JPS6372699A - アフィニティクロマトグラフィ−による生体高分子の分離・精製方法 - Google Patents

アフィニティクロマトグラフィ−による生体高分子の分離・精製方法

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JPS6372699A
JPS6372699A JP62197991A JP19799187A JPS6372699A JP S6372699 A JPS6372699 A JP S6372699A JP 62197991 A JP62197991 A JP 62197991A JP 19799187 A JP19799187 A JP 19799187A JP S6372699 A JPS6372699 A JP S6372699A
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porous
affinity
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DEIAGEN INST fur MOREKURAABIOROJITSUSHIE DEIAGUNOSUTEITSUKU GmbH
DIAGEN INST MOLEKULARBIO
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、表面にアフィニティリガンド（ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ　ｌｉｇａｎｄ）が共有結合した多孔性ｔ］体を用
いたア、イユティクロマトグラフィーによす生体高分子
を分離および精製する方法に関する。
［発ＩＪ１の背景］ まず第一に、アフィニティクロマトグラフィーには、デ
キストラン、アガランおよびアクリルアミド等の多孔性
担体が使用される。その細孔径は２０〜１００　ｎ　ｍ
　（２００〜１０００　Ｘ）の範囲に分布している。こ
のような物質には、例えば共有結合抗体が結合している
。これらの物質を使用することによってインシュリン、
インターフェロン等の蛋白質を商業的規模で精製するこ
とが可ス鮭となる。
米国特許第４，４１５，６５５号には、アガロース、セ
ルロースまたはシリカゲルなどの高分子担体に、生物活
性のある有機物質を共有結合させる特殊な方法が開示さ
れている。その実施例４および５では、不特定な細孔径
および粒子径の多孔性シリカゲルを使用し、Ｎ”−（６
−７ミノヘキシル）−アデノシン−５′−モノホスフェ
イトを共ｔｒ　＆ｉ　合させている。しかし、この方法
はｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、ヒト成長ホルモン、血液因
子■および単クローン性抗体のような組み換え蛋白質に
対してアフィニティクロマトグラフィーを使用するには
適当でない。
［発明の構成］ 本発明の目的は、その表面に７フイニテイリガンドが共
有結合した多孔性シリカゲルまたは他の多孔性担体（例
えば、多孔性ガラス、ケイ藻土、アルミナ、醸化チタン
およびこれらの混合物）を用いたアフィニティクロマト
グラフィーによる生体高分子を分離・精製する方法を改
良し、迅速、高信頼性、かつ高特異性の分離拳精製を可
能にすることにある。
一方では、その目的は、通常最も高価なアフィニティリ
ガンド（例えば抗体）を最適に使用することであり、ま
た一方では、不必要なロスやＪｉ　ＦＩ化奢避けるため
に、担体物質の使用量をできるだけ少なくすることであ
る０種々の多孔性担体、種々のアフィニティリガンドお
よび種々の生体高分子は、アフィニティクロマトグラフ
ィによる精製により下記の驚くべき結果がもたらされる
。
すなわち、大きさが精製される物質の５〜２０倍の特定
の狭い範囲にある細孔径を有するシリカゲルなどの多孔
性担体を使用する精製方法により上記の目的を最適に達
成することができる。
細孔径の範囲が不特定で広い多孔性の担体を使用した場
合は満足な結果は得られず、上記目的は達成されないで
あろう、多孔性担体が、特定の狭い範囲であったとして
も、精製される物質よりは大きいが５倍より小さい場合
では、高価で価値のあるアフィニティリガンドをただ使
用したというだけで有効な使用法ではない、また、ざら
に細孔径が小さい場合は、にじみ出るアフィニティリガ
ンドの量および／またはその汚染量が増加する。
もし、細孔径が精製される物質の大きさの２０倍より大
きい多孔性担体を使用した場合、その物質の精製される
ために有効な表面桔が減少し、次の初期に結合した生体
高分子を溶離する際、必要以上に大量の多孔性担体と大
容量の溶離液を使用しなければならなくなる。これは、
特に治療の目的で使用される生体高分子の場合には非常
に望ましくない。
精製される物質の５〜２０倍の特定の狭い範囲の大きさ
の本発明に従う細孔径において、この範囲の下側の方が
実質的に球形の生体高分子に使用することが好ましく、
一方この範囲の上側の方は長くてかさばった生体高分子
に使用することが好ましい。
さらに、上記細孔径の下側の範囲のものは、比較的小さ
いアフィニティリガンドが比較的短いスペーサを介して
多孔性担体の表面に結合する場合に好ましく、一方線孔
径の上側の範囲のものは、より大きくよりかさばったア
フィニティリガンドおよび／または長鎖スペーサが使用
される場合に好ましい。
表面に共有結合したアフィニティリガンドとしては、特
に抗体を挙げることができる。しかし、精製される生体
高分子に対して特異的な親和性を有する他の多数の物質
のいずれでもよい、その典型的な例は、スタフィ口コツ
力スアウレウス（Ｓｔａｐｈ７１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ
ｒｅｕｓ）の蛋白質Ａまたは免疫グロブリン（ＩｇＧ）
に特別な親和性を有するＭ１換え蛋白質Ａである。
本発明の方法は、蛋白質、糖蛋白質および／または核酸
、ウィルスまたはワクチン、オルガネラ、原核細胞また
は真核細胞、ミセルまたは小胞、乳び脂粒、Ｖ　Ｌ　Ｄ
　Ｌ　（ｖｅｒｙ　ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ）　、　Ｌ
Ｄ　Ｌ　（ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ）およびＨＤ　Ｌ　
（ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ）リポ蛋白質および蛋白質
複合体の分離および精製に特に重要なものである。
このように、本発明は、少なくとも５〜１０ｎ　ｍ　（
５０−１００又）から５００ｎｍ（５０００Ｋ）以上の
大きさの生体高分子に適用することができる。従って、
本発明では、少なくとも３０ｎｍ（３００又）、シかし
ながら好ましくは５０〜１０００　ｎ　ｍ　（５００〜
１００００　Ｘ　）の４シ定の狭い範囲の細孔径を有す
る多孔性担体が使用される。基本的には、さらに大きな
細孔径を有する多孔性担体を使用することも可使であろ
う、しかしながらこのオーダーの大きさで狭い範囲の細
孔径を有するシリカゲルなどの多孔性担体を製造するこ
とは、これまで技術的に困難であった。
本発明の方法による代表的な適用分野を以下に示す。
−・防接種材料　製　　るためのウィルスとワク天ヱ 生ワクチン（天然痘ウィルス、φ：約２５０ｎｍ（２５
００＾）） 弱毒ウィルス株（口蹄疫ウィルス、φ：約２５０ｎｍ（
２５００Ｘ）） 遺伝子工学的形質発現方法によって、より強い細胞培養
またはバクテリアから調製された組換えワクチン（例え
ば、Ｂ型肝炎ウィルスのコート蛋白質複合体、φ：約５
０ｎｍ（５０祷又））小胞およびミセルを基にしたワク
チン（φ：約１０〜５０ｎｍ　（１００〜５００又））
オルガネラ ミトコンドリア（φ：約５００ｎｍ（５０００Ｘ）） ミクロボディー 原核細　および真核細 例えば、培地または血液から除去したマイコプラズマ（
φ：約１００１００ｎ、０００又））およびＩＩＩ！瘍
細胞（φ：約１００００ｎｍ（１００００ｎ又））。
蛋白質 低分子蛋白質：リンフ才力イン、例えばインターフェロ
ンおよびＴＮＦ（分子Ｈｔｏｏｏｏ〜中分子量蛋白質二
組織特異的プラズミノーゲン活性化因子（分子量約６５
０００）、ＩｇＧ（分子量１５００００、φ：約１５ｎ
ｍ（１５０Ｘ））、ウロキナーゼ（φ：約９ｎｍ（９０
又）） 高分子量蛋白質：ＩｇＧ（分子量９０００００、φ：約
９０ｎｍ　（９００Ｘ））、血液因子で例えば■因子（
分子量〉１万、φ＞　５０　ｎ　ｍ（５００Ｘ）） 蛋白質複合体 血液を洗浄することよって除去した、例えばリウマチ因
子（分子量５０００００、φ〉約５０ｎｍ（５００又）
）のような免疫複合体。
例えば脂肪酸合成酵素（分子量約２．３万）のような酵
素複合体。
例えばミクロチュービリン、アクチン複合体のような線
状複合体。
リポゾーム。
ミセルおよび小胞 キロミクロン（φ：約１００〜１．０００ｎｍ（１００
０〜１ｏｏｏｏλ）） Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　（ｖｅｒｙ　ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ
　１ｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）。
（φ：約３０〜５０　ｎ　ｍ　（３００〜５００　Ｘ　
）　）ＬＤＬ（φ：約２０〜２５　ｎ　ｍ　（２００〜
２５０又）） ＨＤＬ（φ＞　１０　ｎ　ｍ　（ｌ　ＯＯ＠　）　）シ
リカゲルなどの多孔性担体の細孔表面にアフィニティリ
ガンドを共有結合させる方法は、それ自体公知の方法で
行なわれる０例えば、次の反応でアフィニティリガンド
と反応する有機部分を活性化することができるシランの
反応により行なわれる。
特に穏やかな、従って好ましい活性化方法は、穏やかな
条件下で共有結合を介してアフィニティリガンドをシリ
カゲルなどの多孔性担体と結合させるために、特に穏や
かな条件でアフィニティリガンドのアミン基、氷酸基そ
してスルフヒドリルノふと反応するアルキルまたはアリ
ールのスルフォン酸エステルをｒＸＪ製することである
。しかしながら、電荷を持ったアフィニティリガンドを
付与しなかったり、あるいはまた親和性に影響するよう
な変性を起こさない限り、基本的には他の全ての公知で
あるカップリング剤もまた適当である（例えば、グルタ
ルアルデヒドによるアミン基の活性化、カルボニルジイ
ミダゾール、クロロギ酸塩。
ビスエポキシシランによる水＃１基の活性化そして過ヨ
ウ素酸塩によるジオールの活性化）、原則として、長い
スペーサーと同様短いものもシリカゲルなどの多孔性担
体とアフィニティリガンドの間に挿入されても良い、し
かしながら、巾に炭素原子数を２〜１２個有するスペー
サーが好ましい。
短すぎるスペーサーを使用すると、アフィニティリガン
ドと精製される生体高分子間の反応に対して不必要な立
体障害が生ずる。長すぎるスペーサーは、アフィニティ
リガンドの効果を増加させることなく、細孔内の有効な
空間を無駄に使ってしまう。
以下の参考例で、穏やかな条件で種々なアフィニティリ
ガンドと共イ（結合できるようにその表面が活性化され
た、いくつかのシリカゲルの調製法を述べる。その次の
実施例では、いかにして特殊なアフィニティリガンドが
該表面に共有結合するか、そして得られたシリカゲルが
代表的な生体高分子のための高渣率のアフィニティクロ
マトグラフィーに、いかにして使用されるかについて述
へる。
［参考例１］ ジオール令シリカゲルの合成 ５００　ｍ　ｌの三ツロフラスコ内で、細孔径が１００
ｎｍ（１００ｎ又）そして粒子径が６０ルのシリカゲル
５０ｇを、気圧が１ミリバ一ル未満そして１５０℃の温
度で１２ｆｆ）間乾燥した。その後上記材料を冷却し、
フラスコ内を通気しそして純粋トルエン２００ｍｕおよ
びトリブチルアミン１　ｍ　ｌ中に、蒸留したγ−グリ
シジルオキシプロピルートリメトキシシラン５０ｍＭを
添加したものを加えた０反応は、トルエンのＪｈｌｋ温
度である１　１１”Ｃで１２時間行なわれた。反応終了
後、生成物（エポキシシリカゲル）を吸引濾過した。そ
して２５０ｍＭトルエンで二回、２５０ｍＭアセトンで
三回、０．００５Ｍ塩酸で二回洗浄し、それから吸引濾
過した。このエポキシ−シリカゲルを、０．００５Ｍ塩
酸２５０ｍＪｌ中にＦＪ、％し、９０℃で２時間保持し
ジオールを生成させた。
この生成物（ジオール・シリカゲル）を吸引濾過によっ
て選別し、木で五回、アセトンで二回清浄し、５０℃で
乾燥した。
［参考例２］ ジオール令シリカゲルのトシルクロライドによる活性化 ５００ｍ文の三ツロフラスコ内で、参考例１に従って合
成された細孔径が１００ｎｍ（１０１００ｎの乾燥シリ
カゲル５０ｇを、若干残っている可能性のある水分の除
去のため気圧が１ミリバ一ル未満そして７０℃の温度で
２時間転帰した。乾煙後、フラスコ内を通気し、純粋ア
セトン２５０ｍ文および純粋ピリジン１ｍＪｌを加えた
。この懸濁液を真空下にガスを除去し、攪拌機に接続し
た。攪拌しながら懸濁液に、純粋アセトン５０ｍ１にト
シルクロライド１０ミリモルを溶解した溶液をゆっくり
滴下した。２０〜２４℃の室温で３０分間反応後、トシ
ル活性化シリカゲルを吸引濾過した。そしてアセトン、
および組成が７５＝２５．５０：５０．２５　：　７５
のアセトンと２ｍＭ塩酸の混合物そして最後はｌ腸Ｍ塩
酸により、この順で洗浄し、吸引濾過し、そして凍結乾
燥を行なった・ ［参考例３］ ５００　ｍ　ｌの三ツロフラスコ内で、参考例１に従っ
て合成された細孔径が２５０ｎｍ　（２５００又）の乾
燥シリカゲル５０ｇを、若干残っている可能性のある水
分の除去のため気圧が１ミリバ一ル未満そして７０℃の
温度で２時間乾燥した。乾燥後、フラスコ内を通気し、
純粋アセトン２５０ｍ文および純粋ピリジン１ｍＪ２を
加え、フラスコ等の装置を攪拌機に接続した。この懸濁
液を真空下にガスを除去し、水浴で０℃に冷却した。攪
拌しながら懸濁液に、純粋アセトン５０ｍ交にトリクロ
ロメタンスルフオン酸クロライド１０ミリモルを溶解し
た溶液をゆっくり滴下した。０℃の温度で３０分間反応
後、トリクロロメタンスルフオン酸クロライド活性化シ
リカゲルを吸引１１！過した。そしてアセトン、および
組成が７５　：　２５．５０　：　５０．２５　：　７
５のアセトンと２ｍＭ塩酸の混合物そして最後は１ｍＭ
塩酸により、この順で洗浄し、吸引０過し、そして凍結
乾燥を行なった。
［参考例４］ ５００ｍｕの三ツロフラスコ内で、参考例１に従って合
成された細孔径が５００ｎｍ（５０００又）の乾燥シリ
カゲル５０ｇを、若干残っている可能性のある水分の除
去のため気圧が１ミリバ一ル未満そして７０℃の温度で
２時間乾燥した。乾燥後、フラスコ内を通気し、純粋ア
セトン２５０ｍ！；Ｌおよび純粋ピリジン１ｍＪ１を加
え、フラスコ等の装置を攪拌機に接続した。この懸濁液
を真空下にガスを除去し、水浴で０℃に冷却した。攪拌
しながら懸濁液に、純粋アセトン５０ｍ又に２゜４　、
６−　ト’Ｊ　：　トロベンゼンスルフォン酸りロライ
ドｌＯミリモルを溶解した溶液をゆっくり滴下した。０
℃の温度で３０分間反応後、トリニトロベンゼンスルフ
オン酸クロライド活性化シリカゲルを吸引濾過した。そ
してアセトン、および組成が７５　：　２５．５０：５
０．２５ニア５のアセトンと２＋ｓＭ塩酸の４２合物そ
して最後は１　ｍＭ塩酸により、この順で洗浄し、吸引
濾過し、そして凍結乾燥を行なった。
［参考例５］ ５００　ｍ　ｌの三ツロフラスコ内で、参考例１に従っ
て合成された細孔径が１，０００ｎｍ（１００００又）
の乾燥ジオール番シリカゲル５０ｇを、若干残っている
可爺性のある水分の除去のため気圧が１ミリバ一ル未満
そして７０℃の温度で２時間乾燥した。乾燥後、フラス
コ内を通気し、純粋アセトン２５０ｍＭおよび純粋ピリ
ジン１ｍ文を加え、フラスコ等の装はを攪拌機に接続し
た。この懸濁液を真空下にガスを除去し、水浴で０℃に
冷却した。攪拌しながら懸濁液に２゜２．２−トリフロ
ロエタンスルフオン酸クロライド１０ミリモルをゆっく
り滴下した。０℃の温度で３０分間反応後、２．２．２
−）リフロロエタンスルフォン酸クロライド（Ｔｒｅｓ
ｙｌ　Ｃ：ｈｌｏｒｉｄｅ）活性化シリカゲルを吸引濾
過した。そしてアセトン、および組成が７５　：　２５
．５０　：　５０．２５ニア５のアセトンと２１塩酸の
ｄシ合物、そして最後は１ｍＭ塩酸により、この順で洗
浄し、吸引０過し、そして凍結乾燥を行なった。
［参考例６］ ジオール番シリカゲルの過ヨウ素酸ナトリウムによる活
性化 ５００ｍＱの三ツロフラスコ内で、参考例１に従って合
成された細孔径が２５０ｎｍ（２５００又）、粒子径が
７５〜１２５μｍの範囲にある乾燥ジオール争シリカゲ
ル２０ｇをｐＨ４の０．１Ｍ酢酸ナトリウ１、溶液２５
０ｍｆｌに懸濁させ、フラスコ内のガスを減圧除去した
。１０ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを５０ｍＭの水に溶か
した溶液を攪拌しながら懸濁液に滴下した。、そして、
室温で２時間反応を続けた。得られたアルデヒド化シリ
カゲルを吸引濾過し　数回、水、エタノールとエーテル
で洗浄し、減圧乾燥した。
［実施例１］ Ａ：　１１００ｎ　（１０００又）の細孔を有するスル
フォニルクロライド活性化シリカゲル１０ｇをｐＨ８，
０ｃ７）Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭに懸
濁し、真空下にガスを除去した。この５．Ｈ液にｐＨ８
−０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１５ｍ交に溶解
した蛋白質Ａ（スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）または、１ｌ
１１換え蛋白質Ａからの）３００ｍｇを加えた。この懸
濁液は、蛋白質Ａの固定化を確実にするために４℃で６
時間振とうされた０反応後、生成物の蛋白質Ａシリカゲ
ルを濾過により選別し、ｐＨ８，０の０．１Ｍのメルカ
プトエタノールおよび０．１Ｍリン酸ナトリウムの緩衝
液１００ｍＭに懸濁し、スルフォニル基が未反応もまま
残ることを防ぐために２時間振とうした。この阻止反応
後、その生成物をｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液で近回洗浄した。
Ｂ：蛋白質Ａ−シリカゲル−１０００（１０００Ｘ）１
０ｇを１．２７Ｘ１５ｃｍクロマトグラフィのカラムに
入口および出口のアダプターにより充填し、カラム体積
の二倍のｐＨ７，０の０゜１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
で洗浄し、次いでカラム体積の二倍のｐＨ３，０の０．
０５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、そして０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で平衡状態にした。１００
０　ｍ　ｇの未加工のヒ）　−Ｉ　ｇＧから成るＩｇＧ
サンプルをｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液１００ｍＪｌに溶かし、１０＋ｎＪＪ／分でカラム内
に吸着させた。他の蛋白質および非特異的結合のＩｇＧ
による汚染物をカラム体積の二倍のｐＨ７，０（７）Ｏ
，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、そして特異的
結合ヒト・ＩｇＧ１ｐＨ３，０の０．０５Ｍクエン酸ナ
トリウム緩衝液を用い、流速１ｍ１１分で溶出した。
蛋白質Ａ−シリカゲル（細孔径：１ＯＯＯＸ）の結合容
量は、測定の結果、２５ｍｇ−ＩｇＧ／ｍｌカラム容量
であった。
［実施例２］ Ｇ）の精製 Ａ：抗ヒト＠ＩｇＧ抗体２００ｍｇを、２５０ｎｍ（２
５００Ｘ）の、■■孔を有するスルフォニルクロライド
活性化シリカゲル１０ｇに実施例ＩＡと同様に固定化し
た。
Ｂ：抗ヒＦ−ＩｇＧ抗体シリカゲル−２５００を、実施
例ＩＢと同様にしてクロマトグラフィのカラムに充填し
平衡状態にした。未加工のヒト・ＩｇＧを吸着させた後
、非特異的結合蛋白質をｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナ
トリウムＨＨｊ液で溶出し、そして特異的結合ヒト・Ｉ
ｇＧをｐＨ３，０の０．０５Ｍクエン斂ナトリウム緩衝
液を用い、流速１ｍ立／分で溶出した。
抗ヒト・ＩｇＧ抗体シリカゲル（細孔径：２５０ｎｍ　
（２５００又）の結合容量は、測定の結果、１０ｍｇヒ
）ＩｇＧ／ｍ文カラム容量であった。
［実施例３］ Ｍ）の精製 Ａ：抗ヒト−Ｉ　ｇＭ抗体１０ｍｇを、１０００ｎｍ（
１０００ｎ又）の細孔を有するスルフォニルクロライド
活性化シリカゲル１０ｇに実施例ＩＡと同様に固定化し
た。
Ｂ：抗ヒト・ＩｇＭ抗体シリカゲル−１００００を、実
施例ＩＢと同様にしてクロマトグラフィカラムに充填し
平衡状態にした。未加工のヒト・ＩｇＭを吸着させた後
、非特異的結合蛋白質をｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩Ｉｉ液で溶出し、そして特異的結合ヒ）　−
Ｉ　ｇＭをｐＨ３，０（７）０．０５Ｍクエン酸ナトリ
ウム緩衝液を用い、波速１ｍ文／分で溶出した。
抗ヒト・ＩｇＭ抗体シリカゲル（細孔径：１１０００ｎ
　（１００００又）の結合容量は、測定の結果、０　、
７５　ｍ　ｇヒトＩｇＭ／１ｎＪＪカラム容量であった
・

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、表面にアフィニティリガンドが共有結合した多孔性
    シリカゲル、多孔性ガラス、ケイ藻土、アルミナ、酸化
    チタン、氷酸リン灰石、酸化ジルコニウムまたはこれら
    の混合物からなる群より選ばれる多孔性担体を用いたア
    フィニティクロマトグラフィーにより生体高分子を分離
    ・精製する方法において、上記多孔性担体が、精製され
    る物質の大きさの５〜２０倍の特定の狭い範囲内にある
    細孔径を有することを特徴とする方法。 ２、上記多孔性担体が、５０〜１０００ｎｍの特定の狭
    い範囲内にある細孔径を有することを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の方法。 ３、アフィニティリガンドとして抗体が用いられている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、精製される物質が蛋白質、糖蛋白質および／または
    核酸であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ５、精製される物質がウィルスまたはワクチンであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、精製される物質が細胞オルガネラであることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、精製される物質が原核細胞または真核細胞であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、精製される物質がミセル、小胞、乳び脂粒、ＶＬＤ
    Ｌ、ＬＤＬおよび／またはＨＤＬリボ蛋白質であること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
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