JPH02152541A - 流体媒体から材料の生化学分離法 - Google Patents

流体媒体から材料の生化学分離法

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JPH02152541A
JPH02152541A JP1243262A JP24326289A JPH02152541A JP H02152541 A JPH02152541 A JP H02152541A JP 1243262 A JP1243262 A JP 1243262A JP 24326289 A JP24326289 A JP 24326289A JP H02152541 A JPH02152541 A JP H02152541A
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microbeads
fluid medium
binding agent
beads
medium
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Dominique Dubois
ドミニク・デユボワ
Marcel Deizant
マルセル・デルザン
Francois Toussaint
フランソワ・トウサン
Thierry Kemp
テイエリー・カン
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Glaverbel Belgium SA
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は流体媒体から材料を分離する生化学方法に関す
る。本発明は流体媒体から材料を除去するためのキャリ
ヤー媒体及びかかるキャリヤー媒体を含有するアフイニ
テイ力ラム及びパイオリアク々−に及ぶ。
本発明は動物又は植物細胞によって産生される種々の種
類の生物材料の産生に特に関する。
かかる材料の例にはウィルス蛋白質、サイトカイニン（
ｏｙｔｏｋｉｎｓ　）、ホルモン、酵素、モノクローナ
ル抗体、ウィルス及び細菌性ワクチン、薬剤、及び細胞
成分例えば染色体及び細胞オルガネラがある。他の例に
は例えば人工皮ふ移植組織又は肝、膵、腎又は牌細胞の
移植のための全細胞を含む。
本発明は又生物学的処理以外の手段例えば生物の組織の
機械的破砕によって得られる生物学的材料、及び生物学
的方法で産生されるアルフ−ル及びアンモニアの如き材
料、及び生物学的産生媒体から分離することが必要な材
料にも関係する。例えば成る種の酵母は、もし除失しな
ければ酵母に毒である濃度まで蓄積するアルコールを産
生ずる。更に本発明は流体媒体の汚染除去（ｄｓｐｏｌ
ｌｕｔｉｏｎ　）又は精製のための生化学方法に関する
。
しかしながら動物細胞によって産生される生物学的材料
に対する人間及び獣の医薬における重大でかつ益々増大
している要求のため、本発明は以後かかる材料の製造を
特に参照して説明する。
古典的な方法によれば、生物学的材料は培養容器中で醗
酵法によって動物細胞から生産され、これから所望の生
産物を分離し、そして精製しなければならない。所望の
生産物はしばしば非常に稀釈され、これも多くの汚染物
を含有する培地中に小割合でしか存在しない。稀釈のた
め、精製をする前に非常に大量の培地を処理し、濃縮す
る必要がある。汚染のため、生産物は分離することが非
常に困難であり、古典的方法においては、多くの分離段
階を必要としている。このことは非常に時間のかかる従
って高価につくものである。更にかかる方法はバッチ式
で行わなければならない。細胞は栄養培体を含有する培
養容器（バイオリアクター）中で成る時間で生長し、次
いで培地は目的生産物を除去し、精製するため処理され
る。かかる精製法は、目的生産物を汚染材料から分離す
るため、目的生産物の生化学的及び生物物理学的特性の
利点をとる幾つかの精製工程で細胞を分離し、無細胞（
ａｏ・１ｌｕｌａｒ　）培地の処理することをしばしば
包含する。分離工程は例えば所望生産物に対し親和性を
有するように処理されたアガロース又はポリアクリルア
ミドのボールの如き粒子の床によって構成された多孔質
！、トリックスを含有するカラム中に培地を通し、例え
ば培地のｐＨとは異なるｐＨを有する媒体にキャリヤー
粒子を曝臓することによって、キャリヤー粒子から生産
物を除去することによって行うことができる。例をあげ
ると、抗原は、その抗原に対する抗体でキャリヤー粒子
を被覆することによって培地から分離することができる
。かかる多段及びバッチ式処理は精製すべき生物学的媒
体の貯蔵を必要とし、それを分解の危険に曝し、それぞ
れ連続する工程でそれぞれの反応成分の採用を必要とす
ることからその性質によって非効率的で費用がかかる。
本発明の目的は、これらの欠点の少なくとも幾つかを減
少させた流体媒体から材料を分離するための生化学方法
を提供することにある。
本発明によれば、表面に分離する材料に対する結合剤を
固定した多数のガラス微小ビーズを流体媒体中に導入し
、成る量の前記材料が微小ビーズに結合するに充分な滞
留時間微小ビーズを流体媒体に滞留させ、結合した材料
を有する微小ビーズを流体媒体から除去し、微小ビーズ
から結合した材料の少なくとも幾らかを剥離し、一方微
小ビーズに固定された結合剤を残し、結合剤を有する微
小ビーズを流体媒体に再循環することを含む流体媒体か
ら材料を分離する生化学方法を提供する。
本発明は微小ビーズから剥離後集めた生産物が流体媒体
から・分離される材料と同じでない方法を含む。例えば
、その分離された材料の分子が、微小ビーズに結合する
間又はこれらの微小ビーズから剥離する間に変性されて
もよい。
本発明によれば、結合剤を担持するガラス微小ビーズを
含むキャリヤー媒体を流体媒体中を通して循環させ、か
くしてその媒体からの材料の除去を一段法で又は連続的
に行うことができる生化学方法を提供する、これは従来
より使用されていた如き多段バッチ式除去方法よりも本
来的に効率的で従って費用が少なくてすむ。又結合剤を
有する微小ビーズを流体媒体に書循環させることから、
結合剤はそれ自体材料の分離のため再使用できる。従っ
て一定量の材料を除去するために要する結合剤の輩は非
常に減少させられ、従ってその結合剤を提供する費用も
減することができる。
本発明はかかる方法に使用しうるガラス微小ビーズを含
む。
従って本発明は又被覆を担持するガラス微小ビーズも提
供し、前記被覆は、微小ビーズに固定され、生物学的親
和反応によって流体媒体内の材料に対して放出可能に結
合するようになされた少なくとも１種の結合剤を含有し
、これによって材料を微小ビーズに結合した流体媒体か
ら除去できるようにし、次いでこれらの微小ビーズに結
合した結合剤を残しながら微小ビーズから剥離できるこ
とを特徴とする。同じか又は別に処理したキャリヤー上
に、１＃Ａより多くの結合剤を同時に使用して、流体媒
体から異なる材料の同時除去を行うことができる。
かかる微小ビーズは生物学的材料を分離するための方法
に有用であり、それらは再使用できることで経済的であ
る。かかる微小ビーズの大部分の費用は、ガラスの原価
にはなくて、むしろ結合剤それ自体の費用及び微小ビー
ズに結合剤を固定する方法の費用にある。それらが再使
用できるため、かかる費用は長い有効痔命にわたって配
分できる。
ガラス微小ビーズの使用は重大な利点を与える。ガラス
微小ビーズは容易にかつ安価に作ることができ、かかる
ビーズの表面に結合剤を固定するために好適な方法を適
用することは実に容易である。ガラス微小ビーズは容易
に滅菌することができ、容易に取り扱うことができる、
そしてそれらは中ヤリャーとしてのそれらの使用を特に
好適ならしめる性質を与えることができる。他の種類の
ビーズとは対照的に、ガラスピーズは、流体媒体に長期
間曝露されたとき、又は媒体中のイオン濃度が変化した
とき膨潤する傾向がなく、従ってそれらはより信頼性を
確実にし、分離中、例えばバイオリアク横−から材料を
集める間又は例えばアフイニテイ力うム中で結合剤から
材料を剥離する間一定の流体力学的品質を保証する。
有利には、前記微小ビーズは非孔質表面を有するガラス
微小球で少なくとも主として構成する。これは特に望ま
しい性質である、何故ならば非孔質面を有するビーズは
、例えば流体媒体又は材料を分離するため使用する媒体
から、汚染物又は他の望ましからぬ材料を吸収し、捕捉
する孔を有しないからである。事実細胞生長を支持する
流体媒体は細胞及び所望生産物のみならず多くの可溶性
汚染物及び細胞状デブリ、例えば細胞超厚のオルガネラ
及び凝集物及び細胞膜の片を含有する。かかる汚染物は
孔中に吸着され、閉じ込められ、所望生産物の純度を損
うことができ、多孔質ビーズを流体媒体に再循環したと
き細胞を毒し又は他の有害な効果を有しうる。ガラス微
小ビーズの孔、又は他の材料のビーズの孔から捕捉され
た材料を除去することは非常に困難でありうる。しかし
ながら非孔質ビーズは、何ら特別な処理をせずに容易に
再使用できる。それらは目的生産物又は結合剤に有害な
効果を有することなく情態された生産物の剥離前及び後
に再使用することができる。
ガラス微小ビーズは、媒体の密度、及び媒体に加え、そ
れと接触させ、それから除去する目的とする方法に関係
した密度のものであるのが好ましい。一般にそれらは０
．５〜１．５の平均相対密度を有することが好ましい。
それらは中実微小ビーズであることができ、これらは流
体媒体よりも大なる密度を有するであろう、そしてこれ
らは流体媒体を含有する容器の頂部中に導入し、その基
底近くから取り出すことができる。
或いはそして好ましくは、それらは中空ガラス微小ビー
ズによって少なくとも主として構成する。これらは流体
媒体よりかなり小さい密度を有しうる、この場合それら
を容器の基部で導入し、流体媒体の表面をすくいとるこ
とによってそれらを除去することは判るであろう。かか
る低密度ビーズは、攪拌しなければならない媒体で使用
するのに特に好適である。本発明の多くの好ましい実施
態様において、前記微小ビーズは０．９〜１．１の平均
相対密度を有する。かかるビーズは意図している多くの
流体媒体中に容易に懸濁され、媒体内で実質的に中性の
又は僅かに正の浮力を有し、パイプ系を通して媒体と共
に容易に循環することができる。これはかかる媒体内で
のビーズの良好な混合を達成するため、及び生産物の有
効な収集に好適な滞留時間を可能にするための利点であ
る。
微小ビーズの大きさも、結合剤に対するキャリヤー媒体
としてのそれらの有効性に支持を与える。ビーズの処理
は、好みに応じて、それらが１２５μｍ未満、例えば７
５＋１５μｍの中央値直径を有すると容易である。換言
すると、大部分のビーズ（数で）が１２５μｍ未満の直
径を有することが好ましい。又ビーズはかなり狭い大き
さの範囲分布を有すべきことが望ましい。例えばそれら
の上方十分位置径（数で１０％が大きい直径を有する）
がそれらの下方十分位置径（＠で１０％が小さい直径を
有する）の２倍より大きくないことが好ましい。或いは
、又は加えて、それらの上方及び下方十分位置径が２０
μｍ未満まで異なるべきであることが時には望ましい。
かかるビーズの狭い大きさの範囲分布（これは他のビー
ズ形成物質を用いるよりもガラスを用いて容易に達成さ
れる）が、ビーズの濾過及びそこからの材料の溶離を容
易にすることが判る。微小ビーズは２０μｍ〜３０μｍ
の範囲で中央値直径を有することが特に好ましい。これ
は、ビーズへの結合剤の固定に特に好適であり、かかる
結合剤に分離すべき材料を結合させるために好適である
大なる非表面積をビーズに与える。
結合剤は固定剤によってビーズのガラス表面に固定する
のが好ましい。これは、結合された材料を除去するため
ビーズの処理中その結合剤の除去に耐えるビーズへの結
合剤の強力な固定を容易ならしめる、有利には前記結合
剤は共有結合によってビーズのガラス表面へ固定する。
固定剤は、代表的には鎖の一端でガラスに、そして鎖の
他端で結合剤に緊く結合するかなり長い鎖の分子である
。結合剤への結合は、流体媒体から分離されるべき材料
へそれ自体を結合させる結合剤の能力を妨害しないよう
にしなければならない。
ガラス及び有機材料に結合できる種々の固定剤がそれ自
体知られており、本発明において使用できる。前記固定
剤にはシランを含むのが好ましく、最も好ましいのは分
子中に炭素原子６〜１８個を含有するシランである。広
い範囲のシランが市場で入手できる、そしてガラス及び
個々の結合剤に良く結合する適切なシランを選択すると
よい。特に好適なシランにはアミノシラン又はエポキシ
シラン、例えばＴ−グリシドキシプロビルトリメトキシ
シランがある。固定剤はその場で、例えばグルタルアル
デヒドと共にアミノ−アルキルシランを形成できる。Ｔ
−グリシドキシプロビルトリメトキシシランのメトキシ
官能基はガラスに強力に固定し、一方エポキシ官能基は
、最も有利な結合剤に入る蛋白質のア虚ノ基と主として
共有結合を形成するのに特に好適である。別の実施態様
において、シランは、結合剤として作用する糖蛋白質、
糖脂質又はポリサッカライドの一部を形成する糖に結合
できる。かかる糖との反応は普通、結合が生じうる活性
位置を作るため糖と反応する酸化剤で糖を処理した後に
行われる。
本発明の好ましい実施態様において、前記固定剤は実質
的に単分子層として前記微小ビーズに適用する。これは
ガラスと結合剤の間の強力な結合の形成を促進する。か
かる層は結合剤の最大量を固定するため微小ビーズの実
質的に全表面にわたって拡がるのが好ましい。この方法
で結合剤の分子が固定剤の分子に直接結合し、ひいては
ガラスに直接結合する。単分子層は例えば摩耗により損
傷を受けることが少なく、これは固定剤及び固定された
結合剤が剥離されて材料を汚す（これは分離されるのが
望ましい）ことのある危険を大きく減少する。更にこの
特長の採用は、所望の材料以外の材料へ結合しつる被薇
ビーズ上の数少ない位置を残す。この特長の採用は固定
剤及び結合剤の節約でもある。
更に固定剤の単分子層の使用は、結合剤の単位が一つ以
上の位置でキャリヤーに結合されることを避けるために
有利であり、従って生物学的巨大分子の分子移動が期待
でき、流体媒体から分離されるべき材料の結合のための
最高の位置利用性を促進する。
本発明は動物細胞によって作られる生物学的材料例えば
ウィルス蛋白質、サイドキン（ｏｙｔｏｋｉｎｅ　）、
ホルモン、酵素、モノクローナル抗体、ウィルス及び細
菌ワクチン、薬剤、全細胞、及び細胞成分例えば染色体
、及び細胞オルガネラの分離に特に好適である。
本発明は、前記流体媒体が培地であり、前記材料がその
培地での生産物であるとき絆済的で操作の簡便性の特別
の利点を与える。
本発明は培地から抗原を分離するのに特に有用であり、
このため、前記結合剤及び前記材料が抗原−抗体対とし
て機能し、ビーズに結合する結合剤として抗体を用いる
ことが特に好ましい。本発明のこの好ましい特長の採用
は、かかる材料とかかる結合剤の間の高度に選択性であ
る親和力により、所望材料の分離及び精製を容易にする
。例えば工ｇＧ又は工ｇＭ　（ペンタマー）の免疫グル
プリンを使用できる。他の結合剤、例えば幾つかの動物
抗原に対しても親和性を有する蛋白質入又は蛋白質Ｇを
使用できる。或いは流体媒体か（抗体を分離するため、
その相当する抗原又はへブテン又は抗原位置を表わす分
子を、ビーズに固定される結合剤として使用できる。抗
原は全細胞又は細胞画分の如き粒子の一部であることが
できる。
更に本発明は流体媒体から分離されるべき生物学的又は
有機材料の分子の転換に有用である。
かかる分子転換は、流体媒体中でのその元の形における
材料が環境的に有害であるとき、転換された材料が流体
媒体中での本来の材料の更に有用な形であるとき、又は
材料と結合剤の間の反応が流体媒体中のその材料の存在
のための指示薬として有用であるとき特に興味のあるも
のである。
微小ビーズは種々の方法で流体媒体を通して循環させる
ことができる。例えば浮揚性微小ビーズは所望の滞留時
間の間諜体中に滞留させることができ（これは好ましく
は攪拌する）、そして表面からすくいとることができる
。或いはかかる媒体を含有するための背の高い容器を用
い、かかる微小ビーズをその基底部で導入し、媒体の表
面から収集する。
微小ビーズを培養容器を通して？ｉ！ｌ環させる本発明
の実施態様において、培養容器内のフィルター素子によ
って規定された空間に微小ビーズを限定し、媒体の培養
細胞をそれがら実質的に除きつつその空間中に材料の通
過を許容する回転フィル々−素子（スピンフィル脅−）
の使用によって著しい利点が与えられる。
前記材料を担持する微小ピースは、そこから材料を剥離
するためアフィニティクロマトグラフ力ラムに通すのが
好ましい。これは材料を担持する微小ビーズのパッチを
処理する簡単にして便利な方法である。培養容器へ再循
環するたメロ１小ビーズの充分な余力を維持しながら、
与えられたカラム中で材料を剥離するための充分な時間
与えるため所望に従って単一培養容器とかかるカラムの
複数を組合せるとよい。材料は例えば酸性媒体で溶離す
ることによって微小ビーズから剥離できる。本発明の特
別の利点は、材料のかかる除去が連続法で行いうろこと
にある。
系の汚染は、滅菌装置及び滅菌取り扱い法を用いる滅菌
微小ビーズを作ることによって避けることができ、それ
以上の汚染は好適な抗生物質製剤の使用によって所望に
応じて制御できる。
例えばフルオロキノロンを使用できる。
本発明は本発明によるガラス微小ビーズを使用するバイ
オリアクターに及ぶ。
従って本発明はここに定義する如き微小ビーズ及び流体
媒体を含有する容器を含むバイオリアクターに及び、こ
の場合、前記微小ビーズを前記媒体から連続的に除去し
、その中に連続的に導入するための手段を設ける。特に
本発明は流体媒体を含有するためのパイオリアク々−を
提供し、前記リアク々−は、流体媒体の成分に対する結
合剤を担持するガラス微小ビーズと流体媒体を接触する
ための第−帯域及び微小ビーズから前記成分の続いての
分離をするための第二帯域を含むことを特徴としている
。
リアクター中に二つの帯域を設けうる種々の方法があり
、各帯域は分離した形であることができるが、相互連続
した容器であることができる、或いはそれらは単一容器
内で異なる室であることもできる。同じ容器内に異なる
帯域を設ける一つの好都合な手段は、それらの間に例え
ば不銹鋼メツシュの篩又は有孔シートを用いることであ
る。シリンダーの形に形成したメツシュは特にこのため
に便利である。シリンダーには又メツシュを通って流体
媒体の一定の成分の通過を阻止するように、そして閉塞
する危険を減するようそれを回転するための手段も設け
る。
かかる回転メツシュシリンダーをここではスピンフィル
ターと称する。それらは流体媒体の降下及び上昇をする
ことができ、これによって流体媒体内から所望成分をビ
ーズがピックアップでき、流体媒体からシリンダーで除
去でき、尚シリンダー内に保持されている間に所望成分
から分離される種類のものであることもできる。
スピンフィルターを有するバイオリアクターの特に好ま
しい、態様は、流体媒体及び内部フィルター及び外部フ
ィル々−を有する容器（これらフィルターは上記容器内
でそれらの間に環状空間を規定する）、前記環状空間か
ら前記媒体の懸濁した材料を排除し、一方でかかる媒体
中に溶解した生物学的方法の可溶性生産物をその空間中
に入れることができるよう回転状態で前記フィルターを
駆動するための手段、及び前記環状空間を通ってガラス
微小ビーズを循環させるための手段を有する。
バイオリアクターのかかる非常に簡単な構成の使用は培
地から材料を分離するための効率的でかつ経済的な生化
学方法を与える。二つのかかる回転しうるフィルター素
子（ここでは二重スピンフィルターと称する）の使用は
著しい利点を与える。微小ビーズは培養容器の良く規定
された領域に限定させることができ、従ってその空間を
通ってビーズを循環させ、一方でその中での所望の滞留
時間を許容することが簡略化される。これは分離法の効
率を促進する。媒体の培養細胞は微小ビーズの領域から
排除できるため、結合剤への材料の結合は妨害されずに
進行できる。二重スピンフィルターを使用スることに更
に別の利点は、与えられたフィル々−素子が通す粒子の
最大の大きさを、フィル々−の回転速度を増大させるこ
とによってフィルター素子中の孔の大きさから変化させ
ることができることにある。従って、二つの異なる大き
さの二重スピンフィル々−を必要とする異なる材料の処
理に当って、単一の二重スピンフィルターを使用できる
。更に別の利点は、急速に回転するスピンフィルター素
子中の孔が、固定フィルター素子のものよりも詰まるよ
うになることが非常に少ないことにある。この方法は例
えばかかるスピンフィルターによって分けられ又は規定
された入口室から出口室へと順流によって進行させるこ
とができる。
前記フィルターの内側内の空間から流体を引き出し、容
器の外側で微小ビーズと接触させるためその流体を運び
、続いてその流体を容器に戻すための手段を設けてもよ
い。これは、例えば培養容器中で充分な量を保持し、流
体媒体の効率的使用をさせながら、微小ビーズを輸送し
又は、洗浄するための流体を提供する非常に簡単な方法
である。
本発明の好ましい実施態様において、少なくとも一つの
アフイニテイ力ラムを、そのカラムに微小ビーズを運び
そして微小ビーズを容器に戻すための手段と組合せて設
ける。
本発明はここに説明した被覆された微小ビーズを含むア
フイニテイ力ラムに及ぶ。かかるカラムは充填されたと
き良好な流体力学的性質を有し、それはカラム及び微小
ビーズを滅菌回路内に留めうる例えば培地を流体媒体と
７ラツシングによって容易に排除できる。
本発明の幾つかの好ましい実施態様を図面を参照して実
施例によってここに説明する。
第１図は内部詳細を示すためケーシングの部分を切欠し
たバイオリアクターの斜視略図である０ 第２図はバイオリアクター系の第二の態様のフローチャ
ートである。
第３図はバイオリアクター系の第三の態様のフローチャ
ートである。
第４ａ図及び第４ｂ図はパイオリアクタ−系の第四の態
様のフローチャーＦである。
第５図はパイオリアクタ−系の第五の態様の７０−チャ
ートである。
第１図のバイオリアクターの図は、二重スピンフィルタ
ーを一緒に形成し、共通基部を有する共軸シリンダー状
フィルター素子２．３の対を保持する培養容器１を示す
。フィルター素子２．３は５μｍ〜１０μｍの開孔を有
する不［４メツシユのものが好適である。それらは例え
ば１００　ｒｐｍの速度でモー々−４によって回転駆動
される。流体培地を攪拌するための装置は示してない。
培地の攪拌は使用する回転二重スピンフィルターとはｉ
＋を関係であることができる。
導管６及び７は、二重スピンフィル々−の二つの素子２
，３の間の環状空間を通って結合剤を担持するガラス微
小ビーズを循環させるために設けである。導管９は二重
スピンフィルターの外がら培養容器に培地を供給するた
めのものであり、導管１０は二重スピンフィル々−の中
央空間から流体を取り出すためのものである。又培養容
器１内の圧力、液体の高さ、溶解した二酸化炭素及び酸
素、培地内の温度及びｐＨ，二重スピンフィルターの回
転速度及び微小ビーズの循環を監視し、調整するための
装置も設ける（図示せず）。
第１図に示したパイオリアク々−を使用する代表的な例
において、丁度１．０より下の平均相対密度を有する中
空ガラス微小ビーズを駅別して２０μｍと３０μｍの間
の直径を有するバッチを得る。ビーズは先ず塩酸で洗い
、所望によって洗剤で洗う。特定的には、ビーズ２０？
のパッチを先ず塩酸中で２０〜８０°Ｃの温度で１時間
洗浄する。この処理は、生物学的に活性な環境にｌ１１
ｇしたときガラスのイオン平衡及びその安定性に本要な
効果を有する。酸洗浄処理は、薄すぎる壁又は完全に形
成されていない壁を有するビーズを破壊できる。ビーズ
は、沈降する傾向を有するできそこなったビーズの廃物
から良く形成されたビーズを分離するために傾消し、次
にそれらは溶離剤のｐＨが６〜７に戻るまで脱イオン水
で烈しく洗い、次にビーズを１３０°Ｃの温度で一定重
債になるまで乾燥する。
改変例において、微小ビーズは０，５１の平均相対密度
及び５３〜９０μｍの直径を有するように選択する。
次いで固定剤を処理したビーズの表面に結合させる。こ
の例で選択した固定剤はＴ−グリシドキシプロビルトリ
メトキシシランである。最初の方法においては、１５１
ｉｌＬのビーズを処理するため、２ｔｎｌのシランを７
５ｍ１のトルエンに溶解する。ビーズを１１０″Ｃで１
８時間溶液中に浸漬し、次いで取り出し、２００＃Ｉ／
のトルエン、１００＋／のメタノールで連続して洗い、
次いで脱イオン水で洗浄する。改変例において、使用し
た固定剤はＮ−トリメトキシシリルエチレンジアミンで
ある。
第二の方法において、１．２１Ｒ１のシランを、ｐＨ５
，５に緩衝した０、　１　ｍｏ／酢酸ナトリウムの水溶
液６Ｑｍｌに溶解し、１５？の微小ビーズを９０°Ｃで
４時間その溶液で処理し、次いで脱イオン水で洗浄する
。この処理で、エポキサイド官能基の幾らかがジオール
に加水分解する。加水分解を完全にするため、ビーズ１
？について溶液４０ゴの量で、ＰＨ３の硫酸水溶液で２
時間ビーズを処理する。次いでビーズを蒸溜水で洗浄す
るＯ 微小ビーズに蛋白質材料を固定するためのシランの能力
を促進するため、ジオール基部いて過沃素酸イオンで処
理してアルデヒド基を形成する。５Ｐのかかるビーズを
氷で冷却した５０ｙｎｌメタノール中に懸濁し、１０Ｒ
ｔの水中の３８０ダのＮａＢＨ４及び３０叩のＮａＯＨ
の溶液を２ｍｌずっ加える。温度を室温にまで上昇させ
、懸濁液を４０℃で１５分間加熱する。次にビーズを続
けて水、アセトン及びエーテルで洗浄し、次いで減圧下
７０℃で２時間乾燥する。これはジオール基を１級アル
コール基に変換する。これらの条件下、２　、４−ジニ
トロフェニルヒドラジンでの試験はマイナスであり、微
小ビーズが白色のままで残存カルボニル官能基の不存在
を示している。
かく処理した微小ビーズ３ｉを次いで２５酎の無水ジオ
キサン中の７０ｆｉ’／の１，１′−カルボジイミダゾ
ール（約１００倍過剰）で処理する。
室温で２時間後、微小ビーズを戸別し、エーテルで洗い
、減圧下デシケータ中で乾燥する。これはイミダゾイル
カルバメート官能基（これはＨ，Ｎ−蛋白質を良く固定
しうる）を有するシランで被覆されたガラスピーズを残
す。
上述した如くして結合させた固定剤を担持する微小ビー
ズを、ウシ血清アルブミン（Ｂ１９Ａ　）を用いて蛋白
質を固定するためのそれらの能力について試験した。各
試験において２５０’Ｐのビーズを使用した。ビーズを
、２０°Ｃの温度でＩＷＬｔについて５りのＢＡＡを含
有するｐ）１９．０に１５０ｍＭのＮａｐ／と１００ｍ
Ｍの硼酸塩で緩衝した溶液１．５　ａｔ中で６　Ｑ　ｒ
ｐｍで水平回転で攪拌した。
固定剤がエポキサイド官能基を含有したビーズは２時間
処理後８０μｇのＢＳＡを平均して固定した。固定剤が
イミダゾイルカルバメート官能基を含有したビーズは、
２時間処理後４２４μｇのＢＳＡを平均して固定し、４
時間処理後４８０μｇのＢＢＡを平均して固定した。
結合剤の選択は、収集し、精製することを望む生産物に
よることは勿論である。下記実施例においては、収集し
、精製する生産物は、バイオリアクター中で生長したマ
ウスハイプリドーマによって産生されたマウスモノクロ
ーナル抗体工ｇＧ１である。
固定剤に固定するための結合剤として、マウス免疫グロ
ブリンエｇＧｓに対して免疫化したラビットの全血清（
ＲＡＭ　（ラビット−アンティマウス〕血清）を選択し
た。工ｇＧ１はラビットによって異種抗原として認知さ
れ、抗原に対して特異的に指向されたラビット免疫グロ
ブリン抗体のインビボでの生産を生せしめる。
固定剤を担持するガラス微小ビーズは処理溶液ＩＩＩＩ
ｔについて、２５０Ｗの割合で処理する。
処理溶液は硼酸塩緩衝され、２０岬／　ｍｅ　ＲＡＭ血
清を含有していた。ビーズは、６０　ｒｐｍで水平回転
により攪拌しつつ、２０°Ｃで２時間処理溶液中に懸濁
させた、その後７°Ｃで１６時間後反応培養を生起させ
た。微小ビーズは、支持された蛋白質に対して改変され
たフォリン−ローリ−法で測定したとき、乾燥ビーズＩ
ＰについてＲＡＭ血清６６０μｇを共有的に固定したこ
とが判った。
結合剤を固定した後、所望材料を結合するに当って微小
ビーズの特異性を促進するため、使用されなかった固定
剤の残存位置を不活性化することが望ましい。これはＩ
ＩＨ９で１５０＋ｎＭグリシンーＮａＯＨを含有する緩
衝溶液中で固定された結合剤を有する微小ビーズを洗浄
し、次いで中性緩衝液でビーズを洗って行う。
かかるポリクローナル血清結合剤は所望によってモノク
ローナル抗体で置換してもよい。かかるモノクローナル
抗体は、マウス免疫グロブリンの単一抗原特性を認知す
るため、ハイプリドーマ又は形質転換されたリンパ球、
例えばラットモノクローナル抗体（工ｇＲ）を生産する
ラットハイプリドーマの培養から得ることができ、同じ
方法で固定できる。
精製すべきマウス免疫グロブリンＩｇＧ　、は、培養容
器中で好適な媒体でマウスハイプリドーマによって作ら
れる。好適な培地は、血清又は血清代替物を含有するダ
ルベツコ改変イーグルス培地によって形成される。ｐＨ
は７．２に調整する。
培地は、含有しなければ存在する蛋白質を消化する酵素
の生産を防止するため、阻害剤（例えばベプス々チンＡ
又はフェニルメチルスルホニルクロライド）を更に含有
する。培地は二重スピンフィルターをとりまくため培養
容器中に導入する。フィルターは培養液及び溶解した材
料を通過させるが、培養容器の周囲領域に培養細胞を保
持させるように制御する。
第１図に示した装置を用い、結合剤を担持するビーズを
フィルター素子間の空間８中に導入し、それらを溶解し
た工ｇＧ１を含有する培養液中に浸漬する。結合した生
産物を担持するビーズは、キャリヤーとしての培養液中
の培地から導管７を介して連続的に取り出す、そしてそ
れらがクロマトグラフのマトリックスを構成するクロマ
トグラ７カラム（図示せず）に通す。培養キャリヤー液
は導管９を通して培養容器に戻すとよい。工ｇＧｓ生産
物は例えば酸性媒体及び低〜中圧を用いて溶離によって
微小ビーズから剥離する、その後向固定された結合剤を
有する微小ヒースは、導管１０を介して二重スピンフィ
ルターの中央から取り出した培養液をキャリヤー流体と
して用い培養容器に再循環させる。必要な工ｇＧ、生産
物は変性を防止するため直ちに緩衝し、その同定は酵素
結合免疫溶媒分析で立証し、その純度は電気泳動でチエ
ツクした。
改変例において、導管７自体をクロマトグラフカラムと
して構成し、それを通して培養液を連続的に循環させ、
工ｇＧ１生産物の結合を連続的に行う。カラムは好適ζ
滞留時間後取り出し、生産物の溶離後置換する。２０Ｆ
のビーズ含有量及びマウスエｇＧｔ２Ｗの容量を有する
かかるカラムにおいて、単一工程で７５０倍の精製率を
達成した、蛋白質電気泳動は純粋生産物であることを示
した。
滅菌状態を保ち、培養容器からの汚染物を排除するため
厳格な注意を払い、培養液及び尚結合剤を担持する微小
ビーズをそれに所望レベルを保つために再循環する。フ
ルオロキノロンの如き細胞の被毒又は汚染をさせない広
域抗生物質を使用するとよい。
同様の結果を生せしめる改変例においては、微小ヒース
ヲ、固定剤としてのアミノシラン及びグルタルアルデヒ
ドで処理する。
別の改変例においては、微小ビーズを固定剤としてのア
ミノシランで被覆する。抗体結合剤として作用すべきで
ある本実施例において工ｇＲと称される如き免疫グロブ
リンのオリゴサツカライド鎖は酸化される。このため、
ビーズ１？について工ｇＲ１”Ｐを使用する。ｐＨ５，
５を有するアセテート媒体中に工ｇＲを含有する溶液１
　ｍｌについてＨａ工ａ４（０，５Ｍ　）の溶液２０μ
ｌを加える。
酸化は間欠的に攪拌して室温で２０分間進行させる。次
いで酸化されたＩｇＲを古典的なりロマトグラフイ法で
酸化媒体から分離する。溶液中の酸化された工ｇＲを次
いでシラン化微小ビーズに、３０〜６０　ｒｐｍの速度
で回転する反応容器中で１１のビーズに２ｍｌの溶液量
で加える。２４時間後、ビーズを２時間常温で低速回転
下にグリシンの溶液で処理してガラス上の残存自由位ｆ
ｔヲ失活させる。微小ビーズを次いでプッフナーフィル
ター上で洗い、リン酸塩緩衝溶液と接触させて置いた（
ビーズ１デについて２酎）。
緩衝溶液１　ｍｌについて２０ｐｌのＢａＢＨ＠ＯＮ　
（Ｑ、５Ｍ）の還元性溶液を加え、常温で低速回転で４
時間放置し、再びグツフナ−フィルター上で洗う。
微小ビーズは回収し、使用するため必要になるまで、Ｎ
ａｐｌ及びＮａＮ３を含有する３−（Ｎ−モルホリノ）
プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ　）の緩衝液（０，０１
Ｍ、　ｐＨ７，４）中で冷間貯蔵する。
第２図に示すパイオリアク々−系は、培養容器１１を有
し、これに結合剤被覆ガラスピーズをホッパー１５から
導管１３を介して供給する。
容器１１には所望材料を分離すべきである生物学的流体
培地も含有する。流体媒体中でビーズを混合するのを助
けるため攪拌機１７を設ける。
パルプ付出口ライン１９は容器１１をクロマトグラフカ
ラム２１に接続する。それぞれ制御パルプをとりつけた
５個の異なる流体供給ライン２５．２６，２７．２８及
び２９で供給させる供給導管２３がカラム２１の基部に
博く。ライン２５，２６，２７．２８及び２９を介して
供給される流体は、それぞれカラム洗浄流体（ＭＯＰＳ
緩衝溶液）、第一カラム清浄化溶液（高イオン濃度溶液
）、第二カラム清浄化溶液（１！Ｉ′ｌ−？アンモニウ
ム溶液）、材料溶離流体（グリシン−Ｈ０ｊ’緩衝溶液
）及びビーズ洗浄流体としてのＭａＯＨを含有するＮ−
（２−ヒドロキシエチル）−ビペラジンーＮ′−３−プ
ロパンスルホン酸（ｎｍｐｐｓ　）緩衝溶液である。パ
イプラインマニホールド３１は流体溜り３２からカラム
２１の側面へ導き、カラム２１中へ異なるレベルで流体
を導入し、カラムからビーズを分離し、それらを容器１
１へ戻すのを助ける。カラム２１からの主出口は導管３
３で、パルプ３５に導かれ、パルプ３５はスペクトロフ
オトメー々−４３を通りライン４１を介してカラム２１
からの流体を、パルプ付き廃液ライン４５又はバルブ付
生産物ライン４７の選択をさせることができる。
パルプ３５は別に流体及び／又はビーズを、容器１１に
戻すポンプ３９をとりつけたラインを介して導くことが
できる。
第２図の装置は、ビーズが容器１１及びカラム２１を通
って上方に浮揚できるよう、相対的に小さい密度、例え
ば０．５〜０．９のものであるビーズを必要とする。
第２図のバイオリアクター系の運転に当って、結合剤被
覆ビーズはライン１３を介して容器１１中に供給し、そ
こでそれらは攪拌機１７の作用の下、生物学的流体と完
全に混合される。充分な滞留時間後、攪拌を停止し、パ
ルプ１９を開き、ここで容器１１中で媒体から分離され
た材料を担持するビーズがカラム２１中を上方に向って
浮揚する。ライン２５．２６及び２７によりビーズを洗
浄し、清浄化した径、所望生産物をライン２８からの溶
離液でビーズから分離する。溶出液はライン３３及び３
５に供給し、そこでスペクトロフォトメーター４３が溶
出液中の蛋白質の存在を監視し、パルプ４７を開き生産
物を集める、洗浄及び清浄化溶液はパルプ４５により廃
液放出点までとする。要求生産物の全部が除去されたと
き、カラム２１中のビーズは洗浄サイクル（ライン２９
及び２５）の作用を受ける。マトリックスは中圧下に溜
り３２から培地を射出して除く、そしてビーズはパルプ
１９を介して容器１１に再循環し、ここで分離すべき新
しく生物学的材料を結合するために備える、又この生物
学的材料はパイオリアクタ−中で連続的に生産される。
第３図に示すバイオリアクター系は、第２図の系の特長
に類似した多くの特長を有し、これらは同じ参照番号で
示してある。しかしながら、第３図において、容器１１
は、第１図のフィルター素子と同様のフィルター素子２
．３によって形成された二重スピンフィルターを含む。
精製系中への微小ビーズの滅菌導入のため、第３図にお
けるビーズ供給ライン１３はスイッチバルブ５３を介し
てバイオリアクターに導かれる。
導管５１は環状空間８からパルプ５３へと導き、容器１
１から分離された材料を担持するビーズをカラム２１に
運び、一方ビーズを含まぬ流体をパルプ３５及びポンプ
３９を介してリアクターへ再循環する。ポンプ１６をと
りつけた導管１０はスピンフィルター２，３のフィルタ
ー素子２によって形成された内室からマニホールド３１
に導くバルブ付ライン２０へと導く。
第３図のバイオリアクター系を運転するに当って、分離
される材料を担持する結合剤被覆ビーズはライン５１及
びパルプ５３を介してカラム２１へと通る。この系にお
いてビーズは約１．０の密度を有することが要求される
。所望生産物材料はライン２８からの溶離液によってビ
ーズから分離される。洗浄／清浄／溶離／濯ぎマニホー
ルド２５，２６，２７，２８．２９及びその操作は一般
に第２図のそれと同じである。溶出液は同様にライン３
３に供給し、そこでスペクトロフォトメーター４３が蛋
白質の存在を需視し、必要なときにパルプ４７を開く。
洗浄後マトリックスは、ポンプ１６及びパルプ２０の作
用の下向部スピンフィルター内からとった培地の噴射に
よって排除する。ビーズはカラム２１からパルプ５３及
びライン５１を介して環状空間８に戻される。
第４ａ図及び第４ｂ図に示したバイオリアクター系は単
一スピンフィルター６１を有し、りロマトグラフカラム
がないことで他の装置系とは異なる。この系においてス
ピンフィルターは上方位置（第４ａ図に示す）及び下方
位置（第４ｂ図に示す）の間で高さを調整できる。環状
じゃま板６３はスピンフィルター６１の運動の上限を規
定する。スピンフィルター６１（Ｆ）ｉＥ［の７ランジ
６７は環状シール６５を有し、これはスピンフィル４Ｉ
−６１の送行の上限で板６３と封止突き合せするように
なる。洗浄／清浄／溶離／すすぎマニホールド２５．２
６．２７゜２８及び２９からの導！’２３はスイッチパ
ルプ５４を介してフォーク付供給ライン２３＆。
２３ｂに導かれ、スピンフィルター６１の内部に導かれ
る。ライン５６も、スピンフィル々−６１がその上方位
置にあるとき、スピンフィルター６１と容器１１の壁の
間で形成される環状空間６２からパルプ５４に導かれる
。生産物抽出ライン４２は環状空間６２から生産物分離
単位４３．４５．４７へ導く。
第４ａ図及び第４ｂ図パイオリアク々−系の運転に当っ
て約１の相対密度を有する結合剤被覆゛ビーズを含有す
るスピンフィルＪ−６１は流体１４中に降下しく第４ｂ
図）、被覆ビーズに所望の生成物材料の結合を行うのに
充分な時間その中に留める。次いでスピンフィル々−６
１を上方位置に上昇させ（第４ａ図）、生産物材料は、
第２図の場合と同様にして洗浄／清浄化／溶離／すすぎ
サイクルに従ってビーズから分離する。
第５図に示すバイオリアクターは二つの容器１１及び７
１を組入れてあり、それぞれがスピンフィルター（それ
ぞれ７２ａ及び７２ｂ）を有する。この例において、培
地１４は容器１１中の７２ａで１濾過され、次いでライ
ン７３を介してメンブレンフィルター７４に運ばれ、ス
ピンフィルター７２ａを通す細胞デプリを保有し、次い
でライン７５を介して容器７１へと導く、ここで結合剤
被覆ビーズは所望生産物材料を除失する。約１の相対密
度を有するビーズは、容器７１全体に留まる。ライン７
６及び７７は残存流体を容器１１に再循環させ、ライン
７６は容器７１内の流体レベルを監視、容器中７１中の
レベルがセットした限界以上に上昇したときポンプ７９
を賦活する制御装［７８で賦活される。充分な時間後、
流体再循環を停止し、洗浄／清浄／＃ＩＩＩｍ／すすぎ
流体を容器７１へと供給ライン２３０を介して供給し、
分離した生産物は他の例と同じようにライン４１を介し
て取り出す。
【図面の簡単な説明】
第１図は内部詳細を示すためケーシングの部分を切欠し
たバイオリアクターの斜視略図、第２図はバイオリアク
ター系の第二の態様のフローチャート、第３図はバイオ
リアクター系の第三の態様のフローチャート、第４ａ図
及び第４ｂ図はバイオリアクター系の第四の態様のフロ
ーチャート、第５図はバイオリアクター系の第五の態様
のフローチャートである。 １・・・培養容器、２．３・・・フィルター素子、４・
・・モーター、８・・・管状空間、１１・・・培養容器
、１５・・・ホッパー　１７・・・攪拌機、２１・・・
クロマトグラフカラム、２５，２６，２７．２８．２９
・・・供給ライン、３２・・・溜り、４３・・・スペク
トロフォトメーター　３９・・・ポンプ、５３・・・ス
イッチパルプ、６１・・・スピンフィルＪＪ−６３・・
・環状じゃま板、６７・・・７ランジ。 ｅ Ｆｊｇ、１ Ｆｉｇ、３ Ｆｌｌ、４ｋ Ｆｌｌ、２ ｒ１１４身

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、流体媒体から材料を分離する生化学方法において、
    表面に前記材料のための結合剤を固定してあるガラス微
    小ビーズの多数を流体媒体中に導入し、微小ビーズを、
    多量の前記材料を微小ビーズに結合させるのに充分な滞
    留時間流体媒体中に滞留させ、流体媒体から結合した材
    料を有する微小ビーズを除去し、微小ビーズに固定され
    た結合剤を残しながら微小ビーズから少なくとも幾らか
    の結合した材料を剥離し、結合剤を有する微小ビーズを
    流体媒体に再循環させることを特徴とする生化学方法。 ２、前記微小ビーズが非孔質表面を有するガラス微小球
    によつて少なくとも主として構成されている請求項１記
    載の方法。 ３、前記微小ビーズが中空ガラス微小球によつて少なく
    とも主として構成されている請求項１又は２記載の方法
    。 ４、前記微小ビーズが０．５〜１．５、好ましくは０．
    ９〜１．１の平均相対密度を有する請求項３記載の方法
    。 ５、前記微小ビーズが１２５μｍ未満、好ましくは２０
    〜３０μｍの中央値直径を有する請求項１〜４の何れか
    に記載の方法。 ６、前記結合剤がビーズのガラス表面に固定剤によつて
    固定されている請求項１〜５の何れかに記載の方法。 ７、前記結合剤がビーズのガラス表面に共有結合によつ
    て固定されている請求項６記載の方法。 ８、前記固定剤がシランを含有する請求項６又は７記載
    の方法。 ９、前記固定剤が実質的に単分子層として前記微小ビー
    ズに付与されている請求項６〜８の何れかに記載の方法
    。 １０、前記流体媒体が細胞培地であり、前記材料がその
    培地の生産物である請求項１〜９の何れかに記載の方法
    。 １１、前記結合剤及び前記材料が抗原−抗体対として機
    能する請求項１〜１０の何れかに記載の方法。 １２、微小ビーズを培養容器内の環状空間を通つて循環
    させ、その空間は、培養容器内の微小ビーズをその環状
    空間に限定し、材料の培養細胞をそれから実質的に排除
    しながらその環状空間中に材料の通過を許す二つの回転
    フィルター素子によつて規定される請求項１〜１１の何
    れかに記載の方法。 １３、前記材料を担持する微小ビーズを、そこから材料
    を剥離するためクロマトグラフカラムに通す請求項１〜
    １２の何れかに記載の方法。 １４、被覆を担持するガラス微小ビーズにおいて、前記
    被覆が微小ビーズに固定される少なくとも１種の結合剤
    を含有し、その結合剤が生物親和反応によつて流体媒体
    内の材料に放出可能に結合するようになされており、こ
    れによつて材料が、微小ビーズに結合した流体媒体から
    除去でき、次いでこれらの微小ビーズに結合した結合剤
    を残しながら微小ビーズから剥離できるガラス微小ビー
    ズ。 １５、前記微小ビーズが非孔質表面を有するガラス微小
    球によつて少なくとも主として構成されている請求項１
    ４記載の微小ビーズ。 １６、前記微小ビーズが中空ガラス微小球によつて少な
    くとも主として構成されている請求項１４又は１５記載
    の微小ビーズ。 １７、前記微小ビーズが０．５〜１．５の平均相対密度
    を有する請求項１６記載の微小ビーズ。 １８、前記微小ビーズが０．９〜１．１の平均相対密度
    を有する請求項１７記載の微小ビーズ。 １９、前記微小ビーズが１２５μｍ未満の中央値直径を
    有する請求項１４〜１８の何れかに記載の微小ビーズ。 ２０、前記微小ビーズの少なくとも９０％が２０〜３０
    μｍの直径を有する請求項１９記載の微小ビーズ。 ２１、前記結合剤が、固定剤によつてビーズのガラス表
    面に固定されている請求項１４〜２０の何れかに記載の
    微小ビーズ。 ２２、前記結合剤が共有結合によつてビーズのガラス表
    面に固定されている請求項２１記載の微小ビーズ。 ２３、前記固定剤がシランを含有する請求項２１又は２
    ２記載の微小ビーズ。 ２４、前記固定剤が実質的単分子層として前記微小ビー
    ズに付与されている請求項２１〜２３の何れかに記載の
    微小ビーズ。 ２５、前記結合剤が抗原／抗体である請求項１４〜２４
    の何れかに記載の微小ビーズ。 ２６、請求項１４〜２５の何れかに記載の微小ビーズ及
    び流体媒体を含有する容器を含み、前記媒体から及び前
    記媒体中に前記微小ビーズを連続的に除去し、連続的に
    導入する手段を設けたバイオリアクター。 ２７、少なくとも一つのアフイニテイカラムを、そのカ
    ラムに微小ビーズを搬送し、微小ビーズを容器に戻すた
    めの手段と組合せて設けた請求項２６記載のバイオリア
    クター。 ２８、請求項１４〜２５の何れかに記載の微小ビーズを
    含有するアフイニテイカラム。
JP1243262A 1988-09-21 1989-09-19 流体媒体から材料の生化学分離法 Pending JPH02152541A (ja)

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