｃＦｖである。別の好適な実施態様において抗体は、軽鎖の無い１本鎖抗体、最も好ましくはカメリッド（Ｃａｍｅｌｉｄ）由来抗体である（例えば、国際特許公報ＷＯ９４／０４６７８号に記載されている）。
本発明で使用される抗原結合断片には、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ＶHドメイン、ＶLドメイン、Ｆｖ、Ｆａｂ、ジ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ＶHHドメイン、ＩｇＮＡＲ ＶドメインおよびＣＤＲがある。当業者は、免疫グロブリン軽鎖と重鎖、ＶHとＶLドメイン、Ｆｖ、Ｆａｂ、ジ−Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＣＤＲ、ならびにこれらの調製は周知しているであろう。ＶHHドメインとその単離は当該分野で記載されており、例えば国際特許公報ＷＯ９４／０４６７８号、国際特許公報ＷＯ０１／９０１９０号、およびそこに含まれる文献を参照されたい。ＩｇＮＡＲ抗体はサメから得られる１本鎖抗体であり、これはカメリッド（Ｃａｍｅｌｉｄ）抗体と同様に軽鎖が欠如している（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：１６８−１７３を参照）。これらの抗体の抗原結合領域であるＩｇＮＡＲ可変ドメイン（ＩｇＮＡＲ Ｖドメイン）はまた、当該分野で記載されている。例えばＤｏｏｌｅｙら、２００３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：２５−３３）およびそこに引用されている文献を参照されたい。ある実施態様において本発明で使用される抗体成分は、上記した好適な標的タンパク質の１つを認識するカメリッド（Ｃａｍｅｌｉｄ）抗体またはＶHHドメインであろう。特に配列番号１、３、５、６、１１または２７のいずれかに結合するカメリッド（Ｃａｍｅｌｉｄ）抗体またはＶHHドメインが好適であり、配列番号５、６、１１または２７のいずれかに結合するＶHHドメインが特に好適である。
本発明で使用される抗体および抗原結合断片はまた、その安定性を上昇させるように作成され、例えばジスルフィド結合により安定化される（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（１０）：１２３９−１２４５参照）。
上記したように抗体成分は、無傷のげっ歯動物タンパク質またはＲＳＥ（この用語はＲＳＰＥを含む）を抗原として使用するか、または非標的（すなわち、非げっ歯動物、例えばヒト）動物からの同種のタンパク質との同一性パーセントの低いものとして選択された適当な抗体／抗原結合断片をスクリーニングすることにより得られる。こうして本発明の抗体成分が非標的種からの同種のタンパク質と交差反応する確率が低下される。すなわち本発明の好適な実施態様において、抗体成分（および本発明のげっ歯動物防除剤も）は、非標的動物からの同種のタンパク質上の対応するエピトープよりげっ歯動物標的タンパク質上のエピトープに対する選択性を示す。すなわち本発明の好適な抗体成分は、非標的動物からの同種のタンパク質（または、同種のタンパク質）上の対応するエピトープに対するより大きな親和性でそこに（またはそこからＲＳＥが得られるげっ歯動物タンパク質に）結合することによりＲＳＥに対する選択性を示す。非標的動物には、ヒト、鳥、農場動物、および有害生物ではない野生動物を含む。
好ましくは本発明の抗体成分は、ヒトの同種のタンパク質に対する結合の低下を示し、さらに好ましくは結合しない。さらに好ましくは本発明の抗体成分は、ヒトの同種のタンパク質に対する結合の低下を示さない（または結合しない）のみでなく、少なくとも１つの他の非標的動物の同種のタンパク質に対する結合の低下を示す（結合しない）。
不明確さを避けるために本明細書において用語「結合する」は、本発明の抗体成分とエピトープまたはタンパク質との定性的または定量的相互作用を示す。
この用語が定性的に使用される場合、標的タンパク質、ＲＳＥまたはＲＳＰＥへの結合の特異性は、抗体成分の標的タンパク質、ＲＳＥまたはＲＳＰＥに置換可能な方法で結合する能力を示しており、ここで抗体結合の置換は、それに対して抗体が作成されたかまたはスクリーニングされた抗原（以後「特異抗原」と呼ぶ）の存在により生じる。かかる標的−タンパク質／ＲＳＥ／ＲＳＰＥ特異的抗体成分の非標的タンパク質（または非標的タンパク質からの対応するエピトープ）の結合が観察されないなら、または特異抗原により置換されない非標的タンパク質（または非標的タンパク質からの対応するエピトープ）への何らかの結合が観察されるなら、抗体成分は、非標的タンパク質または非標的タンパク質からの対応するエピトープへの結合より大きい親和性で標的タンパク質／ＲＳＥ／ＲＳＰＥに結合するという点で、抗体成分は標的タンパク質、ＲＳＥまたはＲＳＰＥ（適宜）に対する選択性を示すと見なされる。従って特異性と選択性は、適当な組織試料の免疫組織化学的解析および／または適切な試料を用いるＥＬＩＳＡにより測定される。
用語「結合する」が定量的に使用される場合、これは、相互作用するエピトープまたはタンパク質に対して抗体成分が少なくとも１０-6Ｍの親和性を有することを意味する。好ましくは親和性は、少なくとも１０-7Ｍ、さらに好ましくは１０-8Ｍ、さらに好ましくは１０-9Ｍ、さらに好ましくは１０-10Ｍ、および最も好ましくは１０-11Ｍ、またはそれ以上である。すなわち抗体成分がＲＳＥまたはＲＳＰＥ（またはＲＳＥもしくはＲＳＰＥが得られるタンパク質）に結合する場合、これは少なくとも１０-6Ｍの親和性を有し、さらなる実施態様においてこれは、１０-7Ｍ、少なくとも１０-8Ｍ、少なくとも１０-9Ｍ、および少なくとも１０-10Ｍの親和性を有する。好適な実施態様において抗体成分は、１つまたはそれ以上の非標的種（好ましくはヒト）からの同種のタンパク質上の対応するエピトープに結合しない（すなわち、非標的種からの同種のタンパク質への抗体成分の親和性は１０-6Ｍ未満である）か、またはその結合が低下している（すなわち、非標的種からの同種のタンパク質に対する抗体成分の親和性は、標的げっ歯動物タンパク質に対するより少なくとも１０倍小さい）。すなわち好適な実施態様において本発明の抗体成分がＲＳＥまたはＲＳＰＥ（またはＲＳＥもしくはＲＳＰＥが得られるタンパク質）に対して少なくとも１０-6Ｍの親和性を有する場合、非標的種からの同種のタンパク質に対する抗体成分の親和性は１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-5Ｍ未満またはそれ以下である；本発明の抗体成分がＲＳＥまたはＲＳＰＥ（またはＲＳＥもしくはＲＳＰＥが得られるタンパク質）に対して少なくとも１０-7Ｍの親和性を有する場合、非標的種からの同種のタンパク質に対する抗体成分の親和性は１０-6Ｍまたはそれ以下である；本発明の抗体成分がＲＳＥまたはＲＳＰＥ（またはＲＳＥもしくはＲＳＰＥが得られるタンパク質）に対して少なくとも１０-8Ｍの親和性を有する場合、非標的種からの同種のタンパク質に対する抗体成分の親和性は１０-7Ｍまたはそれ以下、好ましくは１０-6Ｍまたはそれ以下である；本発明の抗体成分がＲＳＥまたはＲＳＰＥ（またはＲＳＥもしくはＲＳＰＥが得られるタンパク質）に対して少なくとも１０-9Ｍの親和性を有する場合、非標的種からの同種のタンパク質に対する抗体成分の親和性は１０-8Ｍまたはそれ以下、好ましくは１０-6Ｍ未満またはそれ以下である。
標的および非標的タンパク質（ならびにそこからのエピトープ）への抗体成分の親和性は、適切な方法、例えば表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いる）を使用して測定される。
本発明のある実施態様においてげっ歯動物防除剤は融合タンパク質の形であり、ここで融合タンパク質は第１のタンパク質成分と第２のタンパク質成分とを含み、該第１のタンパク質成分は上記した抗体成分であり、該第２のタンパク質成分は、毒素、免疫原およびホルモンよりなる群から選択される。
第１のタンパク質成分は直接第２のタンパク質成分に結合してもよいが、２つの成分はリンカーペプチドにより間接的に結合されることが好ましい。リンカーペプチドは一般に、第１の成分と第２の成分が、１つの成分が他の成分の機能に悪影響を与える（例えば立体障害）ことなく必要に応じて機能するのに充分な長さである。本発明での使用に適した通常使用されるリンカーペプチドの例は（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）nであり、ここで「ｎ」は１より大きい整数かまたは１である。典型的にはｎは３より大きいかまたは等しい。好ましくはリンカーペプチドの一次配列は、厳しい加水分解環境および熱環境で安定であるように設計される。これは、例えばタンパク質分解機構を介するリンカーのプロセシングのための認識部位として作用するリンカー中の残基を除去または変異させることにより行われる。適当なリンカーペプチドのさらなる例は、Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎら、２００１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １４：７１１−７１５）、Ｈｅｎｎｅｃｋら、１９９８（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４０５−４１０）、およびＨｕｓｔｏｎら、１９９１（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８）に記載されているものである。
さらなる実施態様において、融合タンパク質が適切な場所に置かれた時に２つのタンパク質成分の制御分離／第２のタンパク質成分放出が行われるように、例えば融合タンパク質がいったんインターナリゼーションされると第２のタンパク質成分が細胞内に放出されるように、リンカーペプチド中に特異的不安定性を作成することが好ましい。記載された分離の制御は、いくつかの融合タンパク質の活性を増強するのに有用である。
上記したように融合タンパク質のある実施態様において、第２のタンパク質成分は毒素である。毒素は融合タンパク質に殺鼠活性を付与する：これは、外部性または内部性作用モードを介して、標的となるげっ歯動物細胞に対する毒性を示す。本発明のこの態様で使用するのに適した毒素には、特に膜を破壊するタンパク質であるリボシルトランスフェラーゼ、セリンプロテアーゼ、グアニリルシクラーゼアクチベーター、ＡＴＰａｓｅ介在イオン輸送に関与するタンパク質、カルモジュリン依存性アデニリルシクラーゼ、ＲＮＡグリコシダーゼ、およびリボヌクレアーゼがある。適当な毒素の具体例を以下の表２に示す。表２に記載の毒素のいくつかは毒素分子ファミリーの代表であり、この場合、これらのメンバーの任意の１つが本発明で使用できることを当業者は理解するであろう。
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本発明の実施態様で使用される好適な毒素には、グランザイムＢ（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）、ｃｙｔ２Ａ、β−プロチオニン、ＶＩＰ２Ａ、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、およびグラヌリシンがある。特に好適な毒素は、グランザイムＢ（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）、ｃｙｔ２Ａ、β−プロチオニン、ＶＩＰ２Ａ、およびゲロニンよりなる群から選択される。
上記のタンパク質毒素は、本発明の融合タンパク質中に完全に取り込んでもよい。あるいはかかる毒素のドメインまたは断片が毒性を付与する場合、そのドメインまたは断片は融合タンパク質中で第２のタンパク質成分として使用される。
別の実施態様において本発明の融合タンパク質中の第２のタンパク質成分は免疫原であり、すなわちげっ歯動物で免疫応答を誘発することができるポリ−またはオリゴ−ペプチドである。好適な実施態様において免疫原−本発明の融合タンパク質は免疫避妊薬として作用することができ、生殖を妨害することによりげっ歯動物防除剤として作用するであろう。精子または卵子特異的抗原、例えば乳酸脱水素酵素Ｃ、精子抗原ＰＨ−２０（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆら、１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５４３−６）、フェルチリン（ＰＨ−３０）、および透明帯抗原は、本発明の融合タンパク質中の第２のタンパク質成分として使用するのに適した免疫原である。
さらに別の実施態様において本発明の融合タンパク質中の第２のタンパク質成分は、ホルモンまたはタンパク質性ホルモン模倣物である。この実施態様において第２のタンパク質成分はげっ歯動物の生殖を妨害し防止し、従って融合タンパク質は繁殖の妨害によりげっ歯動物防除剤として作用する。本発明のこの実施態様で使用されるホルモンの例には、ゴナドトロピン放出ホルモンがある。
さらなる実施態様において上記融合タンパク質は、少なくとも１つの追加のタンパク質成分を含む。この追加のタンパク質成分（または複数の成分）は、上記の毒素、免疫原、ホルモン、またはタンパク質性ホルモン模倣物でもよい。従って抗体成分と少なくとも２つの追加のタンパク質成分とを含む融合タンパク質が構築され、ここで追加のタンパク質成分のそれぞれは融合タンパク質にげっ歯動物防除（すなわち、毒性もしくは避妊、または両方）機能を与える。第２のタンパク質成分および追加のタンパク質成分は、それぞれ同じかまたは異なるげっ歯動物防除機能を有し（すなわち、これらはそれぞれ独立に毒性であるかまたは避妊性である）、ここでこれらは同じ機能を有し、これらは同じかまたは独立に異なる作用モードを有する。追加のタンパク質成分が同じげっ歯動物防除機能を有し、少なくとも１つの追加のタンパク質成分が第２のタンパク質成分に対して異なる作用モードを有する場合、げっ歯動物防除剤の効力が増強される（げっ歯動物防除活性を付与する単一のタンパク質成分を含むげっ歯動物防除剤に対して）。例えば第２のタンパク質成分により付与される膜破壊活性は、げっ歯動物細胞の内部への第１のタンパク質成分の接近を容易にすることにより追加のタンパク質成分の機能活性を補助するため、融合タンパク質［ここで第２のタンパク質成分は細胞破壊性毒素（例えば、ペルフリンゴリシンＯ、アルファヘモリジン、スフィンゴメリナーゼ、デルタヘモリジン、アルファ毒素、ｃｙｔ毒素、グラヌリジン、メリチン、ペルフォリン、エキナトキシン、リステリオリジン、エアロリジン、ヘモリシンＡ、アメーバポア、Ｅ１ Ｔｏｒヘモリジン、ビブリオ・ダムセラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａ）ヘモリジン、ニューモリジン、ストレプトリジンＯ、カナガワ毒素、レプトスピラヘモリジン、ｃｒｙ毒素、ＶＩＰ３、チオニン、およびβ−プロチオニン）であり、追加のタンパク質成分は活性であるために細胞内でのインターナリゼーションを必要とする毒素（グランザイムＢ、ジフテリア毒素、コレラ内毒素、ＶＩＰ２、付属エンテロトキシン、コリシンＥ１、ＣＴＸ IV、２型リボゾーム不活性化タンパク質、例えばリシン、炭疽毒素、シュードモナス外毒素Ａ、バルナーゼ、１型リボゾーム不活性化タンパク質、例えばゲロニン、よりなる群から選択される）でもよい］は、特に有効なげっ歯動物防除剤である。好適な実施態様において融合タンパク質は、ｃｙｔ２Ａ、β−プロチオニン、およびグラヌリジンよりなる群から選択される少なくとも１つの毒素成分；およびグランザイムＢ、ＶＩＰ２Ａ、およびゲロニンよりなる群から選択される少なくとも１つの毒素成分を含む。
本発明の融合タンパク質は、第１のタンパク質成分（抗体成分）が第２のタンパク質成分のＮ末端側であるように構築されるか、または第２のタンパク質成分が第１のタンパク質成分のＮ末端側にあるように構築される。上記したようにある実施態様において、２つのタンパク質成分をリンカーペプチドを介して間接的に結合することが好ましい。すなわち本発明の融合タンパク質はＮからＣ末端に、第１のタンパク質成分がペプチド結合を介してリンカーペプチドに結合し、これは次にペプチド結合を介して第２のタンパク質成分に結合するか、またはＮからＣ末端に、第２のタンパク質成分がペプチド結合を介してリンカーペプチドに結合し、これは次にペプチド結合を介して第１のタンパク質成分に結合している。
融合タンパク質が追加のタンパク質成分を含む場合、これは第１の成分のＮ末端側であり、すなわち追加のタンパク質成分はペプチド結合によりＣ末端残基を介して第１のタンパク質成分のＮ末端に直接結合するか、またはペプチドリンカー（または追加のタンパク質成分）を介して間接的に第１のタンパク質成分のＮ末端残基に結合する。さらなる実施態様において追加のタンパク質成分は第２のタンパク質成分のＮ末端側であり、すなわち追加のタンパク質成分はペプチド結合によりＣ末端残基を介して第２のタンパク質成分のＮ末端に直接結合するか、またはペプチドリンカー（または追加のタンパク質成分）を介して間接的に第２のタンパク質成分のＮ末端残基に結合する。さらなる実施態様において追加のタンパク質成分は、ｉ）第１の成分のＣ末端側であり、すなわち追加のタンパク質成分はＮ末端残基を介してペプチド結合により第１のタンパク質成分のＣ末端残基に直接結合するか、またはペプチドリンカー（または第１のタンパク質成分）を介して間接的に第１のタンパク質成分のＣ末端残基に結合する；またはii）第２のタンパク質成分のＣ末端側であり、すなわち追加のタンパク質成分はＮ末端残基を介してペプチド結合により第２のタンパク質成分のＣ末端残基に直接結合するか、またはペプチドリンカー（または第１の追加のタンパク質成分）を介して間接的に第２のタンパク質成分のＣ末端残基に結合する。
本発明の抗体成分および／または融合タンパク質は、これらをコードする核酸を任意の適当なタンパク質発現系で発現させることにより産生される。すなわちさらなる態様において本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、第１のタンパク質成分をコードする核酸を第２のタンパク質成分をコードする核酸とフレーム内でクローニングすることにより得られる。第１のタンパク質成分と第２のタンパク質成分がペプチドリンカーを介して間接的に結合している時、リンカーをコードする核酸は分離され、融合タンパク質の２つのタンパク質成分とフレーム内である。
抗体成分をコードする核酸は、本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞から標準的分子生物学的方法を使用して単離される。あるいは抗体成分をコードする核酸は、再度標準的分子生物学的方法を使用して、本発明の抗体または抗原結合断片をコードするファージ表示または他のライブラリークローンから得られる。
第２のタンパク質成分（毒性または避妊成分）の例をコードする核酸配列は当該分野で利用可能であり、例えば表２に示すＥＭＢＬデータベース文献を参照されたい。
リンカーペプチドをコードする核酸は例えばリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドから新規合成される。
抗体成分または融合タンパク質が適当なタンパク質発現系で発現されるためには、融合タンパク質をコードする核酸は適当なプロモーター、および随時適当な転写ターミネーターに機能できる形で結合している。一般に融合タンパク質をコードする核酸が機能できる形で結合したプロモーターは、核酸が導入される宿主細胞中で融合タンパク質の発現を指令することができる任意のプロモーターである。すなわち融合タンパク質の抗体成分を細菌細胞中で発現したい場合、プロモーターは細菌細胞中で機能できるであろう。同様に抗体成分または融合タンパク質を真菌発現系で発現したい場合、プロモーターは真菌細胞中で機能でき、構築体を哺乳動物細胞培養物発現系または植物発現系中に導入したい場合は同じ理論が適用される。抗体成分または融合タンパク質が植物細胞および／または植物中で発現される場合は、種子特異的プロモーターの使用が特に好ましい。本発明の核酸が適当な転写ターミネーター領域に機能できる形で結合される場合、これは、本発明の抗体成分または融合タンパク質が発現される宿主細胞中で転写の停止を仲介するものである。この目的に適した転写ターミネーター領域は当該分野で記載されている。
本発明の抗体成分および／または融合タンパク質の発現のための適当な発現系には、微生物発現系、例えば細菌発現系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス発現系）、および真菌系、例えば酵母（例えば、サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の種、および他の真菌発現系（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種、トリコデルマ・ラエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、およびノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来の糸状菌発現系）；哺乳動物発現系、例えばＣＨＯ細胞、および植物発現系がある。本発明の融合タンパク質の発現に使用される好適な植物および植物細胞には、小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、オート麦、イネ、およびキビがある。当業者はこれらの発現系を周知しており、これらは当該分野で充分に記載されている。
本明細書に記載の新規げっ歯動物防除剤はまた、タンパク質結合体の形でもよい。すなわち本発明のさらなる態様は、毒性成分または避妊成分に化学的に結合した本明細書に記載の本発明の抗体成分を含むタンパク質結合体を提供する。ある実施態様において毒性成分または避妊成分は小さい化学物質であり、さらなる実施態様において毒性成分または避妊成分は、本発明の融合タンパク質に関し上記したタンパク質またはペプチドである。毒性成分が小さい化学物質である場合、本発明のこの態様で使用される適当な毒性成分の例は、コルヒチン；ドキソルビシン；カリケアミシン；非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）クラスの分子；サイトカラシン；抗凝固剤、例えばブロジフィクム、ジフェナクム、ブロマジオロン、フロクマフェン、ジフェチアロン、ヒドロキシクマリン類、インダン−ジオン類；カルシフェロール；ブロメタリン；フルプロパジン；亜リン酸亜鉛；シリロシド；（モノ）フルオロ酢酸ナトリウム；フルオロアセトアミド；アルファクロラロース；硫酸タリウムがある。
避妊成分が小さい化学物質である場合、本発明のこの態様で使用される適当なホルモンおよびホルモン様化合物には、例えばプロゲステロンおよびエストロゲン（いずれも合成および天然）およびジアザコン（すなわち、２０，２５ジアザコレステロール）がある。
タンパク質結合体の抗体成分は上記したように得られ、毒性成分または避妊成分に直接化学的に結合してもよい。典型的にはこの結合にはヘテロ２官能性物質の使用が関与し、これは当該分野で記載されているようにジスルフィドまたはチオエステル結合を与える（例えば、架橋試薬の使用に関する標準的方法については、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．「バイオ結合体法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン、１９９６を参照）。
毒性成分または避妊成分が小さい化学物質であるさらなる実施態様において、毒性成分、ホルモンまたはホルモン様化合物はカプセル化され、カプセルは本発明の抗体または抗原結合断片に結合される。具体的な実施態様においてカプセルは、上記したように化学的結合を介して結合される。別の具体的な実施態様において本発明の抗体または抗原結合断片は、カプセルに結合する第２の結合成分に化学的に結合されるかまたはペプチド結合を介して融合される。例えば本発明の抗原結合断片は、二重特異的または多重特異的結合分子に１つの特異性を提供するのに使用され、ここで第２の（または追加の）特異性はカプセルのためであり、この第２の（または追加の特異性）は、カプセルに特異的に結合する分子（例えば抗原結合断片）により提供される。
さらなる態様においてタンパク質結合体の抗体成分は、２つまたはそれ以上の毒性成分もしくは避妊成分に化学的に結合される。さらなる毒性成分または避妊成分は、タンパク質もしくはペプチド成分または小さい化学物質の形でもよい。少なくとも１つの毒性成分または避妊成分がタンパク質もしくはペプチド成分である場合、追加の成分は上記した毒素、免疫原、ホルモン、またはタンパク質性ホルモン模倣物でもよい。少なくとも１つのさらなる毒性成分または避妊成分が小さい化学物質である場合、これは上記した毒性成分またはホルモンまたはホルモン様化合物でもよい。
本発明のこの態様のある実施態様において、それぞれがタンパク質結合体にげっ歯動物防除（すなわち、毒性または避妊性、または両方）機能を付与する少なくとも２つの追加の成分に化学的に結合した、上記した抗体成分を含むタンパク質結合体が作成される。第２の追加の成分（および追加の成分）は（それぞれ）、第１の追加の成分に対して同じかまたは異なるげっ歯動物防除機能を有し、ここでこれ（ら）が同じ機能を有する場合、これ（ら）は、本発明の融合タンパク質について上記したように、同じかまたは異なる（独立に異なる）作用モードを有する。ある具体的な実施形態においてタンパク質結合体は、第２の毒性成分または避妊成分の１つまたはそれ以上の分子に化学的に結合した上記抗体成分を含む。結合部位は、結合反応で使用される化学に依存する。２つの異なる追加の成分を第１の（抗体）成分に結合することが好ましい場合、異なる追加の成分が、第１の成分上の同じ部位への結合について互いに競合しないことを確実にするために、各追加の成分についての異なる化学的結合法を使用することが好ましい。
本発明のさらなる態様において、上記した融合タンパク質またはタンパク質結合体を含むげっ歯動物防除剤が提供され、ここで融合タンパク質またはタンパク質結合体は少なくとも２つの抗体成分を含む。ある実施態様において各抗体成分は同じ標的タンパク質に結合し、こうしてその標的組織へのげっ歯動物防除剤の結合の確率を上昇させ、またげっ歯動物防除剤の結合活性を上昇させる可能性もある。かかる実施態様において抗体成分は同じかまたは異なるってよい。抗体成分が異なる場合、これは標的タンパク質中の同じＲＳＥまたはＲＳＰＥに結合する異なる抗体成分を包含するか、またはさらに好ましくは各抗体成分が同じ標的タンパク質内の異なるＲＳＥまたはＲＳＰＥに結合する異なる抗体成分を包含する。さらなる実施態様においてげっ歯動物防除剤は、少なくとも２つの異なる標的タンパク質に結合する抗体成分を含む。単一の標的タンパク質内の異なるＲＳＥまたはＲＳＰＥに結合する抗体成分、および／または異なる標的タンパク質に結合する抗体成分を含む実施態様は、げっ歯動物防除剤に対して起きる耐性の発生を遅延させるのに、または可能な標的部位の１つの耐性を妨害するのに特に有用である。
本発明の抗体、抗原結合断片、融合タンパク質、およびタンパク質結合体はげっ歯動物を防除するのに有用であり、例えばこれらは、げっ歯動物を死亡させる方法で、またはげっ歯動物の繁殖を防ぐ方法で使用される。すなわちさらなる態様において、本明細書に記載の抗体、抗原結合断片、融合タンパク質、またはタンパク質結合体を含むかこれらからなるげっ歯動物防除剤が提供される。
第２のタンパク質成分が毒素であるかまたは抗体もしくは抗原結合断片が毒性成分もしくはタンパク質／ペプチド毒素に結合している本発明の融合タンパク質とタンパク質結合体は、げっ歯動物を死亡させることによりげっ歯動物防除を達成する（すなわち、かかる融合タンパク質とタンパク質結合体はその作用モードが殺鼠性である）。抗体または抗原結合断片成分がげっ歯動物の消化管の上皮で発現されるタンパク質を認識する場合、融合タンパク質またはタンパク質結合体は上皮に結合するであろう。融合タンパク質／タンパク質結合体中に存在する毒素または毒性成分の種類に依存して、毒素または毒性成分は細胞膜を破壊することがある。消化管の上皮の完全性が傷害され、消化管中に発生する病変がげっ歯動物を死亡させる。あるいは毒素または毒性成分が細胞内作用モードにより中毒を示す場合、結合した融合タンパク質またはタンパク質結合体はエンドサイトーシスを介するインターナリゼーションに依存する。融合タンパク質またはタンパク質結合体がいったん細胞に入ると、毒素／毒性成分は中毒を引き起こすことができ、これは最終的にげっ歯動物を死亡させる。
第２のタンパク質成分が免疫原である融合タンパク質はまた、げっ歯動物細胞への摂取を必要とする。げっ歯動物細胞内にいったん存在すると、免疫原に対する免疫応答が始まる。すなわち免疫原が卵子または精子特異的抗原である場合、これは生殖の発生を防止する免疫応答を開始させる。融合タンパク質の抗体および抗原結合断片は、げっ歯動物に吸収される（エンドサイトーシスにより）免疫原の量を有利に増加させ、また補助剤として作用して、適当な免疫応答が始まる確率を上昇させる。
第２のタンパク質成分または結合成分がホルモンまたはホルモン様化合物である本発明の融合タンパク質とタンパク質結合体は、同様にげっ歯動物細胞への摂取を必要とする。げっ歯動物細胞内にいったん存在すると、ホルモン／ホルモン様化合物は生殖のホルモン調節を妨害し、こうして繁殖を防ぐことによりげっ歯動物を防除する。
本明細書に記載の融合タンパク質とタンパク質結合体の抗体／抗原結合部分のげっ歯動物特異性は、本発明のげっ歯動物防除剤にいくつかの利点を与える。げっ歯動物組織に対する高い特異性は、げっ歯動物防除剤がげっ歯動物組織に特異的に標的化することを意味し、こうして毒性／免疫学的／ホルモン成分の摂取／活性を促進する。次にこの特異的標的化は、有効な防除により必要なげっ歯動物防除剤がより少なく、環境に存在するげっ歯動物防除剤がより少なく、環境に存在するものが、非標的種には特異的ではなく、従って非標的種より吸収され損傷を引き起こす可能性が小さいことを意味する。
本発明のげっ歯動物防除剤は、活性成分として本発明の融合タンパク質またはタンパク質結合体を少なくとも１つの添加剤、希釈剤、および／または担体とともに含む組成物として調製される。特定の添加剤には、例えばげっ歯動物の誘引物質として作用する化合物、げっ歯動物にとって組成物をおいしくする化合物、追加のげっ歯動物防除剤、およびげっ歯動物防除剤を安定化または防御するのに作用する化合物がある。適当な誘引物質には、小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、オート麦、イネ、およびキビなどの食料がある。本発明で使用される美味増強化合物には、甘味剤（例えば、アセスルフェーム−Ｋ、アリテーム、アスパルテーム、ブラゼイン、シクラメート、サッカリン、スクラロース、ショ糖、グルコース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、タウマチン、モネリン、イソマルト、およびイソマルツロース）、植物油または動物油（例えば、トウモロコシ、大豆、およびピーナツ油、魚油）、および乾燥酵母がある。適当な安定性増強／防御性化合物には、げっ歯動物に摂取されるとタンパク質分解または加水分解からげっ歯動物防除剤を防御するかまたは防ぐもの、例えば制酸剤およびｐＨ放出カプセルの生成で使用される化合物がある。
本発明の組成物で使用される適当な希釈剤および担体には、既知のげっ歯動物防除剤とともに希釈剤および／または担体として使用されるもの、例えば蝋、および結合剤、例えばセルロースエーテル、デンプン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、グアールガム、カラゲニン、ゼラチン、カラヤゴム、キサンタンゴム、アラビアゴム、ローカストビーンガム、トラガカントゴム、ペクチン、およびポリアクリレートがある。
本発明の組成物は、上記添加剤、希釈剤または担体の任意の１つ以外におよび／またはその代わりに、例えば本発明の導入で記載したような追加のげっ歯動物防除剤を含む。特に本発明はまた、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の新規げっ歯動物防除剤と、少なくとも１つの第１世代抗凝固剤および／または少なくとも１つの第２世代抗凝固剤との混合物を含む。本発明のこの態様で使用される好適な第１世代抗凝固剤には、ヒドロキシクマリン類およびインダン−ジオン類があり、ワーファリン、クマコール、クマフリル、およびクマテトラリルが特に好適なヒドロキシクマリン類であり、プリンドン、ジファシノン、およびクロルファシノンが特に好適なインダン−ジオン類である。本発明のこの態様で使用される好適な第２世代抗凝固剤には、ブロマジオロン、ブロジファクム、ジフェナクム、フロクマフェン、およびジフェチアロンがある。
本発明はまた、前記した少なくとも２つの新規げっ歯動物防除剤の混合物ならびにかかる混合物を含む組成物（前記）を包含する。例えばげっ歯動物防除剤がげっ歯動物で発現されるタンパク質の細胞外エピトープに結合する抗体成分である（すなわち抗体成分自体が機能性げっ歯動物防除剤である）場合、これは１つまたはそれ以上の追加のげっ歯動物防除剤と一緒にされ、ここで追加のげっ歯動物防除剤は抗体成分と１つまたはそれ以上の毒性成分または避妊成分を含む（すなわち１つまたはそれ以上の追加のげっ歯動物防除剤は本明細書に記載の融合タンパク質またはタンパク質結合体である）。さらなる態様において混合物は、本明細書に記載の２つまたはそれ以上の融合タンパク質および／またはタンパク質結合体を含む。
ある実施態様において本発明の融合タンパク質は植物で産生され、発現される融合タンパク質を含有する植物物質はげっ歯動物防除の餌として使用される。好ましくは融合タンパク質を産生する植物は、げっ歯動物の食物源として作用することができるものであり、例えば小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、オート麦、イネ、およびキビはすべて、本発明のこの態様に従って本発明の融合タンパク質の発現のために適した植物である。ある実施態様において、融合タンパク質は植物の種子中で発現されることが特に好適である。こうして本発明の融合タンパク質を発現する植物からの穀物は直接餌として使用される。
本発明の上記した組成物ならびに本発明の融合タンパク質を含有する植物および／または穀物は、げっ歯動物防除剤として使用される。従ってさらなる態様において本発明は、げっ歯動物が常に出入りする場所にげっ歯動物防除剤を置き、該げっ歯動物の該げっ歯動物防除剤の摂取により該げっ歯動物が死亡するようにすることを含んでなる、げっ歯動物を死亡させる方法を提供する。当業者はまた本発明が、げっ歯動物が常に出入りする場所にげっ歯動物防除剤を置き、該げっ歯動物の該げっ歯動物防除剤の摂取により生殖能力が阻止されるようにすることを含んでなる、げっ歯動物の繁殖を防ぐ方法も提供することを理解するであろう。
本発明のげっ歯動物防除剤の効力を試験するために、種々のインビトロおよびインビボ試験が行われる。適当なインビトロ試験の例は、Ｈｅｙｌｉｎｇｓ １９９１（Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０７：４８２−２９３）と実施例９に記載される消化管ループアッセイ（ｇｕｔ ｌｏｏｐ ａｓｓａｙ）である。
本発明のげっ歯動物防除剤の殺鼠性のインビボ評価の典型的な方策は以下の要件に基づく：１）試験に使用される動物の数を最小にする、２）コストを低く維持する、３）有用な情報を迅速に得る、４）有望な活性物質を排除しない。
試験条件が注意深く管理できるように、最初の試験は通常実験室で行われる。一連の試験操作が使用される。この一連の操作は、連続的決定プロセスを使用して活性物質を容認または拒絶することを可能にする。通常の被験体はノルウェー（Ｎｏｒｗａｙ）ラット、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）およびハウスマウス（Ｈｏｕｓｅ ｍｏｕｓｅ）、マウス（Ｍｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）である。クマネズミ（Ｒｏｏｆ ｒａｔ）は別の重要な被験体であるが、実験室系統としては利用可能ではなく、これは評価プログラムの後半の段階でのみ試験される。抗凝固剤に耐性であるげっ歯動物の系統もまた、これらの動物に対して効力を試験するために、実験室プログラムの後半の段階で使用される。
実験室試験で活性があり有望な本発明のげっ歯動物防除剤は次に野外で評価される。野外試験はすべての重要な有害げっ歯動物種について種々の自然の条件で行われる。
当業者は、容易に入手でき実験室（ＥＰＰＯ／ＯＥＰＰ．１９９９、殺鼠剤および殺鼠剤調製物の毒性と許容性の評価のための実験室試験；ＯＥＥＰ／ＥＰＰＯ ＰＰ１／１１３（２）：８９−１０１）と野外（ＥＰＰＯ／ＯＥＰＰ．１９９９、植物防御製品の効力評価のためのガイドライン：共ヒト生のげっ歯動物ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、クマネズミ（Ｒ. ｒａｔｔｕｓ）に対する野外試験；ＯＥＥＰ／ＥＰＰＯ ＰＰ１／１１４（２）：１０２−１１３）での殺鼠剤の論理的な試験法を示すガイドライン文書を参照されたい。英国（著者名無し、２００５、非農薬殺虫剤製品である殺鼠剤の認可のための効力データ要件についてのガイドライン、Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ、ブートル（Ｂｏｏｔｌｅ）、英国、３０頁）、ヨーロッパ連合（著者名無し、２００２、殺生物剤製品の販売についてのヨーロッパ議会と協議会の支持９８／８／ＥＣの添付書類ＶＩを支持する手引きの技術メモ。製品の許可と登録の一般的原理と実際的方法。欧州委員会、２００２年７月、２１５頁）およびアメリカ合衆国における規制要件を満足する試験方法についての、勧告が入手できる。
本発明のげっ歯動物防除剤の効力を評価するために実験室で行われる典型的な一連の試験には、経口挿管試験、無選択食餌試験、および選択食餌試験がある。これらの試験のさらなる詳細を以下に概説する。
経口挿管：活性物質の力価を確立するための最初の試験は活性物質の送達であり、ポリエチレングリコールのような不活性液体で輸送されて、胃管栄養法を使用して被験体の胃に直接送達される。こうして致死用量パーセンタイル統計量を決定するために正確な用量が送達される。試験は、被験体種の消化管中の条件下で活性物質が活性を維持する能力および消化管膜の通過に関する情報を提供する。試験はまた活性物質の固有の毒性についての情報も提供する。
無選択食餌試験：ほとんどすべての市販の殺鼠剤製品は調製された餌として提供されている。一連の試験の次の段階は、活性物質（この場合、本発明のげっ歯動物防除剤）を含有する餌の調製である。食用の餌として提供された時活性物質が活性があるかどうかを確立するために、「無選択食餌試験」（ここで個々にケージに入れられた被験体は提供された実験用餌のみを食べる）をまず行う。試験用餌は通常自由に利用できる。経口挿管試験で得られたような情報以外に、無選択食餌試験は、被験体種の消化過程で餌から取り出される活性物質の能力についての情報を提供する。
選択食餌試験：調製餌中の活性物質により管理できるためには、げっ歯動物は代替自然食物の存在下で致死量を摂取するために充分量の餌を消費しなければならない。従って活性物質（すなわち本発明のげっ歯動物防除剤）のおいしさは評価のための重要な側面である。計量された濃度の餌基剤に活性物質を加える選択試験が行われる。個々にケージに入れた被験体に、活性物質を含有する試験餌と活性物質を含有しない同じ餌のいずれかを選択させる。被験体により検出される活性物質の濃度を確立するために、このような一連の試験を行う。通常このような検出は、活性物質を含有する餌を嫌うことで証明される。評価の重要な点は、被験体により検出され顕著な嫌悪感を示す濃度が、試験餌中の致死用量を与えるのに必要な濃度より低いことである。
市販調製物の開発中に製造される実験的餌についてさらなる選択試験を行う。これらの選択試験は、実験的調製物と「抗原刺激食餌」の提供を含む。抗原刺激食餌は、実験的調製物の適度においしい代替物を提供するように構成される。かかる試験で使用される典型的な「抗原刺激食餌」は「ＥＰＡ食餌」である。これは、一定量のオート麦、ひき割りトウモロコシ、糖および油を含む調製物である。その消費量が、被験体により消費される抗原刺激食餌と実験的調製物の合計の最小の３０％を含む実験的調製物は、野外試験の候補と見なされるのが一般的である。
実験室での試験後、野外環境で効力を試験する。げっ歯動物は、自然の条件下でのみ充分示される複雑で高度に適応性の行動を有する。従って野外条件下で殺鼠剤活性物質と調製品の有効性を評価するために野外試験が行われる。通常野外試験は、ある範囲の標的種に対して、実際的げっ歯動物防除処理が行われる環境に典型的な種々の自然環境で行われる。
活性物質を含有する典型的な餌とともに提供された時、標的げっ歯動物種における自然の挙動を調べるために、野外試験は製品開発の早い段階で、市販化を目的とする実験的調製物を使用して行われる。
次に野外試験はまた、実際的条件下でその効力を証明するために、市販の餌製品について行われる。
本発明の種々の態様および実施態様を例により詳細に説明する。本発明の範囲を逸脱することなく、詳細部分の修飾が可能であることを理解されたい。
不明確さを避けるために、本出願の本文内に文献、特許出願、または特許が引用されるが、該引用の全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
実施例１ ＲＳＰＥの作成と調製
１．１ ペプチドの選択と合成
げっ歯動物の消化管上皮上に存在するタンパク質標的候補は、文献とバイオインフォマティクスアプローチにより同定される。げっ歯動物特異的ペプチドエピトープ（ＲＳＰＥ）はこれらのタンパク質中で以下の基準に従って同定される：ＢＬＡＳＴ整列を使用してマウスとラット配列間の高配列同一性（好ましくは８０〜１００％同一性）と、げっ歯動物とヒト配列間の低配列同一性（好ましくは０〜４０％同一性）、および他の種との有意なヒットが無い；その親水性プロフィール（表面確率の指標）；柔軟性と２次構造の予測。親水性、柔軟性、および２次構造を予測するのに使用されるアルゴリズムは、ＤＮＡｓｔａｒとＶｅｃｔｏｒＮＴＩスイートのプログラムにより提供される。
いったん適当なＲＳＰＥが同定されると、ペプチドはＦｍｏｃ固相合成を使用して合成され、約９０％の純度まで精製される。以下の表３に示すペプチドが合成されている。
該当する場合、キャリアータンパク質への指令結合を可能にするためにＮ末端システインが配列に付加される。あるいはおよび該当する場合、キャリアータンパク質への指令結合を可能にするためにＮ末端アミノ酸はブロックしないまま配列が合成される。結合の必要が無い時、Ｎ末端アミノ酸はアセチル化によりブロックされる。さらにＣ末端アミノ酸はアミド基によりブロックされる。
Figure 0005032458
１．２ ＢＳＡへのペプチドの結合
Ｎ末端システイン残基を含有するペプチドは、ヘテロ２官能性架橋剤ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを使用してＢＳＡに結合される。ＢＳＡ中の病変残基上の１級アミンとペプチド中のシステイン残基上のスルフヒドリル基を介して、ＫｉｔａｇｏｗａとＡｉｋａｗａ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７９：２３３−２３６（１９７６）に記載のように結合が行われる。
ＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、プール（Ｐｏｏｌｅ）、ドルセット（Ｄｏｒｓｅｔ）の２５ｍｇ／ｍｌ溶液を０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で調製し、ＭＢＳ（ペルビオ（Ｐｅｒｂｉｏ）、チェシャー（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ））の２５ｍｇ／ｍｌ溶液をジメチルホルムアミド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で作成する。３０μｌのＭＢＳ溶液を１ｍｌのＢＳＡ溶液を攪拌しながら滴下して加え、暗所で室温で４５分インキュベートする。活性化ＢＳＡ溶液を次に、あらかじめ０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化させておいたＰＤ１０ゲルろ過カラム（ジーイーヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、バッキンガムシャー（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ））に通過させる。ＢＳＡ含有画分を２８０ｍｍの吸収で同定しプールする。２ｍｇのペプチドを１ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に溶解させる。充分な活性化ＢＳＡ溶液をペプチドに加えて、３０：１モル比のペプチド：ＢＳＡを得る。これは室温で４時間インキュベートし、次に４℃で暗所で混合しながら一晩インキュベートする。結合したペプチドを−２０℃で保存する。
Ｎ末端にリジン残基または１級アミンを含有するペプチドを、２工程グルタルアルデヒド法を使用してＢＳＡに結合する。結合は、ＢＳＡとペプチド中の１級アミン基との間であり、これは「バイオ結合体法（Ｂｉｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９６、５８３〜５８４頁の方法に基づく。
ＢＳＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．８）中で作成する。グルタルアルデヒド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を最終濃度１．２５％になるように加え、混合物を室温で攪拌しながら１２時間インキュベートする。活性化ＢＳＡ溶液をあらかじめＰＢＳで平衡化させておいたＰＤ１０ゲルろ過カラムに通過させる。ＢＳＡ含有画分を２８０ｍｍの吸収で同定しプールする。２ｍｇのペプチドを１ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）に溶解させ、充分な活性化ＢＳＡ溶液をペプチドに加えて、１０：１モル比のペプチド：ＢＳＡを得る。混合物を室温で４時間インキュベートする。過剰の反応部位を４０μｌの１Ｍエタノールアミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を加えてブロックする。結合したペプチドを−２０℃で保存する。
実施例２ 抗体成分の作成
上記実施例１に記載されているように合成しＢＳＡに結合したペプチドを使用して、げっ歯動物で発現されるタンパク質の細胞外エピトープに結合する抗体を作成する。
２．１ ウサギ免疫プロトコール
ニュージーランド白色ウサギをポリクローナル抗体産生のために使用する。最初の投与でフロインド完全アジュバント（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用してウサギに１００μｇのタンパク質を皮下投与して免疫する。次に２８日、５６日、および８４日目に、フロインド不完全アジュバント（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中の１００μｇのタンパク質を皮下投与して３回の追加免疫を行う。最初の免疫の前に前血液を採取し、第３回目の投与後の１０〜１４日目に試験血液を採取し、第４回目の投与後１０〜１４日目にハーベスト（ｈａｒｖｅｓｔ）血液を採取する。
以下のＲＳＰＥのそれぞれについて、２羽のウサギを免疫し、ポリクローナル抗体血清を作成した：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５。
以下のＲＳＰＥのそれぞれについて１羽のウサギを免疫した：配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４。
２．２ マウス／ハムスター免疫プロトコール
モノクローナル抗体産生のためにマウスとハムスターを使用し、最初の投与でフロインド完全アジュバント中の２０μｇのタンパク質を皮下投与して免疫する。次に、２８日と５６日目に２０μｇのタンパク質を２回皮下投与する。用量は２８日目にフロインド不完全アジュバント中で投与し、５６日目はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で投与した。投与３後の７日目に試験血液を採取した。３回目の投与後少なくとも６週間後に、マウスをＰＢＳ中の２０μｇのタンパク質を静脈内投与して追加免疫する。４日後、融合のために脾臓を採取する。
以下のＲＳＰＥのそれぞれでマウスを免疫し、ポリクローナル抗体血清を作成した：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９。
２．３ モノクローナル抗体の産生
Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．とＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５））に基づく方法を使用して、モノクローナル抗体を作成する。採取した脾臓から、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペイズリー（Ｐａｉｓｌｅｙ））を用いて２０ゲージ針付きシリンジでリンパ球を洗浄する。ＮＳ０ミエローマ細胞（ヨーロッパ細胞培養物コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ポートンダウン（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）、ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ））を、１０％（ｖ／ｖ）胎児牛血清（ピーエーエー（ＰＡＡ）、イエオビル（Ｙｅｏｖｉｌ）、サマーセット（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ））、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＨＴサプリメント、および５０単位／ｍｌペニシリンと５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より）を含有するＤＭＥＭ中で３７℃で５％ＣＯ2で、５×１０5／ｍｌの密度まで培養する。単一の脾臓からのリンパ球（約２×１０8）を２×１０7のＮＳ０ミエローマ細胞と混合する。２０００×ｇで４分間遠心分離後、細胞ペレットを静かに再懸濁し、７５ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ８）（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ルイス（Ｌｅｗｅｓ）、イーストサセックス（Ｅａｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ））中の５０％（ｗ／ｗ） ポリエチレングリコール（１５００）の１ｍｌを滴下して加えて融合させる。Ｈ１クローニングサプリメント（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を補足した完全培養培地（前述）を最終容量５０ｍｌになるまでゆっくり数分間かけて加える。得られた融合溶液を５つの無菌マイクロタイター細胞培養プレート（ヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、ローボロー（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ）、レイチェスタシャー（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ））で１００μｌ／ウェルで４時間３７℃で５％ＣＯ2で培養した後、４％（ｖ／ｖ）１×ＨＡＴ選択培地（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有する完全培養培地１００μｌ／ウェルを加える。融合の１４日後、抗体捕捉酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、Ｅｎｇｖａｌｌ Ｅ．とＰｅｒｌｍａｎｎ Ｐ．、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８：８７１−８７４（１９７１）；Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．ら、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８８，１８２〜１８３頁に記載の方法に基づいて、培養上清をペプチド特異的抗体について測定する。限界希釈と次の再測定により少なくとも２回のクローニングして選択ハイブリドーマ細胞を採取し、ハイブリドーマのクローン性と安定性を確認する。胎児牛血清中１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、プール（Ｐｏｏｌｅ）、ドルセット（Ｄｏｒｓｅｔ））からなる凍結培地中で、凍結速度１℃／分で８０分間、次に液体窒素中で保存して、凍結ハイブリドーマのバンクを調製する。選択されたモノクローナル抗体をスケールアップ組織培養により産生する。
配列番号１、配列番号５、配列番号１１、配列番号６および配列番号２７で免疫したマウスの脾臓からのリンパ球を使用して、ハイブリドーマ融合体が得られた。マウスＧＬＵＴ７（配列番号１１）からのＲＳＰＥに対する抗体を産生する４つの安定なモノクローナル細胞株を単離し、増殖させ、凍結する。ラットＣＦＴＲ（配列番号５）からのＲＳＰＥに対する抗体を産生する４つの安定なモノクローナル細胞株が単離された。ラットＰｅｐＴ１（配列番号１）からのＲＳＰＥに対する抗体を産生する７つの陽性モノクローナル細胞株を単離し、増殖させ、凍結した。
２．４ ファージ表示ライブラリーからの抗体成分の同定と単離
２．４．１ ナイーブなカメリド（Ｃａｍｅｌｉｄ）ＶHHファージ表示ライブラリーのスクリーニング
上記実施例１．２に記載のように化学合成と以後のＢＳＡへの結合により、ナイーブなラーマ・グラーマ（Ｌｌａｍａ ｇｌａｍａ）ＶHHＭ１３糸状ファージ表示レパートリーのスクリーニングのためのＲＳＰＥを調製する。ファージ表示免疫結合ドメインのスクリーニングは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙとＪｏｈｎｓｏｎ（「ペプチドとタンパク質のファージ表示（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、９８〜１００頁、Ｋａｙ、ＷｎｔｅｒとＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、１９９６、アカデミックプレスインク（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））に記載されたような確立された方法に従う。ＲＳＰＥ：：ＢＳＡ結合体を、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６）緩衝液で１００μｇ／ｍｌの濃度で適用して一晩インキュベートして、マキシソルブイムノチューブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ）（ヌンク（Ｎｕｎｃ））の内表面に接着させる。ＰＢＳで３回洗浄して遊離のＲＳＰＥ：：ＢＳＡ結合体を取り出し、次にＰＢＳ／２％スキムミルクタンパク質（ＰＢＳＭ）を添加し３７℃で２日間インキュベートして表面をブロックする。イムノチューブを必要なＲＳＰＥで感作後、４ｍｌのＰＢＳＭ中１０12〜１０13のファージを添加し室温で２時間インキュベートして「パニング」を行う。この工程の後、チューブの内容物を吸引し、チューブをＰＢＳ／０．１％ツイーン２０で２０回洗浄し、次にＰＢＳでさらに２０回洗浄する。次にイムノチューブ結合ファージ（大部分のＲＳＰＥ：：ＢＳＡ特異的ＶHH結合物である）を１ｍｌの１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を１０分間添加して溶出させる。溶液を０．５ｍｌの１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．４）を含有する新鮮なチューブに移して中和する。次に溶出したファージを使用して、混合し３７℃で３０分インキュベートして対数期のＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を感染させて、次に２４×２４ｃｍの２×Ｙ／２％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート（ヌンクバイオアッセイディッシュ（Ｎｕｎｃ ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｄｉｓｈ））に蒔いて３７℃で一晩インキュベートする。翌日プレートを引っ掻いて、ＲＳＰＥ：：ＢＳＡに結合体に対する結合特異性を有する配列を含有する細胞（これは、ファジミッドクローンの濃縮され増加した集団である）を取り出す。ＲＳＰＥに対する高親和性を示すこの集団からクローンをさらにスクリーニング／選択するために、ヘルパーファージ（例えばＭ１３−ＫＯ７またはＶＣＳ−Ｍ１３）を添加してファージ粒子を「レスキュー」する。簡単に説明すると、最後の工程からの細胞を２５０ｍｌの円錐フラスコ中の５０ｍｌの２×ＹＴ／２％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンピシリン中に接種し、ＯＤ600が約０．５になるまで３０℃でインキュベートする。次にヘルパーファージを加えて、１：１比のヘルパーファージ対細菌（典型的には２×１０10ｐｆｕ／５０ｍｌ）を得て、次に３７℃で１時間インキュベートする。次に細胞を３０００ｇで１０分間遠心分離して沈降させ、上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、これを使用して２リットルのフラスコ中の新鮮な培地［５００ｍｌの２×ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／５０μｇ／ｍｌカナマイシン（グルコース無し）］に接種する。この培養物を激しく攪拌しながら３０℃で一晩インキュベートし、次に１００ｍｌの２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌを４℃で３０分添加してファージ−ＶHH粒子を採取する。次に沈降したファージを４０００ｇで１０分間遠心分離して集め、５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、次のスクリーニングの準備ができる。各ラウンドのパニングでイムノチューブを感作するのに使用されるＲＳＰＥ：：ＢＳＡ結合体の量を減らすことにより、選択プロセスの効率が改良される。さらにいくつかの物理化学的特性（例えばタンパク質分解安定性）を示すファージ−ＶHH粒子の選択に偏らせる工程を含むように、選択プロセスを調整することができる。例えばＭ１３ファージ粒子はいくつかのタンパク質分解酵素（例えばトリプシンおよびキモトリプシン）によるタンパク質分解に対して耐性（Ｓｃｈｗｉｎｄら、１９９２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：４３１−４３６）であり、この性質は構造的に安定な変種の選択のためにファージ表示で利用することができる（ＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎとＷｉｎｔｅｒ、１９９８、Ｆｏｌｄｉｎｇ ＆ Ｄｅｓｉｇｎ ３：３２１−３２８）ことが知られている。
ＲＳＰＥに対する所望の親和性と選択性を示す個々のクローンを選択するために、２×ＹＴ／２％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート（パニング工程後に溶出ファージにより感染させたＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の連続希釈試料から得られる）上のユニークなコロニーを取り上げ、ウェル当たり１５０μｌの２×ＹＴ／２％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する９６ウェル培養ブロックに並べ、ＯＤ600が約０．５に達するまで３０℃で振盪してインキュベートする。次に各ウェルにヘルパーファージを加えて、１：１比のヘルパーファージ：細菌を得て、次に３７℃で１時間振盪してインキュベートする。次に細胞を３０００ｇで遠心分離して沈降させて培地を除去し、１．５ｍｌの２×ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／５０μｇ／ｍｌカナマイシン（グルコース無し）と交換し、激しく振盪しながら３０℃で一晩インキュベートを続ける。次に２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌを４℃で３０分添加し４０００ｇで遠心分離して各ウェルからファージ粒子を採取し、ＰＢＳに再懸濁する。これらのクローンファージ試料は、抗ファージ抗体−ＨＲＰ複合体を使用して固定化ＲＳＰＥに対する相対的結合親和性を測定するＥＬＩＳＡで使用するか、または非アンバーサプレッサー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主（ＨＢ２１５１株）をファージで感染させて可溶性ＶHHが発現させるのに使用される。ＩＰＴＧ誘導を使用して９６ウェル培養物と可溶性の分泌されたＶHHの発現が可能になり、粗培養培地（可溶性ＶHHを含有する）またはＩＭＡＣ精製ＶHH（内部ヘキサヒスチジンタグにより）をＥＬＩＳＡで使用して、固定化ＲＳＰＥへの結合を測定する。この場合適当な検出抗体は、可溶性ＶHHタンパク質上に存在するｃ−Ｍｙｃタグを検出する９Ｅ１０−ＨＲＰ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））である。
まず、上記したナイーブなカメリド（Ｃａｍｅｌｉｄ）ファージ表示ライブラリーに対して以下のＲＳＰＥをＲＳＰＥ：：ＢＳＡ結合体としてスクリーニングする：配列番号５を有するＲＳＰＥ、配列番号６を有するＲＳＰＥ、配列番号１１を有するＲＳＰＥ、配列番号２７を有するＲＳＰＥ。このスクリーニングから同定されるＶHHクローンは次に、本明細書に記載の融合タンパク質と抗体結合体の産生に使用される。
２．５ 組換え抗体結合ドメインのクローニングと発現
１本鎖抗体（さらに具体的にはｓｃＦｖ）の作成プロセスを例示するために、ハイブリドーマＨＢ−８７６６（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）；Ｒｅｔｉｇら、１９８９、ＵＳ４８５１３３２）からのＳＶ６３マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（いくつかの結腸直腸腫瘍により発現されるヒトアルカリホスファターゼからの細胞表面エピトープを認識する）を、モデル細胞表面抗原結合タンパク質として使用する。このＩｇＧ１ ＭＡｂからｓｃＦｖ分子を誘導するために、文献［例えば、Ｄｕｂｅｌら、１９９４，Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：８９−９５；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙとＪｏｈｎｓｏｎ、「ペプチドとタンパク質のファージ表示（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、９５頁、Ｋａｙ、ＷｎｔｅｒとＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、１９９６、アカデミックプレスインク（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）］に記載のように、げっ歯動物Ｆｖおよび定常ドメイン特異的プライマーセットを用いるＲＴ−ＰＣＲを使用して、文献に記載された個々のプライマーに対する修飾を使用して、ハイブリドーマからＦｖ配列をクローン化する。この例で使用したプライマーの配列を以下の表４に示す。
Figure 0005032458
２．５．１ ハイブリドーマＲＮＡの単離とｃＤＮＡ合成
ハイブリドーマ細胞（１０7）を遠心分離し、１ｍｌのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（登録商標）と２００μｌのクロロホルムに再懸濁した。試料を室温で１５分間激しく混合し、次に１２０００ｇで４℃で１５分間遠心分離した。水層を除去し、等量のイソプロパノールを加える。試料を１２０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離してＲＮＡを沈降させ、これを７０％エタノールで洗浄し、次にＲＮａｓｅを含まない水に再懸濁する。
５μｌのＲＮＡ、０．１ＵのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅＩ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））および１ＵのＲＮａｓｉｎを含有する１０μｌの反応物中でＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅで処理して、ＲＮＡから微量のゲノムＤＮＡを除去した。混合物を３７℃に３０分間入れ、次に８０℃で５分間インキュベートした。
次にＤＮａｓｅＩ処理ＲＮＡを製造業者の標準条件（１．５μｌ ＲＮＡ、５０μｌ総反応容量、オリゴｄＴプライマー）下でアクスクリプト（Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））反応で使用して、第１鎖ｃＤＮＡを産生する。
２．５．２ ＳＶ６３ＶH領域の単離とクローニング
ＳＶ６３ＲＮＡから得られた鋳型としての１μｌのオリゴｄＴプライムした第１鎖ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドＲｏＰｒｏ−９（配列番号３７）およびＲｏＰｒｏ−２８（配列番号３８）を使用して、ＰＣＲを行った。
反応容量２５μｌで０．５ＭのＧＨ−ＲＩＣＨ分解緩衝液を用いて、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＧＣ−ＲＩＣＨ ＰＣＲシステムを使用した。
反応は以下のサイクリング条件を用いてストラタジーンロボサイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）で行った。
サイクル１〜５ サイクル６〜３５ 最終伸長
９４℃ ３０秒 ９４℃ ３０秒
５４℃ ３０秒 ６０℃ ３０秒
７２℃ ６０秒 ７２℃ ６０秒 ７２℃ ３００秒
この反応からのＰＣＲ産物の収率は非常に低かった。従って産生された分子をさらに増幅するために第２のＰＣＲを行った。
上記反応からの２μｌのＰＣＲ産物を鋳型として使用して、以下のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して２つの反応を設定した：ｉ）ＲｏＰｒｏ−６（配列番号３９、ＲｏＰｒｏ−９（配列番号３７）やＲｏＰｒｏ−２５（配列番号３０、３’ネステッド）より特異性は低い）、およびii）ＲｏＰｒｏ−９（配列番号３７）とＲｏＰｒｏ−２８（配列番号３８）。ＰＣＲは上記したように行った。
上記反応の試料を１％アガロース／ＴＢＥゲル上に流し臭化エチジウムで染色すると、両方のＰＣＲが約４００ｂｐのＤＮＡ断片を含有した。上記反応２からのＰＣＲ産物を単離し、ゲネクリーンスピン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ）キットを使用して精製し、ｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔII（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。
８つのＴＯＰＯクローンをＤＮＡ配列決定により完全に解析すると、これらのクローンの１つは、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＩＰＩデータベースのＢＡＬＳＴＰ解析により測定すると典型的（しかしユニーク）なＶH配列の特徴を有した。
２．５．３ ＳＶ６３ＶH領域の単離とクローニング
ＳＶ６３ ＲＮＡから得られた鋳型としての２μｌのオリゴｄＴプライムした第１鎖ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドＲｏＰｒｏ−３（配列番号４１）およびＲｏＰｒｏ−４（配列番号４２）を使用して、ＰＣＲを行った。反応容量５０μｌでストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｙａｄサーマルサイクラーで以下のサイクリング条件を使用して反応を行った：９５℃、１分、次に［９５℃、１分；５２℃、１分；６８℃、３分］を４０サイクル、次に６８℃、１０分で最後の伸長。
上記反応の試料を１％アガロース／ＴＢＥゲル上に流し臭化エチジウムで染色すると、約３５０ｂｐの断片が観察された。このＰＣＲ産物を単離し、キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））ゲル溶出を使用して精製し、ｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔII（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。
５つのＴＯＰＯクローンをＤＮＡ配列決定により完全に解析すると、これらのクローンのうちの４つは同じであり、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＩＰＩデータベースのＢＡＬＳＴＰ解析により測定すると典型的（しかしユニーク）なＶL配列の特徴を有した。５つのクローンのうちの１つは、ハイブリドーマの作成で使用したミエローマ融合パートナーから増幅された無関係の配列であるＭＯＰＣ２１カッパ軽鎖可変配列（スイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）：Ｐ０１６３４）と同一の配列を含有した。
２．５．４ ｓｃＦｖ構築体へのＶHとＶL配列のアセンブリー
ＰＣＲ重複伸長（「スプライス重複伸長」（ＳＯＥ）としても知られている）を使用して、２つの配向のＳＶ６３ ｓｃＦｖ：（ｉ）ＶH−［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー−ＶLと（ii）ＶL−［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー−ＶHを作成し、それぞれは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＤＧＦ［ＮＥＢベクターｐＭＡＬｃ−２から得られる、ｐＤＧＦは、マルトース結合タンパク質（これは切断されている）をコードする配列以外のｐＭＡＬｃ−２のすべての特徴を含む］とｐＩＭＳ１４７（ＨａｙｈｕｒｓｔとＨａｒｒｉｓ、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １５：３３６−３４３）中にＮ末端ＰｅｌＢリーダー配列とＣ末端ＦＬＡＧ、およびヘキサヒスチジンタグを含有する。以下の表５は、使用したオリゴヌクレオチドプライマーとその目的を示す。
Figure 0005032458
ＶL−［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー−ＶH ｓｃＦｖ配列を作成するために、ＰＣＲを２工程で行った。第１の工程は２つの反応からなり、ｉ）構築体の５’側の半分を増幅するための鋳型としてｓｃＦｖオリゴ１と２（それぞれ配列番号４３と４４）とｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔII ＳＶ６３ＶLクローン；ii）構築体の３’側の半分を増幅するための鋳型としてｓｃＦｖオリゴ３と４（それぞれ配列番号４５と４６）とｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔII ＳＶ６３ＶHクローンを含有した。第２の工程はＳＯＥを使用して、相補的３’と５’末端（それぞれ）をアニーリングして（ｉ）と（ii）からの２つの断片を連結し、ポリメラーゼを添加して完全長産物まで伸長し、次にｓｃＦｖオリゴ１と４（それぞれ配列番号４３と４６）を使用して増幅した。
同様の方法でＶH−［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー−ＶL ｓｃＦｖ配列を作成した。第１の工程は２つの反応からなり、ｉ）構築体の５’側の半分を増幅するための鋳型としてｓｃＦｖオリゴ５と６（それぞれ配列番号４７と４８）とｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔII ＳＶ６３ＶHクローン；ii）構築体の３’側の半分を増幅するための鋳型としてｓｃＦｖオリゴ７と８（それぞれ配列番号４９と５０）とｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔII ＳＶ６３ＶLクローンを含有した。第２の工程はＳＯＥを使用して、相補的３’と５’末端（それぞれ）をアニーリングして（ｉ）と（ii）からの２つの断片を連結し、ポリメラーゼを添加して完全長産物まで伸長し、次にｓｃＦｖオリゴ５と８（それぞれ配列番号４７と５０）を使用して増幅した。
第１工程の反応はＲｏｃｈｅ ＧＣＲＩＣＨキットと製造業者の条件（反応容量２５μｌ中の０．５Ｍ濃度のＧＣ−ＲＩＣＨ分解緩衝液を用いる）を使用して行った。反応はストラタジーンロボサイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）を用いて以下のサイクリング条件で行った。
サイクル１〜２ サイクル３〜２７ 最終伸長
９４℃ ３０秒 ９４℃ ３０秒
５４℃ ３０秒 ６５℃ ３０秒
７２℃ ６０秒 ７２℃ ６０秒 ７２℃ ３００秒
上記反応の試料を１％アガロース／ＴＢＥゲルで分析し、臭化エチジウムで染色すると、これらは、すべての４つの予測されたＤＮＡ断片が産生されていたことを明らかにした。
第２工程ＳＯＥ反応は、製造業者の条件（反応容量２５μｌ中の０．５Ｍ濃度のＧＣ−ＲＩＣＨ分解緩衝液を用いる）を使用して、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＧＣ−ＲＩＣＨキット反応液中で適切な断片対をほぼ等量で混合して行った。
サイクル１〜２
９４℃ ３０秒
６５℃ ３０秒
７２℃ ６０秒
この反応はプライマー伸長として作用して完全長融合体を産生する。次にオリゴヌクレオチドプライマーを加えて、以下のサイクリング条件を使用して完全長分子をＰＣＲ増幅した。
サイクル３〜１５ 最終伸長
９４℃ ３０秒
６５℃ ３０秒
７２℃ ６０秒 ７２℃ ３００秒
上記ＳＯＥ反応の試料を１％アガロース／ＴＢＥゲルで分析し、臭化エチジウムで染色すると、両方の反応物は約７５０ｂｐ（予測されたサイズ）のＤＮＡ断片を含有することが証明された。
ＳＯＥ産物を単離し、ゲネクリーンスピン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ）キットを使用して精製し、ｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔII（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。各ＳＯＥ産物（ＶH-＞ＶLおよびＶL-＞ＶH）について、ＴＯＰＯクローンをＤＮＡ配列決定により完全に解析した。次に、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩを使用してｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔIIからｓｃＦｖ配列を切り出してｐＤＧＦ発現構築体（ｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬとｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＬＶＨ）を作成し、次に同様に調製したｐＤＧＦベクター骨格ＤＮＡ中に連結した。ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩを使用してｐＣＲＴＯＰＯＢｌｕｎｔIIからｓｃＦｖ配列を切り出してｐＩＭＳ１４７発現構築体（ｐＩＭＳ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬとｐＩＭＳ−ＳＶ６３−ＶＬＶＨ）を作成し、次に同様に調製したｐＩＭＳ１４７ベクター骨格ＤＮＡ中に連結した。連結反応物を製造業者の説明書と同定された形質転換体とを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。正しいｐＩＭＳ１４７−ＳＶ６３ ｓｃＦｖとｐＤＧＦ−ＳＶ６３ ｓｃＦｖクローンをＤＮＡ配列解析により同定して、読みとり枠の維持と配列の正確性を確認した。
２．５．５ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の組換えｓｃＦｖタンパク質の発現
Ｃｈａｒｌｔｏｎが記載した指針（「抗体の工学作成：方法とプロトコール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、２４５〜２５４頁、Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、フマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２００４）に従って、ｐＩＭＳＳＶ６３−ｓｃＦｖ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０クローンを可溶性ｓｃＦｖタンパク質の発現について試験した。簡単に説明すると、選択されたクローンの一晩培養物を使用して、５００ｍｌの２ＴＹ（ａｍｐ／ｇｌｕ）（１リットル中に１６ｇ バクト−ペプトン／５ｇ 酵母エキス／５ｇ ＮａＣｌ／２％（ｗ／ｖ）グルコース（ｐＨ７．５）＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を２．５リットルのフラスコに接種し、これを次に、ＯＤ600が約０．８に達するまで３７℃で２５０ｒｐｍでインキュベートした。この時点で、３０００ｇで遠心分離して細胞を採取し、２．５リットルフラスコ中の５００ｍｌの新鮮な２ＴＹ（ａｍｐ／ｇｌｕ）（１リットル中に１６ｇ バクト−ペプトン／５ｇ 酵母エキス／５ｇ ＮａＣｌ／０．４Ｍ ショ糖（ｐＨ７．５）＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に移した。次に３０℃で２５０ｒｐｍで１時間インキュベーションを開始し、次にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加えた。次にインキュベーションをさらに１６時間行い、この時点で細胞と培地を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット法を使用して組換えｓｃＦｖの存在について分析した。抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ＨＲＰ抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をＢＭ ＰＯＤ発色基質溶液（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））とともに使用するウェスタン解析は、両方の配向のｓｃＦｖの培地試料について可溶性細胞溶解物と培地試料で、組換えタンパク質（約３０ｋＤａの予測されたサイズの分子量）の良好なレベルの発現を示した。
ＩＭＡＣカラムクロマトグラフィーを使用して組換えｓｃＦｖタンパク質を精製し、Ｃａｃｏ２Ｂｂｅ１細胞（ＣＲＬ−２１０２、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））を使用して免疫細胞化学アッセイで抗原結合について親ＳＶ６３ ＭＡｂとの競合により機能を試験した。両方の配向のｓｃＦｖが、細胞表面への親ＳＶ６３ ＭＡｂの結合を阻害することが観察され、作成されたｓｃＦｖ中の抗原結合表面の維持を示していた。
実施例３ 抗体精製
３．１ ペプチド親和性カラムの調製
ポリクローナル血清からのペプチド特異的抗体の精製のために、ペプチド親和性カラムを作成する。ペプチドのＮ末端残基により、カラム調製の２つの方法の１つを使用した。これらは、親和性マトリックスとしてスルホリンク（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ）またはアミノリンク（ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ）結合ゲルを使用した。
スルホリンク結合ゲル（ペルビオ（Ｐｅｒｂｉｏ））は、親和性精製法で使用するためのアガロースゲル支持体へのスルフヒドリル含有ペプチドの共有固定化を可能にする。製造業者により提供され以下に要約されるプロトコールを使用して、ＲＳＰＥをこのゲルに結合する。
１０ｍｌのスルホリンクゲルスラリー（５ｍｌのゲルベッド容量）を室温に平衡化させる。ゲルスラリーをカラムに注ぎ、２０ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で平衡化させる。１ｍｇの合成ペプチドを５ｍｌの結合緩衝液に溶解し、カラムに加える。カラムを密封し、室温で１５分間転倒混合してインキュベートし、次にゲルを３０分間沈降させる。過剰の緩衝液を排水させ、次にカラムを１５ｍｌの結合緩衝液で洗浄する。非特異結合部位を５ｍｌの結合緩衝液中５０ｍＭ 塩酸Ｌ−システイン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））でブロックする。カラムを密封し、上記したように混合有りおよび混合無しでインキュベートする。カラムを３０ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で洗浄し、０．０５％アジ化ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する１０ｍｌの脱気したＰＢＳ（ｐＨ７．２）を加えて保存の準備をする。結合カラムを４℃で保存する。
アミノリング結合ゲル（ペルビオ（Ｐｅｒｂｉｏ））は、親和性精製法で使用するためのアガロースゲル支持体へのペプチドの１級アミンを介する共有固定化を可能にする。製造業者により提供され以下に要約されるプロトコールを使用して、ＲＳＰＥをこのゲルに結合する。
１０ｍｌのアミノリンクゲルスラリー（５ｍｌのゲルベッド容量）を室温に平衡化させる。ゲルスラリーをカラムに注ぎ、２０ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．０５％アジ化ナトリウム）で平衡化させる。１ｍｇの合成ペプチドを５ｍｌの結合緩衝液に溶解する。次に０．０１Ｍ水酸化ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で作成した１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム２５０μｌをペプチド溶液に加え、これをカラムに注ぐ。カラムを密封し、室温で６時間転倒混合してインキュベートする。カラムを靜置させ、次に上清を除去する。５ｍｌの１Ｍトリス−塩酸ｐＨ７．４（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と０．０１Ｍの水酸化ナトリウムで作成した１Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウム２５０μｌとを加える。カラムを密封し、室温で３０分間転倒混合してインキュベートする。カラムを３０ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１０ｍｌの脱気したＰＢＳを加えて保存の準備をする。結合カラムを４℃で保存する。
３．２ ポリクローナル血清からのペプチド特異的抗体の精製
ポリクローナルウサギ血清を２５００×ｇで１０分間遠心分離し、０．４５ミクロン膜を使用してろ過し、次にＰＢＳで１：１希釈する。ペプチド親和性カラムを室温にし、次に４カラム容量のＰＢＳで平衡化させる。調製した血清溶液をカラムに加え、フロースルーをカラムに戻す。カラムを６カラム容量のＰＢＳで洗浄する。０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をカラムに適用してペプチド特異的抗体を溶出し、０．１ｍｌの１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）を含有するチューブ中に１ｍｌ画分で集める。次にタンパク質含有画分を２８０ｎｍの吸光度で同定しプールする。精製した抗体を、１０，０００分子量カットオフ（ペルビオ（Ｐｅｒｂｉｏ））を有するスライド−ａ−ライザー（Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｓｅｒ）カセットを使用してＰＢＳに透析し、−２０℃で保存する。一方カラムを３カラム容量の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）、次に８カラム容量のＰＢＳで再生する。
３．２ モノクローナル抗体の精製
タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーによりＨｉＴｒａｐタンパク質ＧＨＰ１ｍｌカラム（ジーイーヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して培養上清から、モノクローナルＩｇＧを精製する。培養上清を２５００×ｇで１０分間遠心分離し、使用前に０．４５ミクロン膜を使用してろ過する。全体を通して最大流速は１ｍｌ／分である。カラムを１０カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ７）で平衡化し、試料をのせる。カラムを１０カラム容量のＰＢＳで洗浄する。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をカラムに適用して抗体を溶出し、０．１ｍｌの１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）を含有するチューブに１ｍｌ画分を集める。次にタンパク質を含有する画分を２８０ｎｍの吸光度で同定し、プールする。精製した抗体を、１０，０００分子量カットオフ（ペルビオ（Ｐｅｒｂｉｏ））を有するスライド−ａ−ライザー（Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｓｅｒ）カセットを使用してＰＢＳに透析し、−２０℃で保存する。一方カラムを１０カラム容量の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で再生し、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、２０％エタノール中で４℃で保存する。
実施例４ 抗体の性状解析
４．１ 酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による抗ペプチド抗体の力価測定
ペプチド結合体で免疫したウサギ、マウスまたはハムスターから得られた血清を、Ｅｎｇｖａｌｌ Ｅ．とＰｅｒｌｍａｎｎ Ｐ．、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８：８７１−８７４（１９７１）：Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．ら、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８８、１８２〜１８３頁に記載された方法に基づき、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定して、抗体応答の相対的強さを測定する。
３５ｍＭの重炭酸ナトリウム、１５ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中の２μｇ／ｍｌのペプチド溶液を１００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに加え、少なくとも４時間４℃でインキュベートする。次にプレートをＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で３回洗浄する。残存する結合部位を１％スキムミルク粉末（マーベル（Ｍａｒｖｅｌ）、プレミアフーズ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｆｏｏｄｓ）、セントアルバンス（Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ））を含有する２００μｌ／ウェルのＰＢＳで室温で３０分間ブロックする。上記のように洗浄後、ＰＢＳＴをプレートに１００μｌ／ウェルで加える。血清の最初の希釈物をカラム１の二重でウェルに加え、次にプレートのウェルを通して二倍希釈していき、ＰＢＳＴのみを含有するカラム１２のウェルを残す。プレートを室温で２時間インキュベートする。上記のようにさらに洗浄後、プレートを、ＰＢＳＴで１／１０，０００に希釈した適切な抗種結合抗体で室温で１時間インキュベートする。ウサギ血清試料をヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））とインキュベートする；ハムスター血清をウサギ抗シリアンハムスターＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（ストラテク（Ｓｔｒａｔｅｃ）、ソハム（Ｓｏｈａｍ）、ケンブリッジシャー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ））とインキュベートする；そしてマウス血清試料をウサギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片ＨＲＰ結合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））とインキュベートする。１０ｍｌの２４ｍＭクエン酸、６０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中で１ｍｇの３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン二塩酸塩（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する１つの錠剤を希釈し、２μｌの３０％過酸化水素溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を加えて、基質溶液を調製する。さらに洗浄後、新鮮な基質溶液を１００μｌ／ウェルでプレートに加え、プレートを暗所で室温で３０分間放置する。得られる発色を５０μｌ／ウェルの３Ｍ硫酸を加えて停止させる。次にプレートの光学密度を４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーを使用して読む。
４．２ ＥＬＩＳＡの結果
４．２．１ ウサギからのポリクローナル抗血清
以下の標的タンパク質（上記実施例２．１参照）、ラットオリゴペプチドトランスポーターＰｅｐＴ１、ラットＣＤ１５５（ＰＶＲ−ポリオウイルス受容体；Ｔａｇｅ４）、ラットＧＴＲ２、ラットＣＦＴＲ、ラットＣＮＴ２、ラットＭＤＲ１、マウスＭＤＲ１、ラットスクラーゼ−イソマルターゼ、マウスＧＬＵＴ７、ラットＧＴＲ５、ラットＯＡＴＰ−Ｂ、ラットＧＣＣ、ラットＰＬＢ、ラットＬＰＨ、ラットＡＭＰＮ、ラットＭＣＤＬ、およびラットＳＣＡＢからのＲＳＰＥで免疫したウサギからの第３回目の投与後に取った血清を、上記実施例４．１に記載のペプチドＥＬＩＳＡにより測定した。各ウサギからの試験血清および免疫前血清を免疫ペプチドに対する力価測定により評価した。５０％結合力価値（最大シグナルを５０％に下げるのに必要な希釈）を計算することにより、免疫応答を評価した。結果を以下の表６に要約する。
Figure 0005032458
それぞれの試験血液からの血清を実施例３．２に記載したように親和性精製し、次に上記したＥＬＩＳＡにより試験した。結果を以下の表７に要約する。
Figure 0005032458
ラットＣＮＴ２ヌクレオシドトランスポーターからのＲＳＰＥで免疫したウサギのハーベスト（harvest）血液もまた親和性精製し、ＥＬＩＳＡにより試験した。ウサギ１からのハーベスト（harvest）血液を０．８６ｍｇ／ｍｌの濃度で３６．５ｍｌで溶出し、５０％結合力価を１対４７，０００で測定した。ウサギ２からのハーベスト（harvest）血液を０．５７ｍｇ／ｍｌの濃度で２７．５ｍｌで溶出し、５０％結合力価を１対４４，０００で測定した。
ウサギ１からの親和性精製したポリクローナル抗体をプロテインＡカラム（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用してさらに精製し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、ＥＬＩＳＡにより試験した。これにより、ＣＮＴ２由来のＲＳＰＥ（配列番号６）に対して１３ｍｌのさらに精製したポリクローナルＩｇＧが得られ、これは１．９７ｍｇ／ｍｌの濃度と１対９０，０００の５０％結合力価を有した。
４．２．２ マウスからのポリクローナル抗血清
以下の標的タンパク質（上記実施例２．２参照）、ラットオリゴペプチドトランスポーターＰｅｐＴ１、ラットＣＤ１５５（ＰＶＲ−ポリオウイルス受容体；Ｔａｇｅ４）、ラットＧＴＲ２、ラットＣＦＴＲ、ラットＣＮＴ２、ラットＭＤＲ１、マウスＭＤＲ１、ラットスクラーゼ−イソマルターゼ、マウスＧＬＵＴ７、ラットＧＣＣ、ラットＰＬＢ、およびラットＬＰＨからのＲＳＰＥで免疫したマウスからの第３回目の投与後に取った血清を、上記実施例４．１に記載のペプチドＥＬＩＳＡにより測定した。各マウスからの試験血清を免疫ペプチドに対する力価測定により評価した。５０％結合力価値（最大シグナルを５０％に下げるのに必要な希釈）を計算することにより、免疫応答を評価した。結果を以下の表８に要約する。
Figure 0005032458
Figure 0005032458
４．２．３ ラットオリゴペプチドトランスポーターＰｅｐＴ１からのＲＳＰＥに対するモノクローナル抗体
配列番号１（上記実施例２．３参照）を有するＲＳＰＥに対する抗体を産生する７つの陽性モノクローナル細胞株のそれぞれからの４０ｍｌの培養上清を、実施例３．２に記載のように親和性精製し、次に上記実施例４．１に記載のようにＥＬＩＳＡにより試験した。精製モノクローナル抗体を免疫ペプチド（配列番号１）に対する力価により測定した。５０％結合力価値（最大シグナルを５０％に下げるのに必要な希釈）を計算することにより、免疫応答を評価した。結果を以下の表９に要約する。
Figure 0005032458
ハイブリドーマ細胞株１６４５．１４２．００２、１６４４．１１２．０４０および１６４７．３７２．２４５は、ラットＰｅｐＴ１から得られる配列番号１の配列を有するＲＳＰＥを認識するモノクローナル抗体を明らかに産生する。
４．２．４ マウスＧＬＵＴ７トランスポーターからのＲＳＰＥに対するモノクローナル抗体
配列番号１１（上記実施例２．３参照）を有するＲＳＰＥに対する抗体を産生する４つの陽性モノクローナル細胞株のそれぞれからの４０ｍｌの培養上清を、実施例３．２に記載のように親和性精製し、次に上記実施例４．１に記載のようにＥＬＩＳＡにより試験した。精製モノクローナル抗体を免疫ペプチド（配列番号１１）に対する力価により測定した。５０％結合力価値（最大シグナルを５０％に下げるのに必要な希釈）を計算することにより、免疫応答を評価した。４つの抗ＧＬＵＴ７モノクローナル抗体のうちの２つの結果を以下の表１０に要約する。
Figure 0005032458
４．３ げっ歯動物消化管組織切片の免疫組織化学試験
ラットの消化管組織を液体窒素で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。すべての組織を−２０℃のクリオスタットで切片にし、組織を陽性荷電したスライド上に置き、氷冷アセトンで１０分間固定し、風乾した。スライドを−２０℃で保存し、１ヶ月以内に切片を作成して使用した。免疫組織化学試験を開始する前に、すべてのスライドを室温まで暖めた。次に用手法ＩＨＣを行うために、これらをセクエンザ（Ｓｅｑｕｅｎｚａ）にのせた。ペルオキシダーゼブロック［ダコエンビジョン（Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）（登録商標）キット］を室温で６時間適用することにより内因性ペルオキシダーゼについて、すべてのスライドをブロックした。次にスライドをツイーン２０（０．１％）（ＴＢＳＴ）を有するトリス−緩衝化食塩水（１０ｍＭ）で５分間洗浄した。室温で３０分間５％乳汁タンパク質［マーベル（Ｍａｒｖｅｌ）（登録商標）］を添加して非特異タンパク質をブロックした。１次抗体［表に記載した希釈で、１％マーベル（Ｍａｒｖｅｌ）（登録商標）を有するＴＢＳＴで作成した］を適用し、スライドを室温で１時間インキュベートした。次にスライドをＴＢＳＴで洗浄した（２×５分）。エンビジョン（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）（登録商標）ウサギポリマーを適用し、スライド上で室温で３０分インキュベートした。スライドをＴＢＳＴで洗浄した（２×５分）。ＤＡＢを室温で５分適用した。スライドを蒸留水で洗浄し、段階的アルコールとキシレンで脱水し、次にＤＰＸにマウントした。
Figure 0005032458
Figure 0005032458
ブロッキングペプチドを使用して特異的染色を評価した。最適染色を与える希釈率の１次抗体を、１％マーベル（Ｍａｒｖｅｌ）（登録商標）を有するＴＢＳ中で１０倍過剰のペプチドと室温で２時間インキュベートし、次にスライドにのせ、残りのプロトコールは上記したものとした。結果を前述の表１１に要約する。
実施例５ 組換えタンパク質毒素の産生
５．１ 組換えゲロニン産生
２５１アミノ酸のゲロニンタンパク質をコードする遺伝子（Ｎｏｌａｎら、１９９３，Ｇｅｎｅ １３４：２２３−２２７）を、ｐｅｌＢリーダー配列とＣ末端ヘキサヒスチジンタグとともに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現についてコドン最適化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター［ｐＤＧＦ − ＮＥＢベクターｐＭＡＬｃ−２から得られる；ｐＤＧＦはマルトース結合タンパク質（これは切り出されている）をコードする配列を除くｐＭＡＬｃ−２のすべての特徴を含む］中にハイブリッドｔａｃプロモーターの制御下でクローン化した。組換えベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株に形質転換した。
１ｍＭ ＩＰＴＧで２８℃で２０時間誘導したＬＢ培地中で形質転換したＴＯＰ１０細胞を増殖させて、ゲロニンの発現を行った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を採取後、細胞をフレンチプレッシャセル（コンスタントシステムズ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；２０，０００ｐｓｉで破砕）を使用して１×ＰＢＳ／３０ｍＭイミダゾール中で破砕した。可溶性抽出物をグラビトラップ（ＧｒａｖｉＴｒａｐ）カラム（ジーイーヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に適用し、１×ＰＢＳ／３０ｍＭイミダゾールで１５ｍｌ洗浄した後、ゲロニンを１×ＰＢＳ／５００ｍＭイミダゾールで溶出した。２回目の精製工程として、溶出液を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で脱塩し、リソースエス（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ）陽イオン交換カラムに適用し０．１Ｍ塩勾配溶出した。
組換えゲロニンが活性（機能性）であるかどうかを調べるために、精製ゲロニンタンパク質をＴ７ルシフェラーゼＤＮＡを基質として使用してタンパク質翻訳阻害アッセイ（ＴＮＴ Ｔ７クイック結合転写／翻訳システム、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で試験した。陽性対照としてシクロヘキシミドを使用した。これは、組換え精製ゲロニンがＴ７ルシフェラーゼＤＮＡの翻訳を阻害することを証明した。
５．２ 組換えＶＩＰ２Ａ産生
４６４アミノ酸のＶＩＰ２Ａタンパク質をコードする遺伝子（ＵＳ５，８４９，８７０号を参照）をＣ末端ヘキサヒスチジンタグとともに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現について最適化し、ｐＥＴ２４ａ発現ベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））にクローン化した。組換えベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
１ｍＭ ＩＰＴＧで２８℃で２０時間誘導したてＬＢ培地で形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を増殖させて、ＶＩＰ２Ａの発現を行った。採取後、上記実施例５．１に記載のように、細胞をフレンチプレッシャセルを使用して破砕した。可溶性抽出物をヒストラップエィチピー（ＨｉｓＴｒａｐＨＰ）カラム（ジーイーヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に適用し、５カラム容量のＰＢＳ／２０ｍＭイミダゾールで洗浄後、ＶＩＰ２Ａタンパク質を５００ｍＭイミダゾールまでの勾配で溶出した。
精製工程からの可溶性抽出物と試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、組換え産生したヒスチジンタグ付きＶＩＰ２Ａについて予測されたサイズのバンドを証明した。
５．３ 組換えグランザイムＢの産生のための発現構築体
ラットからの２２８アミノ酸の成熟グランザイムＢタンパク質をコードする遺伝子（配列情報についてはジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号Ｍ３４０９７を参照）を人工的に合成（ＤＮＡ断片０５００３１）し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにクローン化してプラスミドｐ０５００３１を得た。ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲアプローチにより、グランザイムＢコード配列を発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に導入した。
ｐ０５００３１からの成熟グランザイムＢコード配列を、プライマーＲｏＰｒｏ０７０ｐｅｔＥＫ／ｒＧｒｚＢＦ１（配列番号５１）とＲｏＰｒｏ０６７ｒＧｒｚＢ Ｒ（配列番号５２）を使用してＰＣＲ増幅して、ｐＥＴ３２ａ（＋）中の融合タグに存在するエンテロキナーゼと相同的な５’テイルを導入した。得られたＰＣＲ産物を第２部のネステッドＰＣＲの鋳型として使用して、これはプライマーＲｏＰｒｏ０７６ｐｅｔＥＫ／ｒＧｒｚＢＦ２（配列番号５３）とＲｏＰｒｏ０６７ｒＧｒｚＢ Ｒ（配列番号５２）を使用して５’ＫｐｎＩ部位を導入した。
最終的にＰＣＲ産物をＫｐｎＩ／ＮｏｔＩで消化し、同様に消化したｐＥＴ３２ａ（＋）に連結して発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）：：ｒＧｒｚＢを得た。これは宿主ベクターからのＮ末端発現タグと組換えグランザイムＢコード配列とのきれいな融合体を与え、こうして発現後のエンテロキナーゼ処理による組換えグランザイムＢの活性化を可能にする。最終発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）：：ｒＧｒｚＢは適当な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター宿主（例えばＲｏｓｅｔｔａＧａｍｉ（ＤＥ３））に形質転換される。
ｐＥＴ３２ａ（＋）：：ｒＧｒｚＢの構築に使用されたプライマーの配列は以下の通りである（すべてのプライマー配列は５’から３’で示す）：ＲｏＰｒｏ０７０ｐｅｔＥＫ／ｒＧｒｚＢＦ１（配列番号５１）ＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＣ；ＲｏＰｒｏ０６７ｒＧｒｚＢ Ｒ（配列番号５２）ＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＧＡＣ；ＲｏＰｒｏ０７６ｐｅｔＥＫ／ｒＧｒｚＢＦ２（配列番号５３）ＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣ。
実施例６ 毒素への抗体成分の結合
６．１ ポリクローナル抗ラットＣＮＴ２抗体への市販ゲロニンの結合
この操作を実施するのに選択される方策は、チオール化毒素へジスルフィド結合を形成する架橋剤ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート；ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））を用いて抗体を活性化することである。使用した方法は、この結合が毒素ゲロニン（３０ｋＤａ）の活性を妨害しないと記載したＨｅｒｍａｎｓｏｎ １９９６「バイオ結合体法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、５０９頁）からきている。最も効率的な反応混合物を得るために、５：１および１０：１のモル比のゲロニン対抗ＣＮＴ２ポリクローナル抗体を使用した。
６．１．１ ＣＮＴ２ポリクローナル抗体のＳＰＤＰ処理
１ｍｌアリコートのプロテインＡ濃縮したウサギ１ポリクローナルＩｇＧ（実施例４．２．１を参照、ウサギ１からのハーベスト血液を親和性精製し、次にプロテインＡカラムを使用して精製した）を、１０ｋＤａカットオフを有するセントリコンスピン濃縮器を使用して濃縮した。得られた１６０μｌをＰＢＳ １０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中１０ｍｇ／ｍｌ溶液とした。６μｌのＳＰＤＰ（ＤＭＦ中３ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌの抗体溶液に加え、室温で３０分インキュベートした。反応混合物を、ＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）で平衡化したＰＤ１０脱塩カラムに適用した。３．５ｍｌ試料容量のすべてを採取し、セントリコン濃縮器を使用して濃縮して、最終濃度３．６ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ処理抗ＣＮＴ２抗体を得た。
６．１．２ ゲロニンのチオール化
ゲロニンは、ゲロニウム・ムルチフロルム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）の種子から精製された凍結乾燥タンパク質の５ｍｇ試料としてアクゾン（Ａｃｚｏｎ）ＳｐＡから得た。まず試料をＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶解した。３００μｌのこの溶液をセントリコン濃縮器で濃縮し、容量を５５μｌに減少させた。次にこれを５０ｍＭ トリエタノールアミン １０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）で希釈して１０ｍｇ／ｍｌのゲロニン溶液を得た。２−イムノチオランを溶解して蒸留水中２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。１０．５μｌの２−イムノチオラン溶液を１５０μｌのゲロニン溶液に加えて、混合物を氷上で１時間インキュベートした。活性化したゲロニンを、ＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）で平衡化したＰＤ１０脱塩カラムに適用した。３．５ｍｌ試料容量のすべてを採取し、セントリコン濃縮器を使用して濃縮して、最終濃度３ｍｇ／ｍｌのチオール化ゲロニンを得た。
６．１．３ 抗ＣＮＴ２ポリクローナル抗体のゲロニンへの結合
５：１モル比のゲロニン対抗ＣＮＴ２抗体を得るためには、０．５ｍｇのチオール化ゲロニンを０．５ｍｇの抗ＣＮＴ２抗体と反応させる必要があった。従って１３８μｌのＳＰＤＰ処理抗ＣＮＴ２抗体を１６７μｌのチオール化ゲロニンに加えた。
ゲロニン対抗ＣＮＴ２抗体の１０：１モル比でも反応を行った（３３３μｌ中の１ｍｇのチオール化ゲロニンを１３８μｌ中の０．５ｍｇのＳＰＤＰ処理抗ＣＮＴ２抗体に加えた）。各反応は窒素下で密封し、４℃で２０時間インキュベートした。この時間後、ヨードアセトアミドを最終濃度２ｍＭになるように加えて、未反応スルフヒドリル残基をブロックした。
６．１．４ 結合体の分析
各反応混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＥＬＩＳＡにより分析した。反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離と質量スペクトル法から得られたデータ（示していない）は、各結合反応がうまくいき、単一の抗体分子に１、２および３分子のゲロニンが結合した分子種が同定されたことを示した。質量スペクトルデータは、少量の非結合抗体の存在を示したが、この量はクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察するには不充分であった。２つの反応比間で結合効率に差は無いようであった。
各反応混合物について既に記載されているようにＥＬＩＳＡアッセイを行い、抗体の結合活性が結合反応の影響を受けるかどうかを評価した。得られたデータを以下の表１２に要約する。
Figure 0005032458
この結合は、ＳＰＤＰポリリンカーの添加とゲロニンへの結合により影響を受けることがわかる。しかし結合した抗体反応混合物はまだ顕著な結合を示す。これは反応混合物中の結合抗体と非結合抗体に起因する。結合していない抗体の量は少ないため、観察された結合の良好な比率は結合抗体に起因すると推定される。
６．２ ポリクローナル抗ラットＣＮＴ２抗体への組換えゲロニンの結合
上記実施例６．１で概説したものと同じ方策を採用して、上記実施例５に記載されたように産生した組換えゲロニンをポリクローナル抗ラットＣＮＴ２抗体に結合させた。最も効率的な反応混合物を得るために、５：１のゲロニン対抗ＣＮＴ２ポリクローナル抗体モル比を使用した。
６．２．１ 抗ＣＮＴ２ポリクローナル抗体のＳＰＤＰ処理
ＰＢＳ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中の１０ｍｇ／ｍｌ溶液として３．７５ｍｇのプロテインＡ処理ウサギ１ポリクローナル抗体を１１．２５μｌのＳＰＤＰ（ＤＭＦ中３ｍｇ／ｍｌ）と混合し、室温で３０分インキュベートした。反応混合物を、ＰＢＳ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）であらかじめ平衡化させたゼバ（Ｚｅｂａ）（ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））脱塩カラムに通した。
６．２．２ 組換えゲロニンのチオール化
３．７５ｍｇの組換えゲロニンを５０ｍＭトリエタノールアミン １０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２）で１０ｍｇ／ｍｌにした。２−イミノチオラン（トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）；シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を、脱気した窒素下でバブリングした脱イオン水で２０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、これをゲロニン溶液に加え、窒素雰囲気中で氷上で１時間インキュベートした。チオール化ゲロニンをＰＢＳ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）であらかじめ平衡化させたゼバ（Ｚｅｂａ）（ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））脱塩カラムに通した。
６．２．３ 組換えゲロニンへの抗ＣＮＴ２ポリクローナル抗体の結合
ＳＰＤＰ反応した抗体溶液をチオール化組換えゲロニンと混合して、等量の各タンパク質成分を得て、５：１モル比の組換えゲロニン対抗体を得た。反応物を窒素下で密封し、４℃で２０時間インキュベートした。
この時間後、未反応のスルフヒドリル基をヨードアセトアミドを最終濃度２ｍＭで加えてブロックし、次に室温で最小の１時間インキュベートした。
６．２．４ 非結合組換えゲロニンからの結合体の分離
ＰＢＳを用いるゲルろ過を使用して、非結合ゲロニン分子を結合体から分離した。アクタ（Ａｋｔａ）ＦＰＬＣ装置（アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用して、１０／３００スーパーデックス２００カラム（アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を３カラム容量（ＣＶ）のＰＢＳで平衡化させた。クロマトグラフィーはユニコーン（Ｕｎｉｃｏｒｎ）ソフトウェア（アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））で動くＰＣにより制御し、これは試料を注入し、次に０．５ｍｌ／分の流速を維持し、０．１ＣＶが溶出した後９６ウェルブロック中に０．５ｍｌ画分を採取した。溶出は１．４ＣＶ進めた。
選択された画分を、製造業者が記載したように非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＭＯＰＳ緩衝液中４〜１２％ビス−トリスヌページ（ＮｕＰａｇｅ）；インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で分析した。製造業者が記載したようにシンプリーブルー（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ）クマシー染色（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用してゲルを染色した。結合体を含有すると測定された画分をプールし、次の精製工程に提供した。
６．２．５ 非結合抗ＣＮＴ２抗体からの結合体の分離
組換えゲロニン分子上のヘキサヒスチジンＣ末端テイルの存在は、結合体の精製において２回目のクロマトグラフィー工程として固定化金属−キレート親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の適用を可能にした。非結合抗体（ゲルろ過後にも結合体画分中に存在する）上のヘキサヒスチジンモチーフの欠如は、ヘキサヒスチジン含有結合体からの遊離抗体の除去を可能にする。従って上記６．２．４で得られたプール画分を、ユニコーン（Ｕｎｉｃｏｒｎ）ソフトウェア（アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））で動くＰＣにより制御されるアクタ（Ａｋｔａ）ＦＰＬＣ装置に連結したＨｉｓｔｒａｐＨＰ １ｍｌニッケル親和性カラム（５ＣＶのＰＢＳ／１５ｍＭイミダゾールであらかじめ平衡化させた；アマシャムバイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に通した。カラムへの充填と洗浄は、充填／洗浄緩衝液としてＰＢＳ／１５ｍＭイミダゾールを使用して５ＣＶにわたって行った。ヘキサヒスチジン含有タンパク質の溶出は、１５ｍＭイミダゾール（ＰＢＳ中）の勾配を２０ＣＶにわたって適用して行った。画分を０．５ｍｌ容量で９６ウェルブロックに集めた。
選択された画分を、製造業者が記載したように非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＭＯＰＳ緩衝液中４〜１２％ビス−トリスヌページ（ＮｕＰａｇｅ）；インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で分析した。製造業者が記載したようにシンプリーブルー（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ）（登録商標）クマシー染色（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用してゲルを染色した。
ゲルは、ＩＭＡＣ工程により結合体が遊離抗体から実質的に精製されていることを証明した。結合体を含有する画分をプールし、１０ｋＤａ分子量カットオフを有するビバスピン（ＶｉｖａＳｐｉｎ）２０ｍｌスピン濃縮器を使用してＰＢＳに脱塩した。
６．２．６ 結合体の分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを使用して、プールした結合体試料の組成を非結合抗ＣＮＴ２抗体と比較して分析した。得られた質量スペクトル（示していない）は、プールした結合体画分（プールＢ）中の１：１、１：２および１：３比の抗体：ゲロニン結合体種の存在を示した。単一荷電した非結合抗体種は観察されなかったが、非結合抗体の２重荷電種と相関するスペクトル上のピークが同定された。すなわち非結合抗体の大部分は結合抗体から精製された（ＩＭＡＣ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により示される）が、プールされた精製試料中には非常に少量の非結合抗体が残存することが推定される。
ＩＭＡＣ精製したプール試料中の結合体の機能活性を、ＥＬＩＳＡ（抗体結合への結合体形成の影響を調べるために）とインビトロ翻訳阻害アッセイ（ゲロニンの機能活性が結合体形成により影響を受けているかどうかを調べるために）により評価した。
ＥＬＩＳＡ（データは示していない）は、市販ゲロニンへの結合について観察されたものと同様の結果（上記実施例６．１．４）を示した：抗体結合は、ＳＰＤＰポリリンカーの添加と組換えゲロニンへの結合の両方により影響を受けたが、結合した抗体反応混合物はまだラットＣＮＴ２ＲＳＰＥへの顕著な結合を示した。質量スペクトルは、ＩＭＡＣ精製後もまだある程度の非結合抗体が残存していることを示したが、ＩＭＡＣ精製試料中の非結合抗体の量は、ＩＭＡＣ精製の結果として天然のゲロニン／抗ＣＮＴ２抗体についての結合反応混合物中より少ないであろう。従って観察された抗体結合は、抗ＣＮＴ２抗体−組換えゲロニン結合体が主な原因かも知れない。
ＩＭＡＣ精製からの試料を含有するプールした結合体中の抗ＣＮＴ２抗体に結合した組換えゲロニンのリボゾーム阻害能力の保持を、製造業者が記載したようにＴＮＴクイック結合転写／翻訳システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して測定した。図２はその結果を示す。ＩＭＡＣ精製したプール試料（プールＢ）中の結合体により示される翻訳阻害は、元々の組換えゲロニン（ｒゲロニン）と等しい。このリボゾーム阻害能力は結合後に維持されている。
６．３ 市販β−プロチオニン（β−ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ）のポリクローナル抗ラットＣＮＴ２抗体への結合
この結合のために選択された方策は、比較的小さな（５ｋＤａ）β−プロチオニン分子にできるだけ多くの接触を得るために、大きなスペーサーアームを有するＴＦＣＳ架橋剤（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用することであった。ＴＦＣＳは一端にＮＨＳエステル基（これは抗体上のアミン基に結合する）を有し、他端に保護されたアミン基（これはｐＨを８に上げることにより、適切に処理されたβ−プロチオニンへの反応のために暴露される）を有する。プロチオニン上のカルボキシル基はＥＤＣと反応されて、不安定なアミン反応性中間体を生成し、これは次にスルホ−ＮＨＳと反応してより安定な結合を与える。次にＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ処理したβ−プロチオニンはＴＦＣＳリンカーのアミン端に結合される。
６．３．１ ＣＮＴ２ポリクローナルのＴＦＣＳ処理
１ｍｌアリコートのプロテインＡ精製したウサギ１ポリクローナルＩｇＧ（実施例４．２．１を参照、ウサギ１からのハーベスト血液を親和性精製し、次にプロテインＡカラムを使用して精製した）を、１０ｋＤａカットオフを有するセントリコンスピン濃縮器を使用して濃縮した。得られた試料容量を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 ０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）中５ｍｇ／ｍｌ溶液とした。１５μｌのＴＦＣＳ（ＤＭＦ中３ｍｇ／ｍｌ）を５００μｌの抗体溶液に加え、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したＰＤ１０脱塩カラムに適用した。３．５ｍｌ試料容量のすべてを採取し、セントリコン濃縮器を使用して濃縮して、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌのＴＦＣＳ処理抗ＣＮＴ２抗体を得た。
６．３．２ β−プロチオニンのＥＤＣとスルホ−ＮＨＳ処理
小麦胚乳からの凍結乾燥したβ−プロチオニン（タカラ（Ｔａｋａｒａ））を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 ０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶解して、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。ＥＤＣを加えて、最終濃度５ｍＭのスルホ−ＮＨＳとともに最終濃度２ｍＭを得て、混合物を室温で１５分反応させた。２−メルカプトエタノールを最終濃度２０ｍＭになるように加えて反応を停止させた。活性化したβ−プロチオニンを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 ０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で平衡化させたポリアクリルアミド脱塩カラム（サイズ排除限界１，８００Ｄａ；ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））に適用した。画分を集め、毒素の存在についてＯＤ２８０ｎｍをチェックした。
６．３．３ 抗ＣＮＴ２ポリクローナル抗体の活性化β−プロチオニンへの結合
ＴＦＣＳ処理した抗体とＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ処理したβ−プロチオニンとを混合して、３０：１モル比のβ−プロチオニン：抗ＣＮＴ２抗体を得て、４℃で一晩反応させた。次にヒドロキシアミンを最終濃度１０ｍＭになるように加えて反応を停止させた。次に反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに適用して、β−プロチオニンを抗体−β−プロチオニン結合体から分離した。結合体を含有する画分をプールした。
６．３．４ 結合体の分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル法を使用して、プールした結合体試料の組成を非結合抗ＣＮＴ２抗体と比較して分析した。得られた質量スペクトル（示していない）は、プールした結合体画分中の１：１、１：２および１：３比の抗体：β−プロチオニン結合体種の存在を示した。少量の単一荷電された非結合抗体種が観察された。
プール試料中の結合体の機能活性を、上記したようにＥＬＩＳＡにより評価した。結合体の５０％結合力価は、非結合抗ＣＮＴ２抗体の０．０４１μｇ／ｍｌに対して０．０６７μｇ／ｍｌと計算された。
Figure 0005032458
げっ歯動物消化管組織の免疫組織化学分析のために、抗ＣＮＴ２：：β−プロチオニン結合体の試料を使用した（方法については実施例４．２を参照）。結果を前述の表１３に要約する。
実施例７ 融合タンパク質発現ベクターの構築
細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖと３つの異なるタンパク質毒素（ゲロニン、グランザイムＢ、およびｃｙｔ２Ａ）との間で融合タンパク質発現ベクターを構築した。この例で使用したｓｃＦｖは上記実施例２．５に記載したＳＶ６３ｓｃＦｖである。全体を通してプラスミド調製、制限酵素消化、連結、ＥｃｏＲＩ形質転換などについて標準的分子生物学的方法に従った。
７．１ ゲロニン−ｓｃＦｖ融合構築体
２５１アミノ酸のゲロニンタンパク質をコードする遺伝子（Ｎｏｌａｎら、前述）を、ＳＶ６３抗体からの配列をコードするＶH（人工的遺伝子０５４０１４を与える）またはＶL（人工的遺伝子０５４０１３を与える）のいずれかへのフレーム内融合を可能にするように設計された５’配列を用いて人工的に合成し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにサブクローン化して２つの構築体ｐ０５４０１３とｐ０５４０１４を得た。
プラスミドｐ０５４０１３をＳｐｅＩとＮｏｔＩで消化し、作成されたゲロニンをコードする断片を精製し、同様に消化したｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬに連結して、ベクターｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬｒＧｅｌを得た。これは、単一のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーを介してＳＶ６３ｓｃＦｖのＮ末端と組換えゲロニンとのフレーム内融合体を作成した。すなわちｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬｒＧｅｌ中の発現カセットは５’から３’方向に以下の成分を含む：ｔａｃプロモーター、ｐｅｌＢリーダー配列、ＳＶ６３ＶHコード配列、［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー、ＳＶ６３ ＶLコード配列、Ｇｌｙ4Ｓｅｒリンカー、組換えゲロニンコード配列。
ＳＶ６３ ＶHコード配列、［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー、ＳＶ６３ ＶLコード配列、Ｇｌｙ4Ｓｅｒリンカー、および組換えゲロニンコード配列は、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片として容易に切り出され、所望であれば代替発現／クローニングベクター、例えばｐＩＭＳ１４７またはｐＥＴ３２ａに連結することができる。
プラスミドｐ０５４０１４をＢｓｅＲＩとＮｏｔＩで消化し、ゲロニンをコードする作成された断片を精製し、同様に消化したｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＬＶＨに連結してベクターｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬｒＧｅｌを得た。これは単一のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーを介してｓｃＦｖのＮ末端と組換えゲロニンとのフレーム内融合体を作成した。すなわちｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬｒＧｅｌ中の発現カセットは５’から３’方向に以下の成分を含む：ｔａｃプロモーター、ｐｅｌＢリーダー配列、ＳＶ６３ＶLコード配列、［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー、ＳＶ６３ ＶHコード配列、Ｇｌｙ4Ｓｅｒリンカー、組換えゲロニンコード配列。
ＳＶ６３ ＶLコード配列、［Ｇｌｙ4Ｓｅｒ］3リンカー、ＳＶ６３ ＶHコード配列、Ｇｌｙ4Ｓｅｒリンカー、および組換えゲロニンコード配列は、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片として容易に切り出さｌｗ、所望であれば代替発現／クローニングベクター、例えばｐＩＭＳ１４７またはｐＥＴ３２ａに連結することができる。
７．２ グランザイムＢ−ｓｃＦｖ融合構築体
それぞれがＳＶ６３ｓｃＦｖのＮ末端に融合したグランザイムＢを有する２つの構築体を作成した（ｐＥＴ３２ａ：：ｒＧｒｚＢ：：ＳＶ６３ＶＨＶＬとｐＥＴ３２ａ：：ｒＧｒｚＢ：：ＳＶ６３ＶＬＶＨ）。
ｐＥＴ３２ａ（＋）：：ｒＧｒｚＢ（上記実施例５．３）を鋳型として使用してプライマー重複伸長アプローチを組合せて用いて、プラスミドｐＥＴ３２ａ：：ｒＧｒｚＢ：：ＳＶ６３ＶＨＶＬを作成して、成熟グランザイムＢコード配列を単一のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーを介してＶＨＶＬ配向（Ｎ末端からＣ末端）でＳＶ６３ｓｃＦｖに融合した。
（ｉ）ｐＥＴ Ｆ（配列番号５４）とＲｏＰｒｏ０７１ Ｇ４Ｓ／ｒＧｒｚＢ Ｒ１（配列番号５５）プライマーを用いて、ｐＥＴ３２ａ（＋）：：ｒＧｒｚＢをＰＣＲの鋳型として使用して、単一のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーをコードする３’末端配列を成熟グランザイムＢコード配列に付加した。
（ii）ＲｏＰｒｏ０７４ｒＧｒｚＢ／Ｇ４Ｓ／ＶＨＶＬ Ｆ（配列番号５６）とＲｏＰｒｏ０７５ ｐＥＴ／ＶＨＶＬ Ｒ（配列番号５７）プライマーを用いて、ｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬをＰＣＲの鋳型として使用して、単一のＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーをコードする５’末端配列とグランザイムＢコード配列の一部をＳＶ６３ ＶＨＶＬコード配列に付加した。
上記（ｉ）と（ii）からの生成物を精製し等量混合した後、プライマー不含伸長を行い、次にｐＥＴ Ｆ（配列番号５４）とＲｏＰｒｏ０７５ ｐＥＴ／ＶＨＶＬ Ｒ（配列番号５７）を使用するＰＣＲにより完全長融合産物を増幅し、これをユニークなＳｆｕＩ部位とＮｏｔＩ部位を使用してｐＥＴ３２ａ（＋）にクローン化した。
ｐＥＴ３２ａ（＋）：：ｒＧｒｚＢ（上記実施例５．３）を鋳型として使用してプライマー重複伸長アプローチを組合せて用いてプラスミドｐＥＴ３２ａ：：ｒＧｒｚＢ：：ＳＶ６３ＶＬＶＨを作成して、成熟グランザイムＢコード配列を単一のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーを介してＶＬＶＨ配向（Ｎ末端からＣ末端）でＳＶ６３ｓｃＦｖに融合した。
（ｉ）上記（ｉ）に記載のように単一のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーをコードする３’末端配列をグランザイムＢコード配列に付加した。
（ii）ＲｏＰｒｏ０７２ｒＧｒｚＢ／Ｇ４Ｓ／ＶＬＶＨ Ｆ（配列番号５８）とＲｏＰｒｏ０７３ ＶＬＶＨ／ｐＥＴ Ｒ（配列番号５９）プライマーを用いて、ｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＬＶＨをＰＣＲの鋳型として使用して、単一のＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーをコードする５’末端配列とグランザイムＢコード配列の一部をＳＶ６３ ＶＬＶＨコード配列に付加した。
上記（ｉ）と（ii）からの生成物を精製し等量混合した後、プライマー不含伸長を行い、次にｐＥＴ Ｆ（配列番号５４）とＲｏＰｒｏ０７３ ＶＬＶＨ／ｐＥＴ Ｒ（配列番号５９）を使用してＰＣＲにより完全長融合産物を増幅し、これをユニークなＳｆｕＩ部位とＮｏｔＩ部位を使用してｐＥＴ３２ａ（＋）にクローン化した。
上記実施例５．３に記載のようにグランザイムＢ−ｓｃＦｖ融合構築体の構築で使用したプライマーの配列は、上記実施例５．３に記載したものと以下のものである（すべてのプライマーを５’から３’で示す）：ｐＥＴ Ｆ（配列番号５４）ＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＧ；ＲｏＰｒｏ０７１Ｇ４Ｓ／ｒＧｒｚＢ Ｒ１（配列番号５５）ＡＣＴＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＧ；ＲｏＰｒｏ０７４ｒＧｒｚＢ／Ｇ４Ｓ／ＶＨＶＬ Ｆ（配列番号５６）ＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧ；ＲｏＰｒｏ０７５ｐＥＴ／ＶＨＶＬ Ｒ（配列番号５７）ＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧ；ＲｏＰｒｏ０７２ｒＧｒｚＢ／Ｇ４Ｓ／ＶＬＶＨ Ｆ（配列番号５８）ＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣ；ＲｏＰｒｏ０７３ＶＬＶＨ／ｐＥＴ Ｒ（配列番号５９）ＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣ。
７．３ Ｃｙｔ２Ａ−ｓｃＦｖ融合構築体
ＳＶ６３ｓｃＦｖとＣｙｔ２Ａ配列のフレーム内融合体を作成するために、ＧｕｒｋａｎとＥｌｌａｒの方法（２００３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２９（１）：１０３−１６）に従った。１４アミノ酸のＸｐｒｅｓｓエピトープ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のフレーム内Ｃ末端付加を作成するために設計した３’配列を含有するために、Ｃｙｔ２Ａａ１（ＥＭＢＬ：ＢＴＣＹＴＢＧ）の最初の２３７アミノ酸をコードする遺伝子を人工的に合成した。この人工的合成したＣｙｔ２Ａ−Ｘｐｒｅｓｓエピトープ配列は０５１０７２として知られており、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔにサブクローン化してｐ０５１０７２を得た。プラスミドｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬ（実施例２．５を参照）を２工程で改変した。まずＳＶ６３ＶＬ配列の３’末端配列の一部、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカー、および成熟Ｃｙｔ２Ａａ１タンパク質（ＧｕｒｋａｎとＥｌｌａｒ、前述、が記載したように）の５’末端配列の一部を含有させることにより結合断片を作成する、人工的に合成した配列を設計し産生した（ｐ０５４２４７と呼ぶ）。この断片をｐ０５４２４７からＳｐｅＩ（５’）とＥｃｏＲＩ（３’）を使用して切り出し、同様に調製したｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬ（実施例２．５を参照）に連結した。次に得られたプラスミドをＳｆｕＩとＢａｍＨＩで切断し、ｐ０５１０７２からの約５２０ｂｐのＳｆｕＩ／ＢａｍＨＩ断片（成熟Ｃｙｔ２Ａａ１配列の３’末端＋Ｘｐｒｅｓｓエピトープを示す）を導入することにより、さらに修飾した。得られたプラスミド（ｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＨＶＬ：：Ｃｙｔ２Ａ）は、柔軟性リンカーを介して、Ｘｐｒｅｓｓエピトープが続くＣｙｔ２Ａａ１（アミノ酸３７〜２３７）の活性（成熟）型へのＳＶ６３ＶHＶLｓｃＦｖの完全なフレーム内融合体を含む。
同様に、プラスミドｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＬＶＨを２工程で改変してＣｙｔ２Ａａ１配列を導入した。まずＳＶ６３ＶＨ配列の３’末端配列の一部、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカー、および成熟Ｃｙｔ２Ａａ１タンパク質（ＧｕｒｋａｎとＥｌｌａｒ、前述、が記載したように）の５’末端配列の一部を含有させることにより結合断片を作成する、人工的に合成した配列を設計し産生した（０５４２４８と呼ぶ）。この人工的断片をｐＣＲＳｃｒｉｐｔにサブクローン化してプラスミドｐ０５４２８を得た。この断片をｐ０５４２４８からＢｓｅＩ（５’）とＥｃｏＲＩ（３’）を使用して切り出し、同様に調製したｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＬＶＨに連結した。次に得られたプラスミドを、ＳｆｕＩとＢａｍＨＩで切断し、ｐ０５１０７２からの約５２０ｂｐのＳｆｕＩ／ＢａｍＨＩ断片（成熟Ｃｙｔ２Ａａ１配列の３’末端＋Ｘｐｒｅｓｓエピトープを示す）を導入することにより修飾した。得られたプラスミド（ｐＤＧＦ−ＳＶ６３−ＶＬＶＨ：：Ｃｙｔ２Ａ）は、柔軟性リンカーを介して、Ｘｐｒｅｓｓエピトープが続くＣｙｔ２Ａａ１（アミノ酸３７〜２３７）の活性（成熟）型へのＳＶ６３ＶLＶHｓｃＦｖの完全なフレーム内融合体を含む。
実施例８ 融合タンパク質の発現
ＳＶ６３ｓｃＦｖ−ゲロニン融合遺伝子（上記実施例７．１を参照）を有するベクターをＥｃｏＲＩ ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。形質転換細胞を２×ＹＴ／２％グルコース培地中で増殖させ、次に２０℃または１５℃で１ｍＭ ＩＰＴＧ補足２×ＹＴ培地で１６時間インキュベートして、パイロット発現試験を行った。少量の試料（１０ｍｌ）を採取し、遠心分離し、各細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁した。試料を超音波処理し、１３，０００ｒｐｍで室温で５分間再遠心分離を行い、上清（可溶性画分）をデカントした。ペレット（不溶性画分）を１ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。
可溶性画分および不溶性画分を、ヘキサヒスチジンタグに対する抗体を使用してウェスタンブロットにより分析した。この分析は、両方の発現ベクターからｓｃＦｖ−ゲロニン融合タンパク質が産生されていることを証明した（すなわち、ｓｃＦｖがＶHＶL配向であり、かつｓｃＦｖはＶLＶH配向であった）。しかしｓｃＦｖのＶLＶH配向は可溶性タンパク質のより高い収率を与えた。
より大きなスケールの増殖と誘導を行い、可溶性画分からグラビトラップ（Ｇｒａｖｉｔｒａｐ）カラムで精製してｓｃＦｖ−ゲロニン融合タンパク質を得た。
実施例９ タンパク質結合体と融合タンパク質のインビトロ試験
単離されたラット十二指腸の切片を使用して、非吸収性マーカーであるマンニトールに対する粘膜の透過性を測定することにより、本発明のタンパク質結合体と融合タンパク質が上部消化管に傷害を引き起こす能力を評価する。すでに公表された方法（Ｈｅｙｌｉｎｇｓ，１９９１，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０７：４８２−４９３）の改変法を使用して、インビトロで単離された組織をこれらのげっ歯動物防除剤に暴露する。
簡単に説明すると、大人の雄のアルダーレイパーク（Ａｌｄｅｒｌｅｙ Ｐａｒｋ）系統ラット（Ａｐ：ＡｋfＳＤ）からの消化管の１０ｃｍ切片（胃の端部）を、安楽死後直ちに取り出す。組織を酸素添加ＴＣ１９９培地に入れ、胃から最も離れた端からＴＣ１９９培地を使用して消化管から食物破片を注意深く流し去る。十二指腸の２つの切片（各２．５ｃｍの長さ）を準備する（近い切片（胃のすぐ後）と遠い切片（胆管の入り口の直ぐ後））。
リザーバーに連結した２つのガラス管の開いた端に切片を、結紮糸を用いてぴんと張って注意深くつなぐ。これは、単離した粘膜の管腔（粘膜）表面と血液側（漿膜）表面を、別々の溶液に浸すことを可能にする。各粘膜チャンバー中のガラス棒の端のギャップは１２ｍｍである。装置の略図は、前述のＨｅｙｌｉｎｇｓ １９９１の上部の図１に示すものと同様である。粘膜をつないだチャンバーを酸素添加ＴＣ１９９培地で数回リンスして、組織の管腔側の過剰の粘液を除去する。管腔（粘膜）側に、２０ｍｇのマンニトール／ｍｌを含有するＴＣ１９９培地（ＴＣ１９９−Ｍ）４ｍｌを充填して粘膜の洩れをチェックする。粘膜チャンバーを、９５％Ｏ2：５％ＣＯ2を通気した４０ｍｌのＴＣ１９９培地（漿膜側溶液）を充填したアウターカップ（ｏｕｔｅｒ ｃｕｐ）型のガラス容器に浸した。２つの溶液間の水圧勾配を避けるようにチャンバーを置く。両方の溶液は、外部ポンプにつないだ水ジャケットを使用して３７±０．１℃に維持する。１０分間プレインキュベーション後、粘膜チャンバーを取り出し、ＴＣ１９９培地でフラッシュして粘液の蓄積を取り除き、最後に管腔側に５×１０5ｄｐｍ／ｍｌの濃度で14Ｃ−マンニトール（消化管によりあまり吸収されない非電解質）を含有する４ｍｌのＴＣ１９９−Ｍを充填し、ガラスチャンバーに戻す。
マンニトールに対する単離した十二指腸粘膜の透過性を測定するために、漿膜側溶液の二重の１５０μｌのアリコートを１０、２０、３０、６０、１２０、１８０および２４０分に取り、粘膜側に加える。吸収されたマンニトールの量を液体シンチレーション計測により測定する。インキュベーション開始後３０分に、陽性対照として消化管の既知の局所刺激物質であるパラコート（４０ｍｇパラコートイオン／ｍｌ）を粘膜チャンバーに加えて、モデルが粘膜傷害を検出できることを証明する。インキュベーション開始後３０分に、粘膜チャンバーに少量を直接添加することによりげっ歯動物防除剤（融合タンパク質またはタンパク質結合体、上記実施例６〜８を参照）を加え、マンニトール吸収の経時変化プロフィールを追跡する。これを、平行して流したラット十二指腸の近い部分と遠い部分の両方について陰性対照と比較する。
上記方法は十二指腸組織を使用するが、上記と同じ方法を使用して消化管の他の部分を代用して試験してもよい。
実施例１０ タンパク質結合体と融合タンパク質のインビボ試験
１０．１ マウスにおける経口胃管栄養法による効力の試験
マウス（全部で１８匹、１群９匹）に経口胃管栄養法により、ｉ）タンパク質結合体または融合タンパク質（詳細は実施例６〜８を参照；群１のマウス）、またはii）不活性ビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール；群２のマウス）を投与する。試験中は定期的に臨床的観察を行い、投与の２４、４８、および７２時間後に動物を屠殺する。屠殺後、十二指腸、空腸、回腸、および結腸組織をホルマリン緩衝化食塩水で固定し、処理し、蝋に包埋し、病理解剖的評価のためにＨ＆Ｅで染色する。
融合タンパク質／タンパク質結合体を以下の試験濃度で使用する（体重１ｋｇ当たりの化合物のｍｇで示す）：８ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ。
組換えゲロニンによるルシフェラーゼ翻訳の阻害。 抗ＣＮＴ２ポリクローナル抗体−組換えゲロニン結合体によるルシフェラーゼ翻訳の阻害。プールＡ試料は、遊離の抗体を含有することが測定されたＩＭＡＣ精製からのプール画分に対応する。プールＢ試料は、抗体−毒素結合体を含有することが測定されたＩＭＡＣ精製からのプール画分に対応する。

Claims (21)

  1. げっ歯動物特異的ペプチドエピトープ（ＲＳＰＥ）に結合する抗体を含むげっ歯動物防除剤であって、
    該ＲＳＰＥは、げっ歯動物中で発現されるタンパク質のオリゴペプチド断片からなり、
    該オリゴペプチド断片配列は、ヒトまたは鳥からの同種のタンパク質からの対応する線状ペプチド配列と６０％またはそれ以下の同一性パーセントを有する細胞外連続的ペプチドエピトープであり、
    該抗体は毒性成分に結合しており、
    該げっ歯動物防除剤はげっ歯動物を死亡させるものであり、
    該タンパク質は、ラットＰＥＰＴ１、ラットＣＤ１５５、ラットＧＴＲ２、ラットＣＦＴＲ、ラットＣＮＴ２、ラットＣＡＴＢ（０＋）、ラットＭＤＲ１、マウスＭＤＲ１、ラットスクラーゼ−イソマルターゼ、マウスＧＬＵＴ７、ラットＧＴＲ５、ラットＮｐｔ２Ａ、ラットＯＡＴ−Ｂ、ラットＡＳＢＴ、ラットＣＡＴ１、ラットＯＡＴＰ３、ラットＡＢＣＧ８、ラットＧＴＲ８、ラットＭＲＰ１、ラットＣＮＴ１、ラットＵＴ−Ｂ、ラットＤＲＡ１、マスＥＮＴ１、およびラットＥＮＴ１よりなる群から選択されるか、または、ラットＧＣＣ、ラットＰＬＢ、ラットＬＰＨ、マウスＬＰＨ、ラットＡＭＰＮ、ラットＭＣＤＬ、ラットＳＣＡＢ、ラットＫＣＶ２よりなる群から選択されることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  2. 融合タンパク質を含む請求項１に記載のげっ歯動物防除剤であって、該融合タンパク質は第１のタンパク質成分と第２のタンパク質成分とを含み、該第１のタンパク質成分は抗体であり、該第２のタンパク質成分は毒素であることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  3. 該第１のタンパク質成分と第２のタンパク質成分はペプチドリンカーを介して互いに結合していることを特徴とする、請求項２に記載のげっ歯動物防除剤。
  4. 該ペプチドリンカーはグリシンとセリン残基を含むことを特徴とする、請求項３に記載のげっ歯動物防除剤。
  5. 該ペプチドリンカーは少なくとも３つの（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）モチーフを含むことを特徴とする、請求項４に記載のげっ歯動物防除剤。
  6. タンパク質結合体を含む請求項１に記載のげっ歯動物防除剤であって、該タンパク質結合体は、毒性成分に化学的に結合した請求項１に記載の抗体を含むことを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  7. 毒性成分はタンパク質毒素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のげっ歯動物防除剤。
  8. 請求項７に記載のげっ歯動物防除剤であって、該毒素は、ａ）群１に列記したタンパク質の群から選択される完全長タンパク質であり、ここで群１は膜を破壊するタンパク質である、リボシルトランスフェラーゼ、セリンプロテアーゼ、グアニリルシクラーゼアクチベーター、ＡＴＰａｓｅ介在イオン輸送に関与するタンパク質、カルモジュリン依存性アデニリルシクラーゼ、およびリボヌクレアーゼからなり、またはｂ）群１から選択されるタンパク質の毒性ドメインであることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  9. 該毒素は、ａ）完全長ＲＮＡグリコシダーゼ、またはｂ）ＲＮＡグリコシダーゼの毒性ドメインであることを特徴とする、請求項７に記載のげっ歯動物防除剤。
  10. 請求項８に記載のげっ歯動物防除剤であって、該毒素は、ａ）完全長β−プロチオニンまたは群２に列記したタンパク質の群から選択される完全長タンパク質であり、ここで群２はペルフリンゴリシンＯ、アルファヘモリジン、スフィンゴメリナーゼ、デルタヘモリジン、グランザイムＢ、アルファ毒素、Ｃｙｔ毒素、ジフテリア毒素、グラヌリジン、メリチン、ペルフォリン、コレラエンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、エキナトキシン、リステリオリジン、ＶＩＰ２、付属エンテロトキシン、エアロリジン、ＢｉｎＡ、ＢｉｎＢ、コリシンＥ１、ヘモリシンＡ、ＣＴＸ ＩＶ、リシン、アメーバポア、Ｅ１ Ｔｏｒヘモリジン、ビブリオ・ダムセラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａ）ヘモリジン、ニューモリジン、ストレプトリジンＯ、カナガワ毒素、レプトスピラヘモリジン、Ｃｒｙ毒素、炭疽毒素、シュードモナス外毒素Ａ、バルナーゼ、およびＶＩＰ３からなり、またはｂ）ｂ−プロチオニンの毒性ドメインまたは群２から選択されるタンパク質の毒性ドメインであることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  11. 毒素はゲロニンである、請求項９に記載のげっ歯動物防除剤。
  12. 請求項６に記載のげっ歯動物防除剤であって、毒性成分は、コルヒチン；ドキソルビシン；カリケアミシン；非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）化合物；サイトカラシン；抗凝固剤；カルシフェロール；ブロメタリン；フルプロパジン；亜リン酸亜鉛；シリロシド；（モノ）フルオロ酢酸ナトリウム；フルオロアセトアミド；アルファクロラロース；硫酸タリウムよりなる群から選択される毒性化合物であることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  13. 請求項１２に記載のげっ歯動物防除剤であって、抗凝固剤は、ブロジフィクム、ジフェナクム、ブロマジオロン、フロクマフェン、ジフェチアロン、ヒドロキシクマリン類、およびインダン−ジオン類よりなる群から選択されることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  14. 請求項１に記載のげっ歯動物防除剤であって、細胞外エピトープは配列番号１〜２６よりなる群から選択されるアミノ酸配列により提供されることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  15. 請求項１に記載のげっ歯動物防除剤であって、細胞外エピトープは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列により提供されることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  16. 請求項１に記載のげっ歯動物防除剤であって、細胞外エピトープは配列番号２７〜３６よりなる群から選択されるアミノ酸配列により提供されることを特徴とするげっ歯動物防除剤。
  17. 抗体はポリクローナル、モノクローナルまたは１本鎖抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のげっ歯動物防除剤。
  18. 抗体成分はジスルフィド安定化されていることを特徴とする、請求項１に記載のげっ歯動物防除剤。
  19. 少なくとも１つの添加剤をさらに含む組成物の形の、請求項１に記載のげっ歯動物防除剤。
  20. 少なくとも１つの添加剤は、げっ歯動物にとって組成物をおいしくする機能を有することを特徴とする、請求項１９に記載のげっ歯動物防除剤。
  21. げっ歯動物を死亡させる方法であって、請求項１に記載のげっ歯動物防除剤をげっ歯動物が常に出入りする場所に置いて、該げっ歯動物による該げっ歯動物防除剤の摂取により該げっ歯動物を死亡させることを特徴とする方法。
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