DE3627063A1 - Verfahren zur abtrennung und reinigung von biopolymeren durch affinitaetschromatographie - Google Patents

Verfahren zur abtrennung und reinigung von biopolymeren durch affinitaetschromatographie

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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Biopolymeren durch Affinitätschromatographie mit Hilfe von porösem Silica­ gel und daran oberflächlich kovalent gebundenen Affini­ tätsliganden.
Für die Affinitätschromatographie werden in erster Li­ nie poröse Träger wie Dextrane, Agarosen, Acrylamid etc. eingesetzt, die Porengrößenverteilungen zwischen 200 und 1000 Å aufweisen. An diese Materialien sind beispielsweise kovalent Antikörper gebunden. Mit derar­ tigen Materialien ist es möglich, Proteine wie Insulin, Interferone etc. im industriellen Maßstab zu reinigen.
In der US-PS 44 15 665 ist eine spezielle Methode zur kovalenten Bindung von biologisch aktiven organischen Substanzen an polymere Träger beschrieben, zu denen unter anderem Agarose, Cellulose und Silicagel zählen. Verwendet wurde in den Beispielen 4 und 5 ein poröses Silicagel unbestimmter Porengröße und unbestimmter Korn­ größe. Kovalent gebunden wurde N6-(6-Aminohexyl)-Adeno­ sin-5′-Monophosphat. Dieses Material ist jedoch nicht für die Affinitätschromatographie geeignet.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, das Ver­ fahren zur Abtrennung und Reinigung von Biopolymeren durch Affinitätschromatographie mit Hilfe von porösem Silicagel und daran oberflächlich kovalent gebundenen Affinitätsliganden zu verbessern, so daß hiermit eine rasche, zuverlässige und hochspezifische Abtrennung und Reinigung von Biopolymeren möglich ist.
Dabei soll einerseits der meistens sehr teure Affini­ tätsligand, wie zum Beispiel Antikörper, optimal ausge­ nutzt werden, zum anderen auch die Menge des Trägerma­ terials so klein wie möglich gehalten werden, um unnö­ tige Verluste und Verdünnungen zu vermeiden. Intensive Untersuchungen verschiedener poröser Träger, verschie­ dener Affinitätsliganden und verschiedener durch die Affinitätschromatographie zu reinigender Biopolymere haben zu dem überraschenden Ergebnis geführt, daß die oben genannte Aufgabe optimal dadurch gelöst werden kann, daß Silicagele verwendet werden mit definierten engen Porengrößenbereichen, welche jeweils das fünf- bis zwanzigfache der Größe des zu reinigenden Materials aufweisen.
Werden Silicagele verwendet mit undefinierten und brei­ ten Porengrößenbereichen, kann keines der oben genann­ ten Ziele optimal gelöst werden. Werden Silicagele mit definierten engen Porengrößenbereichen eingesetzt, wel­ che zwar größer sind als das zu reinigende Material, jedoch kleiner als das fünffache der Größe des zu rei­ nigenden Materials, werden die teuren und wertvollen Affinitätsliganden nur unvollständig ausgenutzt. Außer­ dem wächst bei kleineren Porengrößenbereichen bereits die Menge an ausgebluteten Affinitätsliganden bzw. ver­ unreinigenden Fragmenten derselben. Werden Silicagele eingesetzt mit Porengrößenbereichen, die größer sind als das zwanzigfache der Größe des zu reinigenden Mate­ rials, so sinkt die Oberfläche des Materials in so er­ heblichem Maße, daß unnötig große Mengen Silicagel ein­ gesetzt werden müssen und ein unnötig großes Volumen von Elutionsflüssigkeit eingesetzt werden muß, um die ursprünglich gebundenen Biopolymeren wieder aus dem Material auszuwaschen.
Dies ist insbesondere bei therapeutisch einzusetzenden Biopolymeren außerordentlich unerwünscht.
Innerhalb des erfindungsgemäßen Bereiches vom fünf- bis zwanzigfachen der Größe des zu reinigenden Materials ist der untere Bereich bevorzugt für praktisch kugel­ förmige Biopolymere und der obere Bereich für langge­ streckte und sperrige Biopolymere.
Weiterhin ist der untere Porengrößenbereich bevorzugt, wenn relativ kleine Affinitätsliganden mit relativ kur­ zen Spacern an die Oberfläche des Silicagels gebunden sind, während der obere Porengrößenbereich bevorzugt ist, wenn größere und sperrige Affinitätsliganden und/ oder längerkettige Spacer zur Bindung der Affinitätsli­ ganden an die Oberfläche des Silicagels zum Einsatz kommen.
Als oberflächlich kovalent gebundene Affinitätsliganden kommen in erster Linie Antikörper in Frage, jedoch auch andere mehr oder weniger große Substanzen mit spezifi­ scher Affinität zu dem zu reinigenden Biopolymeren. Ein typisches Beispiel hierfür ist das Protein A aus Sta­ phylococcus aureus oder rekombinantes Protein A, wel­ ches eine spezifische Affinität zu Immunglobulinen (IgG) aufweist.
Besonders bedeutungsvoll ist das erfindungsgemäße Ver­ fahren für die Abtrennung und Reinigung von Proteinen, Glykoproteinen und/oder Nukleinsäuren, von Viren oder Vaccinen, von Zellorganellen, prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, Micellen oder Vesikeln, von Chylomikronen, VLDL- (very low density), LDL- (low den­ sity) und HDL- (high density) Lipoproteinen sowie Pro­ teinkomplexen.
Es handelt sich somit insbesondere um Biopolymere mit Größen von mindestens 50 bis 100 Å bis hinaus zu Biopo­ lymeren mit Größen von 5000 und mehr Å. Erfindungsge­ mäß werden somit poröse Silicagele eingesetzt mit de­ finierten engen Porengrößenbereichen von mindestens 300 Å, vorzugsweise jedoch zwischen 500 und 10 000 Å. Prin­ zipiell könnten auch Silicagele mit noch größeren Po­ rengrößen eingesetzt werden, jedoch ist es bisher tech­ nisch schwierig, Silicagele mit engen Porengrößenberei­ chen dieser Größenordnung herzustellen.
Einige typische Anwendungsgebiete für das erfindungsge­ mäße Verfahren sind im folgenden zusammengestellt:
Viren und Vaccine zur Impfstoffherstellung
  • - Lebend-Vaccine (Pockenviren, ⌀ca. 2500 Å)
  • - attenuierte Virusstämme (Maul- und Klauenseuche-Vi­ ren, ⌀ca. 2500 Å)
  • - recombinante Vaccine hergestellt durch gentechnolo­ gische Expressionsverfahren aus höheren Zellkulturen oder Bakterien (z. B. Hepatis B-Virus Hüllproteinkom­ plexe, ⌀ca. 500 Å)
  • - Vaccine auf der Basis von Vesikeln und Micellen (⌀ca. 100-500 Å).
Organellen
  • - Mitochondrien (⌀ca. 5000 Å)
  • - Microbodies
Pro- und eukaryotische Zellen
  • - z. B. Entfernung von Mykoplasmen (⌀ca. 1000Å) und Tumorzellen (⌀ca. 100 000 Å) aus Medien oder Blut
Proteine
  • - kleine Proteine: Lymphokine wie z. B. Interferon und TNF (MW 10 000-20 000)
  • - mittlere Proteine: gewebsspezifische Plasminogenakti­ vatoren (MW ca. 65 000) IgG (MW 150 000, ⌀ca. 150 Å) Urokinase (⌀ca. 90 Å)
  • - große Proteine: IgM (MW ca. 900 000 Å, ⌀ca. 900 Å) Blutfaktoren wie z. B. Faktor VIII (MW<1 Mio., ⌀<500Å)
Proteinkomplexe
  • - Entfernung von Immunkomplexen wie Rheumafaktoren (MW 500 000, ⌀ca.<500 Å) durch Blutwäsche
  • - Enzymkomplexe wie Fettsäuresynthethase (MW ca. 2,3 Mio.)
  • - filamentöse Komplexe wie Microtubulin, Actinkomplexe
  • - Ribosomen
Micellen und Vesikel
  • - Chylomikronen (⌀ca. 1000-10 000 Å)
  • - VLDL (very low density lipoproteins), ⌀ca. 300- 500 Å
  • - LDL (⌀ca. 200-250 Å)
  • - HDL (⌀<100 Å)
Die kovalente Bindung der Affinitätsliganden an die Oberfläche der Poren des Silicagels erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Umsetzung eines Silans, welches durch anschließende Reaktionen am orga­ nischen Rest aktiviert werden kann zur Umsetzung mit den Affinitätsliganden.
Eine besonders schonende und deshalb bevorzugte Aktivie­ rung besteht im Aufbau von Alkyl- bzw. Arylsulfonsäure­ estern. Da diese in besonders schonender Weise mit Ami­ nogruppen, Hydroxylgruppen und Sulfhydrylgruppen der Affinitätsliganden reagieren und diese dadurch schonend kovalent an das Silicagel binden. Prinzipiell sind aber auch alle anderen bekannten Kupplungsreagenzien geeig­ net, sofern diese nicht zu einer elektrischen Aufladung des Affinitätsliganden oder einer sonstigen, die Affini­ tät beeinflussenden Denaturierung führen. Prinzipiell können sowohl kürzere als auch längere Spacer zwischen Silicagel und den Affinitätsliganden eingebaut werden. Besonders bevorzugt sind jedoch solche mit nur 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Kürzere Spacer können zu einer unnö­ tigen sterischen Behinderung der Reaktion zwischen Af­ finitätsliganden und zu reinigenden Biopolymeren füh­ ren. Längere Spacer führen zu einer unnötigen Vergeu­ dung des innerhalb der Poren zur Verfügung stehenden freien Raumes, ohne den Wirkungsgrad der Affinitätsli­ ganden zu erhöhen.
In den nachfolgenden Bezugsbeispielen ist die Herstel­ lung von einigen Silicageln beschrieben, die ober­ flächlich so aktiviert sind, daß sie verschiedene Af­ finitätsliganden schonend kovalent binden können. In den anschließenden Beispielen ist beschrieben, wie spe­ zielle Affinitätsliganden oberflächlich kovalent gebun­ den werden und die so entstandenen porösen Silicagele zur effizienten Affinitätschromatographie der entspre­ chenden Biopolymeren eingesetzt werden können.
Bezugsbeispiel 1
Synthese von Diol-Silicagel
50 g poröses Silicagel mit einer Porengröße von 1000 Å und einer Partikelgröße von ca. 60 µm werden in einem 500 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 12 Stunden bei einer Temperatur von 150°C getrocknet und aktiviert. Nach dem Abkühlen wird belüftet und mit 50 ml destilliertem γ-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan in 200 ml absolutem Toluol und 1 ml absolutem Tributylamin versetzt. Die Umsetzung erfolgt 12 Stunden bei 111°C, der Rückflußtemperatur von Toluol. Nach der Reaktion wird das Produkt Epoxy-Silicagel abgesaugt und zweimal mit 250 ml Toluol, dreimal mit 250 ml Aceton und zwei­ mal mit 0,005 M HCl gewaschen und abgesaugt. Das Epoxy- Silicagel wird in 250 ml 0,005 M HCl suspendiert und in 2 Stunden bei 90°C die Epoxy-Gruppe zur Diol-Gruppe gespalten.
Das Produkt Diol-Silicagel wird abgesaugt, fünfmal mit H2O und zweimal mit Aceton gewaschen und bei 50°C ge­ trocknet.
Bezugsbeispiel 2
Aktivierung von Diol-Silicagel mit Tosylchlorid
50 g trockenes Diol-Silicagel mit 1000 Å Porengröße, synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig­ keit zu entfernen. Nach der Trocknung wird belüftet und mit 250 ml absolutem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin versetzt, die Suspension im Vakuum entgast und an einen Rührer angeschlossen. Zu dieser Suspension werden 10 mmol Tosylchlorid, gelöst in 50 ml absolutem Aceton, unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach der Reaktion bei Raumtemperatur 20 bis 24°C für 30 Minuten wird das Tosyl-aktivierte Silicagel abgesaugt und mit Aceton, Aceton:2 mM HCl der Zusammensetzungen 75 : 25, 50 : 50, 25 : 75 gewaschen und abschließend mit 1 mM HCl gewaschen, abgesaugt und gefriergetrocknet.
Bezugsbeispiel 3
Aktivierung von Diol-Silicagel mit Trichlormethansul­ fonsäurechlorid
50 g trockenes Diol-Silicagel mit 2500 Å Porengröße, synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig­ keit zu entfernen. Nach der Trocknung wird belüftet und mit 250 ml absolutem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin versetzt und an einen Rührer angeschlossen. Die Suspen­ sion wird unter Vakuum entgast und mit einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Zu dieser Suspension werden 10 mmol Tri­ chlormethansulfonsäurechlorid, gelöst in 50 ml absolu­ tem Aceton, unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach der Reaktion bei 0°C für 30 Minuten wird das Tri­ chlormethansulfonsäurechlorid-aktivierte Silicagel ab­ gesaugt und mit Aceton, Aceton:2 mH HCl der Zusammen­ setzungen 75 : 25, 50 : 50, 25 : 75 gewaschen und abschlie­ ßend mit 1 mM HCl gewaschen und gefriergetrocknet.
Bezugsbeispiel 4
Aktivierung von Dio-Silicagel mit 2,4,6-Trinitroben­ zolsulfonsäurechlorid
50 g trockenes Diol-Silicagel mi5 5000 Å Porengröße, synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig­ keit zu entfernen.
Nach der Trocknung wird belüftet und mit 250 ml absolu­ tem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin versetzt und an einen Rührer angeschlossen. Die Suspension wird unter Vakuum entgast und mit einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Zu dieser Suspension werden 10 mmol 2,4,6-Trinitrobenzol­ sulfonsäurechlorid, gelöst in 50 ml absolutem Aceton, unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach der Reaktion bei 0°C für 30 Minuten wird das 2,4,6-Trini­ trobenzolsulfonsäurechlorid-aktivierte Silicagel abge­ saugt und mit Aceton, Aceton:2 mM HCl der Zusammenset­ zungen 75 : 25, 50 : 50, 25 : 75 gewaschen und abschließend mit 1 mM HCl gewaschen und gefriergetrocknet.
Bezugsbeispiel 5
Aktivierung von Diol-Silicagel mit 2,2,2-Trifluorethan­ sulfonsäurechlorid (Tresylchlorid)
50 g trockenes Diol-Silicagel mit 10 000 Å Porengröße, synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig­ keit zu entfernen. Nach der Trocknung wird belüftet und mit 250 ml absolutem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin versetzt und an einen Rührer angeschlossen. Die Suspen­ sion wird unter Vakuum entgast und mit einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Zu dieser Suspension werden 10 mmol Tresyl­ chlorid unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach der Reaktion bei 0°C für 30 Minuten wird das Tresylchlo­ rid-aktivierte Silicagel abgesaugt und mit Aceton, Ace­ ton:2 mM HCl der Zusammensetzungen 75 : 25, 50 : 50, 25 : 75 gewaschen und abschließend mit 1 mM HCl gewaschen und gefriergetrocknet.
Beispiel 1
Reinigung von Human-Immunglobulinen (IgG) mit Protein A- Affinitätschromatographie
A: 10 g Sulfonylchlorid aktiviertes Silicagel mit ei­ ner Porengröße von 1000 Å werden in 50 ml 0,1 M Na- Phosphatpuffer, pH 8.0, suspendiert und im Vakuum ent­ gast. Zu dieser Suspension werden 300 mg Protein A (aus Staphyloccus aureus oder recombinantes Protein A) gelöst in 15 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 8.0, zuge­ geben. Die Suspension wird 6 Stunden bei 4°C geschüt­ telt, um eine hohe Immobilisierung von Protein A zu gewährleisten. Nach der Reaktion wird das Produkt Pro­ tein A-Silicagel abfiltriert, in 100 ml 0,1 M Mercapto­ ethanol, 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 8.0, suspendiert und 2 Stunden geschüttelt, um nicht abreagierte Sulfo­ nylgruppen zu blockieren. Nach der Blockierungsreaktion wird das Produkt fünfmal mit 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, gewaschen.
B: 10 g Protein A-Silicagel-1000 Å (1000 Å) werden in eine 1,27 cm × 15 cm Chromatographiesäule mit Einlaß- und Auslaßadapter gepackt und zweimal mit 3 Säulenvolu­ mina 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, und 2 Säulenvolu­ mina 0,05 M Na-Citratpuffer, pH 3.0, gewaschen und 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, äquilibriert. Die IgG-Pro­ be, bestehend aus 1000 mg rohem Human-IgG, wurde in 100 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, gelöst und mit einer Flußgeschwindigkeit von 10 ml/min auf die Säule adsorbiert. Verunreinigungen mit anderen Proteinen und unspezifisch gebundenes IgG werden mit 2 Säulenvolumina 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, ausgewaschen und das spezifisch gebundene Human-IgG mit 0,05 M Citratpuffer, pH 3,0, und einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min elu­ iert.
Die Bindekapazität von Protein A-Silicagel (Porengröße 1000 Å+ wurde zu 25 mg IgG/ml Säulenvolumen bestimmt.
Beispiel 2
Reinigung von Human-Immunglobulinen (IgG) mit Anti-Hu­ man-IgG Antikörpern durch Affinitätschromatographie
A: 200 mg Anti-Human-IgG Antikörper werden analog Bei­ spiel 1A an 10 g Sulfonyl aktiviertes Silicagel mit einer Porengröße von 2500 Å immobilisiert.
B: Entsprechend Beispiel 1 B wird das Anti-Human-IgG Silicagel-2500 in eine Chromatograhiesäule gepackt und äquilibriert. Nach der Bindung von rohem Human-IgG wer­ den die unspezifisch gebundenen Proteine mit 0,1 M Na- Phosphatpuffer, pH 7.0, ausgewaschen und das spezifisch gebundene Human-IgG mit 0,05 M Citratpuffer, pH 3.0, und einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Bindekapazität von Anti-Human-IgG Silicagel (Porengröße 2500 Å) wurde zu 10 mg Human IgG/ml Säulenvolumen be­ stimmt.
Beispiel 3
Reinigung von human IgM mit Maus Anti-human-IgM Anti­ körper Affinitätschromatographie
A: 10 mg Anti-human-IgM Antikörper werden analog Bei­ spiel 1 an 10 g Sulfonyl aktiviertes Silicagel mit einer Porengröße von 10 000Å immobilisiert.
B: Entsprechend Beispiel 1 B wird das Anti-human-IgM Antikörper-Silicagel-10 000 in eine Chromatograhiesäule gepackt und äquilibriert.
Nach der Bindung von rohem Human-IgM werden die unspe­ zifisch gebundenen Proteine mit 0,1 M Na-Phosphatpuf­ fer, pH 7.0, ausgewaschen und das spezifisch gebundene Human-IgM mit 0,05 M Citratpuffer, pH 3.0, und einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Bindeka­ pazität von Maus Anti-Human-IgM Silicagel (Porengröße 10 000 Å) wurde zu 0,75 mg IgM/ml Säulenvolumen be­ stimmt.

Claims (9)

1. Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Biopolymeren durch Affinitätschromatographie mit Hilfe von porösem Silicagel und daran oberflächlich kovalent gebundenen Affinitätsliganden, dadurch gekennzeichnet, daß Silica­ gele verwendet werden mit definierten engen Porengrößen­ bereichen, welche jeweils das fünf- bis zwangzigfache der Größe des zu reinigenden Materials aufweisen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Silicagele verwendet werden mit definierten engen Po­ rengrößen im Bereich von 500 bis 10 000 Å.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß als Affinitätsliganden Antikörper verwendet werden.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Protei­ ne, Glykoproteine und/oder Nukleinsäuren sind.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Viren oder Vaccine sind.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Zellor­ ganellen sind.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material prokaryo­ tische oder eukaryotische Zellen sind.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Micel­ len, Vesikel, Chylomikronen, VLDL-, LDL- und/oder HDL- Lipoproteine sind.
9. Verwendung von porösem Silicagel definierter enger Po­ rengrößenbereiche mit daran oberflächlich kovalent ge­ bundenen Affinitätsliganden für die Affinitätschromato­ graphie von Biopolymeren mit Größen von 1/5 bis 1/20 der jeweiligen Porengröße des Silicagels.
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