DE3930947A1 - Biochemische abtrennung von material von einem fluiden medium - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren zur Abtrennung eines Materials von einem fluiden bzw. flüssigen Medium, das im folgenden auch fließfähig genannt wird. Die Erfindung erstreckt sich auf ein Trägermedium zur Entfernung des Materials von dem fließfähigen Medium und auf einen Bioreaktor sowie eine Affinitätssäule, die ein solches Trägermedium enthalten.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Erzeugung von verschiedenen Arten von biologischen Materialien, die durch tierische oder pflanzliche Zellen erzeugt werden. Beispiele solcher Materialien sind Viren, Proteine, Cytokine, Hormone, Enzyme, monoklonale Antikörper, virale und bakterielle Vakzine, Pharmazeutika und Zellbestandteile wie Chromosomen und zelluläre Organellen. Zu anderen Beispielen gehören ganze Zellen, z.B. für künstliche Hauttransplantate oder Verpflanzungen von Leber-, Pancreas-, Nieren- oder Milzzellen.

Die Erfindung ist auch wichtig für biologische Materialien, die nach anderen als biologischen Aufarbeitungsweisen erhalten sind, z.B. durch mechanisches Zerquetschen von biologischem Gewebe und für Materialien, wie Alkohole und Ammoniak, die durch ein biologisches Verfahren erzeugt sind und die vom biologischen Produktionsmedium abgetrennt werden müssen. Z.B. erzeugen gewisse Hefen Alkohol, der, wenn er nicht entfernt wird, sich zu Konzentrationen aufbaut, die für die Hefe toxisch sind. Zusätzlich ist die Erfindung wichtig für biochemische Verfahren zur Entgiftung oder Reinigung eines fließfähigen Mediums.

Wegen der Wichtigkeit und dem zunehmendem Bedarf in der Human- und Veterinärmedizin an biologischen Materialien, die durch tierische Zellen erzeugt sind, wird jedoch die Erfindung im nachfolgenden unter besonderer Bezugnahme auf die Herstellung solcher Materialien beschrieben.

Gemäß klassischer Methoden werden biologische Materialien aus tierischen Zellen durch ein Fermentationsverfahren in einem Züchtungsgefäß erzeugt, aus welchem das gewünschte Produkt abgetrennt und gereinigt werden muß. Das gewünschte Produkt ist oft hochgradig verdünnt und nur in geringen Mengenanteilen im Züchtungsmedium vorhanden, das auch viele Verunreinigungen enthält. Wegen der Verdünnung müssen sehr große Mengen des Züchtungsmediums verarbeitet und konzentriert werden bevor die Reinigung erfolgt. Wegen der Verunreinigung ist das Produkt sehr schwierig abzutrennen und bei klassischen Methoden sind viele Abtrennstufen erforderlich. Dies ist sehr zeitraubend und daher teuer. Überdies müssen solche Verfahren ansatzweise durchgeführt werden. Die Zellen werden für eine Zeitspanne in einem Züchtungsgefäß (Bioreaktor) gezüchtet, das ein Nährmedium enthält, und das Züchtungsmedium wird dann verarbeitet um das gewünschte Produkt zu entfernen und zu reinigen. Die Arbeitsweisen für diese Reinigung umfassen oft die Abtrennung der Zellen und die Weiterverarbeitung des zellfreien Züchtungsmediums in mehreren Reinigungsstufen, welche biochemische oder biophysikalische Merkmale des gewünschten Produktes ausnutzen um es nach und nach vom Verunreinigungsmatrial abzutrennen. Eine Trennstufe kann z.B. durchgeführt werden, indem man das Züchtungsmedium durch eine Säule führt, die eine poröse Matrix enthält, die aus einem Bett von Teilchen, wie Perlen von Agarose oder Polyacrylamid besteht, die behandelt wurden um eine Affinität für das gewünschte Produkt zu haben und das Produkt von den Trägerteilchen zu entfernen, z.B. indem man die Trägerteilchen einem Medium aussetzt, das ein anderes pH hat als das des Züchtungsmediums. Als ein Beispiel kann ein Antigen von einem Züchtungsmedium abgetrennt werden, indem man die Trägerteilchen mit einem Antikörper für dieses Antigen beschichtet. Da ein solches mehrstufiges und ansatzweises Aufarbeiten die Lagerung des zu reinigenden biologischen Mediums erfordert, was es der Gefahr des Abbaus aussetzt, und die Anpassung der individuellen Reaktionspartner bei jedem aufeinanderfolgenden Schritt erfordert, ist es von Natur aus wenig wirksam und recht teuer.

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines biochemischen Verfahrens zur Abtrennung eines Materials aus einem fluiden Medium, wobei wenigstens einige dieser Nachteile vermindert sind.

Gemäß der Erfindung wird ein biochemisches Verfahren zur Abtrennung eines Materials aus einem fluiden bzw. flüssigen Medium bereitgestellt, wobei man in das fluide bzw. flüssige Medium eine Mehrzahl von Glasmikroperlen einführt, an deren Oberflächen ein Bindemittel für dieses Material fixiert ist, die Mikroperlen eine ausreichende Verweilzeit im fluiden bzw. flüssigen Medium verbleiben läßt, daß eine Menge dieses Materials an die Mikroperlen gebunden wird, die Mikroperlen mit gebundenem Matrial aus dem fluiden bzw. flüssigen Medium entfernt, wenigestens einen Teil des gebundenen Materials abstreift während man das Bindemittel an die Mikroperlen gebunden läßt und die Mikroperlen mit dem Bindemittel zum fluiden bzw. fließfähigen Medium zurückführt.

Die Erfindung umfaßt Arbeitsweisen, bei welchen das nach dem Abstreifen von den Mikroperlen gesammelte Produkt nicht identisch ist mit dem Material, das vom fließfähigen Medium abgetrennt wird. Z.B. können die Moleküle dieses abgetrennten Materials verändert werden, während sie an die Mikroperlen gebunden sind oder während sie von diesen Mikroperlen abgestreift werden.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein biochemisches Verfahren bereitgestellt, wobei ein Trägermedium, das Glasmikroperlen enthält, die ein Bindemittel enthalten, durch ein fließfähiges Medium im Kreislauf geführt wird, so daß die Entfernung des Materials von diesem Medium in einer einzigen Stufe oder kontinuierlich durchgeführt werden kann und dies ist von Natur aus wirksamer und daher weniger teuer als Arbeitsweisen mit mehrstufiger und ansatzweiser Entfernung, wie sie bisher verwendet wurden. Da Mikroperlen mit Bindemittel zum fließfähigen Medium im Kreislauf zurückgeführt werden, ist das Bindemittel selbst zur Abtrennung des Materials wiederverwendbar. Die Menge des zur Entfernung einer gegebenen Menge von Material erforderlichen Bindemittels ist daher sehr viel kleiner und demgemäß auch die Kosten um dieses Bindemittel bereitzustellen.

Die Erfindung umfaßt auch Glasmikroperlen, die in einem solchen Verfahren verwendet werden können.

Demgemäß liefert die Erfindung Glasmikroperlen, die einen Überzug tragen und sich dadurch auszeichnen, daß dieser Überzug wenigstens ein Bindemittel an die Mikroperlen fixiert enthält, das zur lösbaren Bindung an dem Material innerhalb eines fließfähigen Mediums durch biologische Affinitätsreaktionen befähigt ist, wodurch das an die Mikroperlen gebundene Material vom fließfähigen Medium entfernt und dann von den Mikroperlen abgestreift werden kann, während das Bindemittel an diesen Mikroperlen gebunden bleibt. Indem man gleichzeitig mehr als ein Bindemittel verwendet, gleichgültig ob auf einem gleichen oder einem unterschiedlich behandelten Träger, ist es möglich, die gleichzeitige Entfernung von verschiedenen Materialen vom fließfähigen Medium durchzuführen.

Solche Mikroperlen sind brauchbar bei Verfahren zur Abtrennung von biologischen Materialien und sie sind wirtschaftlich, da sie wiederverwendbar sind. Es ist ersichtlich, daß die Hauptkosten solcher Mikroperlen nicht in den Glaskosten liegen sondern in den Kosten des Bindemittels selbst und in den Kosten des Verfahrens zur Fixierung des Bindemittels an den Mikroperlen. Da sie wiederverwendbar sind, können solche Kosten über eine längere Gebrauchsdauer verteilt werden.

Die Verwendung von Glasmikroperlen ergibt bedeutende Vorteile. Glasmikroperlen können leicht und billig hergestellt werden und es ist recht leicht, eine geeignete Technik anzuwenden um das Bindemittel an der Oberfläche solcher Perlen zu fixieren. Glasmikroperlen sind leicht sterilisierbar und leicht zu handhaben und man kann ihnen Eigenschaften verleihen, welche sie zu ihrer Verwendung als Träger besonders geeignet machen. Im Gegensatz zu anderen Arten von Perlen neigen Glasperlen nicht zum Quellen, wenn sie längerer Zeit einem fließfähigen Medium ausgesetzt sind oder wenn die Ionenkonzentration in diesem Medium schwankt. Somit gewährleisten sie zuverlässigere und beständigere hydrodynamische Eigenschaften während der Abtrennung, gleichgültig, ob dies während der Sammlung des Materials, z.B. aus einem Bioreaktor, oder während des Abstreifens des Materials vom Bindemittel, z.B. in einer Affinitätssäule ist.

Vorteilhafterweise bestehen diese Mikroperlen wenigstens hauptsächlich aus Glasmikrokugeln mit nicht poröser Oberfläche. Dies ist eine besonders erwünschte Eigenschaft, da Perlen mit nicht poröser Oberfläche keine Poren haben, die Verunreinigungen oder anderes unerwünschtes Material adsorbieren und einschließen könnten, z.B. vom fließfähigen Medium oder einem Medium das zum Abstreifen des Materials von ihnen benutzt wird. Tatsächlich enthält das fließfähige Medium, welches das Zellwachstum unterstützt, nicht nur Zellen und das gewünschte Produkt, sondern viele lösliche Verunreinigungen und Zellbruchstücke, wie Stücke von Zellmembranen und Aggregate und Organellen zellulären Urspungs. Solche Verunreinigungen können in Poren adsorbiert oder eingeschlossen werden und die Reinheit des gewünschten Produktes beeinträchtigen und könnten die Zellen vergiften oder andere nachteilige Effekte auf sie haben, wenn poröse Perlen zum fließfähigen Medium im Kreislauf zurückgeführt würden. Es kann außerordentlich schwierig sein, eingeschlossenes Material aus Poren von Glasmikroperlen oder aus Poren von Perlen aus jedem anderen Material zu entfernen. Nichtporöse Perlen jedoch können leicht ohne besondere Behandlung wiederverwendet werden. Sie können einfach vor und nach dem Abstreifen des gereinigten Produktes intensiv gewaschen werden ohne daß dies eine nachteilige Wirkung auf das Bindemittel oder das gewünschte Produkt hätte.

Die Glasmikroperlen haben vorzugsweise eine Dichte, die mit der Dichte des Mediums und mit den beabsichtigten Arbeitsweisen, der Zugabe zu, dem Kontakt mit und der Entfernung von dem Medium in Beziehung steht. Im allgemeinen haben sie vorzugsweise eine durchschnittliche relative Dichte zwischen 0,5 und 1,5. Sie können feste Mikroperlen sein, die eine größere Dichte haben als das fließfähige Medium und können in das Oberteil eines Gefäßes eingeführt werden, welches das fließfähige Medium enthält und von nahe dem Boden desselben entfernt werden. Alternativ und vorzugsweise bestehen sie wenigstens hauptsächlich aus Hohlglasmikrokugeln. Diese können eine beträchtlich geringere Dichte haben als das fließfähige Medium, in welchem Falle es zweckmäßig ist, sie an der Unterseite eines Gefäßes einzuführen und sie zu entfernen, indem man die Oberfläche des fließfähige Mediums abstreift. Solche Perlen niederer Dichte eignen sich besonders zur Verwendung bei einem Medium, das gerührt werden muß. In vielen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung haben diese Mikroperlen eine durchschnittliche relative Dichte zwischen 0,9 und 1,1. Solche Perlen lassen sich leicht in vielen der in Betracht zu ziehenden fließfähigenMedien suspendieren, haben praktische neutrale oder schwach positive Schwimmfähigkeit im Medium und können leicht mit dem Medium durch ein Leitungssystem zirkuliert werden. Dies ist vorteilhaft um eine gutes Vermischen der Perlen in einem solchen Medium zu erzielen und eine geeignete Verweilzeit für eine wirksame Aufnahmezeit des Produktes zu gestatten.

Die Größe der Mikroperlen hat ebenfalls einen Einfluß auf ihre Wirksamkeit als Trägermedium für das Bindemittel. Die Aufarbeitung der Perlen wird erleichtert wenn, wie dies bevorzugt ist, sie einen mittleren Durchmesser unterhalb 125 µm haben, z.B. 75+/-15 µm. D.h. vorzugsweise haben die meisten der Perlen (auf die Zahl bezogen) einen Durchmesser von weniger als 125 µm. Es ist auch erwünscht, daß die Perlen eine ziemlich enge Verteilung ihres Größenbereiches haben. Z.B. ist es bevorzugt, daß ihr oberer Dezildurchmesser (wobei 10%, bezogen auf ihre Zahl, einen größeren Durchmesser haben), nicht mehr als das Zweifache ihres unteren Dezildurchmessers ist (bei welchem 10%, bezogen auf ihre Zahl, einen kleineren Durchmesser haben). Alternativ oder zusätzlich ist es manchmal erwünscht, daß ihr oberer und unterer Dezildurchmesser sich um weniger als 20 µm unterscheiden sollen. Eine solch enge Verteilung des Größenbereiches der Perlen, der leichter mit Glas als mit anderen perlenförmigen Substanzen zu erreichen ist, erleichtert insbesondere das Filtrieren der Perlen und die Elution des Materials daraus. Es ist besonders vorzugt, daß die Mikroperlen einen mittleren Durchmesser (Mediandurchmesser, also Zentralwert) im Bereich von 20 µm bis 30 µm einschließlich haben sollten. Dies verleiht den Perlen eine hohe spezifische Oberfläche, was sich besonders für das Fixieren von Bindemittel daran und für das Binden des abzutrennenden Materials an ein solches Bindemittel eignet.

Vorzugsweise wird das Bindemittel an den Glasoberflächen der Perlen mittels eines Fixiermittels fixiert. Dies erleichtert eine starke Fixierung des Bindemittels an den Perlen, was der Entfernung dieses Bindemittels während der Aufarbeitung der Perlen zur Entfernung des gebundenen Materials widersteht, und vorteilhafterweise ist dieses Bindemittel an die Glasoberflächen der Perlen durch eine kovalente Bindung fixiert.

Das Fixiermittel ist im typischen Fall ein ziemlich langkettiges Molekül, das sich selbst fest an das Glas mit einem Ende der Kette und an das Bindemittel mit den anderen Ende der Kette anheftet. Das Anheften des Bindemittels muß so sein, daß es die Fähigkeit des Bindemittels, sich selbst mit dem vom fluiden Medium abzutrennenden Material zu verbinden, nicht hindert. Es gibt verschiedene Fixiermittel, die für die Verbindung mit Glas und organischem Material als solche bekannt sind und diese können in dieser Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise umfaßt dieses Fixiermittel ein Silan, noch bevorzugter Silane mit 6 bis 18 Kohlenstoffatome im Molekül. Ein weiter Bereich von Silanen ist im Handel erhältlich und ein geeignetes Silan, das sich gut mit Glas und dem besonderen in Betracht gezogenen Bindemittel verbindet, kann ausgewählt werden. Ein besonders geeignetes Silan ist ein Aminosilan oder ein Epoxysilan, z.B. Gamma-Glycidoxypropyltrimethoxysilan. Das Fixiermittel kann in situ gebildet werden, z.B. Aminoacrylsilan zusammen mit Glutaraldehyd. Die Methoxyfunktionen von Gamma-Glycidoxypropyltrimethoxysilan verbinden sich stark mit Glas, während die Epoxyfunktion sich besonders zur Bildung kovalenter Bindungen hauptsächlich mit Aminogruppen von Proteinen eignet, und in diese Klasse fallen die am meisten bevorzugten Bindemittel. Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Silan an einen Zucker gebunden sein, der Teile eines Glycoproteins, Glycolipids oder Polysaccharids, bildet, das als Bindemittel wirkt. Eine solche Reaktion mit Zucker wird normalerweise bewirkt, nachdem der Zucker mit einem oxidierenden Mittel behandelt wurde, das mit dem Zucker unter Bildung aktiver Stellen reagiert, bei welchen die Bindungen auftreten können.

Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird dieses Fixiermittel auf diese Mikrokugeln praktisch als monomolekulare Schicht aufgebracht. Dies begünstigt die Bildung einer starken Bindung zwischen dem Glas und dem Bindemittel. Eine solche Schicht erstreckt sich vorzugsweise über die gesamte Oberfläche der Mikrokugeln um die maximale Menge an Bindemittel zu fixieren. Auf diese Weise verbindet sich ein Molekül des Bindemittels direkt mit einem Molekül des Fixierungsmittels, das seinerseits sich direkt mit dem Glas verbindet. Eine monomolekulare Schicht ist weniger anfällig gegen Schädigung, z.B. durch Abrieb, und dies vermindert in großem Maß das Risiko, daß Fixierungsmittel und fixiertes Bindemittel abgestreift werden und das Material verunreinigen, das man abtrennen will. Außerdem hinterläßt die Wahl dieses Merkmals weniger Stellen auf den beschichteten Perlen, die dazu befähigt sind, anderes Material festzuhalten als das gewünschte Material. Die Wahl dieses Merkmales ist auch wirtschaftlich für Fixiermittel und Bindemittel. Überdies ist die Verwendung einer monomolekularen Schicht von Fixiermittel günstig um zu vermeiden, daß Einheiten von Bindemittel am Träger an mehr als einer Stelle fixiert werden, was die Molekularbewegung von biologischen Makromolekülen berücksichtigt und die maximale Verfügbarkeit von Bindestellen für das vom fließfähigen Medium abzutrennende Material begünstigt.

Die Erfindung eignet sich besonders für die Abtrennung von biologischen Materialien, die durch tierische Zellen erzeugt werden, z.B. Viren, Proteine, Zytokine, Hormone, Enzyme, monuklonale Antikörper, virale und bakterielle Vakzine, Pharmazeutika, deren Zellen und Zellbestandteile, wie Chromosomen und zelluläre Organellen.

Die Erfindung bietet besondere Vorteile bezüglich Einfachheit des Betriebes und Wirtschaftlichkeit, wenn dieses fließfähige Medium ein Züchtungsmedium und das Material ein Produkt dieses Züchtungsmediums ist.

Die Erfindung ist auch besonders brauchbar zur Abtrennung eines Antigens von einem Züchtungsmedium und für diesen Zweck ist es besonders bevorzugt, daß das Bindemittel und das Material als Antigen-Antikörperpaar wirken, wobei der Antikörper das an den Perlen befestigte Bindemittel ist. Die Wahl dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erleichtert die Abtrennung und Reinigung des gewünschten Materials sehr aufgrund der hochgradigen selektiven Affinität zwischen einem solchen Material und einem solchen Bindemittel. Z.B. können Immunglobulin des Typs IgG oder IgM (Pentamer) benutzt werden. Auch andere Bindemittel können benutzt werden, z.B. Protein A oder Protein G, die ebenfalls eine Affinität für mehrere tierische Antigene haben. Alternativ kann zur Abtrennung eines Antikörpers vom fließfähigen Medium sein entsprechendes Antigen oder Hapten oder ein Molekül, das die Antigenstelle darstellt, als Bindemittel benutzt werden, das an die Perlen fixiert ist. Das Antigen kann Teil eines Teilchens sein, wie einer ganzen Zelle oder eines Zellbruchstückes.

Zusätzlich eignet sich die Erfindung bei der Überführung oder Umwandlung von Molekülen eines biologischen oder organischen Materials, das vom fließfähigen Medium abgetrennt werden soll. Eine solche molekulare Transformation (Umwandlung bzw. Überführung) ist von besonderem Interesse, wenn das Material in seiner ursprünglichen Form im fließfähigen Medium umweltschädlich ist, wenn das transformierte Material eine nützlichere Form des ursprünglich im fließfähigen Medium vorliegenden Materials ist oder wenn die Reaktion zwischen dem Material und dem Bindemittel brauchbar als Indikator für das Vorliegen dieses Materials im fließfähigen Medium ist.

Die Mikroperlen können durch das fließfähige Medium auf verschiedene Weise zirkuliert werden. Z.B. kann man schwimmfähige Mikrokugeln im Medium (das vorzugsweise gerührt wird) für eine gewünschte Verweilzeit halten und dann von der Oberfläche abstreifen. Alternativ kann man unter Verwendung eines großen Gefäßes für ein solches Medium diese Mikroperlen unten einführen und von der Oberfläche des Mediums sammeln bzw. abführen.

Bei den Ausführungsformen der Erfindung, in welchen die Mikroperlen durch ein Züchtungsgefäß im Kreislauf geführt werden, erhält man wesentliche Vorteile durch die Verwendung von rotierenden Filterelementen (Spinnfiltern), welche die Mikroperlen auf einen durch die Filterelemente im Züchtungsgefäß begrenzten Raum beschränken und den Durchtritt des Materials in diesen Raum gestatten, während davon Züchtungszellen des Mediums praktisch ausgeschlossen sind.

Mikroperlen, welche dieses Material tragen, werden vorzugsweise einer Affinitätschromatographiesäule zum Abstreifen des Materials von ihnen zugeführt. Dies ist ein einfacher und bequemer Weg, um Ansätze von Mikroperlen, welche Material tragen, zu verarbeiten. Eine Mehrzahl solcher Säulen kann einem einzigen Züchtungsgefäß, je nach Wunsch, zugeordnet werden um eine ausreichende Zeit für das Abstreifen des Materials in jeder gegebenen Säule zu gestatten während eine ausreichende Reserve der Mikroperlen für die Rückführung zum Züchtungsgefäß aufrechterhalten wird. Das Material kann z.B. von den Mikroperlen durch Elution mit einem sauren Medium abgestreift werden. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, daß eine solche Entfernung des Materials in kontinuierlicher Weise durchgeführt werden kann.

Die Verunreinigung des Systems kann vermieden werden, indem man sterile Mikroperlen herstellt unter Verwendung von steriler Einrichtung und sterilen Arbeitsweisen, und die weitere Verunreinigung kann nach Wunsch durch die Verwendung geeigneter antibiotischer Präparate unter Kontrolle gehalten werden. Z.B. kann ein Fluorchinolon verwendet werden.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf einen Bioreaktor, in welchem Glasmikroperlen gemäß der Erfindung verwendet werden.

Demgemäß erstreckt sicht die Erfindung auf einen Bioreaktor, der ein Gefäß aufweist, das ein fließfähiges Medium und Mikroperlen, wie hier definiert, enthält, und worin Mittel vorgesehen sind um diese Mikroperlen kontinuierlich von diesem Medium zu entfernen und kontinuierlich in dieses Medium einzuführen. Insbesondere liefert die Erfindung einen Bioreaktor für die Aufnahme eines fließfähigen Mediums, der sich dadurch auszeichnet, daß dieser Reaktor eine erste Zone aufweist, um das fließfähige Medium mit den Glasmikroperlen in Kontakt zu bringen, die ein Bindemittel für eine Komponente des fließfähigen Mediums enthalten, und eine zweite Zone für die anschließende Abtrennung dieser Komponente von den Mikroperlen.

Es gibt verschiedene Wege wie die zwei Zonen im Reaktor vorgesehen werden können: die Zonen können in getrennten jedoch miteinander verbundenen Gefäßen sein oder sie können in verschiedenen Abteilungen innerhalb eines einziges Gefäßes sein. Eine bequeme Weise, um verschiedene Zonen im gleichen Gefäß vorzusehen ist es, perforierte Bleche oder Siebe, z.B. aus rostfreiem Stahldraht, zwischen ihnen zu verwenden. Ein Siebnetz, zu zylindrischer Form geformt, ist besonders bequem für diesen Zweck. Der Zylinder ist vorzugsweise auch mit Mitteln versehen um ihn zu rotieren, um so den Durchtritt von gewissen Komponenten des fließfähigen Mediums durch das Sieb zu verhindern und somit das Riskio des Verstopfens zu vermindern. Solche rotierenden Siebzylinder werden hier als Spinnfilter bezeichnet. Sie können auch von einer Art sein, die in das fließfähige Medium abgesenkt und in es eingetaucht und wieder herausgenommen werden können, was es gestattet, daß die Perlen die gewünschte Komponente aus dem fließfähigen Medium aufnehmen, mit dem Zylinder aus dem fließfähigen Medium entfernt werden und von der gewünschten Komponente abgetrennt werden während sie sich noch im Zylinder befinden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines Bioreaktors mit Spinnfiltern umfaßt ein Gefäß für ein fließfäiges Medium und innere und äußere Filter, die einen ringförmigen Raum zwischen ihnen im Gefäß umgrenzen, Mittel um dieses Filter in Rotation zu versetzen um suspendiertes Material dieses Mediums aus diesem ringförmigen Raum praktisch auszuschließen während ein lösliches Produkt eines biologischen Verfahrens, das in diesem Medium gelöst ist, in diesen Raum eintreten kann und Mittel um die Glasmikroperlen durch diesen ringförmigen Raum zirkulieren zu lassen.

Die Verwendung einer solchen sehr einfachen Konstruktion von Bioreaktor ergibt einen effizienten und wirtschaftlichen biochemischen Prozeß für die Abtrennung eines Materials aus einem Züchtungsmedium. Die Verwendung von zwei solchen rotierenden Filterelementen (die hier als Doppelspinnfilter bezeichnet werden), ergibt bedeutende Vorteile. Die Mikroperlen können in einem wohldefinierten Bereich des Züchtungsgefäßes gehalten werden, so daß die Kreislaufführung der Perlen durch diesen Raum und ihre gewünschte Verweilzeit darin vereinfacht werden. Dies begünstigt die Wirksamkeit des Abtrennverfahrens. Weil die Züchtungszellen des Mediums von dem Bereich der Mikroperlen ausgeschlossen werden können, kann das Binden des Materials an das Bindemittel ungehindert erfolgen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung eines Doppelspinnfilters besteht darin, daß die maximale Größe der Teilchen, die durch ein gegebenes Filterelement durchtreten, variiert werden kann und zwar von der Größe der Öffnungen im Filterelement nach abwärts, indem man die Umdrehungsgeschwindigkeit des Filters steigert. Demgemäß kann ein einziges Doppelspinnfilter zu unterschiedlichen Zeiten zur Verarbeitung von verschiedenen Materialien verwendet werden, die sonst Doppelspinnfilter zwei unterschiedlicher Maschenweiten erfordern würden. Ein noch weiterer Vorteil besteht darin, daß die Öffnungen bei sich rasch drehenden Spinnfilterelementen sehr viel weniger zur Verstopfung neigen als diejenigen von stationären Filterelementen. Das Verfahren kann z.B. durch Perfusion von einem Eintrittsabteil zu einem Austrittsabteil, die durch solche Spinnfilter getrennt oder davon definiert werden, durchgeführt werden.

Es können Mittel vorgesehen sein, um Flüssigkeit von einem Raum innerhalb des Inneren dieser Filter abzuziehen um diese Flüssigkeit oder dieses fließfähige Medium für den Kontakt mit Mikroperlen außerhalb des Gefäßes zu transportieren und dann diese Flüssigkeit zum Gefäß zurückzuführen. Dies ist eine sehr einfache Weise um Flüssigkeit z.B. für den Transport oder für das Spülen der Mikroperlen zu liefern während man eine wirksame Verwendung des fließfähigen Mediums und eine ausreichende Menge davon im Züchtungsgefäß aufrechterhält.

Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird wenigstens eine Affinitätssäule vorgesehen, der Mittel für den Transport von Mikroperlen zu dieser Säule und für die Rücklieferung der Mikroperlen zum Gefäß zugeordnet sind.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf eine Affinitätssäule, welche beschichtete Mikroperlen, wie hier definiert, enthält. Eine solche Säule hat gute hydrodynamische Eigenschaften in gepacktem Zustand und kann leicht mit Hohlräumen versehen werden, indem man sie mit einem fließfähigen Medium kräftig spült, z.B. einem Züchtungsmedium, was es gestattet, Säule und Mikroperlen in sterilem Kreislauf zu halten.

Verschiedene bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nun beispielsweise unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben. Es bedeuten:

Fig. 1 ist eine schematische perspektivische Ansicht eines Bioreaktors, in welchem ein Teil des Gehäuses weggeschnitten ist um die inneren Einzelheiten zu zeigen;

Fig. 2 ist ein Fließdiagramm mit einer zweiten Ausführungsform eines Bioreaktorsystems;

Fig. 3 ist ein Fließdiagramm mit einer dritten Ausführungsform eines Bioreaktorsystms;

die Fig. 4a und 4b sind Fließdiagramme einer vierten Ausführungsform eines Bioreaktorsystems und

Fig. 5 ist ein Fließdiagramm einer fünften Ausführungsform eines Bioreaktorsystems.

Die Zeichnung eines Bioreaktors in Fig. 1 zeigt ein Züchtungsgefäß 1, das ein Paar von koaxialen zylindrischen Filterelementen 2, 3 mit gemeinsamem Boden enthält, die zusammen ein Doppelspinnfilter bilden. Die Filterelemente 2, 3 sind zweckmäßigerweise aus rostfreiem Stahlnetz mit Maschenöffnungen von 5 µm bis 10 µm. Sie werden durch einen Motor 4 in Drehung versetzt, z.B. mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm. Das System zum Rühren des flüssigen Züchtungsmediums ist nicht gezeigt. Das Rühren des Züchtungsmediums kann unabhängig vom Drehen des verwendeten Doppelspinnfilters sein. Die Leitungen 6 und 7 dienen für das Zirkulieren von Glasmikroperlen, die Bindemittel aufweisen, durch den ringförmigen Raum zwischen den beiden Elementen 2, 3 des Doppelspinnfilters. Die Leitung 9 ist für die Zufuhr von Züchtungsmedium zum Züchtungsgefäß außerhalb des Doppelspinnfilters und die Leitung 10 ist für die Entnahme von Flüssigkeit vom mittleren Raum des Doppelspinnfilters. Mittel (nicht gezeigt) sind auch vorgesehen um den Druck im Züchtungsgefäß 1, das Flüssigkeitsniveau, gelöstes Kohlendioxid und gelösten Sauerstoff, Temperatur und pH im Züchtungsmedium, die Drehgeschwindigkeit des Doppelspinnfilters und die Zirkulation der Mikroperlen zu überwachen und einzustellen.

In einem typischen Beispiel der Verwendung des in Fig. 1 gezeigten Bioreaktors werden hohle Glasmikroperlen mit einer durchschnittlichen relativen Dichte von gerade unterhalb 1,0 gesiebt um einen Ansatz mit Durchmessern zwischen 20 µm und 30 µm zu geben. Die Perlen werden zuerst in Salzsäure gewaschen und gewünschtenfalls auch in einem Detergens. Insbesondere wird zuerst ein Ansatz von 20 g Perlen in Salzsäure für eine Zeitspanne von 1 h bei einer Temperatur zwischen 20°C und 80°C gewaschen. Diese Behandlung hat eine wichtige Wirkung auf das ionische Gleichgewicht des Glases und seine Stabilität bei Einwirkung einer biologisch aktiven Umgebung. Die Säurewaschbehandlung kann Perlen zerstören, wenn sie zu dünn oder nicht voll ausgebildet sind. Die Perlen werden dekantiert um hohl ausgebildete Perlen von den Bruchstücken und den schlecht ausgebildeten Perlen zu trennen, da letztere absinken, und werden dann mit entmineralisiertem Wasser gewaschen bis das pH des Abflusses zwischen 6 und 7 liegt. Dann werden die Perlen zur Gewichtskonstanz bei einer Temperatur von 130°C getrocknet.

Bei einer Abänderung werden die Mikroperlen so gewählt, daß sie eine durchschnittliche relative Dichte von 0,51 und Durchmesser zwischen 53 µm und 90 µm haben.

Dann wird ein Fixiermittel an die Oberflächen der behandelten Mikroperlen angelagert. Das in diesem Beispiel gewählte Fixiermittel ist Gamma-Glycidoxypropyltrimethoxysilan. Bei einer ersten Methode werden 2 ml Silan in 7 ml Toluol für die Behandlung von 15 g Perlen gelöst. Die Perlen werden in die Lösung 18 h bei 110°C eingetaucht, dann entfernt und nacheinander in 200 ml Toluol, 100 ml Methanol und dann in demineralisiertem Wasser gewaschen. Bei einer Abänderung wird als Fixiermittel N-Trimethoxysilylethylendiamin benutzt.

Bei einer zweiten Methode werden 1,2 ml Silan in 60 ml einer wässrigen Lösung von 0,1 ml1 Natriumacetat, gepuffert auf ein pH von 5,5, gelöst und 15 g Mikroperlen werden in dieser Lösung 4 h lange bei 90°C behandelt und dann mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Bei dieser Behandlung werden einige der funktionellen Eopxidgruppen zu Diolen hydrolysiert. Um die Hydrolyse zu vervollständigen werden die Perlen mit einer wässrigen Lösung von Salpetersäure bei pH3 zwei h in einer Menge von 40 ml Lösung pro Gramm Perlen behandelt. Die Perlen werden dann mit destilliertem Wasser gewaschen.

Um die Fähigkeit des Silans, proteinhaltiges Material an die Mikroperlen zu binden, zu begünstigen, werden die Diolgruppen ihrerseits mit Perjodationen umgesetzt um Aldehydgruppen zu bilden. 5 g solcher Perlen werden in 50 ml eisgekühltem Methanol suspendiert und eine Lösung von 380 mg NaBH₄ und 30 mg NaOH in 10 ml Wasser wird in 2 ml-Anteilen zugefügt. Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur kommen und die Suspension wird dann während 15 min auf 40°C erwärmt. Die Perlen werden dann nacheinander mit Wasser, Aceton und Äther gewaschen und dann unter Vakuum bei 70°C 2 h lang getrocknet. Dies überführt die Diolgruppen in primäre Alkoholgruppen. Unter diesen Bedingungen ist die Prüfung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin negativ, was das Fehlen von restlichen funktionellen Carbonylgruppen anzeigt, da die Mikroperlen weiß bleiben.

3 g der so behandelten Mikroperlen werden dann mit 70 mg 1,1′-Carbodiimidazol (ein etwa 100-facher Überschuß) in 25 ml wasserfreiem Dioxan behandelt. Nach 2 h bei Umgebungstemperatur werden die Mikroperlen abgefiltert in Äther gewaschen und in einem Exsiccator unter Vakuum getrocknet. Dies läßt die Glasmikroperlen mit einem Silan beschichtet, das eine funktionelle Imidazoylcarbamatgruppe hat, die sich gut an jedes H₂N-Protein binden kann.

Mikroperlen, welche wie beschrieben Fixiermittel gebunden enthalten, wurden auf ihre Fähigkeit zur Fixierung von Proteinen geprüft, wobei Rinderserumalbumin (BSA) verwendet wurde. 250 mg Perlen wurden bei jeder Prüfung verwendet. Die Perlen wurden durch horizontale Rotation bei 60 Upm in 1,5 ml einer Lösung gerührt, die mit 100 mM Borat und 150 mM NaCl auf pH 9,0 gepuffert war und 5 mg BSA pro ml bei einer Temperatur von 20°C enthielt. Die Perlen, deren Fixiermittel funktionelle Epoxidgruppen enthielt, fixierten im Durchschnitt 80 µg BAS nach 2-stündiger Behandlung.

Die Perlen, deren Fixiermittel funktionelle Imidazoylcarbamatgruppen enthielt, fixierten im Durchschnitt 424 µg BSA nach 2-stündiger Behandlung und durchschnittlich 480 µg BAS nach 4-stündiger Behandlung.

Die Wahl des Bindemittels hängt selbstverständlich vom Produkt ab, das man sammeln und reinigen will. Im folgenden Beispiel wird angenommen, daß das zu sammelnde und zu reinigende Produkt ein monoklonaler Mausantikörper IgG₁ ist, der durch im Bioreaktor wachsende Maushybridome produziert wird.

Als Bindemittel zur Fixierung des Fixiermittels wurde Gesamtkaninchenserum verwendet, das gegen Mausimmunoglobulin IgG₁ immunisiert war (RAM(Kaninchenantimaus)serum). Der IgG₁ wird als Fremdantigen vom Kaninchenserum erkannt und gibt Anlaß zur in vivo-Produktion von Kaninchenimmunoglobulinantikörper der spezifisch gegen dieses Antigen gerichtet ist.

Glasmikroperlen, welche Fixiermittel tragen werden in einer Menge von 250 mg/ml Behandlungslösung behandelt. Die Behandlungslösung war gepuffertes Borat, das 20 mg/ml RAM-Serum enthielt. Die Perlen wurden in der Behandlungslösung 2 h bei 20°C suspendiert während sie horizontal mit einer Rührgeschwindigkeit von 60 Upm gerührt wurden, worauf eine Nachreaktionsinkubation von 16 h bei 7°C erfolgt. Es wurde gefunden, daß die Mikroperlen in kovalenter Weise 660 µg RAM Serum pro g getrocknete Perlen banden, wenn nach einer Folin-Lowrymethode gemessen wurde, die für auf Träger aufgebrachtes Protein modifiziert war.

Nach Fixieren des Bindemittels ist es erwünscht, alle verbliebenen Stellen des nichtbenutzten Fixiermittels zu inaktivieren um die Spezifität der Mikroperlen zum Binden eines gewünschten Materials zu begünstigen. Dies erfolgt durch Waschen der Mikroperlen mit dem fixierten Bindemittel in einer Pufferlösung die 150 mM Glycin-NaOH bei einem pH von 9 enthält um dann die Perlen in einem neutralen Puffer zu waschen.

Ein solches polyklonales Serumbindemittel kann gewünschtenfalls durch einen monoklonalen Antikörper ersetzt werden. Ein solcher monoklonaler Antikörper kann aus einer Züchtung von Hybridomen oder transformierten Lymphozyten erhalten werden, z.B. Rattenhybridomen, die monoklonale Rattenantikörper (IgR) erzeugen um ein einziges antigenes Merkmal eines Mausimmunoglobulins zu erkennen und sie können in der gleichen Weise fixiert werden.

Zu reinigendes Mäuseimmunoglobulin IgG₁ wird durch Maushybridome in einem geeigneten Medium im Züchtungsgefäß gereinigt. Ein geeignetes Züchtungsmedium wird gebildet von Dulbecco modifiziertem Eagle′s Medium, das Serum oder Serumersatz enthält. Das pH wird auf 7,2 eingestellt. Das Züchtungsmedium enthält zusätzlich einen Inhibitor (z.B. Pepstatin A oder Phenylmethylsulfonylfluorid) um die Erzeugung von Enzymen zu verhindern, die sonst die vorhandenen Proteine verdauen würden. Das Züchtungsmedium wird in das Züchtungsgefäß eingeführt, so daß es das Doppelspinnfilter umgibt. Das Filter wird so kontrolliert, daß es den Durchtritt der Züchtungsflüssigkeit und jeglichen gelösten Materials erlaubt, jedoch die Züchtungszellen in dem umgebenden Raum des Züchtungsgefäßes zurückhält.

Unter Verwendung der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung werden die das Bindemittel aufweisenden Perlen in den Raum 8 zwischen die Filterelemente eingeführt, so daß sie in die Züchtungsflüssigkeit, welche gelöstes IgG₁ enthält, eingetaucht sind. Die gebundenes Produkt tragenden Perlen werden kontinuierlich vom Züchtungsmedium durch die Leitung 7 in der Züchtungsflüssigkeit als Träger entfernt und zu einer Chromatographiesäule (nicht gezeigt) geführt, in welcher sie die chromatographische Matrix bilden. Die Züchtungsträgerflüssigkeit kann zum Züchtungsgefäß über die Leitung 9 zurückgeführt werden. Das IgG₁-Produkt wird von den Mikroperlen abgestreift, indem beispielsweise mit einem sauren Medium und bei geringem bis mäßigen Druck eluiert wird, worauf die Mikroperlen, die noch Bindemittel fixiert enthalten, zum Züchtungsgefäß zurückgeführt werden, wobei Züchtungsflüssigkeit, die von der Mitte des Doppelspinnfilters über die Leitung 10 abgezogen wurde, als Trägerflüssigkeit verwendet wird. Das gewünschte IgG₁-Produkt wird sofort abgepuffert um Denaturierung zu vermeiden, und seine Identität wird durch einen enzymverbundenen Immunosorbent-Assay und die Reinheit wird durch Elektrophorese geprüft.

Bei einer Abänderung stellt die Leitung 7 selbst eine Chromatographiesäule dar, durch welche Züchtungsflüssigkeit kontinuierlich zirkuliert wird, so daß das Binden des IgG₁-Produktes kontinuierlich erfolgt. Die Säule wird nach einer geeigneten Verweilzeit entfernt und nach Elution des Produktes wieder eingesetzt. In einer solchen Säule mit einem Perlengehalt von 20 g und einer Kapazität von 2 mg Maus IgG₁ wurde ein Reinigungsfaktor von 750 mal in einer einzigen Stufe erzielt, wobei die Proteinelektrophorese ein reines Produkt zeigte.

Es müssen strikte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten und Verunreinigungen aus dem Züchtungsgefäß auszuschließen und die Züchtungsflüssigkeit und die Mikroperlen, die noch Bindemittel tragen, werden diesem zur Aufrechterhaltung der gewünschten Niveaus im Kreislauf zugeführt. Es kann ein breites Spektrum von Antibiotika, welche Zellen nicht vergiften oder verunreinigen, wie Fluorchinolin, verwendet werden.

Bei einer Abänderung, die ähnliche Ergebnisse liefert, werden Mikroperlen mit Aminosilan und Glutaraldehyd als Fixiermittel behandelt.

Bei einer anderen Abänderung werden die Mikroperlen mit einem Aminosilan als Fixiermittel behandelt. Die Oligosaccharidketten eines Immunoglobulins, wie das IgR in diesem Beispiel genannte, das als Antikörperbindemittel dienen soll, werden oxidiert. Für diesen Zweck wird 1 mg IgR pro Gramm Perlen verwendet. 20 µl einer Lösung (0,5 M) von NaJO₄ werden pro ml einer Lösung zugesetzt, die das IgR in einem Acetatmedium vom pH 5,5 enthält. Die Oxidation läßt man 20 min bei Umgebungstemperatur mit intermittierendem Rühren ablaufen. Das oxidierte IgR wird dann vom Oxidationsmedium durch eine klassische Chromatagraphiearbeitsweise abgetrennt. Oxidiertes IgR in Lösung wird dann zu den silanisierten Mikroperlen in einer Menge von 2 ml Lösung zu 1 g Perlen in einem Reaktionsgefäß zugesetzt, das mit 30 bis 60 Upm rotiert. Nach 24 h werden die Perlen 2 h, immer noch unter Umgebungstemperatur und unter langsamer Rotation, mit einer Lösung von Glycin behandelt um alle verbleibenden freien Stellen auf dem Glas zu desaktivieren. Die Mikroperlen werden dann auf einem Büchnertrichter gewaschen und in Kontakt mit einer Phosphatpufferlösung (2 ml pro g Perlen) gebracht. 20 µl einer reduzierenden Lösung von BaBH₃CN (0,5 M) werden pro ml Pufferlösung zugegeben und man läßt 4 h lang unter langsamer Rotation bei Umgebungstemperatur stehen bevor man wieder auf einem Büchnertrichter wäscht. Die Mikroperlen werden isoliert und kalt in einer Pufferlösung (0,01 M, pH 7,4) von 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure (MOPS) gelagert, die NaCl und NaN₃ enthält, bis sie verwendet werden sollen.

Das in Fig. 2 gezeigte Bioreaktorsystem umfaßt ein Züchtungsgefäß 11, dem mit Binder beschichtete Glasperlen durch die Leitung 13 vom Einfülltrichter 15 zugeführt werden. Das Gefäß 11 enthält auch das biologische flüssige Züchtungsmedium, aus welchem das gewünschte Material abgetrennt werden soll. Ein Rührer 17 ist vorgesehen, um das Mischen der Perlen mit dem flüssigen Medium zu unterstützen. Eine mit einem Ventil versehene Auslaßleitung 19 verbindet das Gefäß 11 mit einer Chromatographiesäule 21. Eine Zufuhrleitung 23, die von fünf verschiedenen Zufuhrleitungen 25, 26, 27, 28 und 29 für die Flüssigkeit gespeist wird, die jeweils mit einem Kontrollventil ausgestattet sind, führt zum Boden der Säule 21. Die nacheinander durch die Leitungen 25, 26, 27, 28 und 29 zuzufüllenden Flüssigkeiten sind jeweils Säulenwaschflüssigkeit (MOPS Pufferlösung), Reinigungsflüssigkeit für die erste Säule (Lösung mit hoher Ionenstärke), Reinigungsflüssigkeit für die zweite Säule (Ammoniumacetatlösung), Elutionsflüssigkeit für das Material (Glycin-HCl-Pufferlösung) und als Flüssigkeit zum Spülen der Perlen N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N′-3-propansulfonsäure (HEPPS) Pufferlösung, die NaOH enthält. Ein Leitungsverteiler 31 führt zu der Seite der Säule 21 von einem Flüssigkeitsreservoir 32 und dient dazu, Flüssigkeit bei unterschiedlichen Niveaus in die Säule einzuführen und unterstützt die Abtrennung von Perlen von einer Säule für ihre Rückführung zum Gefäß 11. Der Hauptauslaß aus der Säule 21 ist eine Leitung 33, die zu einem Ventil 35 führt, das Flüssigkeit von der Säule 21 über eine Leitung 41 durch ein Spektralphotometer 43 je nach Wahl zu einer mit einem Ventil versehenen Abfalleitung 45 oder einer mit Ventil versehenen Produktleitung 47 leiten kann. Das Ventil 35 kann alternativ Flüssigkeit und/oder Perlen über eine Leitung 37, die mit einer Pumpe 39 zurück zum Gefäß ausgestatet ist, führen.

Das System nach Fig. 2 erfordert, daß die Perlen verhältnismäßig geringe Dichte haben, z.B. 0,5 bis 0,9, so daß sie durch das Gefäß 11 und die Säule 21 nach oben schwimmen können.

Im Betrieb des Bioreaktorsystems nach Fig. 2 werden die mit Binder beschichteten Perlen in das Gefäß 11 durch die Leitung 13 eingeführt, wo sie gründlich mit der biologischen Flüssigkeit unter der Einwirkung des Rührers 17 gemischt werden. Bei einer ausreichenden Verweilzeit wird das Rühren eingestellt, das Ventil 19 geöffnet und die Perlen, die nun das vom Medium im Gefäß 11 abgetrennte Material tragen, schwimmen nach oben durch die Säule 21. Nach Waschen und Reinigen der Perlen durch die Leitungen 25, 26 und 27 wird das gewünschte Produkt von den Perlen durch eine Elutionsflüssigkeit aus der Leitung 28 abgetrennt. Das Eluat wird der Leitung 33 und dem Ventil 35 zugeführt, wo das Spektralphotometer 43 das Vorliegen von Proteinen im Eluat überwacht und das Ventil 47 öffnet um das Produkt zu sammeln, wobei die Wasch- und Reinigungslösungen bis zu diesem Punkt durch das Ventil 45 dem Abfall zugeführt wurden. Wenn alles erforderliche Produkt entfernt ist werden die Perlen in der Säule 21 einer Spülung und einem Waschzyklus (über die Leitungen 29 und 25) unterzogen. Die Matrix wird entfernt, indem man Züchtungsmedium vom Vorratsbehälter 32 unter mäßigem Druck einführt und die Perlen werden dann durch das Ventil 19 zum Gefäß 11 zurückgeführt und sind fertig um neues biologisches Matrial, das abgetrennt werden soll, zu binden, welch letzteres kontinuierlich im Bioreaktor erzeugt wird.

Das in Fig. 3 gezeigte Bioreaktorsystem hat viele Merkmale, die ähnlich denjenigen des Systems nach Fig. 2 sind und diese sind durch gleiche Bezugszeichen dargestellt. Im System nach Fig. 3 umfaßt jedoch das Gefäß 11 ein Doppelspinnfilter, das durch die Filterelemente 2 und 3 gebildet ist, die ähnlich denen von Fig. 1 sind. Zur sterilen Einführung von Mikroperlen in das Reinigungssystem führt die Perlenzufuhrleitung 13 in Fig. 3 durch ein Schaltventil 53 zum Bioreaktor. Die Leitung 51 führt von dem ringförmigen Raum 8 zum Ventil 53, so daß sie Perlen transportiert, die abgetrenntes Material vom Gefäß 11 zur Säule 21 tragen während die perlenfreie Flüssigkeit zum Reaktor über das Ventil 35 und die Pumpe 39 zurückgeführt wird. Eine Leitung 10, die mit einer Pumpe 16 ausgestattet ist, führt von der inneren Kammer, die vom Filterelement 2 des Spinnfilters 2, 3 gebildet wird, zu einer mit einem Ventil versehenen Leitung 20, die zum Verteiler 31 führt.

Im Betrieb des Bioreaktorsystems nach Fig. 3 gehen die mit Binder beschichteten Perlen, die das abgetrennte Material tragen, durch die Leitung 51 und das Ventil 53 zur Säule 21. In diesem System müssen die Perlen eine Dichte von etwa 1,0 haben. Das gewünschte Produktmaterial wird von den Perlen durch eine Elutionsflüssigkeit aus der Leitung 28 abgetrennt. Der Wasch/Reinigungs/Elutions/Spülverteiler 25, 26, 27, 28, 29 und ihr Betrieb sind im allgemeinen gleich zu dem von Fig. 2. Das Eluat wird entsprechend der Leitung 33 zugeführt wo das Spektralphotometer 43 das Vorliegen von Protein überwacht und erforderlichenfalls das Ventil 47 öffnet. Nach Waschen und Spülen wird die Matrix abgebaut, indem Züchtungsmedium injiziert wird, das von innerhalb des inneren Spinnfilters unter der Einwirkung der Pumpe 16 und des Ventils 20 entnommen wird. Die Perlen werden von der Säule 21 zum ringförmigen Raum 8 über das Ventil 53 und der Leitung 51 zurückgeführt.

Das in den Fig. 4a und 4b gezeigte Bioreaktorsystem unterscheidet sich von den anderen gezeigten Systemen dadurch, daß es ein einfaches Spinnfilter 61 und keine Chromatographiesäule hat. In diesem System ist das Spinnfilter in der Höhe zwischen einer oberen Lage (in Fig. 4a gezeigt) und einer unteren Lage (in Fig. 4b gezeigt) einstellbar. Eine ringförmige Ablenkscheibe 63 begrenzt die obere Grenze der Bewegung des Spinnfilters 61. Ein Flansch 67 auf dem Boden bzw. unteren Ende des Spinnfilters 61 trägt eine ringförmige Dichtung 65, die mit der Platte 63 an der oberen Grenze des Laufweges des Spinnfilters 61 in dichtenden Eingriff kommt. Die Leitung 23 von der Wasch/Reinigungs/Elutions/Spül-Verteilung 25, 26, 27, 28, 29 führt über ein Schaltventil 54 zu einer gegabelten Zufuhrleitung 23 a/23 b und dann zum Inneren des Spinnfilters 61. Die Leitungen 56 führen auch zum Ventil 54 aus dem ringförmigen Raum 62, der, wenn das Spinnfilter 61 sich in seiner oberen Lage befindet, zwischen dem Spinnfilter 61 und den Wänden des Gefäßes 11 gebildet wird. Eine Produktextraktionsleitung 42 führt vom ringförmigen Raum 62 zur Produktabtrenneinheit 43, 45, 47.

Im Betrieb des Reaktorsystems nach Fig. 4a/4b wird das Spinnfilter 61, das die mit Binder beschichteten Perlen mit einer relativen Dichte von etwa 1 enthält, in die Flüssigkeit 14 (Fig. 4b) abgesenkt und bleibt darin für eine ausreichende Zeitspanne um das Binden des gewünschten Produktmaterials an die beschichteten Perlen zu bewirken. Das Spinnfilter 61 wird dann zur oberen Lage angehoben (Fig. 4a) und das Produktmaterial wird von den Perlen nach einem Wasch/Reinigungs/Elutions/Spül-Zyklus entsprechend dem von Fig. 2 abgetrennt.

Das in Fig. 5 gezeigte Bioreaktorsystem umfaßt zwei Gefäße 11 und 71, die jeweils Spinnfilter haben (72 a bzw. 72 b). Bei dieser Ausführungsform wird das Züchtungsmedium 14 bei 72 a im Gefäß 11 filtriert und dann über die Leitung 73 zum Membranfilter 74 überführt um Zellbruchstücke zurückzuhalten, die durch das Spinnfilter 72 a gegangen sein können und dann über Leitung 75 zum Gefäß 71, in welchem die mit Binder beschichteten Perlen das gewünschte Produktmatrial entfernen. Die Perlen, die eine relative Dichtigkeit von etwa 1 haben, bleiben dauernd im Gefäß 71. Die Leitungen 76 und 77 gestatten die Rückführung der restlichen Flüssigkeit zum Gefäß 11, wobei die Leitung 76 durch eine Kontrollvorrichtung 78 aktiviert wird, welche den Flüssigkeitsspiegel im Gefäß 71 überwacht und eine Pumpe 79 betätigt, wenn das Niveau im Gefäß 71 über eine gegebene Grenze steigt. Nach einer ausreichenden Zeitspanne wird die Rückführung der Flüssigkeit abgestellt und die Wasch/Reinigungs/Elutions/Spül-Flüssigkeiten werden dem Gefäß 71 durch eine Zufuhrleitung 23 c zugeführt und abgetrenntes Produkt wird durch die Leitung 41 in entsprechender Weise zu den anderen Ausführungsformen abgezogen.

Claims (28)

1. Biochemisches Verfahren zur Abtrennung eines Materials aus einem fluiden bzw. flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man in das fluide bzw. flüssige Medium eine Mehrzahl von Glasmikroperlen einführt, an deren Oberflächen ein Bindemittel für dieses Material fixiert ist, die Mikroperlen eine ausreichende Verweilzeit im fluiden bzw. flüssigen Medium verbleiben läßt, daß eine Menge dieses Materials an die Mikroperlen gebunden wird, die Mikroperlen mit gebundenem Matrial aus dem fluiden bzw. flüssigen Medium entfernt, wenigestens einen Teil des gebundenen Materials abstreift während man das Bindemittel an die Mikroperlen gebunden läßt und die Mikroperlen mit dem Bindemittel zum fluiden bzw. fließfähigen Medium zurückführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroperlen wenigstens hauptsächlich aus Glasmikrokugeln mit nichtporösen Oberflächen bestehen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroperlen wenigstens hauptsächlich aus hohlen Glasmikrokugeln bestehen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroperlen eine durchschnittliche relative Dichte zwischen 0,5 und 1,5 und vorzugsweise zwischen 0,9 und 1,1 haben.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroperlen einen Mediandurchmesser unter 125 µm und vorzugsweise zwischen 20 µm und 30 µm haben.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel an den Glasoberflächen der Perlen mittels eines Fixiermittels fixiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel an den Glasoberflächen der Perlen durch eine kovalente Bindung fixiert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixiermittel ein Silan umfaßt oder ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixiermittel auf die Mikroperlen als praktisch monomolekulare Schicht aufgebracht wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das fluide bzw. fließfähige Medium ein Zellzüchtungsmedium und das Material ein Produkt dieses Züchtungsmediums ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel und das Material als Antigen-Antikörperpaar wirken.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokugeln durch einen ringförmigen Raum innerhalb eines Züchtungsgefäßes im Kreislauf geführt werden, welcher Raum durch zwei rotierende Filterelemente gebildet ist, welche die Mikroperlen innerhalb des Züchtungsgefäßes auf diesen ringförmigen Raum beschränken, jedoch den Durchtritt des Materials in diesen ringförmigen Raum gestatten, während davon Züchtungszellen des Mediums praktisch ausgeschlossen bleiben.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die das Material tragenden Mikroperlen einer Chromatographiesäule zum Abstreifen des Materials davon zugeführt werden.

14. Glasmikroperlen mit einem Überzug, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Überzug wenigstens ein Bindemittel umfaßt, das an die Mikroperlen fixiert ist und dieses Bindemittel zur lösbaren Bindung eines Matrials in einem flüssigen bzw. fießfähigen Medium durch biologische Affinitätsreaktion befähig ist, wodurch das Material von dem fluiden bzw. fließfähigen Medium in an die Mikroperlen gebundener Form entfernt und dann von den Mikroperlen abgestreift werden kann während das Bindemittel an diese Mikroperlen gebunden zurückbleibt.

15. Mikroperlen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens hauptsächlich aus Glasmikrokugeln mit nichtporösen Oberflächen bestehen.

16. Mikroperlen nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens hauptsächlich aus hohlen Glasmikroperlen bestehen.

17. Mikroperlen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine durchschnittliche relative Dichte zwischen 0,5 und 1,5 haben.

18. Mikroperlen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine durchschnittliche relative Dichte zwischen 0,9 und 1,1 haben.

19. Mikroperlen nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Mediandurchmesser unterhalb von 125 µm haben.

20. Mikroperlen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 90% davon einen Durchmesser zwischen 20 µm und 30 µm haben.

21. Mikroperlen nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel an die Glasoberflächen der Perlen mittels eines Fixiermittels fixiert ist.

22. Mikroperlen nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel an die Glasoberflächen der Perlen durch eine kovalente Bindung fixiert ist.

23. Mikroperlen nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixiermittel ein Silan umfaßt oder ist.

24. Mikroperlen nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixiermittel auf die Mikroperlen als eine praktisch monomolekulare Schicht aufgebracht ist.

25. Mikroperlen nach einem der Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel ein Antigen/Antikörper ist.

26. Bioreaktor mit einem Gefäß, das ein fluides bzw. flüssiges Medium und Mikroperlen nach einem der Ansprüche 14 bis 25 enthält, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um diese Mikroperlen kontinuierlich von diesem Medium zu entfernen und kontinuierlich in dieses Medium einzuführen.

27. Bioreaktor nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Affinitätssäule vorgesehen ist, der Mittel zum Transport der Mikroperlen zu dieser Säule und zur Rückführung der Mikroperlen zum Gefäß zugeordnet sind.

28. Affinitätssäule, enthaltend Mikroperlen nach einem der Ansprüche 14 bis 25.