KR101829401B1 - 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 코끼리조개(Panopea japonica) 암수판별 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코끼리조개(Panopea japonica)는 암수판별을 위한 비텔로제닌(Vitellogenin) 바이오 표지에 관한 것으로 본 발명에서 비텔로제닌 유래 단백질을 이용한 항체는 외형적 구분이 되지 않아 해부 및 현미경적 관찰이 필요한 코끼리조개의 암수판별에 있어서 현미경적으로도 암수 확인이 되지 않는 성숙개체에서 암컷에만 존재하는 비텔로제닌 단백질에 결합하여 판별이 가능한 것을 확인하였다. 이에 상기 비텔로제닌 유래 단백질은 코끼리조개의 암컷을 식별하는 효과를 갖고 있어 코끼리조개 암수판별용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 코끼리조개(Panopea japonica) 암수판별 용도{Vitellogenin protein specific antibody and uses thereof for determining of Panopea japonica}

본 발명은 비텔로제닌(Vitellogenin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 코끼리조개(Panopea japonica) 암수판별 용도에 관한 것이다.

코끼리조개(Panopea japonica)는 이매패강(Bivalvia) 우럭목(Myoida) 족사부착쇄조개과 (Hiatellidae)에 속하는 조개로 수관이 큼지막하고 조개 껍질 안으로 몸이 다 들어가지 않는 외형을 갖고 있다. 코끼리 조개를 영어권에서는 구이덕(Geoduck), 일본에서는 미루가이(ミルガイ), 중국에서는 상발방(象拔蚌, 말조개)등으로 부르고 있으며, 일반 조개보다 훨씬 쫀득하고 달짝지근하면서도 새우나 게처럼 기름기 없이 담백한 맛을 지녔으며, 향 및 식감도 좋아 중국 홍콩 일본의 미식가들에게도 최고급 요리로 평가받지만 수심 20~30m의 모래 속에 살며, 뻘 속에 들어가 살기 때문에 눈에 잘 띄지 않아 잠수부가 물을 고압으로 뿌려대며 하나씩 찾아야 해 그 희소성으로 인해 최고급 레스토랑이나 일식집 등에서 고급 메뉴로 나오다가, 미식인구의 증가와 함께 점차 인구에 회자 되면서 수요가 증가해 경제성 높은 수산물로 부각되고 있다.

그러나, 전술한 바와 같이 코끼리조개는 채집이 쉽지 않으며, 상업적으로 잡기 시작한 1970년대 이래 남획으로 인해 1996년에 176t으로 최고 생산량을 기록한 후, 자원이 지속적으로 감소해 2006년부터 현재까지 생산이 미미한 실정이다. 이때문 국내에서는 4월부터 7월까지는 수산자원 보호를 위하여 채취가 금지되어 있으며, 양식 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 코끼리조개는 단위 면적당 양식효율이 아주 높은 고가의 종으로 2005년 이후 아시아와 북미에서 수요가 점점 증가하는 추세이며 코끼리조개를 양식하는 나라는 많지 않으므로 패류 양식 산업에 경쟁력 있는 양식종이 될 수 있다.

조개의 종묘 생산을 위한 연구와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0947742호에서는 흑진주 조개의 번식량을 예측하기 위한 흑진주 조개 알 추출물의 항원 단백질과 이에 특이적인 항체 및 이를 이용하여 흑진주를 생산하는 흑진주 조개의 효율적 관리 및 생활사 연구에 적용이 가능함을 개시하고 있다. 코끼리조개에 관해서는 인공 종묘 생산시 산란유발 및 알 발생, 서식상태, 섭식활동과 환경내성 등의 선행 연구가 있으나 암수판별을 이용한 어미의 인공 종묘 생산에 관한 연구는 미흡한 실정이다. 이러한 점에서 양식으로 자연 채묘 및 종패 확보가 어려우므로 인공 종묘의 생산을 위하여 양식 기술 개발이 필요하고, 효율적으로 인공종묘를 대량생산하기 위해서는 암컷만을 선별하여 산란을 유도하는 방법이 필요하나 코끼리조개는 외관상 암수 구별이 어려워 해부를 통해 현미경상으로 생식 세포를 확인하는 등의 절차를 통해 암수를 판별하여야 한다.

비텔로제닌(vitellogenin; 어류 난황단백질)은 무척추동물에서 척추동물에 이르기까지 난생동물의 알의 구성 성분인 난황의 전구물질로서 여포세포에서 분비되는 에스트로겐(estrogen)의 자극을 받아 간에서 합성된 후 혈액을 통해 난소로 이동되는 단백질이다. 비텔로제닌은 암컷에서만 생성되는 단백질로 암수를 판별하는 지표 물질이 될 수 있으며, 선행연구들을 통해 외부로부터 에스트로겐 활성을 가지는 내분비계 교란물질들의 검출을 평가할 수 있는 생체 바이오 지표로서 많은 연구가 되어있다. 국내외에서 송어, 연어, 넙치, 게 등을 비롯한 다양한 난생 동물의 환경평가의 바이오 지표로서 비텔로제닌이 활용이 되고 있지만 코끼리조개와 같이 해부를 통해서만 암수가 판별이 되는 패류에는 표지 물질로서의 연구는 미흡한 실정이다.

이에 본 발명자들은 코끼리조개의 대량 생산을 위한 암수판별 바이오 표지로서 비텔로제닌의 항체를 개발하였으며, 현미경상으로도 확인이 안되는 개체에 대해서도 성 판별이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0947742호

본 발명의 목적은 비텔로제닌(Vitellogenin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 코끼리조개(Panopea japonica) 암수판별 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는, 코끼리조개의 암수판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

a) 코끼리조개의 생물학적 시료를 채취하는 단계;

b) 상기 단계 a)의 생물학적 시료와 제 1항의 항체를 반응시키는 단계; 및

c) 상기 단계 b)에서 항체 반응시 암컷으로 판단하는 단계를 포함하는, 코끼리조개의 암수판별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터를 대장균에 주입하는 단계; 및

b) 상기 a의 대장균에서 발현된 단백질을 인간을 제외한 포유류에 주입하는 단계를 포함하는 코끼리조개의 암수판별용 다클론 항체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 코끼리조개 유래 비텔로제닌 특이적 항체는 외형적 구분이 되지 않아 해부 및 현미경적 관찰이 필요한 코끼리조개의 암수판별에 있어서 현미경적으로도 암수 확인이 되지 않는 성숙개체에서 암컷에만 존재하는 비텔로제닌 단백질에 결합함을 확인하였다. 이에 상기 항체는 코끼리조개의 암컷을 식별하는 효과를 갖고 있어 코끼리조개 암수판별용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 황산암모늄 처리 전후의 단백질 분리 차이를 나타낸 결과이다.
도 2는 본 실시예에 따른 암컷에서만 존재하는 비텔로제닌을 나타낸 결과이다.
·F1, F2: 암컷 생식세포 단백질
·M1, M2: 수컷 생식세포 단백질
도 3은 본 실시예에 따라 정제된 비텔로제닌을 나타낸 결과이다.
·F1, F2: 암컷 생식세포 단백질
·M1, M2: 수컷 생식세포 단백질
·VTG: 정제된 비텔로제닌 단백질
도 4는 본 실시예에 따라 확인된 비텔로제닌의 염기 및 아미노산 일부 서열을 굴(oyster) 및 가리비(scallop)와 비교한 것이다. (A: 염기 서열의 비교, B: 아미노산 서열의 비교)
도 5는 본 실시예에 따른 재조합 대장균에서 합성된 단백질을 나타낸다.
도 6은 본 실시예에 따른 코끼리조개의 비텔로제닌 항체를 비교한 결과를 나타낸다. (A: 생식세포에서 추출된 단백질을 이용한 항체, B: 재조합된 대장균에서 합성된 단백질을 이용한 항체)
·F: 암컷 생식세포 단백질
·M: 수컷 생식세포 단백질
도 7은 본 실시예에 따른 비텔로제닌의 농도에 대한 표준검량곡선을 나타낸다. (A: 비텔로제닌의 농도별 ELISA 측정 결과, B: A에 대한 표준검량곡선)
도 8 내지 13은 각각 해당 샘플 그룹의 ELISA 측정 결과를 나타낸다. (C: control, F: female, M: male, ND: No Detection)
·C: 반응시키지 않은 대조구
·F: 현미경상으로 암컷으로 확인된 것
·M: 현미경상으로 수컷으로 확인된 것

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체를 제공한다.

상기 비텔로제닌 단백질은 코끼리조개로부터 유래한 것이다.

본 발명의 항체는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하고, 상기 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체이다. 또한, 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab' F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 암컷에서만 존재하는 비텔로제닌 단백질을 분리 및 정제하였으며(도 2 및 3), 비텔로제닌의 일부 DNA 서열을 확인하고(도 4), 단백질을 합성한 후(도 5), 이를 이용해 비텔로제닌 특이적 항체를 만들었다(도 7). 상기 비텔로제닌 항체는 현미경적으로도 암컷의 판별이 곤란한 개체에 대해서도 유효한 효과를 나타내었다(도 8 내지 13).

따라서 본 발명에 의한 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체는 코끼리조개의 암수판별 용도에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는, 코끼리조개의 암수판별용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 비텔로제닌(Vitellogenin) 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체를 포함하는, 코끼리조개의 암수판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에는 비텔로제닌 단백질의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 비텔로제닌 단백질을 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 비텔로제닌 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민),TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

상기 키트는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정될 수 있으나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 키트는 상기 비텔로제닌 단백질에 결합하는 1차 획득 시약(capture reagent) 및 1차 획득시약에 결합하지 않는 2차 획득 시약을 포함할 수 있다.

상기 1차 획득시약은 항체 또는 금속킬레이트, 바람직하게는 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체이고, 2차 획득시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드로 표지한 접합체(conjugate)로 2차 항체이다. 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일,디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸이 가능하다.

개체로부터 수득된 시료를 1차 획득시약, 바람직하게는 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될수 있고 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형상에 고정될 수 있다. 고형상은 유리나 플라스틱 예를 들어 미세역가 플레이트(microtiter plate), 막대, 비드(bead) 또는 미세비드(microbead) 등이 될 수 있다. 항체는 또한 프로브 기질이나 단백질 칩에 결합될 수 있다. 시료를 항체와 정온 배치한 후 세척하여 항체-마커 복합체를 측정할 수 있다. 이는 세척된 혼합물을 2차 획득시약, 바람직하게는 2차 항체와 정온 배치하여 수행된다. 항체-마커 복합체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다. 상기 방법 외에도 시료 내의 단백질 마커는 간접적인 분석방법 예를 들어, 단백질 마커의 다른 에피토프에 결합하는 모노클론 항체와 경쟁 또는 억제 반응 분석을 실시하여 검출할 수 있다.

상기 항체-마커 복합체란 시료 중의 비텔로제닌 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항체-마커 복합체의 형성은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassy, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블랏, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항체-마커 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위 원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

상기 암수판별용 키트는 바람직하게 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 암컷에서만 존재하는 비텔로제닌 단백질을 분리 및 정제하였으며(도 2 및 3), 비텔로제닌의 일부 DNA 서열을 확인하고(도 4), 단백질을 합성한 후(도 5), 이를 이용해 비텔로제닌 특이적 항체를 만들었다(도 7). 상기 비텔로제닌 항체는 현미경적으로도 암컷의 판별이 곤란한 개체에 대해서도 유효한 효과를 나타내었다(도 8 내지 13).

따라서 본 발명에 의한 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물 및 키트는 코끼리조개의 암수판별 용도에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터를 인간을 제외한 포유류에 주입하는 단계를 포함하는, 코끼리조개의 암수판별용 다클론 항체의 제조방법을 제공한다.

상기 벡터는 형질전환될 수 있으며, 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주입(microinjection), 형질 도입(transduction), 전기충격 유전자전달법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 원형질융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, 리포좀 매개 형질감염(liposemmediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 형질 감염(polybrene-mediated transfection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다. 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아파스토리스(Pichiapastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사(Neurosporacrassa))등과 같은 하등 진핵세포, 곤충세포, 식물세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질의 과발현을 위해서, IPTG(isopropylthiogalactoside)를 0.1 내지 1mM 처리하고 단백질 발현을 1시간 내지 20시간 동안 유도할 수 있다. 바람직하게는 재조합 단백질의 과발현 유도를 위하여 1mM의 IPTG를 처리한 후, 12시간 동안 발현을 유도하여 재조합 단백질의 과발현을 유도할 수 있다.

상기 단백질은 히스티딘 융합 재조합 단백질로 제조될 수 있으며, 히스티딘 융합 재조합 단백질의 정제는 각 도메인 별로 히스티딘 융합 재조합 단백질의 발현을 유도한 후, 용해 완충액에 넣고 초음파 분쇄를 거친 후, 순수 정제함으로써 이루어질 수 있다. 이를 위하여 pH 7.0 완충액으로 평형시킨 코발트 수지에 재조합 단백질을 포함하는 상층액을 반응시켜 컬럼을 이용하여 분리해 낼 수 있으며, 세척 완충액을 단계적으로 사용하여 비특이적 단백질을 제거할 수 있다. 순수 정제된 재조합 단백질 중 비텔로제닌 특이적 재조합 단백질은 용출 완충액으로 추출하여 얻는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 인간을 제외한 포유류는 바람직하게는 토끼, 쥐, 기니피그, 햄스터, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 고릴라일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 히스티딘 융합 재조합 단백질의 주입에 의하여, 인간을 제외한 포유류에서는 비텔로제닌 단백질을 항원으로 인식하여 면역 반응이 유도되며, 체액성 면역반응에 의하여 항원-항체 특이적 결합반응이 일어나, 비텔로제닌 특이적인 항체를 생성할 수 있다.

상기의 제조방법을 이용하면, 비텔로제닌 단백질을 특이적으로 과발현시키고 이를 효과적으로 정제하고 수득하여, 인간을 제외한 포유류에 주입함으로써, 비텔로제닌 단백질에 대한 특이적인 항원-항체 반응을 유도하여, 항체 역가가 매우 높은 인간 비텔로제닌 특이적인 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 암컷에서만 존재하는 비텔로제닌 단백질을 분리 및 정제하였으며(도 2 및 3), 비텔로제닌의 일부 DNA 서열을 확인하고(도 4), 단백질을 합성한 후(도 5), 이를 이용해 비텔로제닌 특이적 항체를 만들었다(도 7). 상기 비텔로제닌 항체는 현미경적으로도 암컷의 판별이 곤란한 개체에 대해서도 유효한 효과를 나타내었다(도 8 내지 13).

따라서 본 발명에 의한 다클론 항체의 제조방법은 코끼리조개의 암수판별에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 a) 코끼리조개의 생물학적 시료를 채취하는 단계; b) 상기 단계 a)의 생물학적 시료와 제 1항의 항체를 반응시키는 단계; 및 c) 상기 단계 b)에서 항체 반응시 암컷으로 판단하는 단계를 포함하는, 코끼리조개의 암수판별 방법을 제공한다.

상기 a)의 생물학적 시료는 체액, 조직, 세포 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.

단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 코끼리조개에서 비텔로제닌 ( VTG ) 분리 및 정제

코끼리조개의 생식세포에서 체액을 채취하여 세포 용해 완충 용액으로 세포 안의 단백질들을 추출하고, 35% 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)으로 용해도가 낮은 물질들을 침전시키고, 다시 분리했다.

구체적으로는 성숙한 코끼리조개의 생식 세포 체액을 채취하여 체액 100ml당 1X PBS(Phosphate Buffer Saline) 10ml을 첨가한 후 1200 rpm, 4℃, 5 min 조건으로 원심분리를 하여 상층액을 버리고 pellet을 얻었다. 상기 pellet에 1X PBS 5ml을 가한 뒤, 이를 현탁하고 다시 1200 rpm, 4℃, 5 min 조건으로 원심분리를 하여 상층액을 버리고 pellet을 얻은 후, 상기 pellet에 1X PBS 1ml을 가한 뒤, 이를 현탁하고 다시 3000 rpm, 4℃, 5 min 조건에서 원심분리를 하여 상층액을 버려서 washing된 pellet을 얻었다. 상기 pellet에 Lysis buffer(1% NP-40, 150mM Tris-HCl(pH7.6), 1mM PMSF)를 1ml 첨가해 재현탁하고, 13000 rpm, 4℃, 1 hr 조건으로 원심분리를 하여 추출한 상층액에 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)을 35%가 되도록 천천히 첨가 및 혼합하면서 2시간 가량 교반시켜 침전을 형성시키고, 이를 3000 rpm, 4℃, 5 min 조건에서 원심분리를 하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액은 1l의 HEPES buffer로 12시간동안 투석(dialysis)시켰다. 그 결과, 도 1과 같이 구분이 뚜렷하게 된 단백질들을 얻었다. 종래에 굴, 전복, 가리비의 비텔로제닌 단백질 분자량이 240~250 kDa으로 알려져있어 코끼리조개의 분자량도 비슷할 것으로 예측하고 그 부분에서 암수 차이가 나는 단백질을 8% 아크릴아마이드 겔(30% acrylamide Mix, 1.5M Tris(pH8.8), 10% SDS, 10% APS, TEMED)에서 찾아 도2와 같이 비텔로제닌으로 추정되는 밴드를 찾아냈다.

상기 밴드를 Separating gel(30% acrylamide Mix, 1.5M Tris(pH8.8), 10% SDS, 10% APS, TEMED)과 Stacking gel(30% acrylamide Mix, 1.5M Tris(pH6.8), 10% SDS, 10% APS, TEMED)을 이용해 VTG 단백질을 분리 및 정제하였으며, 도 3과 같이 정제된 단백질을 확인하였다.

실시예 2. 대장균에서 코끼리조개의 비텔로제닌 단백질 합성

코끼리조개 암컷의 생식세포에서 TRIzol (Thermo Fisher Scientific)을 이용해 total RNA를 추출한 후 Genebank에서 굴, 전복, 가리비의 비텔로제닌 DNA 서열을 검색 후 참조하고, 표 1과 같이 프라이머를 제작하여 cDNA를 합성한 후 RT-PCR을 실시하고, 도 4와 같이 코끼리조개 비텔로제닌의 일부 DNA 서열을 확인했다.

프라이머	서열(5'-3')
sense	TNACCGGNATNCCNANGGG
anti-sense	TCTGATNANCGTCNCACA

RT-PCR에서 얻어진 코끼리조개 비텔로제닌 DNA 서열을 단백질 발현 벡터인 pET21b+ 벡터에 삽입하고 BL21(DE3) 균주에서 형질 전환시켰다. 상기 pET21b+ 벡터는 C-말단에 Hig-tag이 붙어 있어 니켈과의 친화력으로 니켈 컬럼에서 단백질 정제가 용이한 특징을 갖는다. 이후 LB broth 배지에서 37℃, 180rpm으로 OD₆₀₀에서 0.6이 될 때까지 키운 후 1mM 농도의 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가해 단백질 생산을 유도하고 4시간 동안 30℃, 90rpm으로 키운 다음 단백질 발현을 확인했다. 비텔로제닌 단백질의 일부분을 발현한 후 15% 아크릴아마이드 겔에서 Tricine 버퍼를 사용하여 전기영동으로 도 5와 같이 단백질의 생성을 확인했다.

실시예 3. 코끼리조개의 비텔로제닌 항체 제작

상기 실시예 2를 통해 얻은 대장균에서 합성한 비텔로제닌 단백질을 항원으로 하여 FCA(Freund's complete adjuvant, Merck Millipore)와 섞어서 emulsion 상태로 만들고, 이를 생후 6주 된 암컷 BALB/c 마우스 복강에 100㎍ 주사하여 초회 면역을 유도하고, 2주 후 IFA(Incomplete Freund's adjuvant, Merck Millipore)을 다시 복강에 주사하였으며, 다시 1주 간격으로 3회씩 비텔로제닌 단백질을 주사하여 추가 면역을 유도했다. 상기 추가 면역 유도된 마우스를 10일 후 sacrifice한 뒤 혈청을 분리하고, 이온교환수지 정제법을 이용해 폴리클론(polyclonal) 항체를 획득하였다.

상기 항체의 비텔로제닌에 대한 특이성을 확인하기 위하여 웨스턴 블로팅을 시행하였다. 웨스턴 블롯을 실시하기 위하여 RIPA(Raioimmunoprecipitation assay) 버퍼(50 mM of Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM of NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS 및 protease inhibitor(Sigma-Aldrich))를 이용하여 코끼리조개의 생식세포를 갈아준 후 14000 rpm, 10 분, 4℃에서 고속원심분리 후 상층액을 취하여 단백질 정량을 실시하고, 50 ㎍의 단백질을 6X sample loading buffer(150 mM, Tris-Cl, pH 6.8, 6% SDS, 12% 2-mercaptoethanol, 30% glycerol, 0.1% bromophenol blue)에 넣고 95℃에서 5 분간 끓였다. 그 후 8% SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전이(transfer)시켰다. 5% BSA(bovine serum albumin)가 함유된 1X TBS(Tris-Buffered Saline)로 1시간동안 블로킹한 후, 일차 항체로 상기 실시예로 만들어진 비텔로제닌 항체를 4 ℃에서 밤새 반응 시키고, 1X TBST (with 0.05% tween20)를 이용하여 4 회 세척(washing) 후 이차 항체로 anti-mouse-HRP(Jackson Laboratory)를 실온에서 1 시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)과 chemidoc system (Biorad)을 이용하여 단백질 발현을 측정하였다.

또한, 비교를 위해 실시예 1을 통해 얻은 코끼리조개의 체액에서 분리한 비텔로제닌 단백질을 항원으로 하여 대장균에서 합성한 비텔로제닌 단백질에 대한 상기 항체와 같이 BALB/c 마우스 복강에 주사하여 폴리클론 항체를 획득하여 상기와 동일한 웨스턴 블로팅을 시행하였다.

그 결과, 도 6과 같이 실시예 2의 비텔로제닌 단백질에 대한 항체(도 6B)는 실시예 1의 합성된 비텔로제닌 단백질에 대한 항체(도 6A)와 마찬가지로 암컷에서 비텔로제닌 단백질을 검출하는 것으로 확인되었다.

실험예 1. 비텔로제닌 항체를 이용한 코끼리조개 체액에서의 암수판별

상기 실시예 3에서 제작한 비텔로제닌 항체를 이용하여 코끼리조개의 암수를 구분하였다.

실험예 1-1. 비텔로제닌 단백질 농도 측정용의 표준검량곡선 작성

실제 코끼리조개의 비텔로제닌 단백질 측정을 위하여 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 시행하였다.

구체적으로 상기 실시예 2의 비텔로제닌 단백질을 96 well plate에 농도별로 코팅하고 PBS 완충용액으로 세척한 다음 생산된 폴리클론항체를 HRP-conjugated secondary 항체와 발색제를 처리해 흡광도를 측정농도별로 표준검량 곡선을 작성하였다.

그 결과 도 7과 같이 비텔로제닌의 농도는 Y=0.029X+0.059의 계산식으로 나타났다.

실험예 1-2. 비텔로제닌 항체를 이용한 암수의 판별

실제 코끼리조개를 대상으로 해부를 통한 암수의 판별과 항체를 이용한 암수판별을 비교 실험하였다. 해부를 통한 판별을 위해 개체별로 길이와 무게를 잰 후 해부를 하였으며, 생식 세포가 위치해 있는 조직을 칼로 긁어서 현미경으로 확인을 하였다. 이와 별도로 코끼리조개로부터 주사기를 이용하여 생식세포가 위치해 있는 부위로부터 체액을 채취 후 항체를 이용한 판별용으로 사용하였다. 하기 표2와 같이 성숙도가 다른 6개 그룹을 대상으로 항체를 이용해 암수를 판별하였으며 각기 3 반복으로 시행하였다.

group	개체수	무게 및 길이	특징
A	5	무게 100~150g, 길이 ±10cm	아직 성숙하지 않은 단계이며, 현미경상으로도 암수 구분이 어려움
B	20	무게 200~350g, 길이 ±11cm	개체와 조직은 성숙했지만, 현미경상으로도 암수 구분이 어려움
C	10	무게 200~450g, 길이 ±11cm	현미경에서 암컷에서의 난황 생성 확인되나, 일부 개체는 현미경상으로도 암수 구분이 어려움
D	10	무게 200~400g, 길이 +10cm	일부는 현미경에서 암수의 구분 가능하나, 일부 개체는 현미경상으로도 암수 구분이 어려움
E	10	무게 150~300g, 길이 +10cm	일부는 현미경에서 암수의 구분 가능하나, 일부 개체는 현미경상으로도 암수 구분이 어려우며, 암컷은 확인되지 않음
F	10	무게 200~350g, 길이 ±10cm	일부는 현미경에서 암수의 구분 가능하나, 일부 암컷은 난황 퇴화. 현미경상으로도 암수 구분이 어려운 개체 존재함

그룹 A는 하기 도 8 및 표 3과 같이 아직 완전히 성숙되지 않은 개체로써 암컷이 검출되지 않았다(N: 성별 확인 불명, ND: 검출되지 않음, F, 암컷, M: 수컷).

개체번호	현미경상 성별	항체처리 결과
		단백질 평균농도 (ng/ml)	항체 반응상 성별
1	N	ND	N
2	N	ND	N
3	N	ND	N
4	N	ND	N
5	N	ND	N

그룹 B는 하기 도 9 및 표 4와 같이 현미경상으로는 암컷을 구분할 수 없었으나, ELISA 테스트결과 11개의 샘플에서 암컷임이 나타났다. 농도 범위는 평균 2.25~6.47ng/ml 였다(N: 성별 확인 불명, ND: 검출되지 않음, F, 암컷, M: 수컷).

개체번호	현미경상 성별	항체처리 결과
		단백질 평균농도 (ng/ml)	항체 반응상 성별
1	N	ND	M
2	N	3.283759	F
3	N	ND	M
4	N	3.3642	F
5	N	4.846977	F
6	N	4.387207	F
7	N	ND	M
8	N	ND	M
9	N	5.732034	F
10	N	6.466069	F
11	N	ND	M
12	N	2.892954	F
13	N	ND	M
14	N	ND	M
15	N	4.433184	F
16	N	2.249276	F
17	N	ND	M
18	N	5.111345	F
19	N	4.490655	F
20	N	ND	N

그룹 C는 하기 도 10 및 표 5와 같이 현미경상으로는 암컷을 구분할 수 없었던 개체들중에서 ELISA 테스트 결과 1개의 샘플에서 암컷임이 나타났다. 현미경상에서 암컷임이 확인된 샘플에서는 90.9~148ng/ml, 현미경상에서 구분이 되지 않았던 샘플에서 평균농도 17.8 ng/ml이 검출되었다(N: 성별 확인 불명, ND: 검출되지 않음, F, 암컷, M: 수컷).

개체번호	현미경상 성별	항체처리 결과
		단백질 평균농도 (ng/ml)	항체 반응상 성별
1	F	99.60911	F
2	N	ND	M
3	N	17.77804	F
4	M	ND	M
5	N	ND	M
6	F	90.9237	F
7	F	102.1695	F
8	N	ND	M
9	F	99.37488	F
10	F	148.09542	F

그룹 D는 하기 도 11 및 표 6과 같이 현미경상으로는 암컷을 구분할 수 없었던 개체들 중에서 ELISA 테스트 결과 1개의 샘플에서 암컷임이 나타났다. 현미경상에서 암컷임이 확인된 샘플에서는 50.0~270.6ng/ml, 현미경상에서 구분이 되지 않았던 샘플에서 평균농도 6.62ng/ml이 검출되었다(N: 성별 확인 불명, ND: 검출되지 않음, F, 암컷, M: 수컷).

개체번호	현미경상 성별	항체처리 결과
		단백질 평균농도 (ng/ml)	항체 반응상 성별
1	F	215.1132	F
2	F	50.02957	F
3	N	ND	M
4	M	ND	M
5	F	206.7905	F
6	F	189.22097	F
7	M	ND	M
8	N	ND	M
9	F	270.6014	F
10	N	6.620579	F

그룹 E는 하기 도 12 및 표 7과 같이 현미경상으로는 암컷을 구분할 수 없었던 개체들 중에서 ELISA 테스트 결과 2개의 샘플에서 암컷임이 나타났다. 현미경상에서 구분되지 않은 암컷의 평균농도는 3.71~3.87ng/ml으로 검출되었다(N: 성별 확인 불명, ND: 검출되지 않음, F, 암컷, M: 수컷).

개체번호	현미경상 성별	항체처리 결과
		단백질 평균농도 (ng/ml)	항체 반응상 성별
1	N	ND	M
2	M	ND	M
3	M	ND	M
4	M	ND	M
5	N	ND	M
6	N	3.715086	F
7	M	ND	M
8	M	ND	M
9	N	3.875039	F
10	M	ND	M

그룹 F는 하기 도 13 및 표 8과 같이 현미경상으로는 암컷을 구분할 수 없었던 개체에서 ELISA 테스트 결과 암컷이 나타나지 않았으며 현미경상에서 암컷임이 확인된 개체에서는 평균농도 6.67~42ng/ml이 검출되었다(N: 성별 확인 불명, ND: 검출되지 않음, F, 암컷, M: 수컷).

개체번호	현미경상 성별	항체처리 결과
		단백질 평균농도 (ng/ml)	항체 반응상 성별
1	M	ND	M
2	F	30.22013	F
3	M	ND	M
4	N	ND	M
5	N	ND	M
6	F	6.667944	F
7	F	32.40868	F
8	F	41.86996	F
9	F	30.13932	F
10	N	ND	M

상기와 같이 성숙된 개체 중 현미경상에서 암수 구별이 되지 않는 개체에 대해서도 비텔로제닌 항체를 통해 암컷을 확인할 수 있는 것으로 나타났다.

<110> National Institute of Fisheries Science <120> Vitellogenin protein specific antibody and uses thereof for determining of Panopea japonica <130> 2017S-04-028 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <400> 1 Thr Gly Ile Pro Gly Gly Ser Lys Ile Arg Ser Gly Met Gln Trp Lys 1 5 10 15 Ser Gly Val Arg Leu Gln Leu Lys Thr Ser Ser Arg Thr Ala Leu Gly 20 25 30 Leu Asp Lys Val Gln Ile Pro Lys Ile Asn Glu Ile Cys Glu Trp Leu 35 40 45 Asp Pro Thr Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asp Met Leu Gly Gln Leu Thr 50 55 60 Ser Gln Asp Val Glu His Ile Val Gly Asn Leu Gly Ala Arg Ile Asn 65 70 75 80 Phe Arg Tyr Val Arg Ser Thr Val Ile Ala Leu Gln Arg Glu Ala Asp 85 90 95 Asp Thr Glu Cys Ser Ala Asn Phe Lys Arg Gly Leu Leu Ser Met Leu 100 105 110 Glu Met Asn Leu Asp Glu Gly Glu 115 120

Claims (7)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 파노패아 자포니카(Panopea japonica) 유래 비텔로제닌(Vitellogenin) 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체.
   
2. 삭제
3. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 파노패아 자포니카(Panopea japonica) 유래 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는, 코끼리조개의 암수판별용 조성물.
   
4. a) 코끼리조개의 생물학적 시료를 채취하는 단계;
   b) 상기 단계 a)의 생물학적 시료와 제 1항의 항체를 반응시키는 단계; 및
   c) 상기 단계 b)에서 항체 반응시 암컷으로 판단하는 단계를 포함하는, 코끼리조개의 암수판별 방법.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 단계 a)의 생물학적 시료는 체액, 조직, 세포 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 코끼리조개의 암수판별 방법.
   
6. 제 1항의 다클론 항체를 포함하는, 코끼리조개의 암수판별용 키트.
   
7. a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터를 대장균에 주입하는 단계; 및
   b) 상기 단계 a)의 대장균에서 발현된 단백질을 인간을 제외한 포유류에 주입하는 단계를 포함하는, 코끼리조개의 암수판별용 다클론 항체의 제조방법.

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