SK11982002A3 - Nová protilátka so špecificitou pre rakovinu hrubého čreva - Google Patents

Nová protilátka so špecificitou pre rakovinu hrubého čreva Download PDF

Info

Publication number
SK11982002A3
SK11982002A3 SK1198-2002A SK11982002A SK11982002A3 SK 11982002 A3 SK11982002 A3 SK 11982002A3 SK 11982002 A SK11982002 A SK 11982002A SK 11982002 A3 SK11982002 A3 SK 11982002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
binding structure
binding
tumor
cells
phage
Prior art date
Application number
SK1198-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas N. Brodin
Pia J. Karlstr�M
Bo H. K. Nilson
Lennart G. Ohlsson
M. Jesper Tordsson
Original Assignee
Active Biotech Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Active Biotech Ab filed Critical Active Biotech Ab
Publication of SK11982002A3 publication Critical patent/SK11982002A3/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka väzobnej štruktúry, ktorá sa viaže na, a/alebo k povrchu nádorových buniek; cieľovej štruktúry vystavenej, a/alebo exprimovanej vo alebo na povrchu nádorových buniek; väzobnej štruktúry, ktorá rozpoznáva a blokuje spomínanú cieľovú štruktúru; substancie, ktorá sa viaže ku alebo blokuje expresiu spomínanej cieľovej štruktúry; farmaceutických preparátov obsahujúcich spomínanú väzobnú štruktúru, cieľovej štruktúry alebo substancie ako aktívnej zložky; vakcínových preparátov obsahujúcich spomínané cieľové štruktúry ako aktívne zložky; spôsobu pre selekciu fágov; spôsobov pre in vitro a in vivo diagnózu a prognózu, a pre liečbu ľudských maligných ochorení zahrnujúcich použitie vyššie uvedených predmetných látok.
Doterajší stav techniky
Transformácia normálnych buniek na bunky nádorové je združená s genotypovými a/alebo fenotypovými alteráciami transformovaných buniek aj s mikroprostredím rastúceho nádoru (Korbel RS, 1995). V zásade môžu byť niektoré z týchto alterácií rozpoznané imunitným systémom ako tumor špecifické antigény (TSA), a teda tvorí základ tumor špecifickej imunoterapie. Hoci mutácie, ovplyvnenia základným nádorovým procesom a tumorigenézy ako také môžu viesť k expresii TSA, môžu zahrnovať sekundárne zmeny, ako dysregulácie expresie a posttranslačných modifikácií normálnych antigénov väčšinu
01-2113-02-Če antigénov združených s nádormi, ktoré sú užitočné ako ciele pre imunoterapiu.
Molekuly združené s nádorovým genotypom môžu byť identifikované za použitia moderných technológii genomiky a
I proteomiky, ktoré priamo zahrnujú samotné ciele pre identifikáciu molekulárnych modifikácii a narušené expresie (Williams KL, 1999 ) . Nepriamym spôsobom boli antigény združené s nádormi (TAA) charakterizujúci nádorový genotyp tiež identifikované za použitia monoklonálnych protilátok odvodených z hybridómov.(Koulet C, Milstein C, 1976).
Technológia fágovej expozície sa stala platnou alternatívou k hybridómovej technológii a pre niektoré aplikácie dokonca metódou voľby pre tvorbu monoklonálnych afit ly ΘΠΟιιι skoiľCj
QAU čistým vyhľadávaním (Hoogenboom HR, 1998). Technológia je založená na časticiach bakteriofága, ktorý na svojom povrchu vystavuje špecifický fragment protilátky kódovanej v jeho geonóme, ktorý tak umožňuje výber fágu a jeho kódujúcej DNA ako genetického súboru. Za predpokladu, že sú dostupné priméry komplementárne ku génom pre ťažké a ľahké reťazce protilátky, môžu byť vložené gény pre protilátky do fágových vektorov amplifikované polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) od imúnnych alebo neimúnnych zvierat akéhokoľvek druhu, a môžu byť skonštruované veľké knižnice fágových protilátok.
Výber fágových knižníc na bunkách, tkanivových rezoch a ďalšom biologickom materiáli generuje monoklonálne protilátky alebo peptidy viažuce sa ku zložkám v použitých komplexných antigénnych materiáloch (Hoogenboom HR et al. 1998, Tordsson J et al 1997). Výsledok z priamych pozitívnych selekcií za použitia komplexných antigénov predstavuje roztriedenie špecificit z celkového repertoáru reagujúceho tkaniva,
01-2113-02-Če skreslené vysoko exprimovanými a imunodominantnými antigénmi a vysoko afinitnými interakciami. K presnejšej identifikácii diferenciálne exprimovaných antigénov musí byť použité konkrétne prístupy na báze odpočítania špecifického fenotypu.
I
Popis vynálezu
Podľa predkladaného vynálezu je poskytnutá väzobná štruktúra, ako je napríklad protilátka, viažuca sa k nádorovým bunkám, obzvlášť epiteliálnym nádorovým bunkám, ako sú napríklad bunky karcinómu kolorektálneho, pankreatického, prsníka a pľúc.
Tiež sú poskytnuté cieľové štruktúry vystavené alebo exprimované na povrchu takých nádorových buniek.
Tiež je poskytnutý nový subtrakčný selekčný spôsob za použitia tkanivových rezov alebo kombináciou tkanivových rezov a buniek ako materiálu pre výber fágu.
Preto sa v jednom zo svojich aspektov predkladaný vynález týka väzobnej štruktúry, ktorá sa viaže na a/alebo k bunečnému povrchu nádorových buniek a táto väzobná štruktúra je prevažne určená štruktúrami ťažkých reťazcov CDR definovanými v podstate počtom aminokyselín 160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID č.: 2, zatiaľ čo ďalšia väzobná špecifika je poskytnutá jednou alebo viacej štruktúrami ľahkých reťazcov CDR definovanými v podstate počtom aminokyselín 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91100 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID č.: 2.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka väzobnej štruktúry, ktorá sa viaže na, a/alebo k bunečnému povrchu
01-2113-02-Če nádorových buniek a táto väzobná štruktúra obsahuje jednu alebo viacej sekvencii oblastí určujúcich komplementaritu (CDR) protilátky v lahkom reťazci, ktorá obsahuje v podstate počet aminokyselín 23-35 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQUENCE LISTING ID č. : 2, a CDR sekvencie v ťažkom reťazci obsahujúce v podstate počet aminokyselín 160-165 (CDR1), 180-185 (CDR2), 228-238 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQUENCE LISTING ID č.: 2.
V jednej forme vynálezu obsahuje spomínaná väzobná štruktúra všetky spomínané CDR sekvencie.
V ďalšej forme vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra protilátkou, a/alebo jej fragmentmi, . ktoré v ďalších formách λΙλ 1 r· -P
W.L U.O Lpodstate počet aminokyselín
1-110 aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQUENCE LISTING
ID č.: 2, a variabilné oblasti ťažkého reťazca obsahujúce v podstate počet aminokyselín 130249 aminokyselinovej sekvencie uvedenej v
SEQUENCE
LISTING ID
č.: 2. V ešte ďalšej forme vynálezu obsahuje spomínaná protilátka celú aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQUENCE
LISTING ID vynálezu sa spomínaná väzobná štruktúra viaže silne povrchu epiteliálnych obsahujúcej primárne
č.: 2. V jednej forme a/alebo homogénne v a/alebo k bunečnému nádorových buniek vybraných zo skupiny metastatické bunky karcinómu a/alebo kolorektálneho pankreatického, prsníka a pľúc. V ďalšej forme štruktúra viaže slabo a/alebo vynálezu sa spomínaná väzobná heterogénne a/alebo sa neviaže k bunkám karcinómu prostaty a/alebo malígneho melanómu.
V ďalšej forme vynálezu sa spomínaná väzobná štruktúra viaže silno k apikálnym častiam epiteliálneho povrchu, hrubého a tenkého čreva. V ďalšej forme vynálezu sa spomínaná väzobná
01-2113-02-Če štruktúra viaže k apikálnej časti bunečného povrchu mikroklkov a/alebo kefového lemu superficiálnych epiteliálnych buniek hrubého čreva. V ešte ďalšej forme vynálezu sa spomínaná štruktúra viaže slabo až mierne ku glandulárnemu epitelu mliečnej žlazy a/alebo jeho obklopujúcemu spojivovému tkanivu.
V ďalšej forme vynálezu sa spomínaná väzobná štruktúra viaže slabo a/alebo heterogénne a/alebo sa neviaže k normálnym tkanivom zahrnujúcim slezinu, obličky, pečeň, plúca, kožu, pankreas/ štítnu žlazu, srdcové tkanivo, a/alebo centrálny nervový systém.
V ďalšej forme vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra poskytnutá selekciou fágu, ktorá v ďalšej forme vynálezu zahrnuje kombináciu in vivo imunologický vopred zvoleného repertoáru väzobných štruktúr vystavaných na časticiach fágu a subtrakčnej selekcii častíc fágu za použitia páru tkanív o rôznom fenotype. V ďalšej forme vynálezu sú spomínané sekvencie pôvodom z Macaca fascicularis, ktorého sekvencie môžu mať aminokyselinovú identitu aspoň 78% (VI) a 86% korešpondujúcimi sekvenciami ľudského pôvodu.
v ešte ďalšej forme vynálezu má spomínaná väzobná štruktúra u človeka nízku imunogenitu alebo nemá žiadnu imunogenitu.
V jednej forme vynálezu bola spomínaná väzobná štruktúra derivatizovaná geneticky väzbou k polypeptidu a/alebo chemickou konjugáciou k organickým alebo neorganickým chemickým molekulám, a/alebo pomocou di-, oligo- alebo multimerizácia.
V ďalšej forme vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra geneticky spojená alebo chemicky konjugovaná k cytotoxickým
01-2113-02-Če polypeptidom alebo cytotoxickým či neorganickým chemickým molekulám; alebo k biologicky aktívnym molekulám; alebo k molekulám aktivujúcim imunitný systém.
V ďalšej forme vynálezu bola spomínaná väzobná štruktúra zmenená, za účelom zvýšenia alebo zníženia jej avidity a alebo afinity alebo k zvýšeniu výťažku jej produkcie;
alebo k ovplyvneniu jej farmakokinetických vlastností;
alebo k predaniu nových farmakokinetických vlastností molekule.
V ešte ďalšej forme vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra označená a jej väzba je špecifická a inhibovateľná neoznačenou formou spomínanej väzobnej štruktúry a nie ďalšími väzobnými štruktúrami a toto nevedie k inhibícii väzby ďalších väzobných struktur majúcich ine specificity.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka DNA sekvencie kódujúcej protilátku definovanú vyššie, čo je protilátka obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQUENCE LISTING ID č.: 2, táto DNA sekvencia obsahuje sekvenciu uvedenú v SEQUENCE LISTING ID č.: 1.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka cieľovej štruktúry vystavenej, a/alebo exprimovanej na povrchu nádorových buniek, kde spomínaná cieľová štruktúra má schopnosť byť špecificky naviazaná k väzobnej štruktúre, ako je definované vyššie, a k ďalším väzobným štruktúram s podobnými väzobnými vlastnosťami.
V jednej forme vynálezu má spomínaná cieľová štruktúra schopnosť byť špecificky blokovaná a špecificky blokovať spomínané väzobné štruktúry.
01-2113-02-Če
V ďalších formách vynálezu je spomínaná cieľová štruktúra vystavená, a/alebo exprimovaná silno, a/alebo homogénne v, a/alebo na bunečnom povrchu epiteliálnych nádorových buniek vybraných zo skupiny obsahujúcej primárne, a/alebo metastatické bunky karcinómu kolorektálneho, pankreatického, prsníka a pľúc.
V ešte ďalších formách vynálezu je spomínaná cieľová štruktúra vystavená, a/alebo exprimovaná slabo, a/alebo heterogénne, a/alebo vôbec na bunkách karcinómu obličky, a/alebo predstojnice, a/alebo malígneho melanómu.
V ďalších formách vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra vystavená, a/alebo exprimovaná silno na apikálnych častiach epiteliálneho povrchu hrubého a tenkého čreva.
V ešte ďalších formách vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra vystavená, a/alebo exprimovaná v apikálnej časti bunečného povrchu mikroklkov a/alebo kefového lemu superficiálnych epiteliálnych buniek hrubého čreva.
V ešte ďalších formách vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra vystavená, a/alebo exprimovaná slabo až mierne ku glandulárnemu epitelu mliečnej žľazy, a/alebo j eho obklopujúcemu spojivovému tkanivu.
V ešte ďalších formách vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra vystavená, a/alebo exprimovaná slabo, a/alebo heterogénne, a/alebo sa neviaže k normálnym tkanivom zahrnujúcim slezinu, obličky, pečeň, pľúca, kožu, pankreas, štítnu žľazu, srdcové tkanivo, a/alebo centrálny nervový systém.
V ešte ďalšej forme vynálezu je vystavenie, a/alebo
01-2113-02-Če expresia spomínanej cieľovej štruktúry vo spojení s epiteliálnym tkanivom.
V ďalšie forme vynálezu má spomínaná väzobná štruktúra zjavnú molekulovú váhu vo svojej neredukovanej forme 90 a/alebo 220 kilodaltonov.
V ďalšom aspekte sa vynález týka anti-idiotypu cieľovej štruktúry, ako je definované vyššie, anti-idiotyp je špecificky viazaný väzobnou štruktúrou a špecificky sa viaže k tejto väzobnej štruktúre, ktorá má podobnú väzobnú špecifiku pre spomínanú cieľovú štruktúru.
V jednej forme vynálezu je spomínaný anti-idiotyp špecificky blokovaný väzobnou štruktúrou a špecificky blokuje spomínane väzobné štruktúry.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka väzobnej štruktúry, ktorá rozpoznáva cieľovú štruktúru, ako je definované vyššie, a ktorá má organický chemický charakter.
V jednej forme vynálezu blokuje táto väzobná štruktúra väzbu väzobnej štruktúry, ako je definované vyššie.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka substancia, ktorá blokuje expresiu cieľovej štruktúry, ako je definované vyššie.
V jednej forme vynálezu je spomínaná substancia anti-sense oligonukleotid a/alebo molekula ribozýmu.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka substancie, ktorá blokuje funkciu cieľovej štruktúry, ako je definované vyššie.
01-2113-02-Če
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu obsahujúceho ako aktívnu zložku aspoň jednu väzobnú štruktúru, ako je definované vyššie.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu obsahujúceho ako aktívnu zložku cieľovú štruktúru, ako je definované vyššie, alebo antiidiotyp spomínanej cieľovej štruktúry, ako je uvedené vyššie.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu obsahujúceho ako aktívnu zložku substanciu, ako je definované vyššie.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález, týka vakcinového preparátu obsahujúceho ako aktívnu zložku cieľovú štruktúru, ako j e definovane vyššie, alebo anti-idiotyp spomínanej cieľovej štruktúry, ako je definované vyššie.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu selekcie fágu zahrnujúce kombináciu in vivo imunologický vopred zvoleného repertoáru väzobných štruktúr vystavaných na časticiach fágu a subtrakčnej selekcii častíc fágu ' za použitia párov tkanív o rôznom fenotype.
V jednej forme spomínaného spôsobu sú spomínaným vopred zvoleným repertoárom väzobných štruktúr protilátky pôvodom od primáta.
V ďalšej forme spomínaného spôsobu sú spomínané páry tkanív spárované. Prednostne sú spárované páry tkanív pôvodom od rovnakého jedinca.
V ďalších formách vynálezu sú spomínané tkanivá použité vo forme zamrazených tkanivových rezov, a/alebo vo formalíne
01-2113-02-Če fixovaných parafínových tkanivových rezov, a/alebo fragmentov, a/alebo bunečných suspenzií.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu in vitro histopatologickej diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde vzorka je v kontakte s aspoň jednou z väzobných štruktúr, ako je definované vyššie, a s indikátorom. Prednostne je spomínaná vzorka vzorkou tkaniva, ktorá bola zamrazená, a/alebo fixovaná vo formalíne a zaliata do parafínu pred vytvorením rezov.
V niektorých formách vynálezu zahrnuje spomínaný spôsob typizáciu nádoru, jeho vyhľadávanie, diagnózu a stanovenie prognózy, monitoráciu pre-malignych stavov.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález tyká sposobu in vitro diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde je stanovená koncentrácia aspoň jednej väzobnej štruktúry v telesných tekutinách, ako je definované vyššie.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu in vitro diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde je
stanovená koncentrácia antigénu obsahujúceho cieľovú
štruktúru, ako je definované vyššie, alebo anti-idiotypu
spomínanej cieľovej štruktúry, ako je definované vyššie, v
telesných tekutinách.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu in vitro diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde je
stanovená koncentrácia a) antigénu obsahujúceho cieľovú
štruktúru, ako je definované vyššie, alebo anti-idiotypu
spomínanej cieľovej štruktúry, ako je definované vyššie, a b)
aspoň jednej väzobnej štruktúry, ako je definované vyššie, v telesných tekutinách.
01-2113-02-Če
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu in vivo diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde je určená lokalizácia aspoň jednej väzobnej štruktúry, ako je definované vyššie, k nádorovým depozitom u človeka. V jednej forme vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra podaná jedincovi pred určením tejto lokalizácie. V ďalšej forme vynálezu je spomínaná väzobná štruktúra akumulovaná v nádorových depozitoch. V ešte ďalšej forme vynálezu je spomínaný spôsob kvantitatívny.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu liečby zhubných ochorení človeka, kde aspoň jedna väzobná štruktúra, ako je definované, vyššie, je podaná človeku.
T T y ďalších formách spomínaného spôsobu bola spomínaná
väzobná štruktúra zmenená genetickým spojením s molekulami, čo
viedlo ku vzniku kombinovanej molekuly so zmenenými
farmakokinetickými vlastnosťami, alebo bola spomínaná väzobná štruktúra zmenená derivatizáciou.
V ešte ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu liečby zhubných ochorení človeka, kde cieľová štruktúra, ako
je definované vyššie, je podaná človeku. V jednej forme
spomínaného spôsobu je vyvolaná imunitná odpoveď
k spomínanej cieľovej štruktúre.
V ďalších formách vynálezu bola cieľová štruktúra zmenená genetickým alebo chemickým spojením s molekulami, čo viedlo ku vzniku kombinovanej molekuly so zmenenými farmakokinetickými vlastnosťami, alebo bola spomínaná väzobná štruktúra zmenená genetickým alebo chemickým spojením s molekulami, čo viedlo ku vzniku kombinovanej molekuly so zmenenými imunogénnymi a/alebo antigénnymi vlastnosťami, alebo bola cieľová štruktúra zmenená
01-2113-02-Če derivatizáciou alebo bola geneticky modifikovaná. V ďalších formách spomínaného spôsobu bola spomínaná cieľová štruktúra zmiešaná s ďalšími molekulami, aby sa zmenili imunogénne vlastnosti zmesi, alebo s adjuvantnými látkami.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobu liečby zhubných ochorení človeka, kde substancia, ako j e definovaná vyššie, je podaná človeku.
V ďalších formách spomínaného spôsobu bola spomínaná substancia zmenená genetickým alebo chemickým spojením s molekulami, čo viedlo ku vzniku kombinovanej molekuly so zmenenými farmakokinetickými vlastnosťami, alebo bola spomínaná väzobná štruktúra derivátizovaná. V jednej forme spomínaného spôsobu bola vyvolaná imunitná odpoveď. V ďalších formách spomínaného spôsobu bola spomínaná substancia zmenená genetickým alebo chemickým spojením s molekulami, čo viedlo ku vzniku kombinovanej molekuly so zmenenými imunogénnymi a/alebo antigénnymi vlastnosťami, alebo bola cieľová štruktúra geneticky modifikovaná. V ešte ďalších formách spomínaného spôsobu bola spomínaná substancia zmiešaná s ďalšími molekulami, aby sa zmenili imunogénne vlastnosti zmesi, alebo bola zmiešaná s adjuvantnými látkami.
Detailný popis vynálezu
Vo výberovom spôsobe podľa vynálezu sú použité tkanivové rezy alebo kombinácie tkanivových rezov buniek ako materiály pre výber fágu. Mierne zafixované tkanivové rezy by mali predstavovať biologický materiál s pôvodnou štruktúrou a vysoko chráneným genotypom.
Spôsob bol vyvinutý a aplikovaný za použitia imunitnej fágovej knižnice karcinómu hrubého čreva pre substrakčný výber
01-2113-02-Če spárovaných autologných párov tkanív hrubého čreva a karcinómu hrubého čreva resekovaných od šiestich rôznych pacientov. Jedna zo zvolených špecifík, tu nazývaná K293, reagovala homogénne so všetkými nádormi použitými vo výbere, ale reagovala velmi obmedzene s normálnym hrubým črevom. Klony so špecifikou K293 boli často nájdené v posledných selekčných koloch, čo naznačuje funkcionalitu subtrakčného prístupu založeného na tkanivách.
Preferenčná expresia K293 definovaných antigénov združených s nádorom (ΤΆΆ) nádorovými fenotypmi vyvinutých u pacientov skôr ako in vitro kultivovaných nádorových bunečných línií podčiarkne výhodu a relevanciu použitia tkanivových rezov ako selekčných materiálov pri cielení na identifikáciu reagencií k novým a terapeuticky príslušným antigénom združených s nádormi.
Protilátka K293 ďalej demonštrovala silnú reaktivitu s karcinómom kolerektálnym, pankreatickým, plúc a prsníka a vysoko obmedzenú reaktivitu pri testovaní na veľkom paneli normálnych tkanív. Bola demonštrovaná reaktivita na bunečnom naznačená vhodnosť tohto antigénu pre povrchu a spolu s chýbaním demonštrovatelných hladín antigénu v cirkulácii bola cielenie nádorov.
To bolo tiež podporené K293 Fabsuperantigénom SEA cielenej terapeutické (D227A) demonštrujúcim predbežný dôkaz aktivity u humanizovaného modelu SCID za použitia heterotransplantovaných ľudských nádorových buniek.
Nakoniec bolo afinitnou chromatografiou za použitia imobilizovaných fragmentov protilátky K293 dosiahnuté purifikácie proteínovej frakcie. Frakcia sa objavila ako pásik o molekulovej váhe 35-45 kDa pri neredukujúcej SDS gélovej chromatografii, a peptidické natrávenie a sekvenácia viedla k získaniu troch sekvencii peptidových fragmentov podporujúcich
01-2113-02-Če homológiu s GAPDH, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázou.
Predkladaná štúdie naznačuje stratégiu k identifikácii fenotypových rozdielov medzi normálnymi a chorými tkanivami, a nepriamo k identifikácii génov kódujúcich rôzne exprimované· molekuly. Táto stratégia bola použitá na identifikácii antigénov združených s karcinómom hrubého čreva. V širšej perspektíve môže byť vyvinutý spôsob podobne použitý v ďalších výskumných oblastiach za použitia párov tkanív, ako sú napríklad normálne verzus zápalové, alebo zrelé verzus nezrelé tkanivá, pre identifikáciu zápalových ochorení alebo markerov a cieľov stavu vývoja.
Účinnosť za použitia tkanivových rezov ako antigénneho zdroja pre subtrakciu fágových knižníc bola vyhodnotená na modelovom systéme. Čistá subtrakcia jednej viažucej sa fágovej protilátky od inej by mohla byť dosiahnutá za použitia fágu kódujúceho scFv protilátky reprezentujúcej široko reaktívny (C215) a tumor špecifickej (1F) špecificity. Druhá z uvedených je miernym zjednodušením, pretože 1F antigén je slabo exprimovaný, ale nechýba celkom v tkanive tenkého čreva (Tordsson et al. Zaslané k publikácii). Následne môže mať menšie subtrakcie tiež 1F fágu zníženú separáciu dvoch špecifických fágov.
Ak sú naviac použité pre pozitívny selekčný krok (a maternicové tkanivové rezy pre negatívny selekčný krok) v acetóne fixované tkanivové rezy nádorov
Colo 205, ktoré narástli u SCID myší namiesto kultivovaných intaktných buniek
Colo 205, výťažok 1F fágu sa znížil 12 až 16 krát viacej ako bol výťažok u fágu
C215 (Obrázok 2
Interpretáciou by mohlo byť, že 1F antigén je citlivý k premytiu použitému v selekčnom spôsobu založenom na tkanivách.
fixácii, alebo že väzba 1F scFv fágu je citlivá k hrubému
01-2113-02-Če
Pridanie negatívneho· selekčného kroku za .použitia maternicových rezov neviedlo ku zmene výťažku C215 a 1F fágu z buniek vo zrovnaní s iba pozitívnou selekciou (Tordsson et al. Zaslané k publikácii) podporujúce špecificitu systému a negatívnu reakciu s maternicovými tkanivami skôr nájdenú imunohistochemicky za použitia týchto špecifík.
Záverom je možno povedať, že navzdory chýbaniu optimálneho tumoršpecifického fágu v modeli bola demonštrovaná účinnosť a špecificita pri fágovej adsorpcii založenej na tkanivách, čo poskytuje základ pre subtrakčný zisťujúci protokol. Opakovanie adsorpčného kroku v každom selekčnom kole (s minimálnou stratou fágového výťažku) alebo medzi selekčnými kolmi naviac zvýši účinnosť adsorpcie.
Pretože výbery knižníc boli prevedené pred tým, ako bolo demonštrované, že opakované negatívne adsorpčné kroky v každom subtrakčnom selekčnom kole boli účinnejšie, bolo vo všetkých siedmich selekčných krokoch použité iba jednej adsorpcie. Toto nemusí byť nevýhodou. Môže byť očakávané, že rôzne sily negatívnej selekcie dosiahnutej prevedením rôznych počtov adsorpcii v každom selekčnom kroku účinkujú ako ladička. Týmto možno postupne ovplyvniť selekčný výsledok od protilátok k vysoko (široko) exprimovaným antigénom (žiadna negatívna adsorpcia) k protilátkam k prísne diferenciálne exprimovaným antigénom (opakovaná negatívna selekcia).
Predkladané dáta z modelových experimentov však demonštrujú, že sila pozitívnej selekcie vysoko prevyšuje silu negatívnej selekcie. Tiež niektoré zo špecificít boli nájdené málo často v úzkom okne jedného alebo dvoch selekčných kôl, po ktorých pokračujúce kolá selekcie sa zdali saturovať selekčný filter a zloženie špecificít sa zmenilo smerom k široko
01-2113-02-Če reaktívnym protilátkam.
Počas selekcie subtrakčnej knižnice bolo pozorované, že je potreba veľa selekčných kôl k získaniu vysokého percenta viažuceho fágu. To by malo byť vo zrovnaní s 2-3 kolmi normálne dostatočné pri pozitívnej selekcii na bunkách alebo na tkanivových rezoch. To ukazuje, že selekcia slúži ako účinný filter pre väčšinu špecifík v knižnici a môže poskytnúť základ pre navrhnutie optimálnej selekčnej stratégie. Napríklad menší obohacujúci faktor umožňuje použiť väčší počet nádorov pred dosiahnutím optimálneho selekčného kola. To ovplyvní selekciu smerom k identifikácii bežne exprimovaných na nádory obmedzených antigénov.
Väčšina monoklonálnych protilátok k antigénom združeným s iiaduľml SU technológiou.
myšacie prutilátky vytvorené hybriuóirtovou
Avšak protilátkové odpovedi, ktoré rozlišujú medzi menšími variantmi normálnych ľudských antigénov, ako sú napríklad človeka a aloantigény, boli o veľa častejšie vyvolané druhov blízkych človeku.
Pre imunoterapiu na veľkých užitočné prakticky iba časté TAA.
individuálne nádorovo špecifické populáciách pacientov
Toto vylučuje jedinečné mutácie, hoci tieto sú špecifické antigény. Pretože často predstavujú pravé tumor exprimované antigény združené s nádormi predstavujú u väčšiny prípadov normálne alebo minimálne modifikované antigény (napríklad posttranslačne modifikované) , môžu byť primáti imunizovaní ľudskými nádormi najlepším zdrojom protilátok k takým antigénom združeným s nádormi.
Kombináciou týchto repertoárov so subtrakčnou selekciou fágu môže byť rozumné ďalšie rozdelenie repertoáru a výsledok špecificit by mohol byť lepšie kontrolovaný. Identifikácia
01-2113-02-Če kompletne odlišnej súpravy protinádorových protilátok z imunitnej knižnice karcinómu hrubého čreva pri použití selekcie založenej na subtrakcii tkanív podlá predkladaného vynálezu vo zrovnaní s priamou pozitívnou selekciou (Tordsson et al. Zaslané k publikácii) podporuje túto hypotézu.
Zvolené klony predstavované K293 špecificitou demonštrovali vysoko homogénne farbenie všetkých tkanív kolorektálneho karcinómu zahrnutých v selekčnom protokole a velrni obmedzenú reaktivitu s normálnymi epiteliami hrubého čreva. Subtrakčný selekčný filter definoval úzku fenotypovú špecificitu pre umožnenie pasáže, ktorá bola nájdená v malom rozdiele medzi normálnymi a malígnymi epiteliami hrubého čreva, čo bolo bežné u šiestich jedincov, tzn. u pacientov, od ktorých každý z takých spárovaných párov tkanív pochádzal. Z analýzy špecificiLy bolo jasné, že kritéria nastavené pre filter boli takmer kompletne splnené pomocou K293 špecificity.
Pre subtrakčné selekcie k identifikácii antigénov na bunečnom povrchu boli skoršie použité eukaryotické bunky. Avšak na rozdiel k tomu, kedy použiť bunky pre selekciu fágu, by· tkanivové rezy dovolili identifikáciu reagencií ku všetkým tkanivovým zložkám exprimovaným in vivo, vrátane antigénov regulovaných faktormi okolia tkaniva, alebo štruktúrami, ktoré je nemožné alebo obtiažne reprodukovať in vitro.
Dve zo štyroch testovaných bunečných línií kolorektálneho karcinómu exprimovalo nedetekovatelný K293 antigén, buď to ako in vitro kultivované bunky, alebo pri rastu in vivo u SCID myší. Naviac päť bunečných línií kultivovaných in vitro bolo negatívnych na expresiu antigénu (neuvedené).
Časté a homogénne expresie nájdené pre K293 antigén u nádorov odvodených od pacienta sa zdajú byť stratené vo velkom
01-2113-02-Če rozsahu, ak sú bunky karcinómu hrubého čreva kultivované in vitro. Expresia nemôže byť naviac indukovaná rastom buniek in vivo u xenogénneho hostiteľa.
Fúzny protein K293FabSEA/Ell bol formátom pre rozšírenú analýzu K293 špecificity umožňujúcu zvýšenú senzitivitu a znížené pozadie. U tohto konštruktu bolo preukázané, že reaguje s veľkým počtom karcinómov hrubého čreva, prsníka a pľúc. U väčšiny z týchto nádorov je K293FabSEA/Ell pozitívny na 90% alebo viacej malignych buniek. Reakcia nie je obmedzená na primárne nádory, pretože veľké percento metastáz karcinómu hrubého čreva tiež vykazuje silnú reaktivitu. Na druhú stranu žiadna reaktivita nebola získaná u karcinómu prostaty a obličiek, a iba obmedzená reakcia bola zistená u maligneho melanómu.
Normálna reaktivita tkaniva bola zistená iba na apikálnej časti črevného epitelu hrubého a tenkého čreva, a u glandulárneho epitelu a jeho obklopujúcej stromy u normálneho prsníkového tkaniva.
Elektrónová mikroskopia jasne odhaluje, že K293FabSEA/Ell sa viaže k antigénu, ktorý je exprimovaný na bunečnom povrchu normálnych i malignych buniek. Na sliznici normálneho hrubého čreva je reakcia lokalizovaná na apikálnom bunečnom povrchu ohraničujúcom mikroklky superficiálnych epiteliálnych buniek.
Apikálne farbenie tiež dominuje u vysoko diferencovaných nádorov, zatiaľ čo málo až stredne diferencované nádory majú tendenciu byť homogénne pozitívne na všetkých častiach bunečného povrchu.
Hoci K293FabSEA/Ell reaguje s materiálom podobným mucínu, v neoplastických glandulárnych útvaroch nemohol byť antigén
01-2113-02-Če detekovaný vo zbieranej plazme od pacientov s karcinómom hrubého čreva. V tejto zbieranej plazme boli preukázané vysoké hladiny CA242 antigénu hrubého čreva, čo ukazuje na vysokú nádorovú záťaž u pacientov. Pretože K293FabSEA/Ell je silne pozitívny u 12 z 12 vyšetrených primárnych nádorov a u metastáz karcinómu hrubého čreva, ukazuje to na fakt, že epitop nie je vysoko exprimovaný na cirkulujúcom antigénu.
K293FabSEA/Ell vykazuje niekoľko charakteristík, ktoré ju činia zaujímavou ako kandidátnu molekulu pre cielenie nádorov:
1) rozpoznáva vysoké percento primárnych nádorov a metastáz,
2) vykazuje obmedzenú reaktivitu s normálnym tkanivo, 3) viaže sa na antigén, ktorý je exprimovaný na povrchu nádorových buniek a 4) viaže sa k antigénu, ktorý nie je detekovateľný v periférnej krvi u pacientov s nádorovým ochorením.
Potenciálne použitie K293FabSEA/Ell pre cielenie nádorov bolo ďalej podporené liečebným experimentom za použitia SCID myši nesúcich humanizovaný nádor. Vo zrovnaní s nedeleným kontrolným FabSEA fúznym proteínom vykázala K293FabSEA/Ell viacej ako 80% zníženie rastu nádorov L5174T v peritoneálnej dutine. Imunohistochemické vyšetrenie neliečených nádorov L5179T rastúcich u SCID myší ukazuje, že iba 50% malígnych buniek je pozitívnych s K293FabSEA/Eli (údaje nie sú uvedené). To ukazuje, že niektoré z K293Fab negatívnych nádorových buniek by mohli byť potenciálne usmrtené nešpecifickým efektom, snáď uvolnenim cytokínov z T lymfocytov. U nádorov resekovaných od pacientov s kolorektálnym karcinómom vykazujúcich vyššie percento pozitívnych buniek by sa terapeutická účinnosť mala teda potencionálne zvýšiť.
K293 antigén môže spadať do skupiny sekvestrovaných antigénov vždy prítomných v normálnom tkanive, ale za normálnych okolností neexponovaných imunitnému systému. V
01-2113-02-Če hrubom ani tenkom čreve nie je antigén prítomný na bazálnom povrchu buniek, kde by bol vystavený cirkulujúcim protilátkam a imunokompetentným bunkám. U veľa nádorových vzoriek bol však K293 antigén nájdený distribuovaný cez celú bunečnú membránu, takto teda mohol byť exponovaný cirkulácii.
K293FabSEA/Ell sa zdá byť odlišná od profilu špecificity existujúcich často používaných protilátok viažucich sa na bunky karcinómu hrubého čreva. Je teda nepravdepodobné, že sa viaže k týmto známym cieľovým molekulám. Apikálne farbenie normálneho hrubého čreva pomocou K293FabSEA/Ell vykazuje podobnosť s reakciou s protilátkou anti-CEA. Avšak bolo tiež zaznamenané, že protilátky proti CEA reagujú s granulocytmi a/alebo mikrofágmi. CEA antigén je ďalej ľahko detekovaný v cirkulácii a je používaný ako sérový marker pre kolorektálny karcinóm. Protilátky B3, 19-9 a B72,3 reagujúce s karcinómom hrubého čreva majú všetky obmedzenú heterogénnu reaktivitu v normálnom hrubom čreve a tiež sa zdajú byť odlišné, čo sa týka špecificity K293. Toto je tiež rovnaké pre MUC-1, -2, -3, -4 antigény, ktoré majú odlišnú distribúciu v normálnom hrubom čreve vo zrovnaní s antigénom rozpoznávaným pomocou K293.
Vyvinutý fágový selekčný spôsob založený na tkanivách podľa vynálezu by mal pridať nový rozmer k technológiám cielenia. Genomika a proteomika sú založené na identifikácii diferenciálne exprimovaných génov a proteínov. Tieto spôsoby priamo zahrnujú vystavenie samotných cieľov, zatiaľ čo -technológia predkladaného vynálezu používa fágovú knižnicu vystavených činidiel ku zisteniu buniek a tkanív s exprimovanými cieľmi.
Identifikácia činidla k novému cieli poskytuje účinný prostriedok k analýze tkanivovej distribúcie epitopu a pre purifikáciu a charakterizáciu odpovedajúceho antigénu(ov).
01-2113-02-Če
Demonštrácia úspešnej afinitnej purifikácie a charakterizácia sekvenčnou analýzou domnelého cieľového antigénu pre protilátku K293 slúži ako príklad silného potenciálu takých protilátkových prób pre účinnú a rýchlu identifikáciu ciele. Tri peptidy majúce 10 aminokyselín vykazujú identitu k molekule glyceraldehyd-3fosfát dehydrogenázy, čo naznačuje, že táto molekula môže byť cieľom pre protilátku K293.
Hoci genomika môže viesť k identifikácii cieľových génov, zlyháva táto technológia k zaisteniu alterácii v posttranslačných modifikáciách vzniklých na úrovni proteínu. Užitočná informácia genetickej expresie v rôznych tkanivách môže byť dosiahnutá hľadaním v databázach génovej expresie (elektronickej Northern bloty), zatiaľ čo priama demonštrácia by vyžadovala použitie in situ hybridizácie.
Proteomika môže byť použitá pre detekciu niektorých typov posttranslačných modifikácií. Analýza tkanivovej distribúcie identifikovaného proteínu by však vyžadovala buď to vytvorenie DNA prób založených na jeho aminokyselinovej sekvencií, ktorá má byť použitá pre in situ hybridizáciu, alebo vytvorenie protilátok proti proteínu.
Ani genomika ani proteomika nepokrývajú napríklad sacharidy a lipidy a ďalšie biologické molekuly ne proteinového charakteru.
Bola demonštrovaná účinná automatizovaná technológia, ktorá kombinuje proteomiku s technológiou vystavenia fágu, alebo špecifickejšie toto znamená výber protilátkového fágu oproti proteínovým pásikom na dvojrozmerných géloch (prezentované spoločností CaT,
Cambridge, UK). Toto bude bezpochyby vytvárať činidlá k novým antigénom, ale vrátane obmedzenia proteomiky a faktu, že veľa epitopov exponovaných na denaturovaných proteínoch nie je exponované in vivo a veľa epitopov exponovaných na zbalených
01-2113-02-Če proteínoch in vivo nebude detekované. Táto technológia môže byť pravda tiež použitá obrátene za použitia činidla tvoreného prístupom subtrakčnej fágovej selekcie k detekcii cieľového proteínu nasledované hmotovou spektrometriou a sekvenáciou pre identifikáciu cieľa.
Vybrané protilátky, obzvlášť K293 špecificity, majú niekoľko výhodných vlastností pre použitie ako skupiny k cieleniu nádorov. Tieto vlastnosti zahrnujú reaktivitu nádoru s vysoko homogénnou väzobnou aktivitou k veľkej časti nádorov kolorektálneho karcinómu a p'otencionálne tiež k ďalším bežným nádorovým typom. Dôležité je, že reaktivita normálneho tkaniva je vysoko obmedzená a cieľový antigén nie je detekovateľný v cirkulácii pacientov s nádorovým ochorením za použitia štandardnej metodiky. Tiež u protilátky získanej od primátov, ktorá je vysoko homológna k ľudským imunoglobulínovým sekvenciam, nie je očakávané, že bude indukovať silnú xenoprotilátkovú odpoveď (vedúcu k tvorbe imunokomplexov a k eliminácii) u človeka.
Predkladaná stratégia pre fágovú selekciu je založená na použití in vivo vopred zvoleného repertoáru väzobných štruktúr (protilátok) od primáta vo spojení s úzkym filtrom pre subtrakčnú selekciu.
Ďalšie zamýšľané použitie vynálezu je vo spojení s použitím veľkých nie-imunitných knižníc k vylúčeniu imunizačného ovplyvnenia, ako je napríklad imunodominancia, a toto bude vyzývať k rozdeleniu sily navrhnutých selekčných stratégií. Tieto zahrnujú subtrakčnú selekciu za použitia autentického in vivo fenotypu reprezentovaného tkanivovými rezmi,' zmenením pozadia antigénneho prostredia k podporeniu antigénov reprezentujúcich bežných menovateľov fenotypu, a špecifickým blokovaním často identifikovaných epitopov (pri
01-2113-02-Če použití klonovaných protilátok) .
Predkladaná práca jasne demonštruje, že fágová selekcia môže byť použitá ako zisťujúci prostriedok pre stratégiu orientovanú na definovaný ciel, a že výber selekčných kritérií je kritický pre úspešný výsledok.
Predkladaný vynález bude teraz ilustrovaný nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi prevedenia vynálezu vo spojení so sprevádzajúcimi obrázkami.
Príklady prevedenia vynálezu
Príklad 1
Účinná selekcia subtrakčného modelu
Princíp subtrakčnej selekcie fagemidových knižníc podlá vynálezu je uvedený na Obr. 1. Jednotlivý fág v súbore knižnice, ktorý má byť subtrakčne vybraný (s cieľom identifikovať tumor asociované antigény) môže byť ideálne klasifikovaný podľa špecificity nimi kódovaných protilátok, najmä ako 1) široko nádorovo reaktívne, 2) obmedzené na nádor, a 3) nešpecifické. Fagemidová knižnica má tiež veľkú časť fágov, ktoré nevystavujú nimi kódované protilátky. Tieto fágy nemôžu byť špecificky adsorbované v negatívnom selekčnom kroku, ale môžu byť vymyté v pozitívnom selekčnom kroku pred propagáciou fágu do baktérie.
Široko reaktívny fág C215 scFv reagujúci s epiteliálnou bunečnou adhéznou molekulou, Ep-CAM, a viacej na nádor obmedzená fágová špecificita 1F scFv (skoršie identifikovaná z fágovej knižnice) boli zmiešané (2,5 x 107 C215 a 1,3 x 10s
01-2113-02-Če scFv fágu) a použité v modelovom experimente uvedenom na Obr. 2A. Tieto fágové špecificity boli inkubované na rezoch buď to C215 exprimujúceho tkaniva tenkého čreva, alebo na tkanive negatívnom pre oba antigény, ako je maternica. Po adsorpcii na tkanivové rezy bol špecifický fág zostávajúci v supernatante
I pozitívne vybraný za použitia buniek Colo 205.
Relatívne zloženie rôznych jednotiek prenášajúcich rezistenciu voči antibiotikom (rôzne klony fágov) v nevybraných a vo vybraných fágových súboroch bolo analyzované za použitia titrácie kolónií a bol ilustrovaný výťažok fágu pre každú z jeho špecificít. Dáta ukazujú, že adsorpcia na rezoch tenkého čreva znížila výťažok široko reaktívneho C215 fágu 33-krát vo zrovnaní s adsorpciou maternice.
Odpovedajúce zníženie pre ďalšiu špecificitu 1F bolo iba 1,2-krát. Pomer fágu (1F/C215) vo zrovnaní s pôvodnou zmesou sa zmenil 50-krát po selekcii za použitia rezov tenkého čreva (l,8krát pri použití rezov maternice).
V opakovanom experimente sa fágový pomer zmenil 17-krát pri použití rezov tenkého čreva (1,4-krát pre rezy maternice).
Použitie tkanivových rezov pre oba selekčné kroky demonštrovalo zníženie subtrakčnej účinnosti. Kombinované použitie rezov tenkého čreva/Colo205
SCID nádoru a tenkého čreva/primárneho karcinómu hrubého čreva znížilo C215 špecifický fágový výťažok 4-krát a respektíve 3-krát vo zrovnaní s odpovedajúcim nastavením pri použití maternice pre adsorpciu. Avšak opakovaním adsorpčného kroku dvakrát sa adsorpčná účinnosť zvýšila 25krát (dáta nie sú uvedené). V týchto experimentoch bolo použité veľké množstvo špecifických fágov, 3,8 x 109 a 1,2 x 1O10 C215 a 1F fágov s pozadím 6, 1 x 1O10 nešpecifického Dl, 3 fágu, čo ukazuje na vysokú adsorpčnú kapacitu rezov tenkého čreva.
01-2113-02-Če
V experimente uvedenom na Obrázku 2B bolo pre dve negatívne tkanivové adsorpcie použité rovnako veľké množstvo fágov, 7,2 x 109 C215, 2,2 x 1O10 1F a 4,2 x 1O10 Dl, 3 fágu pri použití rezov z maternice, tenkého čreva alebo pľúc nasledované pozitívnou selekciou za použitia rezov nádoru Colo205. Adsorpcia rezov tenkého čreva a pľúcneho tkaniva významne znížila (p menej ako 0,05, n = 4) obohatenie C215 fágu (C215/D1,3 fágový výťažok) faktorom 11 a respektíve 2,2krát vo zrovnaní s adsorpciou maternice(Obr. 2B) . Naproti tomu obohatenie 1F fágu (55-64-krát oproti Dl, 3 fágu) nebolo ovplyvnené voľbou tkaniva pre adsorpciu (znížené faktorom 1,1 a 0,9-krát pre tenké črevo a respektíve pre maternicu).
Záverom je možno povedať, že adsorpcia negatívneho tkanivového rezu C215 fágu bola závislá od Ep-CAM tkanivového antigénu a vykázala 33-násobnou účinnosť. Dáta tiež ukazujú, že subtrakčná selekcia bola závislá od účinnosti ako negatívneho, tak tiež pozitívneho selekčného kroku.
Materiál a Metodika
Zvieratá
Opice Macaca fascicularis boli ustajnené vo Švédskom ústave pre kontrolu infekčných chorôb vo Stockholme. Opice boli imunizované subkutánne hrubou suspenziou ľudských kolorektálnych nádorov s alebo bez kamencovej adjuvantnej látky (po dvoch jedincoch). Zosilňovacie dávky boli podané 21., 35. a 49. deň.
Samice myší s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID) boli získané z Bommice, Ry, Dánsko. Myši boli ustajnené za podmienok bez prítomnosti patogénov v klietkach Macrolone
01-2113-02-Če (III) so sterilnou peletovanou diétou pre hlodavcov získané zo Special Diets Sevices, Essex, UK a so sterilnou vodou dostupnou ad libitum. Myši (dve myši na nádorovú líniu) vo veku 8-12 týždňov boli injikované subkutánne do každého boku bunkami karcinómu hrubého čreva, Colo205, eIDE, .HT29 alebo LS174T v množstve 2 x 106 suspendovaných v 200 ul 1% Balb/c séra. Nádory boli ponechané rásť do veľkosti 4-5 mm v priemere a potom resekované a zamrazené pre imunohistochémiu.
Všetky zvieratá boli uchovávané podľa švédskej legislatívy a experimenty boli povolené miestnou komisiou.
Bunky a tkanivo
Ľudské kolorektálne bunečné línie Colo201, Colo205, Colo320DM, SW480, SW 620, EIDE, HT29 a L5174T boli získané od Američan Type Tissue Culture Collection, Rockville, MD a Colol37 boli získané z CanAB, Gothenburg, Švédsko. Bunky boli kultivované v RPMI 1640 médiu (Vinco) suplementovaných 10% teplom inaktivovaným fetálnym bovinným sérom (FBS) od spoločnosti Vinco a 0,1 mg/ml gentamycín sulfátu (Biological Industrie. Kibbutz Beit Haemk, Izrael). Ľudské nádorové a normálne tkanivá boli získané z Lund University Hospital a Malmo Generál Hospital vo Švédsku. Pre subtrakčné selekcie z knižníc boli použité páry tkanív primárneho kolorektálneho karcinómu a normálneho epiteliálneho tkaniva hrubého čreva (lokalizované vo vzdialenosti aspoň 5 cm od nádorovej lézie) získaných od šiestich jedincov.
Knižnica a modelový fág
Fagemidový vektor používaný pre knižnicu a modelový fág,
01-2113-02-Če primery pre amplifikáciu a zostavenie scFv génu polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) génov pre lambda ľahké a ťažké reťazce, ktoré mali byť vložené do fagemidového vektora boli popísané skoršie(Tordsson et al. 1997 a Tordsson et al. Zaslané k publikácii). Krátko povedané, cDNA bola amplifikovaná z celkovej RNA sleziny za použitia RNA izolačného kitu od spoločnosti Promega a RNA PCR kitu od spoločnosti PE Biosystéme, Stockholm, Švédsko. Modelové fágy Dl, 3, C215 a 1F scFv použité vo štúdii kódujú gény pre rezistenciu voči antibiotikom ampicilinu, chlóramfenikolu a tetracyklínu, aby umožnili analýzu jednotlivých fágových titrov vo zmesi fágov pomocou titrácie kolónií za použitia agarových platní obsahujúcich odlišné antibiotiká. Vystavené protilátky reagujú so slepačím vaječným lyzozýmom (Dl,3), anti-epiteliálnou adhéznou molekulou (C215) a doposiaľ neznámou povrchovou molekulou epiteliálnej nádorovej bunky (1F, Tordsson et al, zaslané k publikácii)·
Subtrakčná selekcia
Rezy negatívneho selekčného tkaniva (hrubé črevo, tenké črevo alebo maternica) boli vysušené vzduchom na sklíčkach, zafixované v ľadovo studenom acetóne a rehydratované v 20% FBS v TBS. Fág z knižnice, 1O10 alebo 1011 v 20% FBS, alebo zmesi modelového fágového klonu, miniknižnice, boli inkubované s rezmi po dobu 15-24 hodín vo vlhkej atmosfére, aby došlo k adsorpcii nechcených fágových špecificít.
Adsorbovaný fágový roztok bol prenesený a inkubovaný, ako je uvedené vyššie, pre pozitívnu selekciu na rezoch nádorov karcinómu hrubého čreva. Rezy boli premyté šesťkrát po dobu 10 minút v TBS pufri a potom dvakrát po dobu 5 minút v Genenase pufri, IM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 6 mM CaCl2, 1 mM EDTA, pH 8,0.
01-2113-02-Če
Fág bol eluovaný po dobu 30 minút 400 ug/ml Genenase v Genenase pufri pri izbovej teplote. Eluovaný fág bol uvolnený za použitia 1 ml 10 x koncentrovaného kmeňa E. coli DH5aF' ODsoo 1/0. Infikované baktérie boli nariedené v 2xYT suplementovanom ampicilinom v koncentrácii 0,1 mg/ml alebo
I chlóramfenikolom (50 ug/ml) a kultivované po dobu 1-24 hodín pri teplote 24-37°C (až do dosiahnutia Οϋθοο 0,5).
Bol pridaný pomocný fág M13K07 (MOI približne 10, inkubácia pokračovala po dobu 2 hodín, po ktorej bol pridaný kanamycín do finálnej koncentrácie 70 ug/ml a kultúra bola pretrepaná pri 250 ot/min a teplote 28°C, až bolo dosiahnuté Οϋδοο 2-3 (1-2 dni) . Baktérie boli peletizované centrifugáciou a fág v supernatantu peletoval dvomi PEG/NaCl precipitáciami a centrifugáciami. Fágová peleta bola nariedená v TBS.
Pre tetracyklínový a chlóramfenikolový modelový fág predchádzala 45 minútová inkubácia pri teplote 37°C titrácii kolónií. Pre chlóramfenikol rezistentný fagemidový konštrukt z knižnice bolo toto obdobie expresie rezistencie predĺžené na 2 hodiny.
Alternatívne k tkanivovým rezom boli použité živé bunky v 1% BSA v PBS pre pozitívnu selekciu v modelových experimentoch. Adsorbovaný fág bol prenesený a inkubovaný na 3 miliónoch buniek Colo205 po dobu 1 hodiny. Bunky boli trikrát premyté po dobu 10 minút a potom eluované pomocou 100 ul Genenase, ako je popísané vyššie. V experimentoch vyššie bol pridaný k zníženiu potenciálnych nešpecifických väzobných miest fág s obmedzenou infekčnou kapacitou a kódovaným génom pre rezistenciu voči antibiotiku (1012/ml) .
V modelových experimentoch za použitia tkanivových rezov pre negatívne i pozitívne selekčné kroky bol použitý fág Dl, 3
01-2113-02-Če scFv v rovnakom koncentračnom rozmedzí, ako u špecifického fágu.
Príklad 2
I
Je zrejmé neskoré obohatenie špecificity z knižnice a je zistená optimálna diverzita v predposlednom selekčnom kole.
Hoci bol výťažok fágu z knižnice v zrovnaní s vnútorným kontrolným fágom Dl, 3 scFv nízky, zvýšil sa medzi šiestym a siedmym selekčným kolom, čo ukazuje obohatenie tkanivovo špecifického fágu v knižnici.
Protilátky ScFv boli produkované kultiváciou bakteriálnych klonov infikovaných fágom z knižnice z posledných štyroch selekčných kôl (260-280 klonov/selekčné kolo). Percento scFv protilátok viažucich sa na tkanivové rezy karcinómu hrubého čreva a na rezy hrubého čreva a relatívny výťažok fágu z knižnice oproti vnútornému kontrolnému fágu (obohatenie knižnice) sú uvedené na Obr. 3. Tkanivovo reaktívne scFv protilátky (29/280) nemohli byť demonštrované až do piateho selekčného kola, čo naznačuje, že negatívna adsorpcia potlačila obohatenie bežných široko reaktívnych špecificít.
V predchádzajúcich štúdiách bola za použitia rovnakej knižnice pre pozitívnu selekciu na bunkách karcinómu hrubého čreva (Tordsson et al, zaslané k publikácii), za použitia melanómovej knižnice pre pozitívnu selekciu na melanómových tkanivových rezoch (Tordsson et al. 1997) a pozitívnej selekcie na rôznych nádorových bunkách (nepublikované výsledky) , .dosiahnutá vysoká frekvencia špecifického fágu už vo druhom alebo treťom selekčnom kole.
01-2113-02-Če
Naviac boli teraz za použitia vyvinutého spôsobu subtrakčnej selekcie tkanivových rezov identifikované nové špecificity, ktoré neboli skoršie vybrané z knižnice karcinómu hrubého čreva. Imunohistochemické farbenie scFv protilátkových
I . ‘ klonov reprezentujúce šesť identifikovaných špecifitných skupín je vedené na Obr. 4. Protilátka K302 scFv silno reaguje s tkanivom kolorektálneho karcinómu (A) , ale tiež široko s bunkami epiteliálnymi, lamina propria a Peyerských plátov v hrubom čreve(B, C). K293 scFv reaguje s bunkami a depozitovaným materiálom (snáď mucínom) v nádorovom tkanive (D) a iba s luminálnou stranou normálnych epiteli! .hrubého čreva a nie s Peyerskými plátmi (E, F) . Protilátka K320 reagovala s nádorovými bunkami domnelými infiltrujúcimi bunkami v tkanive karcinómu hrubého čreva (G) . Táto protilátka silne reagovala s epiteliami normálneho hrubého čreva hlboko v kryptách, ale nie s bunkami lamina propria (H) . Protilátka K294 scFv reagovala spôsobom, ktorý naznačuje intracelulárnu lokalizáciu rozpoznávaného antigénu v hrubom čreve(I) a v karcinómu hrubého čreva (nie je uvedené). Kloň IIID9 scFv reagoval s bunkami karcinómu hrubého čreva, ale nie s depozitovaným materiálom alebo infiltrujúcimi bunkami (J). Reagoval hlbšie v kryptách hrubého čreva ako K293 scFv, ale zdal sa byť viacej obmedzený ako protilátka K320 scFv (K) . Posledná protilátkové špecificita, IIDllscFv, farbila výstelku povrchovej vrstvy vnútri krvných ciev (najpravdepodobnejšie endoteliálne bunky, L).
Zloženie špecificitných typov sa zmenilo po posledných troch selekčných kolách (Tabulka 1) . V piatom selekčnom kole boli nájdené iba dva typy, väčšinou na nádor obmedzená skupina K293, a široko reagujúca skupina K293. Vysoká frekvencia skupiny K293 sa znížila a u skupiny K302 sa zvýšila po poslednom kole, zatiaľ čo ich frekvencia sa významnejšie
01-2113-02-Če nezmenili medzi piatom a šiestom selekčnom kolom. V šiestom selekčnom kole sa objavili štyri ďalšie špecificitné typy. Tri z týchto typov zmizli v poslednom kole.
ukázalo počtom zatiaľ
Záverom je možno povedať, že predposledné selekčné kolo optimálnu diverzitu špecificitných skupín s vysokým špecifických verzus nešpecifických fágov v knižnici, čo široko reagujúca K302 špecificitná dominovala po poslednom selekčnom kole, vyhľadávania optimálneho selekčného kola odlišnosti špecificity a naznačuje, že skupina
To ukazuje k nájdeniu význam širokej negatívny selekčný filter bol účinný do šiesteho selekčného kola, po ktorom bol saturovaný.
Tabuľka 1.
Frekvencia (%) väzby scFv. Špecificita na selekčné kolo.
Špecificitné skupiny: R5 R6 R7
K293 69 65 28
K302 31 31 71
K320 0 1,1 0
K294 0 U 1,7
IIID9 0 0,6 0
11D11 0 0,6 0
Celková frekvencia väzobných látok 10 65 89
01-2113-02-Če
Príklad 3
Častá a homogénna expresia tumor selektívneho antigénu je demonštrovaná K293-superantigén fúznym proteínom.
Reprezentant väčšiny na tumor obmedzujúcich sa špecificitných skupín, protilátka K293, bola reklonovaná, aby bola geneticky spojená s imunologickou efektorovou molekulou, D227A mutantom superantigénu Stafylokokového Enterotoxínu A, SEA (D227A). Tento fúzny proteín bol kultivovaný vo fermentore a purifikovaný, a použitý k demonštrácii homogénnej reaktivity s piatimi použitými nádormi. Reaktivita fúzneho proteínu K293 scFv-SEA (D227A) ukázala rovnako homogénne farbenie kolorektálneho karcinómu uvedené na Obrázku 5 v zrovnaní s EpCAM špecifickým fúznym proteínom C215 Fab-SEA (D227A). Farbenie depozitovaného materiálu vnútri nádorových kanálikov a obmedzená reaktivita hrubého čreva k povrchovým epiteliám bola potvrdená za použití K293 scFv-SEA (D227A) fúzneho proteínu.
Materiál a metodika
Tvorba ScFv protilátky a scFv (D227A)
Jednotlivé klony nie-supresorového kmeňa E. coli HB2151, transdukované fágom z šiesteho a siedmeho selekčného kola, boli kultivované po dobu 17 hodín pri teplote 37 °C v mikrojamkových doštičkách (Nunc) v 2x YT médiu suplementovanom 100 ug/ml ampicilínu. Alikvóty boli prenesené do mikrojamkových doštičiek s nízkym obsahom fosfátového média a antibiotikami pre expresiu scFvs z phoA promótora a kultivované pri teplote 30°C po dobu 17 hodín. Bunky boli peletované centrifugáciou pri 2200 ot/min po dobu 7 minút a supernatanty boli prenesené na doštičky obsahujúce rovnaký
01-2113-02-Če objem/jamku 1% bovinného sérového albumínu (BSA) v PBS. ScFvSEA (D227A) fúzne proteíny boli produkované fermentáciou a
purifikované za použitia králičej anti-SEA protilátky
naviazanej na afinitnú kolónu podľa Tordssona et al. 1997 a
štandardných metód. Purifikované fúzne proteíny boli
kvantifikované sendvičovou ELISA analýzou za použitia anti-SEA
protilátky a biotinylovaných anti-SEA protilátok ako
zachycujúcich a detekujúcich protilátok. Integrita fúznych
proteínov bola potvrdená ímunoblotovou analýzou za použitia biotinylovaných anti-SEA protilátok.
Imunohistochéiaia
Rezy (6-8 um) boli zafixované v ľadovom acetóne a rehydratované v 20% FBSve 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,6 (TBS). Endogénny biotín bol blokovaný avidínom a biotínom (Vector Laboratoriem, Burlingame, CA). Primárne scFvs (supernatanty kultúr) alebo scFv-SEA (D227A) fúzne proteíny, 5 ug/ml, boli inkubované s rezmi po dobu 1 hodiny. Králičie antisérum proti C terminálnemu koncu, ATPAKSE, nasledované biotinylovanými kozími anti-králičími protilátkami (DÁKO A/S), 1 ug/ml, bolo použité k detekcii scFvs. Fúzne proteíny boli detekované za použitia afinitne purifikovaných a biotinylovaných králičích anti-SEA protilátok, 5 ug/ml.
Tieto reagencie a nasledujúci StreptABCkomplex HRP (DÁKO A/S) nariedený 1/110 v 50 mM Tris pH 7,6 boli inkubované po dobu 30 minút. Medzi všetkými krokmi boli rezy premyté 3-krát v TBS. Farbiaca reakcia bola vyvíjaná 8 minút v 0,5 mg/ml 3,3'-diaminobenzidín tetrachloridu (Sigma) rozpustenom v Tris pH 7,6 s 0,01 percentným Η2Ο2. Po 10 minútach prefarbenia v metylovej zeleni boli sklíčka prepláchnuté 10 minút tečúcou vodou a postupne dehydratované v 70-99% etanole a xyléne pred uložením do DPX média (Sigma).
01-2113-02-Če
Finger printing scFvs.
ScFv gény (predstavitelia scFv špecificky) boli amplifikované polymerázovou reťazovou reakciou. Boli použité alikvóty po 5 ul z mikrojamkových bakteriálnych kultúr ä priméry komplementárne oblastiam 5' a 3' scFv génu vo fagemidovém vektore transferovaných baktérií (oblasti vo phoA promótora a M13 génu III). Hinf I reštrikčné typy amplifikovaných scFv génov boli analyzované na 1% gélovej elektroforéze. Klony s jedinečnými typmi alebo prototypovými typmi boli vybrané a uložené ako predstavitelia každej imunohistochemickej špecificitnej skupiny.
Príklad 4
Absencia alebo spätneväzobné zníženie expresie K293 antigénu in vitro odráža výhody selekčného princípu založeného na tkanivách (predstavujúca uchovanie autentického in vivo fenotypu)
Mierne fixované zamrazené tkanivové rezy nádorov resekovaných od pacientov (v zrovnaní s kultivovanými nádorovými bunkami) sú zdrojom komplexných antigénov (pre selekciu fágov), ktoré velmi napodobňujú pôvodný nádorový genotyp. Na rozdiel od homogénnej a častej reaktivity s nádormi odvodenými od pacientov, reagovala protilátka K293 scFv-SEA (D227A) slabo s 2/9 (HT29 a LS174T) a nereagovala s 7/9 (CO1O201, Colo205, Colol37, Colo320DM, SW480, SW620 a
EIDE) bunečnými líniami karcinómu hrubého čreva pomocou prietokovej cytometrie, na rozdiel od miernej až silnej reakcie s C215 Fab-SEA (D227A) (Tabuľka 2 a neuvedené výsledky). Dve z negatívnych bunečných línií (Colo205 a WiDr) a dve slabo reagujúce bunečné línie boli ponechané rásť
01-2113-02-Če subkutánne na myšiach SCID.
K analýze reaktivity K293 scFv-SEA (D227A) s týmito nádormi bola použitá imunohistochémia. Nádor Colo205 bol kompletne negatívny, zatiaľ čo nádorové bunky nádoru WiDr boli negatívne, ale depozitovaný materiál bol pozitívny. Nádor HT29 bol pozitívny na menšie časti buniek, približne 5-10% a pre depozitovaný materiál. LS174T nádor bol heterogénne pozitívny u približne 50% buniek a pozitívny na depozitovaný materiál. Častá a homogénna expresia epitopu K293 u primárnych nádorov pacientov nie je teda pozorovaná ani u in vitro kultivovaných nádorových bunečných línií, ani u nádorov odvodených od bunečných kultivovaných u xenogénneho hostitela. To ukazuje, že použitie tkanivových rezov ako antigénneho zdroja pre selekciu fágu bolo nezbytné k nalezeniu na. nádor obmedzenej K293 špecificity.
Slabá expresia K293 epitopu na dvoch bunečných líniách
detekovaná prietokovou cytometriou naznačuje, že rozpoznané
TAA môžu byť exprimované na povrchu nádorových buniek.
Povrchová expresia in vivo bola potvrdená prietokovou
cytometriou prevedenou na nádorových bunkách odvodených z resekovaných primárnych karcinómov hrubého čreva a podrobených reakcii Dispázou (neutrálna proteáza) a kolagenózou za účelom dezintegrácie nádorov do bunečných suspenzií. Nádorové bunky rozpoznávané od ďalších buniek (ako sú napríklad fibroblasty, krvné bunky a bunky hladkého svalstva) ako Ep-CAM+ bunky, ako bolo detekované pomocou monoklonálnej protilátky C215 boli dvojito ofarbené na K293scFv-SEA (D227A) reaktivitu (Obr. 6). Veľká časť Ep-CAM pozitívnych nádorových buniek bolo K293 reaktívnych (približne 60%) po o.n. enzymatickej reakcii vyžadovanej extrakcii buniek.
Hoci s variabilnou silou, reaktivita K293scFv-SEA (D227A)
01-2113-02-Če mohla byť demonštrovaná v troch ďalších experimentoch za použitia buniek z resekovaných primárnych nádorov, čo podporuje, že K293 TAA je v autológnom hostiteľovi exprimovaný na povrchu nádorových buniek.
Tabuľka 2. Protilátka K293 homogénne farbí primárne karcinómy hrubého čreva, ale iba slabo a heterogénne bunečné línie karcinómu hrubého čreva kultivované in vitro alebo u xenogénneho hostiteľa, tzn. subkutánne u SCID myší.
Bunečná línia Prietoková cytometria Sc.rast.u SCID myší Primáme karcinómy hrubého čreva
Colo205 Negatívna Negatívny
WiDr Negatívna Negatívny *
HT29 Slabo pozitívna 5-10% pozitívnych buniek* HomoRénne farbenie piatich primárnych karcinómov hrubého Čreva použitých pre selekciu
LS174T Slabo Dozitívna 50% heterogénne pozitívny*
* Depozitovaný materiál' je silne pozitívny
Materiál a metodika
Prietoková cytometria
Reaktivita protilátok geneticky spojených so Stafylokokovým Enterotoxínom A, SEA, ku kultivovaným čerstvo pripraveným nádorovým bunkám bola demonštrovaná za použitia biotinylovaných králičích anti-SEA protilátok a avidín-PE.
01-2113-02-Če
Primárne bunky ľudského karcinómu hrubého čreva boli odvodené od kolorektálnych karcinómov resekovaných rovnaký deň a udržovaných na ľade vo 150 mM NaCl až do použitia (menej nie 4 hodiny). Nádory boli narezané na malé kúsky a pomaly pretrepané pri izbovej teplote cez noc v roztoku obsahujúcom 1 mg/ml kolagenózy (Sigma), 0,1 mg/ml hyaluronidázy (Sigma), 2,4 mg/ml Dispázy (Boehringer Mannheim) a 20 ug/ml deoxyribonukleázy (Sigma) neriedených v médiu RPMI 1640 (Vinco, Middlesex, UK) . Nádorové bunky boli separované od tkanivových zvyškov filtráciou, jedenkrát premyté pomocou PBS/1% BSA a potom ofarbené pomocou 5 ug/ml králičej antimyšacej FITC monoklonálnej protilátky C215 (Dakopatts) nariedenej 1/20 a pomocou 5 ug/ml K293scFv-SEA (D227A)/biotinylovaných polyklonálnych králičích anti-SEA protilátok nariedených 1/1000/avidín-PE nariedený 1/20.
Príklad 5
Protilátka K293FabSEÄ/Ell silne a vo vysokom percente farbí epiteliálne nádory
Imunohistochemická reakcia na rôznych ľudských nádoroch je sumarizovaná v Tabuľke 3. Protilátka K293FabSEA/Ell vykazuje silnú pozitívnu reakciu na adenokarcinómoch hrubého čreva, pankreasu, pľúc a prsníka (Obrázok 7). Silná reakcia je zisťovaná u malígnych buniek aj u mucínu podobnému odlúčenému materiálu v glandulárnych štruktúrach. Žiadna reakcia nebola získaná u karcinómu obličiek alebo prostaty, zatiaľ čo jeden z dvoch melanínov vykázal slabú až strednú reakciu. U karcinómov hrubého čreva došlo k silnému ofarbeniu u všetkých 12 vyšetrených nádorov. Percento pozitívnych malígnych buniek v jednotlivých nádoroch sa líšilo od 75 do 100%. Bolo zistené, že päť zo šiestich nádorov prsníka je silne pozitívnych s
01-2113-02-Če frekvenciou pozitívnych malígnych buniek 75-100%. Hoci percento pozitívnych buniek u karcinómov hrubého čreva a prsníka sa líši od 75 do 100%, vykazuje väčšina nádorov viacej ako 90% pozitívnu reakciu. Dvaja z dvoch pankreatických nádorov tiež vykázali silnú reakciu u viacej ako 90% malígnych buniek.
Medzi nemalobunečnými karcinómami pľúc (NSLC sú dva skvamózne karcinómy a štyri sú adenokarcinómy plúc. Všetky vykázali silnú farebnú reakciu malígnych buniek. U oboch vyšetrených skvamóznych karcinómov bolo pozorované pozitívne farbenie u viacej ako 90% nádorových buniek. U adenokarcinómov 2 vykázali 90% reaktivitu nádorových buniek a dva boli pozitívne na menej ako 10% bunkách.
Typ reaktivity K293FabSEA/Ell na rôznych karcinómoch hrubého čreva sa zdá korelovať so stupňom diferenciácie nádoru. U vysoko diferencovaných nádorov dominuje apikálne farbenie malígnych buniek. U niektorých z týchto vysoko diferencovaných nádorov sú bazolaterálne časti malígnych buniek kompletne negatívne, zatiaľ čo apikálne časti sú silne pozitívne. U nízko a stredne diferencovaných nádorov nie je imunoreakcia polarizovaná do určitej časti, ale je skôr uniformné distribuovaná v malígnych bunkách.
Tabulka 3. Reaktivita nádorového tkaniva, K293FabSEA/Ell
Karcinóm hrubého čreva, primáme nádory Karcinóm hrubého čreva
Karcinóm pankreasu
Silné farbenie u 12/12 nádorov. 75-100% reaktivity nádorových buniek. Silná reakcia je tiež patrná u mucínu podobnému odlúčenému materiálu.
Silné farbenie u 3/4 nádorov * . 75-100% reaktivity nádorových buniek.
Silné farbenie u 2/2 nádorov * . 90% reaktivity nádorových buniek.
01-2113-02-Če
Karcinóm prsníka
Nemalobunečný karcinóm pľúc (NSLC) Malígny melanóm
Karcinóm prostaty
Karcinóm obličky
Silná reakcia u 5/6 nádorov. (75-100% reaktivity nádorových buniek). Silná reakcia je tiež patmá u mucínu podobnému odlúčenému materiálu.
Silná reakcia u 6/6 nádorov. Menej ako 10% reaktivity nádorových buniek u 2/6, viacej ako 90% u 4/6. Reakcia je tiež patmá u mucínu podobnému odlúčenému materiálu.
Slabá až mierna reakcia u 1/2 (90% reaktivity nádorových buniek). Negatívne u 1/2.
Negatívne u 2/2.
Negatívne u 2/2.
* Jedna z pozitívnych metastáz bola fixovaná vo formalíne a zaliata do parafínu.
Príklad 6
Protilátka K293FabSEA/Ell vykazuje veľmi obmedzenú skríženou reaktivitu s normálnym tkanivom
Reaktivita s normálnym tkanivom je medzi panelom študovaných orgánov obmedzená na hrubé črevo, tenké črevo a prsník. Je patrné silné farbenie apikálnej časti epiteliálnych buniek v hrubom čreve (Obrázok 8) . To je tiež zisťované v jednej z vyšetrených biopsií z tenkého čreva. Tieto biopsie sú zrejme odobraté z odlišných oblastí, čo ukazuje, že protilátka K293FabSEA/Ell reaguje iba s určitými časťami tenkého čreva. V prsníkovom tkanive . je patrná slabá až mierna reakcia glandulárnych epiteliálnych bunkách a v častiach obklopujúcich stróma (Obrázok 8) . Žiadna reakcia nie je patrná v žalúdku, slezine, obličkách, pečeni, pľúcach, koži, pankrease, štítnej žľaze, srdcovom svale alebo centrálnom nervovom systéme (Tabuľka 4) .
01-2113-02-Če
Tabúlka 4. Normálna reaktivita tkanív, protilátky
K293FabSEA/Ell
Hrubé črevo Silná reakcia v apikálnych častiach epitelu. 5/5
Tenké črevo Silná reakcia v epiteli v 1/2
Žalúdok Negatívna 2/2
Slezina Slabá až mierna reakcia vglandulámom epiteli a obklopujúcich stromálnych častiach. 2/2
Oblička Negatívna 2/2
Pečeň Negatívna 2/2
Pľúca Negatívna 2/2
Koža Negatívna 2/2
Pankreas Negatívna 2/2
Štítna žľaza Negatívna 1/1
Srdcový sval Negatívna 1/1
Centrálny systém nervový Negatívna 1/1
Materiál a Metodika
Imunohistochémia
Kryorezy pre svetelnú mikroskopiu
Nádorové a normálne tkanivo láskavo poskytnuté Chirurgickým oddelením v Lund University Hospital boli okamžite zamrazené v izopentáne, ktorý bol vopred vychladený v tekutom dusíku a uskladnený pri -70°C. Po vytvorení kryorezov boli rezy cez noc vysušené vzduchom. Rezy boli fixované v studenom acetóne, blokované pre endogénny biotín pomocou avidín / biotínu (Vector, Burlingame, CA) a potom inkubované s primárnou protilátkou K293FabSEA/Ell po dobu 1 hodiny.
Fúzy proteíny bol pripravený genetickou fúziou génov K293
01-2113-02-Če
VH a VL (získaných od scFv vybraných z knižnice) s génmi cynomolgus CH1 a C-lambda. Kombinované Fab boli pripojené k chimérickej mutante superantigénu Stafylokokového enterotoxínu AE (D227A, vykazujúcej silne zníženú väzbu MHC triedy II) Ell. Bolo preukázané, že tento konštrukt, K293FabSEA/Ell, sa nešpecifický viaže na veľmi nízkych hladinách a umožňuje citlivú detekciu sekundárnymi protilátkami polyklonálneho králičieho anti-SEA antiséra prevedenú a bitinylovanú štandardnými spôsobmi.
Sekundárne protilátky boli inkubované po dobu 30 minút s následným streptavidín-biotín/HRP (Dakopatts, Kodaň) krokom po ďalších 30 minút. Medzi všetkými krokmi bolo prevedené trikrát premytie pomocou 0,05 M Tris, pH 7,6 a 0,15 M NaCl. Ako chromogén bol použitý diaminobenzidín (DAB) a rezy boli prefarbené v 0,5% metylovej zeleni. Panepiteliálny reaktívny fúzny proteín C215FabSEA (D227A) bol použitý ako pozitívna kontrola. Ako negatívna kontrola bol použitý fúzny proteín medzi netkanivovou reaktívnou Fab a SEA-D227A alebo nebola použitá žiadna primárna protilátka. Všetky protilátky boli použité v koncentrácii 5 ug/ml. Výsledky sú vyjadrené ako negatívne, slabé, stredné alebo silné.
Parafínové rezy pre svetelnú mikroskopiu
Nádorové tkanivo lymfatických metastáz kolorektálneho karcinómu bolo fixované vo 4g formaldehydu (Sigma, St. Louis MO) pri teplote 4°C cez noc. Po premytí v PBS bolo tkanivo dehydratované a zaliate do parafínu (Histolab AB, Gothenburg, Švédsko). Parafínové rezy boli pripravené a vysušené pri teplote 37°C cez noc. Rezy boli deparaf inozované, rehydratované a imunohistochemicky ofarbené, ako je popísané vyššie.
01-2113-02-Če
Príklad 7
Protilátka K293FabSEA/Ell rozpoznáva antigén exprimovaný na povrchu
Subcelulárna lokalizácia imunoreakcie je presnejšie demonštrovaná na tenkých rezoch v zrovnaní s 8 um kryorezmi. Vo 2 um plastových rezoch bolo možné demonštrovať farbenie apikálne, rovnako tak ako bazolaterálne bunečné membrány buniek kolorektálneho karcinómu (Obrázok 9A). Táto vzorka nádoru bola tiež spracovaná pre elektrónovú mikroskopiu. Vďaka rozlíšeniu elektrónovej mikroskopie bolo možné demonštrovať, že imunoreakcia je lokalizovaná na vonkajšom povrchu malignych buniek. Farbenie s následnou mikroskopiou 2 um poltenkých rezov a' elektrónová mikroskopia normálneho hrubého čreva tiež preukázala, že imunoreakcia je lokalizovaná na úrovni vonkajšieho, povrchu mikroklkov v luminálnom epiteli (Obrázky 9B a C).
Materiál a Metódy
Plastové rezy pre svetelnú mikroskopiu a elektrónovú mikroskopiu
Materiál normálneho a nádorového tkaniva bol spracovaný podlá nasledujúceho popisu. Čerstvý nesekčný materiál bol zafixovaný vo zmesi 4% formaldehydu (Sigma, St. Louis MO) a 0,25% glutaraldehydu (TAAB, Berkshire) po dobu 2 hodín. Po premytí v FBS boli tkanivá cez noc kryoprezervované premytím v PBS obsahujúcom 30% sacharózu a potom okamžite zamrazené v izopentáne/tekutom dusíku, ako je uvedené vyššie. 50 um velké, volne plávajúce kryorezy boli inkubované s rovnakými protilátkami, ako je popísané pre svetelnú mikroskopiu, ale
01-2113-02-Če inkubačné časy sa líšili. Primárna protilátka bola inkubovaná cez noc, sekundárna po dobu 3 hodín a streptavidín-biotín/HRP po dobu ďalších 3 hodín. Po reakcii v DAB boli rezy opäť fixované v 1% OsO4 (Štandard Supplies, Kallered) , dehydratované a zaliate do Eponu (Agar Scientific Ltd, Stansted, UK).
Poltenké rezy (2um) pre svetelnú mikroskopiu a ultratenké rezy (50-60 nm) pre elektrónovú mikroskopiu boli pripravené na ultramikrotóme (LKB, Hromka, Švédsko). Poltenké rezy boli prefarbené 1% metylénovou modrou. Ultratenké rezy boli ofarbené v zariadení pre farbenie ultratenkých rezov (LKB, Hromka) v 2% uranylacetátu a citrátu olovnatom.
Príklad 8 .
Protilátka K293FabSEA/Ell nedetekuje cirkulujúci antigén v séru pacientov s kolorektálnym karcinómom
Obr. 10 ukazuje veľkosť frakcie rádiooznačeného SEA fúzneho proteínového konštruktu a cirkulujúceho nádorového antigénu po inkubácii sa vzorky plazmy od pacientov s kolorektálnym karcinómom a od jedného zdravého dobrovoľníka.
Pre protilátku K293FabSEA/Ell bolo zistené, že sa vyskytuje v menej ako 1,5-krát väčšom množstve v proteínových komplexoch po inkubácii s plazmou od pacientov s nádormi vo zrovnaní s inkubáciou s plazmou od zdravých jedincov. Na druhú stranu pre C242-Fab- konštrukt (pozitívna kontrola) bolo zistené, že viacej ako osemnásobok je vo forme komplexu, ak je inkubovaný s plazmou od pacientov s nádormi. Protilátka K293FabSEA/Ell teda nerozpoznáva žiadny cirkulujúci antigén u pacientov s nádormi.
01-2113-02-Če
Materiál a metódy
Príprava testovanej zlúčeniny
I ug protilátky K293Fab-SEA/Ell, C215Fab-SEAmut.9 a C242FabSE7Lnut .23 bolo označené pomocou 125I do špecifickej aktivity 10 uCi/ug za použitia vopred potiahnutých skúmaviek Iodogen (Pharmacia-Amersham Biotech) (Fraker a Speck, 1978). Označené testované zlúčeniny boli určené s ohľadom na koncentráciu proteínu a špecifickou rádioaktivitu pomocou HPLC (viď nižšie).
Vzorky plazmy boli odobraté od pacientov s kolorektálnym karcinómom (n=12), čo ukazuje na vysoké hladiny cirkulujúceho CA242 antigénu pomocou komerčného stanovenia (CanAg Diagnostics AB, Gothenburg, Švédsko) a od jedného zdravého dobrovoľníka s veľmi nízkymi hladinami CA242 v plazme.
Analýza testovaných roztokov v plazme ul neriedených vzoriek plazmy bolo inkubované s 1 ug/ml testovanej zlúčeniny (nariedená v PBST) po dobu 60 minút pri okolitej teplote a trepaní inkubačnej zmesi. Všetky vzorky boli analyzované pomocou HPLC (viď nižšie).
Pretože vzorky plazmy obsahovali protilátky proti SEA a mohli by dávať falošne pozitívny interakčný signál, boli inkubované s proteínom A, aby sa odstránili imunoglobulíny. Po tomto odstraňovanom kroku bol anti-SEA obsah menej ako 10 pmol/ml. Plazmatický obsah CA 242 vo zbieranej plazme od pacientov s nádormi bol 479 U/ml a menej ako 20 U/ml vo vzorkách zdravých darcov po inkubácii s proteínom A.
01-2113-02-Če
Označené testované zlúčeniny a pripravené vzorky boli analyzované pomocou HPLC na základe molekulového sita. 50 ul vzorky bolo injikované (Waters 717 AutoSampler) a separované na TSK G3000 SW kolóne (7,5 x 600 mm, Toso Haas). Vzorka bola eluovaná pomocou 10 mM PBS, pH 7,4, pri: prietoku 1,0 ml/min pri okolitej teplote. Detekcia bola prevedená pomocou UV detektora (A280 nm, Waters 486) a rádioaktivitného detektora (Flo-Onem A-515-AX) spriahnutých do série a dáta boli zbierané počas 35-60 minút v závislosti od vzorky. Frakcie obsahujúce komplexne naviazanú testovanú zlúčeninu boli pozorované ako vrcholy o vysokej molekulovej váhe, ktoré sa objavovali skoršie na chromatograme ako samotná testovaná zlúčenina. Frakcie obsahujúce jodinovaný fragment alebo volný jód boli
pozorované ako vrcholy o nízkej molekulovej váhe.
Rádioaktivitné chromatogramy boli integrované a oblasť
kompletovaných testovaných zlúčenín a vrcholov o nízkej
molekulovej váhe boli exprimované v percentách celkovej
plochy.
Príklad 9
Purifikácia antigénu združeného s nádormi, ktorý je rozpoznávaný protilátkou K293 reagujúcou s karcinómom hrubého čreva
Z nádorového tkaniva ľudského karcinómu hrubého čreva bol pripravený nádorový extrakt. Extrakt bol aplikovaný na dve kolóny, kontrolnú kolónu a predkolónu spojenú s C215Fab-SEAm9 a kolónu združenú s K293Fab-SEAm9. Kolóny boli zapojené do série pre aplikáciu tkanivového extraktu na kolóny, ale boli separované počas alkalickej elúcie naviazaných proteínov.
Eluované frakcie z kolóny s naviazanou K293Fab-SEAm9 boli
01-2113-02-Če pozbierané, neutralizované, koncentrované a potom analyzované pomocou SDS-PAGE za neredukujúcich podmienok (Obrázok 11). Hlavný pásik (označený A na Obrázku 11) mohol byť vidno približne v oblasti 35-45 kDa vo frakcii eluovanej pri vysokom pH. Hlavný pásik bol vyrezaný a bolo prevedené proteolytické natrávenie trypsínom. Vytvorené tryptické peptidové fragmenty boli separované a sekvencia desiatich prvých N-terminálnych aminokyselinových rezíduí bola určená pre tri z týchto izolovaných peptidov (Obrázok
12). Tri určené krátke Nterminálne peptidové sekvencie (SEQUENCE LISTING ID č. 3-5) vykazujú úplnú homológiu k častiam ľudskej bielkoviny glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáze (GAPDH) (Obrázok 13).
Materiál a metódy
Solubilizácia nádorového tkaniva
Tkanivo ľudského karcinómu hrubého čreva exprimujúce K293 antigén bolo poskytnuté nemocnicami vo Švédsku a toto tkanivo bola skladované zamrazené pri teplote -70°C v tkanivovej banke ABR. Zamrazené tkanivá karcinómu hrubého čreva boli nakrájané skalpelom a prenesené do skúmavky s pufrom s izotonickou sacharózou vopred vychladeným na teplotu 4°C (0,25 M sacharóza, 10 mM KC1, 1,5 mM MgCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4 pri teplote 25°C obsahujúca 1% (v/v) Nonidet P-40 (NP-40) a inhibítory proteáz (Complete™ Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Boehringer Mannheim). Tkanivové rezy boli homogenizované pomocou homogenizátora Ultra-Turrax a boli ponechané solubilizovať pri teplote 0°C. Solubilizovaný roztok bol centri fugovaný pri 11000 ot/min (centrifúga Jetŕich, rotor Universal 30 RF) , aby sa odstránila väčšina bunečných zvyškov. Supernatant bol ďalej centrifugovaný pri 108000 x g pri teplote 4°C (ultracentrifúga Beckman, rotor Ti-60) a finálne sfiltrovaný cez 0,2 um Minisart plus filter (Sartorius AG,
01-2113-02-Če
Góttingen, Nemecko).
Afinitná purifikácia tkanivových antigénov
Protilátky K293Fab-SEAm9 a C215Fab-SEAm9 boli naviazané k , I c
NHS aktivovaným kolónam HiTrap® (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) podľa inštrukcií výrobca. Kontrolná kolóna a predkolóna s naviazanou protilátkou C215Fab-SEAm9 a kolóna s naviazanou protilátkou K293Fab-SEAm9 boli zapojené do série a boli vopred premyté štartovacím pufrom (20 mM tris-HCl, pH 7,5 pri teplote 4°C obsahujúcej 0,2% NP-40). Extrakt bol potom nanesený na kolónu rýchlosťou 0,1 ml/min, prietok bol necirkulovaný, a potom boli kolóny premyté štartovacím pufrom. Naviazané antigény na každej kolóne boli eluované gradientom dietylamínu od pH 7 do pH 11 dosiahnutého za 20 minút. Boli zbierané frakcie o 0,5 ml, ktoré boli neutralizované pomocou 0,1 ml IM Tris HC1 o pH 6,7 a tieto frakcie boli uskladnené pri teplote -20°C. Purifikácia bola prevedená za použitie FPLC systému ÄKTA od spoločnosti Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Švédsko). Eluované frakcie boli zozbierané, skoncentrované a potom analyzované na SDS PAGE. Identifikované proteínové pásiky boli vyrezané a uložené pri teplote 4°C. Proteíny boli potom natrávené trypsínom a bola určená Nterminálna peptidová sekvencia pre jednotlivé peptidy v centri Protein Analysis Center (Karolínska Inštitúte, Stockholm, Švédsko).
Príklad 10
Protilátka K293FabSEA/Ell je schopná potlačiť nádorový rast u myší s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou. (SCID)
Superantigén SEA má schopnosť aktivovať T lymfocyty k
01-2113-02-Če produkcii cytokínov a k cytotoxicite. Ak je superantigén fúzovaný s protilátkou reagujúcou s nádorom, má schopnosť zacieliť nádorové bunky. Lokalizácia superantigénu v oblasti nádoru potom vedie k selektívnemu zabitiu nádorových buniek.
Výsledok experimentu je prezentovaný na Obrázku 14, ktorý ukazuje, že zvieratá liečené pomocou K293FabSEA/Ell majú 80% zníženie nádorovej masy v zrovnaní s kontrolnými zvieratami liečenými nedelenými protilátkami
NRML-05 (antimelanómové)
FabSEA (D227A) .
Materiál a metódy
Myši s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID) (Bommice, Ry,
Dánsko) boli injikované ip. bunkami karcinómu hrubého čreva LS174T (ATCC, Rockville, MD) v množstve 5xl06 v
0,2 ml vehikula (PBS-1% Balb/c sérum. 0 24 hodín neskoršie boli myši injikované ip. ludskými mononukleárnymi bunkami (PBMC) v množstve 20 x 106 pripravenými pomocou Ficoll-Hypaque separácie leukocytárnych konzerv od darcov krvi z Fakultnej nemocnice v Lunde vo Švédsku. Prvý, tretí a šiesty deň po injekcii nádoru bola zvieratá liečená 100 ug NRML05FabSEA/D227A (6 zvierat) alebo 100 ug K293 FabSEA/Ell (7 zvierat). 51. deň boli zvieratá usmrtená, nádorové ložiská boli odstránené a bola určená hmota nádorov.
01-2113-02-Če
Referencie
Hoogenboom HR, deBruine AP,.Hufton SE, Hoet RM, Arends JW, Roovers RC. Antibody phaqe display technology and its applications. (1998) Immunotechnology 4:1
Korbel RS. Significance of tumor-host interactions in cancer growth and metastases. (1995) Cancor Metastasi Rev 14:259 Koulet G, Milstein C. Derivation of specific antibodyproducing tissue culture and tumor lines by celí vision. (1976) Eur J Immunol 6:511
Tordsson J, Abramsen L, Kalland T, Ljung C, Invar C, Brodin T. Efficient selection of scFv antibody phage by adsorption to in situ expressed antigens in tissue sections. (1997) J Immunol Methods 210:11
Tordsson J, Lavasani S, Ohlsson L, Karlstróm P, Svendberg H, Abrahmsén L a Brodin T. A3 - a novel colon and pancreatic cancor reactive antibody from a primáte phage library selected using intact tumor cells. Zaslané k publikácii do Int J Cancor.
Williams KL.
Genomes and proteomes: towards a multidimensional view of biology.
(1999) Electrophoresis
20:678.
01-2113-02-Če
Legenda k obrázkom
Obr. 1. Princíp subtrakčnej selekcie. Špecifická desorpcia široko reaktívneho fágu (čierne) a zníženie nevystavujúceho a nešpecifického fágu (biele) premytím počas pozitívnej selekcie. Potom je eluovaný na nádor obmedzený fág (kockované).
Obr. 2. Účinná subtrakčná selekcia. Negatívna adsorpcia na rezy tkaniva maternice alebo tenkého čreva s následnou pozitívnou selekciou na bunkách Colo205 (A) . Dve opakované adsorpcie na rezoch maternice, tenkého čreva alebo pľúc a pozitívna selekcia na rezoch nádorového tkaniva Colo205 (B).
Obr. 3. Neskoré obohatenie panelu tkanivovo špecifického fágu zo subtrakčnej vybratej knižnice.
Obr. 4. Typy imunohistochemického farbenia vybranej knižnice acFvs. Farbenie karcinómu hrubého čreva (A), epitelu hrubého čreva (B) a Peyerských plátov (C) pomocou K302 scFv a K293 scFv (D-F). Farbenie karcinómu hrubého čreva (G) a epitelu hrubého čreva (H) pomocou K320 scFv a IIID9 scFv (J,K). Farbenie epitelu hrubého čreva pomocou K294 scFv (I) a krvných ciev hrubého čreva pomocou IIDllscFv (L).
Obr. 5. Imunohistochemické reaktivita K293 scFv-SEA (D227A) voči karcinómu hrubého čreva (A) a hrubého čreva (B) , a reaktivita C215 Fab-SEA (D227A) voči karcinómu hrubého čreva (C) a hrubého čreva (D) pri koncentrácii 100 nM. Čiara v A má 10 um.
Obr. 6. Prietoková cytometria buniek karcinómu hrubého čreva čerstvo pripravených z resekovaného primárneho ľudského
01-2113-02-Če karcinómu hrubého čreva. Bunky zadržané pre svoju veľkosť, granularitu (A,B) a expresiu Ep-CAM ako markéra pre epiteliálne bunky boli ofarbené 5 ug/ml K293scFv-SEA (D227A) (šedá línia) alebo ako negatívna kontrola bez primárneho protilátkového fúzneho proteínu (čierna línia) (C).
Obrázok
7.
Farbenie rôznych nádorov pomocou
K293FabSEA/Ell.
A. Farbenie mierne diferencovaného karcinómu hrubého čreva vykazujúce silné farbenie malígnych buniek (šipka) aj mucinu podobnému materiálu (m) v glandulárnych štruktúrach.
B.
Farbenie vysoko diferencovaného karcinómu hrubého čreva ilustrujúce silné apikálne farbenie (šípka) malígnych buniek, zatiaľ čo bazálne časti neoplastických žliazok (b) nereagujú. C.
Silné farbenie malígnych buniek
Silné farbenie malígnych buniek adenokarcinómu pľúc (šípka). Čiara v A nádoru prsníka (šípka) D.
predstavuje 50 uM a je tiež platná pre B-D.
Obrázok 8.
Farbenie normálneho hrubého čreva pomocou
K293FabSEA/Ell.
Všimnite si apikálneho farbenia epiteliálnych buniek (šípka).
Imunoreakcia je nájdená v epiteli hladiacom do lúmen hrubého čreva, zatiaľ čo krypty sú negatívne.
B.
Farbenie pomocou K293FabSEA/Ell normálneho prsníka. Slabé až mierne farbenie je vidno v glandulárnom epiteli (g) a obklopujúcich stromálnych častiach (s). C.
Normálne tkanivo prsníka ofarbené pomocou
FabSEA a
SEAD (227A) (FabC215SEAD227A). Všimnite si silného značenia glandulárnych epiteliálnych buniek (g).
Vo stromálnych častiach nie je
D. Normálne prsníkové tkanivo ako primárna protilátka) ilustrujúce negatívna kontrola (žiadna žiadnu reakciu v glandulárnych epiteliálnych bunkách (g) a vo stromálnych častiach (s) . Čiara v A predstavuje 50 um. Čiara v
B 50 um platí tiež pre C a D.
01-2113-02-Če
Obrázok 9. Poltenký rez z karcinómu hrubého čreva (A) a normálneho hrubého čreva (B) ofarbený pomocou K293FabSEA/Ell. V rezu karcinómu hrubého čreva sú pozitívne ofarbené bazálne (šípka b) , apikálne (šípka a) aj laterálne časti nádorových buniek. U normálneho hrubého čreva je patrné pozitívne farbenie na apikálnom povrchu epiteliálnych buniek (šípka). Elektrónová mikroskopia ukazuje, že imunoreakcia je lokalizovaná na povrchu mikroklkov v normálnych epiteliálnych bunkách hrubého čreva (C, šípka). Čiara v A predstavuje 30 um a je tiež platná pre B.
Obrázok 10. Analýza tvorby komplexu protilátkových SEA fúznych proteínov so zložkami plazmy od pacientov s karcinómom hrubého čreva a od zdravých jedincov. Je vykreslené percento eluované rádioaktivity vo vysoko-molekulovej oblasti. Všimnite si vysokej väzby C242FabSEA k plazme od pacientov s kolorektálnym karcinómom.
Obrázok podmienok
1). Hlavný analýzu aminokyselinovej neredukuj úcich kolóny (riadok
11. Analýza pomocou PAGE eluovanej frakcie elektroforézy za z K293 afinitnej pásik označený sekvencie.
ako
Sú
A bol vyrezaný na uvedené pozície použitých štandard molekulovej váhy.
Obrázok 12. N-terminálna sekvencia s SEQUENCE LISTINGS č.:
3-5 z troch tryptických peptidových fragmentov z 35-45 kDa proteínového pásika (označený ako A) izolovaný pomocou K293 afinitnej purifikácie (viď obrázok 1) .
Obrázok 14. Imunoterapeutičký efekt FabSEA fúznych proteínov na rast LS-174T nádorových buniek u myší SCID suplementovaných ľudskými mononukleárnymi bunkami periférnej krvi (PBMC). Všimnite si zníženia váhy nádoru (v mg) po liečbe pomocou K293FabSEA/Ell.
$3 cetĹVÉi/a/i <110> Active Biotech AB <120> Novel antibody
<130> 2000449
' <140> <141>
<160> 2
<170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 747 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220>
<221> CDS <222> (1)..(747) <223> K293 variable región (scFv); PRT (aa)-sequence VI (1-110), mod Hustou (111-129), Vh (130-249) <4Ó0> 1
cac gtt ata ttg act cag tcg ccc His Val íle Leu Thr Gin Ser Pro tct Ser gtg tct ggc tct cct gga cag
Val Ser 10 Gly Ser Pro Gly 15 Gin
1 5
tcg gtc acc ctc tcc tgc act gga acc age aat gac atc ggt ggc tat
Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp' íle Gly Gly Tyr
20 25 30
gat tat gtc tcg tgg tat cag cat cac cca ggc aaa gcc ccc aag ctc
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gin His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
atg att tac aat gtc aat aag cgg ccc tca ggg gtc tct gag ege ttc
Met íle Tyr Asn Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Glu Árg Phe
1. 50 55 60
tct ggc tcc aag tct gcc aac acg gcc tcc ctg acc atc tctjgga ctc
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr íle Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gat gac gat gag get gat tac tat tgc . agt tcc tat gca ege cgg
Gin Asp Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr ALa Arg Arg
85 90 4 95
gac act tac att ttc ggt ggt ggg acc cgg ctc acc gtc cta ggt caa
Asp Thr Tyr íle Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly Gin
100 105 110
gcc aac ggt gaa ggc ggc tct ggt ggc ggg gga tcc gga ggc ggc ggt
Ala Asn Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
144
192
240
288
336
384
tct gag gtg cag ctg Ser Glu Val Gin. Leu 130 cag gag tgg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg 432
Gin Glu Trp Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
135 140
gag acc ctg tcc ctc acc tgc get gtc tct ggt ttc tcc atč age agt - 480
Glu Thr •Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser íle Ser Ser
145 150 155 160 ' .
ggt tat ggc tgg age tgg atc cgt cag tcc cca ggg aag gga ctg gaa 528
Gly Tyr Gly Trp Ser Trp íle Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
tgg att gga gac atc tct tat agt ggg aac tcc agg tac aac ccg tcc 576
Trp íle Gly Asp íle Ser Tyr Ser Gly Asn Ser Arg Tyr Asn Pro Ser
180 185 190
ctc aag agt ega gtc acc att tca aga gac acg tcc aag aac cag ttc 624
Leu Lys Ser Arg Val Thr íle Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe
195 200 205
tcc ctg aag ctg acc tct gtg acc gcc gcg gac acg gcc gtg tat tac 672
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
tgt gcg aga cat gat aga ggc tgg cac gaa tac ttc gac ttc tgg ggc •720
Cys Ala Axg His Asp Arg Gly Trp His Glu Tyr Phe Asp Phe.Trp.Gly
225 230 235 240
cag gga gtc ctg gtc acc gtt tcc tca 747
Gin . Gly - Val Leu val Thr Val Ser Ser
245 <210> 2 <211> 249 .
<212> PRT <213> Macaca fascicularis
<400> 2 His Val 1 íle Leu Thr Gin Ser Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gin
5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp íle Gly Gly Tyr
20 25 30 ' .í-.JS
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gin. His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu ·· «'·« •
35 40 45
Met íle Tyr Asn Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Glu Arg Phe : s]
50 55 60 A-
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr íle Ser Gly Leu
65 70 75 80 ·
Gin Asp Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Arg Arg , -.v<. s
85. 90 95
Asp Thr Tyr íle Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly Gin .<
100 105 110 V
ΓΓ
Ala Asn Gly 115 Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
120 125
Ser Glu Val Gin Leu Gin Glu Trp Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
130 135 14 0
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser íle Ser Ser
145 150 155 160
Gly Tyr Gly Trp Ser Trp íle Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp íle Gly Asp íle Ser Tyr Ser Gly Asn Ser Arg Tyr Asn Pro Ser
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Val Thr íle Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe
195 200 205
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cýs Ala Arg Kls Asp Arg Gly Trp His Glu Tyr Phe Asp Phe Trp Gly
225 230 235 240
Gin Gly • Val Leu Val Thr Val Ser Ser
245
•A >
01-2113-02-Če
5G

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY bunečnému
    1. Väzobná štruktúra, ktorá sa viaže na, a/alebo k povrchu nádorových buniek, ktorá ako taká väzobná štruktúra je prevážne určená štruktúrami ťažkých reťazcov
    CDR definovanými v podstate počtom aminokyselín
    160-165 (CDR1) , 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ
    ID č. :
    2, zatial čo ďalšia väzobná špecificita je poskytnutá jednou alebo viacej štruktúrami
    CDR definovanými v podstate ľahkých počtom reťazcov aminokyselín
    23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID č.: 2.
    2. Väzobná štruktúra, ktorá sa viaže na, a/alebo k bunečnému povrchu nádorových buniek, ktorá ako taká väzobná štruktúra obsahuje jednu alebo viacej sekvencií oblastí určujúcich komplementaritu (CDR) protilátky v ľahkom reťazci obsahujúcej v podstate počet aminokyselín 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQUENCE LISTING ID č. : 2, a CDR sekvencie v ťažkom reťazci obsahujúcej v podstate počet aminokyselín 160-165 (CDR1), 180-185 (CDR2), 228-238 (CDR3) aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQUENCE LISTING ID č.: 2.
    3. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá obsahuje všetky spomínané CDR sekvencie.
    4. .Väzobná štruktúra podľa akéhokoľvek z patentových'nárokov 1 až 3, ktorá je protilátkou a/alebo jej fragmentmi.
    01-2113-02-Če
    5-7
    5. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá je protilátkou a/alebo jej fragmentmi, tiež obsahujúcu variabilnú oblasť ľahkého reťazca, obsahujúcu v podstate počet aminokyselín
    1-110 aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ variabilnej oblasti ťažkého reťazca obsahujúcej v podstate počet aminokyselín
    130-249 aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID č.: 2.
    6. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 5, v ktorej obsahuje spomínaná protilátka aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID č.: 2.
    7. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá sa viaže silno a/alebo homogénne v a/alebo k bunečnému povrchu epiteliálnych nádorových buniek vybraných zo skupiny obsahujúcej primárne a/alebo metastatické bunky karcinómu kolorektálneho, pankreatického, prsníka a pľúc.
    8. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá sa viaže slabo a/alebo heterogénne a/alebo sa neviaže k bunkám karcinómu prostaty a/alebo malígneho melanómu.
    9. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá sa viaže silno k apikálnym častiam epiteliálneho povrchu hrubého a tenkého čreva.
    10. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 9, ktorá sa viaže k apikálnej časti bunečného povrchu mikroklkov a/alebo kefového lemu superficiálnych epiteliálnych buniek hrubého čreva.
    11. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá sa viaže slabo až mierne ku glandulárnemu epitelu
    01-2113-02-Če mliečnej žlazy a/alebo jeho obklopujúcemu spojivovému tkanivu.
    12. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá sa viaže slabo a/alebo heterogénne a/alebo sa neviaže k normálnemu tkanivu zahrnujúcemu slezinu, obličky, pečeň, pľúca, kožu, pankreas, štítnu žľazu, srdcové tkanivo, a/alebo centrálny nervový systém.
    13. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá je poskytnutá selekciou fágu.
    14. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 13, kde spomínaná selekcia fágu zahrnuje kombináciu in vivo, imunologický vopred štruktúr vystavených selekcii častíc fágu zvoleného repertoáru väzobných na časticiach fágu a subtrakčnej za použitia párov tkanív o rôznom fenotype.
    15. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, kde spomínané sekvencie sú pôvodom z Macaca fascicularis.
    16. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, kde spomínané sekvencie môžu mať aminokyselinovú identitu aspoň 78% (VI) a 86% (Vh) s korešpondujúcimi sekvenciami . ľuds kého pôvodu.
    17. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá má u človeka nízku imunogenitu alebo nemá žiadnu imunoqenitu.
    18. Väzobná štruktúra podľa patentového nároku 1 alebo 2, ktorá bola derivatizovaná geneticky väzbou k polypeptidom a/alebo chemickou konjugáciou k organickým alebo
    01-2113-02-Če neorganickým chemickým molekulám, a/alebo pomocou di-, oligo- alebo multimerizácie.
    19. Väzobná štruktúra podlá patentového nároku 1 alebo 2, ktorá je geneticky spojená alebo chemicky konjugovaná >k cytotoxickým polypeptidom alebo cytotoxickým či neorganickým chemickým molekulám.
    20. Väzobná štruktúra podía patentového nároku 1 alebo 2, ktorá je geneticky spojená alebo chemicky konjugovaná k biologicky aktívnym molekulám.
    21. Väzobná štruktúra podía patentového nároku 1 alebo 2, ktorá je geneticky spojená alebo chemicky konjugovaná k molekulám aktivujúcim imunitný systém.
    22. Väzobná štruktúra podía patentového nároku 1 alebo 2, ktorá bola zmenená za účelom zvýšenia alebo zníženia jej avidity a/alebo afinity.
    23. Väzobná štruktúra podía patentového nároku 1 alebo 2, ktorá bola zmenená za účelom zvýšenia výťažku jej produkcie. 24. Väzobná štruktúra podía patentového nároku 1 alebo 2, ktorá bola zmenená za účelom ovplyvnenia ich
    farmakokineťických vlastností.
    25. Väzobná štruktúra podía patentového nároku 1 alebo 2, ktorá bola zmenená za účelom pridania nových farmakokinetických vlastností k tejto molekule.
    26. Väzobná štruktúra podía patentového nároku 1 alebo 2, ktorá je označená, a jej väzba je špecifická a
    01-2113-02-Če inhibovateľná neoznačenou formou spomínanej väzobnej štruktúry a nie ďalšími väzobnými štruktúrami a toto nevedie k inhibicii väzby ďalších väzobných štruktúr majúcich iné špecificity.
    27. DNA sekvencia kódujúca protilátku definovanú v patentovom nároku 6, ktorá ako táto DNA sekvencia obsahuje sekvencie uvedené v SEQ ID č.: 1.
    28. Farmaceutický preparát obsahujúci ako aktívnu zložku väzobnú štruktúru, ako je definované v akomkoľvek z patentových nárokov 1-26.
    29. Spôsob in vitro histopatologickej diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde vzorka je v kontakte s väzobnou štruktúrou, ako je definované v akomkoľvek z patentových nárokov 1-26, a s indikátorom.
    30. Spôsob podľa patentového nároku 29, kde spomínaná vzorka je vzorka tkaniva, ktorá bola zamrazená, a/alebo fixovaná vo formalíne a zaliata do parafínu pred vytvorením rezov.
    31. Spôsob podľa patentového nároku 29, ktorý ako taký spôsob zahrnuje typizáciu nádoru.
    32. Spôsob podľa patentového nároku 29, ktorý ako taký spôsob zahrnuje vyhľadávanie nádoru.
    33. Spôsob podľa patentového nároku 29, ktorý ako taký spôsob zahrnuje diagnózu nádoru a stanovenie prognózy.
    34. Spôsob podľa patentového nároku 29, ktorý ako taký spôsob zahrnuje monitoráciu premalígnych stavov.
    01-2113-02-Če
    0/
    35. Spôsobu in vitro diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde je stanovená koncentrácia väzobnej štruktúry v telových tekutinách, ako je definované v akomkoľvek z patentových nárokov 1-26.
    i
    36. Spôsob in vivo diagnózy a prognózy zhubných ochorení človeka, kde je určená lokalizácia väzobnej štruktúry, ako je definované v akomkoľvek z patentových nárokov 1-26, k nádorovým depozitom u človeka.
    37. Spôsob podľa patentového nároku 36, kde spomínaná väzobná štruktúra je podaná jedincovi pred určením.
    38. Spôsob podľa patentového nároku 37, kde spomínaná väzobná štruktúra je akumulovaná v nádorových depozitoch.
    39. Spôsob podľa akéhokoľvek z patentových nárokov 36-38, ktorý je kvantitatívny.
    40. Spôsob liečby zhubných ochorení človeka, kde väzobná štruktúra, ako je definované v akomkoľvek z patentových nárokov 1-26, je podaná človeku.
    41.
    Spôsob podľa patentového nároku 40, kde spomínaná väzobná štruktúra bola zmenená genetickým spojením s molekulami, čo viedlo ku vzniku kombinovanej farmakokinetickými vlastnosťami.
    Spôsob podľa patentového nároku 40, molekuly so zmenenými kde spomínaná väzobná štruktúra bola zmenená derivatizáciou.
    1/14
SK1198-2002A 2000-02-24 2001-02-23 Nová protilátka so špecificitou pre rakovinu hrubého čreva SK11982002A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0000597A SE0000597D0 (sv) 2000-02-24 2000-02-24 Novel antibody
PCT/SE2001/000395 WO2001062286A1 (en) 2000-02-24 2001-02-23 Novel antibody with specificity for colon cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK11982002A3 true SK11982002A3 (sk) 2003-03-04

Family

ID=20278567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1198-2002A SK11982002A3 (sk) 2000-02-24 2001-02-23 Nová protilátka so špecificitou pre rakovinu hrubého čreva

Country Status (22)

Country Link
US (1) US7425623B2 (sk)
EP (1) EP1257291A1 (sk)
JP (1) JP2003523213A (sk)
KR (1) KR20020079888A (sk)
CN (1) CN1406136A (sk)
AU (1) AU775876B2 (sk)
BR (1) BR0108609A (sk)
CA (1) CA2400661A1 (sk)
EE (1) EE200200473A (sk)
HK (1) HK1052648A1 (sk)
HU (1) HUP0300007A3 (sk)
IL (1) IL151325A0 (sk)
MX (1) MXPA02008315A (sk)
NO (1) NO20023670L (sk)
NZ (1) NZ520523A (sk)
PL (1) PL356386A1 (sk)
RU (1) RU2268068C2 (sk)
SE (1) SE0000597D0 (sk)
SK (1) SK11982002A3 (sk)
WO (1) WO2001062286A1 (sk)
YU (1) YU63702A (sk)
ZA (1) ZA200206039B (sk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1403283A4 (en) * 2001-06-12 2006-05-10 Greenpeptide Co Ltd TUMOR ANTIGENS
US20030206916A1 (en) 2002-05-03 2003-11-06 Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center Immunogenic peptides
CN1303105C (zh) * 2003-12-08 2007-03-07 陈志南 抗人大肠癌单克隆抗体CAb—2轻、重链可变区基因及其应用
CN103709252B (zh) * 2006-06-07 2016-12-07 生物联合公司 识别癌细胞上表达的cd-43和cea的含糖表位的抗体及其使用方法
EP2048241B1 (en) * 2007-10-08 2012-07-25 Sividon Diagnostics GmbH Method employing GAPDH as molecular markers for cancer prognosis
RU2528738C2 (ru) * 2007-12-18 2014-09-20 Биоэллаенс К.В. Антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения
WO2010023917A1 (ja) * 2008-09-01 2010-03-04 国立大学法人名古屋大学 抗がん剤の作用増強剤及びその利用、並びにがん患者の予後推定用バイオマーカー及びその利用
FR2945952B1 (fr) * 2009-05-27 2013-10-04 Univ Claude Bernard Lyon Anticorps anti-ck8 pour utilisation comme medicament.

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5798257A (en) * 1990-07-09 1998-08-25 Research Corporation Technologies, Inc. Nucleic acid encoding human MTS-1 protein
US5994088A (en) * 1991-03-08 1999-11-30 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and reagents for preparing and using immunological agents specific for P-glycoprotein
DE69334076D1 (de) * 1992-08-07 2006-11-30 Pharmexa Inc Hla bindepeptide und ihre verwendungen
US5972643A (en) * 1994-06-17 1999-10-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Isolated polynucleotide molecules encoding CTCF, a CCCTC-binding factor
US6140470A (en) * 1995-06-30 2000-10-31 Yale University Human monoclonal anti-tumor antibodies
ATE449849T1 (de) * 1996-01-08 2009-12-15 Genentech Inc Ob rezeptor-variante und liganden
WO1998003411A1 (fr) 1996-07-18 1998-01-29 Montania Bouchon avec recipient auxiliaire et procede de realisation
AU4474497A (en) * 1996-10-08 1998-05-05 U-Bisys B.V. Methods and means for selecting peptides and proteins having specific affinity for a target
SE9700291D0 (sv) * 1997-01-31 1997-01-31 Pharmacia & Upjohn Ab Selection method and prodcts resulting therefrom
DE69830901T2 (de) * 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
WO1999010485A1 (en) * 1997-08-29 1999-03-04 Selective Genetics, Inc. Methods using phage display for selecting internalizing ligands for gene delivery
DE19739525A1 (de) * 1997-09-09 1999-09-30 Heinrich Abbrederis Die Vorrichtung T.C.Reinigungskopf ermöglicht die Reinigung, Schmierung und Konservierung von Ketten im eingebauten und ausgebauten Zustand unter minimalen Platzverhältnissen
CA2253633A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-03 Boehringer Mannheim Corporation Complex specific antibodies, method of preparation and uses thereof
IL144559A0 (en) * 1999-03-01 2002-05-23 Genentech Inc Antibodies for cancer therapy and diagnosis

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200206039B (en) 2003-07-29
CA2400661A1 (en) 2001-08-30
US20030176661A1 (en) 2003-09-18
RU2002125386A (ru) 2004-03-20
WO2001062286A1 (en) 2001-08-30
NZ520523A (en) 2004-08-27
CN1406136A (zh) 2003-03-26
EP1257291A1 (en) 2002-11-20
MXPA02008315A (es) 2002-12-09
HUP0300007A2 (en) 2003-05-28
YU63702A (sh) 2006-01-16
BR0108609A (pt) 2002-11-19
SE0000597D0 (sv) 2000-02-24
IL151325A0 (en) 2003-04-10
EE200200473A (et) 2004-02-16
JP2003523213A (ja) 2003-08-05
PL356386A1 (en) 2004-06-28
AU3629401A (en) 2001-09-03
RU2268068C2 (ru) 2006-01-20
NO20023670L (no) 2002-08-23
HUP0300007A3 (en) 2005-11-28
HK1052648A1 (zh) 2003-09-26
KR20020079888A (ko) 2002-10-19
AU775876B2 (en) 2004-08-19
NO20023670D0 (no) 2002-08-02
US7425623B2 (en) 2008-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7189816B1 (en) Compounds
EP2215121B1 (en) Anti-mesothelin antibodies and uses therefor
JP5904478B2 (ja) 腫瘍において示差的に発現する遺伝子産物およびその利用
KR101683884B1 (ko) 항-ＥｐＣＡＭ 항체 및 이의 용도
JP2008505645A (ja) ガン細胞に特異的な抗体を見出すための方法およびそれによって見出される抗体
CZ294425B6 (cs) Způsob výroby anti-humánního antigenového receptoru, anti-humánní antigenový receptor, řetězec VH a VL, souprava pro selekci anti-humánních antigenových receptorů a farmaceutická kompozice, obsahující uvedený receptor
US6346249B1 (en) Methods for reducing the effects of cancers that express A33 antigen using A33 antigen specific immunoglobulin products
CN106916227B (zh) 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
KR20050037478A (ko) Ｍｎ 결합 및 세포 부착-중화 활성을 갖는 인간 항체
SK11982002A3 (sk) Nová protilátka so špecificitou pre rakovinu hrubého čreva
KR101098186B1 (ko) 피에이유에프(ｐａｕｆ) 특이적인 인간 단일클론항체, 이를 포함하는 암 치료용 조성물, 이를 이용하는 암의 진단방법
JP2003527334A (ja) Ａ３３抗原特異的免疫グロブリン産物を用いるａ３３抗原を発現する癌の影響を低減する方法
EP4174086A1 (en) Antibody specifically binding to lgals3bp, and use thereof
AU762240B2 (en) Melanoma associated antigen (HMW-MAA) defined by a monoclonal antibody
US20150203582A1 (en) Method of generating antibodies
KR20220002098A (ko) Lgals3bp에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
KR101551696B1 (ko) Ｔｍ４ｓｆ５에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
Casey et al. Cambridge Healthtech Institute’s 4th Annual Recombinant Antibodies Conference

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application