JP2003523213A - 結腸癌に対して特異性を有する新規抗体 - Google Patents

結腸癌に対して特異性を有する新規抗体

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Abstract

(57)【要約】 腫瘍細胞の中および／または表面に結合する結合構造；腫瘍細胞の中、もしくは表面に提示および／または発現される標的構造； 前記標的構造を認識およびブロックする結合構造； 前記標的構造に結合する、もしくは前記標的構造の発現をブロックする物質； 活性成分として前記結合構造、標的構造もしくは物質を含む薬学的組成物； 活性成分として前記標的構造を含むワクチン組成物； ファージ選択のための方法； 並びに、インビトロおよびインビボの診断および予後予測の方法、および上記の発明の使用を含むヒト悪性疾患を治療する方法、が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍細胞の中および／または表面に結合する結合構造； 腫瘍細胞
の中、もしくは表面に提示および／または発現される標的構造； 前記標的構造
を認識およびブロックする結合構造； 前記標的構造に結合する、もしくは前記
標的構造の発現をブロックする物質； 活性成分として前記結合構造、標的構造
もしくは物質を含む薬学的組成物； 活性成分として前記標的構造を含むワクチ
ン組成物； ファージ選択のための方法； 並びに、インビトロおよびインビボの
診断および予後予測の方法、および上記主題の使用を含むヒト悪性疾患を治療す
る方法、に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
正常細胞の癌細胞への形質転換は、形質転換細胞および成長する腫瘍の微小環
境の双方の遺伝子型および／または表現型の変化と関連する（Kerbel RS、1995
）。第一に、これらの変化のいくつかは腫瘍特異的な抗原（ＴＳＡｓ）として免
疫系によって認識され得る、従って腫瘍特異的免疫療法のための基礎を形作る。
腫瘍プライミングおよび腫瘍発生の基礎をなす突然変異イベント自体がＴＳＡｓ
の発現を導く可能性があるが、正常抗原の非制御発現および翻訳後修飾のような
二次的変化が免疫療法の標的として有効な多数の腫瘍関連抗原を含む可能性があ
る。
【０００３】 腫瘍表現型と関連する分子は、分子修飾および発現レベル変化の同定のために
標的自身に直接的に関与する、現代のゲノミックスおよびプロテオミックス技術
を使用して同定できる(Williams KL, 1999)。より間接的には、腫瘍表現型の特
性を表わす腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）は、ハイブリドーマ由来の単クローン抗体
の使用によっても同定されている(Kohler G, Milstein C, 1976)。
【０００４】 ファージ・ディスプレイ技術は、ハイブリドーマ技術に対する確立された代替
技術となっており、またある種の適用においては、純粋なスクリーニングによら
ずに、抗原駆動の選択原理による単クローン抗体生成のための選択方法となって
いる(Hoogenboom HR et al, 1998)。この技術は、ファージ表面にそのゲノムに
コードされた特定の抗体断片を提示するバクテリオファージ粒子に基づくもので
あり、ファージおよびそのコード化ＤＮＡを遺伝子パッケージとして選択するこ
とを可能にする。抗体可変部の重鎖および軽鎖の遺伝子に対して相補的なプライ
マーが利用できると仮定するならば、ファージベクターに挿入すべき抗体遺伝子
は、任意種の免疫もしくは非免疫動物からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
り増幅でき、大きなファージ抗体ライブラリーが構築される。
【０００５】 細胞、組織切片、および他の生体物質上でのファージ・ライブラリーの選択に
よって、使用された複合抗原物質内の構成要素に結合する単クローン抗体または
ペプチドが生成されている(Hoogenboom HR et al 1998, Tordsson J et al 1997
)。複合抗原を使用した直接のポジティブ選択は、全組織反応性レパートリー（r
epertoire）から、高発現抗原および免疫優性抗原、並びに高親和性相互作用に
偏った特異性の一群を選択する結果となる。異なった様式で発現する抗原（特定
の表現型を表す）を同定するためには、むしろサブトラクティブなアプローチが
使用されなければならない。
【０００６】
【発明の概要】
本発明によれば、腫瘍細胞、特に上皮腫瘍細胞、例えば結腸直腸（colorectal
）、膵臓、乳房（胸部；breast）および肺のカルシノーマ細胞に結合する結合構
造（例えば、抗体）が提供される。また、かかる腫瘍細胞の中および／または表
面上に提示および／または発現する標的構造が提供される。
【０００７】 また、ファージ選択の材料（materials）として組織切片、或いは組織切片お
よび細胞の組み合わせを使用した、新規のサブトラクション選択方法が提供され
る。
【０００８】 従って、一つの側面において、本発明は腫瘍細胞の中および／または細胞表面
に結合する結合構造に関するものであり、その結合構造は配列番号２に示したア
ミノ酸配列のアミノ酸番号160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3)に
より本質的に定義される重鎖ＣＤＲ構造により主に決定され、一方、付加的な結
合特異性は、配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号23-36 (CDR1), 52
-58 (CDR2), 91-100 (CDR3)により本質的に定義される１以上の軽鎖ＣＤＲ構造
により提供される。
【０００９】 更なる側面において、本発明は腫瘍細胞の中および／または細胞表面に結合す
る結合構造に関するものであり、前記結合構造は、配列番号２に示したアミノ酸
配列のアミノ酸番号23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3)を本質的に含
む軽鎖において、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上を含み、および配列
番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2),
228-238 (CDR3)を本質的に含む重鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００１０】 一態様において、前記結合構造は前記ＣＤＲ配列の全てを含む。
【００１１】 更なる態様において、前記結合構造は抗体および／またはその断片であり、そ
れは更なる態様において、配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号1-11
0を本質的に含む軽鎖の可変領域、および配列番号２に示したアミノ酸配列のア
ミノ酸番号130-249を本質的に含む重鎖の可変領域を含む。なおまた別の態様に
おいて、前記抗体は配列番号２に示される全アミノ酸配列を含む。
【００１２】 一態様において、前記結合構造は、原発性および／または転移性の結腸直腸、
膵臓、乳房（胸部）および肺のカルシノーマ細胞を含むグループから選択された
上皮腫瘍細胞の中および／または細胞表面に、強程度および／または均質に結合
する。更なる態様において、前記結合構造は腎臓および／または前立腺のカルシ
ノーマおよび／または悪性メラノーマ細胞に、低程度および／または不均質に結
合する、および／または結合しない。別の態様において、前記結合構造は結腸表
面上皮および小腸(small bowel)上皮の先端部位に強く結合する。更なる態様に
おいて、前記結合構造は、結腸表層上皮細胞（the colonic superficial epithe
lial cells）の微小絨毛および／または刷子縁の細胞表面の先端側に結合する。
なお更なる態様において、前記結合構造は、乳房の腺上皮および／またはその周
囲の結合組織に低から中程度（weakly to moderately）に結合する。
【００１３】 更なる態様において、前記結合構造は、脾臓、腎臓、肝臓、肺、皮膚、膵臓、
甲状腺、心筋、および／またはＣＮＳを含む正常組織に低程度および／または不
均質に結合する、および／または結合しない。
【００１４】 一態様において、前記結合構造はファージ選択によって提供される。更なる態
様において、該ファージ選択は、ファージ粒子上に提示された、インビボで免疫
学的に予め選択されたレパートリーの結合構造と、異なる表現型の組織ペアを用
いたファージ粒子のサブトラクション選択との組み合わせを含む。更なる態様に
おいて、前記配列はオナガザル（Macaca fascicularis）起源であり、その配列
はヒト起源の対応する配列に対して、少なくとも７８％ (Ｖｌ) および ８６％
(Ｖｈ) のアミノ酸同一性を有してもよい。
【００１５】 なお更なる態様において、前記結合構造は、ヒトにおいて低免疫原性もしくは
非免疫原性を有する。
【００１６】 一態様において、前記結合構造は、ポリペプチドへの遺伝子的連結（genetica
lly linking）により、および／または有機もしくは非有機化学分子への化学的
な結合により、および／またはダイメリゼーション、オリゴメリゼーション、マ
ルチメリゼーションにより誘導体化される。
【００１７】 更なる態様において、前記結合構造は、細胞障害性ポリペプチドに対して、ま
たは細胞障害性の有機もしくは非有機化学分子に対して；または生物学的活性分
子に対して；または免疫活性分子に対して、遺伝子的に連結されるか、または化
学的に結合される。
【００１８】 更なる態様において、前記結合構造は、そのアビディティーおよび／またはア
フィニティーを増加もしくは減少するため；またはその生産高を増加するため；
またはその薬物動態学的な特性に影響するため；またはそれに新規の薬物動態的
な特性を付与するために変更される。
【００１９】 なお更なる態様において、前記結合構造は標識されており、その結合は特異的
であると共に、非ラベル型の該結合構造により阻止可能で且つ他の結合構造によ
り阻止不可能であり、また別の特異性を有する他の結合構造の結合を阻害するこ
とがない。
【００２０】 別の側面において、本発明は上記で定義したような抗体をコードするＤＮＡ配
列に関する、前記抗体は配列番号２に示したアミノ酸配列を含む、そのＤＮＡ配
列は配列番号１に示した配列を含む。
【００２１】 別の側面において、本発明は腫瘍細胞の中、もしくは表面上に提示および／ま
たは発現される標的構造に関するものであり、該標的構造は上記で定義したよう
な結合構造により特異的に結合される能力、および該結合構造に対して特異的に
結合する能力、および類似する結合特性を有する他の結合構造に特異的に結合す
る能力を有する。
【００２２】 一態様において、前記標的構造は前記結合構造により特異的にブロックされる
能力、および前記結合構造を特異的にブロックする能力を有する。
【００２３】 更なる態様において、前記標的構造は原発性および／または転移性の結腸直腸
、膵臓、乳房（胸部）および肺のカルシノーマ細胞を含むグループから選択され
た上皮腫瘍細胞の中および／または細胞表面上に強程度および／または均質に提
示および／または発現される。
【００２４】 なお更なる態様において、前記標的構造は腎臓および／または前立腺のカルシ
ノーマおよび／または悪性メラノーマにおいて、低程度および／または不均質に
提示および／または発現され、および／または提示および／または発現されない
。
【００２５】 更なる態様において、前記標的構造は、結腸表面上皮および小腸(small bowel
)上皮の先端部位に強く提示および／または発現される。
【００２６】 なお更なる態様において、前記標的構造は結腸表層上皮細胞の微小絨毛および
／または刷子縁の細胞表面の先端側に関連して提示および／または発現される。
【００２７】 更なる態様において、前記標的構造は、乳房の腺上皮および／またはその周囲
の結合組織に低から中程度に提示および／または発現される。
【００２８】 なお更なる態様において、前記標的構造は脾臓、腎臓、肝臓、肺、皮膚、膵臓
、甲状腺、心筋、および／またはＣＮＳを含む正常組織に、低程度および／また
は不均質に提示および／または発現され、および／または提示および／または発
現されない。
【００２９】 別の態様において、前記標的構造の前記提示および／または発現は、上皮組織
に関連するものである。
【００３０】 更なる態様において、前記標的構造は、その非還元型において９０および／ま
たは２２０キロダルトンの見掛けの分子量を有する。
【００３１】 更なる側面において、本発明は上記で定義したような標的構造の抗イデオタイ
プに関連し、その抗イデオタイプは、前記標的構造に対して類似する結合特異性
を有する結合構造によって特異的に結合され、および該結合構造に対して特異的
に結合する。
【００３２】 一態様において、前記抗イデオタイプは前記結合構造により特異的にブロック
され、および前記結合構造を特異的にブロックする。
【００３３】 なお更なる側面において、本発明は上記で定義したような標的構造を認識する
結合構造に関するものであり、それは有機化学的な性質のものである。一態様に
おいて、この結合構造は上記で定義したような結合構造の前記結合をブロックす
る。
【００３４】 なおまた別の側面において、本発明は上記で定義したような標的構造の発現を
ブロックする物質に関する。
【００３５】 一態様において、前記物質はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または
リボザイム分子である。
【００３６】 更なる側面において、本発明は上記で定義したような標的構造の機能をブロッ
クする物質に関する。
【００３７】 なお更なる側面において、本発明は、上記で定義したような少なくとも１つの
結合構造を活性成分として含む薬学的組成物に関する。
【００３８】 更なる側面において、本発明は、上記で定義したような標的構造、もしくは上
記の前記標的構造の抗イデオタイプを活性成分として含む薬学的組成物に関する
。
【００３９】 なお更なる側面において、本発明は、上記で定義したような物質を活性成分と
して含む薬学的組成物に関する。
【００４０】 更なる側面において、本発明は、上記で定義したような標的構造、もしくは上
記で定義したような前記標的構造の抗イデオタイプを活性成分として含むワクチ
ン組成物に関する。
【００４１】 なお更なる側面において、本発明は、ファージ粒子上に提示される、インビボ
で免疫学的に予め選択された結合構造のレパートリーと、異なる表現型の組織ペ
アを用いたファージ粒子のサブトラクション選択との組み合わせを含んだ、ファ
ージ選択の方法に関する。
【００４２】 前記方法の一態様において、前記「予め選択されたレパートリーの結合構造」
は、霊長類に由来する抗体である。
【００４３】 前記方法の更なる態様において、前記組織ペアはマッチする。好ましくは、前
記「マッチした組織ペア」は同一の個体に由来するものである。
【００４４】 更なる態様において、前記組織は、凍結および／またはホルマリン固定／パラ
フィン包埋された組織切片および／または断片および／または細胞懸濁液の形態
で使用される。
【００４５】 更なる側面において、本発明は、上記で定義されたような少なくとも１つの結
合構造および指示薬とサンプルが接触される、ヒト悪性疾患のインビトロの組織
病理学的診断および予後予測の方法に関する。好ましくは、前記サンプルは、切
片作成前に凍結および／またはホルマリン固定およびパラフィン包埋された組織
サンプルである。
【００４６】 いくつかの態様において、前記方法は、腫瘍タイピング、腫瘍スクリーニング
、腫瘍診断および予後予測、前悪性状態のモニタリングを含む。
【００４７】 なお更なる側面において、本発明は、上記で定義したような少なくとも１つの
結合構造の体液濃度がアッセイされる、ヒト悪性疾患のインビトロ診断および予
後予測の方法に関する。
【００４８】 なおまた別の側面において、本発明は、上記で定義したような標的構造、もし
くは上記で定義したような前記標的構造の抗イデオタイプを含む抗原の体液濃度
がアッセイされる、ヒト悪性疾患のインビトロ診断および予後予測の方法に関す
る。
【００４９】 なお更なる側面において、本発明は、ヒト悪性疾患のインビトロ診断および予
後予測の方法に関するものであり、該方法においてａ）上記で定義されたような
標的構造を含む抗原、もしくは上記で定義されたような前記標的構造の抗イデオ
タイプ、およびｂ）上記で定義されたような少なくとも１つの結合構造、の複合
体の体液濃度がアッセイされる。
【００５０】 なおまた別の側面において、本発明は、ヒト悪性疾患のインビトロ診断および
予後予測の方法に関するものであり、該方法においてヒト被験者の腫瘍沈着（tu
mour deposits）に対する上記で定義したような少なくとも１つの結合構造の局
在が決定される。一態様において、前記結合構造は前記決定前に前記被験者に投
与される。更なる態様において、前記結合構造は腫瘍沈着に蓄積する。なお更な
る態様において、前記方法は定量的である。
【００５１】 更なる側面において、本発明は、上記で定義されたような少なくとも１つの結
合構造がヒト被験者に投与される、ヒト悪性疾患の治療の方法に関する。
【００５２】 前記方法の更なる態様において、前記結合構造は、分子に遺伝子的に連結して
変更された薬物動態的特性を有する複合分子（combined molecule）を与えるこ
とにより、または誘導体化されることにより変更される。
【００５３】 なおまた別の側面において、本発明はヒト悪性疾患の治療の方法に関し、該方
法において上記で定義したような標的構造はヒト被験者に投与される。前記方法
の一態様において、前記標的構造に対する免疫応答が誘導される。
【００５４】 更なる態様において、前記標的構造は、分子に遺伝子的および／または化学的
に連結して変更された薬物動態的特性を有する複合分子を提供することにより、
或いは分子に遺伝子的および／または化学的に連結して変更された免疫原性およ
び／または抗原性の特性を有する複合分子を提供することにより、或いは誘導体
化されることにより、或いは遺伝子的に修飾されることにより、変更される。前
記方法の更なる態様において、前記標的構造は、変更された免疫原性特性を有す
る混合物を提供するために他の分子と混合され、またはアジュバンドと混合され
る。
【００５５】 更なる側面において、本発明は、ヒト悪性疾患の治療の方法に関し、該方法に
おいて上記で定義されたような物質がヒト被験者に投与される。前記方法の更な
る態様において、前記物質は、分子に遺伝子的および／または化学的に連結して
変更された薬物動態的特性を有する複合分子を提供することにより、或いは誘導
体化されることにより変更される。一態様において、前記物質に対する免疫応答
が誘導される。前記方法の更なる態様において、前記物質は、分子に遺伝子的お
よび／または化学的に連結して変更された免疫原性および／または抗原性の特性
を有する複合分子を提供することにより；或いは遺伝子的に修飾されることによ
り変更される。なお更なる態様において、前記物質は、変更された免疫原性の特
性を有する混合物を提供するために他の分子と混合される、またはアジュバンド
と混合される。
【００５６】
【発明の詳細な記述】
本発明による選択方法において、組織切片或いは組織切片および細胞の組み合
わせが、ファージ選択の材料として使用される。穏やかに固定された組織切片は
、高度に保存されたオリジナルの構造および表現型を有する生体物質であるはず
である。
【００５７】 前記方法は、６個体の異なる患者から摘出した結腸および結腸癌のマッチする
自己組織ペアにおけるサブトラクション選択のために、免疫結腸癌ファージライ
ブラリーを使用して開発および適用される。ここでＫ２９３と命名される選択さ
れた特異性の１つは、選択に使用された全ての腫瘍と均質に反応するが、正常結
腸とは非常に限定的に反応するものである。Ｋ２９３特異性パターンを有するク
ローンは、最終の選択ラウンド（selection rounds）において頻繁に見出された
。このことは組織に基づくサブトラクション的なアプローチの機能性を示唆して
いる。
【００５８】 インビトロで培養された腫瘍細胞株よりもむしろ患者において発生した腫瘍表
現型において、Ｋ２９３で定義される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が優先的に発現さ
れるという事実は、新規且つ治療上適切な腫瘍関連抗原に対する試薬の同定を目
指す際の選択材料として、組織切片を使用することの有効性および妥当性を強調
するものである。
【００５９】 さらに、Ｋ２９３抗体は、結腸直腸、膵臓、肺、乳房（胸部）のカルシノーマ
への強い反応性を示し、また正常組織の多数例において試験した際に高度に限定
された反応性を示した。細胞表面の反応性が調査され、循環系中に調査し得るレ
ベルが認められないことも調べられ、この抗原の腫瘍ターゲティングに対する適
切性が示唆された。このことはＫ２９３ Ｆａｂスーパー抗原 ＳＥＡ (Ｄ２２
７Ａ)によっても支持され、異種間移植されたヒト腫瘍細胞を使用したヒト化Ｓ
ＣＩＤモデルにおいて標的化治療活性（targeted therapeutic activity）の予
備的な証拠を示している。
【００６０】 最終的に、固定化Ｋ２９３抗体断片を使用したアフィニティークロマトグラフ
ィーにより蛋白質画分の精製が達成できた。前記画分は非還元ＳＤＳゲルクロマ
トグラフィーによりＭＷ ３５−４５ ｋＤａの１バンドとして示され、ペプチ
ド消化およびシーケンスが３つのペプチド断片配列を明らかにし、それはグリセ
ロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate de
hydrogenase）との相同性を支持している。
【００６１】 本発明は正常組織および疾患組織間の表現型の差異を同定し、また間接的には
異なった様式で発現する分子をコードする遺伝子の差異を同定するための戦略を
提案するものである。この戦略は結腸癌関連抗原、およびこれらの抗原と反応す
る抗体の同定に適用するものである。より広範な展望として、この開発された方
法は、炎症性疾患または発生段階マーカーおよび標的の同定のために、例えば正
常組織と炎症組織、もしくは成熟組織と未成熟組織などの組織ペアを使用した他
の研究分野に同様に適用し得る。
【００６２】 ファージライブラリーのサブトラクションのための抗原ソースとしての組織切
片の使用効率をモデル系において評価した。１つの結合ファージ抗体を他から明
確にサブトラクションすることが、広域反応性（Ｃ２１５）及び腫瘍特異的（１
Ｆ）の特異性を有するｓｃＦｖ抗体をコードするファージを使用して達成できた
。後者は若干単純である。何故なら、１Ｆ抗原は小腸(small bowel)において若
干発現しており、完全に欠如しているわけではないからである (Tordsson 等、
投稿中）。結果的に、１Ｆファージのマイナーなサブトラクションもまた、二つ
の特異的なファージの分離を困難にし得る。
【００６３】 さらに、ＳＣＩＤマウスにおいて成長させたＣｏｌｏ ２０５腫瘍のアセトン
固定組織切片を、培養したインタクトなＣｏｌｏ ２０５細胞の代わりにポジテ
ィブ選択工程（及び、子宮組織切片をネガティブ選択工程）に使用した場合、１
Ｆファージの収量（yield）は１２から１６倍減少し、それはＣ２１５ファージ
収量の減少よりも顕著であった（図２、および記載しないデータ）。１Ｆ抗原は
固定に敏感であるか、または１Ｆ ｓｃＦｖファージの結合は組織に基づく選択
方法において使用される粗雑な洗浄操作に敏感であるとの解釈が可能であろう。
【００６４】 子宮切片を使用したネガティブ選択工程の付加は、ポジティブ選択のみ（Tord
sson 等、投稿中）と比較して、細胞からのＣ２１５及び１Ｆ ファージの相対
的収量を変化させなかった。このことは、系の特異性、またこれらの特異性を使
用した免疫組織化学により以前見つけられた子宮とのネガティブな反応性を確証
するものである。
【００６５】 結論として、前記モデルにおいて最適な腫瘍特異的ファージが欠如しているに
もかかわらず、組織に基づくファージ吸着において効率性および特異性が示され
、従ってサブトラクション発見プロトコールの基礎が提供される。また、各選択
ラウンド（ファージ収量の最少の損失で）中、または選択ラウンド間の吸着工程
の反復は、吸着の効率を増大する。
【００６６】 以前からライブラリー選択は実施されていたので、各サブトラクション選択ラ
ウンドにおけるネガティブ吸着工程の反復はより効率的であることが示され、従
って１回の吸着が７つの選択ラウンドの全てにおいて使用された。これは障害と
はならなかったであろう。各選択ラウンドにおいて様々な回数の吸着を実施する
ことにより達成される異なる強度のネガティブ選択が、チューナーのように作用
するだろうことが期待できた。これにより、高度に（広範に）発現する抗原に対
する抗体（ネガティブ吸着なし）から、厳密に異なって発現する抗原に対する抗
体（反復ネガティブ選択）へと選択結果を徐々に片寄らせることができた。
【００６７】 しかしながら、モデル実験による今回のデータは、ポジティブ選択の力はネガ
ティブ選択の力を大きく上回るものであることを示している。また、特異性のい
くつかは、１から２回の限られた範囲（narrow window）の選択ラウンドにおい
て低い頻度で見つけられた、その後に継続した選択ラウンドは選択フィルターを
飽和したようであり、特異性の構成はより広域反応性の抗体へと変化した。
【００６８】 結合ファージの高い割合を得るためには多くの選択ラウンドが必要であること
が、サブトラクションライブラリー選択の期間の観察において見出された。これ
は、細胞もしくは組織切片上でポジティブな選択をする際には通常十分である、
２〜３ラウンドと比較するべきである。このことは、前記選択がライブラリー中
の特異性の多くに対して効率的なフィルターとして作用し、そして最適な選択戦
略デザインの基礎を提供するだろうことを示している。例えば、より小さな濃縮
因子は、最適な選択ラウンドに到達する前に多数の腫瘍が使用されることを許容
する。このことは共通に発現する腫瘍限定抗原の同定に選択を片寄らせるだろう
。
【００６９】 腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体の多くは、ハイブリドーマ技術によ
り作成されたマウス抗体である。一方、例えばアロ抗原のように正常ヒト抗原の
マイナーな変異を識別する抗体反応が、ヒト及びヒト近縁種において度々首尾よ
く誘導された。
【００７０】 頻出するＴＡＡｓのみが、巨大な患者集団の免疫療法における実際上有効な標
的である。この標的設定により本当に腫瘍特異的な抗原を代表するのであっても
ユニークな個々の腫瘍特異的変異を排除される。
【００７１】 多くのケースにおいて頻繁に発現する腫瘍関連抗原は、正常もしくは最小限の
変化をうけた（例えば、翻訳後修飾された）抗原なので、ヒト腫瘍で免疫された
霊長類はかかる腫瘍関連抗原のすぐれた供給源となりえる。
【００７２】 そのようなレパートリーとサブトラクションファージ選択の組み合わせにより
、更なるレパートリーの分析が可能であろう、そして特異性の選択の結果はより
制御され得る。直接のポジティブ選択（Tordsson等、投稿中）と比較して、本発
明の組織に基づくサブトラクション選択を使用した際に免疫結腸癌ライブラリー
から完全に異なるセットの抗腫瘍抗体が同定されたことは、この仮説を支持する
ものである。
【００７３】 Ｋ２９３特異性により代表される選択クローンは、選択プロトコールに含まれ
る全ての結腸直腸カルシノーマ組織において高度に均質な染色性を示し、そして
正常結腸上皮とは非常に限定された反応性を示した。サブトラクション選択フィ
ルターは、継代を許容する狭い表現型特異性を規定するものであり、これは６個
体（すなわち、各々のかかるマッチした組織ペアが由来する患者）において共通
する正常および悪性結腸上皮の間では小さな差異で存在する。前記フィルターに
設定される基準がＫ２９３タイプの特異性によってほとんど完全に成就したこと
は特異性分析から明白であった。
【００７４】 真核細胞は、細胞表面抗原を同定するためにサブトラクション選択に以前から
使用されてきた。しかしながら、ファージ選択に細胞を使用する場合と比較して
、組織切片は組織環境因子、またはインビトロにおいて再現が不可能もしくは困
難な構造により制御される抗原を含む、インビボにおいて発現する全ての組織成
分に対する試薬の同定を可能とするであろう。
【００７５】 ４つの試験した結腸直腸癌細胞株中の２つは、インビトロで培養した細胞にお
いて、またはＳＣＩＤマウスにおいてインビボで成長させた際にも検出可能なＫ
２９３抗原を発現していなかった。加えて、インビトロで培養した別の５系統の
細胞株は、抗原発現陰性だった（示さず）。
【００７６】 患者由来の腫瘍におけるＫ２９３抗原の頻繁且つ均質な発現は、結腸癌細胞が
インビトロで培養される際には大幅に失われるようである。加えて、異種ホスト
においてインビボで前記細胞を成長させても前記発現を誘導することができなか
った。
【００７７】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１融合蛋白質は、増大した感受性および減弱した
バックグランドを可能とする、Ｋ２９３特異性分析を拡大するための一形式であ
った。この構築物が多数の結腸、乳房（胸部）および肺のカルシノーマと反応す
ることが示された。これらの腫瘍の多くで、Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ/Ｅ１１は９
０％以上の悪性細胞において陽性である。前記反応は原発性の腫瘍に限定されな
い、なぜなら結腸癌の転移の多くも強い反応性を示すからである。一方、前立腺
または腎細胞癌においては如何なる反応も得られず、そして悪性メラノーマにお
いては限定的な反応のみが認められた。
【００７８】 正常組織反応性は、結腸および小腸（small intestinal）上皮の先端部、並び
に正常乳房（胸部）の腺上皮およびその周囲のストローマ部位にのみ認められた
。
【００７９】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１が、正常および悪性細胞双方の細胞表面上に発
現する抗原に結合することを電子顕微鏡検査は明瞭に示した。正常結腸粘膜にお
いて、前記反応は表在性の上皮細胞の微小絨毛の輪郭を形作る頂端細胞表面（ap
ical cell surface）に局在する。また、先端部染色は高度に分化した腫瘍にお
いて優勢であり、一方、低―中程度の腫瘍は細胞表面の全ての側面上で均質に陽
性である傾向にある。
【００８０】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１が新生物性（neoplastic）の腺形成においてム
チン様物質と反応するにもかかわらず、前記抗原は結腸癌患者のプラズマプール
中で検出されなかった。このプールはＣＡ２４２ 結腸癌抗原の高レベルを示し
、患者の高い腫瘍荷重（tumour burden）を示している。Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ
／Ｅ１１は１２例の原発性腫瘍中の１２例、また転移性結腸癌の３／４において
強く陽性なので、これは循環性の抗原上にエピトープが高度に提示されていない
ことを示している。
【００８１】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１は、腫瘍ターゲティング（tumour targeting）
の候補として興味深いいくつかの特性を呈する、すなわち、１）陽性の原発性腫
瘍および転移を高率に認識する、２）限定された正常組織反応性を示す、３）腫
瘍細胞表面に発現する抗原に結合する、および４）癌患者の末梢血液中で検出さ
れない抗原に結合する。
【００８２】 腫瘍ターゲティングに対するＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１の使用の可能性は
、ヒト化腫瘍を保持するＳＣＩＤマウスを使用した治療実験により更に支持され
た。ターゲティングされないコントロールＦａｂＳＥＡ融合蛋白質と比較して、
Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１は腹腔内で成長するＬＳ１７４Ｔ腫瘍の８０％を
越える減少を示した。ＳＣＩＤマウス中で成長した未治療のＬＳ１７４Ｔ腫瘍の
免疫組織化学検査は、悪性細胞の５０％のみがＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１陽
性であることを示した（データ示さず）。この結果は、Ｋ２９３Ｆａｂ陰性の腫
瘍細胞のいくつかは、潜在的にＴリンパ球からのサイトカイン放出によるような
傍観者効果（bystander effect）により殺傷され得ることを示している。従って
、陽性細胞の割合が高い結腸直腸癌患者から摘出した腫瘍においては、治療効率
は潜在的に増大すべきである。
【００８３】 Ｋ２９３抗原は、常に正常組織に存在するが、通常の状況においては免疫系に
暴露されない「隔離された」抗原のグループにマッチするだろう。結腸および小
腸(small intestine)において、前記抗原は、それが循環抗体および免疫応答性
細胞（immunocompetent cells）に暴露されるだろう細胞の基底面（basal surfa
ce）上に存在しない。しかしながら、多くの腫瘍サンプルにおいて、Ｋ２９３抗
原は細胞膜全体に分布することが見出されており、従って循環系に暴露されるだ
ろう。
【００８４】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１は、現存し頻繁に使用される結腸癌結合抗体の
特異性プロファイルとは区別されるようである。従って、それがこういった既知
の標的分子に結合することはありそうもない。Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１に
よる正常結腸の先端部の染色は、抗ＣＥＡ抗体で認められる反応と類似性を示し
た。しかしながら、ＣＥＡに対する抗体は、顆粒球および／またはマクロファー
ジとも反応すると報告されている。さらに、ＣＥＡ抗原は循環系において容易に
検出され、ゆえに結腸直腸癌の血清マーカーとして使用される。結腸癌反応性抗
体Ｂ３、１９−９およびＢ７２．３全ては、正常結腸において限定された不均質
な反応性を有し、またＫ２９３の特異性とも区別されるようである。このことは
ＭＵＣ−１、−２、−３、−４抗原についてもまた真実であり、これらはＫ２９
３に認識される抗原と比較して正常結腸において異なる分布を有する。
【００８５】 本発明により開発された組織に基づくサブトラクションファージ選択法は、標
的発見技術に新たな局面をもたらすであろう。ゲノミックスおよびプロテオミッ
クスは、異なって発現される遺伝子および蛋白質の同定に基づいている。これら
の方法は直接的に標的自体の提示に関与するが、本発明の技術は細胞および組織
に発現する標的を分析するためにファージ上に提示される試薬のライブラリーを
使用する。
【００８６】 新規標的に対する試薬の同定は、エピトープの組織分布を分析するための、並
びに対応する抗原（類）の精製および特性評価のための効率的な手段を提供する
。アフィニティー精製の実施が可能であったこと、またＫ２９３抗体の想定され
る標的抗原の配列分析による特性評価は、かかる抗体の効率的且つ迅速な標的同
定のためのプローブとしての強力な潜在能力を例証するものである。３つの１０
アミノ酸長ペプチドは、グリセロアルデヒド―３―リン酸脱水素酵素分子との同
一性が示され、この分子がＫ２９３の標的であることを示唆している。
【００８７】 ゲノミックスは標的遺伝子の同定にいたるであろうが、この技術は蛋白質レベ
ルで付加される翻訳後修飾における変化を保証できない。様々な組織における遺
伝的発現の有用な情報は、遺伝子発現データベース（電子的なノーザンブロット
）を検索することで提供し得るが、直接的な実施はインサイチューハイブリダイ
ゼーションの使用を必要とするだろう。
【００８８】 プロテオミックスは何タイプかの翻訳後修飾の検出に使用できる。しかしなが
ら、同定された蛋白質の組織分布の分析は、そのアミノ酸配列に基づいたインサ
イチューハイブリダイゼーションに使用されるＤＮＡプローブの作成、或いは蛋
白質に対する抗体試薬の作成の何れかを必要とするだろう。
【００８９】 ゲノミックスもプロテオミックスも、例えば炭水化物および脂質および非蛋白
質性の他の生体分子をカバーしない。強力な自動化技術が実施されており、それ
はファージ・ディスプレイ技術とプロテオミックスを組み合わせたもので、さら
に特定するとこの技術は二次元ゲル上の蛋白質スポットに対する抗体ファージの
選択を意味している（CaT、Cambridge、 U. K.から提供される）。この技術は疑
いなく新規抗原に対する試薬を生成することが可能であるが、プロテオミックス
の技術制限、並びに変性蛋白質上に暴露する多くのエピトープはインビボでは暴
露されなく、またインビボの折りたたまれた蛋白質上で暴露される多くのエピト
ープは検出されないという問題を内包するものである。もちろん、かかる技術は
、標的蛋白質スポットを検出するためにサブトラクションファージ選択アプロー
チにより作成される試薬を用いて逆の様式でも使用することができる、スポット
検出後には標的同定のためにマススペクトルおよびシーケンス分析がなされる。
【００９０】 選択された抗体（特にＫ２９３特異性）は、腫瘍をターゲッティングする部分
としての使用において、いくつかの有利な特性を有している。これらには、結腸
直腸カルシノーマの大部分の腫瘍および潜在的に他の通常認められる腫瘍タイプ
に対する、高度に均質な結合パターンでの腫瘍反応性が含まれる。重要なことは
、正常組織の反応性は非常に限定されていること、そして癌患者の循環系におい
て標準的な方法論を用いての標的抗原の検出は不可能であるということである。
また、霊長類の抗体はヒト免疫グロブリンの配列と高度に相同性があり、ヒトで
強い異種抗体反応（免疫複合体形成を生じて排除される）を誘導しないことが期
待される。
【００９１】 ファージ選択に対する本戦略は、サブトラクション選択のための狭いフィルタ
ーと共に、インビボで予め選択されたレパートリーの霊長類結合構造（抗体）を
利用することに基づくものである。
【００９２】 本発明の更に意図される適用は、免疫優勢（immunodominance）のような免疫
のバイアスをさけるための大きい非免疫ライブラリーに関連するものであり、こ
れはデザインした選択戦略の分析力に挑むものである。これら適用には、組織切
片により提示される信憑性のあるインビボ表現型を使用したサブトラクション選
択、表現型の「共通因子」の抗原提示を促進する抗原環境のバックグランドの変
更、および頻繁に同定されるエピトープの特異的なブロッキング（クローン化し
た抗体の使用による）が含まれる。
【００９３】 本研究は、ファージ選択が規定の標的指向性戦略のための発見手段として使用
できること、並びに選択計画基準が成功に重要であることを明確に示している。
【００９４】 本発明は添付の図面を参照して、以下に記載する限定されることのない実施例
によって説明される
【００９５】
【実施例】
＜実施例１＞ 《効率的なサブトラクティブモデル選択》 本発明によるファージミド・ライブラリーのサブトラクション選択の原理を図
１に示す。サブトラクション選択された（腫瘍関連抗原を同定する目的で）ライ
ブラリーのプールにおける個々のファージは、理想的にはそれらのコードする抗
体の特異性パターンに従い分類される、すなわち１）広域組織反応性、２）腫瘍
限定、および３）非特異的に分類される。また、ファージミド・ライブラリーは
、それらのコードする抗体を提示しない多数のファージを有している。これらの
ファージは、ネガティブ選択工程において特異的に吸着されないが、細菌中での
ファージ増殖の前のポジティブ選択工程において洗浄除去される。
【００９６】 上皮細胞接着分子Ｅｐ−ＣＡＭと反応性の広域反応性ファージＣ２１５ ｓｃ
Ｆｖ、および、より腫瘍に限定したファージ特異性１Ｆ ｓｃＦｖ（以前にファ
ージライブラリーから同定された）が混合（2.5x107 Ｃ２１５ および 1.3x106 １Ｆ ｓｃＦｖ ファージ）され、そして図２Ａに示されるモデル実験に使用
された。これらのファージ特異性をＣ２１５発現組織（小腸 small bowel）また
は両抗原の発現が陰性の組織（子宮）のどちらかの切片上でインキュベーション
した。組織切片吸着後に、上清に残存する特異的ファージがＣｏｌｏ２０５細胞
を使用してポジティブ選択された。
【００９７】 非選択および選択されたファージプールにおける異なる抗生物質耐性導入単位
（異なるファージクローン）の相対的構成を、コロニータイトレーションおよび
各々のファージ特異性に対して明らかにされたファージの収量を用いて分析した
。データは、小腸(small bowel)の切片上の吸着は広域反応性Ｃ２１５ファージ
の収量を子宮上の吸着と比較して３３倍減少させたことを示している。
【００９８】 他の特異性１Ｆの対応する減少は、ほんの１．２倍であった。オリジナルの混
合物と比較したファージの比率（１Ｆ／Ｃ２１５）は、小腸(small bowel)切片
を使用した選択後に５０倍変化した（子宮切片の使用では１．８倍）。
【００９９】 反復実験において、ファージ比率は小腸(small bowel)切片を使用した際に１
７倍変化した（子宮切片においては１．４倍）。両選択工程での組織切片の使用
は、サブトラクション効率の減少を示した。小腸(small bowel)／Ｃｏｌｏ２０
５ ＳＣＩＤ腫瘍および小腸(small bowel)／原発性結腸カルシノーマの切片の
組み合わせによる使用は、吸着に子宮を使用した対応する設定と比較して、それ
ぞれ４倍および３倍Ｃ２１５特異的ファージ収量を減らした。しかしながら、２
回吸着工程を繰り返すことにより、吸着効率は２５倍に増大した（データ示さず
）。特異的ファージの多数がこれらの実験に使用された（6.1x1010の非特異的Ｄ
１．３ファージのバックグランドにおいて、3.8x109 および 1.2x1010 のＣ２１
５ および １Ｆ ファージ）、これは小腸(small bowel)組織切片の高い吸着能力
を示している。
【０１００】 図２Ｂに示される実験において、同等に多数のファージ（7.2x109 Ｃ２１５,
2.2x1010 １Ｆ および 4.2x1010 Ｄ１．３ ファージ）が、子宮、小腸(small
bowel)、もしくは肺の切片を使用したネガティブ組織吸着の2回の反復に使用さ
れ、続いてＣｏｌｏ２０５腫瘍切片を使用したポジティブ選択が行われた。小腸
(small bowel)および肺の組織切片吸着は、子宮吸着と比較して夫々１１および
２．２倍Ｃ２１５ファージ濃縮（Ｃ２１５／Ｄ１．３ファージ収量）を顕著に (
p < 0.05, n=4) 減少化した（図２Ｂ）。
【０１０１】 対照的に、1Fファージ濃縮（Ｄ１．３ ファージに対して５５−６４倍）は、
吸着に使用する組織の選択には影響されなかった（それぞれ小腸(small bowel)
および子宮に対して１．１および０．９倍減少）。
【０１０２】 結果として、Ｃ２１５ファージのネガティブ組織切片吸着は、Ｅｐ−ＣＡＭ組
織抗原依存的であり、３３倍までの効率化を示した。前記データはサブトラクシ
ョン選択がネガティブおよびポジティブ選択工程の双方の効率に依存したことを
示している。
【０１０３】 ＜材料および方法＞ ［動物］ オナガザル（Macaca fascicularis）は、ストックホルムのスウェーデン感染
症制御研究所（Swedish Institute for Infectious Disease Control）で維持し
た。前記サルをアルムアジュバンド（alum adjuvant）を添加もしくは非添加（
各々２個体）したヒト結腸直腸腫瘍の粗懸濁液（a crude suspension）で経皮的
に免疫した。追加免疫用量を２１、３５および４９日に投与した。
【０１０４】 重症複合免疫不全症 (ＳＣＩＤ) 雌マウス (Ｃ． Ｂ−１７) をBommice（ Ry
, Denmark）から入手した。前記マウスをMacrolone ケージ(III)中で病原体フリ
ーの条件で維持し、自由にSpecial Diets Services（Essex, UK）の滅菌ネズミ
餌および滅菌水を与えた。８−１２週齢のマウス（細胞株ごと２匹のマウス）の
各わき腹の皮下に１％Ｂａｌｂ／ｃ血清２００μｌに懸濁した2x106 の結腸癌細
胞、Ｃｏｌｏ２０５、ＷｉＤｒ、ＨＴ２９もしくはＬＳ１７４Ｔを注射した。腫
瘍を直径４〜５ｍｍのサイズに成長させ、そして摘出し、免疫組織化学検査のた
めに凍結した。
【０１０５】 全ての動物はスウェーデンの法律に従って維持され、そして実験は地域委員会
により承認された。
【０１０６】 ［細胞および組織］ ヒト結腸直腸細胞株Ｃｏｌｏ２０１, Ｃｏｌｏ２０５, Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ,
ＳＷ４８０, ＳＷ６２０, ＷｉＤｒ, ＨＴ２９および ＬＳ１７４Ｔはアメリカ
ン・タイプ・ティッシュ・カルチャー・コレクション（American Type Tissue C
ulture Collection，Rockville, MD）から入手し、そしてＣｏｌｏｌ３７はCanA
g AB（Gothenburg, Sweden）から入手した。細胞をＧｉｂｃｏの１０％熱不活化
牛胎児血清（ＦＢＳ）および0.1 mg/mlゲンタマイシン硫酸（Biological Indust
ries, Kibbutz Beit Haemek, Israel）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中（Gib
co）で培養した。ヒトの腫瘍および正常組織はスウェーデンのＬｕｎｄ大学病院
およびMalm総合病院から入手した。サブトラクションライブラリー選択のために
、６個体から得た原発性結腸直腸カルシノーマおよび正常結腸上皮組織（腫瘍病
巣から少なくとも５ｃｍの距離に位置する）のペアが使用された。
【０１０７】 ［ライブラリーおよびモデルファージ］ ライブラリーおよびモデルファージに使用するファージミドベクター、増幅並
びにファージミドベクターに挿入されるラムダ軽鎖および重鎖遺伝子のポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｓｃＦｖ遺伝子の組み立てのためのプライマーは
、以前に記載 されている(Tordsson 等 、1997および Tordsson等、投稿中)。簡
潔に説明すると、ｃＤＮＡをプロメガのＲＮＡ単離キットおよびＰＥ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ（ストックホルム、スウェーデン）のＲＮＡ ＰＣＲキットを使用
して総脾臓ＲＮＡから増幅した。本研究に使用したＤ１．３、Ｃ２１５ および
１Ｆ ｓｃＦｖモデルファージは、各々アンピシリン、クロラムフェニコールお
よびテトラサイクリン抗生物質耐性遺伝子をコードしており、これにより異なる
抗生物質を含有する寒天プレートを使用したコロニータイトレーションによるフ
ァージ混合物中での個々のファージ力価の分析が可能となる。提示した抗体は、
鶏卵リゾチーム(Ｄ１．３)、抗上皮接着分子 (Ｃ２１５)および今まで知られて
なかった上皮腫瘍細胞表面分子（１Ｆ、Tordsson 等、投稿中）に反応性のもの
である。
【０１０８】 ［サブトラクション選択］ ネガティブ選択組織（結腸、小腸(small bowel)もしくは子宮）の切片をスラ
イド上で空気乾燥し、氷冷アセトン中で固定し、そして２０％ＦＢＳ含有ＴＢＳ
中で再水和した。必要としないファージ特異性を吸着するために、ライブラリー
ファージ（２０％ＦＢＳ中に1010 もしくは 1011）またはモデルファージクロー
ン混合物（ミニライブラリー）を湿度を与えられた空気中で切片と共に４℃で１
５−２４ｈインキュベーションした。
【０１０９】 吸着操作したファージ溶液を移し、結腸癌腫瘍（colon cancer tumours）の切
片上でポジティブ選択のために上記のようにインキュベーションした。前記切片
をＴＢＳ緩衝液中で１０分間６回、そしてゲネネース緩衝液（Genenase buffer,
1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 6 mM CaCl2, 1 mM EDTA, pH 8.0）中で５分間２回
洗浄した。ファージを室温でゲネネース緩衝液中の４００μｌの３３μｇ／ｍｌ
ゲネネースで３０分間溶出した。溶出したファージを１ｍｌの１０Ｘ 濃縮大腸
菌株 ＤＨ５ａＦ’ O. D. 600 1.0を使用してレスキューした。感染した細菌を
０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンもしくはクロラムフェニコール(５０μｇ／ｍｌ)
を添加した２ｘＹＴ中に希釈し、２４〜３７℃で１２４ｈ培養した（Ｏ．Ｄ．60 0 が０．５に達するまで）。
【０１１０】 ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７ (ＭＯＩ 約 10)を添加し、２ｈインキュベ
ーションを継続して、その後７０ μｇ/ｍｌ最終濃度までカナマイシンを添加し
、Ｏ．Ｄ．600が２〜３に達するまで（１〜２日）２８℃、２５０ ｒｐｍで培
養液を振とうする。細菌を遠心分離でペレットにし、そして上清中のファージを
２回のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離でペレット化した。前記ファージペ
レットをＴＢＳ中で希釈した。
【０１１１】 テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールモデルファージに対しては、コ
ロニータイトレーションの前に３７℃で４５分インキュベーションした。クロラ
ムフェニコール耐性ライブラリーファージミド構築物に対しては、耐性発現期間
を２ｈに延長した。
【０１１２】 組織切片とは別に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の生細胞をモデル実験のポジテ
ィブ選択に使用した。吸着したファージを移し、１時間３００万のＣｏｌｏ２０
５細胞上でインキュベーションした。細胞を１０分間３回洗浄し、そして上記の
ように１００μｌのゲネネースで溶出した。上記の実験において、減弱した感染
能力および抗生物質耐性遺伝子を有するファージ(1012/ml)を潜在的な非特異的
結合部位を減らすために添加した。
【０１１３】 ネガティブおよびポジティブ選択工程の双方に組織切片を使用したモデル実験
において、非特異的ファージＤ１．３ ｓｃＦｖを特異的ファージと同じ濃度範
囲で使用した。
【０１１４】 ＜実施例２＞ 《ライブラリー特異性の後期濃縮が認められ、最適な多様性が最後から２番目
の選択ラウンドにおいて認められた》 内部標準としてのファージＤ１．３ ｓｃＦｖと比較したライブラリーファー
ジの収量は、少ないけれども６番目と７番目の選択ラウンドの間で増加し、ライ
ブラリー内の組織特異的ファージの濃縮を示している。
【０１１５】 ＳｃＦｖ抗体を最後の４回の選択ラウンド（２６０〜２８０ クローン／選択
ラウンド）からのライブラリーファージで感染させた細菌クローンを培養して生
産した。結腸癌および結腸の組織切片に結合するｓｃＦｖ抗体の頻度、並びに内
部標準ファージ（ライブラリー濃縮）に対するライブラリーファージの相対的収
量を図３に示した。組織反応性ｓｃＦｖ抗体(２９／２８０)は第５選択ラウンド
まで示すことができず、ネガティブ吸着が共通に広域に反応性する特異性の濃縮
を抑制したことを示唆している。
【０１１６】 結腸癌細胞上でのポジティブ選択に対して同じライブラリーを使用した研究(T
ordsson 等、投稿中)、メラノーマ組織切片上でのポジティブ選択に対してメラ
ノーマライブラリーを使用した研究（Tordsson 等、１９９７）並びに様々な腫
瘍細胞上でのポジティブ選択の研究（未発表の結果）などの以前の研究において
、特異的ファージの高頻度の選択は２もしくは３番目の選択ラウンドで既に達成
された。
【０１１７】 加えて、結腸癌ライブラリーから以前に選択されていない新規特異性が、サブ
トラクション組織切片選択の開発された方法を用いて今回同定された。６つの同
定された特異性グループを提示するｓｃＦｖ抗体クローンの免疫組織染色パター
ンを図４に示した。抗体Ｋ３０２ ｓｃＦｖは結腸癌組織（Ａ）と強く反応する
が、結腸（Ｂ、Ｃ）の上皮、固有層（lamina propria）およびパイエル板細胞と
も広範に反応する。Ｋ２９３ ｓｃＦｖは、腫瘍組織（Ｄ）中の細胞および沈着
物質（おそらくムチン）と反応し、また正常結腸上皮の管腔側（luminal side）
のみと反応したが、パイエル板（Ｅ、Ｆ）とは反応しなかった。Ｋ３２０ ｓｃ
Ｆｖ抗体は、結腸癌組織（Ｇ）内の腫瘍細胞および浸潤細胞（infiltrating cel
ls）と推測される細胞と反応した。この抗体は陰窩（crypts）深く正常結腸上皮
と強く反応したが、固有層（lamina propria）（Ｈ）の細胞とは反応しなかった
。Ｋ２９４ ｓｃＦｖは、結腸（Ｉ）および結腸癌（示さず）の細胞内の認識抗
原位置を示唆するパターンで反応した。クローンＩＩＩＤ９ ｓｃＦｖは結腸癌
細胞と反応するが、沈着物質もしくは浸潤細胞（Ｊ）とは反応しない。それはＫ
２９３ ｓｃＦｖよりも結腸陰窩深く反応するが、Ｋ３２０ ｓｃＦｖ （Ｋ）
よりもより限定しているように思われた。最後の抗体特異性、ＩＩＤ１１ｓｃＦ
ｖは血管（内皮細胞が最もあり得る、Ｌ）の内部を裏打ちする表層を染色する。
【０１１８】 特異性パターンの構成は、最後の３回の選択ラウンド（表１）で変化した。２
つのパターンのみが第５の選択ラウンドにおいて認められた、すなわち大部分腫
瘍限定的なグループＫ２９３、及びより広域反応性のＫ３０２グループである。
最終ラウンド後に高頻度のＫ２９３グループは減少し、そしてＫ３０２グループ
は増大した、第５と第６選択ラウンドの間でそれらの頻度は顕著に変化しなかっ
たのではあるが。４つの付加的な特異性パターンが、第６選択ラウンドで出現し
た。これらのパターンのうち３つは最終ラウンドで消失した。
【０１１９】 結果として、最後から２番目の選択ラウンドは、ライブラリー中の非特異的フ
ァージに対して特異的ファージの多数を提示する特異性グループの最適多様性を
示した、一方、広域反応性Ｋ３０２特異性グループは最終選択ラウンド後に優勢
となった。
【０１２０】 これは特異性の広範な多様性を見つけるために最適な選択ラウンドをスクリー
ニングする重要性を示しており、ネガティブ選択フィルターが第６選択ラウンド
まで効率的であったが、その後は飽和したことを示唆している。
【０１２１】
【表１】 ＜実施例３＞ 《頻繁および均質な腫瘍選択抗原発現が、Ｋ２９３スーパー抗原融合蛋白質に
より示された》 多くの腫瘍限定特異性グループの代表、Ｋ２９３を免疫エフェクター分子（ス
ーパー抗原StaphylococcalエンテロトキシンＡのＤ２２７Ａ変異体）であるＳＥ
Ａ（Ｄ２２７Ａ）と遺伝子的に連結するため再クローン化した。この融合蛋白質
を発酵槽で培養し、精製し、そして使用した５つの腫瘍と均質な反応性を示すた
めに使用した。融合蛋白質Ｋ２９３ ｓｃＦｖ−ＳＥＡ(Ｄ２２７Ａ)の反応性は
、Ｅｐ−ＣＡＭ特異的融合蛋白質Ｃ２１５ Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）と比
較して図５に示される結腸癌腫瘍において等しく均質な染色性を示した。腫瘍ダ
クトの内部の沈着物質の染色および表面上皮への限定的な結腸反応性は、Ｋ２９
３ ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）融合蛋白質を使用して確認された。
【０１２２】 ［材料および方法］ 《ＳｃＦｖ抗体及びｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の生産》 第６および第７ライブラリー選択ラウンドからのファージを導入した大腸菌の
非サプレッサー株ＨＢ２１５１の個々のクローンを１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを添加した２ｘＹＴ培地を分注したマイクロウェルプレート中で３７℃で１７
時間培養した。アリクオットをｐｈоＡプロモーターからｓｃＦｖを発現するた
めの低リン酸培地および抗生物質を分注したマイクロウェルプレート中に移し、
そして３０℃で１７時間培養する。前記細胞を２２００ｒｐｍ、７分間の遠心分
離により沈降させ、そして上清を等しい容量／ウェルの１％牛血清アルブミン（
ＢＳＡ、ＰＢＳ中に溶解）を含むプレートに移す。ＳｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７
Ａ）融合蛋白質をTordsson等 （１９９７）および標準法に従って、発酵により
生産し、ウサギ抗ＳＥＡ結合アフィニティーカラムを使用して精製した。精製融
合蛋白質を、捕捉および検出抗体として抗ＳＥＡ抗体およびビオチン化・抗ＳＥ
Ａ抗体を使用したサンドウィッチタイプＥＬＩＳＡで定量した。融合蛋白質の完
全性をビオチン化ウサギ抗ＳＥＡ抗体を使用したイムノブロット分析により確認
した。
【０１２３】 〈免疫組織化学〉 切片（６〜８μｍ）を氷冷アセトン中で固定し、２０％ＦＢＳを添加した150
mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.6 (TBS)中で再水和した。内在性のビオチンをアビジ
ンおよびビオチン(Vector Laboratories, Burlinngame, CA)でブロックした。最
初のｓｃＦｖ（培養上清）もしくはｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）融合蛋白質
、５μｇ／ｍｌ、を切片と１時間インキュベーションした。Ｃ末端タグＡＴＰＡ
ＫＳＥに対するウサギ抗血清、続いてビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ
Ａ／Ｓ）、１μｇ／ｍｌ、をｓｃＦｖの検出のために使用した。融合蛋白質をア
フィニティー精製した抗体およびビオチン化ウサギ抗ＳＥＡ抗体５μｇ／ｍｌを
使用して検出した。
【０１２４】 これらの試薬および５０ｍＭ トリス pH 7.6に１／１１０に希釈したＳｔｒ
ｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ ＨＲＰ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ）を３０分間インキュベ
ーションした。全ての工程間で前記切片をＴＢＳ中で３回洗浄した。０．０１パ
ーセントＨ２Ｏ２を含有するトリスｐＨ７．６に溶解した０．５ｍｇ／ｍｌの３
，３’-ジアミノベンチジン・テトラヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ）中で染色
反応を８分間行った。０．５％メチルグリーン中での１０分間の対比染色後、Ｄ
ＰＸメディウム (Ｓｉｇｍａ)中にマウントする前に前記スライドを水道水中で
１０分間リンスし、７０〜９９％エタノールおよびキシレン中で徐々に脱水した
。
【０１２５】 〈ｓｃＦｖのフィンガープリント〉 ＳｃＦｖ遺伝子（ｓｃＦｖ特異性の代表）をポリメラーゼ連鎖反応により増幅
した。マイクロウェルの細菌培養物のアリクオット（５μｌ）、並びに形質転換
した細菌のファージミドベクター中の（ｐｈｏＡプロモーターおよびＭ１３遺伝
子ＩＩＩの領域）ｓｃＦｖ遺伝子の５’および３’領域に相補的なプライマーを
使用した。
【０１２６】 増幅したｓｃＦｖ遺伝子のＨｉｎｆ Ｉ制限酵素パターンを１％アガロースゲ
ル電気泳動により分析する。ユニークなパターンもしくは原型のパターンを有す
るクローンを選び、各々の免疫組織化学特異性グループの代表として保存した。
【０１２７】 ＜実施例４＞ 《インビトロでのＫ２９３抗原の発現の欠如もしくはダウンレギュレーション
は、組織に基づく（本物のインビボの表現型の保存物を代表する）選択原理の利
点を反映する》 患者から摘出した腫瘍（培養腫瘍細胞と比較して）の穏和に固定した凍結組織
切片は、オリジナルの腫瘍表現型と密接に類似する複合抗原（ファージ選択のた
めの）の供給源である。患者由来の腫瘍との均質および頻繁な反応性と対照的に
、Ｋ２９３ ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）抗体は、フローサイトメトリーに
より２／９（ＨＴ２９およびＬＳ１７４Ｔ）と弱く反応し、７／９（Ｃｏｌｏ２
０１， Ｃｏｌｏ２０５， Ｃｏｌｏ１３７, Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ， ＳＷ４
８０， ＳＷ６２０,およびＷｉＤｒ）の結腸癌細胞株とは反応しなかった、対
照的にＣ２１５ Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）は中程度から強程度の反応性を
示した（表２、および未記載結果）。２つのネガティブな細胞株（Ｃｏｌｏ２０
５ および ＷｉＤｒ）および２つの低反応性細胞株をＳＣＩＤマウスの皮下で成
長させた。
【０１２８】 免疫組織化学を用いて、これらの腫瘍とＫ２９３ ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２
７Ａ）の反応性を分析した。Ｃｏｌｏ２０５腫瘍は完全にネガティブであり、一
方、ＷｉＤｒ腫瘍の腫瘍細胞はネガティブだが沈着物質はポジティブであった。
ＨＴ２９腫瘍は少数の細胞（約５〜１０％）および沈着物質に対してポジティブ
であった。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍は細胞の約５０％に対して不均質にポジティブで、
また沈着物質に対してもポジティブであった。従って、原発性の患者腫瘍におけ
るＫ２９３エピトープの頻繁および均質な発現は、インビトロで培養した腫瘍細
胞株または異種ホスト中で成長した細胞株に由来する腫瘍の何れにおいても観察
されなかった。この結果は、ファージ選択の抗原ソースとしての組織切片の使用
が腫瘍に限定したＫ２９３の特異性を見つけるために必須であったことを示して
いる。
【０１２９】 フローサイトメトリーによって検出される２つの細胞株上のＫ２９３エピトー
プの低い発現は、認識されるＴＡＡが腫瘍細胞の表面に発現され得ることを示唆
している。インビボの表面発現は、原発性結腸カルシノーマに由来する腫瘍細胞
、並びに腫瘍を細胞懸濁液に乖離するためにディスパーゼ（天然のプロテアーゼ
）およびコラゲナーゼで処理した腫瘍細胞におけるフローサイトメトリーの実施
により確認された。ｍＡｂ Ｃ２１５で検出されるＥｐ−ＣＡＭ＋細胞のような
他の細胞（例えば、線維芽細胞、血液細胞および平滑筋細胞）から区別される腫
瘍細胞は、Ｋ２９３ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）反応性に対して２重染色さ
れた（図６）。Ｅｐ−ＣＡＭ陽性腫瘍細胞の多数は、細胞の抽出に必要とされる
一晩（ｏ．ｎ．）の酵素処理後にＫ２９３反応性（約６０％）であった。
【０１３０】 Ｋ２９３ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）反応性は、様々な強度ではあるが摘
出した原発性腫瘍の細胞を使用した３つの追加実験において示され、これはＫ２
９３ ＴＡＡが同種ホストの腫瘍細胞表面上に発現することを支持している。
【０１３１】
【表２】 ［材料及び方法］ 〈フローサイトメトリー〉 培養腫瘍細胞または新たに用意された腫瘍細胞に対する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃａｌ エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）に遺伝子的に連結された抗体の反応
性がビオチン化ウサギ抗ＳＥＡ抗体およびアビジン−ＰＥを使用して示された。
【０１３２】 原発性ヒト結腸癌細胞は、同日に摘出された結腸直腸癌腫瘍（colorectal can
cer tumours）に由来し、使用まで150 mM NaCl中で氷冷維持された（４時間未満
）。前記腫瘍は小片に切断され、ＲＰＭＩ １６４０培地 (Gibco, Middlesex,
UK)中に希釈した１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼ (Sigma), ０．１ｍｇ／ｍｌ ヒア
ルロニダーゼ（hualuronidase 、Sigma), ２．４ｍｇ／ｍｌ ディスパーゼ (Boe
hringer Mannheim) および ２０μｇ／ｍｌ デオキシリボヌクレアーゼ (Sigma)
を含有する溶液中で一晩ゆっくりと室温で振とうした。前記腫瘍細胞を濾過によ
り組織砕片から分離し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで１度洗浄し、そして５μｇ／ｍｌ
Ｃ２１５ ｍＡｂ／ウサギ抗マウスＦＩＴＣ(Dakopatts)の１／２０希釈物お
よび５μｇ／ｍｌ Ｋ２９３ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）／ビオチン化ポリ
クローナルウサギ抗ＳＥＡ抗体の１／１０００希釈物／アビジン−ＰＥの１／２
０希釈物で染色した。
【０１３３】 ＜実施例５＞ 《Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１は上皮腫瘍を強く且つ頻繁に染色する》 様々なヒト腫瘍における免疫組織化学反応性を表３に要約する。Ｋ２９３Ｆａ
ｂＳＥＡ／Ｅ１１は、結腸、膵臓、肺および乳房（胸部）のアデノカルシノーマ
において強い陽性反応を示す（図７）。強い反応が腺構造における悪性細胞およ
び粒状構造のムチン様／シェッド（shed）物質の双方で認められた。腎臓もしく
は前立腺癌においては如何なる反応も得られてないが、一方、２つの悪性メラノ
ーマのうち１つは低程度から中程度の反応性を示した。結腸癌において、試験し
た腫瘍１２例の全てが強く陽性に染色された。
【０１３４】 個々の腫瘍の中で陽性悪性細胞の頻度は、７５から１００％まで変化する。６
例の乳房（胸部）腫瘍のうち５例は、７５〜１００％の陽性悪性の頻度で強く陽
性であった。結腸および乳房（胸部）のカルシノーマ中の陽性細胞の頻度は７５
から１００％まで変化するが、大多数の腫瘍は９０％を越える陽性反応を示す。
２例の試験した膵臓腫瘍のうち２例も、９０％を越える悪性細胞において強い反
応性を示す。
【０１３５】 非小細胞肺カルシノーマ(NSCLC；non small lung carcinomas )の中で２例は
、扁平上皮細胞カルシノーマで、４例は肺アデノカルシノーマである。全例とも
悪性細胞の強い染色性を示した。試験した扁平上皮細胞カルシノーマ双方におい
て、９０％を越える腫瘍細胞において陽性染色が認められた。アデノカルシノー
マにおいて、２例は９０％腫瘍細胞反応性を示し、そして２例は１０％未満の陽
性率であった。
【０１３６】 異なる結腸癌におけるＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１の反応性パターンは、腫
瘍の分化程度と相関しているようである。高度に分化した腫瘍において、悪性細
胞の先端の染色性が優勢である。これらの高度に分化した腫瘍のいくつかにおい
て、腫瘍細胞の基底外側部分（baso-lateral parts）は完全に陰性だが、一方、
先端部分は強く陽性である。低程度および中程度に分化した腫瘍において、免疫
反応は特定部位に対して分極することはなく、むしろ悪性細胞において一様に分
布している。
【０１３７】
【表３】 ＜実施例６＞ 《Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１は、非常に限定した正常組織反応性を示した
》 正常組織反応性は、研究した器官の一群のなかで結腸、小腸(small intestine
)および乳房（胸部）に限定している。上皮細胞の先端部分の強い染色は、結腸
において認められた（図８）。これは、小腸(small intestine)からの２例の試
験したバイオプシーのうちの１例においても認められる。多分、これらのバイオ
プシーは異なる領域から採取されたものであり、Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１
が小腸(small intestine)の特定部位のみと反応することを示している。乳房（
胸部）組織において、低程度から中程度の反応が腺上皮細胞（glandular epithe
lial cells）および周囲ストローマ部分に認められる（図８）。如何なる反応も
胃、脾臓、腎臓、肝臓、肺、皮膚、膵臓、甲状腺、心筋もしくはＣＮＳにおいて
認められなかった（表４）。
【０１３８】
【表４】 ［材料及び方法］ 〈免疫組織化学〉 《光学顕微鏡法のための凍結切片》 ルンド大学病院の外科から提供された腫瘍および正常組織を液体窒素中で前冷
却したイソペンタン中で急速冷凍（snapfrozen）し、そして-７０℃で保存した
。凍結切片作成後、切片を一晩空気乾燥した。前記切片を冷却アセトン中で固定
し、内在性のビオチンをアビジン／ビオチン (Vector, Burlingame CA)でブロッ
クし、そして一次抗体Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１で１時間インキュベーショ
ンした。Ｋ２９３ ＶＨ および ＶＬ遺伝子（ライブラリーから選択したｓｃＦ
ｖより得た）をカニクイザル（cynomolgus）ＣＨ１およびＣ−ラムダ遺伝子に遺
伝子的に融合して融合蛋白質を調製した。結合したＦａｂをスーパー抗原Staphy
lococcalエンテロトキシンＡＥキメラ変異体(Ｄ２２７Ａ、（非常に減弱したＭ
ＨＣクラスＩＩ結合を示す）Ｅ１１と連結した。この構築物、Ｋ２９３ＦａｂＳ
ＥＡ／Ｅ１１は、非常に低レベルの非特異的結合を示し、そして標準方法により
生産され、ビオチン化された二次抗体ポリクローナル・ウサギ抗ＳＥＡ抗血清に
よる高感度検出を可能とした。
【０１３９】 前記二次抗体を３０分間インキュベーションし、続いてストレプトアビジン-
ビオチン／ＨＲＰ (Dakopatts, Copenhagen)による別の３０分間の工程でインキ
ュベーションされた。全ての工程間で洗浄を0.05 M Tris pH 7.6 および 0.15 M
NaClにより３回実施した。ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を色素原として使用
し、前記切片を０．５％メチルグリーン中で対比染色した。ポジティブコントロ
ールとして、汎上皮反応性融合蛋白質Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）を使
用した。ネガティブコントロールとして、組織非反応性ＦａｂとＳＥＡ−Ｄ２２
７Ａの融合蛋白質を使用するか、または如何なる一次抗体も使用しなかった。全
ての抗体は５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。結果をそれぞれ陰性、低程度、中程
度もしくは強程度の染色性と表記した。
【０１４０】 《光学顕微鏡法のためのパラフィン切片》 リンパの結腸癌転移の腫瘍組織を４％ホルムアルデヒド (Sigma, St. Louis M
O)中、４℃で一晩固定した。ＰＢＳ中で洗浄後、前記組織を脱水し、パラフィン
(Histolab AB, Gothenburg, Sweden)中に包埋した。パラフィン切片を調製し、
３７℃で一晩乾燥させた。前記切片を脱パラフィンし、脱水し、そして上記のと
おり免疫組織化学的に染色した。
【０１４１】 ＜実施例７＞ 《Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１は表面発現抗原を認識する》 免疫反応のサブセルラー局在を８μｍ凍結切片と比較して薄層切片上でより正
確に実施した。２μｍの合成樹脂包埋切片において、結腸癌細胞の基底外側に加
えて先端部の細胞膜染色の実施が可能であった（図９Ａ）。この腫瘍標本は電子
顕微鏡用にも処理された。電子顕微鏡の解像度で免疫反応は悪性細胞の外側表面
に位置することを示すことが可能であった。正常結腸の染色後の２μｍ準薄切片
（semithin sections）の顕微鏡検査および電子顕微鏡検査は、免疫反応が管腔
上皮（luminal epithelium）中の微小絨毛の外側表面のレベルにも位置すること
を示した(図９Ｂ および Ｃ)。
【０１４２】 ［材料及び方法］ 《光学顕微鏡法および電子顕微鏡法のための合成樹脂包埋切片》 腫瘍および正常組織物質を以下の記載に従って処理した。新鮮な摘出物を４％
ホルムアルデヒド(Sigma, St. Louis MO)および ０．２５％グルタールアルデヒ
ド (TAAB, Berkshire)の混合物中で２時間固定した。ＰＢＳでの洗浄後、前記組
織を３０％スクロース含有のＰＢＳ中でリンスして一晩凍結保護（cryoprotecte
d）し、そして上記のようにイソペンタン／液体窒素中で急速凍結した。自由浮
遊した５０μｍ凍結切片を光学顕微鏡法で記載した同一の抗体とインキュベーシ
ョンした、しかしインキュベーション時間は異なる。一次抗体で一晩、二次抗体
で３時間、そしてストレプトアビジン−ビオチン／ＨＲＰでもう３時間インキュ
ベーションした。ＤＡＢ中で反応後、前記切片を１％ ＯｓＯ4 (Standard sup
plies, Kallered)中で後固定し、脱水してＥｐｏｎ (Agar Scientific Ltd, Sta
nsted, U. K.)中に包埋した。
【０１４３】 光学顕微鏡法のための準薄切片（２μｍ）および電子顕微鏡法のための超薄切
片（５０−６０ｎｍ）をウルトラミクロトーム(LKB, Bromma, Sweden)で調製し
た。準薄切片を１％メチレンブルーで対比染色した。超薄切片を２％酢酸ウラニ
ル（uranylacetate）およびクエン酸鉛（leadcitrate）中のultrastainer (LKB,
Bromma)で染色した。
【０１４４】 ＜実施例８＞ 《Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅｌｌは結腸癌患者の血清中の循環する抗原を検出
しない》 図１０は、それぞれ結腸癌患者群および一人の健常人ボランティアのプラズマ
サンプルとインキュベーションした後の、放射性同位元素標識ＳＥＡ融合蛋白質
構築物および循環する腫瘍抗原のフラクションのサイズを示す。
【０１４５】 健常人個体のプラズマとインキュベーションした場合と比較して、癌患者のプ
ラズマとインキュベーションした場合には１．５倍未満のＫ２９３Ｆａｂ−ＳＥ
Ａ／Ｅ１１が蛋白質複合体として認められた。一方、Ｃ２４２−Ｆａｂ構築物（
ポジティブコントロール）においては、癌患者のプラズマとインキューベートし
た場合、８倍を越えるものが複合体型であった。従って、Ｋ２９３Ｆａｂ−ＳＥ
Ａ／Ｅ１１は、癌患者中の如何なる循環する抗原をも認識しなかった。
【０１４６】 ［材料及び方法］ 〈試験混合物の処方〉 Ｋ２９３Ｆａｂ−ＳＥＡ／Ｅ−１１, Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡmut．9 および
Ｃ２４２Ｆａｂ−ＳＥＡmut.23の５０μｇを、Ｉｏｄｏｇｅｎプレコートチュ
ウブ (Pharmacia-Amersham Biotech) を使用して１０μＣｉ／μｇの比放射能に
まで125Ｉでラベルした(Fraker and Speck, 1978)。ＨＰＬＣによりラベルした
試験混合物の蛋白質濃度および比放射活性を決定した（以下を参照）。
【０１４７】 プラズマサンプルを市販のアッセイ(CanAG Diagnostics AB, Gothenburg, Swe
den)により高レベルの循環ＣＡ２４２抗原を示した結腸直腸癌患者 （ｎ＝１２
）、および非常に低レベルのプラズマＣＡ２４２を有する一人の健常人ボランテ
ィアから採取した。
【０１４８】 〈プラズマの被験液の分析〉 ５０μｌの未希釈プラズマサンプルを１μｇ／ｍｌの試験混合物（ＰＢＳＴ中
に希釈）とインキュベーション混合液を振とうして周辺温度（ambient temperat
ure）で６０分間インキュベーションした。全てのサンプルをＨＰＬＣで分析し
た（以下を参照）。
【０１４９】 前記プラズマサンプルはＳＥＡに対する抗体を含有し、偽陽性相互作用シグナ
ルを提示したので、免疫グロブリンを除くためにそれらをプロテインＡとインキ
ュベーションした。この除去工程後に抗ＳＥＡ含量は＜１０ｐｍｏｌ／ｍｌであ
った。プロテインＡとインキュベーションした後に癌患者からプールしたプラズ
マ中のＣＡ２４２のプラズマ含量は４７９Ｕ／ｍｌで、健常人ドナーのサンプル
中では２０Ｕ／ｍｌ未満であった。
【０１５０】 ラベルした試験混合物および調製したサンプルをサイズ排除ＨＰＬＣにより分
析した。５０μｌのサンプルを注入 (Waters 717 Auto Sampler) し、ＴＳＫ
Ｇ３０００ＳＷ カラム (7.5 x 600 mm, Toso Haas)上で分離した。前記サンプ
ルを周辺温度、流速１．０ｍｌ／分で１０ｍＭ ＰＢＳ， ｐＨ＝７．４により
溶出した。直列に連結したＵＶ検出器 (A280 nm, Waters 486)および放射活性検
出器(Flo-One, A-515-AX)により検出を行った、そしてサンプルによりデータを
３５−６０分間収集した。試験混合物を結合した複合体を含有するフラクション
は、試験混合物自身より早くクロマトグラム中に出現する高分子量ピークとして
観察される。ヨウ素化した断片もしくはフリーのヨウ素を含有するフラクション
は、低分子量ピークとして観察された。放射活性クロマトグラムを統合し、複合
体化した試験混合物および低分子量ピークの領域を全領域のパーセントとして表
示した。
【０１５１】 ＜実施例９＞ 〈結腸癌反応性抗体Ｋ２９３により認識される腫瘍関連抗原の精製〉 腫瘍抽出物をヒト結腸癌組織から作成した。前記抽出物を２つのカラム、Ｃ２
１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ９を結合したコントロールおよびプレカラム、並びにＫ２
９３Ｆａｂ−ＳＥＡｍ９を結合したカラムにアプライした。組織抽出物を前記カ
ラムにアプライする場合は、前記カラムを直列に連結したが、結合蛋白質のアル
カリ溶出の間は分離した。
【０１５２】 Ｋ２９３Ｆａｂ−ＳＥＡｍ９ 結合カラムから溶出したフラクションを収集し
、中和し、濃縮し、そして非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１
１）。高ｐＨで溶出したフラクション中に約３５−４５ｋＤａのメジャーバンド
（図１１でＡと表示）が認められた。メジャーバンドを切り取り、トリプシンに
よる蛋白質分解を実施した。生成したトリプシンペプチド断片を分離し、それら
の分離したペプチドの３つについてＮ末端アミノ酸残基の最初の１０配列を決定
した（図１２）。配列決定した３つの短いＮ末端ペプチド配列（配列番号３−５
）は、ヒト蛋白質グリセロアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＤＰＨ）の部
分配列と完全な相同性を示した（図１３）。
【０１５３】 ［材料及び方法］ 〈腫瘍組織の可溶化〉 Ｋ２９３抗原を発現するヒト結腸癌組織は、スウェーデンの病院から提供され
、ＡＢＲの組織バンクで−７０℃で凍結保存された。凍結結腸癌組織をメスでス
ライスし、そして１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０） お
よびプロテアーゼ阻害剤 (CompleteTM プロテアーゼ阻害剤カクテル錠, Boehrin
ger Mannheim)を含有する４℃で冷却した等張スクロース緩衝液(0.25M スクロー
ス, 10mM KCl, 1.5mM MgCl, 50mM Tris-HC1、２５℃でpH 7.4)を含むチューブに
移した。組織スライスをＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーでホモジナイ
ズし、０℃で静置して可溶化した。大部分の細胞残渣を取り除くために、前記可
溶化溶液を１１０００ｒｐｍ (Hettich centrifuge, Universal 30 RF ローター
)で遠心分離した。前記上清を４℃、１０８０００ｘ ｇ(Beckman ultracentrif
uge, Ti-60 ローター)で更に遠心分離し、そして最終的に０．２μｍのMinisart
plus フィルター (Sartorius A G, ゲッチンゲン,ドイツ)を通して濾過した。
【０１５４】 〈組織抗原のアフィニティー精製〉 抗体、Ｋ２９３Ｆａｂ−ＳＥＡｍ９ および Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ９を製
造者の指示に従ってＮＨＳ−活性化 ＨｉＴｒａｐ（登録商標） カラム(Pharma
cia Biotech, Uppsala, Sweden) に結合した。Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ９を結
合したコントロールおよびプレカラム、並びにＫ２９３Ｆａｂ−ＳＥＡｍ９を結
合したカラムを直列に連結し、スタート緩衝液 (０．２％ ＮＰ−４０を含有す
る２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４℃でｐＨ７．５)で前洗浄した。そして、前
記抽出液をカラムに０．１ｍｌ／分の流速でロードし、フロースルーを再循環し
、続いてスタート緩衝液でカラムを洗浄した。各々のカラムに結合した抗原をジ
エチルアミンのグラジュエント（２０分間でｐＨ７からｐＨ１１に至る）により
溶出した。０．５ｍｌのフラクションを集めて、０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ， ｐＨ６．７で中和し、そして−２０℃で保存した。精製をアマシャム
・ファルマシア・バイオテック(ウプサラ、 スウェーデン)のＡＫＴＡ ＦＰＬ
Ｃシステムを使用して４℃で実施した。溶出したフラクションをプールし、濃縮
し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。同定した蛋白質バンドを切り取り、４
℃で保存した。そして蛋白質をトリプシンで消化し、個々のペプチドのＮ末端ペ
プチド配列を蛋白質分析センター(カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウ
ェーデン)で決定した。
【０１５５】 ＜実施例１０＞ 《Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅｌｌは重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに
おける腫瘍成長を抑制することができる》 スーパー抗原ＳＥＡは、サイトカイン産生および細胞毒性を担うＴリンパ球を
活性化する能力を有する。スーパー抗原を腫瘍反応性抗体と融合した際、それは
腫瘍細胞にターゲットされた。そして腫瘍領域中のスーパー抗原の局在は、腫瘍
細胞の選択的な殺傷を誘導する。
【０１５６】 実験結果は図１４に示す、そこではＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１で処理した
動物の腫瘍容積が、ターゲット化されていないＮＲＭＬ−０５ (抗メラノーマ)
ＦａｂＳＥＡ(Ｄ２２７Ａ)で処理されたコントロール動物と比較して８０％減少
したことを示している。
【０１５７】 ［材料及び方法］ 重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス (Bommice, Ry, デンマーク)に０．２
ｍｌのビークル（ＰＢＳ−１％ Ｂａｌｂ／ｃ 血清)中に懸濁した5x106のＬＳ
１７４Ｔ結腸癌細胞 (ＡＴＣＣ, Rockville, MD)を腹腔内注射した。２４時間後
、スウェーデンのルンド大学病院の血液提供者から得たバフィコートのフィコー
ルハイパーク分離により調製した20x106ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を前
記マウスの腹腔内に注射した。腫瘍注射後の１、３および６日目に前記動物を１
００μｇのＮＲＭＬ−０５ＦａｂＳＥＡ／Ｄ２２７Ａ(６動物個体) もしくは １
００μｇのＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１(７動物個体)で処理した。５１日目に
前記動物を供試し、腫瘍節（tumour nodules）を除去して質量を決定した。
【０１５８】
【参照文献】
-Hoogenboom HR, de Bruine AP, Hufton SE, Hoet RM, Arends JW, Roovers RC.
Antibody phage display technology and its applications. (1998) Immunote
chnology 4: 1 -Kerbel RS. Significance of tumor-host interactions in cancer growth and
metastases. (1995) Cancer Metastasis Rev 14: 259 -Kohler G, Milstein C. Derivation of specific antibodyproducing tissue c
ulture and tumor lines by cell fusion. (1976) Eur J Immunol 6: 511 -Tordsson J, Abrahmsen L, Kalland T, Ljung C, Ingvar C Brodin T. Efficie
nt selection of scFv antibody phage by adsorption to in situ expressed a
ntigens in tissue sections. (1997) J Immunol Methods 210: 11 -Tordsson J, Lavasani S, Ohlsson L, Karlstrom P, Svedberg H, Abrahmsen L
and Brodin T. A3-a novel colon and pancreatic cancer reactive antibody
from a primate phage library selected using intact tumor cells. Submitte
d to Int J Cancer. -Williams KL. Genomes and proteomes: towards a multidimensional view of
biology. (1999) Electrophoresis 20: 678
【図面の簡単な説明】
【図１】 サブトラクション選択の原理を説明する図である。 広域反応性ファージ（黒）の特異的吸着、そしてポジティブ選択の間の洗浄に
よる非提示および非特異的ファージ（白）の減少。そして腫瘍限定ファージ（チ
ェック）が溶出される
【図２】 効率的なサブトラクション選択を示すグラフである。 子宮もしくは小腸(small bowel)組織切片上のネガティブ吸着に続くＣｏｌｏ
２０５細胞上でのポジティブ選択（Ａ）。子宮、小腸(small bowel)もしくは肺
の組織切片上での２回の反復吸着、そしてＣｏｌｏ２０５腫瘍組織切片上でのポ
ジティブ選択（Ｂ）。
【図３】 サブトラクション選択したライブラリーからの組織特異的ファージの一群の後
期濃縮を示すグラフである。
【図４】 ライブラリー選択したｓｃＦｖの免疫組織化学染色パターンを示す顕微鏡写真
である。 Ｋ３０２ ｓｃＦｖおよびＫ２９３ ｓｃＦｖ（Ｄ−Ｆ）で染色した結腸カル
シノーマ（Ａ）、結腸上皮（Ｂ）およびパイエル板（Ｃ）の染色像。Ｋ３２０
ｓｃＦｖおよびＩＩＩＤ９ ｓｃＦｖ（Ｊ、Ｋ）で染色した結腸カルシノーマ（
Ｇ）および結腸上皮（Ｈ）の染色像。Ｋ２９４ ｓｃＦｖ（Ｉ）で染色した結腸
上皮、およびＩＩＤ１１ｓｃＦｖ（Ｌ）で染色した結腸血管。
【図５】 １００ｎＭでの結腸癌（Ａ）および結腸（Ｂ）に対するＫ２９３ ｓｃＦｖ−
ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の免疫組織化学的反応性、並びに結腸癌（Ｃ）および結腸
（Ｄ）に対するＣ２１５ Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の免疫組織化学的反応
性を示す写真である。 （Ａ）のバーは１００μｍである。
【図６】 摘出した原発性ヒト結腸カルシノーマから新規に調製した結腸癌細胞のフロー
サイトメトリー分析を示す図である。 サイズ、顆粒性（Ａ，Ｂ）および上皮細胞のマーカーとしてのＥｐ−ＣＡＭ発
現に対してゲートされた細胞は、５μｇ／ｍｌ Ｋ２９３ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ
２２７Ａ） (グレーライン)で染色されるか、または一次抗体を有さない融合蛋
白質ネガティブコントロール（黒ライン）によって染色された（Ｃ）。
【図７】 異なる腫瘍のＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１染色を示す顕微鏡写真である。 Ａ．腺構造中で悪性細胞（矢印）およびムチン様物質（ｍ）の双方の強い染色
性を示す中程度に分化した結腸癌の染色。Ｂ．悪性細胞の強い先端部染色（矢印
）を示す高度に分化した結腸癌の染色、一方、新生物性の小腺（neoplastic gla
ndules）（ｂ）の基底部分は非反応性である。Ｃ．乳房（胸部）腫瘍（矢印）に
おける悪性細胞の強程度染色。Ｄ．肺アデノカルシノーマ（矢印）における悪性
細胞の強程度染色。Ａでのバーは５０μｍを示し、Ｂ−Ｄに対しても同様である
。
【図８】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１染色を示す写真である。 Ａ．正常結腸のＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１染色。上皮細胞の先端部染色（
矢印）に注意。免疫反応は結腸の管腔（lumen）に面する上皮に認められたが、
陰窩（ｃ）では陰性である。Ｂ．正常乳房（胸部）のＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ
１１染色。低程度から中程度の染色性が腺上皮（ｇ）、および周囲のストローマ
部位（ｓ）に認められた。Ｃ．汎上皮マーカーＣ２１５とＳＥＡＤ（２２７Ａ）
（ＦａｂＣ２１５ＳＥＡ−Ｄ２２７Ａ）のＦａｂＳＥＡ融合蛋白質で染色した正
常乳房（胸部）。腺上皮細胞（ｇ）の強いラベルに注意。ストローマ部位（ｓ）
では如何なる反応も認められない。Ｄ．腺上皮細胞（ｇ）およびストローマ部位
（ｓ）において如何なる反応をも示さない正常乳房（胸部）のネガティブコント
ロール（一次抗体なし）。Ａにおけるバーは５０μｍを表す。Ｂにおけるバーは
５０μｍを表し、ＣおよびＤに対しても同様である。
【図９Ａ】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１で染色した結腸癌（Ａ）の準薄切片の顕微鏡写
真である。 結腸癌切片において、腫瘍細胞の基底（矢印ｂ）、先端（矢印ａ）および側面
部分の各部位は陽性に染色された。バーは３０μｍを表す。
【図９Ｂ】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１で染色した正常結腸（Ｂ）の準薄切片の顕微鏡
写真である。 正常結腸において、上皮細胞の先端表面（矢印）に陽性染色が認められる。図
９Ａにおけるバーは３０μｍを表しており、本図においても同様である。
【図９Ｃ】 正常結腸上皮細胞の電子顕微鏡写真である。 電子顕微鏡法は正常結腸上皮細胞（Ｃ、矢印）の微小絨毛の表面に免疫反応が
局在することを示す。
【図１０】 結腸癌患者および健常者個体のプラズマ成分に対する抗体ＳＥＡ融合蛋白質の
複合体形成の分析結果を示すグラフである。 高分子量領域で溶出された放射活性のパーセンテージをプロットした。結腸癌
患者のプラズマに対するＣ２４２ＦａｂＳＥＡの高い結合に注意。
【図１１】 Ｋ２９３結合アフィニティーカラムから溶出したフラクションの非還元ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析（レーン１）を示す写真である。 Ａとマークされたメジャーバンドがアミノ酸配列分析のために切り取られた。
使用した分子量標準の位置が示される。
【図１２】 Ｋ２９３アフィニティー精製で分離された３５〜４５ｋＤａ蛋白質バンド（Ａ
とラベル）の３つのトリプシン消化ペプチド断片のＮ末端配列（配列番号３〜５
）を示す図である（図１を参照）。
【図１３】 配列番号２の１、２および３のペプチド配列をグリセロアルデヒド３−リン酸
デヒドロゲナーゼ（スイスプロット・データベースのアクセッション番号Ｐ０４
４０６）の蛋白質配列と整列させた図である。
【図１４】 ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を供給されたＳＣＩＤマウス中のＬＳ−１
７４Ｔ腫瘍細胞の成長におけるＦａｂＳＥＡ融合蛋白質の免疫療法効果を示すグ
ラフである。 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１の処理後の腫瘍重量（ｍｇ）の減少に注目。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年６月３日（２００２．６．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 サブトラクション選択の原理を説明する図である。 広域反応性ファージ（黒）の特異的吸着、そしてポジティブ選択の間の洗浄に
よる非提示および非特異的ファージ（白）の減少。そして腫瘍限定ファージ（チ
ェック）が溶出される
【図２】 効率的なサブトラクション選択を示すグラフである。 子宮もしくは小腸(small bowel)組織切片上のネガティブ吸着に続くＣｏｌｏ
２０５細胞上でのポジティブ選択（Ａ）。子宮、小腸(small bowel)もしくは肺
の組織切片上での２回の反復吸着、そしてＣｏｌｏ２０５腫瘍組織切片上でのポ
ジティブ選択（Ｂ）。
【図３】 サブトラクション選択したライブラリーからの組織特異的ファージの一群の後
期濃縮を示すグラフである。
【図４】 ライブラリー選択したｓｃＦｖの免疫組織化学染色パターンを示す顕微鏡写真
である。 Ｋ３０２ ｓｃＦｖおよびＫ２９３ ｓｃＦｖ（Ｄ−Ｆ）で染色した結腸カル
シノーマ（Ａ）、結腸上皮（Ｂ）およびパイエル板（Ｃ）の染色像。Ｋ３２０
ｓｃＦｖおよびＩＩＩＤ９ ｓｃＦｖ（Ｊ、Ｋ）で染色した結腸カルシノーマ（
Ｇ）および結腸上皮（Ｈ）の染色像。Ｋ２９４ ｓｃＦｖ（Ｉ）で染色した結腸
上皮、およびＩＩＤ１１ｓｃＦｖ（Ｌ）で染色した結腸血管。
【図５】 １００ｎＭでの結腸癌（Ａ）および結腸（Ｂ）に対するＫ２９３ ｓｃＦｖ−
ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の免疫組織化学的反応性、並びに結腸癌（Ｃ）および結腸
（Ｄ）に対するＣ２１５ Ｆａｂ−ＳＥＡ（Ｄ２２７Ａ）の免疫組織化学的反応
性を示す写真である。 （Ａ）のバーは１００μｍである。
【図６】 摘出した原発性ヒト結腸カルシノーマから新規に調製した結腸癌細胞のフロー
サイトメトリー分析を示す図である。 サイズ、顆粒性（Ａ，Ｂ）および上皮細胞のマーカーとしてのＥｐ−ＣＡＭ発
現に対してゲートされた細胞は、5μｇ／ｍｌ Ｋ２９３ｓｃＦｖ−ＳＥＡ（Ｄ
２２７Ａ） (グレーライン)で染色されるか、または一次抗体を有さない融合蛋
白質ネガティブコントロール（黒ライン）によって染色された（Ｃ）。
【図７】 異なる腫瘍のＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１染色を示す顕微鏡写真である。 Ａ．腺構造中で悪性細胞（矢印）およびムチン様物質（ｍ）の双方の強い染色
性を示す中程度に分化した結腸癌の染色。Ｂ．悪性細胞の強い先端部染色（矢印
）を示す高度に分化した結腸癌の染色、一方、新生物性の小腺（neoplastic gla
ndules）（ｂ）の基底部分は非反応性である。Ｃ．乳房（胸部）腫瘍（矢印）に
おける悪性細胞の強程度染色。Ｄ．肺アデノカルシノーマ（矢印）における悪性
細胞の強程度染色。Ａでのバーは５０μｍを示し、Ｂ−Ｄに対しても同様である
。
【図８】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１染色を示す写真である。 Ａ．正常結腸のＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１染色。上皮細胞の先端部染色（
矢印）に注意。免疫反応は結腸の管腔（lumen）に面する上皮に認められたが、
陰窩（ｃ）では陰性である。Ｂ．正常乳房（胸部）のＫ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ
１１染色。低程度から中程度の染色性が腺上皮（ｇ）、および周囲のストローマ
部位（ｓ）に認められた。Ｃ．汎上皮マーカーＣ２１５とＳＥＡＤ（２２７Ａ）
（ＦａｂＣ２１５ＳＥＡ−Ｄ２２７Ａ）のＦａｂＳＥＡ融合蛋白質で染色した正
常乳房（胸部）。腺上皮細胞（ｇ）の強いラベルに注意。ストローマ部位（ｓ）
では如何なる反応も認められない。Ｄ．腺上皮細胞（ｇ）およびストローマ部位
（ｓ）において如何なる反応をも示さない正常乳房（胸部）のネガティブコント
ロール（一次抗体なし）。Ａにおけるバーは５０μｍを表す。Ｂにおけるバーは
５０μｍを表し、ＣおよびＤに対しても同様である。
【図９Ａ】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１で染色した結腸癌（Ａ）の準薄切片の顕微鏡写
真である。 結腸癌切片において、腫瘍細胞の基底（矢印ｂ）、先端（矢印ａ）および側面
部分の各部位は陽性に染色された。バーは３０μｍを表す。
【図９Ｂ】 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１で染色した正常結腸（Ｂ）の準薄切片の顕微鏡
写真である。 正常結腸において、上皮細胞の先端表面（矢印）に陽性染色が認められる。図
９Ａにおけるバーは３０μｍを表しており、本図においても同様である。
【図９Ｃ】 正常結腸上皮細胞の電子顕微鏡写真である。 電子顕微鏡法は正常結腸上皮細胞（Ｃ、矢印）の微小絨毛の表面に免疫反応が
局在することを示す。
【図１０】 結腸癌患者および健常者個体のプラズマ成分に対する抗体ＳＥＡ融合蛋白質の
複合体形成の分析結果を示すグラフである。 高分子量領域で溶出された放射活性のパーセンテージをプロットした。結腸癌
患者のプラズマに対するＣ２４２ＦａｂＳＥＡの高い結合に注意。
【図１１】 Ｋ２９３結合アフィニティーカラムから溶出したフラクションの非還元ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析（レーン１）を示す写真である。 Ａとマークされたメジャーバンドがアミノ酸配列分析のために切り取られた。
使用した分子量標準の位置が示される。
【図１２】 Ｋ２９３アフィニティー精製で分離された３５−４５ｋＤａ蛋白質バンド（Ａ
とラベル）の３つのトリプシン消化ペプチド断片のＮ末端配列（配列番号３−５
）を示す図である（図１を参照）。
【図１４】 ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を供給されたＳＣＩＤマウス中のＬＳ−１
７４Ｔ腫瘍細胞の成長におけるＦａｂＳＥＡ融合蛋白質の免疫療法効果を示すグ
ラフである。 Ｋ２９３ＦａｂＳＥＡ／Ｅ１１の処理後の腫瘍重量（ｍｇ）の減少に注目。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】削除
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８５ 45/00 47/48 ４Ｃ０８６ 47/48 48/00 ４Ｈ０４５ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ０７Ｋ 14/82 16/32 16/32 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 オールソン、レナルト・ジー スウェーデン国、エス−226・55 ルンド、 ルーデボクスベーゲン 898 (72)発明者 トルドソン、エム・イェスパー スウェーデン国、エス−224・74 ルンド、 イリオングレンデン ケー120 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA13 FB02 FB03 4B024 AA01 AA12 BA45 CA04 HA15 4B050 CC10 DD11 LL01 LL03 4C076 AA95 CC27 EE59 4C084 AA13 AA16 NA14 ZB262 4C085 AA03 AA15 BB01 EE01 EE05 EE06 FF24 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 MA05 NA14 ZB26 4H045 AA11 AA30 CA41 DA76 DA86 EA28 EA31 EA51 HA06 HA07

Claims (85)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 腫瘍細胞の中および／または表面に結合する結合構造であっ
    て、その結合構造は配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号１６０−１
    ６５ （ＣＤＲ１）， １８０−１９５ （ＣＤＲ２）， ２２８−２３８ （
    ＣＤＲ３）により本質的に定義される重鎖ＣＤＲ構造により主に決定され、一方
    、付加的な結合特異性が配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号２３−
    ３６ （ＣＤＲ１）， ５２−５８ （ＣＤＲ２）， ９１−１００ （ＣＤＲ
    ３）により本質的に定義される１以上の軽鎖ＣＤＲ構造により提供される結合構
    造。
  2. 【請求項２】 腫瘍細胞の中および／または細胞表面に結合する結合構造で
    あって、該結合構造が、配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号２３−
    ３６ （ＣＤＲ１）， ５２−５８ （ＣＤＲ２）， ９１−１００ （ＣＤＲ
    ３）を本質的に含む軽鎖に抗体の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、およ
    び配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号１６０−１６５ （ＣＤＲ１
    ）， １８０−１９５ （ＣＤＲ２）， ２２８−２３８ （ＣＤＲ３）を本質
    的に含む重鎖に該ＣＤＲ配列を含む結合構造。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造が
    前記ＣＤＲ配列の全てを含む結合構造。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３の何れか１項に記載の結合構造であって、該結
    合構造が抗体および／またはその断片である結合構造。
  5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造が
    配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号１−１１０を本質的に含む軽鎖
    の可変領域、および配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号１３０−２
    ４９を本質的に含む重鎖の可変領域、を含む抗体および／またはその断片である
    結合構造。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の結合構造であって、前記抗体が配列番号２
    に示したアミノ酸配列を含む結合構造。
  7. 【請求項７】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造が
    原発性および／または転移性の結腸直腸、膵臓、乳房（胸部）および肺のカルシ
    ノーマ細胞を含むグループから選択された上皮腫瘍細胞の中および／または細胞
    表面に強程度および／または均質に結合する結合構造。
  8. 【請求項８】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造が
    腎臓および／または前立腺カルシノーマおよび／または悪性メラノーマ細胞に対
    して低程度および／または不均質に結合する、および／または結合しない結合構
    造。
  9. 【請求項９】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造が
    結腸表面上皮および小腸（ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ）の上皮の先端部分に強程度
    に結合する結合構造。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の結合構造であって、該結合構造が結腸表
    層上皮細胞の微小絨毛および／または刷子縁の細胞表面の先端側に結合する結合
    構造。
  11. 【請求項１１】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が乳腺上皮および／またはその周囲の結合組織に低程度から中程度で結合する結
    合構造。
  12. 【請求項１２】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が脾臓、腎臓、肝臓、肺、皮膚、膵臓、甲状腺、心筋、および／またはＣＮＳを
    含む正常組織に、低程度および／または不均質に結合する、および／または結合
    しない結合構造。
  13. 【請求項１３】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    がファージ選択により提供される結合構造。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の結合構造であって、前記ファージ選択
    が、ファージ粒子上に提示されるインビボで免疫学的に予め選択されたレパート
    リーの結合構造と、異なる表現型の組織ペアの使用によるファージ粒子のサブト
    ラクション選択との組み合わせを含む結合構造。
  15. 【請求項１５】 請求項１または２に記載の結合構造であって、前記配列が
    オナガザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）起源である結合構造。
  16. 【請求項１６】 請求項１または２に記載の結合構造であって、前記配列が
    ヒト起源の対応する配列に対して、少なくとも７８％（Ｖｌ）および８６％（Ｖ
    ｈ）のアミノ酸同一性を有する結合構造。
  17. 【請求項１７】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    がヒトにおいて低免疫原性もしくは非免疫原性を有する結合構造。
  18. 【請求項１８】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、ポリペプチドに対する遺伝子的な連結により、および／または有機もしくは
    非有機化学物質に対する化学的結合により、および／またはダイメリゼーション
    、オリゴメリゼーションもしくはマルチメリゼーションにより、誘導体化されて
    いる結合構造。
  19. 【請求項１９】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、細胞毒性ポリペプチドまたは細胞毒性有機もしくは非有機化学分子に遺伝子
    的に連結した、または化学的に結合した結合構造。
  20. 【請求項２０】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、生物学的活性分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃ
    ｕｌｅｓ）と遺伝子的に連結した、または化学的に結合した結合構造。
  21. 【請求項２１】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、免疫活性化分子（ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ
    ｓ）と遺伝子的に連結した、または化学的に結合した結合構造。
  22. 【請求項２２】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、そのアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）および／またはアフィニティー（ａ
    ｆｆｉｎｉｔｙ）を増加または減少するために変更されている結合構造。
  23. 【請求項２３】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、その生産高を増加するために変更されている結合構造。
  24. 【請求項２４】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、その薬物動態特性に影響するために変更されている結合構造。
  25. 【請求項２５】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    が、それに新規薬物動態特性を付与するために変更されている結合構造。
  26. 【請求項２６】 請求項１または２に記載の結合構造であって、該結合構造
    は標識されており、その結合は特異的であると共に、非ラベル型の該結合構造に
    より阻止可能で且つ他の結合構造により阻止不可能であり、また該結合構造は他
    の特異性を有する他の結合構造の結合を阻止しない結合構造。
  27. 【請求項２７】 請求項６で定義した抗体をコードするＤＮＡ配列であって
    、該ＤＮＡ配列が配列番号１に示す配列を含むＤＮＡ配列。
  28. 【請求項２８】 腫瘍細胞の中もしくは表面に提示および／または発現され
    る標的構造であって、該標的構造は、請求項１〜２６の何れか１項で定義された
    結合構造により特異的に結合される能力、該結合構造に対して特異的に結合する
    能力、および類似する結合特性を有する他の結合構造に特異的に結合する能力を
    有する標的構造。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の標的構造であって、前記結合構造によ
    り特異的にブロックされる能力、および前記結合構造を特異的にブロックする能
    力を有する標的構造。
  30. 【請求項３０】 請求項２８に記載の標的構造であって、該標的構造は原発
    性および／または転移性の結腸直腸、膵臓、乳房（胸部）および肺のカルシノー
    マ細胞を含むグループから選択された上皮腫瘍細胞の中および／または細胞表面
    に強程度および／または均質に提示および／または発現される標的構造。
  31. 【請求項３１】 請求項２８に記載の標的構造であって、該標的構造は腎臓
    および／または前立腺のカルシノーマおよび／または悪性メラノーマにおいて、
    低程度および／または不均質に提示および／または発現される、および／または
    提示および／または発現されない標的構造。
  32. 【請求項３２】 請求項２８に記載の標的構造であって、該標的構造は結腸
    表面上皮および小腸（ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ）の上皮の先端部位に強く提示お
    よび／または発現される標的構造。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の標的構造であって、該標的構造は結腸
    表層上皮細胞の微小絨毛および／または刷子縁の細胞表面の先端側に関連して提
    示および／または発現される標的構造。
  34. 【請求項３４】 請求項２８に記載の標的構造であって、該標的構造は乳房
    の腺上皮および／またはその周囲の結合組織に低程度から中程度に提示および／
    または発現される標的構造。
  35. 【請求項３５】 請求項２８に記載の標的構造であって、該標的構造は脾臓
    、腎臓、肝臓、肺、皮膚、膵臓、甲状腺、心筋、および／またはＣＮＳを含む正
    常組織に、低程度および／または不均質に提示および／または発現され、および
    ／または提示および／または発現されない標的構造。
  36. 【請求項３６】 請求項２８に記載の標的構造であって、該標的構造の提示
    および／または発現が上皮組織に関連する標的構造。
  37. 【請求項３７】 請求項２８に記載の標的構造であって、該標的構造は、そ
    の非還元型において９０および／または２２０キロダルトンの見掛けの分子量を
    有している標的構造。
  38. 【請求項３８】 請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造の抗イ
    デオタイプであって、該抗イデオタイプは前記標的構造に対して同様の結合特異
    性を有する結合構造によって特異的に結合され、および該結合構造に対して特異
    的に結合する抗イデオタイプ。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の抗イデオタイプであって、該抗イデオ
    タイプは前記結合構造によって特異的にブロックされ、および前記結合構造を特
    異的にブロックする抗イデオタイプ。
  40. 【請求項４０】 請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造を認識
    する結合構造であって、該結合構造が有機化学性質のものである結合構造
  41. 【請求項４１】 請求項４０に記載の結合構造であって、該結合構造は請求
    項１〜２６の何れか１項で定義した結合構造の結合をブロックする結合構造。
  42. 【請求項４２】 請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造の発現
    をブロックする物質。
  43. 【請求項４３】 請求項４２に記載の物質であって、該物質がアンチセンス
    オリゴヌクレオチドおよび／またはリボザイム分子である物質。
  44. 【請求項４４】 請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造の機能
    をブロックする物質。
  45. 【請求項４５】 請求項１〜２６もしくは４０〜４１の何れか１項で定義し
    た結合構造を有効成分として含む薬学的組成物。
  46. 【請求項４６】 請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造、また
    は請求項３８もしくは３９で定義した前記標的構造の抗イデオタイプを有効成分
    として含む薬学的組成物。
  47. 【請求項４７】 請求項４２〜４４の何れか１項で定義した物質を有効成分
    として含む薬学的組成物。
  48. 【請求項４８】 請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造、また
    は請求項３８もしくは３９で定義した前記標的構造の抗イデオタイプを有効成分
    として含むワクチン組成物。
  49. 【請求項４９】 ファージ粒子上に提示されるインビボで免疫学的に予め選
    択されたレパートリーの結合構造、および異なる表現型の組織ペアの使用による
    ファージ粒子のサブトラクション選択の組み合わせを含むファージ選択の方法。
  50. 【請求項５０】 請求項４９に記載の方法であって、前記「予め選択された
    レパートリーの結合構造」が霊長類に由来する抗体である方法。
  51. 【請求項５１】 請求項４９に記載の方法であって、前記組織ペアがマッチ
    するものである方法。
  52. 【請求項５２】 請求項５１に記載の方法であって、前記「マッチした組織
    ペア」が同一の個体に由来するものである方法。
  53. 【請求項５３】 請求項４９に記載の方法であって、前記組織が凍結および
    ／またはホルマリン固定／パラフィン包埋した組織切片および／または断片およ
    び／または細胞懸濁液の形態で使用される方法。
  54. 【請求項５４】 ヒト悪性疾患のインビトロの組織病理学的な診断および予
    後予測の方法であって、サンプルが請求項１〜２６もしくは４０〜４１の何れか
    １項で定義された結合構造および指示薬と接触する方法。
  55. 【請求項５５】 請求項５４に記載の方法であって、前記サンプルが切断（
    ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）前に凍結および／またはホルマリン固定およびパラフィ
    ン包埋されている組織サンプルである方法。
  56. 【請求項５６】 腫瘍タイピングを含む、請求項５４に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 腫瘍スクリーニングを含む、請求項５４に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 腫瘍の診断および予後予測を含む、請求項５４に記載の方
    法。
  59. 【請求項５９】 前悪性状態（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉ
    ｏｎｓ）のモニタリングを含む、請求項５４に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 ヒト悪性疾患のインビトロ診断および予後予測のための方
    法であって、請求項１〜２６もしくは４０〜４１の何れか１項で定義した結合構
    造の体液中の濃度がアッセイされる方法。
  61. 【請求項６１】 ヒト悪性疾患のインビトロ診断および予後予測のための方
    法であって、請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造、または請求項
    ３８もしくは３９で定義した前記標的構造の抗イデオタイプを含む抗原の体液中
    の濃度がアッセイされる方法。
  62. 【請求項６２】 ヒト悪性疾患のインビトロ診断および予後予測のための方
    法であって、ａ）請求項２８〜３７の何れか１項で定義した標的構造、または請
    求項３８もしくは３９で定義した前記標的構造の抗イデオタイプを含む抗原、と
    ｂ）請求項１〜２６もしくは４０〜４１の何れか１項で定義した結合構造、との
    複合体の体液中の濃度がアッセイされる方法。
  63. 【請求項６３】 ヒト悪性疾患のインビボ診断および予後予測のための方法
    であって、ヒト被験者中の腫瘍沈着に対する結合構造（請求項１〜２６もしくは
    ４０〜４１の何れか１項で定義された）の局在が決定される方法。
  64. 【請求項６４】 請求項６３に記載の方法であって、前記結合構造が前記決
    定の前に前記被験者に投与される方法。
  65. 【請求項６５】 請求項６４に記載の方法であって、前記結合構造が腫瘍沈
    着に蓄積する方法。
  66. 【請求項６６】 定量的である、請求項６３〜６５の何れか１項に記載の方
    法。
  67. 【請求項６７】 ヒト悪性疾患の治療のための方法であって、請求項１〜２
    ６もしくは４０〜４１の何れか１項で定義された結合構造がヒト被験者に投与さ
    れる方法。
  68. 【請求項６８】 請求項６７に記載の方法であって、前記結合構造が分子と
    遺伝子的に連結されることにより変更されており、変更された薬物動態特性を有
    する複合分子を提供する方法。
  69. 【請求項６９】 請求項６７に記載の方法であって、前記結合構造が誘導体
    化により変更されている方法。
  70. 【請求項７０】 ヒト悪性疾患の治療のための方法であって、請求項２８〜
    ３７の何れか１項で定義した標的構造がヒト被験者に投与される方法。
  71. 【請求項７１】 請求項７０に記載の方法であって、前記標的構造に対する
    免疫反応が誘導される方法。
  72. 【請求項７２】 請求項７０に記載の方法であって、前記標的構造が遺伝子
    的および／または化学的に分子と連結されることにより変更されており、変更さ
    れた薬物動態特性を有する複合分子を提供する方法。
  73. 【請求項７３】 請求項７０に記載の方法であって、前記標的構造が遺伝子
    的および／または化学的に分子と連結されることにより変更されており、変更さ
    れた免疫原性および／または抗原性の特性を有する複合分子を提供する方法。
  74. 【請求項７４】 請求項７０に記載の方法であって、前記標的構造が誘導体
    化により変更されている方法。
  75. 【請求項７５】 請求項７０に記載の方法であって、前記標的構造が遺伝子
    的修飾により変更されている方法。
  76. 【請求項７６】 請求項７０に記載の方法であって、前記標的構造は変更さ
    れた免疫原特性を有する混合物を提供するために他の分子と混合されている方法
    。
  77. 【請求項７７】 請求項７０に記載の方法であって、前記標的構造がアジュ
    バンドと混合されている方法。
  78. 【請求項７８】 ヒト悪性疾患の治療のための方法であって、請求項４２〜
    ４４の何れか１項で定義した物質がヒト被験者に投与される方法。
  79. 【請求項７９】 請求項７８に記載の方法であって、前記物質は遺伝子的お
    よび／または化学的に分子と連結されることにより変更されている、変更された
    薬物動態特性を有する複合分子を提供する方法。
  80. 【請求項８０】 請求項７８に記載の方法であって、前記物質が誘導体化に
    より変更されている方法。
  81. 【請求項８１】 請求項７８に記載の方法であって、前記物質に対する免疫
    反応が誘導される方法。
  82. 【請求項８２】 請求項７８に記載の方法であって、前記物質が遺伝子的お
    よび／または化学的に分子に連結されることにより変更されており、変更された
    免疫原性および／または抗原性の特性を有する複合分子を提供する方法。
  83. 【請求項８３】 請求項７８に記載の方法であって、前記物質が遺伝子的修
    飾により変更されている方法。
  84. 【請求項８４】 請求項７８に記載の方法であって、前記物質が変更された
    免疫原性の特性を有する混合物を提供するために他の分子と混合されている方法
    。
  85. 【請求項８５】 請求項７８に記載の方法であって、前記物質がアジュバ
    ンドと混合されている方法。
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