CN104961827A - 农用化学品的特异性输送 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及向植物特异性输送农用化学品。更具体来说，它涉及基本上由靶向剂和农用化学品或农用化学品组合组成的组合物，所述靶向剂包含至少一个可特异地与完整活植物上的结合位点结合的结合结构域。本发明还涉及特异地与所述完整活植物上的结合位点结合的结合结构域。更具体来说，涉及结合结构域，其含有包含4个框架区和3个互补决定区或其任何合适的片段的氨基酸序列，其中所述结合结构域能够使载体结合或保留在植物上。在一个优选的实施方案中，本发明涉及结合结构域，其特异地结合表皮毛、气孔、角质层、皮孔、棘、刺、根毛或蜡质层。本发明还涉及向植物输送农用化学品的方法，其用于改善农用化学品在植物上的沉积，并用于使所述农用化学品保留在植物上(其使用包含所述结合结构域的靶向剂)，和涉及使用同样的化学品保护植物免受生物和非生物胁迫或控制植物生长的方法。本发明还涉及用于制造特异性靶向的农用化学品载体的方法。

Description

农用化学品的特异性输送
本发明是申请日为2011年4月6日，申请号为201180027994.0，标题为“农用化学品的特异性输送”的专利申请的分案申请。
本发明涉及向植物特异性输送农用化学品。更具体来说，它涉及基本上由靶向剂和农用化学品或农用化学品的组合组成的组合物，所述靶向剂包含至少一个可特异地与完整活植物上的结合位点结合的结合结构域。本发明还涉及特异地与所述完整活植物上的结合位点结合的结合结构域。更具体来说，涉及结合结构域，其含有包含4个框架区和3个互补决定区或其任何合适的片段的氨基酸序列，其中所述结合结构域能够使载体结合或保留在植物上。在一个优选的实施方案中，本发明涉及结合结构域，其特异地结合表皮毛(trichome)、气孔、角质层(cuticle)、皮孔、棘(thorn)、刺(spine)、根毛或蜡质层。本发明还涉及用于向植物输送农用化学品的方法，其用于改善农用化学品在植物上的沉积，并用于使所述农用化学品保留在植物上(其使用包含所述结合结构域的靶向剂)，和涉及使用同样的化学品保护植物免受生物和非生物胁迫或控制植物生长的方法。本发明还涉及用于制造特异性靶向的农用化学品载体的方法。
许多年来，园艺家和农学家已通过大田喷施将化学品应用于杂草防治、植物保护和植物生长调节。对需要应用于植物(例如叶)的组合物来说，仅小部分组合物结合并保留在其可发挥生物学活性的植物部分上，而大量组合物没有附着于植物表面，并通过滴落或被雨水冲走而损失。除了引起化学品的效力降低，由于在喷施时从植物滴落至土壤中或由于降雨过程中的冲刷引起的化学品损失可能导致地下水污染、环境破坏、生物多样性丧失以及人和动物的健康后果。
若干研究者已尝试通过向植物应用可粘着于叶并在一段时间内释放它们的内容物的缓释颗粒来解决此问题。US 6180141描述了可用于输送植物保护活性成分的复合凝胶微粒。WO 2005102045描述了包含至少一种植物活性化合物和包囊化佐剂的组合物，其中所述佐剂包含真菌细胞或其片段。US 20070280981描述了载体颗粒，其表面包被有亲脂性增粘剂，由此载体颗粒附着于植物、禾本草和杂草表面。
这些旨在输送农用化学品的微粒的特征在于，它们通过非常弱的、非特异的相互作用，例如亲脂性相互作用粘着于植物。尽管其与正常喷施相比具有优势，这样的输送方法的效力仍然是有限的，并且所述颗粒可能非最优地分布于叶，或在化合物的释放完成之前就在自然多变的气候条件下被冲走。为了微粒的特异性分布和保留效率，需要特异的、强烈的结合分子，其可保证载体粘着于植物直至其内容物完全输送。
纤维素结合结构域(CBD)已被描述为对将分子物质连接于纤维素有用的试剂(US 5738984和US 6124117)。事实上，由于棉花的90％由纤维素组成，已证明CBD对将所谓的“效益剂(benefit agent)”输送至棉花组织(cotton fabrics)上是有用的，如在WO 9800500中所公开，其中使用直接融合的CBD和酶以利用CBD的亲和力来与棉花组织结合。WO 03031477要求了相似的多功能融合蛋白用于传输包囊化的效益剂的用途的权利，其中所述多功能融合蛋白质由第一结合结构域(其为碳水化合物结合结构域)和第二结合结构域组成，其中第一结合结构域或第二结合结构域可与微粒结合。WO 03031477示例性地使用了双功能融合蛋白，其由CBD和结合微粒的抗RR6抗体片段组成，其中复合物沉积于棉花表面(cotton treads)或李氏禾(cut grass)上。然而，这样的多功能融合蛋白用于输送包囊化的效益剂的用途具有许多严重的缺陷：第一，尽管纤维素是植物细胞壁的主要组分，植物所有物质的约33％由纤维素组成，在完整活植物中，由角质和蜡质形成的植物角质层使纤维素避开外部环境，所述角质层是不透水屏障，植物细胞壁由其覆盖，使得纤维素几乎不可接受CBD的结合。第二，包囊化的效益剂对植物的有效输送需要第一结合结构域与植物和第二结合结构域与微粒同时结合。由于两个结合事件发生的可能性是由结合结构域和它们的靶分子的摩尔浓度以及结合复合物的摩尔浓度之间微妙的平衡所决定的，在溶液中几乎不太可能存在足够使这样的同时结合成为可能的多功能融合蛋白。此外，结合事件的平衡强烈地受到环境参数例如温度和pH的影响，其对每个结合结构域的最优条件可能极为不同。因此，两个这样的多功能融合蛋白的结合结构域这样的同时结合几乎不太可能导致可将包囊化的效益剂保留于植物上的足够强的结合。第三，尽管CBD某种程度上特异地与纤维素结合，仍可将使用多功能融合蛋白(其中的CBD应可与植物结合)视为通用结合方法(因为所有的植物都含有纤维素)，其因此与非特异地粘着的增粘剂和粘着剂是相似的。靶向方法具有相当高的价值，其中结合结构域的特异性结合将允许在与一种植物物种结合和与另一种结合之间区分。WO03031477还表明(没有进一步的示例)，碳水化合物或多糖的其它结合子可用于产生可将微粒沉积于活生物体上的融合蛋白。然而，WO 03031477中既没有公开除了CBD之外的结合结构域，也没有公开与完整活植物结合的结合结构域。
因其对特定靶的特异性和高亲和力而众所周知的分子为抗体。可产生针对广泛不同的靶的抗体，并且已描述了为研究植物细胞壁结构和动力学而产生的抗体，其可特异地与特定的植物成分，主要是植物细胞壁成分结合(Penell等人，1989；Jones等人，1997；Willats等人，1998；Willats和Knox，1999；Willats等人，2001)。然而，并不清楚产生的所述抗体所针对的任何植物细胞壁成分是否可直接接近来自外部环境的抗体。此外，抗体受其作为适应性免疫系统的组分的性质限制，它们在生理条件下它们的靶结合，其包括严格调节的pH、温度和血液正常渗透压范围。如果考虑将抗体用于靶向输送农用化学品，所述抗体不应只能够在农用化学品制剂中与其在完整活植物上的靶结合，其中生理生化特征基本偏离了生理条件，它们还应该能够足够强地结合以将载体保留在植物上。对任何早先描述的植物结合抗体，已表明不具备这两个关键特征中的任何一个。
重链骆驼抗体的可变结构域(VHH)是特别有趣的抗体片段类型，因为他们是很小的15kDa的单链蛋白质，其由于对其靶显示出高度亲和力可被选择。另外，作为小单链分子的性质，VHH是易于生产的并具有超过常规抗体的优越的稳定性特征。然而，目前没有描述结合植物的VHH。另外，尽管已显示共价连接到固体树脂颗粒的VHH可保持它们能够从溶液中捕获抗原的功能(WO 0144301)，仍然没有显示或不可预期VHH对其靶的亲和力足够将载体保留在固体植物表面上。
仍存在对特异性输送农用化学品的方法的未满足的需要，其中农用化学品被输送或沉积至完整活植物上的作用位点上或附近，其利用可特异地并强烈地与完整活植物结合并能够将农用化学品或包含所述农用化学品的载体保留在植物上的结合结构域。
我们分离了结合结构域，更具体地为含有包含4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)(根据Kabat定义FR和CDR)的氨基酸序列的结合结构域，其中所述结合结构域能够与完整活植物上的结合位点结合，并且令人吃惊的是，通过这样做能够将农用化学品或包含农用化学品的载体保留在所述植物上。优选地，所述结合结构域在恶劣的条件下(例如不同的温度、pH、盐浓度、水或水分的可用性)保持稳定并保留其结合能力；更优选地，所述结合结构域在农用化学品制剂中保持稳定并保留其结合能力。包含4个FR和3个CDR的结合结构域(优选以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序)是本领域技术人员已知的，并且已在Wesolowski等人(2009)中作为非限制性的实例被描述。优选地，所述结合结构域衍生自骆驼抗体，优选来自无轻链的重链骆驼抗体，例如骆驼抗体重链的可变结构域(VHH)。包含这些结合结构域的靶向剂可将农用化学品保留在植物或植物部分的特异结合位点上，并可用于向植物，优选向整个活植物输送和保留农用化学品，其中包含于这样的靶向剂中的结合结构域特异地与植物上的结合位点结合，在那里农用化学品可发挥其活性。农用化学品组合物包含至少一种靶向剂和农用化学品，优选结合于载体上或包含于载体中，其可适于允许使用减少剂量的农用化学品和/或减少施用农用化学品的频率，所述农用化学品在保持其总体效力的同时包含于这样的组合物中。另外，当包含于本发明的组合物中时，农用化学品可在一段较长的时间里发挥其活性，最终导致更少的农用化学品损失和环境污染；还有，通过应用本发明的组合物中的农用化学品，向农用化学品活性中引入原本不存在的特异性是可能的。
本发明的第一方面是结合结构域，其能够与完整活植物上的至少一个结合位点结合。
如本文所用，“完整活植物”意指正在生长的植物，不论其是否生长于土壤中、水中或人工基质中，并且不论其是否生长于田间、温室、庭院、花园、花盆或水耕栽培系统中。完整活植物优选包括所有正常天然存在于这样的植物上的植物部分(根、茎、枝、叶、针叶、茎刺、花、种子……)，尽管一些植物部分，例如花，可在植物生命循环的某些时期缺失。完整活植物不包括从植物移除的植物部分，例如从植物切下并分离的叶和花。然而，应清楚，完整活植物包括被正常自然事件损伤的植物，例如被天气(例如但不限于，风、雨或冰雹)、动物(不论是食用所述植物的动物或踩踏到所述植物的动物)、植物病虫害(例如但不限于昆虫、线虫和真菌)损伤或由农业实践引起的损伤，例如但不限于，修剪、收获果实或收获花。植物包括裸子植物和被子植物，单子叶植物和双子叶植物，树，果树，田间和蔬菜作物以及观赏物种。作为非限制性的实例，所述植物可为雪松、柏树、杉树、桧柏、落叶松、松树、红杉、云杉、红豆杉、银杏、油棕榈、橡胶树、橡树、山毛榉、玉米、棉花、大豆、小麦、稻、大麦、黑麦、高粱、粟、油菜、蚕豆、豌豆、花生、向日葵、马铃薯、番茄、甜菜、甘蔗、木薯、烟草、香蕉、苹果，橘子、柠檬、橄榄、菠萝、油梨、葡萄、莴苣、甘蓝、胡萝卜、茄子、辣椒、甜瓜、玫瑰、百合、菊花、禾本草样杂草或阔叶杂草。
如本文所用，“结合位点”意指分子结构或化合物，例如蛋白质、(多)肽、(多)糖、糖蛋白、脂蛋白、脂肪酸、脂质或核酸，或这样的分子结构或化合物上的特定区域，或这样的分子结构或化合物的特定构象，或这样的结构或化合物的组合或复合物。优选地，所述结合位点包括至少一个抗原。如本文所用，“抗原”意指能够在动物中诱导免疫应答的分子。优选地，所述结合位点包含于植物结构例如表皮毛、气孔、皮孔、棘、刺、根毛、角质层或蜡质层中。甚至更优选地，所述结合位点包含于植物结构例如表皮毛、气孔或角质层中。所述结合位点对一种特定植物结构可为唯一的，或它可更普遍地包含于多于一种植物结构中。优选地，所述结合位点存在于特定植物部分，例如叶、茎、根、果实、球果、花、球茎或块茎。甚至更优选地，所述结合位点存在于这样的特定植物部分的表面，意指结合位点存在于例如叶表面、茎表面、根表面、果实表面、球果表面、花表面、球茎表面或块茎表面。所述结合位点对一种特定植物部分可为唯一的，或它可更普遍地存在于多于一种植物部分上。
如本文所用，“结合结构域”意指蛋白质性质的分子(蛋白质、蛋白质样或含蛋白质)的整体或部分，其能够使用特异的分子间相互作用与靶分子结合。结合结构域可为天然存在的分子例如纤维连接蛋白，它可衍生自天然存在的分子例如来自先天性或适应性免疫系统的组分，或它可为完全人工设计的。结合结构域可为基于免疫球蛋白的，或它可为基于存在于蛋白质中的结构域的，所述蛋白质包括但不限于，微生物蛋白质、蛋白酶抑制剂、毒素、纤维连接蛋白、脂质运载蛋白、单链反平行卷曲螺旋蛋白或重复基序蛋白。这样的结合结构域的非限制性的实例为，碳水化合物结合结构域(CBD)(Blake等人，2006)、重链抗体(hcAb)、单结构域抗体(sdAb)、微抗体(minibody)(Tramontano等人，1994)、重链骆驼抗体的可变结构域(VHH)、新抗原受体的可变结构域(VNAR)、亲和体(affibody)(Nygren等人，2008)、阿尔法体(alphabody)(WO 2010066740)、设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)(Stumpp等人，2008)、抗转运蛋白(anticalin)(Skerra等人，2008)、打结素(knottin)(Kolmar等人，2008)和工程化的CH2结构域(纳米抗体；Dimitrov，2009)。优选地，所述结合结构域由单一多肽链组成并且是未经翻译后修饰的。更优选地，所述结合结构域不是CBD。甚至更优选地，所述结合结构域衍生自先天性或适应性免疫系统，优选来自先天性或适应性免疫系统的蛋白质。仍然更优选地，所述结合结构域衍生自免疫球蛋白。最优选地，所述结合结构域包含4个框架区和3个互补决定区，或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少所述互补决定区之一的一些氨基酸残基)。优选地，结合结构域易于以高产量(优选在微生物重组表达系统中)生产，并且随后方便地分离和/或纯化。还优选地，结合结构域在储存和利用期间是稳定的，意指在储存和/或利用的条件下保持结合结构域的完整性，所述条件可包括温度升高、冻-融循环、pH或离子强度变化、UV辐射、存在有害化学品等等。更优选地，所述结合结构域在农用化学品制剂中是稳定的。如本文所用，“农用化学品制剂”意指用于农用化学品用途的组合物，如进一步所定义的，其包含至少一种活性物质，任选地含一或多种有利于农用化学品的最优分散、雾化、沉积、叶湿润、分布、保留和/或摄取的添加剂。作为非限制性的实例，这样的添加剂为稀释剂、溶剂、佐剂、表面活性剂、润湿剂、铺展剂、油、粘着剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、酸化剂、抗沉降剂、抗冻剂、光保护剂、消泡剂、生物杀伤剂和/或漂移控制剂。最优选地，当在环境温度下储存2年时间或在54℃储存2周时间，所述结合结构域在农用化学品制剂中保持稳定。优选地，所述结合结构域选自DARPin、打结素、阿尔法体和VHH。更优选地，所述结合结构域选自阿尔法体和VHH。最优选地，所述结合结构域为VHH。
结合结构域与结合位点或包含于结合位点中的抗原的结合以高亲和力发生。通常用解离常数描述结合结构域与其靶分子之间的亲和力。优选地，结合结构域与包含于结合位点中的靶分子之间的结合的解离常数低于10-5M，更优选地，解离常数低于10-6M，甚至更优选地，解离常数低于10-7M，最优选地，解离常数低于10-8M。优选地，结合结构域与结合位点的结合是特异的，意指结合结构域仅在靶分子存在于结合位点时与结合位点结合，以及结合结构域不结合或以低得多的亲和力结合缺失靶分子的结合位点。可通过例如在实施例2中描述的ELISA方法分析结合结构域的结合特异性，其中将结合结构域与其靶分子的结合与结合结构域与无关分子的结合比较，并与结合结构域与反应容器的非特异粘着相比较。特异性还可表现为结合结构域对其靶分子的亲和力相比于对无关分子的亲和力的差异。优选地，结合结构域对其靶分子的亲和力相比于对无关分子的亲和力的比值大于10，更优选地，所述比值大于20，最优选地，所述比值大于100。结合结构域的结合可为对一种特定植物结构特异的，意指包含于这样的植物结构中的结合位点在其它植物结构中不存在或存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一种植物结构中，所述结合对多于一种植物结构是更普遍的。结合结构域的结合可为对一种特定植物部分特异的，意指存在于这样的植物部分之中或之上(可能包含于这样的植物部分上的植物结构中)的结合位点在其它植物部分中不存在或存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一种植物部分中，所述结合对多于一种植物部分是更普遍的。结合结构域的结合可为对一种特定植物物种特异的，意指存在于这样的植物物种之中或之上的结合位点在其它植物物种中不存在或存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一种植物物种中，所述结合对多于一种植物物种是更普遍的。结合结构域的结合可为对一种特定植物属特异的，意指存在于这样的植物属之中或之上的结合位点在其它植物属中不存在或存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一种植物属中，所述结合对多于一种植物属是更普遍的。结合结构域的结合可为对植物的一个特定生长阶段特异的，意指在特定生长阶段存在于这样的植物之中或之上的结合位点在另一个生长阶段的植物中不存在或存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一个植物生长阶段中，所述结合对多于一个植物生长阶段是更普遍的。如下文将解释的，结合结构域的所有类型的结合特异性可具有其特异的用途。
优选地，在恶劣的条件下结合结构域与结合位点的结合仍具功能，所述恶劣条件例如低或高温、低或高pH、低或高离子强度、UV辐射、低水可得性、变性化学品存在等等。在一个优选的实施方案中，所述恶劣条件定义为pH范围4-9，更优选为pH范围3-10，甚至更优选为pH范围2-10，最优选为pH范围1-11。在另一个优选的实施方案中，所述恶劣条件定义为温度范围4℃-50℃，更优选为温度范围0℃-55℃，甚至更优选为温度范围0℃-60℃。在另一个优选的实施方案中，所述恶劣条件定义为存在如上述定义的农用化学品制剂。
优选地，结合结构域与结合位点的结合足够强以能够将载体结合(更优选地保留)于所述结合位点；根据载体的大小和结合结构域的亲和力，一或多个结合结构域可结合于一或多个结合位点，并且协作得到的结合结构域对结合位点的亲合力保证了强烈地将载体结合(优选将载体保留)于植物上。如本文所用，“载体”意指任何固体、半固体或液体载体，在其中或其上可适当地掺入、包括、固定、吸附、吸收、结合、包囊化、包埋、连接或包含活性物质。这样的载体的非限制性的实例包括，纳米胶囊、微胶囊、纳米球、微球、纳米颗粒、微粒、脂质体、囊泡、珠、凝胶、弱离子树脂颗粒、脂质体、螺旋状递送载体(cochleate delivery vehicle)、小颗粒剂、颗粒剂、纳米管、巴基球(bucky-ball)、作为油包水型乳剂的部分的水滴、作为水包油型乳剂的部分的油滴、有机材料(例如软木、木材或其他植物来源的材料(例如，以种壳、木屑、纸浆、球、珠、片的形式或任何其它合适的形式)、纸或纸板)、无机材料(例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝、硅酸盐和沸石)、或甚至是微生物细胞(例如酵母细胞)或其合适的组分或片段(如本文进一步描述的)。如本文所用，“保留”意指由单一结合结构域或两个或更多个结合结构域的组合对它或它们的结合位点的亲和力或亲合力导致的结合力大于由载体重力所施加的组合的力和力矩、由喷施的农用化学品溶液流动或滴落引起的力和力矩(如果有的话)和由一或多种外部因子引起的剪切力所施加的力和力矩(如果有的话)。在优选的实施方案中，所述外部因子为雨、灌溉、雪、冰雹或风。通过特异性结合来结合载体比非特异性结合的一个特别的好处是特异性结合对作用于载体的外部剪切力是更耐受的(Cozens-Roberts等人，1990)。
优选地，本发明的结合结构域与存在于完整活植物的一或多种特定植物部分之中或之上的结合位点，或包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述完整活植物的部分选自叶、茎、根、果实、球果、花、球茎或块茎。更优选地，所述完整活植物的部分选自叶、茎或根。更优选地，本发明的结合结构域与完整活植物表面上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。如本文所用，“表面”可为存在于完整活植物上；或完整活植物的一或多个部分上的任何表面，然而，它不包括植物组织学制备物。优选地，所述完整活植物的表面是完整活植物的部分的表面，其选自叶表面、茎表面、根表面、果实表面、球果表面、花表面、球茎表面或块茎表面；甚至更优选地，所述完整活植物的表面是完整活植物的部分的表面，其选自根表面、茎表面和叶表面。
优选地，本发明的结合结构域与完整活植物的特定结构之中或之上，或完整活植物的特定部分的特定结构之中或之上，更优选在参与或涉及参与营养、农用化学品或其它化学品向植物内的运输和/或参与或涉及参与植物防御的特定结构之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔、皮孔、棘、刺、根毛、角质层或蜡质层，甚至更优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔和角质层。在一个优选的实施方案中，所述结合结构域与植物表皮毛之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。植物表皮毛是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于腺表皮毛和叶毛。植物表皮毛在植物防御中是具活性的(Lai等人，2000)，但尤其是非腺表皮毛还被引用为可能是感染靶标(Calo等人，2006)。表皮毛，包括腺表皮毛，还涉及极性化合物穿过植物角质层向植物内部的运输(Schreiber，2005)。这使得表皮毛成为输送农用化学品的理想靶标，其通过增强天然防御或通过在攻击位点浓缩农用化学品或通过改进的(极性)农用化学品向植物内的输送。在另一个优选的实施方案中，所述结合结构域与气孔之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。气孔对CO2扩散进入植物内和最小化水分损失是必不可少的。气孔还用作病原体，尤其是微生物主要的进入位点(Underwood等人，2007)。如本文所用，“微生物”意指细菌、病毒、真菌等等。另外，它们通过可使植物在微生物感染时关闭气孔的特异性信号通路直接涉及植物防御(Melotto等人，2006)。而在另一个优选的实施方案中，所述结合结构域与根毛之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。已知根毛对微生物附着和植物定殖是重要的(Gage，2004；Laus等人，2005)，并因此是农用化学品输送的重要靶标。在另一个优选的实施方案中，所述结合结构域与植物角质层之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。已知植物角质层对微生物附着和植物定殖是重要的，并且在亲脂的农用化学品向植物内的输送和沉积中起重要作用(Schreiber，2005)，并因此是农用化学品输送和沉积的重要靶标。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合结构域与阿拉伯树胶结合。在另一个优选的实施方案中，所述结合结构域结合凝集素、凝集素样结构域、伸展蛋白或伸展蛋白样结构域；更优选地，所述结合结构域结合马铃薯凝集素。优选地，所述结合结构域包含4个框架区和3个互补决定区，或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少所述互补决定区之一的一些氨基酸残基)；更优选地，所述结合结构域衍生自重链骆驼抗体，甚至更优选地，所述结合结构域包含VHH序列。重链骆驼抗体和VHH来源的序列是本领域技术人员已知的。在WO 9404678和WO 2007118670中，与其它抗体一起描述了骆驼抗体，其通过引用并入本文。甚至仍更优选地，所述VHH包含2个二硫桥。大多数VHH分子仅具有1个二硫桥；额外的二硫桥的存在将给予抗体结构域额外的稳定性，其对需要在恶劣条件下保持稳定的结合结构域是有利的特性。最优选地，所述VHH包含优选选自SEQ ID NO 1–SEQ ID NO 42(3A2、3B4、3B7、3D10、3D2、3D8、3E6、3F5、3F7、3F9、3G2、3G4、3H10、3H8、4A1、5B5、5B6、5C4、5C5、5D4、5E5、5F5、5G2、5G5、5H5、7A2、7C2、7D2、7E1_1、7F1、8B10、8B12、9A1、9B5、9C4、9D5、9E1、9E4、9F4、9H1、9H2和12H4)的序列或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少所述互补决定区之一的一些氨基酸残基)或其同源物。如本文所用，同源物为这样的序列，其中每个或任意框架区和每个或任意互补决定区与参考序列中相应的区域显示出至少80％相同性，优选至少85％相同性，更优选90％相同性，甚至更优选95％相同性(即，FR1_同源物对FR1_参考，CDR1_同源物对CDR1_参考，FR2_同源物对FR2_参考，CDR2_同源物对CDR2_参考，FR3_同源物对FR3_参考，CDR3_同源物对CDR3_参考和FR4_同源物对FR4_参考)，如在BLASTp比对中所估量的(Altschul等人，1997；根据Kabat定义FR和CDR)。
本法明第二方面是靶向剂，其能够将农用化学品保留于植物和/或植物部分上。
如本文所用，“靶向剂”为包含至少一个结合结构域的分子结构，优选具有多肽主链。最简单形式的靶向剂仅由单一结合结构域组成；然而，靶向剂可包含多于一个结合结构域并且可为单价或多价的，单特异性或多特异性的，如进一步所定义。除了单一或多结合结构域，靶向剂可另外包含其它部分，其可为化学偶联或融合(N端或C端或甚至内部融合)于结合结构域。所述其它部分包括但不限于，一或多个氨基酸，包括标记的氨基酸(例如荧光或放射活性标记)或可检测的氨基酸(例如可由抗体检测)，一或多个单糖，一或多个寡糖，一或多个多糖，一或多个脂质，一或多个脂肪酸，一或多个小分子或前述的任意组合。在一个优选的实施方案中，所述其它部分在所述靶向剂中起间隔物或接头的作用。
如本文所用，“农用化学品”意指任何在农用化学品工业(包括农业、园艺、花卉和家庭及花园用途，还有旨在非作物相关的产品的用途(例如公共卫生/害虫防治操作者用途，其用于控制不想要的昆虫和啮齿动物)，家庭用途(例如家庭杀真菌剂和杀虫剂和试剂))中可使用的活性物质或成分，其用于保护植物或植物部分、作物、球茎、块茎、果实(例如针对有害的生物体、疾病或害虫)；用于控制植物的生长，优选促进或提高植物的生长；和/或用于促进植物、作物或所收获的植物部分的产量(例如其果实、花、种子等)。这样的物质的实例对本领域技术人员将是清楚的，例如可包括具有杀虫剂(例如接触杀虫剂或内吸杀虫剂，包括用于家庭用途的杀虫剂)、除草剂(例如接触除草剂或内吸除草剂，包括用于家庭用途的除草剂)、杀真菌剂(例如接触杀真菌剂或内吸杀真菌剂，包括用于家庭用途的杀真菌剂)、杀线虫剂(例如接触杀线虫剂或内吸杀线虫剂，包括用于家庭用途的杀线虫剂)和其它杀虫剂或杀生物剂(例如用于杀死昆虫或蜗牛的试剂)活性的化合物；以及化肥；生长调节物例如植物激素；微量营养素，安全剂，信息素；驱虫剂；昆虫诱饵；和/或用于调节(即提高、降低、抑制、增强和/或触发)在靶植物(例如待保护的植物或待控制的植物)中表达或由靶植物表达的基因表达(和/或其它生物学或生物化学过程)的活性成分，例如本身已知用于此目的的核酸(例如，单链或双链RNA，例如在RNAi技术中所使用的)和其它因子、蛋白质、化学品等。这样的农用化学品的实例对技术人员将是清楚的；例如包括但不限于：草甘膦、百草枯、异丙甲草胺、乙草胺、甲基磺草酮、2,4-D、阿特拉津、草铵膦、草硫膦、精恶唑禾草灵、二甲戊乐灵、毒莠定、氟乐灵、溴苯腈、炔草酯、氟草烟、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆、咪草烟、麦草畏、吡虫啉、噻虫嗪、氟虫腈、溴氰菊酯、毒死蜱、λ-三氟氯氰菊酯、硫丹、甲胺磷、呋喃丹、噻虫胺、氯氰菊酯、阿维菌素、吡氟酰草胺、多杀菌素、茚虫威、联苯菊酯、七氟菊酯、嘧菌酯、噻虫嗪、戊唑醇、代森锰锌、氰霜唑、氟啶胺、唑菌胺酯、氟环唑、百菌清、铜杀真菌剂、肟菌酯、丙硫菌唑、苯醚甲环唑、多菌灵、丙环唑、硫菌灵、硫、啶酰菌胺和其它已知的农用化学品，或其任何合适的组合。基于本文的公开，其它合适的农用化学品对技术人员将是清楚的，例如可为任何商业可获得的农用化学品，并例如包括在Phillips McDougall，AgriService November 2007 V4.0，ProductsSection–2006Market，Product Index pp.10-20中列出的每种化合物。所述农用化学品可以不同的形式存在，包括但不限于，晶体、微晶体、纳米晶体、共晶体、粉尘、颗粒剂、粉末、片剂、凝胶、可溶性浓缩物、乳液、可乳化浓缩物、悬浮液、悬浮液浓缩物、悬乳液、分散液、分散液浓缩物、微胶囊悬浮液，或本领域技术人员清楚的任何其它形式或类型的农用化学品制剂。农用化学品不仅包括即用的活性物质或成分，还包括非活性形式的前体，其可由外部因子活化。作为非限制性的实例，可通过由昆虫损伤时植物受伤引起的pH变化、通过由真菌攻击引起的酶作用，或通过温度变化或湿度变化活化前体。
如本文所用，“植物部分”意指任何植物部分，不论是完整活植物或从完整活植物分离或隔离的部分，甚至可考虑死的植物材料。优选地，所述植物部分选自叶、茎、根、果实、球果、花、球茎和块茎。更优选地，所述植物部分选自叶、茎和根。甚至更优选地，所述植物为完整活植物和/或所述植物部分为完整活植物的植物部分。
为了能够将农用化学品保留在植物或植物部分上，将单一或多靶向剂与农用化学品融合或附着，通过共价键、氢键、偶极-偶极相互作用，弱范德华力或前述的任何组合。如本文所用，“附着”意指偶联、连接、锚定、混合或包被。
在一个优选的实施方案中，所述农用化学品结合于载体上或包含于载体中，如上述所定义的，其中靶向剂与载体或农用化学品偶联。优选地，结合结构域与载体偶联。如本文所用，“偶联”可为允许靶向剂保留农用化学品或包含农用化学品的载体的任何偶联；它可为共价和非共价结合。优选地，所述偶联为共价结合。如何将结合结构域和/或靶向剂与存在于载体外表面的任何类型的官能团偶联对本领域技术人员是清楚的。如本文所用，“官能团”意指蛋白质可共价结合的任何化学基团，包括但不限于，羧基、胺基、羟基、巯基或炔基(alkyn)。作为非限制性的实例，可以应用在载体外表面的羧基与结合结构域和/或靶向剂的胺基之间形成碳二亚胺键偶联。结合结构域和/或靶向剂可不需要连接剂而与载体偶联。就微生物细胞或噬菌体来说，本发明的靶向剂可由微生物细胞或噬菌体基因组编码，其中农用化学品作为融合蛋白包含于微生物细胞或噬菌体中或通过化学连接与之偶联。如本文所用，“连接剂”可为本领域技术人员已知的任何连接剂；优选地，连接剂提高结合在载体上的靶向剂的灵活性，从而有利于包含于靶向剂中的结合结构域与植物上的结合位点的结合。可在WO 0024884和WO 0140310中发现这样的连接剂的实例。
优选地，所述载体为微载体。如本文所用，“微载体”为微粒载体，其中颗粒直径小于500μm，优选小于250μm，甚至更优选小于100μm，最优选小于50μm。用于输送农用化学品的微载体是本领域技术人员已知的，包括但不限于，纳米胶囊、微胶囊、纳米球、微球、弱离子树脂颗粒、聚合颗粒、复合凝胶颗粒、由人工木质化的纤维素制造的颗粒、脂质体、囊泡和螺旋状递送载体。一或多种农用化学品存在于微生物细胞(例如酵母细胞)或噬菌体之上或之内是可能的(例如，由于所述一或多种农用化学品可装载于这样的细胞之内(或之上)或其是已在所述微生物细胞中生产/表达的生物学物质)，或所述一或多种农用化学品与细胞片段(例如细胞壁或细胞膜的片段)、细胞组分或其它细胞碎片相连(例如结合于或包埋入)也是可能的(例如，通过将在其内(或其上)已装载、生产或表达了一或多种农用化学品的微生物细胞分解(fractionating)或裂解而获得)，因此所述微生物细胞或噬菌体用作微载体也是可能的。如本文所用，微载体、微粒、微球、微胶囊、纳米颗粒、纳米胶囊和纳米球可互换使用。在US 6180141、WO 2004004453、WO 2005102045和US 7494526中，与其它载体一起描述了这样的微载体，其通过引用并入本文。优选地，所述微载体为包含天然聚合物的微粒。微载体的特征为它们使农用化学品的缓释、农用化学品的延迟释放或农用化学品的速释成为可能，所有类型的微载体具有其特定的用途。微载体可天然含有适合于共价连接的可交联的残基，或微载体可衍生以引入合适的用于本领域公知的方法的可交联基团。这样的衍生可发生于微载体制造之前(即在用于所述制造过程的原材料水平)，它可发生于微载体制造过程期间，或它可发生于微载体制造之后。在一个具体的实施方案中，在微载体上的官能团可能与连接剂或间隔物结合，其如上述定义的依次结合于靶向剂。
在另一个优选的实施方案中，包含于靶向剂中的一或多个结合结构域与结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合，其存在于一或多种植物(优选完整活植物)特定部分之中或之上。优选地，所述植物(更优选完整活植物)部分选自叶、茎、根、果实、球果、花、球茎或块茎。更优选地，所述植物(优选完整活植物)部分选自叶、茎或根。更优选地，包含于靶向剂中的一或多个结合结构域与植物(优选完整活植物)表面上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述植物(优选完整活植物)表面是植物(优选完整活植物)部分的表面，其选自叶表面、茎表面、根表面、果实表面、球果表面、花表面、球茎表面或块茎表面；甚至更优选地，所述植物(优选完整活植物)表面是植物(优选完整活植物)部分的表面，其选自根表面、茎表面和叶表面。
在另一个优选的实施方案中，包含于靶向剂中的一或多个结合结构域与植物(优选完整活植物)特定结构之中或之上或植物(优选完整活植物)特定部分的特定结构之中或之上，更优选在参与或涉及参与营养、农用化学品或其它化学品向植物内的运输和/或参与或涉及参与植物防御的特定结构之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔、皮孔、棘、刺、根毛、角质层或蜡质层，甚至更优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔和角质层。在一个优选的实施方案中，包含于靶向剂中的所述一或多个结合结构域与植物表皮毛之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。在另一个优选的实施方案中，包含于靶向剂中的所述一或多个结合结构域与气孔之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。而在另一个优选的实施方案中，包含于靶向剂中的所述一或多个结合结构域与植物角质层之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。
而在另一个优选的实施方案中，本发明的包含于靶向剂中的一或多个结合结构域与阿拉伯树胶结合。在另一个优选的实施方案中，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域结合于凝集素、凝集素样结构域、伸展蛋白或伸展蛋白样结构域；更优选地，所述结合结构域结合马铃薯凝集素。优选地，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域包含4个框架区和3个互补决定区，或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少所述互补决定区之一的一些氨基酸残基)；更优选地，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域衍生自重链骆驼抗体，甚至更优选地，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域包含VHH序列。甚至仍更优选地，所述VHH包含2个二硫桥。最优选地，所述VHH包含优选选自SEQ ID NO 1–SEQ IDNO 42(3A2、3B4、3B7、3D10、3D2、3D8、3E6、3F5、3F7、3F9、3G2、3G4、3H10、3H8、4A1、5B5、5B6、5C4、5C5、5D4、5E5、5F5、5G2、5G5、5H5、7A2、7C2、7D2、7E1_1、7F1、8B10、8B12、9A1、9B5、9C4、9D5、9E1、9E4、9F4、9H1、9H2和12H4)的序列或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少互补决定区之一的一些氨基酸残基)或其同源物。
本发明第三方面是本发明的靶向剂用于将农用化学品或农用化学品组合输送并保留至植物或植物部分的用途。
任何植物部分，不论是完整活植物的部分或从完整活植物分离或隔离的部分，甚至死的植物材料可被考虑为使用本发明的靶向剂输送并保留农用化学品或农用化学品组合的靶。优选地，所述植物部分选自叶、茎、根、果实、球果、花、球茎和块茎。更优选地，所述植物部分选自叶、茎和根。甚至更优选地，所述植物为完整活植物和/或所述植物部分为完整活植物的植物部分。使用任何合适的或所需的用于应用农用化学品或农用化学品组合的人工或机械技术实现所述输送，其包括但不限于，喷雾，涂刷，拌种(dressing)，滴液，涂覆，浸泡，铺展，作为小液滴、细雾或气雾施用。作为非限制性的实例，本发明的靶向剂可用于将农用化学品或农用化学品组合输送和保留至田间生长的作物叶，它可用于将农用化学品或农用化学品组合输送和保留至溶液培养繁殖的作物的根，它可作为收获后处理用于将农用化学品或农用化学品组合输送和保留至收获的植物部分(例如果实、花或种子)，它可用于在制备耕地时将农用化学品或农用化学品组合输送和保留至存在于土壤中的活或死的植物材料(其与无翻耕农业实践组合是特别有用的)，或它可用于将农用化学品或农用化学品组合输送和保留至放置在根际附近的基质，以在根际实现农用化学品的分布和延长的保留。本发明一个特别有利的方面是，通过适当地选择靶向剂和农用化学品(或农用化学品组合)的组合，它允许配制相同的活性物质用于多种不同的用途，例如不同的植物物种或植物部分，不同的环境条件(土壤类型、降雨量和其它天气条件，甚或不同的季节条件)和不同的最终用途(例如在田间、在温室、在花园、在水耕培养系统，根据快速、延缓或缓慢的释放用途用于可能的环境，用于家庭用途和由害虫防治操作者使用)。因此，通过使用靶向剂输送和保留农用化学品，有可能从具有经证实的效力的环境可接受的活性农用化学品物质或农用化学品制剂出发，提供一系列为所需的或需要的最终用途定制的，不同的和改善的植物保护产品或试剂或其它农用化学品产品。作为非限制性的实例，通过使用包含植物物种特异的结合结构域的靶向剂输送，可将广谱除草剂制造为植物物种特异的；另一方面，使用包含具广谱特异性的结合结构域的靶向剂输送相同的除草剂可帮助降低发挥其所需作用需要的除草剂的量。另外，通过使用包含对靶作物或靶作物的特定部分高度特异的结合结构域的靶向剂输送农用化学品，可避免不想要的农用化学品的脱靶活性，例如，针对有益昆虫的活性。
优选地，所述农用化学品或农用化学品组合选自除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀生物剂、肥料、安全剂、微量营养素和植物生长调节化合物。
优选地，所述农用化学品或农用化学品组合的输送和保留方法导致所述农用化学品或农用化学品组合在植物或植物部分上改善的沉积。如本文中所用，“改善的沉积”意指，当与不使用任何靶向剂的相同的农用化学品或农用化学品组合相比时，取决于包含于靶向剂中的结合结构域的特异性，结合于植物或植物部分的所述农用化学品或农用化学品组合的量提高，和/或所述农用化学品或农用化学品组合的在整个植物或植物部分分布更平均或浓度更高。
在一个优选的实施方案中，所述农用化学品或农用化学品组合结合于载体之上或包含于其中，优选前述所定义的微载体。例如，这对挥发性的或可被环境因子(例如存在水分或UV辐射)快速降解的，或对处理农用化学品或农用化学品组合的人员构成了相当大毒性的农用化学品或农用化学品组合是特别有利的。在一个具体的实施方案中，载体上的官能团可与连接剂或间隔物结合，其如上述定义的依次结合于靶向剂。
本发明第四方面是组合物，其至少包括(i)一种靶向剂，其包含至少一个本发明的结合结构域，和(ii)农用化学品或农用化学品组合。
包含于所述组合物中的靶向剂可为“单特异性”靶向剂或“多特异性”靶向剂。“单特异性”靶向剂意指包含单一结合结构域或包含两或更多个不同的结合结构域(每个针对相同的抗原，所述抗原存在于相同的结合位点上或其中或形成所述结合位点)的靶向剂。因此，单特异性靶向剂能够通过单结合结构域或通过多结合结构域与单个结合位点结合。“多特异性”靶向剂意指包含两或更多个结合结构域(每个针对不同的抗原，所述抗原存在于结合位点上或其中或形成所述结合位点)的靶向剂。因此，“双特异性”靶向剂能够与两个不同的结合位点或两个不同的存在于结合位点上或其中或形成所述结合位点的抗原结合；“三特异性”靶向剂能够与三个不同的结合位点或三个不同的存在于结合位点上或其中或形成所述结合位点的抗原结合；“多特异性”靶向剂依次类推。另外，就本文描述的靶向剂而言，术语“单价”用于表示所述靶向剂包含单一结合结构域；术语“双价”用于表示所述靶向剂包含共2个单一结合结构域；术语“三价”用于表示所述靶向剂总共包含3个单一结合结构域；“多价”靶向剂依次类推。因此，上述本发明的组合物一方面包含两或更多个相同或不同的靶向剂，其意指两或多个靶向剂，对相同的靶向剂，其中每个与存在于相同的结合位点上或其中的相同或不同的抗原结合，而对不同的靶向剂，其中至少一个与存在于相同结合位点和不同的结合位点上或其中的不同抗原结合。
优选地，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域与结合结位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合，所述结合位点存在于一或多种植物(优选完整活植物)特定部分之中或之上。优选地，所述植物(更优选完整活植物)部分选自叶、茎、根、果实、球果、花、球茎或块茎。更优选地，所述完整活植物的部分选自叶、茎或根。更优选地，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域与完整活植物表面上的结合结位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述完整活植物表面是完整活植物的部分的表面，选自叶表面、茎表面、根表面、果实表面、球果表面、花表面、球茎表面或块茎表面；甚至更优选地，所述完整活植物表面是完整活植物的部分的表面，其选自根表面、茎表面和叶表面。
优选地，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域与植物(优选完整活植物)特定结构之中或之上或植物(优选完整活植物)特定部分的特定结构之中或之上，更优选在参与或涉及参与营养、农用化学品或其它化学品向植物内的运输和/或参与或涉及参与植物防御的特定结构之中或之上的结合位点或与包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔、皮孔、棘、刺、根毛、角质层或蜡质层，甚至更优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔和角质层。在一个优选的实施方案中，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域与植物表皮毛之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。在另一个优选的实施方案中，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域与气孔之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。而在另一个优选的实施方案中，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域与植物角质层之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。
而在另一个优选的实施方案中，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域与阿拉伯树胶结合。在另一个优选的实施方案中，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域结合于凝集素、凝集素样结构域、伸展蛋白或伸展蛋白样结构域；更优选地，所述结合结构域结合马铃薯凝集素。优选地，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，所述结合结构域包含4个框架区和3个互补决定区，或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少所述互补决定区之一的一些氨基酸残基)；更优选地，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域衍生自重链骆驼抗体，甚至更优选地，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域包含VHH序列。甚至仍更优选地，所述VHH包含2个二硫桥。最优选地，所述VHH包含优选选自SEQ ID NO1–SEQ ID NO 42(3A2、3B4、3B7、3D10、3D2、3D8、3E6、3F5、3F7、3F9、3G2、3G4、3H10、3H8、4A1、5B5、5B6、5C4、5C5、5D4、5E5、5F5、5G2、5G5、5H5、7A2、7C2、7D2、7E1_1、7F1、8B10、8B12、9A1、9B5、9C4、9D5、9E1、9E4、9F4、9H1、9H2和12H4)的序列或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少互补决定区之一的一些氨基酸残基)或其同源物。
在本发明的组合物中，所述农用化学品或农用化学品组合优选选自除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀生物剂、肥料、安全剂、微量营养素或植物生长调节化合物。
在本发明的组合物中，农用化学品或农用化学品组合可处于液体、半固体或固体形式，并且例如保持为气雾、可流动粉末、可湿性粉末、可湿性颗粒剂、可乳化浓缩物、悬浮液浓缩物、微乳化液、胶囊悬浮液、干微胶囊、片剂或凝胶，或被悬浮、分散、乳化或另外纳入合适的液体介质(例如水或其它合适的水性、有机或油性介质)中而储存或施用于植物上。任选地，组合物还包含一或多种适合于在本发明的组合物中使用的另外的组分，例如但不限于稀释剂、溶剂、佐剂、表面活性剂、润湿剂、铺展剂、油、粘着剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、酸化剂、抗沉降剂、抗冻剂、光保护剂、消泡剂、生物杀伤剂和/或漂移控制剂等等。
在一个优选的实施方案中，农用化学品或农用化学品组合结合于载体上或包含于其中。就农用化学品组合而言，每种单独的农用化学品可结合于单独的载体上或包含于其中，或合适的农用化学品组合可联合地结合于一种载体上或包含于其中。作为使用载体的替代选择，还可以(小)颗粒的形式提供农用化学品或农用化学品组合，其与合适的包被(coating)或(外部)层一起提供，靶向剂偶联或可结合于所述包被或层，并且所述包被或层还可用于稳定或改善颗粒的生理学完整性或稳定性。作为另一个替代选择，可适当地将农用化学品或农用化学品组合与赋形剂或粘合剂混合，靶向剂与所述赋形剂或粘合剂偶联或可与之结合，所述赋形剂或粘合剂还可用于稳定或改善颗粒的生理学完整性或稳定性。这样的包被的或复合的颗粒优选为浆体、湿饼或自由流动的粉末、片剂、胶囊或液体浓缩物(例如乳液、悬液或分散液)的形式。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物用于农用化学品用途。如本文所用，“农用化学品用途”不仅包括如上述定义的，适合和/或旨在用于田间生长的作物(例如农作物)的农用化学品用途(例如，杀虫剂、生长调节物、营养/肥料、驱虫剂、脱叶剂等)，还包括如上述定义的，意在用于温室生长的作物(例如，园艺/花卉)或水耕种植系统的农用化学品用途(例如，杀虫剂、生长调节物、营养/肥料、驱虫剂、脱叶剂等)，甚至如上述定义的适于和/或旨在非作物用途的农用化学品用途，例如私人花园中的用途、家庭用途(例如，家用除草剂或杀虫剂)或由害虫防治操作者使用的用途(例如，杂草防治等)。
例如，基于本说明书中列出的教导，并根据待输送的农用化学品、所述农用化学品待输送至的植物的部分和本发明组合物(和/或其中包含的农用化学品)预期的农用化学品作用，技术人员将能够适当地选择可以/应该存在于本发明的组合物中的特异性结合结构域/靶向剂(以及组合物的其它成分，例如载体、农用化学品和农用化学品形式/制剂)，以实现所需/预期的农用化学品作用。因此，有利地，基于本文的公开，本发明使技术人员适当地选择合适的结合结构域/靶向剂、农用化学品、载体、另外的组合物组分和组合物的农用化学品形式/制剂，以实现预期的/所需的农用化学品作用成为可能。在这方面，应注意在目前所考虑的本发明中，尽管可预见一些这样的组合将会比其它的组合更有效和/或更优选，仍可能存在多种可能的这样的组合，其可给出差不多相同程度的预期的/所需的农用化学品作用。这还允许技术人员在选择要用的组合时考虑其它(第二)因子，例如要保护的特定作物，普遍的田间、土壤、天气和/或其它环境条件，组合物优选的施用方式，其应用的环境(田间、温室等)，所需的持久性和/或其它可影响对用于特定应用的农用化学品组合物的选择的因子。
例如但不限于，当本发明的组合物旨在与植物的一或多个特定部分结合时，优选将(即其中存在一或多个结合结构域的)靶向剂导向存在于(以足够的量)所述植物部分中/上的一或多个(如本文所定义的)结合位点(这样的结合位点也可能以比植物其它部分更大量/更大的程度存在于所述植物部分中/上，从而提供可优选地与预期的/所需的植物部分(与植物一或多个其它部分相比)结合的本发明的结合结构域/靶向剂/组合物)；包含这样的结合结构域/靶向剂(即将组合物导向存在于所需的植物部分中的结合位点，并优选使得它们可优选地与所需的植物部分结合)的本发明的组合物形成了本发明一些具体但非限制性的方面。例如但不限于：
-对于旨在与植物的叶结合的本发明的组合物，可将结合结构域和/或靶向剂导向植物(叶)上的一或多个下列结合位点：角质、角质层蜡质、阿拉伯半乳聚糖蛋白或脂质转移蛋白；
-对于旨在与植物的根结合的本发明的组合物，可将结合结构域和/或靶向剂导向植物(根)上的一或多个下列结合位点：伸展蛋白或果胶；
-对于旨在与植物的茎结合的本发明的组合物，可将结合结构域和/或靶向剂导向植物(茎)上的一或多个下列结合位点：木质素、伸展蛋白或分泌产物；
并且本发明每个这样的组合物形成本发明特定的，但非限制性的方面。
本发明第五方面是组合物，其至少包括(i)一种靶向剂，其包含至少一个本发明的结合结构域，和(ii)载体。
包含于所述组合物中的靶向剂可为单特异性靶向剂或多特异性靶向剂，并可为单价靶向剂或多价靶向剂。因此，上述本发明的组合物一方面包含两或更多个相同或不同的靶向剂，其意指两或更多个靶向剂，对相同的靶向剂，其中每个与存在于相同的结合位点上或其中的相同或不同的抗原结合，而对不同的靶向剂，其中至少一个与存在于相同结合位点和不同结合位点上或其中的不同的抗原结合。
在一个优选但非限制性的具体实施方案中，所述载体允许本发明的组合物被适当地施用于想要的作用位点，和/或其允许本发明的组合物配制为可适当地施用于想要的作用位点；其使用任何合适的或所需的人工或机械技术，例如喷雾、涂刷、滴液，浸泡，涂覆，铺展，作为小液滴、细雾或气雾施用等。基于本文公开，技术人员将清楚这样的技术的实例、适合用于这样的技术的本发明的组合物的实例和用于制造和配制这样的本发明的组合物的方法的实例。优选地，所述载体为可将一或多种活性物质掺入、包囊化入或纳入载体的载体，例如纳米胶囊、微胶囊、纳米球、微球、脂质体或囊泡。甚至更优选地，所述载体使得在这样的掺入、包囊化、包埋或纳入后由此获得的复合物可被悬浮、分散、乳化或加入合适的液体介质中(例如水或另一种合适的水性，有机或油性介质)从而提供本发明的(浓缩的)液体组合物，其具有允许本发明的组合物适当地储存或(在必要时进一步稀释后)施用于想要的作用位点的稳定性。甚至更优选地，所述载体使得本发明的组合物在最终使用前可运输和/或储存，任选地(通常优选地)作为合适的液体浓缩物、干粉、片剂、胶囊、浆体或“湿饼”，其可适当地稀释、分散、悬浮、乳化或另外由最终用户在最终使用前适当地重新配制(这样的浓缩物形成本发明另外的方面)。基于本文公开，适合于此目的的载体，优选微载体(和用于将其中的活性成分吸收、包囊化、包埋等的方法)对技术人员将是清楚的和/或商业可获得的。一些非限制性的实例包括固体或半固体微球或颗粒剂，其中活性成分包埋于或吸收进合适的基质材料或包含壳材料的微胶囊中，所述壳材料围绕在含有活性成分的核心周围(即包囊化入微胶囊中)。
优选地，所述载体具有立即、延迟、渐进、触发或缓慢释放的特征，例如持续若干分钟、若干小时、若干天或若干星期。还有，载体可由随时间(例如经分钟、小时、天或星期)破裂或缓慢降解(例如，由于长时间暴露于高或低温、高或低pH、阳光、高或低湿度或其它环境因子或条件)的材料，或由在特定的外部因子(例如高或低温、高或低pH、高或低湿度或其它环境因子或条件)触发时会破裂或降解并因此从微胶囊中释放出活性剂的材料(例如聚合物)制造。载体还优选为使得在本发明的组合物施用于想要的作用位点时农用化学品以足够在所需的一段时间期间(例如，两次施用本发明的组合物之间的时间)提供所需的农用化学品作用的速率从载体释放。
在一个具体的实施方案中，所述载体，优选微载体，可包括聚合物材料，例如聚氨酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯、聚乙二醇、聚乙烯醇、三聚氰胺、脲/甲醛、丙烯酸聚合物、尼龙、乙酸乙烯酯或硅氧烷聚合物或-任选地(通常优选地)用于农用化学品目的-可生物降解的聚合物(例如琼脂、明胶、藻酸盐、树胶、果胶、聚醇类如鲸蜡醇、油性物质如氢化棕榈油或大豆油、淀粉、蜡质等)。可选地，尽管通常较不优选，可使用不可生物降解的材料，例如聚丙烯酸甲酯、聚醚砜、金属氧化物、碳结构等。
优选地，所述载体选自纳米胶囊、纳米球、微胶囊、微球、聚合物颗粒、由人工木质化的纤维素制造的颗粒、复合凝胶颗粒、弱离子树脂颗粒、微生物细胞或其片段。更优选地，所述载体选自微胶囊、微球或聚合物颗粒。最优选地，所述载体为微胶囊。
在一个优选的实施方案中，包含于所述组合物中的靶向剂包含至少一个结合结构域，其包含4个框架区和3个互补决定区，或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少所述互补决定区之一的一些氨基酸残基)；更优选地，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域衍生自重链骆驼抗体，甚至更优选地，包含于靶向剂中的一或多个所述结合结构域包含VHH序列。甚至仍更优选地，所述VHH包含2个二硫桥。最优选地，所述VHH包含优选选自SEQ ID NO 1–SEQ ID NO 42(3A2、3B4、3B7、3D10、3D2、3D8、3E6、3F5、3F7、3F9、3G2、3G4、3H10、3H8、4A1、5B5、5B6、5C4、5C5、5D4、5E5、5F5、5G2、5G5、5H5、7A2、7C2、7D2、7E1_1、7F1、8B10、8B12、9A1、9B5、9C4、9D5、9E1、9E4、9F4、9H1、9H2和12H4)的序列或其任何合适的片段(然后其通常至少含有形成至少互补决定区之一的一些氨基酸残基)或其同源物。
在另一个优选的实施方案中，包含于本发明的组合物中的靶向剂和载体互相偶联。优选地，所述一个单靶向剂或多靶向剂通过亲和结合或共价结合与所述载体偶联。更优选地，所述一个单靶向剂或多靶向剂通过共价结合与所述载体偶联。优选地，所述一个单靶向剂或多靶向剂通过使用存在于载体外表面的官能团与载体偶联，优选共价偶联。优选地，包含于所述靶向剂中的结合结构域与载体偶联，优选共价偶联。可选地，所述一个单靶向剂或多靶向剂通过包含于靶向剂中的非结合结构域的部分与载体偶联，优选共价偶联。
而在另一个优选的实施方案中，所述载体与至少一种如上述定义的农用化学品偶联和/或包含至少一种如上述定义的农用化学品。优选地，所述农用化学品选自除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀生物剂、肥料、微量营养素、安全剂或植物生长调节化合物。在这个优选的实施方案中，所述组合物用于农用化学品用途。
一或多个靶向剂所结合、偶联或附着或与其相联的载体可能溶解、乳化、悬浮或分散或以其它方式纳入合适液体介质(例如水或另一水性、有机或油性介质)中，从而提供适于储存的(浓缩的)溶液、悬浮液、分散液或乳化液。
例如，当本发明的化合物旨在农用化学品用途时，本发明的化合物可处于适合于喷施的液体、半固体或固体形式，例如溶液、乳化液、悬浮液、分散液、气雾剂、可流动的粉末或任何其它合适的形式。特别的，这样的用于农用化学品用途的本发明的组合物可包括微胶囊、微球、纳米胶囊、纳米球、脂质体或囊泡等，一或多种农用化学品适当地包囊化、封装、包埋、掺入或以其它的方式纳入其中；以及一或多种靶向剂，每种包含一或多个用于与植物或植物的部分(例如植物的叶、茎、花、果实、球茎或块茎)上的一或多个存在于所述结合位点上或之中或形成所述一或多个结合位点的一或多个抗原结合的结合结构域。
本发明第六方面为方法，其用于向植物输送农用化学品或农用化学品组合，所述方法包括本发明的组合物对植物的至少一次施用。
如本文所用，“一次施用”意指对植物或植物部分的单个处理。根据此方法，本发明的组合物原样施用于植物或植物部分，或所述化合物在施用于植物之前首先溶解、悬浮和/或稀释于合适的溶液中。使用任何合适的或所需的用于施用农用化学品或农用化学品组合的人工或机械技术实现对植物的施用，其包括但不限于，喷雾，涂刷，拌种，滴液，浸泡，涂覆，铺展，作为小液滴、细雾或气雾施用。在对植物或植物部分这样施用时，组合物可通过形成包含于组合物中的靶向剂的部分的一或多个结合结构域在结合位点(或与一或多个存在于所述结合位点处或之中，或形成了所述结合位点的抗原)处结合或与之结合，优选以靶向的方式。由此，农用化学品以它们可提供所需的农用化学品作用的方式从载体释放(例如由于载体降解或穿过载体壁的被动转运)。使用本发明的组合物向植物输送农用化学品或农用化学品组合的特别的好处是，它可导致改善的农用化学品或农用化学品组合在植物或植物部分上的沉积和/或提高的农用化学品或农用化学品组合对由于外部因子(例如雨、灌溉、雪、冰雹或风)的损失的耐受。
在一个优选的实施方案中，使用本发明的组合物向植物输送农用化学品或农用化学品组合导致了改善的农用化学品或农用化学品组合的耐雨水冲刷能力(rainfastness)。如本文所用，“改善的耐雨水冲刷能力”意指当农用化学品或农用化学品组合在本发明的组合物中施用时，与包含于不含任何靶向剂的可比性组合物中的相同的农用化学品或农用化学品组合相比，在降雨之前和之后计算的农用化学品或农用化学品组合损失的百分比更小。如本文所用，“可比性组合物”意指除了不存在本发明的组合物所用的靶向剂，所述组合物与本发明的组合物是相同的。
在优选的实施方案中，向植物或植物部分施用适当剂量的包含于本发明的组合物中的所述农用化学品或农用化学品组合。如本文所用，“合适的剂量”意指有效量的包含于所述组合物中的农用化学品活性物质。
优选地，所述方法包括向植物施用有效地降低的剂量的农用化学品或农用化学品组合，以获得与施用包含于(如上述定义的)不含任何靶向剂的类似组合物中的相同的农用化学品或农用化学品组合相比类似的所述农用化学品或农用化学品组合的有益效果。通过使用本发明的靶向剂将所述农用化学品导向至植物获得所述有效的降低。可选地，所述方法包括施用适当剂量的所述农用化学品，其中与施用相同剂量的缺少本发明的靶向剂存在的包囊化的农用化学品组合物的频率相比，其施用的频率有效地减少，获得相似的有益效果。甚至更优选地，所述方法包括施用所述农用化学品，其中与包囊化的缺少本发明的靶向剂存在的农用化学品组合物的适当剂量和应用频率相比，其适当剂量和应用频率都显著降低，获得相似的有益效果。
本发明第七方面为方法，其用于保护植物免受外部(生物或非生物)胁迫和/或调节植物或植物部分活力、生长或产量，和/或在植物或植物部分中调节基因表达，其导致植物成分(例如蛋白质、油、碳水化合物、代谢产物等)(水平的)改变，所述方法包括本发明的组合物的至少一次施用。如果需要，在合适的溶液中溶解、悬浮和/或稀释所述组合物。如本文所用，“保护植物”意指针对任何胁迫对植物的保护；所述胁迫可以是生物胁迫，例如但不限于由杂草、昆虫、啮齿动物、线虫、螨、真菌、病毒或细菌引起的胁迫，或可以是非生物胁迫，例如但不限于干旱胁迫、盐胁迫、温度胁迫或氧化胁迫。
优选地，所述方法包括向植物施用有效地降低的剂量的农用化学品或农用化学品组合，以获得与施用包含于(如前述定义的)不含任何靶向剂的类似组合物中的相同的农用化学品或农用化学品组合相比类似的所述农用化学品或农用化学品组合的有益效果。通过使用本发明的靶向剂将所述农用化学品导向至植物获得所述有效降低。可选地，所述方法包括施用适当剂量的所述农用化学品，其中与施用相同剂量的缺少本发明的靶向剂存在的包囊化的农用化学品组合物的频率相比，其施用的频率有效地减少，获得相似的有益效果。甚至更优选地，所述方法包括施用所述农用化学品，其中与包囊化的缺少本发明的靶向剂存在的农用化学品的适当剂量和施用频率相比，其适当剂量和施用频率都显著降低，获得相似的有益效果。
本发明第八方面是方法，其用于制造特异性靶向的农用化学品载体，所述方法包括(a)将农用化学品包转入载体内或包装于(到)载体上和(b)将使至少一种本发明的靶向剂附着至载体。
如本文所用，“包装”意指掺入、纳入、固定、吸附、吸收、结合、包囊化、包埋、附着、混合、锚定或包含。将农用化学品(如上述定义)包装入载体内或包装于(到)载体上的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于滴注、挤出造粒、流化床造粒、共挤出、喷雾干燥、喷雾冷冻、雾化、加成或缩合聚合、界面聚合、原位聚合、凝聚、喷雾包囊化、冷却熔融分散、溶剂蒸发、相分离、溶剂萃取、溶胶-凝胶聚合、高或低剪切混合、流化床涂层、锅包衣、熔化、被动或主动吸收或吸附。在一个优选的但非限制性的实施方案中，使用合适的微胶囊化技术将农用化学品包装入微载体中，例如界面聚合、原位聚合、凝聚、喷雾包囊化、冷却熔融分散、溶剂蒸发、相分离、溶剂萃取或溶胶-凝胶聚合。用于生产这样的微载体的合适的材料的优选但非限制性的实例为，例如藻酸盐、琼脂、明胶、果胶、树胶、氢化油、淀粉、蜡、聚醇类、聚脲、聚氨酯、聚酰胺、三聚氰胺、脲/甲醛、尼龙和其它(任选地并且通常优选可生物降解的或惰性的)聚合物材料。更优选地，在微载体外表面至少存在一个官能团。
通过共价键、氢键、偶极-偶极相互作用、弱范德华力或任何前述的组合，使至少一种本发明的靶向剂附着于载体。可以在将农用化学品包装入载体内或包装于(到)载体上时进行靶向剂与载体的连接，它可在将农用化学品包装入载体内或包装于(到)载体上之后进行，或它可仅在为了施用而将含有农用化学品的载体溶解于适当溶液的时候进行。将所述靶向剂附着于载体的合适的方法对本领域技术人员是清楚的。在一个优选的实施方案中，靶向剂和载体互相偶联。优选地，所述靶向剂通过亲和结合或共价结合与所述载体偶联。更优选地，所述靶向剂通过共价结合与所述载体偶联。优选地，所述靶向剂通过使用存在于载体外表面的官能团与载体偶联，优选共价偶联。优选地，包含于所述靶向剂中的结合结构域与载体偶联，优选共价偶联。可选地，所述靶向剂通过包含于靶向剂中的非结合结构域的部分与载体偶联，优选共价偶联。在一个优选的实施方案中，将所述靶向剂附着于载体的方法包括(a)使连接剂与载体反应，和(b)使至少一个靶向剂与所述连接剂反应。
本发明的第九方面是方法，其用于将本发明的靶向剂附着于载体，其包括(a)使连接剂与载体反应，和(b)使所述靶向剂与所述连接剂反应。如本文所用，“反应”意指将连接剂置于可使连接剂与载体和/或靶向剂结合的条件下。
本发明第十方面是特异性靶向农用化学品载体，其通过上述描述的方法获得。如本文所用，“特异性靶向”意指载体通过至少一个与载体相附着(优选偶联，最优选共价结合)的本发明的靶向剂，可特异地与植物或植物部分上的结合位点结合。
本发明最后的方面是本发明的任何结合结构域在分离负责与结合位点或包含于所述结合位点中的抗原特异结合的氨基酸序列以及基于所述氨基酸序列构建人工结合结构域中的用途。事实上，在本发明的结合结构域中，框架区和互补决定区是已知的，并且对结合结构域的衍生物的研究将允许推断出涉及与结合位点或包含于所述结合位点中的抗原的结合所必需的氨基酸，所述衍生物与结合结构域结合相同的结合位点或包含于所述结合位点中的抗原。此知识可用于构建最小结合结构域并创造其衍生物。
附图概述
图1：结合结构域(VHH)与叶表面的结合
图1A：PBS中5μg/ml的VHH 3E6与天然马铃薯叶表面结合。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测。VHH 3E6结合叶表面、气孔、腺表皮毛和叶毛。
图1B：PBS中5μg/ml的VHH 3E6与天然马铃薯叶表面结合。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测；用Leica SP5共聚焦显微镜系统成像。VHH 3E6结合叶表面、气孔、腺表皮毛和叶毛。
图1C：PBS中5μg/ml的VHH 5D4与天然马铃薯叶表面结合。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测。VHH 5D4结合叶表面、气孔、腺表皮毛和叶毛。
图1D：PPBS中5μg/ml的CBM3a与马铃薯叶盘边缘受伤的植物组织结合。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测。CBM3a不与叶表面、气孔、腺表皮毛或叶毛结合，而仅与马铃薯叶盘边缘受伤的植物组织结合，其在通过叶穿孔制备样品时造成。
图1E：在天然马铃薯叶表面不添加一抗(空白PBS)。与直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体孵育。
图1F：PBS中5μg/ml的VHH 3E6与天然龙葵叶表面结合。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测。VHH 3E6结合叶表面、腺表皮毛和叶毛。
图1G：PBS中5μg/ml的VHH 3E6与天然禾本科植物(grass)叶表面结合。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测。VHH 3E6与叶表面和马铃薯叶盘边缘受伤的植物组织结合，其在通过叶穿孔制备样品时造成。
图2：结合结构域(VHH)与完整活植物的结合
图2A：PBS中5μg/ml的VHH 3E6与完整活植物结合。将与盆栽马铃薯植物连接的叶浸没于VHH 3E6溶液中。取叶样品。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测。VHH 3E6结合叶表面、气孔、腺表皮毛和叶毛。
图2B：PBS中5μg/ml的VHH 3E6与完整活植物结合。将与盆栽马铃薯植物连接的叶浸没于VHH 3E6溶液中。取叶样品。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测。截取自全叶标记。VHH 3E6结合叶表面、气孔、腺表皮毛和叶毛。
图3：结合结构域与微胶囊的偶联
图3A：通过1步EDC偶联化学偶联有VHH 3E6的微胶囊。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体标记偶联的微胶囊。用Leica SP5共聚焦显微镜系统成像。通过1步偶联化学将VHH 3E6与微胶囊表面偶联。
图3B：通过2步EDC/NHS偶联化学偶联有VHH 3E6的微胶囊。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体标记偶联的微胶囊。用LeicaSP5共聚焦显微镜系统成像。通过2步EDC/NHS偶联化学将VHH 3E6与微胶囊表面相偶联。
图3C：不通过共价偶联将微胶囊与VHH 3E6孵育。用直接与Alexa-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体标记被动吸附的VHH。用Leica SP5共聚焦显微镜系统成像。较小部分的VHH 3E6被动吸附至微胶囊表面。
图3D：不与VHH孵育而仅与直接缀合于Alexa-488荧光染料的抗组氨酸抗体孵育的微胶囊作为对照条件。用Leica SP5共聚焦显微镜系统成像。较小部分的VHH 3E6被动吸附至微胶囊表面。
图4：微胶囊与叶表面的结合和保留
含荧光示踪分子的微胶囊在天然马铃薯叶盘上的叶盘结合测定。对比了偶联有特异性植物结合VHH的微胶囊、偶联有无关对照VHH的微胶囊或空白微胶囊的结合和保留。与空白微胶囊相比，9倍的偶联有特异性VHH的微胶囊结合并保留在马铃薯叶盘上。
图5：使用偶联有靶向剂的微胶囊剂量的减少
含荧光示踪分子的微胶囊在天然马铃薯叶盘上的叶盘结合测定。对比了不同浓度的微胶囊和偶联有特异性植物结合VHH的微胶囊、偶联有无关对照VHH的微胶囊或空白微胶囊的结合和保留。与空白微胶囊相比，多至8倍的偶联有特异性VHH的微胶囊结合并保留在马铃薯叶盘上。
实施例
实施例1：VHH的产生和选择
用阿拉伯树胶、马铃薯叶匀浆或小麦叶匀浆免疫美洲驼(llama)
称量5g来自金合欢树的阿拉伯树胶(Sigma)并溶解于50ml水制备阿拉伯树胶溶液。使用Bradford蛋白质测定确定总蛋白质浓度。进行分装，储存于-80℃并用于免疫。在液氮中冷冻叶并用研钵和研杵将所述叶匀质化直至获得细粉制备马铃薯植物(Solanum tuberosum Désirée品种)或小麦植物(Triticum aestivum Boldus品种)的匀质化的叶。使用Bradford蛋白质测定确定总蛋白质浓度。进行分装，储存于-80℃，悬浮液用于免疫。
根据标准步骤，以每周间隔，肌肉注射阿拉伯树胶、匀质化的马铃薯叶或匀质化的小麦叶6次免疫美洲驼。用阿拉伯树胶免疫2只美洲驼，“404334”和。用匀质化的马铃薯叶免疫3只美洲驼，“407928”、“Chilean Autumn”和“Niagara”，而用小麦叶免疫另外2只美洲驼“33733”和“Organza”。使用佐剂LQ(Gerbu)免疫美洲驼“404334”、“407928”和“33733”，而使用弗氏不完全佐剂(FIA)免疫美洲驼、“Chilean Autumn”、“Niagara”和“Organza”。用于免疫美洲驼“404334”的剂量为第0、7、14、21、28、35天每天350μg，在第40天收集外周血淋巴细胞(PBL)。用于免疫美洲驼“407928”和“33733”的剂量为第0、7、14、21、28、36天每天1mg，在第40天收集PBL。在第40天收集PBL的时候，收集美洲驼“404334”、“407928”和“33733”的血清。用于免疫美洲驼、“Chilean Autumn”、“Niagara”和“Organza”的剂量为第0天100μg而第7、14、21、28和35天50μg。在第0天、第25天和收集PBL的时候，收集美洲驼、“Chilean Autumn”、“Niagara”和“Organza”的血清。
文库构建-对每只被免疫的美洲驼制作了独立的VHH文库。从外周血淋巴细胞分离RNA，随后根据制造商说明使用随机六聚体引物和Superscript III(Invitrogen)合成cDNA。使用正向引物混合物[1:1比例的call001(5’-gtcctggctgctcttctacaagg-3’)和call001b(5’-cctggctgctcttctacaaggtg-3’)]和反向引物call002(5’-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3’)进行第一轮PCR以扩增VHH和VH。分离VHH片段后，使用正向引物A6E(5’-gatgtgcagctgcaggagtctggrggagg-3’)和反向引物38(5’-ggactagtgcggccgctggagacggtgacctgggt-3’)进行第二轮PCR。使用限制性酶PstI和Eco91I(Fermentas)消化PCR片段，并将其连接于pMES4载体(GenBank：GQ907248.1)中pIII基因的上游。根据标准方案将连接产物乙醇沉淀，重悬于水中并电穿孔转化入TG1细胞。文库大小为从1E+08至6E+08个独立的克隆。对从文库中随机挑选的克隆进行单菌落PCR以评估文库的插入百分比。所有的文库具有≥90％的插入百分比，除了来自免疫的美洲驼“Organza”的文库具有80％的插入百分比。美洲驼“404334”、“407928”、“33733”、“Chilean Autumn”、、“Niagara”和“Organza”的文库分别编号为25、27、28、29、30、31、32。根据标准步骤使用VCSM13辅助噬菌体生产每个文库的噬菌体。
针对阿拉伯树胶、植物表皮提取物或全叶的噬菌体选择。
称量5g阿拉伯树胶并溶解于50ml水制备阿拉伯树胶溶液。进行分装并储存于-20℃直至使用。由马铃薯植物茎的薄片(thin strips)制备马铃薯植物角质层和粘附表皮(adhering epidermis)提取物。由小麦鞘叶的薄片制备小麦植物角质层和粘附表皮提取物。依次分别使用CDTA和NaOH(Molle等人，2007)提取富集细胞壁聚糖和非纤维素多糖的提取物。薄片冷冻于液氮并用研钵和研杵研磨直至获得细粉。通过使用每克研磨材料10ml 50mMpH 6.5的CDTA重悬细粉并在4℃颠倒旋转30分钟制备细胞壁聚糖富集的提取物。使用装配有滤器的注射器分离提取物和不溶性材料。通过在微型离心机中20,000g离心5分钟进一步清洗提取物。使用每克不溶性材料10ml 4M NaOH和1％NaBH4，并在4℃颠倒旋转30分钟从CDTA提取后的不溶性材料中制备非纤维素多糖富集的提取物。使用装配有滤器的注射器分离提取物和不溶性材料。通过在微型离心机中20,000g离心5分钟进一步清洗提取物。
在用含1mg/ml或10μg/ml阿拉伯树胶的0.1M pH 8.3的碳酸缓冲液包被的96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔中进行第一轮针对阿拉伯树胶的选择。4℃过夜进行包被。用PBS/0.05％吐温-20洗涤孔3次，并用含5％脱脂奶粉的PBS(5％MPBS)封闭。在2.5％MPBS中重悬噬菌体，对每个孔使用大约2E+11cfu。室温与孔结合2小时后，通过用PBS/0.05％吐温-20和PBS大量洗涤去除未结合的噬菌体。室温下用含0.1mg/ml胰蛋白酶(Sigma)的PBS洗脱结合的噬菌体30分钟。将洗脱的噬菌体转移至含有过量AEBSF胰蛋白酶抑制剂(Sigma)的聚丙烯96孔板(Nunc)。比较靶包被的孔的噬菌体滴度与空白孔的噬菌体滴度以评估富集度。根据标准步骤使用新鲜TG1细胞扩增噬菌体。
与第一轮选择相似地进行第二轮选择，除了对文库25和30用10μg/ml和0.1μg/ml的阿拉伯树胶替代1mg/ml和10μg/ml的阿拉伯树胶来包被孔。在第一轮选择中文库27、28、29、31和32没有获得显著的富集。在第二轮选择中文库28、31和32富集>1000倍，而文库27和29分别富集25倍和250倍。在第一轮选择中文库25和30分别富集50倍和>1000倍。在第二轮选择中，两个文库都富集1000倍。针对马铃薯表皮CDTA提取物的选择与针对阿拉伯树胶的选择相似地进行，但第一轮和第二轮选择用10倍和1000倍稀释的马铃薯表皮CDTA提取物包被孔。第一轮选择中文库25、27、28、29、30、31、32分别富集10、1E+03、20、20、>1E+04、15和5倍，而第二轮选择中所有文库>100倍。针对小麦表皮CDTA提取物的选择与针对马铃薯表皮CDTA提取物的选择相似地进行，但第一轮和第二轮选择用20倍和2000倍稀释的小麦表皮CDTA提取物包被孔。第一轮选择中文库25、27、28、29、30、31、32分别富集>10、>100、>10、1、>1E+03、10和5倍。第二轮选择中文库29富集>10倍，文库25、27、28、30、31、32富集>100倍。针对马铃薯叶的选择在两轮连续的选择中进行，第一轮中使用叶颗粒而第二轮中使用全叶。文库27、28、29、30、31和32用于针对叶的选择。通过使用Ultra-Turrax T25匀浆器在PBS中搅拌马铃薯叶制备用于第一轮选择的叶颗粒。通过离心从悬液中收集叶颗粒。上清液，这里称为“匀质化的叶的可溶部分”，预期(assumingly)是细胞内组分富集的，并在噬菌体选择期间在溶液中使用以竞争掉胞内表位的结合子。室温下在2％MPBS中颠倒旋转30分钟将文库噬菌体与匀质化的叶的可溶部分预孵育。将混合物加入叶颗粒并室温颠倒旋转孵育2小时。通过离心收集结合有噬菌体的叶颗粒，并丢弃上清液。通过连续用PBS洗涤充分洗涤结合有噬菌体的叶颗粒。通过在PBS中重悬叶颗粒、旋转沉降叶颗粒并丢弃上清液进行洗涤。如前述进行噬菌体洗脱和TG1感染。第二轮选择使用完整的全叶。叶倒置漂浮于2％MPBS中的噬菌体溶液中孵育，并允许噬菌体室温结合2小时。通过将叶转移至含PBS的新鲜管中充分洗涤叶。用水中100mM的TEA进行结合的噬菌体的洗脱，并用洗脱的噬菌体一半体积的pH 7.5的1MTris中和含洗脱的噬菌体的溶液。如前述进行TG1感染。
从选择结果挑取单菌落-从文库25和30针对阿拉伯树胶的第一和第二轮选择中挑取单个的克隆。在第二轮选择而不是第一轮选择之后从文库27、28、29、31和32针对阿拉伯树胶的选择中挑取克隆。从阿拉伯树胶的选择总共挑取208个克隆。在所有文库的第一和第二轮选择之后，从针对马铃薯表皮CDTA提取物的选择中总共挑取321个克隆。在所有文库的第二轮选择之后，从针对小麦表皮CDTA提取物的选择中总共挑取162个克隆。在文库27、28、29、30、31和32第二轮选择之后，从马铃薯叶的选择中总共挑取184个克隆。用系列稀释的洗脱的噬菌体感染新鲜的TG1细胞，并涂布于LB琼脂；2％葡萄糖；100μg/ml氨苄青霉素上。将单克隆挑取入每孔含100μl 2×TY；10％甘油；2％葡萄糖；100μg/ml氨苄青霉素的96孔板中。37℃孵育平板并储存于-80℃作为母板(master plate)。
实施例2：VHH的鉴定
单点结合ESLISA-使用单点结合ELISA鉴定与阿拉伯树胶或植物提取物结合的克隆。如下述制备用于ELISA的含VHH的提取物。从母板接种至96孔板(每孔含100μl 2×TY、2％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素)并在37℃生长过夜。每孔25μl的过夜培养物用于接种至每孔含1ml 2×TY；0.1％葡萄糖；100μg/ml氨苄青霉素的96孔深孔板中。37℃孵育器摇动生长3小时后，加入IPTG至终浓度1mM，另外孵育4小时期间将产生重组VHH。通过3,000g离心20分钟旋转沉降细胞并储存于-20℃过夜。解冻细胞沉淀，简单振荡，每孔加入125μl室温PBS。在ELISA摇床平台上室温15分钟重悬细胞。将平板3,000g离心20分钟，每孔100μl含VHH的提取物转移至聚丙烯96孔板(Nunc)并储存于-20℃直至进一步使用。
在用含1mg/ml阿拉伯树胶的pH 8.3的碳酸缓冲液包被的ELISA平板(100μl/孔)中分析来自阿拉伯树胶选择的克隆的结合。对马铃薯表皮CDTA提取物和小麦表皮CDTA提取物分析来自马铃薯表皮CDTA提取物选择的克隆的结合，其使用以100μl/孔的在0.1M pH8.3的碳酸缓冲液中的30倍稀释的马铃薯和30倍稀释的小麦表皮CDTA提取物包被的ELISA平板。使用以100μl/孔的0.1M pH8.3的碳酸缓冲液中的20倍稀释的小麦表皮CDTA提取物包被的ELISA平板分析来自小麦表皮CDTA提取物的选择的克隆的结合。4℃包被过夜并第二天继续室温包被1小时后，用PBS/0.05％吐温-20洗涤平板3次，并用含5％脱脂奶粉的PBS封闭1.5小时。清空平板并每孔加入90μl 1％的MPBS。将来自每个克隆的10μl含VHH的提取物加入抗原包被的孔和空白孔。使VHH室温结合1小时，通过PBS/0.05％吐温-20洗涤3次去除未结合的VHH。依次与含单克隆小鼠抗组蛋白抗体(Abd Serotec)的1％MPBS/0.05％吐温-20和含与碱性磷酸酶缀合的兔抗鼠IgG全分子抗体(RaM/AP)(Sigma)的1％MPBS/0.05％吐温-20孵育检测结合的VHH。通过PBS/0.05％吐温-20洗涤3次去除未结合的抗体。用PBS另外洗涤平板2次并每孔加入100μl pNPP二钠六水化合物底物(Sigma)。
测量405nm的吸光度并计算每个克隆与靶包埋的孔和无靶包埋的孔结合的VHH比值。23％的克隆具有大于2的比值，首先挑取这些克隆用于更详细的鉴定。之后再复查具有1.15和2之间的比值的第二组克隆(包括所有克隆的10％)。具小于1.15比值的克隆不进一步分析。
对来自全叶的选择的克隆，开发了修改的ELISA。倒置漂浮的叶盘用于替代用抗原包埋孔。与提取物ELISA相似地孵育。与底物孵育后，用镊子从孔中去除叶盘并测量405nm的吸光度。每个克隆获得的信号与含没有与一抗孵育的叶盘的孔获得的信号相比，计算比值。从表皮提取物的选择发现并鉴定的叶表面结合抗体用作阳性对照抗体。通过测序进一步分析具大于1.5比值的VHH。
单菌落PCR和测序-如下述对ELISA阳性克隆进行单菌落PCR和测序。来自含ELISA阳性的克隆的母板孔的培养物在蒸馏水中稀释10倍。5μl这些稀释的克隆用作PCR模板，其使用正向引物MP57(5’-ttatgcttccggctcgtatg-3’)和反向引物GIII(5’-ccacagacagccctcatag-3’)。通过Sanger测序法测序PCR产物，其使用MP57引物(VIB Genetic ServiceFacility，University of Antwerp，Belgium)。
抗体生产和纯化-根据标准步骤在大肠杆菌抑制株TG1或非抑制株WK6中生产VHH抗体片段(Fritz等人，Nucleic Acids Research，Volume 16Number 14 1988)。简单地，进行菌落划线并将单菌落的过夜培养物接种于2×TY；2％葡萄糖；100μg/ml氨苄青霉素中。过夜培养物用于1:100在2×TY；0.1％葡萄糖；100μg/ml氨苄青霉素中接种新鲜培养物。37℃孵育器摇动生长3小时后，加入IPTG至终浓度1mM，另外孵育4小时期间将产生重组VHH抗体片段。将细胞旋转沉降并重悬于1/50th初始培养物体积的周质提取缓冲液(50mM pH7的磷酸；1M NaCl；1mM EDTA)中，4℃颠倒旋转孵育过夜。通过3,000g 4℃离心20分钟旋转沉降原生质球。将上清液转移至新鲜管中并再次3,000g 4℃离心20分钟。根据制造商说明使用1/15th提取物体积的TALON金属亲和树脂(Clontech)从周质提取物中纯化六聚组氨酸标记的VHH抗体片段。根据制造商说明使用Vivaspin 5k Da MWCO装置(Sartorius Stedim)在PBS中浓缩并透析纯化的VHH抗体片段。
在ELISA中VHH与阿拉伯树胶结合-在每孔用100μl含100μg/ml阿拉伯树胶的50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液包被的ELISA平板上进行VHH抗体片段的滴定。4℃过夜包被平板并第二天继续室温包被1小时。用PBS/0.05％吐温-20洗涤平板3次并用含5％脱脂奶粉的PBS封闭1小时。在含1％MPBS/0.05％吐温-20的聚丙烯96孔板中制备4倍系列稀释的纯化的VHH抗体片段。抗体浓度范围从3μg/ml至12ng/ml。将抗体稀释液转移至阿拉伯树胶包被的平板并使VHH抗体片段室温结合1小时。依次与单克隆小鼠抗组蛋白抗体(Abd Serotec)和含与碱性磷酸酶缀合的兔抗鼠IgG全分子抗体(RaM/AP)(Sigma)的1％MPBS/0.05％吐温-20孵育检测结合的VHH。每次抗体孵育后用PBS/0.05％吐温-20洗涤3次去除未结合的抗体。用PBS另外洗涤平板2次并每孔加入100μl pNPP二钠六水化合物底物(Sigma)。测量405nm的吸光度并绘制为抗体浓度的函数(见表1)。
表1：
在ELISA中VHH与马铃薯凝结素结合
每孔用100μl含100μg/ml马铃薯凝集素(Sigma)的PBS 4℃过夜包被ELISA平板(Maxisorp，Nunc)并第二天继续室温包被1小时。用PBS/0.05％吐温-20洗涤平板3次并用含5％脱脂奶粉的PBS封闭1小时。将VHH(3μg/ml)转移至马铃薯凝集素包被的平板并使VHH抗体片段室温结合1小时。依次与单克隆小鼠抗组蛋白抗体(Abd Serotec)和含与碱性磷酸酶缀合的兔抗鼠IgG全分子抗体(RaM/AP)(Sigma)的1％MPBS/0.05％吐温-20孵育检测结合的VHH。每次抗体孵育后用PBS/0.05％吐温-20洗涤3次去除未结合的抗体。用PBS另外洗涤平板2次并每孔加入100μl pNPP二钠六水化合物底物(Sigma)，测量405nm的吸光度(见表2)。
表2：
VHH 3E6 VHH 5D4 VHH 5C4 VHH 5G5 VHH 7D2 <空白
阿拉伯树胶 0,882 0,530 0,873 0,751 0,274 0,069
马铃薯凝集素 4,000 4,000 4,000 4,000 4,000 0,081
空白 0,067 0,072 0,071 0,073 0,072 0,072
实施例3：结合结构域与植物表面的结合
VHH与叶盘结合-研究了VHH与马铃薯(Désirée品种)、龙葵、禾本科植物、小麦或杜鹃未固定的叶盘的结合。平行分析了CBM3a与未固定的马铃薯(Désirée品种)叶盘的结合用于比较。通过用5mm的皮带打孔工具穿孔新鲜马铃薯叶制备叶盘。立即将叶盘放入每孔含200μl 5％的MPBS或PBS的96孔板的孔中并孵育30分钟。将叶盘分别转移至含5μg/ml VHH抗体片段的2％MPBS或含5μg/m CBM3a的PBS的溶液中并孵育60-90分钟。通过用2％MPBS或PBS洗涤3次去除未结合的VHH或CBM3a蛋白质。在1％MPBS中与直接缀合于Alexa-488荧光染料(Abd Serotec)的单克隆小鼠抗组氨酸抗体孵育1小时来检测结合的VHH或CBM3a蛋白质。用PBS洗涤3次去除未结合的抗体。将叶盘放置于玻璃载玻片上，盖上盖玻片，并用显微镜或在大变焦显微镜系统(Nikon)或SP5共聚焦显微镜系统(Leica)上分析。通过非限制性的实例，发现VHH抗体片段(例如3E6，5D4)明确地与马铃薯叶的叶表面上的表皮毛、气孔和角质层结合(图1A-C)。与此形成鲜明对比的是，在马铃薯叶表面没有检测到CBM3a的结合，而在马铃薯叶盘的切割边缘仅观察到与受伤组织的微弱的结合(图1D)。一些本发明的VHH(例如3E6)还显示出对龙葵叶或禾本科植物叶表面的特异性结合，如图1F和1G中分别所示。没有观察到对小麦或杜鹃叶表面的显著结合。
VHH与完整活植物的结合-在盆栽马铃薯植物上(Desirée品种)研究了VHH与完整活植物的结合。将完整活植物的复叶浸没入含六聚组氨酸标记的VHH的PBS溶液中，或单独浸入PBS中作为对照条件，保留复叶与植物连接。使VHH结合1小时。然后，将仍连接于植物的复叶在锥形瓶(Erlenmeyer flasks)内PBS中洗涤5次。对不同的叶、叶柄区取样。在PBS中与直接缀合于Alexa-488荧光染料(Abd Serotec)的单克隆小鼠抗组氨酸抗体孵育1小时来检测结合的VHH。用PBS洗涤5次去除未结合的抗组氨酸抗体。用显微镜分析整个叶、叶盘或叶柄区结合的VHH。如图2所示，证实了VHH结合叶结构例如表皮毛和气孔、叶表面和叶柄区。没有观察到无关对照VHH的结合，证实了本发明的VHH能够特异性地与完整活植物结合。
在水中的VHH结合-在从马铃薯植物(Desirée品种)叶切下的叶盘上研究了在水中VHH与叶表面的结合。在超纯水中洗涤叶盘3次。在超纯水中稀释六聚组氨酸标记的VHH，添加至叶盘并使其结合1小时。尽管VHH的储液是在PBS中，这里使用的稀释(200倍至5μg/ml或2000倍至500ng/ml)导致来自储液的PBS显著的稀释，并可被认为是足够稀释的以代表在水中的结合。使VHH结合1小时后，用超纯水洗涤叶盘5次。在PBS中与直接缀合于Alexa-488荧光染料(Abd Serotec)的单克隆小鼠抗组氨酸抗体孵育1小时来检测结合的VHH。用PBS洗涤5次去除未结合的抗组氨酸抗体。用显微镜分析叶盘结合的VHH。如之前描述地分析在PBS中VHH的结合作为对照条件。用与Alex-488荧光染料缀合的抗组氨酸抗体检测结合的VHH，对未结合的抗组氨酸抗体的洗去和用显微镜对VHH结合的分析如水中VHH的结合实验同样进行。证实了VHH在水中可结合叶结构(例如表皮毛和气孔)和叶表面。没有观察到无关对照VHH的结合。所观察到的在水中的结合与在PBS中进行的平行试验中见到的相似。本发明的VHH能够在水中结合叶结构和叶表面。
VHH结合动力学-为了进一步测试VHH在温室或田间施用中(其中结合应该需要在应用后迅速完成)作为结合物的可应用性，采用了叶浸VHH结合实验测试完成可检测的结合的最小VHH孵育时间。使用打孔工具切下的马铃薯叶盘(Desirée品种)并在PBS中洗涤3次。在PBS中制备5μg/ml六聚组氨酸标记的VHH的预稀释液并与叶盘孵育不同的时间。孵育的时间为10秒、30秒、1分钟、5分钟、20分钟或1小时。用PBS洗涤5次去除未结合的VHH。在PBS中与直接缀合于Alexa-488荧光染料(AbdSerotec)的单克隆小鼠抗组氨酸抗体孵育1小时来检测结合的VHH。用PBS洗涤5次去除未结合的抗组氨酸抗体。用显微镜分析叶盘结合的VHH。对每个含特异性VHH的样品观察到特异性的结合，孵育时间从10秒至VHH孵育时间1小时。没有观察到无关对照VHH的结合。本发明的VHH在应用后的10秒之内显示了可检测的与叶结构(例如表皮毛和气孔)和叶表面的结合。
不同pH下的VHH结合-为了测试VHH在温室或田间应用中(其中结合应该可发生于强烈偏离抗体天然结合其靶的生理条件的pH值下)作为结合物的可应用性，在一系列不同pH的溶液中进行叶浸VHH结合实验。制备下述溶液：pH2.0的50mM甘氨酸，pH4.0的50mM醋酸钠，pH9.6的50mM碳酸钠和pH11.0的10mM氢氧化钠。使用打孔工具切下的马铃薯叶盘(Desirée品种)。首先通过用不同pH的溶液洗涤3次将叶盘与不同的pH平衡。将六聚组氨酸标记的VHH在不同pH的溶液中稀释至5μg/ml，添加至相应的平衡的叶盘，并使VHH结合1小时。与VHH孵育后，用相应的不同pH的溶液洗涤叶盘3次。之后，用PBS洗涤所有的叶盘2次以将其与PBS平衡。在PBS中与直接缀合于Alexa-488荧光染料(Abd Serotec)的单克隆小鼠抗组氨酸抗体孵育1小时来检测结合的VHH。用PBS洗涤5次去除未结合的抗组氨酸抗体。用显微镜分析叶盘结合的VHH。一些本发明的VHH(例如VHH 3E6)在测试的整个pH2-pH11的范围显示了可检测的与叶盘的结合。
不同温度下的VHH结合-为了测试VHH在温室或田间应用中(其中结合应该可发生于不同的，有时甚至是极端的温度下)作为结合物的可应用性，使用了不同温度下的叶浸VHH结合实验。所所用的温度为4℃、室温、37℃、55℃或70℃。使用打孔工具切下的马铃薯叶盘(Desirée品种)。通过用不同温度的PBS洗涤3次将叶盘与不同的温度平衡。将六聚组氨酸标记的VHH在不同的温度下稀释至5μg/ml，添加至相应的平衡的叶盘，并使VHH在不同的温度结合1小时。与VHH孵育后，用室温的PBS洗涤叶盘5次。在PBS中与直接缀合于Alexa-488荧光染料(Abd Serotec)的单克隆小鼠抗组氨酸抗体室温孵育1小时来检测结合的VHH。室温下用PBS洗涤5次去除未结合的抗组氨酸抗体。用显微镜分析叶盘结合的VHH。本一些本发明的VHH(例如VHH 3E6)在4-55℃的温度范围显示了可检测的与叶盘的结合。请注意在70℃浸没于PBS中1小时后叶盘遭受严重的破坏，但仍检测到该VHH的结合。
实施例4：靶向剂与微粒的偶联
二价VHH的构建、生产和纯化-通过将2个VHH序列串联克隆入pASF22载体中创建在2个VHH之间含9甘氨酸-丝氨酸接头(GGGGSGGGS)的2个VHH的融合，在细菌中生产二价VHH结构。pASF22是本机构内部产生的pMES衍生物。所用的标签是C末端的c-Myc(EQKLISEEDLN)和六聚组氨酸(HHHHHH)。将3丙氨酸接头(AAA)置于VHH的C末端与c-Myc标签之间，而在c-Myc标签的C末端与六聚组氨酸标签之间使用甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸(GAA)接头。所使用的二价VHH的C末端的完整序列为：AAA-EQKLISEEDLN-GAA-HHHHHH。从菌落划线开始并接种于补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基生产新鲜的过夜培养物。过夜培养物用于1:100在含0.1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基中接种新鲜培养物。37℃孵育器摇动生长3小时后，加入IPTG至终浓度1mM，另外孵育4小时期间将产生重组二价VHH。将细胞旋转沉降并重悬于1/50th初始培养物体积的PBS中，4℃颠倒旋转孵育30分钟。通过3,000g 4℃离心20分钟旋转沉降原生质球。将上清转移至新鲜管中并再次3,000g 4℃离心20分钟。收集上清并将氯化钠浓度调整至500mM，咪唑浓度至20mM。遵循标准步骤在AKTAxpress系统(GE Lifesciences)上使用HisTrap FF Crude 5ml IMAC柱(GE Lifesciences)和HiLoad 16/60Superdex 75制备级凝胶过滤柱(GE Lifesciences)从提取物中纯化出六聚组氨酸标记的二价VHH。
VHH与微粒的偶联-首先检查与微粒共价结合的VHH是否可结合其靶并可提供对含有抗原的表面的足够的附着力以靶向微粒。将微粒与阿拉伯树胶特异的VHH抗体片段偶联并且研究了与用阿拉伯树胶包被的ELISA平板的结合。
制备了不同类型的微粒。根据制造商说明将纯化的VHH抗体片段(i)与Φ2.8μm的顺磁M-270羧酸Dynabeads(Dynal，Invitrogen)偶联，其使用EDC活化珠并随后与VHH抗体片段偶联的2步偶联化学，和(ii)使用1步偶联化学与Φ2μm的FluoSpheres荧光微球(Molecular Probes，Invitrogen)偶联。
简言之，对与M-270羧酸Dynabeads的偶联：使用Vivaspin 5k Da旋转过滤装置(Sartorius Stedim)对50mM，pH5.0的MES缓冲液透析VHH。通依次用10mM NaOH洗涤2次和用水洗涤3次，并用0.1M EDC(Pierce)室温活化30分钟制备珠。快速地依次用冰冷的水和冰冷的50mM pH5.0的MES缓冲液洗涤EDC活化的珠。最后一次洗涤时分装珠。将100μl中含60μg VHH抗体片段的50mM pH5.0的MES添加至3mg珠并室温孵育30分钟。收集偶联后的上清。通过测量未结合部分的蛋白质A280，计算结合的和未结合的VHH的量。多于95％的VHH抗体片段与珠偶联。用50mMpH7.4的Tris封闭珠并用PBS/0.1％吐温-20洗涤3次，储存于4℃。简言之，对与FluoSpheres荧光微球的偶联：使用Vivaspin 5k Da旋转过滤装置(Sartorius Stedim)对50mM，pH6.0的MES缓冲液透析VHH。0.8μm PES过滤装置(Sartorius Stedim)用于整个将珠从溶液分离的过程。通过用超纯水洗涤并重悬于超纯水中制备珠。将100μl含200μg VHH的VHH抗体片段添加至100μl珠。将0.8mg EDC(Pierce)添加至每个珠与VHH的混合物并用0.1M NaOH将pH调整至6.5。室温2小时进行偶联。加入甘氨酸至终浓度100mM并室温孵育30分钟以猝灭反应。通过测量未结合部分的蛋白质A280，计算结合的和未结合的VHH的量。14％和33％之间的不同的VHH抗体片段与珠偶联。用50mM pH7.4的磷酸盐；0.9％NaCl(50mM PBS)洗涤珠2次并储存于含1％BSA，2mM叠氮化钠的50mM PBS中。
靶向剂与含有荧光示踪剂或活性成分的微胶囊的偶联-通过界面聚合生产聚脲微胶囊。为了产生功能化的聚脲微胶囊的目的，将VHH与含有杀虫剂λ氯氟氰菊酯或荧光示踪分子Uvitex OB和壳的微胶囊偶联，所述壳在表面暴露的羧酸残基具掺入的赖氨酸。在包囊化前，λ氯氟氰菊酯以30％-66％之间的浓度溶于苯甲酸苄酯中。可选地，使用含1.5％的Uvitex的苯甲酸苄酯核心使微胶囊易于荧光可视化。甲苯二异氰酸酯(TDI)和多亚甲基多苯基多异氰酸酯(PMPPI)以不同的比例和浓度溶于油相以生产所需的壳特性。乳液的搅拌速度是不同的以控制液滴大小和微胶囊直径。成功地生产了具大约5μm、10μm或50μm直径的微胶囊。双功能的赖氨酸和三功能的二乙烯三胺(DETA)以不同的比例使用和/或在包囊化期间依次添加，一方面最大化微胶囊表面上的羧酸量，另一方面获得足够的胶囊壳强度。生产后用水洗涤微胶囊并在水中储存为微胶囊悬浮液。在马上与VHH偶联前使用真空密闭的过滤烧瓶和P 1.6过滤漏斗(Duran)并用100mM MES，500mM NaCl，pH 6.0洗涤微胶囊。可选地，使用具有0.45μm一次性滤膜的玻璃过滤头(holder)(Millipore)或0.45μm 96孔深孔过滤板(Millipore)。使用碳二亚胺介导的1步过程，不含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或含NHS的2步过程进行VHH与微胶囊的偶联。1步偶联与2步偶联过程之间的主要差异是在1步偶联过程中存在VHH的交联。所述3种过程的方案是大部分相似的，其区别如下。对1步偶联，将VHH添加至洗涤过的微胶囊并添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(Pierce)，使偶联反应室温下进行2小时。对2步偶联，首先在存在或不存在NHS的情况下用EDC将洗涤过的微胶囊活化。通过快速依次用冰冷的缓冲液洗涤去除过量的未反应的EDC(和NHS)，添加VHH并使其与微胶囊壳上活化的羧酸反应。对 的微胶囊，2-20μg的VHH与每毫克微胶囊偶联。对其它直径的微胶囊，相应地调整用量。与VHH偶联后，用PBS洗涤微胶囊并储存于PBS中。组合使用通过SDS-PAGE分析偶联效率和通过显微镜或SP5共聚焦显微镜系统(Leica)使用直接缀合于Alexa-488荧光染料的抗组氨酸抗体分析结合的六聚组氨酸标记的VHH来研究VHH的成功偶联。如所预期的，在1步偶联反应中用SDS-PAGE分析观察到聚合物的形成。用抗组氨酸抗体室温下标记VHH偶联的微胶囊1小时。使用0.45μm的96孔深孔过滤板(Millipore)用PBS洗涤5次去除未结合的抗组氨酸抗体。比较具偶联的VHH的微胶囊、与不添加EDC的VHH孵育的微胶囊和空白微胶囊。如图3中所示，对使用1步或2步偶联步骤偶联至VHH的微胶囊，微胶囊的抗组氨酸标记最浓。还观察到一些VHH被动地吸附于微胶囊。使用1步或2步偶联步骤，可成功地将VHH偶联至不同大小的微胶囊。
实施例5：靶向剂偶联的微粒与含抗原的表面的结合
VHH偶联的珠或微胶囊的结合测定-在用含100μg/ml阿拉伯树胶的50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液或PBS包被的ELISA平板中研究VHH偶联的微粒的功能性。过夜进行包被，用PBS/0.05％吐温-20洗涤平板3次并用含5％脱脂奶粉的PBS封闭1.5小时。将VHH偶联的顺磁珠稀释50倍并在1％MPBS中与直接缀合于Alexa-488荧光染料(Abd Serotec)的单克隆小鼠抗组氨酸抗体孵育1小时。在2％MPBS中制备2倍系列稀释(50-800倍)的VHH缀合的顺磁Dynabeads和FluoSpheres荧光珠，将其转移至阿拉伯树胶包被的ELISA平板并室温下孵育1小时。用PBS/0.05％吐温-20洗涤5次去除未结合的珠。用显微镜分析ELISA平板孔底部结合的珠。如表3中所示，对珠计数并使用显微镜的照相机光罩计算所分析的表面积用于计算每孔结合的珠的数目。可选地，使用大变焦显微镜系统(Nikon)可视化微粒并使用Volocity图像分析软件(PerkinElmer)计数微粒；每孔结合的Fluospheres数目示于表4。
表3：与包被有阿拉伯树胶的孔结合的磁性羧酸Dynabeads计数
表4：与包被有阿拉伯树胶的孔结合的Fluospheres计数
ELISA样的测定装置(setup)用于评估VHH偶联的微胶囊与含抗原的表面的结合。用阿拉伯树胶或马铃薯凝集素包被ELISA平板(Maxisorp(Thermo Scientific Nunc)或高结合半区微孔板(Greiner Bio-One))。用含100μg/ml阿拉伯树胶或马铃薯凝集素的PBS过夜进行包被。对照孔包括空白孔或用无关抗原包被的孔。用含0.05％吐温-20的PBS洗涤平板3次并用含5％脱脂奶粉的PBS封闭1-2小时。在含0.05％吐温-20，1％脱脂奶粉的PBS中将VHH偶联的含λ氯氟氰菊酯或含Uvitex的微胶囊稀释至合适的浓度。将微胶囊加入抗原包被的或对照孔中并使其结合1小时。用含0.05％吐温-20的PBS洗涤5次去除未结合的微胶囊。在大变焦显微镜系统(Nikon)上分析ELISA平板孔底部结合的珠。使用Volocity图像分析软件(Perkin Elmer)计数微胶囊。DAPI过滤器用于可视化Uvitex微胶囊。白光LED照明和亮场图像用于λ氯氟氰菊酯微胶囊。用于含λ氯氟氰菊酯或含Uvitex的微胶囊的对照包括空白微胶囊和无关VHH偶联的微胶囊。
表5：与包被有马铃薯凝集素或无关抗原的孔结合的微胶囊
在另一个实验中还分析确定了λ氯氟氰菊酯的量。加入100μl/孔丙酮洗涤具结合的微胶囊的孔，并转移至含有10ml含0.05％磷酸三苯酯的正己烷作为内部标准的玻璃小瓶中。通过GC/MS-MS分析与标准溶液比较确定λ氯氟氰菊酯的量。用于λ氯氟氰菊酯微胶囊的对照包括无VHH偶联的空白微胶囊和无关VHH偶联的微胶囊。对照还包括无阿拉伯树胶或马铃薯凝集素包被的孔。基于λ氯氟氰菊酯微胶囊的ELISA样测定的结果，发现一些本发明的VHH(例如VHH 3E6)能够将微胶囊结合并保留至抗原包被的表面，其导致与空白微胶囊相比在用抗原包被的孔中λ氯氟氰菊酯的量提高23倍，相比没有用抗原包被的空白孔测量到27倍的提高。
基于微胶囊结合测定的结果，VHH可分类为能够或不能够将微胶囊结合并保留于表面的。已证实当与微胶囊偶联时，一些本发明的VHH(例如VHH 3E6)能够特异性地与抗原包被的表面结合。没有观察到与具无关抗原的表面的显著结合。此外，特异性结合足够强以将微胶囊保留在抗原包被的表面，因为结合力明显可抵抗在洗涤过程中发生的剪切力。更多的是VHH能够将含相关活性成分的微胶囊结合并保留在表面，如含杀虫剂λ氯氟氰菊酯的微胶囊的实例所示。
接下来，研究了是否可以通过使用含多价VHH的靶向剂改善微胶囊与表面的结合。用等量的单价VHH、二价VHH和无关VHH进行了一系列平行的偶联。如实施例4中描述地分析了成功偶联的VHH和多价VHH。使用包被有5μg/孔马铃薯凝集素的高结合半区微孔板(Greiner Bio-One)进行ELISA样测定。对照孔包括空白孔或用无关抗原包被的孔。用含0.05％吐温-20的PBS洗涤平板3次并用含5％脱脂奶粉的PBS封闭1-2小时。在含0.05％吐温-20，1％脱脂奶粉的PBS中将VHH偶联的含Uvitex的微胶囊稀释至合适的浓度。制备了5倍系列的稀释液并使其与表面结合，以比较偶联有单价或二价VHH的微胶囊的结合。将微胶囊加入抗原包被的或对照孔中并使其结合1小时。用含0.05％吐温-20的PBS洗涤5次去除未结合的微胶囊。在大变焦显微镜系统(Nikon)上分析ELISA平板孔底部结合的珠。使用Volocity图像分析软件(Perkin Elmer)计数微胶囊。DAPI过滤器用于可视化Uvitex微胶囊。已证实当与微胶囊偶联时，二价VHH能够特异地与抗原包被的表面结合，并且与具单价VHH的微胶囊相比，使用二价VHH保留了更多微胶囊。在应用最高(计算的可完全覆盖孔底表面的)密度的微胶囊时，发现与相同量的具单价VHH的微胶囊相比，保留在孔中的偶联二价VHH的微胶囊多17％。在应用少25倍的微胶囊时，发现与具单价VHH的微胶囊相比，保留在孔中的偶联二价VHH的微胶囊多160％。偶联二价VHH的微胶囊的表面积高于以此微胶囊密度应用的空白微胶囊的表面积15倍，而具单价VHH的微胶囊的表面积仅高于以此微胶囊密度应用的空白微胶囊的表面积6倍。这种差异可被解释为与单价VHH相比，由于二价VHH额外的亲和力而提高的结合力引起的，还可解释为二价VHH的使用提高了偶联在微胶囊上的靶向剂的灵活性和间隔物长度(或两者的组合)引起的。
表6：与包被有马铃薯凝集素或无关抗原结合的微胶囊的表面积
表面覆盖率 单价VHH 3E6 二价VHH 3E6 无关VHH 空白微胶囊
无包被 100％ 74.536 66.176 77.014 84.982
马铃薯凝集素 100％ 415.773 490.546 141.636 90.030
马铃薯凝集素 20％ 307.478 511.303 43.452 44.024
马铃薯凝集素 4％ 59.377 155.759 19.170 10.599
无包被 100％ 72.036 55.841 68.109 66.509
无关抗原 100％ 69.503 45.677 78.205 50.965
无关抗原 20％ 27.742 22.114 30.459 17.831
无关抗原 4％ 5.011 15.038 19.755 6.279
使用叶盘结合测定评估VHH偶联的微胶囊与马铃薯、禾本科植物和杜鹃叶的相互作用。从盆栽马铃薯植物(Desirée品种)叶、从温室种植的黑麦草(Lollium perenne)叶和从盆栽杜鹃植物叶取样的叶盘。用PBS洗涤叶盘3次。在含0.05％吐温-20，1％脱脂奶粉的PBS中将含λ氯氟氰菊酯或含Uvitex的微胶囊稀释至合适的浓度。将微胶囊添加至叶盘，使微胶囊沉淀并与靶向剂结合1小时。用含0.05％吐温-20的PBS洗涤3-5次去除未结合的微胶囊。
对λ氯氟氰菊酯微胶囊，进行残余物分析以测量马铃薯叶盘上的λ氯氟氰菊酯的量。将洗涤过的含结合的微胶囊的叶盘转移至玻璃小瓶并将微粒溶于丙酮。通过添加作为内部标准的含0.05％磷酸三苯酯的正己烷将样品稀释。通过GC/MS-MS分析与标准溶液比较确定λ氯氟氰菊酯的量。用于λ氯氟氰菊酯微胶囊的对照包括无VHH偶联的空白微胶囊和无关VHH偶联的微胶囊。基于λ氯氟氰菊酯微胶囊的叶盘结合测定的结果，发现一些本发明的VHH能够将微胶囊结合并保留至叶表面，其导致与无VHH偶联的空白微胶囊或无关VHH偶联的微胶囊相比，在叶盘上λ氯氟氰菊酯的量分别提高3.3倍和2.2倍。
在大变焦显微镜系统(Nikon)上分析具Uvitex微胶囊的叶盘结合的微胶囊。使用Volocity图像分析软件(Perkin Elmer)计数微胶囊。DAPI过滤器用于可视化Uvitex微胶囊。用于Uvitex微胶囊的对照包括无VHH偶联的空白微胶囊和无关VHH偶联的微胶囊。基于Uvitex微胶囊的叶盘结合测定的结果，发现一些本发明的VHH(例如VHH 3E6)证实能够将微胶囊特异地结合并保留至叶表面。
在马铃薯叶盘上，与VHH 3E6偶联的微胶囊的特异性结合导致与空白微胶囊相比与叶盘结合的微胶囊多9倍，而与无关VHH偶联的微胶囊相比与叶盘结合的微胶囊多6倍，如图4中所示。在禾本草叶盘上，与VHH 3E6偶联的微胶囊的特异性结合导致与空白微胶囊相比与叶盘结合的微胶囊多3倍，而与无关VHH偶联的微胶囊相比与叶盘结合的微胶囊多2倍。在杜鹃叶盘上，与VHH 3E6偶联的微胶囊没有观察到特异性结合，其与实施例3中证实的VHH的植物物种相关的结合特异性完全近似。
进行了滴度实验来研究多少倍稀释的具特异的VHH的微胶囊对应于在相同的处理后与应用无VHH偶联的微胶囊可获得相似的微胶囊量。制备了2倍系列稀释的微胶囊并且在马铃薯叶盘上分析这些稀释系列与叶盘的结合。如图5所示，由剂量实验计算出，与非功能性微胶囊相比，浓度低8倍的具特异性VHH的微胶囊导致相似的特异性结合于叶盘的微胶囊的量。由此实验将明确，通过将本发明的VHH之一偶联至包含农用化学品的微载体可实现农用化学品适当剂量有意义的减少。
实施例6：靶向剂偶联的微胶囊在完整活植物表面的沉积和保留
在对生长于温室中的整株盆栽马铃薯植物(Desirée品种)的实验中研究偶联的靶向剂对载体沉积和保留的影响。将与特异性VHH偶联、与无关对照VHH偶联的微胶囊或空白微胶囊施用于来自不同植物的全部多重复叶。总共15株植物用于不同的处理。计算微胶囊悬液以在叶表面施用6.4％的微胶囊覆盖率。如微胶囊叶盘结合测定(见上述)同样地将复叶浸没入微胶囊悬液，使微胶囊沉淀和VHH结合修改为仅15分钟。在施用微胶囊后使植物干燥1小时。来自每个复叶中的每对相对的叶之一被取样并分析(无任何另外的处理)。可用这些来自不同施用的叶分析与微胶囊偶联的特异性VHH对微胶囊沉淀的影响。进一步处理仅缺失取样的叶的整个植物以研究偶联于微胶囊的特异性VHH对降雨事件之后的保留的影响，以及对沉积和保留的组合影响。使用45秒内1L/m2细液滴(SSCOTFVS2型喷嘴)的模拟降雨研究保留效果。模拟降雨后，将与已取样的叶相对的叶取样。在大变焦显微镜系统(Nikon)上分析具Uvitex微胶囊的全叶结合的微胶囊。使用Volocity图像分析软件(Perkin Elmer)计数微胶囊。DAPI过滤器用于可视化Uvitex微胶囊。由在降雨事件之前取样的叶计算出与空白微胶囊相比，具特异性靶向剂的微胶囊已有2.7倍的微胶囊沉积。与空白微胶囊相比，具无关对照靶向剂的微胶囊的叶仅包含0.8倍的微胶囊。这显示了特异性VHH对微胶囊在植物上的沉积已具有有益的影响。在降雨事件之后，具特异性VHH的微胶囊平均保留了69(±8)％，而与无关对照VHH偶联的微胶囊和空白微胶囊分别仅保留35(±17)％和39(±4)％的微胶囊。对沉积和保留的组合影响导致与空白微胶囊相比，具特异性VHH或无关对照VHH的微胶囊在整个植物的叶上的微胶囊的量分别为5倍和0.9倍。由此实验将明确，特异性VHH是优越的靶向剂，其使载体向完整活植物的输送和特异结合成为可能。由于改善的沉积和改善的保留，与包含农用化学品或农用化学品组合的载体偶联的本发明的靶向剂使得有望将所述农用化学品特异地输送至植物表面，并在此提高所述农用化学品在植物表面沉积的量，或使得在保持相似效果的同时使施用率降低成为可能，或使得在保持相似效果的同时使施用频率降低成为可能，或使所述农用化学品改善的耐雨水冲刷能力成为可能，或能够诱导所述农用化学品的某种特异性，或使得前述的任何组合成为可能。
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Claims (46)

1.结合结构域，其能够与完整活植物上的至少一个结合位点结合，其中所述结合结构域包含VHH序列、其任何抗原结合片段或同源物。
2.权利要求1的结合结构域，其中所述结合结构域衍生自先天性免疫系统或适应性免疫系统。
3.权利要求1或2的结合结构域，其中所述结合结构域能够将载体结合到植物上。
4.权利要求1或2的结合结构域，其中所述结合结构域能够将载体保留在植物上。
5.权利要求1的结合结构域，其中所述结合结构域与植物的特定部分结合。
6.权利要求5的结合结构域，其中所述植物部分选自叶、茎、根、果实、球果和花。
7.权利要求5的结合结构域，其中所述植物部分是球茎或块茎。
8.权利要求1的结合结构域，其中所述结合结构域与植物上的特定结构结合。
9.权利要求8的结合结构域，其中所述特定结构选自表皮毛、气孔、皮孔、棘、刺、根毛、角质层或蜡质层。
10.权利要求1的结合结构域，其中所述结合结构域在农用化学品制剂中与所述植物结合。
11.权利要求1的结合结构域，其中所述结合结构域与阿拉伯树胶结合。
12.权利要求1的结合结构域，其中所述结合结构域与凝集素、凝集素样结构域、伸展蛋白或伸展蛋白样结构域结合。
13.权利要求1的结合结构域，其中所述VHH具有2个稳定二硫桥。
14.权利要求1的结合结构域，其中所述VHH包含选自SEQ ID NO1-SEQ ID NO 42的序列。
15.靶向剂，其包括至少一个权利要求1-14中任一项的结合结构域，其能够将农用化学品保留在植物和/或植物部分上。
16.权利要求15的靶向剂，其中所述农用化学品结合至载体上或包含于载体中。
17.权利要求15或16的靶向剂，其包括至少一个权利要求1-14中任一项的结合结构域，其中所述结合结构域与植物上的特定结构结合。
18.权利要求17的靶向剂，其中所述特定结构选自表皮毛、气孔、皮孔、棘、刺、根毛、角质层和蜡质层。
19.权利要求15的靶向剂，其包括至少一个权利要求1-14中任一项的结合结构域，其中所述结合结构域与阿拉伯树胶结合。
20.权利要求15的靶向剂，其包括至少一个权利要求1-14中任一项的结合结构域，其中所述结合结构域与凝集素、凝集素样结构域、伸展蛋白或伸展蛋白样结构域结合。
21.权利要求15的靶向剂，其中所述VHH具有2个稳定二硫桥。
22.权利要求15的靶向剂，其中所述VHH包含选自SEQ ID NO1-SEQ ID NO 42的序列。
23.权利要求15-22中任一项的靶向剂用于将农用化学品或农用化学品组合输送并保留至植物和/或植物部分的用途。
24.权利要求23的靶向剂的用途，其中所述农用化学品或农用化学品组合是杀生物剂。
25.权利要求23的靶向剂的用途，其中所述农用化学品或农用化学品组合选自除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料、安全剂、微量营养素或植物生长调节物。
26.权利要求25的靶向剂的用途，其中所述农用化学品或农用化学品组合结合至载体上或包含于载体中。
27.权利要求26的靶向剂的用途，其中所述载体是微载体。
28.权利要求27的靶向剂的用途，其中所述微载体选自微胶囊、微球、纳米胶囊、纳米球、聚合物颗粒、由人工木质化的纤维素制造的颗粒、复合凝胶颗粒、弱离子树脂颗粒、微生物细胞或其片段。
29.权利要求26-28中任一项的靶向剂的用途，其中所述靶向剂通过载体外表面上的官能团与所述载体偶联。
30.权利要求29的靶向剂的用途，其中所述靶向剂通过共价键与所述官能团偶联。
31.组合物，其包含(a)至少一种权利要求15-22中任一项的靶向剂，和(b)农用化学品或农用化学品组合。
32.权利要求31的组合物，其中所述农用化学品或农用化学品组合结合至载体上或包含于载体中。
33.组合物，其包含(a)至少一种权利要求15-22中任一项的靶向剂，和(b)载体。
34.权利要求33的组合物，其中所述靶向剂与所述载体偶联。
35.权利要求34的组合物，其中所述靶向剂与所述载体共价地偶联。
36.权利要求33的组合物，其中所述载体与至少一种农用化学品偶联和/或包含至少一种农用化学品。
37.权利要求32或36的组合物，其中所述农用化学品是杀生物剂。
38.权利要求32或36的组合物，其中所述农用化学品选自除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、肥料、安全剂、微量营养素或植物生长调节化合物。
39.权利要求33的组合物，其中所述载体选自微胶囊、微球、聚合物颗粒、由人工木质化的纤维素制造的颗粒、复合凝胶颗粒、弱离子树脂颗粒、微生物细胞或其片段。
40.用于向植物输送农用化学品或农用化学品组合的方法，所述方法包括在所述植物上施用至少一次权利要求31-39中任一项的组合物。
41.权利要求40的用于向植物输送农用化学品或农用化学品组合的方法，其中与包含于不含任何靶向剂的可比性组合物中的相同农用化学品或农用化学品组合的有效剂量相比，所述农用化学品或农用化学品组合的剂量降低。
42.用于保护植物和/或用于调节植物或植物部分的活力、生长或产量和/或用于调节植物或植物部分中的基因表达的方法，所述方法包括在所述植物上施用至少一次权利要求31-39中任一项的组合物。
43.权利要求42的用于保护植物和/或用于调节植物或植物部分的活力、生长或产量和/或用于调节植物或植物部分中的基因表达的方法，其中与包含于不含任何靶向剂的可比性组合物中的相同农用化学品或农用化学品组合的有效剂量相比，所述农用化学品或农用化学品组合的剂量降低。
44.用于制造特异性靶向农用化学品载体的方法，所述方法包括(a)将农用化学品或农用化学品组合包装入载体内或包装至载体上，和(b)使权利要求15-22中任一项的靶向剂附着于所述载体。
45.用于使权利要求15-22中任一项的靶向剂附着于载体的方法，其包括(a)使连接剂与载体反应，和(b)使所述靶向剂与所述连接剂反应。
46.特异性靶向农用化学品载体，其由权利要求44的方法获得。
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