JPH10319014A - 細胞の分離方法 - Google Patents
細胞の分離方法Info
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- JPH10319014A JPH10319014A JP12537597A JP12537597A JPH10319014A JP H10319014 A JPH10319014 A JP H10319014A JP 12537597 A JP12537597 A JP 12537597A JP 12537597 A JP12537597 A JP 12537597A JP H10319014 A JPH10319014 A JP H10319014A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
-
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
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Abstract
(57)【要約】
【課題】比較的安価なレクチンの有する細胞特異性、お
よびレクチンと抗体との特異的相互作用を利用して、所
望の細胞を他の細胞から効率よく分離することができる
細胞の分離方法を提供する。 【解決手段】特定の細胞１に特異的に結合するレクチン
３を前記特定細胞と結合させてレクチン−細胞結合体を
調製し、前記レクチンに特異的に相互作用する抗体４を
分離剤５に固定させて抗体固定化分離剤を調製し、前記
抗体固定化分離剤を充填したカラムに前記レクチン−細
胞結合体液を通液してレクチンと抗体とをそれらの特異
的相互作用により結合させることによってレクチン−細
胞結合体を分離する。
よびレクチンと抗体との特異的相互作用を利用して、所
望の細胞を他の細胞から効率よく分離することができる
細胞の分離方法を提供する。 【解決手段】特定の細胞１に特異的に結合するレクチン
３を前記特定細胞と結合させてレクチン−細胞結合体を
調製し、前記レクチンに特異的に相互作用する抗体４を
分離剤５に固定させて抗体固定化分離剤を調製し、前記
抗体固定化分離剤を充填したカラムに前記レクチン−細
胞結合体液を通液してレクチンと抗体とをそれらの特異
的相互作用により結合させることによってレクチン−細
胞結合体を分離する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、レクチンと細胞表
面上の糖鎖との特異的結合性を利用した細胞分離方法に
関するものである。
面上の糖鎖との特異的結合性を利用した細胞分離方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生体内には、酵素反応、抗原抗体反応な
ど様々な特異的反応が存在し、精巧な生体系を形づくっ
ているが、今日それらの生体反応をモデルとするバイオ
ミメティックなシステムの研究が種々の分野で盛んに行
われている。
ど様々な特異的反応が存在し、精巧な生体系を形づくっ
ているが、今日それらの生体反応をモデルとするバイオ
ミメティックなシステムの研究が種々の分野で盛んに行
われている。
【０００３】中でも、細胞・細胞間の認識、細胞・蛋白
質間の認識、細胞・異物間の認識における糖鎖の関連性
・認識方法に関する研究分野の進歩にはめざましいもの
がある。代表的には、細胞の外界との最初の認識部位で
かつ細胞の安定化に寄与している植物細胞の細胞壁のプ
ロテオグリカン、細胞の分化・増殖・接着・移動等に影
響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に
関与する糖タンパク質等が研究されている。
質間の認識、細胞・異物間の認識における糖鎖の関連性
・認識方法に関する研究分野の進歩にはめざましいもの
がある。代表的には、細胞の外界との最初の認識部位で
かつ細胞の安定化に寄与している植物細胞の細胞壁のプ
ロテオグリカン、細胞の分化・増殖・接着・移動等に影
響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に
関与する糖タンパク質等が研究されている。
【０００４】さらに最近では、幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、マクロファージなどの機能を有する細胞を効率よく
分離し、細胞自身を医薬としてガンや白血病などの疾患
を治療する方法が活発化しているが、この際、細胞の糖
鎖認識を利用して特定の細胞を分離する方法が研究され
ている［例えば、浦島ら，「今日の移植」，7, 447 (19
94)］。
胞、マクロファージなどの機能を有する細胞を効率よく
分離し、細胞自身を医薬としてガンや白血病などの疾患
を治療する方法が活発化しているが、この際、細胞の糖
鎖認識を利用して特定の細胞を分離する方法が研究され
ている［例えば、浦島ら，「今日の移植」，7, 447 (19
94)］。
【０００５】本発明者らは、細胞表面上のレクチンによ
るの糖鎖認識に着目し、鋭意研究を行ってきており、例
えば、肝細胞表面上のレクチン、アシアロ糖タンパク質
レセプター（ＡＳＧＰＲ）に特異的に認識されるガラク
トース含有ポリマー（ＰＶＬＡと略称）の合成設計を行
った［M. Goto, et.al., J. Controlled Release, 28，
223 (1994)］。
るの糖鎖認識に着目し、鋭意研究を行ってきており、例
えば、肝細胞表面上のレクチン、アシアロ糖タンパク質
レセプター（ＡＳＧＰＲ）に特異的に認識されるガラク
トース含有ポリマー（ＰＶＬＡと略称）の合成設計を行
った［M. Goto, et.al., J. Controlled Release, 28，
223 (1994)］。
【０００６】すなわち、上記のＰＶＬＡを被覆したシャ
ーレを用いることにより、ＰＶＬＡと肝実質細胞表面の
アシアロ糖タンパク質レセプターとの特異的親和力を介
して、肝実質細胞が選択的にＰＶＬＡに結合し、他の肝
非実質細胞から分離できることを見出した［小林明ら，
「人工臓器」，21, 1060 (1992)］。
ーレを用いることにより、ＰＶＬＡと肝実質細胞表面の
アシアロ糖タンパク質レセプターとの特異的親和力を介
して、肝実質細胞が選択的にＰＶＬＡに結合し、他の肝
非実質細胞から分離できることを見出した［小林明ら，
「人工臓器」，21, 1060 (1992)］。
【０００７】また、細胞特異性を有するレクチンをＰＶ
ＬＡと相互作用させてＰＶＬＡに結合させ、さらにその
レクチンと細胞表面上の糖鎖との特異的結合を利用する
ことにより、特定の細胞を選択的に分離する方法を見出
した［上記の小林明ら，「人工臓器」参照］。
ＬＡと相互作用させてＰＶＬＡに結合させ、さらにその
レクチンと細胞表面上の糖鎖との特異的結合を利用する
ことにより、特定の細胞を選択的に分離する方法を見出
した［上記の小林明ら，「人工臓器」参照］。
【０００８】レクチンは、植物や動物に存在するタンパ
ク質であり、細胞・細胞間の接着・認識などの生体の認
識機構に深く関わっており、特定の細胞を特異的に活性
化するなど、その機能は多彩であるが、近年では、細胞
分離に用いられている。 しかしながら、従来の細胞分
離法は、レクチンをカラムやシャーレに固定化して使用
しているために、レクチンの活性低下や副反応が発生
し、レクチンと特定細胞との特異的結合が効率よく行わ
れず、その結果、効果的な細胞の分離を行うことは困難
であった。
ク質であり、細胞・細胞間の接着・認識などの生体の認
識機構に深く関わっており、特定の細胞を特異的に活性
化するなど、その機能は多彩であるが、近年では、細胞
分離に用いられている。 しかしながら、従来の細胞分
離法は、レクチンをカラムやシャーレに固定化して使用
しているために、レクチンの活性低下や副反応が発生
し、レクチンと特定細胞との特異的結合が効率よく行わ
れず、その結果、効果的な細胞の分離を行うことは困難
であった。
【０００９】一方、幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロフ
ァージなどの機能を有する細胞に対する抗体を用いて、
これらの細胞を分離する方法も開発されており、この方
法で分離された細胞の機能も良好に維持され、かつ高い
収率を示すものの、抗体自身が非常に微量で高価である
とともに、使用できるシステムが小さいため、必要な細
胞数を分離・回収するには、小さいシステムを複数回反
復使用する必要がある。
ァージなどの機能を有する細胞に対する抗体を用いて、
これらの細胞を分離する方法も開発されており、この方
法で分離された細胞の機能も良好に維持され、かつ高い
収率を示すものの、抗体自身が非常に微量で高価である
とともに、使用できるシステムが小さいため、必要な細
胞数を分離・回収するには、小さいシステムを複数回反
復使用する必要がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、比較
的安価なレクチンの有する細胞特異性、およびレクチン
と抗体との特異的相互作用を利用して、所望の細胞を他
の細胞から効率よく分離することができる新規かつ改良
された細胞の分離方法を提供することを目的としてなさ
れたものである。
的安価なレクチンの有する細胞特異性、およびレクチン
と抗体との特異的相互作用を利用して、所望の細胞を他
の細胞から効率よく分離することができる新規かつ改良
された細胞の分離方法を提供することを目的としてなさ
れたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明による細胞の分離
方法は、特定の細胞に特異的に結合するレクチンを前記
特定細胞と結合させてレクチン−細胞結合体を調製し、
前記レクチンに特異的に相互作用する抗体を分離剤に固
定させて抗体固定化分離剤を調製し、前記抗体固定化分
離剤を充填したカラムに前記レクチン−細胞結合体液を
通液してレクチンと抗体とをそれらの特異的相互作用に
より結合させることによってレクチン−細胞結合体を分
離することを特徴とするものである。
方法は、特定の細胞に特異的に結合するレクチンを前記
特定細胞と結合させてレクチン−細胞結合体を調製し、
前記レクチンに特異的に相互作用する抗体を分離剤に固
定させて抗体固定化分離剤を調製し、前記抗体固定化分
離剤を充填したカラムに前記レクチン−細胞結合体液を
通液してレクチンと抗体とをそれらの特異的相互作用に
より結合させることによってレクチン−細胞結合体を分
離することを特徴とするものである。
【００１２】本発明においては、レクチンと特異的に結
合する特定細胞を、最終的に回収すべき細胞として分離
することもでき、あるいは、レクチンと特異的に結合す
る特定細胞をレクチンと結合しない他の細胞から分離除
去し、レクチンと結合しない他の細胞を最終的に回収す
ることもできる。
合する特定細胞を、最終的に回収すべき細胞として分離
することもでき、あるいは、レクチンと特異的に結合す
る特定細胞をレクチンと結合しない他の細胞から分離除
去し、レクチンと結合しない他の細胞を最終的に回収す
ることもできる。
【００１３】本発明によれば、レクチンを従来のように
カラムやシャーレに固定することなく、フリーの状態で
特定の細胞と特異的に結合させるため、レクチンの活性
低下や副反応の発生もなく、効率よくレクチン−細胞結
合体を生成させることができる。かくして得られたレク
チン−細胞結合体を次いで抗体固定化分離剤と接触させ
ることにより、レクチンと抗体との特異的な相互作用を
発現させることができ、その結果、効果的なレクチン−
細胞結合体の選択的分離が可能となる。
カラムやシャーレに固定することなく、フリーの状態で
特定の細胞と特異的に結合させるため、レクチンの活性
低下や副反応の発生もなく、効率よくレクチン−細胞結
合体を生成させることができる。かくして得られたレク
チン−細胞結合体を次いで抗体固定化分離剤と接触させ
ることにより、レクチンと抗体との特異的な相互作用を
発現させることができ、その結果、効果的なレクチン−
細胞結合体の選択的分離が可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の概念を添付図面の模式図
を参照して説明すると、特定の細胞１上の糖鎖２を認識
してこれと特異的に結合するレクチン３を細胞１と結合
させて、レクチン−細胞結合体とする。一方、レクチン
３と特異的に相互作用する抗体４を分離剤５と化学的に
結合させることにより、抗体固定化分離剤を調製し、こ
れをカラムに充填する。前記のレクチン−細胞結合体を
含む液をこのカラムに通すことによって、レクチン３と
抗体４との特異的な相互作用により両者を結合させ、特
定の細胞１を他の細胞から分離することができる。
を参照して説明すると、特定の細胞１上の糖鎖２を認識
してこれと特異的に結合するレクチン３を細胞１と結合
させて、レクチン−細胞結合体とする。一方、レクチン
３と特異的に相互作用する抗体４を分離剤５と化学的に
結合させることにより、抗体固定化分離剤を調製し、こ
れをカラムに充填する。前記のレクチン−細胞結合体を
含む液をこのカラムに通すことによって、レクチン３と
抗体４との特異的な相互作用により両者を結合させ、特
定の細胞１を他の細胞から分離することができる。
【００１５】本発明で使用されるレクチンとしては、ピ
ーナッツレクチン、ダイズレクチン、小麦胚芽レクチ
ン、インゲン豆レクチン、ヒマ豆レクチン、コンカナバ
リンＡなどを適宜選択して使用することができる。これ
らのレクチンは、細胞表面上のグルコース、ガラクトー
ス、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセ
チルガラクトサミンなどの単糖類やオリゴ糖類を特異的
に認識してこれらと結合する。
ーナッツレクチン、ダイズレクチン、小麦胚芽レクチ
ン、インゲン豆レクチン、ヒマ豆レクチン、コンカナバ
リンＡなどを適宜選択して使用することができる。これ
らのレクチンは、細胞表面上のグルコース、ガラクトー
ス、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセ
チルガラクトサミンなどの単糖類やオリゴ糖類を特異的
に認識してこれらと結合する。
【００１６】本発明で使用される抗体は、上述したピー
ナッツレクチン、ダイズレクチン、小麦胚芽レクチン、
インゲン豆レクチン、ヒマ豆レクチン、コンカナバリン
Ａなどを特異的に認識して相互作用するものであればい
かなる抗体でも使用することができる。特に、安価で、
大量に調整でき、しかも活性の高い鶏卵由来の抗体が好
ましく用いられる。
ナッツレクチン、ダイズレクチン、小麦胚芽レクチン、
インゲン豆レクチン、ヒマ豆レクチン、コンカナバリン
Ａなどを特異的に認識して相互作用するものであればい
かなる抗体でも使用することができる。特に、安価で、
大量に調整でき、しかも活性の高い鶏卵由来の抗体が好
ましく用いられる。
【００１７】本発明で使用される分離剤としては、デキ
ストラン、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリスチ
レン、多孔質ガラス、それらの架橋体や誘導体など、従
来からカラムに慣用されている分離剤が同様に使用でき
る。これらの分離剤のなかでも、細胞特異性の低いアガ
ロース系のセファロース６ＭＢなどが特に好ましく使用
できる。
ストラン、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリスチ
レン、多孔質ガラス、それらの架橋体や誘導体など、従
来からカラムに慣用されている分離剤が同様に使用でき
る。これらの分離剤のなかでも、細胞特異性の低いアガ
ロース系のセファロース６ＭＢなどが特に好ましく使用
できる。
【００１８】レクチンと特異的に結合させてレクチン−
細胞結合体とする細胞としては、レクチンと特異的に結
合しうる細胞であれば特に限定されることはなく、血液
細胞や皮膚細胞などから必要に応じて特定の細胞を選択
すればよい。また、最終的に分離回収される細胞は、レ
クチンと特異的に結合してレクチン−細胞結合体を形成
した特定の細胞としてもよく、あるいはレクチンと結合
せず従ってレクチン−細胞結合体を形成しない他の細胞
を、最終的に分離回収することも可能である。本発明方
法により分離しうる細胞の中でも特に幹細胞は、ガン治
療などに利用できるため特に有用である。
細胞結合体とする細胞としては、レクチンと特異的に結
合しうる細胞であれば特に限定されることはなく、血液
細胞や皮膚細胞などから必要に応じて特定の細胞を選択
すればよい。また、最終的に分離回収される細胞は、レ
クチンと特異的に結合してレクチン−細胞結合体を形成
した特定の細胞としてもよく、あるいはレクチンと結合
せず従ってレクチン−細胞結合体を形成しない他の細胞
を、最終的に分離回収することも可能である。本発明方
法により分離しうる細胞の中でも特に幹細胞は、ガン治
療などに利用できるため特に有用である。
【００１９】本発明を実施するに際して、レクチン−細
胞結合体を調製するには、細胞液とレクチン溶液とを混
合し４〜３７℃、好ましくは３５〜３７℃で数分から数
十分処理することによりに容易に調製することができ
る。なお、細胞液の調製は、細胞を採取する起源の違い
により種々の方法を採用できるが、例えば血液細胞の場
合には、血液を遠心分離して所望の細胞群を予め濃縮す
る方法が採用でき、混入する微量の赤血球は洗浄して除
去しておくことが望ましい。
胞結合体を調製するには、細胞液とレクチン溶液とを混
合し４〜３７℃、好ましくは３５〜３７℃で数分から数
十分処理することによりに容易に調製することができ
る。なお、細胞液の調製は、細胞を採取する起源の違い
により種々の方法を採用できるが、例えば血液細胞の場
合には、血液を遠心分離して所望の細胞群を予め濃縮す
る方法が採用でき、混入する微量の赤血球は洗浄して除
去しておくことが望ましい。
【００２０】一方、抗体固定化分離剤を調製するに際し
ては、中性ないし弱アルカリ性の緩衝液に活性化した分
離剤を分散した分散液に抗体を添加し、４〜１０℃の低
温で２〜１０時間反応させることにより抗体固定化分離
剤ゲルを得ることができる。
ては、中性ないし弱アルカリ性の緩衝液に活性化した分
離剤を分散した分散液に抗体を添加し、４〜１０℃の低
温で２〜１０時間反応させることにより抗体固定化分離
剤ゲルを得ることができる。
【００２１】かくして得られた抗体固定化分離剤ゲルを
カラムに充填し、レクチン−細胞結合体液をこのカラム
に通液することによって、レクチンと抗体との特異的相
互作用により、レクチン−細胞結合体は抗体固定化分離
剤ゲルのカラムに吸着され、レクチンと結合しない他の
細胞はカラムから流出することにより、レクチンと特異
的に結合する特定細胞と、レクチンと結合しない他の細
胞とを分離することができる。
カラムに充填し、レクチン−細胞結合体液をこのカラム
に通液することによって、レクチンと抗体との特異的相
互作用により、レクチン−細胞結合体は抗体固定化分離
剤ゲルのカラムに吸着され、レクチンと結合しない他の
細胞はカラムから流出することにより、レクチンと特異
的に結合する特定細胞と、レクチンと結合しない他の細
胞とを分離することができる。
【００２２】本発明の方法においては、例えば、抗体、
レクチン、細胞の濃度や個数の組成をそれらの種類や特
性によって適宜変更することによって、抗体やレクチン
の密度を容易に調整でき、細胞の分離効率を向上させる
ことができる。
レクチン、細胞の濃度や個数の組成をそれらの種類や特
性によって適宜変更することによって、抗体やレクチン
の密度を容易に調整でき、細胞の分離効率を向上させる
ことができる。
【００２３】
【実施例】以下に実施例を示して本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこの実施例のみに限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこの実施例のみに限定されるもので
はない。
【００２４】［抗体の吸着剤への固定化］４ｇのＣＮＢ
ｒ活性化セファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）を、
０．５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3 緩衝液
（ｐＨ８）２０ｍｌに加えて分離剤溶液とし、この分離
剤溶液中にダイズレクチン（ＳＢＡ）に対する抗体１０
ｍｇを添加して、２時間、４℃で反応させた。反応終了
後、得られたゲルを上記の緩衝液で洗浄した後、０．２
Ｍグリシン溶液を加えて、さらに４℃で１晩放置した。
ゲルを再度上記の緩衝液で洗浄した後、その６ｍｌを１
０ｍｌシリンジに充填し、抗ＳＢＡ抗体固定化セファロ
ース６ＭＢカラムを得た。
ｒ活性化セファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）を、
０．５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3 緩衝液
（ｐＨ８）２０ｍｌに加えて分離剤溶液とし、この分離
剤溶液中にダイズレクチン（ＳＢＡ）に対する抗体１０
ｍｇを添加して、２時間、４℃で反応させた。反応終了
後、得られたゲルを上記の緩衝液で洗浄した後、０．２
Ｍグリシン溶液を加えて、さらに４℃で１晩放置した。
ゲルを再度上記の緩衝液で洗浄した後、その６ｍｌを１
０ｍｌシリンジに充填し、抗ＳＢＡ抗体固定化セファロ
ース６ＭＢカラムを得た。
【００２５】［細胞液の調製］ヘパリン添加骨髄血か
ら、フィコール・ハイパック比重遠心分離法で必要な骨
髄細胞を分離し、ＰＢＳ（−）溶液（Ｃａ2+を含まない
リン酸緩衝液）で洗浄した後、混入している微量の赤血
球を０．８３％塩化アンモニウム−Ｔｒｉｓ溶液で溶解
して洗浄により除去し、骨髄細胞液を得た。
ら、フィコール・ハイパック比重遠心分離法で必要な骨
髄細胞を分離し、ＰＢＳ（−）溶液（Ｃａ2+を含まない
リン酸緩衝液）で洗浄した後、混入している微量の赤血
球を０．８３％塩化アンモニウム−Ｔｒｉｓ溶液で溶解
して洗浄により除去し、骨髄細胞液を得た。
【００２６】［レクチン溶液の調製］ＳＢＡ（Ｖｅｃｔ
ｏｒ社製、ロット番号＃Ｌ−１０１０）を０．１％アル
ブミンを添加したハンクス緩衝液（ＨＢＢＳ、ｐＨ７．
４）に溶解してＳＢＡレクチン溶液（濃度１ｍｇ／ｍ
ｌ）を調製した。
ｏｒ社製、ロット番号＃Ｌ−１０１０）を０．１％アル
ブミンを添加したハンクス緩衝液（ＨＢＢＳ、ｐＨ７．
４）に溶解してＳＢＡレクチン溶液（濃度１ｍｇ／ｍ
ｌ）を調製した。
【００２７】［レクチン−細胞結合体の調製］骨髄細胞
２×１０6 個を含有する細胞液０．２５ｍｌに対して、
同量の０．２５ｍｌのＳＢＡレクチン溶液（濃度１ｍｇ
／ｍｌ）を加えて１０分間、３７℃で処理することによ
り、ＳＢＡレクチン−細胞結合体液を調製した。
２×１０6 個を含有する細胞液０．２５ｍｌに対して、
同量の０．２５ｍｌのＳＢＡレクチン溶液（濃度１ｍｇ
／ｍｌ）を加えて１０分間、３７℃で処理することによ
り、ＳＢＡレクチン−細胞結合体液を調製した。
【００２８】［抗体固定化カラムへのレクチン−細胞結
合体の吸着操作］ＰＢＳ（＋）溶液（Ｃａ2+を含むリン
酸緩衝液）で平衡化した抗ＳＢＡ抗体固定化セファロー
ス６ＭＢカラムに、上記で得られたＳＢＡレクチン−細
胞結合体液を通液した。次いでこのカラムを３７℃で１
時間インキュベートした後、ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．
４）４ｍｌを通液することにより未吸着細胞をカラムか
ら流出させた。
合体の吸着操作］ＰＢＳ（＋）溶液（Ｃａ2+を含むリン
酸緩衝液）で平衡化した抗ＳＢＡ抗体固定化セファロー
ス６ＭＢカラムに、上記で得られたＳＢＡレクチン−細
胞結合体液を通液した。次いでこのカラムを３７℃で１
時間インキュベートした後、ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．
４）４ｍｌを通液することにより未吸着細胞をカラムか
ら流出させた。
【００２９】なお比較のため、抗ＳＢＡ抗体以外の抗体
（抗ＣｏｎＡ抗体）を固定化したセファロース６ＭＢカ
ラムにＳＢＡレクチン−細胞結合体を通液し、同様にし
てＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を通液することにより
未吸着細胞をカラムから流出させた。流出液中の未吸着
細胞数を算出した結果を表１に示す。
（抗ＣｏｎＡ抗体）を固定化したセファロース６ＭＢカ
ラムにＳＢＡレクチン−細胞結合体を通液し、同様にし
てＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を通液することにより
未吸着細胞をカラムから流出させた。流出液中の未吸着
細胞数を算出した結果を表１に示す。
【００３０】 ［表１］ 実施例 比較例 カラム通液前の細胞液中の細胞数 ２×１０6 ２×１０6 流出液中の未吸着細胞数 ０．４×１０6 １．５×１０6 カラム吸着細胞の割合 ８０％ ２５％
【００３１】表１からわかるように、ＳＢＡレクチン−
細胞結合体を抗ＳＢＡ抗体結合化カラムに通液する本発
明の方法により、ＳＢＡレクチンに特異的に結合する細
胞をＳＢＡレクチンに結合しない他の細胞から効率よく
分離することができる。
細胞結合体を抗ＳＢＡ抗体結合化カラムに通液する本発
明の方法により、ＳＢＡレクチンに特異的に結合する細
胞をＳＢＡレクチンに結合しない他の細胞から効率よく
分離することができる。
【００３２】［幹細胞数の測定］骨髄血から採取した骨
髄細胞液中には、ＳＢＡと相互作用するＴ細胞やＢ細胞
などの細胞群と、ＳＢＡと相互作用しない幹細胞が含ま
れており、上記した分離操作によって、Ｔ細胞やＢ細胞
などの細胞群のほとんどが抗ＳＢＡ抗体固定化セファロ
ース６ＭＢカラムに特異的に吸着され、幹細胞などはカ
ラムに吸着せずそのまま流出する。カラム通液前の細胞
液中およびカラム流出液中のＴ細胞数と幹細胞数を測定
した結果を表２に示す。
髄細胞液中には、ＳＢＡと相互作用するＴ細胞やＢ細胞
などの細胞群と、ＳＢＡと相互作用しない幹細胞が含ま
れており、上記した分離操作によって、Ｔ細胞やＢ細胞
などの細胞群のほとんどが抗ＳＢＡ抗体固定化セファロ
ース６ＭＢカラムに特異的に吸着され、幹細胞などはカ
ラムに吸着せずそのまま流出する。カラム通液前の細胞
液中およびカラム流出液中のＴ細胞数と幹細胞数を測定
した結果を表２に示す。
【００３３】なおＴ細胞数および幹細胞数の測定は、骨
髄細胞を０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添
加したＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に分散させ、幹細
胞と特異的に相互作用する抗体ＣＤ３４およびＴ細胞と
特異的に相互作用するＣＤ２をそれぞれ蛍光ラベル化し
たものを用いて二重染色を行い、ＣＤ３４陽性細胞（幹
細胞）およびＣＤ２陽性細胞（Ｔ細胞）の蛍光強度をフ
ローサイトメトリーを用いて測定した。
髄細胞を０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添
加したＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に分散させ、幹細
胞と特異的に相互作用する抗体ＣＤ３４およびＴ細胞と
特異的に相互作用するＣＤ２をそれぞれ蛍光ラベル化し
たものを用いて二重染色を行い、ＣＤ３４陽性細胞（幹
細胞）およびＣＤ２陽性細胞（Ｔ細胞）の蛍光強度をフ
ローサイトメトリーを用いて測定した。
【００３４】 ［表２］ Ｔ細胞数 幹細胞数 カラム通液前の細胞液 ０．９×１０6 ０．０９×１０6 カラム流出液 ０．２５×１０6 ０．０７×１０6
【００３５】表２からわかるように、骨髄細胞液を抗Ｓ
ＢＡ抗体固定化セファロース６ＭＢカラムに通液するこ
とによって、骨髄細胞中のＴ細胞を含む細胞群が選択的
にカラムに吸着し、一方、骨髄細胞中の幹細胞はほとん
ど吸着せずにカラムから流出するため、流出液中に幹細
胞を相対的に濃縮させることができる。すなわち本発明
の方法によれば、ガンや白血病の治療に有用な幹細胞を
他の細胞群から効率よく分離濃縮して回収できることが
わかる。
ＢＡ抗体固定化セファロース６ＭＢカラムに通液するこ
とによって、骨髄細胞中のＴ細胞を含む細胞群が選択的
にカラムに吸着し、一方、骨髄細胞中の幹細胞はほとん
ど吸着せずにカラムから流出するため、流出液中に幹細
胞を相対的に濃縮させることができる。すなわち本発明
の方法によれば、ガンや白血病の治療に有用な幹細胞を
他の細胞群から効率よく分離濃縮して回収できることが
わかる。
【００３６】
【発明の効果】以上詳述したように本発明によれば、レ
クチンを従来のようにカラムやシャーレに固定すること
なく、フリーの状態で特定の細胞と特異的に結合させる
ため、レクチンの活性低下や副反応の発生もなく、効率
よくレクチン−細胞結合体を生成させることができる。
クチンを従来のようにカラムやシャーレに固定すること
なく、フリーの状態で特定の細胞と特異的に結合させる
ため、レクチンの活性低下や副反応の発生もなく、効率
よくレクチン−細胞結合体を生成させることができる。
【００３７】かくして得られたレクチン−細胞結合体を
含む液を、レクチンと特異的に相互作用する抗体を分離
剤に固定化した抗体固定化分離剤の充填カラムに通液さ
せることにより、レクチンと抗体との特異的な相互作用
によって両者を結合させ、レクチン−細胞結合体を効果
的に選択分離することができ、その結果、レクチンと特
異的に結合する細胞と、レクチンと結合しない他の細胞
とを効率よく分離することが可能となる。
含む液を、レクチンと特異的に相互作用する抗体を分離
剤に固定化した抗体固定化分離剤の充填カラムに通液さ
せることにより、レクチンと抗体との特異的な相互作用
によって両者を結合させ、レクチン−細胞結合体を効果
的に選択分離することができ、その結果、レクチンと特
異的に結合する細胞と、レクチンと結合しない他の細胞
とを効率よく分離することが可能となる。
【図１】本発明の概念を示す模式的説明図である。
Claims (5)
- 【請求項１】 特定の細胞に特異的に結合するレクチン
を前記特定細胞と結合させてレクチン−細胞結合体を調
製し、前記レクチンに特異的に相互作用する抗体を分離
剤に固定させて抗体固定化分離剤を調製し、前記抗体固
定化分離剤を充填したカラムに前記レクチン−細胞結合
体液を通液してレクチンと抗体とをそれらの特異的相互
作用により結合させることによってレクチン−細胞結合
体を分離することを特徴とする細胞の分離方法。 - 【請求項２】 前記レクチンが、ピーナッツレクチン、
ダイズレクチン、小麦胚芽レクチン、インゲン豆レクチ
ン、ヒマ豆レクチンまたはコンカナバリンＡから選択さ
れるものであることを特徴とする請求項１記載の細胞の
分離方法。 - 【請求項３】 前記抗体が、抗ピーナッツレクチン抗
体、抗ダイズレクチン抗体、抗小麦胚芽レクチン抗体、
抗インゲン豆レクチン抗体、抗ヒマ豆レクチン抗体また
は抗コンカナバリンＡ抗体から選択されるものであるこ
とを特徴とする請求項１記載の細胞の分離方法。 - 【請求項４】 前記分離剤が、デキストラン、ポリアク
リルアミド、アガロース、ポリスチレン、多孔質ガラ
ス、それらの架橋体または誘導体から選択されるもので
あることを特徴とする請求項１記載の細胞の分離方法。 - 【請求項５】 前記レクチンとしてダイズレクチンを使
用し、前記抗体として抗ダイズレクチン抗体を使用する
ことを特徴とする請求項１記載の細胞の分離方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12537597A JPH10319014A (ja) | 1997-05-15 | 1997-05-15 | 細胞の分離方法 |
| PCT/JP1998/000460 WO1998052039A1 (fr) | 1997-05-15 | 1998-02-04 | Procede de separation de cellules |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12537597A JPH10319014A (ja) | 1997-05-15 | 1997-05-15 | 細胞の分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10319014A true JPH10319014A (ja) | 1998-12-04 |
Family
ID=14908585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12537597A Pending JPH10319014A (ja) | 1997-05-15 | 1997-05-15 | 細胞の分離方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10319014A (ja) |
| WO (1) | WO1998052039A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013529066A (ja) * | 2010-04-06 | 2013-07-18 | フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー | 農薬の特異的送達 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0399464A3 (en) * | 1989-05-24 | 1992-03-25 | Eiji Ishikawa | Assay method for a substance with a specific sugar chain |
| JPH03287067A (ja) * | 1990-04-03 | 1991-12-17 | Terumo Corp | リンパ球の分離剤、分離装置および分離方法 |
-
1997
- 1997-05-15 JP JP12537597A patent/JPH10319014A/ja active Pending
-
1998
- 1998-02-04 WO PCT/JP1998/000460 patent/WO1998052039A1/ja active Application Filing
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013529066A (ja) * | 2010-04-06 | 2013-07-18 | フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー | 農薬の特異的送達 |
| US10271546B2 (en) | 2010-04-06 | 2019-04-30 | Agrosavfe N.V. | Specific delivery of agrochemicals |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998052039A1 (fr) | 1998-11-19 |
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