JP2013529066A - 農薬の特異的送達 - Google Patents
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Abstract
Description
−植物の葉に結合させるための本発明の組成物について、結合ドメインおよび/またはターゲティング剤は、植物(の葉)の次に記す1つまたは複数の結合部位に対して誘導することができる:クチン、表皮のロウ、アラビノガラクタン−タンパク質または脂質伝達タンパク質;
−植物の根に結合させるための本発明の組成物について、結合ドメインおよび/またはターゲティング剤は、植物(の根)の次に記す1つまたは複数の結合部位に対して誘導することができる:エクステンシンまたはペクチン;
−植物の茎に結合させるための本発明の組成物について、結合ドメインおよび/またはターゲティング剤は、植物(の茎)の次に記す1つまたは複数の結合部位に対して向けられる:リグニン、エクステンシンまたは排出物;
また本発明のこうしたそれぞれの組成物は、本発明の特定の(しかし限定されない)態様を形成する。
VHHの作製および選択
アラビアゴム、ジャガイモ葉ホモジネートまたはコムギ葉ホモジネートを使用するラマの免疫化
アラビアゴムの溶液は、アラビアゴムノキのアラビアゴム5g(Sigma)を秤量し、50mlの水に溶解させることにより調製した。Bradfordタンパク質アッセイを用いて、全タンパク質濃度を測定した。アリコートを調製し、−80℃で保存し、免疫化に使用した。ジャガイモ植物(ソラナム・チューベロサム(Solanum tuberosum)の品種Desiree)のホモゲナイズされた葉またはコムギ植物(トリチクム・アエスチブム(Triticum aestivum)の品種Boldus)のホモゲナイズされた葉は、液体窒素中で葉を凍結させ、細粉が得られるまで乳鉢および乳棒を用いて前記の葉をホモゲナイズすることにより調製した。Bradfordタンパク質アッセイを用いて、全タンパク質濃度を測定した。アリコートを調製し、−80℃で保存し、懸濁液を免疫化に使用した。
VHHの特性決定
単一ポイント結合ELISA − 単一ポイント結合ELISAを使用して、アラビアゴムまたは植物抽出物に結合するクローンを同定した。ELISA用のVHH含有抽出物は、以下のように調製した。1ウェル当たり100μlの2xTY、2%グルコース、100μg/mlアンピシリンを含む96ウェルプレートはマスタープレートから接種し、37℃で一晩増殖させた。1ウェル当たり25μlの一晩培養物を使用して、1ウェル当たり1mlの2xTY;0.1%グルコース;100μg/mlアンピシリンを含有する新しい96ウェルのディープウェルプレートへ接種した。3時間振盪培養器中で37℃にて増殖させた後、IPTGを1mMの最終濃度まで加え、さらなる4時間のインキュベーション中に組換えVHHを産生させた。細胞を3,000g、20分間の遠心分離により沈降させ、−20℃で一晩保存した。細胞ペレットを解凍し、短時間ボルテックスし、1ウェル当たり125μlの室温PBSを加えた。細胞を15分間室温でELISAシェーカープラットフォームに再懸濁した。プレートを3,000gで20分間遠心分離にかけ、1ウェル当たり100μlのVHH含有抽出物をポリプロピレン製96ウェルプレート(Nunc)に移し、さらに使用するまで−20℃で保存した。
PBS中の100μg/mlジャガイモレクチン(Sigma)を1ウェル当たり100μlでコーティングしたELISAプレート(Maxisorp, Nunc)を4℃で一晩コーティングし、コーティングを翌日室温で1時間継続した。プレートをPBS/0.05%−Tween−20で3回洗浄し、1時間PBS中の5%スキムミルクでブロッキングした。ジャガイモレクチンをコーティングしたプレートにVHH(3μg/ml)を移し、VHH抗体フラグメントを室温で1時間結合させた。結合VHHは、1%MPBS/0.05%−Tween−20中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体(Abd Serotec)およびアルカリフォスファターゼとコンジュゲートしているウサギ抗マウスIgG全分子抗体(RaM/AP)(Sigma)での連続したインキュベーションにより検出した。非結合抗体は、各抗体のインキュベーション後、PBS/0.05%−Tween−20で3回洗浄することにより除去した。プレートをPBSでさらに2回洗浄し、100μlのpNPP二ナトリウム六水和物基質(Sigma)を各ウェルに添加し、405nmでの吸光度を測定した(表2参照)。
植物表面への結合ドメインの結合
葉片へのVHH結合 − ジャガイモ(品種Desiree)、イヌホオズキ、雑草、コムギまたはツツジの非固定葉片へのVHH結合を調査した。比較に関し、ジャガイモ(品種Desiree)の非固定葉片へのCBM3aの結合を並行して分析した。葉片は、5mmのベルト穴パンチャーの道具を用いて新鮮なジャガイモ葉をパンチングすることによって調製した。葉片は、5%のMPBSまたはPBSをウェル当たり200μl含有する96ウェルプレートのウェルに直ちに入れ、30分間インキュベートした。葉片を、2%MPBSまたはPBS中それぞれ5μg/mlのVHH抗体フラグメント、5μg/mlのCBM3aを含有する溶液に移し、60−90分間インキュベートした。非結合のVHHタンパク質またはCBM3aタンパク質は、2%のMPBSまたはPBSで3回洗浄することにより除去した。結合VHHまたは結合CBM3aタンパク質は、1時間、1%MPBS中のAlexa−488蛍光色素(Abd Serotec)と直接結合しているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体と培養することにより検出した。非結合抗体は、PBSで3回洗浄することにより除去した。葉片をスライドガラスに置き、カバーグラスでカバーし、顕微鏡検査によって、またはマクロズーム顕微鏡システム(Nikon)もしくはSP5共焦点顕微鏡システム(Leica)で分析した。実施例(限定されるものではない)によって、VHH抗体フラグメント(例えば3E6、5D4)は、ジャガイモ葉の葉表面の毛状体、気孔およびクチクラに明らかに結合していることが判明した(図1A−C)。明確な対照において、CBM3aに関し、ジャガイモ葉の表面での結合は検出されず、ジャガイモ葉片の切り口の損傷組織への微弱結合のみが確認された(図1D)。また本発明の一部のVHH(例えば3E6)はイヌホオズキの葉または雑草の葉の表面にも特異的に結合することが示され、それぞれ図1Fおよび1Gに示された通りである。コムギまたはツツジの葉表面へ有意な結合は認められなかった。
微粒子へのターゲティング剤のカップリング
2価VHHの構築、産生および精製 − 2価VHH構築物は、pASF22ベクター内へ2種のVHH配列を縦並びでクローニングし、2種のVHHの間における2種のVHHの9グリシン−セリンリンカー(GGGGSGGGS)との融合を作製することにより、細菌中で産生させた。pASF22は、インハウスで製造したpMES誘導体である。使用した標識は、C末端c−Myc(EQKLISEEDLN)およびヘキサヒスチジン(HHHHHH)であった。トリプルアラニンリンカー(AAA)はVHHのC末端とc−Myc標識の間に置かれ、グリシンアラニンアラニン(GAA)リンカーはc−Myc標識のC末端とヘキサヒスチジン標識の間に使用した。使用した2価VHHの完全C末端配列:AAA−EQKLISEEDLN−GAA−HHHHHH。新鮮な一晩培養物は、コロニー画線培養から開始し、2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを補充した2xTY培地への接種により調製した。この一晩培養物を使用して、0.1%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを補充した2xTY培地中に新鮮培養物を1:100で接種した。3時間振盪培養器中で37℃にて増殖させた後、IPTGを1mMの最終濃度まで添加し、組換え2価VHHを4時間のさらなるインキュベーション中に調製した。細胞を沈降させ、元の培養物容量の1/50のPBSに再懸濁させ、4℃で30分間、縦方向回転でインキュベートした。スフェロプラストは、4℃で20分間、3,000gの遠心分離を行うことによりを沈降させた。上清を新しいチューブに移し、再度4℃で20分間、3,000gの遠心分離を行った。上清を回収し、塩化ナトリウム濃度を500mMに調整し、イミダゾール濃度を20mMに調整した。ヘキサヒスチジン標識2価VHHは、標準方法に従って、AKTAxpressシステム(GE Lifesciences)でHisTrap FF Crude 5 ml IMACカラム(GE Lifesciences)およびHiLoad 16/60 Superdex 75 prep
gradeゲル濾過カラム(GE Lifesciences)を使用して抽出物から精製した。
抗原含有表面へのターゲティング剤カップリングマイクロ粒子の結合
VHHカップリングビーズまたはマイクロカプセルを用いた結合アッセイ − VHHカップリング微粒子の機能性を、50mM炭酸塩pH9.6またはPBS中の100μg/mlアラビアゴムでコーティングしたELISAプレートで調べた。コーティングを一晩実施し、プレートをPBS/0.05%−Tween−20で3回洗浄し、1.5時間PBS中の5%スキムミルクでブロッキングした。VHHカップリング常磁性体ビーズを50倍希釈し、1時間、1%MPBST中のAlexa−488蛍光色素と直接コンジュゲートしているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体(Abd Serotec)とインキュベートした。VHHコンジュゲート常磁性体DynabeadsおよびFluoSpheres蛍光ビーズの2倍連続希釈液(50−800倍)を2%MPBS中で調製し、アラビアゴムをコーティングしたELISAプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。非結合ビーズは、PBS/0.05%−Tween−20で5回洗浄することにより除去した。ELISAプレートウェルの底を、結合ビーズについて顕微鏡観察により分析した。ビーズのカウント、分析した表面積の計算への顕微鏡カメラマスクの使用が、表3に示したように、ウェル当たりの結合ビーズ数の計算に用いられた。あるいは、微粒子は、マクロズーム顕微鏡システム(Nikon)を利用して視覚化し、Volocity画像分析ソフトウェア(PerkinElmer)を使用してカウントした。1ウェル当たりの結合Fluospheresの数を表4に示す。
生きている無傷植物表面に対するターゲティング剤カップリングマイクロカプセルの堆積および保持
カップリングされたターゲティング剤を含む担体の堆積および保持に関する効果を、温室栽培したジャガイモ鉢植え植物(品種Desiree)全体を用いた実験で調べた。特異的VHHとカップリングしているマイクロカプセル、無関係のコントロールVHHとカップリングしているマイクロカプセルまたはブランクのマイクロカプセルを異なる植物から得た複数の複葉全体に施用した。合計で15植物を異なる処理に使用した。マイクロカプセル懸濁液は、葉表面上に6.4%被覆率のマイクロカプセルが施用されるように算出した。複葉は、マイクロカプセル葉片結合アッセイ(上記参照)に関する方法と同様の方法でマイクロカプセル懸濁液に沈降させたが、変更したのはマイクロカプセルの沈降およびVHHの結合をわずか15分間にさせたことであった。植物は、マイクロカプセルの施用後、1時間、乾燥させた。それぞれの複葉のうちの各ペアの対の葉の1つをサンプリングし、それ以上いかなる処理を行うことなく分析した。マイクロカプセルにカップリングしている特異的VHHのマイクロカプセル堆積に対する効果は、異なる施用から得たこれらの葉を用いて分析することができる。サンプリングした葉のみを失った植物全体は、マイクロカプセルにカップリングしている特異的VHHの降雨事象後の保持に関する効果および堆積および保持を合わせた効果を調べるためにさらに処理した。45秒に1L/m2の微細液滴による降雨シミュレーション(SSCOTFVS2 ノズルタイプ)を使用し、保持効果を調べた。既にサンプリングした葉の反対の葉を降雨シミュレーション後にサンプリングした。Uvitexマイクロカプセルを含む葉全体を、結合マイクロカプセルについてマクロズーム顕微鏡システム(Nikon)で分析した。マイクロカプセルは、Volocity画像分析ソフトウェア(Perkin Elmer)を使用してカウントした。DAPIフィルターを使用してUvitexマイクロカプセルを視覚化した。降雨事象の前にサンプリングした葉から、特異的ターゲティング剤を含むマイクロカプセルに関し、ブランクのマイクロカプセルと比較して、既に2.7倍を超えるマイクロカプセルが堆積していることが算出された。無関係のコントロールターゲティング剤を有するマイクロカプセルを有する葉は、ブランクのマイクロカプセルと比較して0.8割合のマイクロカプセルしか含有していなかった。これは、特異的VHHが、植物に対するマイクロカプセルの堆積に対して有効作用を既に有していることを示す。特異的VHHを含むマイクロカプセルの平均で69(±8)%が降雨事象後に保持されたが、無関係のコントロールVHHがカップリングされているマイクロカプセルおよびブランクのマイクロカプセルについては、それぞれ、35(±17)%および39(±4)%のマイクロカプセルしか保持されなかった。堆積効果および保持効果の組み合わせにより、特異的VHHを含むマイクロカプセルまたは無関係のコントロールVHHを含むマイクロカプセルに関する植物全体の葉上のマイクロカプセル量は、ブランクのマイクロカプセルと比較して、それぞれ5倍および0.9倍であった。この実験から、特異的VHHは、生きている無傷植物全体に対する担体の送達および特異的結合を可能にする優れたターゲティング剤であることが明らかである。農薬または農薬の組み合わせを含有する担体にカップリングされている本発明のターゲティング剤の堆積の改善および保持の改善の結果として、植物表面に特異的に前記農薬を送達すること、それにより、植物表面に堆積した前記農薬の量の増加、または類似効果を維持しながら可能な施用量の軽減、または類似効果を維持しながら可能な施用頻度の軽減、または前記農薬の雨耐性の可能な改善、または前記農薬に対する特定の特異性の誘導、または前述の任意の組み合わせが大いに期待される。
Claims (50)
- 生きている無傷植物上の少なくとも1つの結合部位に結合することが可能である結合ドメイン。
- 自然免疫系または適応免疫系に由来する、請求項1に記載の結合ドメイン。
- 4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含むアミノ酸配列に含まれる、植物上の少なくとも1つの結合部位に結合することが可能である結合ドメイン。
- 植物に対して担体を結合することが可能である、請求項1から3のいずれかに記載の結合ドメイン。
- 植物に対して担体を保持することが可能である、請求項1から3のいずれかに記載の結合ドメイン。
- 植物の特定部位に結合する、請求項1から5のいずれかに記載の結合ドメイン。
- 植物の前記部位が葉、茎、根、果実、球果、花、球根および塊茎からなる群から選択される、請求項6に記載の結合ドメイン。
- 植物上の特定構造に結合する、請求項1から7のいずれかに記載の結合ドメイン。
- 前記特定構造が毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラまたはロウ層からなる群から選択される、請求項8に記載の結合ドメイン。
- 前記植物に農薬製剤の形で結合する、請求項1から9のいずれかに記載の結合ドメイン。
- アラビアゴムに結合する、請求項1から10のいずれかに記載の結合ドメイン。
- レクチン、レクチン様ドメイン、エクステンシンまたはエクステンシン様ドメインに結合する、請求項1から11のいずれかに記載の結合ドメイン。
- ラクダ科動物抗体に由来する、請求項1から12のいずれかに記載の結合ドメイン。
- VHH配列に含まれる、請求項13に記載の結合ドメイン。
- 前記VHHが2つの安定化ジスルフィド架橋を有する、請求項14に記載の結合ドメイン。
- 前記VHHが配列番号1−配列番号42からなる群から選択される配列を含む、請求項15に記載の結合ドメイン。
- 植物および/または植物部位に対して農薬を保持することが可能である、請求項1から16のいずれかに記載の少なくとも1つの結合ドメインを含むターゲティング剤。
- 前記農薬が担体上に結合されているまたは担体中に含まれている、請求項17に記載のターゲティング剤。
- 請求項1から16のいずれかに記載の少なくとも1つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインが植物上の特定構造に結合する、請求項17または18に記載のターゲティング剤。
- 前記特定構造が毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラおよびロウ層からなる群から選択される、請求項19に記載のターゲティング剤。
- 請求項1から16のいずれかに記載の少なくとも1つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがアラビアゴムに結合する、請求項17から20のいずれかに記載のターゲティング剤。
- 請求項1から16のいずれかに記載の少なくとも1つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがレクチン、レクチン様ドメイン、エクステンシンまたはエクステンシン様ドメインに結合する、請求項17から21のいずれかに記載のターゲティング剤。
- 請求項1から16のいずれかに記載の少なくとも1つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがラクダ科動物抗体に由来する、請求項17から22のいずれかに記載のターゲティング剤。
- 請求項1から16のいずれかに記載の少なくとも1つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがVHH配列に含まれる、請求項23に記載のターゲティング剤。
- 前記VHHが2つの安定化ジスルフィド架橋を有する、請求項24に記載のターゲティング剤。
- 前記VHHが配列番号1−配列番号42からなる群から選択される配列を含む、請求項25に記載のターゲティング剤。
- 植物および/または植物部位に農薬または農薬の組み合わせを送達および保持するための、請求項17から26のいずれかに記載のターゲティング剤の使用。
- 前記農薬または農薬の組み合わせが除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、毒性緩和剤、微量栄養素または植物成長調整剤からなる群から選択される、請求項27に記載のターゲティング剤の使用。
- 前記農薬または農薬の組み合わせが担体上に結合されているまたは担体中に含まれている、請求項28に記載のターゲティング剤の使用。
- 前記担体が微小担体である、請求項29に記載のターゲティング剤の使用。
- 前記微小担体が、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、ポリマー粒子、人工的に木質化したセルロースから製造された粒子、複合ゲル粒子、弱イオン性樹脂粒子、微生物細胞またはそれらの断片からなる群から選択される、請求項30に記載のターゲティング剤の使用。
- 請求項29から31のいずれかに記載のターゲティング剤の使用であって、前記ターゲティング剤が、担体の外表面の官能基によって前記担体にカップリングされている、ターゲティング剤の使用。
- 請求項32に記載のターゲティング剤の使用であって、前記ターゲティング剤が共有結合によって前記官能基にカップリングされている、ターゲティング剤の使用。
- (a)請求項17から26のいずれかに記載の少なくとも1つのターゲティング剤および(b)農薬または農薬の組み合わせを含む組成物。
- (a)請求項3に記載の4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含むアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つの結合ドメインを含む少なくとも1つのターゲティング剤および(b)農薬または農薬の組み合わせを含む組成物。
- 前記農薬または農薬の組み合わせが担体上に結合されているまたは担体の中に含まれている、請求項34または35に記載の組成物。
- (a)請求項17から26のいずれかに記載の少なくとも1つのターゲティング剤および(b)担体を含む組成物。
- (a)請求項17から26のいずれかに記載の少なくとも1つのターゲティング剤であって、4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含む少なくとも1つの結合ドメインを含む、前記ターゲティング剤および(b)担体を含む組成物。
- 前記ターゲティング剤が前記担体にカップリングされている、請求項37または38に記載の組成物。
- 前記ターゲティング剤が前記担体に共有結合でカップリングされている、請求項39に記載の組成物。
- 前記担体が少なくとも1つの農薬にカップリングされており、および/または少なくとも1つの農薬を含む、請求項37から40のいずれかに記載の組成物。
- 前記農薬が除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、毒性緩和剤、微量栄養素または植物成長調整化合物からなる群から選択される、請求項36または41に記載の組成物。
- 前記担体が、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ポリマー粒子、人工的に木質化したセルロースから製造された粒子、複合ゲル微粒子、弱イオン性樹脂粒子、微生物細胞またはそれらの断片からなる群から選択される、請求項36から42のいずれかに記載の組成物。
- 植物に請求項34から43のいずれかに記載の組成物を少なくとも1回施用することを含む、植物に農薬または農薬の組み合わせを送達する方法。
- 農薬または農薬の組み合わせの用量が、いかなるターゲティング剤も含まない比較可能な組成物に含まれている同一の農薬または農薬の組み合わせの効果的用量と比べて低減される、請求項44に記載の農薬または農薬の組み合わせを送達する方法。
- 植物を保護する方法および/または植物もしくは植物部位の生存能力、成長もしくは収量を調節する方法および/または植物もしくは植物部位における遺伝子発現を調節する方法であって、前記植物に請求項34から43のいずれかに記載の組成物を少なくとも1回施用することを含む、方法。
- 農薬または農薬の組み合わせの用量が、いかなるターゲティング剤も含まない比較可能な組成物に含まれている同一の農薬または農薬の組み合わせの効果的用量と比べて低減される、請求項46に記載の植物を保護する方法および/または植物もしくは植物部位の生存能力、成長または収量を調節する方法および/または植物もしくは植物部位における遺伝子発現を調節する方法。
- 特異的ターゲティング農薬担体の製造方法であって、(a)担体中にまたは担体上に(担体に)農薬または農薬の組み合わせを充填することおよび(b)前記担体に請求項17から26のいずれかに記載のターゲティング剤を付着させることを含む、方法。
- 請求項17から26のいずれかに記載のターゲティング剤を担体に付着させる方法であって、(a)連結剤を担体と反応させることおよび(b)前記連結剤と前記ターゲティング剤を反応させることを含む、方法。
- 請求項48の方法によって得られるまたは得ることが可能である、特異的ターゲティング農薬担体。
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